KR20190035596A

KR20190035596A - 뇌척수액을 포함하는 줄기세포 투여 제형 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR20190035596A
Application number: KR1020180115348A
Authority: KR
Inventors: 나덕렬; 장종욱; 이정민
Original assignee: 사회복지법인 삼성생명공익재단
Priority date: 2017-09-25
Filing date: 2018-09-27
Publication date: 2019-04-03
Also published as: WO2019059741A1; KR102188572B1

Abstract

줄기세포 투여 제형 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 일 양상에 따른 줄기세포 투여 제형 및 그의 제조 방법에 의하면, 면역적인 측면에서 안전할 뿐만 아니라, 줄기세포성을 유지하면서 환자 맞춤형으로 줄기세포의 유전자 또는 단백질 발현이 변화하거나, 유전자 또는 단백질 발현이 더 활성화되는 효과가 있다.

Description

뇌척수액을 포함하는 줄기세포 투여 제형 및 그의 제조방법{Formulation for injection of stem cells containing cerebrospinal fluid and method for production}

줄기세포 투여 제형 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

줄기세포(stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포로, 만능줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류할 수 있다.

만능 줄기세포(totipotent stem cell)는 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로 난자와 정자의 수정 이후 8세포기까지의 세포가 이러한 성질을 가지며, 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있다. 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells)는 외배엽, 중배엽, 내배엽층 유래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로, 수정 4-5일 후 나타나는 배반포(blastocyst)의 안쪽에 위치한 내세포괴(inner cell mass)에서 유래하며 이를 배아 줄기세포라 하며 다양한 다른 조직세포로 분화되지만 새로운 생명체를 형성하지는 못한다. 다능성 줄기세포(multipotent stem cells)는 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 줄기세포이다.

대량으로 획득이 가능해진 줄기세포는 주로 난치병 등의 치료를 포함한 의학 분야 및 미용, 성형 등의 목적으로 줄기세포 자체를 주사하는 세포치료제로서의 이용이 늘어나고 있는 추세이다.

줄기세포를 보존하는 종래 기술로는, 인간 지방조직 유래 중간엽 줄기세포를 냉장조건에서 생리식염수에 부유하여 보관하는 기술이 있으나, 이 경우 48시간 이상 보관 시 70% 이상의 생존율을 나타내기 어렵다. 또한, 기존 줄기세포 치료제의 경우에는, 환자에 투여되기 위해 배양액 등이 사용되었다. 그러나, 이는 구성 성분, 첨가물의 비율 및 세포에 미치는 영향 등을 정확하게 분석하기 어려워 안전성의 검증에 있어 문제가 제기될 수 있다.

이에, 본 발명자들은 줄기세포의 투여 제형을 개발하기 위해 노력한 결과, 환자 유래 체액의 경우, 체내 구성 성분과 동일하며, 특히 환자 본인의 체액은 면역적인 측면에서 안전할 뿐만 아니라, 줄기세포성을 유지하면서 환자 맞춤형으로 줄기세포의 유전자 또는 단백질 발현이 변화하거나 유전자 또는 단백질의 발현이 더 활성화되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

일 양상은 뇌척수액을 포함하는 줄기세포 투여 제형을 제공하는 것이다.

다른 양상은 줄기세포 투여 제형의 제조를 위한 뇌척수액의 용도를 제공하는 것이다.

다른 양상은 뇌척수액 및 줄기세포를 포함하는 제형을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 질병을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

다른 양상은 질병의 치료를 위한 제제의 제조에 사용하기 위한 뇌척수액 및 줄기세포의 용도를 제공하는 것이다.

다른 양상을 줄기세포를 뇌척수액에 유지하는 단계를 포함하는 환자 맞춤형 줄기세포의 제조 방법, 또는 줄기세포 투여 제형의 제조방법을 제공하는 것이다.

상세하게는 상기 제형은 뇌척수액; 및 상기 뇌척수액에 부유된 줄기세포를 포함하는 줄기세포 투여 제형일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "뇌척수액"은 뇌 또는 척수에 존재하는 체액을 의미할 수 있다. 상세하게는 뇌에서 생성되어 뇌실과 거미막밑공간을 따라 뇌와 척수를 순환하는 액체일 수 있다. 뇌의 맥락얼기에서 생성되며 거미막밑공간의 거미막과립에서 분해, 흡수되어 항상 일정한 양이 유지된다. 뇌척수액은 뇌와 척수 주위를 순환하면서 외부의 충격에 대한 완충작용을 하고 호르몬과 노폐물 등의 물질 운반 역할을 하는 것일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 뇌척수액은 환자 유래 뇌척수액일 수 있다. 상세하게는 줄기세포를 투여하고자 하는 개체로부터 유래된 뇌척수액일 수 있다.

본 명세서에서, 줄기세포는 뇌척수액에 부유된 상태로 존재할 수 있다. 본 명세서에서 "부유된" 또는 "부유하다"는 세포(예를 들면, 줄기세포)가 배양을 위해 용기에 부착되지 않고, 환자에의 최종 투여를 위해 용기에 보관된 상태를 의미할 수 있다. 더욱 상세하게는, 3차원 배양을 위해 배양 용기에서 부유된 상태로 존재하는 줄기세포가 아닌 것일 수 있다. 따라서, 상기 줄기세포는 GMP 공정 내에서 QC가 완료된 세포일 수 있다. 즉, 줄기세포는 GMP 시설 내에서 배양 배지에서 배양된 후, QC(Quality control) 과정을 거쳐, 환자에 투여되기 위한 제형으로 제조된다. 이 때, 기존의 기술은, 환자에 투여되기 위한 최종 줄기세포는 배양 배지와 동일한 배지에서 보관된다.

일 구체예에 있어서, 상기 제형은 환자 맞춤형인 것일 수 있다. 상기 환자에 투여되기 위한 최종 줄기세포는 뇌척수액(예를 들면, 환자 유래)에 보관된다. 이렇게 함으로써, 줄기세포 투여 제형은 줄기세포성은 유지하고, 활성은 변화하지 않으면서, 환자 맞춤형으로 일부 유전자 또는 단백질의 발현이 변화할 수 있다. 상기 환자 맞춤형으로 변화하는 일부 유전자의 예로는 TNFα 등을 포함할 수 있다. 기존 배양 배지(예를 들면, MEMα 배지)에서 보관하는 경우에 비해 TNFα 유전자의 경우, 발현이 감소하는 것일 수 있다. 따라서, 일 구체예에 따른 제형 내의 줄기세포는 뇌척수액에 보관됨에 따라 줄기세포성은 유지하면서 줄기세포의 유전자 또는 단백질 발현은 환자 맞춤형으로 변화하거나 또는 더 활성화(예를 들면, 세포 재생능, 세포 이동능, 세포 부착능, 신생혈관능, 신경재생능과 관련된 유전자 또는 단백질의 활성화) 되는 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "줄기세포"는 다른 세포로의 분화능을 갖는 미분화 세포를 의미할 수 있다. 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포, 유도만능줄기세포, 또는 중간엽줄기세포일 수 있다. 상기 중간엽줄기세포는 다양한 조직, 다양한 인종, 또는 다양한 나이의 인간으로부터 분리된 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 중간엽줄기세포는 지방 조직 유래, 태반 유래, 제대혈 유래, 근육 조직 유래, 각막 조직 유래, 또는 골수 조직 유래의 중간엽줄기세포일 수 있다. 또한, 예를 들면, 상기 중간엽줄기세포는 지방줄기세포, 골수줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포, 태반줄기세포, 또는 제대혈줄기세포인 것일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 제형은 치료적 유효량의 줄기세포를 함유할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "치료적 유효량(treatment-effective amount)"은 줄기세포치료를 필요로 하는 환자, 또는 개체에서, 환자의 상태(예를 들면, 하나 이상의 증상)의 개선, 질병의 진행의 지연 등을 포함한 원하는 효과를 생성하기에 충분한 양을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 "치료하다(treat)"는 질병을 앓거나 또는 질병을 발병할 위험이 있는 개체에게, 상기 개체의 상태(예를 들면, 하나 이상의 증상)의 개선, 질병 진행의 지연, 증상 발생의 지연 또는 증상 진행의 둔화 등을 포함한 효과를 제공하는 임의의 형태의 치료 또는 예방을 의미한다. 따라서, 용어 "치료(treatment)"는 또한 증상의 발생을 예방하는 개체의 예방적 치료를 포함한다. 상기 치료적 유효량은 예를 들면, 1.0 x 10⁵ 내지 1.0 x 10⁸ 세포/kg(체중), 또는 1.0 x 10⁷ 내지 1.0 x 10⁸ 세포/kg(체중)일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 일 구체예에 따른 치료의 대상동물로서는, 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다.

일 구체예에 따른 제형은 유효성분으로서 줄기세포와 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 첨가물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 멸균수, 생리식염수, 관용의 완충제(인산, 구연산, 그 밖의 유기산 등), 안정제, 염, 산화방지제(아스코르브산 등), 계면활성제, 현탁제, 등장화제, 또는 보존제 등을 포함할 수 있다. 국소 투여를 위해, 생체고분자(biopolymer) 등의 유기물, 하이드록시아파타이트 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리락트산 중합체 또는 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 중합체 또는 공중합체 및 그의 화학적 유도체 등과 조합시키는 것도 가능할 수 있다. 일 구체예에 따른 제형은 주사에 적당한 제형으로 조제되는 경우에는, 줄기세포가 약학적으로 허용가능한 담체 중에 용해되어 있거나 또는 용해되어 있는 용액상태로 동결된 것일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 제형은 뇌척수액 0.5 내지 10 ml 당 1x10⁵ cells 내지 1 x 10⁸ cell 또는 1x10⁵ cells 내지 1 x 10⁷ cell의 줄기세포를 포함하는 것일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 제형은 질병의 치료를 위한 것일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 본 명세서는 뇌척수액 및 치료적 유효량의 줄기세포를 포함하는 제형을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 질병을 치료하는 방법을 제공한다.

일 구체예에 따른 줄기세포, 예를 들면, 중간엽 줄기세포는 항염증, 혈관 재생, 및 신경 재생 효과를 갖는 것일 수 있다. 따라서, 상기 제형은 염증성 질환, 허혈성 질환, 및/또는 신경계 질환을 포함하는 다양한 질환의 예방 또는 치료를 위한 세포 치료제에 유용하게 사용될 수 있다. 상기 허혈성 질환의 예는 허혈성 뇌졸중, 심근경색, 허혈성 심장질환, 허혈성 뇌질환, 허혈성 심부전, 허혈성 장염, 허혈성 혈관질환, 허혈성 안질환, 허혈성 망막증, 허혈성 녹내장, 허혈성 신부전, 또는 허혈성 하지질환을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 "허혈성 뇌졸중(ischemic stroke)" 또는 "뇌졸중(stroke)"은 뇌혈류 감소가 일정 시간 이상 지속되어 뇌조직 또는 세포의 괴사로 인해 발생하는 질병을 의미할 수 있으며, "뇌경색(cerebral infarction)"과 호환적으로 사용될 수 있다. 상기 신경계 질환의 예는, 신경퇴행성 질환을 포함할 수 있다. 상기 신경퇴행성 질환의 예는 척수 손상, 다발성 경화증, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 전두측두엽 치매(Frontotemporal dementia), 진행성 핵상 마비(Progressive supranuclear palsy), 피질기저핵변성(corticobasal degeneration), 피크병(Pick's disease), 또는 권투선수 치매 (Dementia pugilistica, DP)를 포함할 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 제형은 목적하는 효과를 얻기 위한 개체의 병소에 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 제형은 뇌 내 투여 제형인 것일 수 있다.

다른 양상은 줄기세포의 투여 제형 제조 방법을 제공한다.

상기 방법은 줄기세포를 뇌척수액 내 부유되도록 유지하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 유지하는 단계는 생체 외에서 수행되는 것일 수 있다.

또한, 상기 줄기세포는 줄기세포성은 유지하면서 줄기세포의 유전자 또는 단백질 발현이 환자 맞춤형으로 변화하거나, 유전자 또는 단백질 발현이 활성화되는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 유전자 또는 단백질의 변화에 대해서는 상기한 바와 같다. 따라서, 상기 줄기세포의 투여 제형 제조 방법은 환자 맞춤형 줄기세포의 투여 제형 제조 방법이거나, 또는 유전자 또는 단백질(예를 들면, 세포 재생능, 세포 이동능, 세포 부착능, 신생혈관능, 또는 신경재생능과 관련된 유전자 또는 단백질) 발현 또는 활성이 증가된 줄기세포의 투여 제형 제조 방법일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 유지하는 단계는 적어도 6시간 이상인 것일 수 있다. 상기 유지 시간은 줄기세포가 안정화되거나, 또는 환자 맞춤형으로 변화하는 시간, 예를 들면, 6 시간 내지 일주일, 또는 6시간 내지 3일 일 수 있다.

또한, 상기 유지는 줄기세포를 상온에서 보관하는 것일 수 있다. 상기 줄기세포는 동결건조된 것일 수 있다.

일 양상에 따른 줄기세포 투여 제형 및 그의 제조 방법에 의하면, 면역적인 측면에서 안전할 뿐만 아니라, 줄기세포성을 유지하면서 환자 맞춤형으로 줄기세포의 유전자 또는 단백질 발현이 변화하거나, 유전자 또는 단백질 발현이 더 활성화되는 효과가 있다.

도 1a은 일 구체예에 따른 탯줄 유래 중간엽줄기세포를 MEM 배지와 알츠하이머병 환자 유래 뇌척수액에서 유지시켰을 때의 세포의 생존능을 유세포 분석으로 확인한 도면이다.
도 1b는 일 구체예에 따른 탯줄 유래 중간엽줄기세포를 MEM 배지와 알츠하이머병 환자 유래 뇌척수액에서 유지시켰을 때의 세포의 생존능을 유세포 분석으로 확인한 결과를 정량화한 그래프이다.
도 2는 일 구체예에 따른 탯줄 유래 중간엽줄기세포의 생존능을 CCK-8 어세이로 확인한 그래프이다.
도 3a는 일 구체예에 따른 탯줄 유래 중간엽줄기세포의 줄기세포성을 확인하기 위한 양성 마커에 대한 유세포 분석 결과이다.
도 3b는 일 구체예에 따른 탯줄 유래 중간엽줄기세포의 줄기세포성을 확인하기 위한 음성 마커에 대한 유세포 분석 결과이다.
도 4a는 일 구체예에 따른 탯줄 유래 중간엽줄기세포의 분화능을 확인한 현미경 사진이다.
도 4b는 일 구체예에 따른 탯줄 유래 중간엽줄기세포의 분화능을 확인한 그래프이다.
도 5는 일 구체예에 따른 탯줄 유래 중간엽줄기세포의 RNA 발현 수준 변화를 나타낸 도면이다.
도 6은 일 구체예에 따른 탯줄 유래 중간엽줄기세포의 RNA 발현 수준 변화를 나타낸 도면이다; 녹색은 발현량 감소, 검정은 발현량 변화없음, 적색은 발현량 증가를 나타낸다.
도 7은 일 구체예에 따른 탯줄 유래 중간엽줄기세포의 RNA 발현 수준 변화를나타낸 도면이다.
도 8a은 일 구체예에 따른 환자 유래 뇌척수액에 보관된 탯줄 유래 중간엽줄기세포의 유전자 발현량을 정상인 유래 뇌척수액에 보관된 탯줄 유래 중간엽줄기세포와 비교한 결과이다; 적색: 유전자 발현 증가; 초록색: 유전자 발현 감소.
도 8b는 일 구체예에 따른 정상인 유래 뇌척수액에 보관된 탯줄 유래 중간엽줄기세포 대비 환자 유래 뇌척수액에 보관된 탯줄 유래 중간엽줄기세포에서 증가한 유전자를 벤다이어그램으로 나타낸 도면이다.
도8c는 일 구체예에 따른 환자 유래 뇌척수액에 보관된 탯줄 유래 중간엽줄기세포에서 증가한 유전자들의 기능을 종합적으로 분석한 표를 나타낸 도면이다.
도 9는 상기 도 8c에서 증가한 유전자들의 기능을 분석한 결과를 나타낸 도면이다; a: 세포 성분; b: 분자적 기능.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 중간엽 줄기세포의 분리

중간엽 줄기세포는 탯줄 유래 중간엽줄기세포를 사용하였다.

구체적으로, 정상적으로 분만한 건강한 산모로부터 사전에 충분한 설명에 근거한 동의(informed consent)를 받고, 첫 번째 분만의 제왕절개시에 약 15cm 내지 약 20cm의 탯줄을 분리하였다. 분리된 탯줄을 PBS로 2 내지 5회 세척하여 혈액을 제거하였다. 이후, 1.5cm정도 크기로 탯줄을 잘라내었고 와튼 젤리로부터 세포를 분리하기 위해, 각 조각을 포셉을 이용하여 혈관 내의 혈액을 제거하였다. 각 조각을 멸균된 가위로 자른 후, 제대혈을 제거하였다. 혈액을 감싸고 있는 젤라틴 조각을 1 내지 3 mm의 크기로 자른 후, 콜라게나제 Ⅰ을 첨가하여, 진탕 배양기 (shaking incubator)에서 반응시켰다. 분해된 조직을 여과기(strainer)를 이용하여 여과한 후, 10 % FBS (Biowest, Nuaille', France), 0.5 % 젠타마이신(10 mg/ml) (Gibco, NY, USA), 및 aMEM(a-modified Minimum Essential Media) (Gibco, NY, USA)을 함유하는 배양 배지에서 배양하였다. 배양 조건은 37℃, 및 5% CO₂조건을 유지하였다. 이후, 3일 내지 4일마다 배양 배지를 교체하여, 플라스크 바닥에 붙지 않은 세포를 제거하였다. 첫 계대 배양은 동물 유래 성분이 없는(Animal Component Free: ACF) 재조합 효소인 TrypLE과 플라스크 바닥에 부착된 세포를 37℃ 인큐베이터에서 약 3분 동안 반응시켜 중간엽 줄기세포를 회수하여 수행하였다.

실험예 1. 중간엽 줄기세포의 생존성 유지 분석

상기 실시예 1.에서 분리한 탯줄 유래 중간엽줄기세포를 MEM 배지를 함유하는 바이알(1.5 ml)에서 5.5 x 10⁶ cells로 보관하였고, 알츠하이머병 환자 유래 뇌척수액을 함유하는 바이알(1.5 ml)에서 5.5 x 10⁶ cells로 보관하여, 유세포 분석을 통해 확인하였다. 유세포 분석 결과를 도 1에 나타내었다. 모든 도면에서 CSF1 ~ CSF4는 알츠하이머병 환자 유래 뇌척수액의 식별번호이다.

또한, 추가적으로, CCK-8 어세이를 통해 세포의 생존능을 분석하였다. 구체적으로, 각 제형(MEM 배지, 및 뇌척수액) 부유시켜 유지하였던 중간엽줄기세포를 96 웰 플레이트에 웰당 3 x 10³ 세포로 분주하였고, 24시간 단위로, 72시간 동안 생존여부를 분석하였다. 세포 부착이 확인된 후에, CCK-8 용액(10ul)을 각 웰에 첨가하였고, 1시간 동안 37 ℃에서 배양하였다. CCK-8의 흡광도는 마이크로플레이트 리더(x-Mark^TM, Bio-Rad Laboratories, Inc)로 450 nm에서 분석하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 1a은 일 구체예에 따른 탯줄 유래 중간엽줄기세포를 MEM 배지와 알츠하이머병 환자 유래 뇌척수액에서 유지시켰을 때의 세포의 생존능을 유세포 분석으로 확인한 도면이다.

도 1b는 일 구체예에 따른 탯줄 유래 중간엽줄기세포를 MEM 배지와 알츠하이머병 환자 유래 뇌척수액에서 유지시켰을 때의 세포의 생존능을 유세포 분석으로 확인한 결과를 정량화한 그래프이다.

도 2는 일 구체예에 따른 탯줄 유래 중간엽줄기세포의 생존능을 CCK-8 어세이로 확인한 그래프이다.

도 1 및 2에 나타낸 바와 같이, 탯줄 유래 중간엽 줄기세포는 환자 유래 뇌척수액에 유지되어도, 세포의 생존능이 대조군과 비교하여 전혀 차이가 없음을 알 수 있다.

실험예 2. 중간엽 줄기세포의 줄기세포성 유지 분석

상기 실험예 1.과 동일한 방법으로 중간엽 줄기세포를 MEM 배지 및 환자 유래 뇌척수액에 유지하였고, 세포의 줄기세포성을 분석하였다.

줄기세포능에 대한 양성 표면 마커로서, CD90, CD73, CD105, CD166 를 사용하였고, 음성 표면 마커로서, CD14, CD11b, CD19, CD34, CD45, HLA-DR 를 사용하였다. 구체적으로, 유세포 분석을 위해 세포는 DPBS를 사용하여 세척 후, 2% FBS가 함유된 DPBS에 담아 CD90, CD73, CD105, CD166, CD14, CD11b, CD19, CD34, CD45, HLA-DR 마커를 아이스에서 20분간 반응시켰다. 이후, 유세포 분석기(FACS Calibur, Becton Bickinson)를 통해 표면 항원을 분석하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

또한, 줄기세포의 분화능을 아래와 같이 분석하였다.

지방세포 분화능 분석을 위해, 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 지방형성 분화 배지(Adipogenesis differentiation media)(StemPro® Adipogenesis Differentiation Kit, Life Technology)에 넣고 2주 동안 3일 간격으로 배지를 교환하면서 배양하였다. 그 후 배양액을 제거하고 Ca/Mg free DPBS로 세척한 다음 4% 파라포름알데하이드를 넣고 상온에서 15 분 동안 반응시켰다. 60% 이소프로판올을 넣어 세척한 다음 오일 레드 O(Oil Red O)를 넣고 10분 동안 반응시킨 후 정제수로 세척한 후 현미경 하에서 지방세포를 관찰하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

뼈세포 분화능 분석을 위해, 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 뼈형성 분화 배지(Osteogenesis differentiation media)(StemPro® Osteogenesis Differentiation Kit, Life Technology)에 넣고 2 주 동안 3일 간격으로 배지를 교환하면서 배양하였다. 그 후 배양액을 제고하고 Ca/Mg free DPBS로 세척한 다음 4% 파라포름알데하이드를 넣고 상온에서 15분 동안 반응시켰다. 반응이 끝나면 정제수를 넣어 세척한 다음 1% 실버 니트레이트 용액(silver nitrate solution)을 넣고 상온에서 5 분 동안 반응시킨 후 정제수로 세척한 후 5% 소듐 티오설페이트 용액(Sodium Thiosulfate solution)을 넣고 상온에서 5 분 동안 반응시켰다. 다음에, 정제수로 세척한 후, 0.1% 뉴클리어 패스트 레드 용액(nuclear Fast Red Solution)을 넣고 상온에서 5 분 동안 반응시켰다. 이후, 정제수로 세척하고 현미경하에서 칼슘 축적된 샘플을 분석하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

연골세포 분화능 분석을 위해, 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 연골형성 분화 배지(Chondrogenesis differentiation media)(StemPro® Chondrogenesis Differentiation Kit, Life Technology)를 넣고 뚜껑을 느슨하게 닫은 상태로 3 주 동안 3일 간격으로 배지를 교환하면서 배양하였다. 세포덩어리를 파라핀 블록(paraffin block)으로 만든 후 절단하고 알시안 블루(Alcian blue) 염색을 수행하였다. 이후, 광학현미경으로 푸른색으로 염색된 연골세포를 분석하였고, 그 결과를 도 4a에 나타내었고 그를 정량화하여 도 4b에 나타내었다.

도 3a는 일 구체예에 따른 탯줄 유래 중간엽줄기세포의 줄기세포성을 확인하기 위한 양성 마커에 대한 유세포 분석 결과이다.

도 3b는 일 구체예에 따른 탯줄 유래 중간엽줄기세포의 줄기세포성을 확인하기 위한 음성 마커에 대한 유세포 분석 결과이다.

도 4a는 일 구체예에 따른 탯줄 유래 중간엽줄기세포의 분화능을 확인한 현미경 사진이다.

도 4b는 일 구체예에 따른 탯줄 유래 중간엽줄기세포의 분화능을 확인한 그래프이다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 기존 제형으로 배양액인 MEM-a에 보관하였던 탯줄 중간엽줄기세포에 비해 알츠하이머병 환자 유래 뇌척수액(AD CSF)에 보관된 탯줄 중간엽줄기세포의 마커 발현은 유의적으로 변화하지 않음을 확인할 수 있었다.

또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 뇌척수액(AD CSF)에 보관된 탯줄 유래 중간엽줄기세포는 지방 세포, 뼈 세포, 및 연골 세포로의 분화 능력을 유지함을 확인할 수 있었다.

실험예 3. 중간엽 줄기세포의 유전자 발현 수준 분석

탯줄 유래 중간엽 줄기세포에서 발현하는 유전자를 분석하기 위하여 줄기세포로부터 RNA를 추출한 후, 라벨링 및 정제를 수행하였다. 라벨된 cDNA를 일루미나 발현 비드칩(Illumina Expression BeadChip)에 혼성화하고 결과를 도출하였으며, 데이터를 통계처리 후, 그 결과를 도 5 내지 도 7에 나타내었다.

확인한 RNA 발현 수준 분석 리스트 아래와 같다.

도 5에 나타낸 바와 같이, Stemness Markers: FGF2, INS, LIF, POU5F1, SOX2, TERT, WNT3A, ZFP42; MSC-Specific Markers: ALCAM, ANPEP, BMP2, CASP3, CD44, ENG, ERBB2, FUT4, FZD9, ITGA6, ITGAV, KDR, MCAM, NGFR, NT5E, PDGFRB, PROM1, THY1, VCAM1; Other Genes Associated with MSC: ANXA5, BDNF, BGLAP, BMP7, COL1A1, CSF2, CSF3, CTNNB1, EGF, FUT1, GTF3A, HGF, ICAM1, IFNG, IGF1, IL10, IL1B, IL6, ITGB1, KITLG, MITF, MMP2, NES, NUDT6, PIGS, PTPRC, SLC17A5, TGFB3, TNF, VEGFA, VIM, VWF; MSC Differentiation Markers; (i) Genes Involved in Osteogenesis: BMP2, BMP6, FGF10, HDAC1, HNF1A, KDR, PTK2, RUNX2, SMURF1, SMURF2, TBX5; (ii) Gene Involved in Adipogenesis: PPARG, RHOA, RUNX2; (iii) Gene Involved in Chondrogenesis: ABCB1, BMP2, BMP4, BMP6, GDF5, GDF6, GDF7, HAT1, ITGAX, KAT2B, SOX9, TGFB1; (iv) Gene Involved in Myogenesis: JAG1, NOTCH1; (v) Gene Involved in Tenogenesis (Tendon Development):BMP2, GDF15, SMAD4, TGFB1는 줄기세포성에 관한 것으로, 환자에 따라 크게 변화가 없는 것을 알 수 있었다.

그러나, 도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 일부 유전자, 예를 들면, TNFα에 대해서는 환자별로 발현 양상에 있어서 차이를 보이는 것을 알 수 있었다. 특히, 공통적으로 염증 관련 인자들의 감소가 확인되었다.

이상의 결과로, 환자 유래 뇌척수액에 보관하였을 시에, 탯줄 유래 중간엽 줄기세포의 유전자 발현이 환자 맞춤형으로 변화하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 추가적으로, 탯줄 중간엽줄기세포가 알츠하이머병 환자 뇌척수액에 노출되었을 때와 정상인 뇌척수액에 노출되었을 때, 세포의 RNA 발현 수준 변화를 비교하였다.

구체적으로, 정상인 유래 뇌척수액을 사용한 것만을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 중간엽줄기세포를 보관하였다. MeV 프로그램을 이용하여 상기 실험과 동일하게 중간엽줄기세포의 유전자 발현을 분석하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

또한, 상기 유전자 발현 분석 결과 각각 발현하는 유전자들이 어떠한 기능을 하는지 분석하기 위해 Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID )를 활용하였고, 그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9의 fold enrichment와 count는 결과에 보여지는 function에 관련된 유전자가 얼마나 많은지를 나타낸다. Count는 해당 function에 관여하는 유전자의 개수가 몇 개인지를 나타낸다. Fold enrichment는 분석이 진행된 전체 유전자 중에서 해당 function에 관여하는 유전자의 비율 / 알려진 human genome 에서 해당 function에 관여하는 유전자의 비율로 계산된다.

도 8a은 일 구체예에 따른 환자 유래 뇌척수액에 보관된 탯줄 유래 중간엽줄기세포의 유전자 발현량을 정상인 유래 뇌척수액에 보관된 탯줄 유래 중간엽줄기세포와 비교한 결과이다; 적색: 유전자 발현 증가; 초록색: 유전자 발현 감소.

도 8b는 일 구체예에 따른 정상인 유래 뇌척수액에 보관된 탯줄 유래 중간엽줄기세포 대비 환자 유래 뇌척수액에 보관된 탯줄 유래 중간엽줄기세포에서 증가한 유전자를 벤다이어그램으로 나타낸 도면이다.

도8c는 일 구체예에 따른 환자 유래 뇌척수액에 보관된 탯줄 유래 중간엽줄기세포에서 증가한 유전자들의 기능을 종합적으로 분석한 표를 나타낸 도면이다.

도 9는 상기 도 8c에서 증가한 유전자들의 기능을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 8에 나타낸 바와 같이 정상인 유래 뇌척수액에 노출된 탯줄 중간엽줄기세포과 환자 유래 뇌척수액에 노출된 탯줄 중간엽줄기세포 모두 유전자가 활성화 되어 있으나, 환자 유래 뇌척수액에 노출된 탯줄 중간엽줄기세포의 유전자가 정상 뇌척수액에 노출된 탯줄중간엽줄기세포에 비해 조금 더 많이 활성화된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 환자 유래 뇌척수액에서 공통적으로 활성화된 유전자도 많지만 각각에서 활성화된 유전자도 있는 것으로 보아 환자 특이적인 유전자 활성화 반응도 있는 것을 알 수 있었다. 이어서, 환자 유래 뇌척수액에 노출된 중간엽줄기세포에서 공통적으로 증가한 유전자의 기능을 분석한 결과 신호 펩티드, 성장 인자 활성, 또는 사이토카인 활성과 같이 분비된 인자에 의한 기능이 많이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 신생혈과, 세포 증식, 세포 이동, 세포 부착, 신경 형성 등과 같이 세포의 이동능, 재생능을 활성화시키는 기능이 많이 증가된 것을 확인할 수 있었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 세포 성분들이 세포 내에서 어디에 위치하는지를 확인한 결과, 대부분의 발현 증가 유전자들이 세포막에서 발현되거나 분비되어 세포 외부로 나가는 것을 확인할 수 있었다. 또한 분자적 기능은 다양한 성장 인자 활성, 세포 부착, 및 사이토카인 활성과 관련이 있음을 알 수 있었다. 상기의 결과는 일 구체예에 따른 뇌척수액에 보관된 중간엽 줄기세포가 여러 활성 단백질을 분비하여 세포치료제로서 사용될 수 있음을 의미한다.

Claims

뇌척수액; 및 상기 뇌척수액에 부유된, 치료적 유효량의 줄기세포를 함유하는 줄기세포의 투여 제형.
청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포인 것인 투여 제형.
청구항 1에 있어서, 상기 뇌척수액은 환자 유래인 것인 투여 제형.
청구항 1에 있어서, 상기 투여는 뇌 내 투여인 것인 투여 제형.
청구항 1에 있어서, 환자 맞춤형 제형인 것인 투여 제형.
청구항 1에 있어서, 뇌척수액 0.5 내지 10 ml 당 1x10⁵ cells 내지 1 x 10⁸ cell의 줄기세포를 포함하는 것인 투여 제형.
청구항 1에 있어서, 상기 줄기세포는 뇌척수액에 보관됨에 따라 줄기세포성은 유지하면서 줄기세포의 유전자 또는 단백질 발현이 환자 맞춤형으로 변화하거나 또는 더 활성화되는 것인 투여 제형.
청구항 1에 있어서, 신경계 질환의 치료를 위한 것인 투여 제형.
생체 외에서 줄기세포를 뇌척수액 내 부유되도록 유지하는 단계를 포함하는 환자 맞춤형 줄기세포의 투여 제형 제조 방법.
청구항 9에 있어서, 상기 줄기세포는 줄기세포성은 유지하면서 줄기세포의 유전자 또는 단백질 발현이 환자 맞춤형으로 변화하거나, 유전자 또는 단백질 발현이 더 활성화되는 단계를 더 포함하는 것인 제조 방법.
청구항 9에 있어서, 상기 유지하는 단계는 적어도 6시간 이상인 것인 제조 방법.
청구항 9에 있어서, 상기 뇌척수액은 환자 유래 뇌척수액인 것인 제조 방법.