CN109152801A

CN109152801A - 采用多能干细胞的围产期脑损伤的改善及治疗

Info

Publication number: CN109152801A
Application number: CN201780030062.9A
Authority: CN
Inventors: 佐藤义朗; 铃木俊彦; 清水忍; 水野正明; 早川昌弘; 出泽真理
Original assignee: INSTITUTE OF LIFE SCIENCES; Nagoya University NUC
Current assignee: INSTITUTE OF LIFE SCIENCES; Nagoya University NUC; Life Science Institute Inc
Priority date: 2016-05-16
Filing date: 2017-05-16
Publication date: 2019-01-04
Also published as: CA3024518C; SG11201810188VA; EP3459553A4; EP3459553A1; JP6994200B2; US20190290702A1; AU2017267809A1; CA3024518A1; KR20200127039A; WO2017199976A1; KR20180130578A; JPWO2017199976A1; AU2017267809B2

Abstract

本发明的目的在于提供在再生医疗中使用多能干细胞(Muse细胞)的新的医疗用途。本发明提供用于改善和治疗学习障碍和运动障碍等的围产期脑损伤的细胞制剂及医药组合物，其中，包含自活体的间充质组织或培养间充质细胞分离得到的SSEA‑3阳性的多能干细胞。本发明的细胞制剂基于通过向具有上述损伤的对象给予Muse细胞而植入损伤脑组织，改善和治疗上述损伤的机理。

Description

采用多能干细胞的围产期脑损伤的改善及治疗

技术领域

本发明涉及再生医疗中的细胞制剂。更具体来说，本发明涉及含有多能干细胞的对围产期脑损伤的治疗有效的细胞制剂及新的治疗方法。

背景技术

围产期脑损伤是指胎儿期和新生儿期发生的某种异常引发的脑麻痹、精神发育迟滞、癫痫、知觉功能障碍等脑损伤，关于其发生原因和病态尚有许多不明之处。近来，在围产期医学方面，关于胎儿的缺氧的研究取得进展，缺氧开始作为损伤因子受到重视。如果该缺氧加剧，则胎儿表现出各种各样的代谢反应，进而陷入代谢功能衰竭，发生脑等脏器的损伤，还可能导致死亡。于是，可认为预防分娩时的缺氧症状能够勉强预防脑麻痹等围产期脑损伤。然而，还认为也由于预防分娩时的缺氧困难，脑麻痹中的约20％出现缺氧的情况(非专利文献1)。

近年来，再生医疗领域中，针对各种各样的疾病对使用干细胞的细胞疗法进行了研究，在不断应用于临床的过程中，期待将干细胞适用于围产期脑损伤的改善和治疗(非专利文献2)。与围产期脑损伤相关的中枢神经疾病中，作为被期待临床应用的可能性的干细胞，已知胚胎干细胞(ES细胞)、神经干/祖细胞(NSPC)、诱导性多能干细胞(iPS细胞)、脐带血干细胞(UCBC)。至今为止，本发明人对于围产期缺氧缺血性脑病(HIE)模型大鼠向脑室内同时给予自大鼠胚胎脑培养并增殖而得的NSPC和硫酸软骨素分解酶，结果发现梗塞面积与未处理组及神经干细胞单独给予组相比显著减少(非专利文献3)。另外，本发明人向HIE模型大鼠的腹腔内给予UCBC，结果确认暂时性地减少了缺氧缺血性脑损伤。

此外，已知骨髓间充质细胞部分(MSC)分离自成体，具有分化成例如骨、软骨、脂肪细胞、神经细胞、骨骼肌等的能力(非专利文献4和5)。然而，MSC是包括各种细胞的细胞群体，其分化能力的本质还不清楚，治疗效果存在较大差异。此外，作为来自于成体的多能干细胞已报道有iPS细胞(专利文献1)，iPS细胞的确立不仅需要在作为间充质细胞的皮肤成纤维细胞部分中将特定的基因或特定的化合物导入体细胞这样非常复杂的操作，而且因为iPS细胞具有高肿瘤形成能力，所以临床应用存在巨大的障碍。

根据本发明人之一的出泽的研究，存在于间充质细胞部分、无需诱导操作即可获得的作为表面抗原表达SSEA-3(Stage-Specific Embryonic Antigen-3，阶段特异性胚胎抗原-3)的多能干细胞(Multilineage-differentiating Stress Enduring cells，多系分化持续应激细胞；Muse细胞)负责间充质细胞部分所具有的多能性，已知可应用于以组织再生为目的的疾病治疗。此外，已知Muse细胞可通过对间充质细胞部分以各种压力进行刺激来富集(专利文献2、非专利文献6)。然而，还没有明确将Muse细胞用于围产期脑损伤的改善和/或治疗并获得所期待的治疗效果的例子。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:日本专利特许第4183742号公报

专利文献2:国际公开第2011/007900号

非专利文献

非专利文献1:池田智明，脑与发育，43卷，206-210页，2011年

非专利文献2:佐藤义朗，围产期医学，41卷，1531-1536，2011年

非专利文献3:Sato，Y.等，Report Sci.，Vol.15，p.613-620(2008)

非专利文献4:Dezawa，M.等，J.Clin.Invest.，Vol.113，p.1701-1710(2004)

非专利文献5:Dezawa，M.等，Science，Vol.309，p.314-317(2005)

非专利文献6:Wakao，S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.108，p.9875-9880(2011)

发明内容

发明所要解决的技术问题

本发明的目的在于提供在再生医疗中使用多能干细胞(Muse细胞)的新的医疗用途。更具体来说，本发明的目的在于提供包含Muse细胞的对围产期脑损伤的治疗有效的细胞制剂及医药组合物、以及新的治疗方法。

解决技术问题所采用的技术方案

本发明人制备围产期缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)模型大鼠，缺氧处理起72小时后通过静脉注射给予了Muse细胞，结果发现围产期脑损伤(例如学习障碍、运动障碍)得到改善，从而完成了本发明。

即，本发明如下。

[1]一种用于改善和/或治疗围产期脑损伤的细胞制剂，其中，包含自活体的间充质组织或培养间充质细胞分离得到的SSEA-3阳性的多能干细胞。

[2]根据上述[1]所述的细胞制剂，其中，包含通过外部压力刺激富集了SSEA-3阳性的多能干细胞的细胞部分。

[3]根据上述[1]或[2]所述的细胞制剂，其中，所述多能干细胞为CD105阳性。

[4]根据上述[1]～[3]中的任一项所述的细胞制剂，其中，所述多能干细胞为CD117阴性且CD146阴性。

[5]根据上述[1]～[4]中的任一项所述的细胞制剂，其中，所述多能干细胞为CD117阴性、CD146阴性、NG2阴性、CD34阴性、vWF阴性且CD271阴性。

[6]根据上述[1]～[5]中的任一项所述的细胞制剂，其中，所述多能干细胞为CD34阴性、CD117阴性、CD146阴性、CD271阴性、NG2阴性、vWF阴性、Sox10阴性、Snai1阴性、Slug阴性、Tyrp1阴性且Dct阴性。

[7]根据上述[1]～[6]中的任一项所述的细胞制剂，其中，所述多能干细胞是具有以下的所有性质的多能干细胞：

(i)端粒酶活性低或无端粒酶活性；

(ii)具有分化为三胚层中的某一胚层的细胞的能力；

(iii)不显示肿瘤性增殖；以及

(iv)具有自我更新能力。

[8]根据上述[1]～[7]中的任一项所述的细胞制剂，其中，围产期脑损伤选自学习障碍、运动障碍、脑麻痹、行为失常、精神发育异常、知觉障碍、语言障碍、癫痫、吞咽困难、及呼吸调节异常。

[9]根据上述[1]～[8]中的任一项所述的细胞制剂，其中，所述多能干细胞具有植入脑组织的能力。

[10]根据上述[1]～[9]中的任一项所述的细胞制剂，其中，向人新生儿、婴儿或幼儿的对象，作为治疗上的有效量以约1×10⁵细胞/个体～约1×10⁸细胞/个体给予所述多能干细胞。

[11]根据上述[3]～[10]中的任一项所述的细胞制剂，其中，向人新生儿、婴儿或幼儿的对象，作为治疗上的有效量以对该对象一个体约3×10⁴细胞/kg～约3×10⁷细胞/kg进行体重换算而得的细胞量给予所述多能干细胞。

发明的效果

本发明可通过脑组织再生机理大幅地缩小围产期脑损伤，所述脑组织再生机理为对患有围产期脑损伤的对象(小儿)从静脉等给予Muse细胞，从而使其选择性地聚集于损伤脑组织，在该组织内Muse细胞分化成构成脑组织的细胞。

附图说明

图1表示确认给予HIE模型大鼠的Muse细胞植入脑组织的结果。

图2表示关于Muse细胞给予组(“Muse”)、仅添加细胞悬浮液(生理盐水)的组(“溶剂”)、及假手术组(“假”)的HIE模型大鼠的运动机能进行转棒试验的结果。

图3表示关于Muse细胞给予组(“Muse”)、仅添加细胞悬浮液(生理盐水)的组(“溶剂”)、及假手术组(“假”)的HIE模型大鼠的情感行为(多动性等)进行旷场试验的结果。

图4表示关于Muse细胞给予组(“Muse”)、仅添加细胞悬浮液(生理盐水)的组(“溶剂”)、及假手术组(“假”)的HIE模型大鼠的学习障碍的改善进行回避(shuttle avoidance)试验的结果。

图5表示关于Muse细胞给予组(“Muse”)、仅添加细胞悬浮液(生理盐水)的组(“溶剂”)、及假手术组(“假”)的HIE模型大鼠的记忆学习和视觉认知记忆的改善进行新对象识别试验的结果。

图6A表示关于Muse细胞给予组(“Muse”)、仅添加细胞悬浮液(生理盐水)的组(“溶剂”)、及假手术组(“假”)的HIE模型大鼠的运动机能改善进行圆筒试验(cylinder test)的结果。

图6B表示关于Muse细胞给予组(“Muse”)、仅添加细胞悬浮液(生理盐水)的组(“溶剂”)、及假手术组(“假”)的HIE模型大鼠的运动机能改善进行圆筒试验的结果。

图7表示关于Muse细胞给予组(“Muse”)、非Muse细胞给予组(“non Muse”)、仅添加细胞悬浮液(生理盐水)的组(“溶剂”)、及假手术组(“假”)的HIE模型大鼠的运动机能进行转棒试验的结果。

图8表示关于Muse细胞给予组(“Muse”)、非Muse细胞给予组(“non Muse”)、仅添加细胞悬浮液(生理盐水)的组(“溶剂”)、及假手术组(“假”)的HIE模型大鼠的情感行为(多动性等)进行旷场试验的结果。

图9表示关于Muse细胞给予组(“Muse”)、非Muse细胞给予组(“non Muse”)、仅添加细胞悬浮液(生理盐水)的组(“溶剂”)、及假手术组(“假”)的HIE模型大鼠的学习障碍的改善进行回避试验的结果。

图10表示关于Muse细胞给予组(“Muse”)、非Muse细胞给予组(“non Muse”)、仅添加细胞悬浮液(生理盐水)的组(“溶剂”)、及假手术组(“假”)的HIE模型大鼠的记忆学习和视觉认知记忆的改善进行新对象识别试验的结果。

图11表示关于Muse细胞给予组(“Muse”)、非Muse细胞给予组(“non Muse”)、仅添加细胞悬浮液(生理盐水)的组(“溶剂”)、及假手术组(“假”)的HIE模型大鼠的运动机能改善进行圆筒试验的结果。

图12表示对Muse细胞给予组(“Muse”)、非Muse细胞给予组(“non Muse”)的向HIE模型大鼠给予2周后的各组织中的植入量进行测定的结果。

具体实施方式

本发明涉及包含SSEA-3阳性的多能干细胞(Muse细胞)的用于改善和/或治疗围产期脑损伤的细胞制剂及医药组合物以及新的治疗方法。以下，对本发明进行详细说明。

1.适用疾病及其诊断

本发明使用包含SSEA-3阳性的多能干细胞(Muse细胞)的细胞制剂或医药组合物，以围产期脑损伤的改善及治疗为目标。一般来说，“围产期脑损伤”是指围产期(人类为妊娠22周至出生后未满7天的时期)发生的脑损伤，例如分娩时的缺氧缺血性脑病、或者病毒或细菌感染等继发的全身炎症反应综合征等相关的脑损伤。然而，本发明中，将由缺氧缺血性脑病导致的脑麻痹作为症状显现的时期(例如人类为满2～3岁)也作为适用范围。更具体来说，根据本发明，将围产期脑损伤，即人新生儿(出生后28天以内)、婴儿(出生后未满1年)、及幼儿(出生后1～6年)发生的脑损伤作为改善及治疗的对象。

“缺氧缺血性脑病”是指动脉血的缺氧和缺血导致的脑损伤，成为新生儿死亡、脑麻痹、智力迟钝的原因。原因在于胎儿期的母体的麻醉、心力衰竭、一氧化碳中毒导致的缺氧、腰椎麻醉或子宫降主动脉压迫导致的低血压、催产素(阵痛促进剂)过量给药导致的子宫复旧不全、脐带血流障碍、胎盘功能障碍、胎盘早期剥离等。此外，还由出生后的重度出血、休克状态、脑损伤、麻醉、外伤、先天性心脏疾病、肺功能障碍等的缺氧导致。对于成熟儿(人类是指在母胎内经过10个月后发育至可在胎外生活的状态后出生的体重约3000g、身高约50cm左右的新生儿)引发大脑皮质坏死或矢状旁区缺血，对于早产儿引发脑室周围白质软化或脑室内出血。重症病例伴有脑水肿。皮肤苍白、发绀、呼吸暂停、心动过缓、肌紧张低下、对刺激无反应为本症的征兆。有时出生后24小时以内发生脑水肿，导致脑干部压迫。预后差，造成死亡、脑麻痹、精神发育迟滞、重症身心残疾。

“脑麻痹”是指脑的发育期(人类为妊娠第13天至出生后48天)发生的不可逆性的脑损伤，具有非进行性病变，其症状基本为运动系统的功能障碍，大多在3岁前发病。具体来说，一般是指新生儿期前发生的脑损伤。关于其原因，根据发生损伤的时期分，有(a)作为出生前原因的胎内感染、胎盘功能障碍、胎儿期的脑血管障碍、遗传性等，(b)作为出生时原因的分娩时的机械损伤、脑出血、缺氧、缺氧、脑循环障碍等，(c)作为出生后原因的重症黄疸(核黄疸)、颅内感染症、脑出血等。分类根据麻痹的内容进行。肌紧张的内容有强直(痉挛)、僵硬、失调、手足徐动症(维持某个姿势或试图进行运动时出现的不随意运动)、无紧张等，麻痹的范围包括四肢麻痹、半身麻痹、两侧麻痹、下身麻痺、双重性偏瘫、单肌麻痹等。合并症状有智力障碍(包括学习障碍)、癫痫发作、脑神经障碍、言语障碍等。作为成熟儿的缺氧缺血性脑病导致的脑病变，认为多见大脑皮质层状坏死、基底核坏死、脑梗塞、白质软化、脑桥钩状回坏死，还可见脑干的坏死，临床上，基底核坏死成为手足徐动型脑麻痹的原因，脑梗塞成为四肢麻痹、半身麻痹的原因。脑干坏死大多预后不良而在婴儿期死亡，即使存活也造成吞咽困难和呼吸调节异常。

采用本发明的细胞制剂及医药组合物的改善和治疗的适用疾病的诊断中，低体温疗法被认为对新生儿的缺氧缺血性脑病有效，因此首先由医师按照低体温疗法适用基准流程图进行。更具体来说，根据出生时的神经学症状是否符合基准A(全身缺氧、缺血的客观观察结果)、接着的基准B(脑病的主观观察结果)中记载的各判断项目诊断。符合基准A和基准B的情况下，可诊断为存在围产期脑损伤。

基准A:怀孕36周以上出生，满足以下的至少一项

—出生后10分钟的阿普伽评分为5分以下

—需要10分钟以上的持续的新生儿复苏(气管插管、正压换气等)

—出生后60分钟以内的血液气体(脐带血、动脉、静脉、周围毛细血管)中pH低于7.0

—出生后60分钟以内的血液气体(脐带血、动脉、静脉、周围毛细血管)中碱缺失(Base deficit)为16mmol/L以上

满足适用基准A的情况下，对B的神经学诊断的异常的有无进行评价。

基准B:确认中度至重度的脑病(相当于Sarnat分级2级以上)、即意识障碍(嗜睡、迟钝、昏睡)和以下的至少一项(理想的是由对新生儿缺氧缺血性脑病精通的新生儿科医生或小儿神经科医生诊断)

—肌紧张低下

—包括“玩偶眼”反射或瞳孔反射异常的异常反射

—吸吮的减弱或消失

—临床痉挛

另外，为了获得脑的生理学观察结果，可根据需要使用例如头部超声成像诊断、MRI、CT、脑波、及激光多普勒血流仪。使用这些装置获得异常的观察结果的情况下，可诊断为存在围产期脑损伤。此外，可通过直接观察对象的学习障碍和运动障碍诊断是否是适用疾病。根据本发明，为了治疗上述的适用疾病，可向对象给予(以下也统称为“移植”)后述的细胞制剂及医药组合物，实现适用疾病的改善和/或治疗。在此，“改善”是指伴随围产期脑损伤的各种症状的缓和及发展的抑制，较好是缓和症状至对日常生活不产生影响的程度。此外，“治疗”是指抑制伴随围产期脑损伤的各种症状或使其完全消失。

2.细胞制剂及医药组合物

(1)多能干细胞

本发明的细胞制剂及医药组合物中所用的多能干细胞典型的是作为本发明人之一的出泽在人体内发现其存在并命名为“Muse(Multilineage-differentiating StressEnduring)细胞”的细胞。Muse细胞可从骨髓液、脂肪组织(Ogura F.等，Stem Cells Dev.，2013年11月20日(Epub)(发表于2014年1月17日))和真皮结缔组织等皮肤组织获得，也散布于各脏器的结缔组织。此外，该细胞为同时具有多能干细胞和间充质干细胞的性质的细胞，例如被鉴定为分别作为各自的细胞表面标记物的“SSEA-3(Stage-specific embryonicantigen-3，阶段特异性胚胎抗原-3)”和“CD105”的双阳性。因此，Muse细胞或包含Muse细胞的细胞群可例如以这些抗原标记物为指标从活体组织分离。此外，Muse细胞呈抗逆性，可从间充质组织或培养间充质细胞通过各种压力刺激富集。本发明的细胞制剂中还可使用通过压力刺激富集了Muse细胞的细胞部分。Muse细胞的分离法、鉴定法、及特征等详细内容揭示于国际公开第WO2011/007900号。此外，如Wakao等(2011，上述)所报道，已知从骨髓、皮肤等培养间充质细胞，将其用作Muse细胞的母群的情况下，SSEA-3阳性细胞全部为CD105阳性细胞。因此，本发明中的细胞制剂及医药组合物中，从活体的间充质组织或培养间充质干细胞分离Muse细胞的情况下，可单独将SSEA-3作为抗原标记物纯化Muse细胞后使用。另外，本说明书中，也将用于改善和/或治疗围产期脑损伤的细胞制剂及医药组合物中可使用的以SSEA-3为抗原标记物从活体的间充质组织或培养间充质组织分离的多能干细胞(Muse细胞)或包含Muse细胞的细胞群简略记作“SSEA-3阳性细胞”。此外，本说明书中，“非Muse细胞”是指活体的间充质组织或培养间充质组织所含的除“SSEA-3阳性细胞”以外的细胞。后述的实施例中，将按照关于人Muse细胞的分离及鉴定的国际公开第WO2011/007900号中所记载的方法从MSC除去SSEA-3及CD105阳性细胞的细胞群用作非Muse细胞。

具体来说，Muse细胞或包含Muse细胞的细胞群可单独使用针对作为细胞表面标记物的SSEA-3的抗体，或者同时使用分别针对SSEA-3及CD105的抗体，活体组织(例如间充质组织)分离。在此，“活体”是指哺乳动物的活体。本发明中，活体不包括受精卵或发育阶段在囊胚期之前的胚胎，但包括胎儿或含囊胚的囊胚期以后的发育阶段的胚胎。哺乳动物无限定，可例举人、猴等灵长类，小鼠、大鼠、兔、豚鼠等啮齿类，猫、狗、绵羊、猪、牛、马、驴、山羊、雪貂等。本发明的细胞制剂及医药组合物所使用的Muse细胞在从活体组织直接用标记物分离这点上与胚胎干细胞(ES细胞)和iPS细胞明显不同。此外，“间充质组织”是指骨、滑膜、脂肪、血液、骨髓、骨骼肌、真皮、韧带、肌腱、牙髓、脐带、脐带血等组织及存在于各种脏器的组织。例如，Muse细胞可从骨髓或皮肤、脂肪组织获得。例如，较好是采集活体的间充质组织，从该组织分离Muse细胞并使用。此外，可使用上述分离手段从成纤维细胞或骨髓间充质干细胞等培养间充质细胞分离Muse细胞。本发明的细胞制剂及医药组合物中，所使用的Muse细胞对于受体可以是自体细胞，也可以是异体细胞。

如上所述，Muse细胞或包含Muse细胞的细胞群可例如以SSEA-3阳性、及SSEA-3和CD105的双重阳性为指标从活体组织分离，已知人的成人皮肤包含各种类型的干细胞及前体细胞。然而，Muse细胞与这些细胞不同。这样的干细胞及前体细胞可例举皮肤来源前体细胞(SKP)、神经嵴干细胞(NCSC)、成黑素细胞(MB)、血管周围细胞(PC)、内皮前体细胞(EP)、脂肪来源干细胞(ADSC)。这些细胞可将固有的标记物的“不表达”为指标分离Muse细胞。更具体来说，Muse细胞可将选自CD34(EP及ADSC的标记物)、CD117(c-kit)(MB的标记物)、CD146(PC及ADSC的标记物)、CD271(NGFR)(NCSC的标记物)、NG2(PC的标记物)、vWF因子(血管性血友病因子)(EP的标记物)、SoxlO(NCSC的标记物)、Snail(SKP的标记物)、Slug(SKP的标记物)、Tyrpl(MB的标记物)及Dct(MB的标记物)的11个标记物中的至少1个，例如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个标记物的不表达作为指标进行分离。例如，虽然无限定，可将CD117及CD146的不表达作为指标进行分离，也能将CD117、CD146、NG2、CD34、vWF及CD271的不表达作为指标进行分离，还能将上述的11个标记物的不表达作为指标进行分离。

此外，本发明的细胞制剂及医药组合物中所使用的具有上述特征的Muse细胞可具有选自下述性质中的至少一个：

(i)端粒酶活性低或无端粒酶活性；

(ii)具有分化为三胚层中的某一胚层的细胞的能力；

(iii)不显示肿瘤性增殖；以及

(iv)具有自我更新能力。

本发明的一种形态中，本发明的细胞制剂及医药组合物中所使用的Muse细胞具有所有上述性质。在此，关于上述(i)，“端粒酶活性低或无端粒酶活性”是指例如使用TRAPEZEXL端粒酶检测试剂盒(Millipore公司)检测端粒酶活性的情况下，检测结果低或无法检出。端粒酶活性“低”是指例如具有与作为体细胞的人成纤维细胞同等程度的端粒酶活性，或者与Hela细胞相比具有1/5以下、较好是1/10以下的端粒酶活性。关于上述(ii)，Muse细胞具有在体外和体内分化为三胚层(内胚层系、中胚层系、及外胚层系)的能力，例如通过以体外进行诱导培养，可分化为肝细胞、神经细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、骨细胞、脂肪细胞等。此外，在体内移植到睾丸的情况下有时也显示出分化为三胚层的能力。另外，还具有通过用静脉注射移植到活体而迀移并植入受损伤的脏器(心脏、皮肤、脊髄、肝、肌肉等)，分化为与组织相对应的细胞的能力。关于上述(iii)，Muse细胞具有下述性质：悬浮培养时以约1.3天的增殖速度增殖，但悬浮培养时从1个细胞开始增殖，形成类胚体样细胞团，至14天左右增殖停止；但如果将这些类胚体样细胞团进行贴壁培养，则细胞增殖重新开始，从细胞团增殖的细胞逐渐扩散。另外，在移植到睾丸的情况下，具有至少半年时间不癌化的性质。此外，关于上述(iv)，Muse细胞具有自我更新(自我复制)能力。在此，“自我更新”是指能确认从通过从1个Muse细胞以悬浮培养方式进行培养而得的类胚体样细胞团中所含的细胞向三胚层性的细胞分化，同时通过将类胚体样细胞团的细胞再次以1个细胞进行悬浮培养，使其形成下一代的类胚体样细胞团，能确认由此重新开始的三胚层性的分化和悬浮培养中的类胚体样细胞团。自我更新进行1次或重复多次的循环即可。

此外，本发明的细胞制剂中所使用的包含Muse细胞的细胞部分可以是SSEA-3阳性及CD105阳性的多能干细胞富集的细胞部分，所述细胞部分可通过包括下述工序的方法获得：对活体的间充质组织或培养间充质细胞给予外源压力刺激，杀灭使除对该外源压力具耐性的细胞以外的细胞，回收存活的细胞；所述细胞部分具有以下的性质中的至少一个、较好是全部：

(i)SSEA-3阳性；

(ii)CD105阳性；

(iii)端粒酶活性低或无端粒酶活性；

(iv)具有分化为三胚层的能力；

(v)不显示肿瘤性增殖；以及

(vi)具有自我更新能力。

上述外源压力可以是蛋白酶处理、低氧浓度下的培养、低磷酸条件下的培养、低血清浓度下的培养、低营养条件下的培养、暴露于热冲击下的培养、低温下的培养、冻结处理、有害物质的存在下的培养、活性氧的存在下的培养、机械刺激下的培养、振荡处理下的培养、压力处理下的培养或物理冲击中的任一种或多种的组合。例如，采用上述蛋白酶的处理时间较好是为了给予细胞外源压力而进行合计0.5～36小时。此外，蛋白酶浓度为剥离贴壁于培养容器的细胞时、将细胞团分散为单一细胞、或从组织回收单一细胞时所用的浓度即可。蛋白酶较好是丝氨酸蛋白酶、天门冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、谷氨酸蛋白酶或N末端苏氨酸蛋白酶。另外，所述蛋白酶较好是胰蛋白酶、胶原酶或分散酶。

此外，本发明的细胞制剂中所使用的具有上述特征的Muse细胞如后所述，通过静脉给予等给予活体后，植入至损伤脑组织。然而，Muse细胞被认为可分化为构成该组织的细胞，改善和/或治疗围产期脑损伤。

(2)细胞制剂及医药组合物的制备及使用

本发明的细胞制剂及医药组合物无限定，使上述(1)中得到的Muse细胞或包含Muse细胞的细胞群悬浮于生理盐水或适当的缓冲液(例如磷酸缓冲生理盐水)而获得。该情况下，从自体或异体的组织分离的Muse细胞数少的情况下，在给予前培养细胞，使其增殖至获得规定的细胞浓度。另外，如已报道那样(国际公开第WO2011/007900号文本)，Muse细胞不会肿瘤化，从活体组织回收的细胞即使在未分化的状态下含有，癌化的可能性也低，安全。此外，回收的Muse细胞的培养无特别限定，可在通常的增殖培养基(例如含10％小牛血清的α-最低必需培养基(α-MEM))中进行。更具体来说，可参照国际公开第W02011/007900号，在Muse细胞的培养及增殖中，适当地选择培养基、添加物(例如抗生素、血清)等，制备包含规定浓度的Muse细胞的溶液。向作为对象的人类给予本发明的细胞制剂或医药组合物的情况下，可从人的髂骨采集数mL左右的骨髓液，例如作为来自骨髓液的贴壁细胞培养骨髓间充质干细胞，使其增殖至可分离有效的治疗量的Muse细胞的细胞量后，以SSEA-3的抗原标记物为指标分离Muse细胞，作为细胞制剂制备自体或异体的Muse细胞。或者，例如可将SSEA-3的抗原标记物为指标分离Muse细胞后，培养细胞而使其增殖至有效的治疗量后，作为细胞制剂制备自体或异体的Muse细胞。

此外，将Muse细胞用于细胞制剂及医药组合物的情况下，可使细胞制剂及医药组合物为了保护该细胞而含有二甲亚砜(DMSO)或血清白蛋白等，为了防止细菌的混入和增殖而含有抗生素等。另外，还可使细胞制剂及医药组合物含有制剂上允许的其他成分(例如载体、赋形剂、崩解剂、缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、无痛剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等)或者间充质细胞所含的Muse细胞以外的细胞或成分。本领域一般技术人员可将这些因子和药剂以适当的浓度添加于细胞制剂及医药组合物。

对于上述中制备的细胞制剂及医药组合物中含有的Muse细胞数，为了在围产期脑损伤的改善和/或治疗中获得所期望的效果(例如学习障碍的改善、运动障碍的改善)，可考虑对象的性别、年龄、体重、患部的状态、使用的细胞的状态等适当进行调整。后述的实施例3中，使用围产期缺氧缺血性脑病(HIE)模型大鼠，对通过Muse细胞移植得到的各种效果进行了探讨，通过对体重约15～20g的该模型大鼠以1×10⁴细胞/头(每一个体)给予SSEA3阳性细胞，获得了非常好的效果。根据该结果，期待通过向人新生儿(出生后28天以内)、婴儿(出生后未满1年)、或幼儿(出生后1～6年)的一个体给予对约3×10⁴细胞/kg～约3×10⁷细胞/kg进行体重换算而得的细胞量而获得良好的效果。例如，将婴儿的体重设为约3000g的情况下，作为给予量粗略计算认为约1×10⁵细胞/个体～约1×10⁸细胞/个体是有效的。另一方面，为了防止向血管的细胞给予导致阻塞，作为1次给予的量，例如以1×10⁷细胞/个体以下使细胞制剂含有SSEA-3阳性细胞即可。在此，个体包括大鼠、人，但并不仅限于此。此外，本发明的细胞制剂及医药组合物可多次(例如2～10次)以适当的间隔(例如1天2次、1天1次、1周2次、1周1次、2周1次)给予，直到获得所期望的治疗效果。因此，虽然也根据对象的状态而不同，但作为治疗上的有效量，较好是例如一个体1×10⁴细胞～1×10⁷细胞、1～10次的给予量。作为一个体的给予总量无限定，可例举1×10⁵细胞～1×10⁸细胞、1×10⁵细胞～5×10⁷细胞、1×10⁵细胞～1×10⁷细胞、1×10⁵细胞～5×10⁶细胞、1×10⁵细胞～1×10⁶细胞、5×10⁵细胞～1×10⁸细胞、5×10⁵细胞～5×10⁷细胞、5×10⁵细胞～1×10⁷细胞、5×10⁵细胞～5×10⁶细胞、5×10⁵细胞～1×10⁶细胞、1×10⁶细胞～1×10⁸细胞、1×10⁶细胞～5×10⁷细胞、1×10⁶细胞～1×10⁷细胞、1×10⁶细胞～5×10⁶细胞等。

本发明的细胞制剂及医药组合物以学习障碍和运动障碍等围产期脑损伤为改善和治疗对象，作为给予时期，为通过出生时的神经学症状、头部超声成像诊断或MRI等诊断为围产期脑损伤后，可以是自刚诊断起数月以内。另一方面，根据本发明，该细胞制剂等较好是在刚受损后给予，但即使是受损后的较晚时期，例如自受损起1小时后、1天后、1周后、1个月后、3个月后、6个月后，也可期待本发明的细胞制剂等的效果。此外，本发明人的实验中确认所使用的Muse细胞即使来自于异体的情况下也不会引发免疫应答，所以围产期脑损伤的改善和治疗中可适当给予至获得所期望的效果。另外，如后述的实施例3所示，使用HIE模型大鼠的基于Muse细胞的围产期脑损伤的改善中，进行了行为学评价，结果围产期脑损伤的改善存在长期(出生后5～6个月)的治疗效果比短期(出生后1个月)的治疗效果显著的倾向。

3.围产期缺氧缺血性脑病(HIE)模型大鼠的制备

本说明书中，为了探讨采用本发明的细胞制剂的围产期脑损伤(例如学习障碍、运动障碍)的改善和治疗效果，可构筑HIE模型大鼠并使用。作为该模型所使用的大鼠无限定，一般可例举Wistar/ST系大鼠、Sprague-Dawley(SD)系大鼠。制备HIE模型大鼠的方法是公知的方法，可例如按照Rice等(Ann.Neurol.,vol.9,131-141(1981)，通过参照援引于本说明书中)的方法制备HIE模型大鼠。此外，可通过二维图像激光血流仪或MRI对以上述方法制备的模型大鼠是否存在缺氧缺血性脑损伤进行梗塞灶评价。

本发明的细胞制剂及医药组合物中所使用的Muse细胞具有聚集于患部的性质。因此，细胞制剂或医药组合物的给予中，它们的给予部位(例如腹腔内、肌肉内、患部)、给予的血管种类(静脉和动脉)等无限定。此外，作为确认所给予的Muse细胞到达患部并植入的方法，例如制备预先引入基因而使其表达荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白质(GFP))的Muse细胞，给予活体后通过可检测荧光的系统(例如IVIS(注册商标)成像系统(“SummitPharmaceuticals International Corporation”住商株式会社))进行观察，确认Muse细胞的动态。另外，本发明的细胞制剂及医药组合物中所使用的Muse细胞来源于人，因此与大鼠为异种的关系。模型动物中给予异种的细胞等的实验中，为了异种细胞在活体内的排异反应，可在异种细胞给予前或同时给予免疫抑制剂(环孢素等)。

4.HIE模型大鼠中的基于Muse细胞的改善和治疗效果

本发明的实施方式中，本发明的细胞制剂及医药组合物可改善和/或治疗包括人的哺乳动物中的围产期脑损伤及伴随其的各种症状。如果采用本发明，可使用上述中制备的HIE模型大鼠，以实验方式探讨围产期脑损伤的大鼠中的基于Muse细胞的症状的改善等，评价该Muse细胞的效果。作为具体的评价方法，可使用利用大鼠评价脑功能的一般的实验体系进行，例如作为行为学的评价，可例举转棒试验(Rota Rod Test)、旷场试验(OpenField Test)、回避试验(Shuttle Avoidance Test)、新对象识别试验(Novel ObjectRecognition Test)、圆筒试验(Cylinder Test)、猫步试验(Cat Walk Test)、莫里斯水迷宮(Morris water maze)试验等。

“转棒试验”是使用测定受试动物所具有的运动机能的协调性和平衡感觉的装置的试验。具体来说，让受试动物上到具有可进行一定的加速的转棒的装置，从缓慢的旋转慢慢地不断加速。考察在该状态下受试动物不从转棒落下，能够跟着旋转行走的时间。通过反复进行试验，还可对运动学习功能进行检查。

“旷场试验”基于将受试动物放入新的一定的空间(例如60(W)×60(D)×40(H)cm的箱子)，观察受试动物的探索行为等情感行为。观察者在实际记录受试动物的行为的同时，还可用摄像机拍摄，采集数据、对活动性/易感性的指标(例如移动距离、静置时间、在中心的逗留率)进行评价。

“回避试验”是使用观察对于声音或光的受试动物的条件反射行为的装置的试验，可对学习障碍进行评价。该试验中，受试动物在一个房间内，发生声响，并亮灯发光后，向地板通电流，为了回避该电刺激，受试动物避难至其他房间。通过反复进行该试验，可对受试动物的学习障碍的有无进行评价。

“新对象识别试验”中，使受试动物在放有2个物体的空间内进行自由探索后，将一方换为新的物体，测定受试动物对新的物体的探索时间的增减，从而可以对记忆学习和视觉认知记忆进行评价。

“圆筒试验”中，将受试动物放入圆筒内，观察探索性地将前腿靠到圆筒壁上的自发动作的左右差，对运动功能障碍进行评价。

“猫步试验”中，使受试动物在内部照射LED的透明玻璃板上行走，根据从下方对根据内部全反射的原理仅使接触面发光的足迹进行摄影而得的图像，用电脑软件分析，可进行对受试动物的肢体动作和步行状态的评价。

通过以下的实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明并不受这些实施例的任何限定。

实施例

实施例1:围产期缺氧缺血性脑病(HIE)模型大鼠的制备和Muse细胞的给予

关于本研究中所使用的实验动物的实验方案得到了名古屋大学医学部动物实验委员会的认可。从日本SLC株式会社(日本，静冈县)购入Wistar/ST大鼠(幼崽)，放入可自由摄取饵料和水的笼内，在12小时明暗循环的条件下饲养。动物室和实验空间始终维持23℃。

HIE模型大鼠使用Wistar/ST大鼠(出生后7天)通过基于Rice等(Ann.Neurol.,vol.9,131-141(1981)中所记载的手法的方法进行制备。对各大鼠通过吸入异氟烷实施麻醉。然而，对左颈动脉进行双重结扎，将结扎间切除。在母鼠身旁休息1小时后，于37℃置于8％O₂的低氧环境下60分钟，再放回维持于23℃的动物室的母鼠身旁。72小时后，对于处置组，从右颈动脉给予Muse细胞(1×10⁴细胞/个体)。对照组中，与处置组同样地结扎左颈动脉，供于低氧状态，但仅给予同体积的生理盐水代替Muse细胞。假手术组未供于左颈动脉结扎和低氧状态。

实施例2:Muse细胞的制备和对脑组织的植入确认

按照关于人Muse细胞的分离及鉴定的国际公开第WO2011/007900号中所记载的方法获得了Muse细胞。对于移植所使用的Muse细胞，为了确认植入到脑组织，使其表达绿色荧光蛋白质(GFP)，细胞由此被标记，预先向Muse细胞中引入了慢病毒-GFP基因。将用GFP标记的Muse细胞或包含Muse细胞的细胞群作为GFP和SSEA-3的双重阳性细胞通过FACS进行分离。然后，如实施例1所记载，给予Muse细胞。

接着，确认给予了Muse细胞的20天龄的大鼠脑中Muse细胞植入到脑组织。对大鼠实施安乐死后，切除脑，按照常规方法制成脑组织的切片。使针对GFP的一次抗体进行反应，再使过氧化物酶标记的二次抗体进行反应。添加针对过氧化物酶的底物(3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐)，通过显色检测植入到脑组织的Muse细胞(图1)。图1的染色图像分别为对制成切片的脑组织(受损伤的左脑)的不同区域(1和2)进行了观察的图像。上段的以箭头表示的细胞为移植的Muse细胞。下段为未进行基于抗体的反应的阴性对照。由这些结果确认，从大鼠的颈动脉移植的Muse细胞植入到受脑损伤的脑组织。此外，同样地给予了Muse细胞和非Muse细胞后2周后对大鼠实施安乐死，检测各组织中植入了的Muse细胞(图12)。与给予了其他MSC的体系比较，可知Muse细胞更显著地植入到损伤脑组织。

实施例3:基于Muse细胞移植的围产期脑损伤改善的评价

移植了Muse细胞的HIE模型大鼠的行为学评价如下进行。

(1)转棒试验

作为测定受试动物所具有的运动功能的协调性和平衡感觉的装置使用一般已知的装置(UGO Basile公司制Rat Rota-Rod 47700)，考察了基于Muse细胞等的移植的围产期脑损伤的改善。该试验的评价中，测定从旋转的台上大鼠落下为止的时间，反复进行共4次，从而由落下为止的时间增加可见运动学习功能的改善，将此作为指标。经试验的HIE大鼠为涉及给予了Muse细胞的组、仅给予了生理盐水的组、及假手术组这3组，对短期(出生后1个月)和长期(出生后5～6个月)分别进行了评价。结果示于图2。不论短期还是长期，Muse细胞给予组与仅给予生理盐水的组(溶剂)相比，均可见运动学习障碍的功能改善(图2左)，长期的改善效果比短期更显著(图2右)。根据该结果，提示Muse细胞可实现作为围产期脑损伤之一的运动学习障碍功能的改善。

与上述同样，除给予Muse细胞的组、溶剂组、假手术组之外，还新增加给予非Muse细胞的组，对HIE大鼠(出生后5个月)进行了转棒试验。结果示于图7。给予Muse细胞的组中，可见运动学习障碍功能的改善，但新增加的给予非Muse细胞的组中，未见与溶剂同等程度的运动学习障碍功能的改善。这提示Muse细胞与非Muse细胞相比，对这样的运动学习障碍功能的改善显示更好的效果。

(2)旷场试验

将各种大鼠放入新的具有一定空间的箱内，对受试动物的情感行为(多动性等)进行了观察。用摄像机(室町机械株式会社制ANY-maze视频跟踪软件)拍摄受试动物的行动，对一定时间内的受试动物的移动距离、不动时间、及在中心部的逗留时间进行了测量(分别为图3的上段、中段、下段)。被置于新空间的大鼠因不安而移动距离加长，但该空间中因用药而移动距离减小。若比较各大鼠组，短期的情况下溶剂组与Muse组未见显著差异，长期的情况下，与溶剂组相比，Muse组中确认活动性的下降，假手术组中也可见同样的倾向。这提示通过Muse细胞的给予可改善受试动物的情感行为。

与上述同样，除给予Muse细胞的组、溶剂组、假手术组之外，还新增加了给予非Muse细胞的组，对HIE大鼠(出生后5个月)进行了旷场试验。结果示于图8，追加对受试动物的平均速度也进行了测定。对于该平均速度，置于新空间的大鼠的移动速度随着不安升高，另一方面，没有不安或不安少的情况下速度降低。给予Muse细胞的组中，所有的试验系中均可见显著的改善，但新增加的给予非Muse细胞的组中，未见与溶剂同等程度的情感行为的改善。这提示Muse细胞与非Muse细胞相比，对这样的情感行为的改善显示更好的效果。

(3)回避试验

为了评价各种大鼠的学习障碍改善，进行了回避试验。用于评价的装置为MedAssociates公司制MED-PC Version IV/MED-APA-DIM，按照常规方法对大鼠对电刺激的回避率共测定了5次(图4)。各组的大鼠对于刺激均学会对其回避，但在短期和长期的情况下Muse细胞组与溶剂组相比均确认显著的差异。此外，Muse细胞组的回避率与伪手术组为同等程度。根据该结果，提示通过Muse细胞的给予受试动物的学习障碍得到改善。

与上述同样，除给予Muse细胞的组、溶剂组、假手术组之外，还新增加给予非Muse细胞的组，对HIE大鼠(出生后5个月)进行了回避试验。结果示于图9。给予Muse细胞的组中，可见学习障碍的改善，但新增加的给予非Muse细胞的组中，未见与溶剂同等程度的学习障碍的改善。这提示Muse细胞与非Muse细胞相比，对这样的学习障碍的改善显示更好的效果。

(4)新对象识别试验

关于新对象识别试验，使用通常所采用的装置(室町机械株式会社制ANY-maze视频跟踪软件)进行。让各种大鼠在放有2个物体(熟悉物体)的空间内自由探索一定时间后，将一方换为新物体，测定该差异下大鼠对新的物体的探索时间。作为评价的指标，使用了DI(Discrimination Index，识别指数)(探索指向性)。具体来说，通过DI＝(TN-TF)/(TN+TN)(式中，TF:对熟悉物体的探索时间，TN:对新物体的探索时间)算出。DI的数值越高，则表示对该物体的兴趣越大。短期的情况下，Muse细胞组与溶剂组相比存在显著差异，但大多DI低于0，对新物体不显示兴趣。另一方面，长期的情况下，Muse细胞组与溶剂组相比存在显著差异，对新物体的兴趣升高至与假手术组同等程度(图5)。根据这些结果，提示了通过Muse细胞的给予，记忆学习和视觉认知记忆得到改善的可能性。

与上述同样，除给予Muse细胞的组、溶剂组、假手术组之外，还新增加给予非Muse细胞的组，对HIE大鼠(出生后5个月)进行了回避试验。结果示于图10。给予Muse细胞的组中，显示对新物体的兴趣高，但新增加的给予非Muse细胞的组中，未见给予Muse细胞的组那样显著的效果。这提示Muse细胞与非Muse细胞相比，显示提高这样的对新物体的兴趣的效果。

(5)圆筒试验

将各种大鼠放入圆筒内(直径20cm)，对健康侧(左前腿)和患侧(右前腿)确认探索性地将前腿靠到壁上的动作的左右差来进行。作为评价的指标，使用“非损伤前腿嗜好性(non-impaired paw preference)”。具体来说，通过非损伤前腿嗜好性(％)＝(R-L)/(R+L+B)×100(式中，R:右前腿的使用次数，L:左前腿的使用次数，B:两前腿的使用次数)算出。该值越高，则表示直立时使用右前腿(患侧)的频率越高。对于长期的结果示于图6A。该结果显示Muse细胞组与溶剂组相比存在显著差异，使用右前腿(患侧)的频率非常高。由此提示通过Muse细胞的给予运动功能得到改善。

若将图6A按照论文等中所使用的通常方式表示，则得到图6B。具体来说，通过非损伤前腿嗜好性(％)＝(L-R)/(R+L+B)×100(式中，R:右前腿的使用次数，L:左前腿的使用次数，B:两前腿的使用次数)算出。该值越高，则表示直立时使用左前腿(健康侧)的频率越高。

与上述同样，除给予Muse细胞的组、溶剂组、假手术组之外，还新增加给予非Muse细胞的组，对HIE大鼠(出生后5个月)进行了圆筒试验。该实验中，大鼠的健康侧为右前腿，患侧为左前腿。结果示于图11。给予Muse细胞的组中，可见运动功能的改善，但新增加的给予非Muse细胞的组中，未见与溶剂同等程度的运动功能的改善。这提示Muse细胞与非Muse细胞相比，对这样的运动功能的改善显示更好的效果。

工业上利用的可能性

本发明的细胞制剂及医药组合物可通过给予HIE模型大鼠而应用于学习障碍和运动障碍等围产期脑损伤的改善和治疗。

本说明书中引用的所有的刊物和专利文献通过参照整体援引于本说明书中。另外，为了示例而在本说明书中对本发明的特定的实施方式进行了说明，本领域一般技术人员应能理解在不超出本发明的主旨和范围的情况下可进行各种改变。

Claims

1.一种用于改善和/或治疗围产期脑损伤的细胞制剂，其中，包含自活体的间充质组织或培养间充质细胞分离得到的SSEA-3阳性的多能干细胞。

2.根据权利要求1所述的细胞制剂，其中，包含通过外部压力刺激富集了SSEA-3阳性的多能干细胞的细胞部分。

3.根据权利要求1或2所述的细胞制剂，其中，所述多能干细胞为CD105阳性。

4.根据权利要求1～3中的任一项所述的细胞制剂，其中，所述多能干细胞为CD117阴性且CD146阴性。

5.根据权利要求1～4中的任一项所述的细胞制剂，其中，所述多能干细胞为CD117阴性、CD146阴性、NG2阴性、CD34阴性、vWF阴性且CD271阴性。

6.根据权利要求1～5中的任一项所述的细胞制剂，其中，所述多能干细胞为CD34阴性、CD117阴性、CD146阴性、CD271阴性、NG2阴性、vWF阴性、Sox10阴性、Snai1阴性、Slug阴性、Tyrp1阴性且Dct阴性。

7.根据权利要求1～6中的任一项所述的细胞制剂，其中，所述多能干细胞是具有以下的所有性质的多能干细胞：

(i)端粒酶活性低或无端粒酶活性；

(ii)具有分化为三胚层中的某一胚层的细胞的能力；

(iii)不显示肿瘤性增殖；以及

(iv)具有自我更新能力。

8.根据权利要求1～7中的任一项所述的细胞制剂，其中，围产期脑损伤选自学习障碍、运动障碍、脑麻痹、行为失常、精神发育异常、知觉障碍、语言障碍、癫痫、吞咽困难、及呼吸调节异常。

9.根据权利要求1～8中的任一项所述的细胞制剂，其中，所述多能干细胞具有植入脑组织的能力。

10.根据权利要求1～9中的任一项所述的细胞制剂，其中，向人新生儿、婴儿或幼儿的对象，作为治疗上的有效量的以约1×10⁵细胞/个体～约1×10⁸细胞/个体给予所述多能干细胞。

11.根据权利要求1～10中的任一项所述的细胞制剂，其中，向人新生儿、婴儿或幼儿的对象，作为治疗上的有效量的以对该对象一个体约3×10⁴细胞/kg～约3×10⁷细胞/kg进行体重换算而得的细胞量给予所述多能干细胞。