JPWO2014133090A1

JPWO2014133090A1 - 脳腫瘍治療のための多能性幹細胞

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Publication number: JPWO2014133090A1
Application number: JP2015503024A
Authority: JP
Inventors: 宏樹難波; 真理出澤; 正順吉田
Original assignee: Tohoku University NUC; Hamamatsu University School of Medicine NUC
Current assignee: Tohoku University NUC; Hamamatsu University School of Medicine NUC
Priority date: 2013-02-28
Filing date: 2014-02-27
Publication date: 2017-02-02
Also published as: WO2014133090A1

Abstract

多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を用いた新たな医療用途を提供することを目的とする。本発明は、生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞から分離されたＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞を含む、脳腫瘍を治療するための細胞製剤を提供する。本発明の細胞製剤は、脳腫瘍の対象に対し、自殺遺伝子を導入したＭｕｓｅ細胞を静脈投与し、さらに、該自殺遺伝子に対応するプロドラッグを投与することにより、該Ｍｕｓｅ細胞を脳腫瘍周辺に選択に集積させ、該自殺遺伝子の発現に伴うプロドラッグの活性化により脳腫瘍を構成する細胞を消滅又はその増殖を減少させるというメカニズムに基づく。

Description

本発明は、脳腫瘍の治療に有効な自殺遺伝子を導入した多能性幹細胞を含有する細胞製剤に関する。

脳腫瘍の約１／４を占めるグリオーマ（神経膠腫）は、周囲の正常脳組織に浸潤性に発育するため、脳機能を温存しようとすれば手術による全摘出は困難である。更に、術後には放射線治療や抗癌剤治療を併用することが多いが、治癒率は低く、最も悪性のグリオブラストーマ（膠芽腫）といわれる腫瘍では平均生存期間は約１年にすぎない。しかもこの成績はさまざまな治療戦略の開発にもかかわらず、過去３０年間ほとんど変わっておらず、２１世紀に残された最後の悪性腫瘍の１つと言われており、新たな治療戦略の開発が急務である。

１９９０年代に導入された「自殺遺伝子治療」という遺伝子治療は、ウイルスなどの遺伝子を用いて、哺乳類では無害な薬物を遺伝子導入細胞中で毒物（抗癌剤）に変化させ、癌細胞を殺す治療法である。中でも単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶｔｋ遺伝子）と抗ウイルス剤ガンシクロビル（ＧＣＶ）を用いた自殺遺伝子治療においては、遺伝子導入細胞が全体の１０％程度でもすべての腫瘍が消失するバイスタンダー効果（ｂｙｓｔａｎｄｅｒｅｆｆｅｃｔ）がある（非特許文献１）。しかし、この治療法はラットなどの動物実験では顕著な効果が見られたが、臨床成績は必ずしも満足のいくものではなかった。その理由の１つとして、遺伝子導入のために用いたレトロウイルス産生線維芽細胞の移動能が低く、浸潤性に発育するグリオーマ細胞をカバーしきれなかったことが挙げられる。

一方、近年発見され神経再生の研究が盛んな神経幹細胞は脳内で極めて活発な移動能を持ち、ラットの実験では脳腫瘍と神経幹細胞を別々に左右の脳に移植して観察すると神経幹細胞が対側の脳腫瘍まで移動し、腫瘍周辺に集積することが知られている（非特許文献２）。このような移動能のある神経幹細胞に自殺遺伝子を組み込み、腫瘍部で細胞障害性物質を発現させることにより脳腫瘍を治療する方法が試みられている（特許文献１）。本発明者らは、ＨＳＶｔｋ／ＧＣＶ遺伝子を導入した神経幹細胞を脳腫瘍の周辺に移植したところ、バイスタンダー効果による抗腫瘍効果を認め、神経幹細胞が悪性グリオーマの治療に適した細胞であることを見出している（非特許文献３）。しかしながら、神経幹細胞は自殺遺伝子を腫瘍部に運搬するベクターとしては極めて有効であるが、臨床応用を考えた場合に、神経幹細胞を患者から取り出すのは侵襲的で極めて困難である。これまで、本発明者らは、神経幹細胞と同様の移動能を持ちかつより汎用的なベクターとして、骨髄より採取された間葉系幹細胞を自殺遺伝子を腫瘍部に運搬するベクターとして用いて脳腫瘍の治療試験を試みた（特許文献２）。しかしながら、この治療試験に使用した間葉系幹細胞は不均一であり効果が一定でなかった。

本発明者らの一人である出澤の研究により、間葉系細胞画分に存在し、誘導操作なしに得られる、ＳＳＥＡ−３（Ｓｔａｇｅ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＥｍｂｒｙｏｎｉｃＡｎｔｉｇｅｎ−３）を表面抗原として発現している多能性幹細胞（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇＳｔｒｅｓｓＥｎｄｕｒｉｎｇｃｅｌｌｓ；Ｍｕｓｅ細胞）が間葉系細胞画分の有する多能性を担っており、組織再生を目指した疾患治療に応用できる可能性があることが分かってきた（特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。しかしながら、脳腫瘍の予防及び／又は治療にＭｕｓｅ細胞を使用し、期待される治療効果が得られることを明らかにした例はない。

特表２００２−５２６１０４号公報特開２００６−３４５７２６号公報国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号

Ｒａｍ，Ｚ．，ｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３，ｐ．１３５４−１３６１（１９９７）Ｌｅｅ，Ｊ．，ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．６３，ｐ．８８７７−８８８９（２００３）Ｌｉ，Ｓ．，ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．１２，ｐ．６００−６０７（２００５）Ｋｕｒｏｄａ，Ｙ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．１０７，ｐ．８６３９−８６４３（２０１０）Ｗａｋａｏ，Ｓ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．１０８，ｐ．９８７５−９８８０（２０１１）

本発明は、脳腫瘍治療において、多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を用いた新たな医療用途を提供することを目的とする。より具体的には、本発明は、自殺遺伝子を導入したＭｕｓｅ細胞及び該自殺遺伝子に対応するプロドラッグを含む、脳腫瘍の予防及び／又は治療のための細胞製剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）遺伝子を導入したヒトＭｕｓｅ細胞をガンシクロビル（ＧＣＶ）とともに、グリオーマ細胞の培養系に添加することによって、該グリオーマ細胞へのＭｕｓｅ細胞のバイスタンダー効果及び遊走能を確認し、グリオーマ細胞の増殖が顕著に抑制されることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］自殺遺伝子を導入した多能性幹細胞を含む、脳腫瘍を治療するための細胞製剤であって、ここで、該多能性幹細胞は、生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞から分離されたＳＳＥＡ−３陽性細胞であり、該細胞製剤は、脳腫瘍を死滅させる又はその増殖を阻害する薬物のプロドラッグとともに使用され、該プロドラッグは、前記自殺遺伝子の発現によって生成する酵素に対する基質である細胞製剤。
［２］脳腫瘍を構成するグリオーマ細胞を治療対象とする、上記［１］に記載の細胞製剤。
［３］前記多能性幹細胞が、ＣＤ１０５陽性である、上記［１］及び［２］に記載の細胞製剤。
［４］前記多能性幹細胞が、ＣＤ１１７陰性及びＣＤ１４６陰性である、上記［１］〜［３］に記載の細胞製剤。
［５］前記多能性幹細胞が、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＮＧ２陰性、ＣＤ３４陰性、ｖＷＦ陰性、及びＣＤ２７１陰性である、上記［１］〜［４］に記載の細胞製剤。
［６］前記多能性幹細胞が、ＣＤ３４陰性、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＣＤ２７１陰性、ＮＧ２陰性、ｖＷＦ陰性、Ｓｏｘ１０陰性、Ｓｎａｉ１陰性、Ｓｌｕｇ陰性、Ｔｙｒｐ１陰性、及びＤｃｔ陰性である、上記［１］〜［５］に記載の細胞製剤。
［７］前記多能性幹細胞が、以下の性質の全てを有する多能性幹細胞である、上記［１］〜［６］に記載の細胞製剤：
（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ。
［８］前記多能性幹細胞が、脳腫瘍部位に集積する能力を有する、上記［１］〜［７］に記載の細胞製剤。
［９］前記自殺遺伝子が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子又はニトロレダクターゼ遺伝子である、上記［１］〜［８］に記載の細胞製剤。
［１０］前記プロドラッグが、自殺遺伝子がＨＳＶｔｋ遺伝子である場合はガンシクロビル（ＧＣＶ）、アシクロビル、ペンシクロビル、ＰＭＥＡアデフォビル又はＰＭＰＡテノフォビルであり、自殺遺伝子がシトシンデアミナーゼ遺伝子の場合は５−フルオロシトシンであり、自殺遺伝子がウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子の場合は５−フルオロウラシルであり、自殺遺伝子がｇｐｔ遺伝子の場合は６−チオキサンチン又は６−チオグアニンであり、自殺遺伝子がニトロレダクターゼ（ｎｔｒ）遺伝子の場合はプロドラッグはＣＢ１９５４である、上記［１］〜［８］に記載の細胞製剤。

本発明は、脳腫瘍を患っている対象に対し、自殺遺伝子を導入したＭｕｓｅ細胞及び該自殺遺伝子に対するプロドラッグを静脈等から投与することにより、Ｍｕｓｅ細胞を脳腫瘍に集積させ、自殺遺伝子の発現に伴うプロドラッグの活性化に基づいて、腫瘍細胞を死滅又はその増殖を抑制することができる。

ヒトグリア芽腫（膠芽細胞種）へのＭｕｓｅ細胞の集積を示す。自殺遺伝子を導入したＭｕｓｅ細胞（Ｍｕｓｅ−ＴＫ）とヒトグリオーマ（Ａ１７２）におけるバイスタンダー効果を示す。図２は、グリオーマ細胞とＭｕｓｅ−ＴＫとを異なる細胞比で同時培養した場合のグリオーマ細胞の培養状態を経時的に観察した結果を示す。図３は、図２で得られた結果に基づいて、グリオーマ細胞の減少を細胞数をカウントすることによって示した図である。グリオーマ細胞に対するＭｕｓｅ細胞の遊走能をボイデンチャンバーを用いて測定した結果を示す。インビボにおけるＭｕｓｅ−ＴＫによるバイスタンダー効果を検証した結果を示す。

本発明は、自殺遺伝子を導入した多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を含む、脳腫瘍を治療するための細胞製剤に関する。本発明を以下に詳細に説明する。

１．適用疾患
本発明は、自殺遺伝子を導入した多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を含む細胞製剤を用いて、脳腫瘍の治療、特に、グリオーマ細胞の死滅又はその増殖を阻害する治療を目指す。ここで、「脳腫瘍」とは、任意のタイプの神経細胞が異常に増殖する状態を指す。脳腫瘍の例としては、限定されないが、グリオーマ（膠腫）、髄芽腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、下垂体腺腫、神経鞘腫、原発性中枢神経系リンパ腫、肉腫、及び脊髄腫瘍が挙げられる。本発明の細胞製剤は、上記各種の脳腫瘍を対象とすることができるが、脳腫瘍の約１／４を占めるグリオーマを治療対象とすることが好ましい。

２．細胞製剤
（１）多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）
本発明の細胞製剤に使用される多能性幹細胞は、本発明者らの一人である出澤が、ヒト生体内にその存在を見出し、「Ｍｕｓｅ（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇＳｔｒｅｓｓＥｎｄｕｒｉｎｇ）細胞」と命名した細胞である。Ｍｕｓｅ細胞は、骨髄液や真皮結合組織等の皮膚組織から得ることができ、各臓器の結合組織にも散在する。また、この細胞は、多能性幹細胞と間葉系幹細胞の両方の性質を有する細胞であり、例えば、それぞれの細胞表面マーカーである「ＳＳＥＡ−３（Ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｅｍｂｒｙｏｎｉｃａｎｔｉｇｅｎ−３）」と「ＣＤ１０５」のダブル陽性として同定される。したがって、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、例えば、これらの抗原マーカーを指標として生体組織から分離することができる。Ｍｕｓｅ細胞の分離法、同定法、及び特徴などの詳細は、国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号に開示されている。また、Ｗａｋａｏら（２０１１、上述）によって報告されているように、骨髄、皮膚などから間葉系細胞を培養し、それをＭｕｓｅ細胞の母集団として用いる場合、ＳＳＥＡ−３陽性細胞の全てがＣＤ１０５陽性細胞であることが分かっている。したがって、本発明における細胞製剤においては、生体の間葉系組織又は培養間葉系幹細胞からＭｕｓｅ細胞を分離する場合は、単にＳＳＥＡ−３を抗原マーカーとしてＭｕｓｅ細胞を精製し、使用することができる。なお、本明細書においては、脳腫瘍を治療するための細胞製剤において使用され得る、ＳＳＥＡ−３を抗原マーカーとして、生体の間葉系組織又は培養間葉系組織から分離された多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団を単に「ＳＳＥＡ−３陽性細胞」と記載することがある。また、本明細書においては、「非Ｍｕｓｅ細胞」とは、生体の間葉系組織又は培養間葉系組織に含まれる細胞であって、「ＳＳＥＡ−３陽性細胞」以外の細胞を指す。

簡単には、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、細胞表面マーカーであるＳＳＥＡ−３に対する抗体を単独で用いて、又はＳＳＥＡ−３及びＣＤ１０５に対するそれぞれの抗体を両方用いて、生体組織（例えば、間葉系組織）から分離することができる。ここで、「生体」とは、哺乳動物の生体をいう。本発明において、生体には、受精卵や胞胚期より発生段階が前の胚は含まれないが、胎児や胞胚を含む胞胚期以降の発生段階の胚は含まれる。哺乳動物には、限定されないが、ヒト、サル等の霊長類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等のげっ歯類、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、フェレット等が挙げられる。本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞は、生体の組織由来である点で、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）と明確に区別される。また、「間葉系組織」とは、骨、滑膜、脂肪、血液、骨髄、骨格筋、真皮、靭帯、腱、歯髄、臍帯などの組織及び各種臓器に存在する組織をいう。例えば、Ｍｕｓｅ細胞は、骨髄や皮膚から得ることができる。例えば、生体の間葉系組織を採取し、この組織からＭｕｓｅ細胞を分離し、利用することが好ましい。また、上記分離手段を用いて、培養間葉系細胞からＭｕｓｅ細胞を分離してもよい。なお、本発明の細胞製剤においては、使用されるＭｕｓｅ細胞は、細胞移植を受けるレシピエントに対して自家であってもよく、又は他家であってもよい。

上記のように、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、例えば、ＳＳＥＡ−３陽性、及びＳＳＥＡ−３とＣＤ１０５の二重陽性を指標にして生体組織から分離することができるが、ヒト成人皮膚には、種々のタイプの幹細胞及び前駆細胞を含むことが知られている。しかしながら、Ｍｕｓｅ細胞は、これらの細胞と同じではない。このような幹細胞及び前駆細胞には、皮膚由来前駆細胞（ＳＫＰ）、神経堤幹細胞（ＮＣＳＣ）、メラノブラスト（ＭＢ）、血管周囲細胞（ＰＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰ）、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）が挙げられる。これらの細胞に固有のマーカーの「非発現」を指標として、Ｍｕｓｅ細胞を分離することができる。より具体的には、Ｍｕｓｅ細胞は、ＣＤ３４（ＥＰ及びＡＤＳＣのマーカー）、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）（ＭＢのマーカー）、ＣＤ１４６（ＰＣ及びＡＤＳＣのマーカー）、ＣＤ２７１（ＮＧＦＲ）（ＮＣＳＣのマーカー）、ＮＧ２（ＰＣのマーカー）、ｖＷＦ因子（フォンビルブランド因子）（ＥＰのマーカー）、Ｓｏｘ１０（ＮＣＳＣのマーカー）、Ｓｎａｉ１（ＳＫＰのマーカー）、Ｓｌｕｇ（ＳＫＰのマーカー）、Ｔｙｒｐ１（ＭＢのマーカー）、及びＤｃｔ（ＭＢのマーカー）からなる群から選択される１１個のマーカーのうち少なくとも１個、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又は１１個のマーカーの非発現を指標に分離することができる。例えば、限定されないが、ＣＤ１１７及びＣＤ１４６の非発現を指標に分離することができ、さらに、ＣＤ１１７、ＣＤ１４６、ＮＧ２、ＣＤ３４、ｖＷＦ及びＣＤ２７１の非発現を指標に分離することができ、さらに、上記の１１個のマーカーの非発現を指標に分離することができる。

また、本発明の細胞製剤に使用される上記特徴を有するＭｕｓｅ細胞は、以下：
（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ
からなる群から選択される少なくとも１つの性質を有してもよい。本発明の一局面では、本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞は、上記性質を全て有する。ここで、上記（ｉ）について、「テロメラーゼ活性が低いか又は無い」とは、例えば、ＴＲＡＰＥＺＥＸＬｔｅｌｏｍｅｒａｓｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いてテロメラーゼ活性を検出した場合に、低いか又は検出できないことをいう。テロメラーゼ活性が「低い」とは、例えば、体細胞であるヒト線維芽細胞と同程度のテロメラーゼ活性を有しているか、又はＨｅｌａ細胞に比べて１／５以下、好ましくは１／１０以下のテロメラーゼ活性を有していることをいう。上記（ｉｉ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏにおいて、三胚葉（内胚葉系、中胚葉系、及び外胚葉系）に分化する能力を有し、例えば、ｉｎｖｉｔｒｏで誘導培養することにより、肝細胞、神経細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、骨細胞、脂肪細胞等に分化し得る。また、ｉｎｖｉｖｏで精巣に移植した場合にも三胚葉に分化する能力を示す場合がある。さらに、静注により生体に移植することで損傷を受けた臓器（心臓、皮膚、脊髄、肝、筋肉等）に遊走及び生着し、分化する能力を有する。上記（ｉｉｉ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、浮遊培養では増殖速度約１．３日で増殖するが、１０日間程度で増殖が止まるという性質を有し、さらに精巣に移植した場合、少なくとも半年間は癌化しないという性質を有する。また、上記（ｉｖ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、セルフリニューアル（自己複製）能を有する。ここで、「セルフリニューアル」とは、１個のＭｕｓｅ細胞を浮遊培養することにより得られる胚様体様細胞塊に含まれる細胞を培養し、再度胚様体様細胞塊を形成させることをいう。セルフリニューアルは１回又は複数回のサイクルを繰り返せばよい。

（２）細胞製剤の調製及び使用
本発明は、自殺遺伝子を導入したＭｕｓｅ細胞を含む、脳腫瘍を治療するための細胞製剤であって、該自殺遺伝子に対応するプロドラッグとともに使用する細胞製剤を提供する。
（ａ）自殺遺伝子
本明細書において使用するとき、「自殺遺伝子」とは、細胞内で発現すると自己を殺傷することができる遺伝子を意味し、典型的には、代謝毒性遺伝子が挙げられる。自殺遺伝子には、限定されないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）遺伝子（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，７８，１４４１−１４４５（１９８１））、シトシンデアミナーゼ遺伝子（ＥＧ１１３２６ｃｏｄＡ３５５３９５．．３５６６７８，大腸菌）、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＥＧ１１３３２ｕｐｐ２６１８８９４．．２６１８２６８，大腸菌）、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子（ＥＧ１０４１４ｇｐｔ２５５９７７．．２５６４３５，大腸菌）、ニトロレダクターゼ（ｎｔｒ）遺伝子（ＥＧ１１２６１ｎｆｓＡ８９０４０７．．８９１１２９，大腸菌）が含まれる。
（ｂ）プロドラッグ
本発明の細胞製剤は、プロドラッグとともに使用することにより脳腫瘍を治療することができる。ここで、本発明の細胞製剤とともに使用される「プロドラッグ」とは、目的とする腫瘍細胞を死滅させる又はその増殖を阻害する薬物のプロドラッグであって、それ自体ではこのような細胞毒性を持たない薬物を意味する。このプロドラッグは、自殺遺伝子の発現によって生成する酵素により薬理活性（細胞毒性）をもつ薬物に変換される。プロドラッグとしては、自殺遺伝子が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）遺伝子の場合、ガンシクロビル（ＧＣＶ）、アシクロビル、ペンシクロビル、ＰＭＥＡアデフォビル、ＰＭＰＡテノフォビルなどが挙げられ、好ましくはＧＣＶ、アシクロビル、ペンシクロビルを用いることができる。これらは、いずれも核酸のプリン体のグアニンの類似物質でＤＮＡ合成に使われると、そこでＤＮＡ合成が停止し、抗ウイルス効果を発揮する。また、自殺遺伝子がシトシンデアミナーゼ遺伝子の場合、プロドラッグは５−フルオロシトシンを用いることができる（ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，７，７１３−７２０（１９９６））。自殺遺伝子がウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子の場合、プロドラッグは５−フルオロウラシルを用いることができる（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ，１８，１１７−１２０（２００１））。自殺遺伝子がグアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子の場合、プロドラッグは６−チオキサンチン又は６−チオグアニンを用いることができる（ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，８，２０４３−２０５５（１９９７））。自殺遺伝子がニトロレダクターゼ遺伝子の場合、プロドラッグはＣＢ１９５４を用いることができる（ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，７，７２１−７３１（２０００））。

また、自殺遺伝子の発現により生成する酵素とプロドラッグの反応機構について、例えば、ＨＳＶｔｋ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）遺伝子とＧＣＶ（ガンシクロビル）を用いて、以下に説明する。例えば癌細胞にＨＳＶｔｋ遺伝子を導入して発現させ、抗ウイルス剤であるＧＣＶをプロドラッグとして投与する。ＨＳＶｔｋ遺伝子を導入された癌細胞はＨＳＶｔｋによってＧＣＶをリン酸化し、一リン酸化型のＧＣＶ（ＧＣＶ−１Ｐ）を形成する。ＧＣＶ−１Ｐは、その後、自身のチミジンキナーゼによって三リン酸までリン酸化が進み、ＤＮＡポリメラーゼを阻害するために、ＤＮＡ複製をおこす細胞はアポトーシスに陥り死滅する。さらにＧＣＶ−１Ｐはギャップジャンクションを通って隣接細胞へも取り込まれ、遺伝子導入がない隣接細胞もＤＮＡ合成が阻害され死滅する（バイスタンダー効果）。

（ｃ）自殺遺伝子のＭｕｓｅ細胞への導入と細胞製剤の調製
本発明の細胞製剤においては、自殺遺伝子を導入したＭｕｓｅ細胞が使用される。Ｍｕｓｅ細胞に前記自殺遺伝子を導入する方法としては、該遺伝子を組み込んだベクターを導入する方法が一般的である。ベクターの使用による遺伝子導入としては、限定されないが、ウイルス性又は非ウイルス性遺伝子導入（例えば、プラスミド導入、ファージインテグラーゼ、トランスポゾン、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及びレンチウイスルなど）が挙げられる。より具体的には、自殺遺伝子として、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）遺伝子を用いる場合、マウス由来のＨＳＶｔｋ−レトロウイルス産生細胞（ＰＡ３１７）培養の上清液により、ウイルスを細胞に感染させて遺伝子を導入することができる。シトシンデアミナーゼ遺伝子を用いる場合には、大腸菌のシトシンデアミナーゼ遺伝子のｃＤＮＡにサイトメガロウイルス初期遺伝子エンハンサー／プロモーターを付したアデノウイルスベクターに組み込み（ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，６，１０５５−１０６３（１９９５））、細胞に導入することができる。また、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＵＰＲＴ）遺伝子を用いる場合には、大腸菌のＵＰＲＴ遺伝子を組み込んだレトロウイルスベクターＬＸＳＮを用いて遺伝子を導入することができる。グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子を用いる場合には、大腸菌のｇｐｔ−レトロウイルス産生細胞（ＧＰ／Ｅ８６ｇｐｔ）培養の上清液により、ウイルスを細胞に感染させて遺伝子を導入することができる。また、ニトロレダクターゼ（ｎｔｒ）遺伝子を用いる場合には、大腸菌のｎｔｒ遺伝子にサイトメガロウイルス初期遺伝子エンハンサー／プロモーターを付したプラスミドを作成し、エレクトロポレーションにより細胞内に遺伝子を導入することができる。なお、遺伝子導入前に所定の細胞数を確保するために、適宜、細胞を増殖させてもよい。

本発明の細胞製剤は、自殺遺伝子導入後のＭｕｓｅ細胞を生理食塩水や適切な緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁させることによって得られる。この場合、自家又は他家の組織から分離したＭｕｓｅ細胞数が少ない場合には、細胞製剤を治療対象への投与前に細胞を培養して、所定の細胞濃度が得られるまで増殖させてもよい。なお、すでに報告されているように（国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号）、Ｍｕｓｅ細胞は、腫瘍化しないため、生体組織から回収した細胞が未分化のまま含まれていても癌化の可能性が低く安全である。また、回収したＭｕｓｅ細胞の培養は、特に限定されないが、通常の増殖培地（例えば、１０％仔牛血清を含むα−最少必須培地（α−ＭＥＭ））において行うことができる。より詳しくは、上記国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号を参照して、Ｍｕｓｅ細胞の培養及び増殖において、適宜、培地、添加物（例えば、抗生物質、血清）等を選択し、所定濃度のＭｕｓｅ細胞を含む溶液を調製することができる。

（ｄ）細胞製剤の使用
Ｍｕｓｅ細胞の細胞製剤への使用においては、該細胞を保護するためにジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）や血清アルブミン等を、細菌の混入及び増殖を防ぐために抗生物質等を細胞製剤に含有させてもよい。さらに、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）や間葉系幹細胞に含まれるＭｕｓｅ細胞以外の細胞又は成分を細胞製剤に含有させてもよい。当業者は、これら因子及び薬剤を適切な濃度で細胞製剤に添加することができる。

上記で調製される細胞製剤中に含有する自殺遺伝子を導入したＭｕｓｅ細胞の数は、脳腫瘍の治療において所望の効果（例えば、腫瘍の消滅、腫瘍サイズの減少）が得られるように、対象の性別、年齢、体重、患部の状態、使用する細胞の状態等を考慮して、適宜、調整することができる。また、本発明の細胞製剤は、所望の治療効果が得られるまで、複数回（例えば、２〜１０回）、適宜、間隔（例えば、１日に２回、１日に１回、１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回）をおいて投与されてもよい。したがって、対象の状態にもよるが、治療上有効量としては、例えば、一個体あたり１×１０^３細胞〜１×１０^６細胞で１〜１０回の投与量が好ましい。一個体における投与総量としては、限定されないが、１×１０^３細胞〜１×１０^７、１×１０^４細胞〜５×１０^６細胞などが挙げられる。

上記した通り、本発明の細胞製剤による脳腫瘍の治療は、Ｍｕｓｅ細胞に導入された自殺遺伝子の発現、それに続く該遺伝子産物である酵素によるプロドラッグの活性化に基づく。そこで、本発明の細胞製剤の使用においては、該細胞製剤の投与部位、投与方法（腫瘍局所投与、頚動脈内投与、静脈内投与）は限定されない。また、本発明の細胞製剤とともに使用されるプロドラッグは、上記記載の静脈投与であってもよく、また腹腔内投与であってもよい。例えば、本発明によれば、限定されないが、Ｍｕｓｅ細胞の遊走能（腫瘍周辺への集積脳）を利用して、例えば、脳腫瘍を有する対象に対して、該細胞製剤を静脈投与後、プロドラッグを静脈内又は腹腔内投与することによって、所望の治療効果を得ることができる。なお、プロドラッグの投与時期は、限定されないが、上記効果を有する限り、本発明の細胞製剤の投与後、投与と同時、及び投与前のいずれであってもよい。本発明の一態様においては、自殺遺伝子を導入したＭｕｓｅ細胞、プロドラッグ、及び場合により担体、賦形剤を含む医薬組成物が提供される。

以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。

実施例１：単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）遺伝子を導入したＭｕｓｅ細胞の作製
（１）ヒトＭｕｓｅ細胞の調製
ヒトＭｕｓｅ細胞の調製は、国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号に記載された方法に従って行った。より具体的には、ヒト骨髄液から接着性を有する間葉系細胞を培養し、増殖を経て、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団をＳＳＥＡ−３陽性細胞としてＦＡＣＳにて分離した。また、非Ｍｕｓｅ細胞は、上記間葉系細胞のうち、ＳＳＥＡ−３陰性の細胞群であり、対照として用いた。その後、リン酸緩衝生理食塩水又は培養液を用いて、所定濃度に調整し、以下のバイスタンダー効果及び細胞遊走能の評価に使用した。なお、骨髄間葉系細胞などの間葉系細胞を培養して得たものをＭｕｓｅ細胞の母集団として用いる場合、Ｗａｋａｏら（２０１１、上述）によって報告されているように、ＳＳＥＡ−３陽性細胞は全て、ＣＤ１０５陽性細胞であることが分かっている。
（２）ＨＳＶｔｋ遺伝子導入
ＨＳＶｔｋレトロウイルス産生細胞（ＰＡ３１７、マウス線維芽細胞、ＧｅｎｅｔｉｃＴｈｅｒａｐｙＩｎｃ．）（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤより提供）をＭＳＣ培地中で４８時間培養した後、その上清よりＨＳＶｔｋレトロウイルスを得た。これを８μｇ／ｍｌポリブレン（ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙＩｎｃ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）とともに培養中のＭｕｓｅ細胞に添加し、さらに５時間培養し、続いて洗浄後に新鮮な培養液と交換した。１５０μｇ／ｍｌＧ４１８（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＪａｐａｎＫ．Ｋ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）とともに１週間培養し、薬剤耐性細胞を選択することにより遺伝子導入細胞のみを得た。これらの細胞株の中からガンシクロビルＧＣＶ感受性の高い株を選び、さらに増殖させ、充分量のＨＳＶｔｋ遺伝子導入細胞（Ｍｕｓｅ−ＴＫ細胞）を得た。

実施例２：グリオブラストーマ（膠芽腫）周辺におけるＭｕｓｅ細胞の検出
ヒト対象から採取したヒトグリオブラストーマにＭｕｓｅ細胞が存在しているかどうかを検討した。採取したグリオブラストーマの組織切片を作製し、Ｍｕｓｅ細胞の細胞表面抗原（ＳＳＥＡ−３）に対する抗体を用いて、常法に従って免疫染色を行った。図１に示すように、Ｍｕｓｅ細胞はグリオブラストーマの周辺に存在することが分かった。

実施例３：Ｍｕｓｅ−ＴＫ細胞によるヒトグリオーマ細胞におけるバイスタンダー効果の確認
実施例１において作製したＭｕｓｅ−ＴＫによるバイスタンダー効果を確認するために、インビトロにおいてＭｕｓｅ−ＴＫ細胞とグリオーマ細胞との共培養により検討した。９６ウェルにヒトグリオーマ細胞（Ａ１７２）を１．５×１０^４細胞／ウェル、Ｍｕｓｅ−ＴＫ細胞をそれと同数（１／１）、１／４、１／８、１／１６、１／３２の細胞数として混ぜ、２μｇ／ｍｌのガンシクロビル（ＧＣＶ）の存在下に所定日数で培養し、位相差顕微鏡で観察し、撮像した。図２に示すように、ＧＣＶ添加後の第９日目には、Ｍｕｓｅ−ＴＫ細胞とグリオーマ細胞の割合が１：１、１：４及び１：８の培養系において、グリオーマ細胞の死滅が観察された。さらに、図２の結果に基づいて、ＧＣＶ添加後の第５日目と第９日目に培養中のグリオーマ細胞を実際にカウントした結果を図３に示す。この結果からも分かるように、１：１〜１：８の細胞比までグリオーマ細胞の細胞増殖を減退させた。このように、Ｍｕｓｅ−ＴＫ細胞において、グリオーマ細胞に対するバイスタンダー効果が認められた。

実施例４：Ｍｕｓｅ−ＴＫ細胞によるグリオーマ細胞への遊走能の確認
実施例２に示されるように、Ｍｕｓｅ細胞は腫瘍周辺に集積する性質を有する。そこで、グリオーマ細胞（Ａ１７２及びＹＫＧ１）の培養上清を用いて、インビトロにおけるＭｕｓｅ細胞の遊走能を検討した。Ｍｕｓｅ細胞の遊走性をボイデンチャンバー法（Ｂｏｙｄｅｎ，Ｓ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．１１５，ｐ．４５３−４６６（１９６２））を用いて定量的に測定した。使用したボイデンチャンバーは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから市販されているＱＣＭＣｈｅｍｏｔａｘｉｓＣｅｌｌＭｉｇｒａｔｉｏｎＡｓｓａｙＫｉｔ（ＱＣＭ２４ＷｅｌｌＣｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃＣｅｌｌＭｉｇｒａｔｉｏｎＡｓｓａｙ）を使用した。このボイデンチャンバーは、チャンバー内部に、８μｍの均一な微細孔を有するフィルターを底部に有するインサートを含む。インサートのフィルター上部にＭｕｓｅ細胞又は非Ｍｕｓｅ細胞を含む培養液を添加し、インサートの下部にグリオーマ細胞の培養上清を添加し、１８時間培養後、フィルターの微細孔を通過した細胞数をカウントした。その結果を図４に示す。「ＭｕｓｅＡ１７２」及び「ＭｕｓｅＹＫＧ−１」の系において、Ｍｕｓｅ細胞は、微細孔を通過して、顕著にインサート下部に移動した。一方、非Ｍｕｓｅ細胞に対してグリオーマ細胞の培養上清を用いた場合、及びこの培養上清の代わりにＤＭＥＭを用いた場合には、Ｍｕｓｅ細胞の移動能は発揮されなかった。このように、グリオーマ細胞の培養上清中には、Ｍｕｓｅ細胞の遊走能を活性化する何らかの因子が存在することが示唆され、インビボにおいては、この因子によってＭｕｓｅ細胞の脳腫瘍への集積を促しているものと考えられる。

実施例５：インビボにおける腫瘍形成抑制効果の検証
実施例１において作製したＭｕｓｅ−ＴＫによるバイスタンダー効果をインビボにおいて確認した。Ｍｕｓｅ−ＴＫ細胞とルシフェラーゼ遺伝子が導入されたＵ８７−ｌｕｃ２細胞（グリオーマ細胞株）をヌードマウス（雄性８週齢）の右脳内に同時移植した。より具体的には、移植されるＭｕｓｅ−ＴＫ細胞及びＵ８７−ｌｕｃ２細胞の細胞数は、それぞれ２．５×１０^４個及び１０×１０^４個（１：４）とした。上記細胞を脳内に移植後（０日）、翌日（１日目）から、ガンシクロビル（ＧＣＶ）（Ｗａｋｏ）をＰＢＳにより希釈して５ｍｇ／ｍｌとし、マウス１匹あたり１回１ｍｇ／２００μｌＰＢＳを１日２回、１０日間、腹腔内に投与した。対照として、ＧＣＶの代わりにＰＢＳを投与した群、及びＭｕｓｅ−ＴＫ細胞の非移植群（Ｕ８７−ｌｕｃ２細胞のみ）を用いた。細胞移植後から１日目、及び移植後から７日目ごとに、ＩＶＩＳ２００を使用し、Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｍａｇｉｎｇ（ＢＬＩ）にて腫瘍形成（増大又は縮小）過程を観察した。その結果を図５に示す。腫瘍形成については３５日目まで観察したが、対照群であるＰＢＳ投与群（２段目及び４段目）、及びＭｕｓｅ−ＴＫ細胞の非移植群（３段目）では、経時的に脳腫瘍の増大が見られた。一方、Ｍｕｓｅ−ＴＫ細胞＋ＧＣＶ群（１段目）では、移植後の７日目より脳腫瘍の形成が抑制され、３５日目では脳腫瘍はほとんど消滅していた。実験した４群のそれぞれについて、ルシフェラーゼによる蛍光強度を経時的に測定した場合においも、上記と同様に、Ｍｕｓｅ−ＴＫ細胞＋ＧＣＶ群において蛍光強度の顕著な低下が見られた（データ示さず）。さらに、上記マウスの生存率を検討するためにＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線を作製した。その結果、移植後の５４日目において、Ｍｕｓｅ−ＴＫ細胞＋ＧＣＶ群では、実験に使用した全てのマウスは生存していたが、その他の３群については、３１〜３７日目において全てのマウスは腫瘍死した（データ示さず）。これらの結果より、インビボにおいてもＭｕｓｅ−ＴＫ細胞によるグリオーマ細胞に対するバイスタンダー効果が確認された。

本発明の細胞製剤は、脳腫瘍の対象に投与することにより、自殺遺伝子を導入したＭｕｓｅ細胞が脳腫瘍周辺に集積し、さらに自殺遺伝子に対応するプロドラッグの投与により、脳腫瘍を構成する細胞を死滅させることができ、脳腫瘍の治療に応用できる。

本明細書に引用する全ての刊行物及び特許文献は、参照により全体として本明細書中に援用される。なお、例示を目的として、本発明の特定の実施形態を本明細書において説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の改変が行われる場合があることは、当業者に容易に理解されるであろう。

Claims

自殺遺伝子を導入した多能性幹細胞を含む、脳腫瘍を治療するための細胞製剤であって、ここで、該多能性幹細胞は、生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞から分離されたＳＳＥＡ−３陽性細胞であり、該細胞製剤は、脳腫瘍を死滅させる又はその増殖を阻害する薬物のプロドラッグとともに使用され、該プロドラッグは、前記自殺遺伝子の発現によって生成する酵素の基質である細胞製剤。
脳腫瘍を構成するグリオーマ細胞を治療対象とする、請求項１に記載の細胞製剤。
前記多能性幹細胞が、ＣＤ１０５陽性である、請求項１又は２に記載の細胞製剤。
前記多能性幹細胞が、ＣＤ１１７陰性及びＣＤ１４６陰性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞製剤。
前記多能性幹細胞が、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＮＧ２陰性、ＣＤ３４陰性、ｖＷＦ陰性、及びＣＤ２７１陰性である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞製剤。
前記多能性幹細胞が、ＣＤ３４陰性、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＣＤ２７１陰性、ＮＧ２陰性、ｖＷＦ陰性、Ｓｏｘ１０陰性、Ｓｎａｉ１陰性、Ｓｌｕｇ陰性、Ｔｙｒｐ１陰性、及びＤｃｔ陰性である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞製剤。
前記多能性幹細胞が、以下の性質の全てを有する多能性幹細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞製剤：
（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ。
前記多能性幹細胞が、脳腫瘍部位に集積する能力を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞製剤。
前記自殺遺伝子が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）遺伝子又はニトロレダクターゼ遺伝子である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞製剤。
前記プロドラッグが、自殺遺伝子がＨＳＶｔｋ遺伝子である場合はガンシクロビル（ＧＣＶ）、アシクロビル、ペンシクロビル、ＰＭＥＡアデフォビル又はＰＭＰＡテノフォビルであり、自殺遺伝子がシトシンデアミナーゼ遺伝子の場合は５−フルオロシトシンであり、自殺遺伝子がウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子の場合は５−フルオロウラシルであり、自殺遺伝子がｇｐｔ遺伝子の場合は６−チオキサンチン又は６−チオグアニンであり、自殺遺伝子がニトロレダクターゼ（ｎｔｒ）遺伝子の場合はプロドラッグはＣＢ１９５４である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞製剤。