JP2017531448A

JP2017531448A - Ｔ細胞前駆細胞を生成するための方法

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Publication number: JP2017531448A
Application number: JP2017537016A
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Inventors: マリーナカヴァッツァーナ; イザベルアンドレ−シュムッツ; シャンタルラグレル−ペイルー; サリマハサイン−ベイ−アビナ; クリスティアンライマン; シャプドレーヌコリーヌド
Original assignee: アシスタンスパブリック−ホピトーデパリ; フォンダシオンイマジネアンスティチュデマラディースジェネティクス; ユニベルシテパリデカルト; インスティチュートナショナルデラサンテエデラルシェルシュメディカル（インセルム）
Priority date: 2014-10-06
Filing date: 2015-10-05
Publication date: 2017-10-26
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Abstract

本発明は、細胞療法の分野、およびT細胞前駆細胞を生成するためのインビトロの方法に関連し、該方法は、CD34+細胞を、モチーフRGDSおよびCS-1とヘパリン結合ドメインとを含むフィブロネクチンの断片の存在下で、タンパク質IgGのFc領域に連結されたDelta様リガンド4の可溶性ドメインであるNotchリガンドを含有する培地に曝露する工程を含む。

Description

本発明は、細胞療法の分野、および特に、形質転換されたまたは形質転換されていない造血幹細胞移植の分野、ならびにそのような移植の後の免疫再構成に関連する。

造血幹細胞・前駆細胞（HSPC）の移植は、最も重篤な遺伝性免疫不全にとって、多数の悪性血液疾患にとって、および一定数の固形腫瘍にとって最良の治療選択肢と考えられている。

現在、部分的なHLA不適合性を伴う同種異系移植の状況において、漸増用量の選別されたCD34+ HSPCを、あらかじめ調整されたレシピエントへ注射することにより、移植片対宿主疾患（GVH）を有効に予防しながらドナー由来の移植片を移植することが可能である。それにもかかわらず、注射されたCD34+細胞からの新たなTリンパ球の分化には4か月の最小期間が必要であり、これらのTリンパ球は、現れて数か月後にやっと、感染症に対して防御的役割を果たすのに十分な数になる。

この緩徐な免疫再構成は、多数の感染性、特にウイルス性の合併症の原因であるが、また再発の原因でもあり、移植された患者の長期予後に影響を及ぼす。

さらに、他の治療プロトコルは、遺伝子治療アプローチ、すなわち形質導入されたHSPCの自己移植を使用し、ある特定の遺伝性免疫不全の処置においてその効力を実証してきている。HLA適合性ドナーが利用可能でない際に、同種異系CD34+ HSPC移植と比較したこの戦略の利点は、生存および罹患率の面で疑いの余地がない。それにもかかわらず、重篤な感染症を有するある特定の患者について、Tリンパ球区画の再構成は緩徐であり、正常レベルの循環Tリンパ球に決して到達しないことが、臨床経験により示されている。この特定の文脈と関連した罹患率および死亡率は高い。

関与する患者の数、およびこのタイプの移植の後の高い罹患率および死亡率のゆえに、移植後の免疫不全期間を減少させることを目的とする新たな療法の開発は十分に正当化される。

したがって、Tリンパ球分化経路に関与する前駆体（T細胞前駆細胞）を投与することによって、Tリンパ球の生成を加速することが重要である。

これらのT細胞前駆細胞は、CD34+ HSPCの分化に由来し、特に、Tリンパ球経路における分化のマーカーであるCD7+マーカーを呈する。それらはまた、他のマーカーも呈し得る。例を挙げると、Awong et al. (Blood 2009; 114:972-982)（非特許文献1）は、以下のTリンパ球前駆細胞を記載している：（CD34+/CD45RA+/CD7+）マーカーを呈する初期胸腺前駆細胞（ETP）、プロT1期の細胞（CD7++/CD5-）、プロT2期の細胞（CD7++/CD5+）、およびプレT期の細胞（CD7++/CD5+CD1a+）。HSPCはこのように、T細胞発生中にこれらの段階を通過しながら、これらのマーカーを逐次的に獲得する。

HSPC移植と同時のT前駆細胞の移植は、成熟した機能的なTリンパ球区画を迅速に産生することを可能にすると考えられ、結果として、患者がその免疫系の完全な再構成の前に最小レベルの免疫から恩恵を受けられるようにすることによって、重篤な感染症のリスクを予防すると考えられる。

さらに、臍帯血細胞よりもむしろ成体細胞を使用できることが重要であり、なぜなら、臍帯血細胞よりも成体細胞を取得する方がより容易かつ安価であり、成体細胞は同種異系移植においてより広く使用されているためである。

しかし、ヒトおよびマウスにおいて得られている、文献に公開されているデータは、胎児造血細胞（臍帯血を含む）と成体細胞との間の内因性の差を示している。これらの差は、生存、DNA損傷を修復する能力、増殖能力、および分化潜在能力（特に、Yuan et al. (Science. 2012 Mar 9; 335(6073):1195-200)（非特許文献2）を参照されたい）に関連しており、成体骨髄細胞は、種々の細胞タイプを生成する潜在能力の面で胎児細胞よりも効率が低いことを示している（Landsorp et al. (J Exp Med. 1993 Sep 1; 178(3):787-91)（非特許文献3）；Szilvassy et al. (Blood. 2001 Oct 1; 98(7):2108-15)（非特許文献4）；Frassoni et al. (Blood. 2003 Aug 1; 102(3):1138-41)（非特許文献5）；Liang et al. (Blood. 2005 Aug 15; 106(4):1479-87)（非特許文献6）；Six et al. (J Exp Med. 2007 Dec 24; 204(13):3085-93)（非特許文献7））。

Notchタンパク質は、数多くの環境シグナルに対する細胞応答を調節する膜貫通受容体である。哺乳動物において、4種類のNotch受容体（Notch1〜4）および5種類のリガンド（Delta様-1、3、および4、jagged1、jagged2）が記載されている（Weinmaster Curr Opin Genet Dev. 2000; 10:363-369（非特許文献8））。

Notchリガンドは、いくつかの名称を有する。例を挙げると、Delta様リガンド4リガンドは、
‐Delta様リガンド4（DLL4遺伝子の名称に対応する）、
‐または単純化によりDelta様-4もしくはDeltaリガンド4（略語DL-4）
と称され得る。

本出願において、Delta様-1およびDelta様-4のNotchリガンドは、それぞれ、DL1およびDL4またはDL-1およびDL-4と表され得る。DL-1およびDL-4リガンドの配列は、それぞれ、SEQ ID No. 1およびSEQ ID No. 2として特定されている。

Notch-1とDL-1またはDL-4リガンドとの相互作用は、初期Tリンパ球新生において重要な役割を果たすことが示されている。

例を挙げると、いくつかの研究グループが、造血前駆細胞を、例えば、DL-1リガンドまたはDL-4リガンドを形質導入したOP9またはTst-4間質細胞と共培養することによって、インビトロでマウスおよびヒトのT分化を誘導することに成功している。このように生成された前駆細胞が、放射線照射された免疫不全マウスへの移植後に成熟Tリンパ球の産生を可能にすることが示されている（特に、Zakrzewski et al., Nat Med 2006 12(9): 1039（非特許文献9）およびNat Biotech 2008 26(4): 453（非特許文献10）；Awong et al., Blood 2009 114 (5): 972（非特許文献1）；Meek et al., Blood 2010. 115:261-264（非特許文献11）を参照されたい）。

しかし、遺伝子改変したマウス間質の使用は、臨床状況において想定することができない。

間質細胞を使用せずにCD34+造血幹細胞からCD7+ Tリンパ球前駆細胞を生成し、かつその数を増加させるのを可能にする方法を開発することが課題である。好ましくは、造血幹細胞は、成体ドナーから単離されている。

OP9/DL1間質を臨床的により許容されるシステムで置き換えることを望んで、本発明者らは、種々の可溶性Notchリガンドを試験し、免疫グロブリンのFc断片と融合されたDL-4リガンドの可溶型（DL4/Fc）が、臍帯血CD34+前駆細胞からCD7+細胞を生成するのを可能にすることを実証した（Reimann et al., Stem Cells 2012; 30:1771-1780（非特許文献12））。

これらの研究により、DL4/Fcリガンドへの7日間の曝露は、数多くのCD7+CD34+/- T前駆細胞を取得するのを可能にすることが示されている。Notchの標的遺伝子およびTリンパ球分化に関与する遺伝子の発現についての生成された集団のTaqman-PCRによる定量解析により、表現型変化が、特に、pTα、Rag1、Il7Rα、およびBCL11bの増加、ならびに骨髄分化経路に関与する転写因子およびBリンパ球分化経路に関与する転写因子（特にPax5）の発現の減少を伴って、Tリンパ球分化経路へのコミットメントに対応したことが示されている。このように、DL4/Fc上で生成した集団は、表現型的および分子的に、ヒト胸腺において見出される集団に対応した。

これらの研究はまた、T細胞受容体遺伝子座の再配列の欠如も示している。培養において生成された前駆細胞のTリンパ球潜在能力が、インビトロおよびインビボで評定されている。インビトロでは、DL-1リガンドを発現するOP9間質上での二次培養における限界希釈条件の下でのTリンパ球潜在能力の定量により、培養していないCD34+ HSPCと比較して200倍よりも大きい増大が実証されている。インビボでは、この潜在能力が、4週間放射線照射されているか、または新生であるNOD/SCID/γc-/-マウスへこれらの細胞を注射することによって判定された。活動的な胸腺細胞新生は、培養していないCD34+細胞を注射されたマウスの13/19匹に見出されたのと比較して、DL4/Fc上で培養した細胞を注射されたマウスでは20/22匹に見出された。成熟Tリンパ球は、DL4/Fc上で培養した細胞のレシピエントにおいてのみ検出された。レパートリー研究および機能試験により、DL4/Fc T前駆細胞から生成されたTリンパ球は、ポリクローナルのレパートリーを呈し、機能的であったことが実証された。

これらの結果により、臍帯血CD34+細胞のDL4/Fcへの曝露は、インビトロでのTリンパ球発生の誘導、および数多くのT前駆細胞の生成を可能にすることが示される。加えて、生成された前駆細胞は、放射線照射された免疫不全マウスの移植後に、インビボでヒト胸腺細胞新生を促進する。このように、先行刊行物は、活動的な胸腺細胞新生にのみ言及したが、成熟ヒトT細胞が、移植のすぐ直後にこれらのマウスにおいて末梢に循環する。

しかし、このシステムは、いくつかの限界を有する：
1）定量的観点から、DL4/Fcシステムは、10⁶個の臍帯血CD34+細胞から6.5×10⁵個のT前駆細胞を取得することを可能にする。この数は、臍帯血移植を受ける成体にとって不十分であることが判明し得る。
2）DL4/Fc分子は、培養ディッシュのプラスチック上に固定化される。この固定化工程は、HSPCのTリンパ球経路へのコミットメントを可能にするために重要である。しかし、このシステムは、以下の面で3つの限界を有する：
‐固定化効率、
‐固定化された分子の半減期、
‐CD34+ HSPCの表面でのDL4/FcのそのNotch受容体への結合。

Delaney et al. (Nat Med. 2010 February; 16(2): 232)（非特許文献13）は、Notchリガンド（DL-1）の存在下での臍帯血幹細胞の培養を記載している。目的は、移植後に造血再構成を加速することであった。しかし、筆者が「前駆細胞」の数の増加に言及していること、および、この用語が実際に、多能性造血細胞、特に、骨髄性前駆細胞および幹細胞を反映していることが、注目されるべきである。細胞は、17〜21日間培養された。

Delaney et al.において引用されているOhishi et al. (J Clin Invest. 2002 Oct; 110(8):1165-74)（非特許文献14）もまた、移植中の胸腺および骨髄の再増殖の能力を増大させるための、インビトロでの臍帯血からの幹細胞の培養を記載している。細胞はここでも、17または18日間培養される。

しかし、これらの筆者は、成体ドナーからの幹細胞の使用も、これらの幹細胞を骨髄移植後の週に使用して、レシピエントに免疫防御を提供することを可能にするTリンパ球前駆細胞の集団を再構成するためのこれらの幹細胞の培養も、記載していない。

Kim and Roy (2009, 「Biological interactions on materials surfaces」中, 2009, Puleo and Bizios, 157-171ページ)（非特許文献15）は、幹細胞の分化を制御および方向付けするための、固定化されたリガンドを有する生体材料の使用を開示している。Delta様-4 Notchリガンドを呈するマイクロビーズの存在下での造血幹細胞の培養は、それらのTリンパ球への分化を補助する。細胞支持体上に固定化されたフィブロネクチンは、幹細胞増大を改善する。同様の結果が、例えば、RGDSおよびCS-1モチーフを含む固定化されたペプチドで得られる。

国際公開公報第2011/068962号（特許文献1）は、造血幹細胞からまたは前駆細胞からインビトロでTまたはNKリンパ球を分化させるための方法を記載している。Tリンパ球分化方法の第1段階により、DL1 Notchリガンドを発現する形質転換されたOP-9フィーダー細胞の層上で幹細胞を培養することによるTリンパ球前駆細胞の産生が可能になる。第1の実施例は、マウス骨髄幹細胞からのTリンパ球前駆細胞の生成を示す。

国際公開公報第2014/110353号（特許文献2）は、少なくとも1つの生体適合性基質に結合した骨誘導性Notchリガンドを含む組成物に関連する。また、少なくとも1つの生体適合性基質に結合した骨誘導性Notchリガンドを含む組成物を投与する工程により、骨組織形成を必要とする患者を処置するための方法にも関連する。

したがって、CD34+細胞から生成されるTリンパ球前駆細胞の量を改善するのを可能にする新規の方法を開発することが必要である。さらに、この方法はまた、同種異系移植または自己移植用の成体CD34+細胞に適用可能であり得る、形質導入されたCD34+ HSPC由来のものを含めて、Tリンパ球前駆細胞を取得することを可能にし、したがって、相対的に少ない数である臍帯血細胞に打ち勝つことを可能にするはずである。

国際公開公報第2011/068962号国際公開公報第2014/110353号

Awong et al. (Blood 2009; 114:972-982) Yuan et al. (Science. 2012 Mar 9; 335(6073):1195-200) Landsorp et al. (J Exp Med. 1993 Sep 1; 178(3):787-91) Szilvassy et al. (Blood. 2001 Oct 1; 98(7):2108-15) Frassoni et al. (Blood. 2003 Aug 1; 102(3):1138-41) Liang et al. (Blood. 2005 Aug 15; 106(4):1479-87) Six et al. (J Exp Med. 2007 Dec 24; 204(13):3085-93) Weinmaster Curr Opin Genet Dev. 2000; 10:363-369 Zakrzewski et al., Nat Med 2006 12(9): 1039 Zakrzewski et al., Nat Biotech 2008 26(4): 453 Meek et al., Blood 2010. 115:261-264 Reimann et al., Stem Cells 2012; 30:1771-1780 Delaney et al. (Nat Med. 2010 February; 16(2): 232) Ohishi et al. (J Clin Invest. 2002 Oct; 110(8):1165-74) Kim and Roy (2009, 「Biological interactions on materials surfaces」中, 2009, Puleo and Bizios, 157-171ページ)

本発明者らは、CD34+細胞をNotchリガンドに、RGDSモチーフ（SEQ ID No. 3、アルギニン‐グリシン‐アスパラギン酸‐セリン）、および／またはCS-1モチーフ、ならびに任意でヘパリン結合ドメインを含有するフィブロネクチン断片の存在下で曝露することによって、該CD34+細胞からのT細胞前駆細胞の量を改善するのが可能であることを示している。好ましくは、前記フィブロネクチン断片は、RGDSモチーフ、CS-1モチーフ、およびヘパリン結合ドメインを含有する。

CD34+細胞のNotchリガンドおよびこのフィブロネクチン断片へのこの共同曝露（joint exposure）によりまた、形質導入されたCD34+細胞のTリンパ球経路に向かう分化を誘導し、それによって遺伝子治療における移植のためのプロセスの使用を可能にする。

観察される効果は、フィブロネクチン断片中のRGDSモチーフおよび／またはCS-1モチーフの存在によると考えられる。したがって、以下に記載されるプロセスおよび方法はまた、フィブロネクチン断片の代わりにRGDSペプチドおよび／またはCS-1ペプチドを使用する際にも適用可能である。しかし、特に同じタンパク質内のRGDSおよびCS-1ペプチドの共同使用が、好ましい。

RGDSペプチドおよび／またはCS-1ペプチドが使用される場合、それらはしたがって、それ自体で培養培地中に存在することができるか、または、該培地中に存在するペプチドまたはタンパク質内に存在することができる。培養培地が、RGDSペプチドおよび／またはCS-1モチーフ自体のみを含有する際に、このペプチドが容器の下壁に固定化されていない場合は、該培地中に「遊離している」発現ペプチドが使用されることになる。実際に、ペプチドは、溶液中に存在していてもよく、または、CD34+細胞のNotchリガンドへの曝露が実施される容器の下壁に固定化されていてもよい。

好ましい態様において、本発明は、T細胞前駆細胞を生成するための方法（またはプロセス）であって、CD34+細胞を、Notchリガンドをフィブロネクチン断片の存在下で含有する培地において曝露する工程を含む方法に関連する。Notchリガンドは、支持体上に固定化されている。フィブロネクチン断片は、RGDSモチーフ、CS-1モチーフ、およびヘパリン結合ドメインを含有する。

本発明による方法は、容器（細胞培養ディッシュ（ペトリディッシュ、24ウェルプレートなど））中でNotchリガンドが固定化されている下壁の上で、インビトロで実施される。Notchリガンドはまた、反応培地中に存在する任意の他の支持体上に、特にマイクロビーズの表面に固定化することもできる。Notchリガンドの固定化の目的は、本質的には、Notch受容体を活性化させるようにリガンドを安定化することである。

「T細胞前駆細胞」という用語は、CD34+ HSPCからTリンパ球経路に向かう分化のための経路にコミットした任意の細胞を表すことが意図される。この細胞は、したがって、T細胞リンパ球新生中に最も初期であるように見えるマーカーの1つであることが公知である、CD7マーカーを発現することを特徴とする。Tリンパ球経路における分化の状態に応じて、それは、CD34マーカーを発現してもよく、または発現しなくてもよい（分化中のCD34の喪失）。

「T細胞前駆細胞」の中で、出生後の胸腺において見出すことができる細胞、すなわち、初期胸腺前駆（ETP）細胞（CD34+/CD45RA+/CD7+）、プロT1細胞（CD34+CD45RA+CD7++CD5-CD1a-）、プロT2細胞（CD34+CD45RA+CD7++CD5+CD1a-）、およびプレT細胞（CD34-CD7++/CD5+CD1a+）に言及がなされる。これらの細胞は、先行技術分野において周知である。それらは、特に、Reimann et al.（2012、前掲書）およびAwong et al.（2009、前掲書）によって言及されている。

「RGDSペプチド」という用語は、VLA-5インテグリン（本明細書における下文を参照されたい）に結合することができるように、RGDSモチーフを含有する任意のペプチドまたは任意のタンパク質を表すことが意図される。そのようなペプチドまたはそのようなタンパク質は、当技術分野において広く記録されている方法により、フィブロネクチンとこのVLA-5インテグリンとの相互作用を排除するその能力によって試験することができる。

RGDSペプチドは、CD49e（α5）およびCD29（β1）から構成される二量体である、VLA-5（再晩期抗原（Very Late Antigen）-5）インテグリンに結合する。

ヘパリン結合ドメインは、当技術分野において公知であり、多くのヘパリン結合タンパク質に存在する。それらは、概して、XBBXBXおよびXBBBXXBX（B＝塩基性アミノ酸；X＝疎水性親水性（hydropathic）アミノ酸；Cardin and Weintraub, Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1989; 9:21-32、SEQ ID No. 4およびSEQ ID No. 5）の形態である。

そのようなヘパリン結合ドメインの存在は、CD34+細胞を、導入遺伝子を発現するT細胞前駆細胞を取得するために形質導入する目的でレトロウイルスベクターに曝露する際に、特に有利である。

CS-1ペプチドまたはCS-1モチーフは、Wayner et al., 1989, J. Cell Biol. 109: 1321によって記載された25アミノ酸（DELPQLVTLPHPNLHGPEILDVPST、SEQ ID No. 6）のペプチドである。このCS-1モチーフは、VLA-4（再晩期抗原-4）受容体に結合する。この抗原は、CD49d（α4）およびCD29（β1）から構成される二量体インテグリンである。

1つの特定の態様において、フィブロネクチン断片は、培養培地中に存在するか、または容器の下壁に固定化されている。フィブロネクチンは、その天然形態において、長さが100 nmで460 kDaの大きなv形の二量体のタンパク質である。2つの単量体が、そのC末端側で2つのジスルフィド架橋によって連結されている。「フィブロネクチン」という用語は、天然のフィブロネクチンタンパク質（すなわち、オルタナティブスプライシングによって産生される任意のアイソフォーム）を表すが、このタンパク質の単量体、またはこのタンパク質の断片（ただし、RGDSペプチド、ならびにまたCS-1ペプチドおよびヘパリン結合部位も含有する）もまた表すことが意図される。

本発明による方法を実施するのに特に適しているフィブロネクチンは、Retronectin（登録商標）である。このタンパク質は、ヒトフィブロネクチンの断片に対応し（断片CH-296；Kimizuka et al., J. Biochem. 1991 Aug; 110(2):284-91；Chono et al., J. Biochem. 2001 Sep; 130(3):331-4）、本方法の実行の文脈において好ましい3つの機能ドメイン（RGDSペプチド、ヘパリン結合ドメイン、およびCS-1配列を含有する細胞への結合のためのCドメイン）を含有する。このタンパク質は、標的細胞（インテグリンVLA-4およびVLA-5への結合）とビリオン（ヘパリン結合ドメインに対して結合する）の共局在化を可能にすることによって、レトロウイルスベクターを用いた形質導入を改善するために既に使用されている（Chono et al.、前掲書）。このタンパク質は、特に、Takara Bio Inc.（滋賀、日本）という会社によって販売されている。

このタンパク質がまた、遺伝子治療の文脈におけるウイルスベクターで形質導入した細胞の、およびまた成体細胞の、T細胞前駆細胞を取得することが望ましい際を含めて、CD34+細胞のT細胞前駆細胞への分化を改善することもできるのは、驚くべきことでありかつ予想外である。

上記で考察したように、しかしこの理論によって束縛されることを望まず、CD34+細胞の分化におけるこの改善は、恐らく、細胞上に存在するVLA-5インテグリンに結合するRGDSモチーフ、および／またはVLA-4受容体に結合するCS-1モチーフの存在に結びつけられる。

1つの特定の態様において、フィブロネクチン断片は、固定化されており（すなわち、固体支持体に結合しており）、溶液中に遊離して存在していない（もっとも、いくつかの要素が支持体から剥離した場合には、恐らく溶液中に見出すことが可能である）。この固体支持体は、好ましくは、その中で方法が実施される容器の下壁である。しかし、ポリマービーズまたは磁気ビーズなどのビーズ（概して1μm〜5μmの直径を有する）へのフィブロネクチン断片の結合を構想することもまた可能である。これらのビーズへのタンパク質またはペプチドの結合は、共有結合性または非共有結合性であり得る。ビーズに対してタンパク質またはペプチドを付着させるための方法は、当技術分野において周知である。このフィブロネクチン断片はまた、寒天またはゲルなどの半固体培地中に導入することもできる。

フィブロネクチン断片が支持体（特に、その中で方法が実施される容器の下壁）に固定化される際には、この固定化もまた、共有結合性または非共有結合性であり得る。1つの好ましい態様において、この固定化は、フィブロネクチン断片を、容器の下壁を形成しているガラスまたはプラスチック上に吸収させることによって、非共有結合性に実施される。

1つの特定の態様において、上記に見られるように、CD34+細胞のT細胞前駆細胞への分化、および、関心対象の遺伝子をCD34+細胞に導入するためのウイルスベクターを用いた該CD34+細胞の形質導入の両方が、実施される。これは、Notchリガンドおよびフィブロネクチン断片に曝露される細胞がまた、Notchリガンドおよびフィブロネクチン断片に曝露される時間の少なくとも一部の期間中に、ウイルス上清にも曝露されることを意味する。

実際に、本発明者らは、あらかじめ形質導入された細胞をNotchリガンド（特にDL-4）に曝露した際に、インビボでのTリンパ球の産生が、形質導入がDL-4への曝露と同時に実施された際よりも緩徐であることを実証できている。したがって、共同曝露により、インビボでの（移植後の）T細胞の産生を加速することが可能になる。

細胞のウイルス上清およびNotchリガンド（特にDL-4）へのこの共同曝露の第2の利点は、培養期間を短縮することである（11日の代わりに7日）。

フィブロネクチン断片の存在下と同じ様式にしたがって、細胞のフィブロネクチン断片の存在を伴わないウイルス上清およびNotchリガンド（特にDL-4）への共同曝露もまた、T細胞前駆細胞の産生を加速することを可能にし、本発明の別の局面であることが、注目されるべきである。

したがって、1つの好ましい態様において、方法は、細胞を、Notchリガンドおよびフィブロネクチン断片に対して、ある一定の期間（好ましくは4時間より長く、およびより好ましくは6時間より長く、またはさらに8時間より長くもしくは10時間より長くであるが、好ましくは36時間未満、より好ましくは30時間未満、より好ましくは24時間未満）、サイトカインの存在下で曝露することによって開始され、それによって、細胞が分裂（予備活性化）サイクルに入ることを可能にし、次いで、ウイルス上清が、ある一定の期間（平均して、好ましくは4時間より長く、より好ましくは6時間より長く、またはさらに8時間より長くもしくは10時間より長くであるが、好ましくは30時間未満、より好ましくは24時間未満、より好ましくは16時間未満）添加される。

形質導入された細胞の数が不十分であると観察される場合には、上記の様式にしたがって細胞をウイルスベクターに再び曝露することによって、第2の形質導入を行うことが可能である。

この態様は、特に、遺伝子治療プロトコルの文脈において造血幹細胞の自己移植を行うことが望ましい際に実行される。したがって、ウイルス上清での形質導入によって導入される導入遺伝子は、患者において欠如または欠損しているタンパク質を、該患者に治療の恩恵を提供するために発現させることが意図される。使用することができる導入遺伝子の中で（この一覧は限定的または網羅的でない）、免疫不全（特に重症複合免疫不全、SCIDまたは非SCID、CID）、HIV、X連鎖性副腎白質萎縮症、異常ヘモグロビン症、特にβ地中海貧血または鎌状細胞貧血のための治療を可能にする遺伝子に言及がなされ得る。先天性免疫不全またはHIVによるAIDSなどの後天性免疫不全は、したがって、遺伝子治療戦略によって標的とすることができる疾患である。

形質導入は、好ましくは、細胞のゲノムへの導入遺伝子の挿入を可能にするレトロウイルス上清で実施される。前記上清中に存在するベクター、特にレンチウイルスベクターは、このタイプの適用に特に適しており、広く文献に記載されている。

したがって、本発明による方法の実行において、培地はまた、CD34+細胞の形質導入を目的とするウイルスベクターも含有し得る。1つの特定の態様において、このウイルスベクターは、4時間〜36時間、好ましくは6時間〜24時間の、培地中での細胞の予備活性化（細胞が分裂サイクルに入ることを可能にするサイトカインの存在下での培養）の期間後に導入される。ウイルスベクターは、4時間〜30時間、好ましくは12時間〜24時間、より好ましくはおよそ16時間の期間、細胞と接触した培地中に維持され、次いで、培地から除去される。ウイルスベクターを培地から「除去する」ために、細胞を収集し、洗浄して、Notchリガンドおよびフィブロネクチン断片の存在下での培養に戻す。

1つの特定の態様において、前記Notchリガンドは、Delta様-1タンパク質（SEQ ID No. 1）または断片（可溶性ドメイン）である。

別の態様において、Notchリガンドは、Delta様-4タンパク質（SEQ ID No. 2）である。

1つの特定の態様において、前記Notchリガンドは、IgGタンパク質のFc領域に融合された、天然Notchリガンドの可溶性ドメインを含む融合タンパク質である。Notchリガンドの可溶性ドメインは、該リガンドの細胞外部分に相当する。これは周知である。例を挙げると、Varnum-Finney et al. (J Cell Sci. 2000 Dec; 113 Pt 23:4313-8)は、DL-1の可溶性部分とIgG1のFc部分との融合から作られた融合タンパク質を記載している。Reimann et al.（前掲書）は、DL-4の可溶性部分（アミノ酸1〜526）とIgG2b免疫グロブリンのFc断片との融合から作られた融合タンパク質を記載している。IgGタンパク質がIgG2である場合が、このように好ましい。

本発明の文脈において使用される培養培地は、CD34+細胞およびT細胞を培養するのに適している任意の培地である。特に、α-MEM、DMEM、RPMI 1640、IMDM、BME、マッコイ5A培地およびStemSpan（商標）（Stem Technologies）培地またはフィッシャー培地に言及がなされ得る。本発明による方法を実施するために完全に適しており、かつ好ましい培養培地は、X-VIVO（商標）20培地（Lonza、バーゼル、スイス）である。この培地は、特に、Jonuleit et.al. (Eur J Immunol, 1997, 27, 12, 3135-42)およびLeft et.al. (J Immunol, 1998, 161, 4, 1947-53)によって使用されている。

好ましくは、基本培地（すなわち、補給物を添加する必要なしに、細胞の成長を可能にする培地）が使用され、しかし、血清、ならびにまた成長因子およびサイトカインが補給されることになる。

したがって、ウシ胎児血清（FBS）またはウシ胎仔血清（FCS）、自己ヒト血清またはヒトAB血清が、好ましくは、基本培養培地に添加される。好ましくは、この培地に、少なくとも15％の胎児血清、より好ましくは少なくとも20％が補給される。FBSは、この方法を実施するために特に適している。特に、規定されたFBSが、好ましくは使用される。規定されたFBSとは、ウイルス粒子の存在を予防するために、解析および濾過されている高品質血清である。それ自体が多数の供給業者によって販売されており、例えば、Thermo Scientific（商標）由来のHyClone（商標）Defined Fetal Bovine Serum（FBS）である。

培養培地はまた、好ましくは、サイトカインおよび成長因子が補給される。これらのサイトカインおよび成長因子は、特に、SCF（幹細胞因子）、トロンボポエチン（TPO、巨核球増殖発達因子、MGDFとも呼ばれる）、Flt3リガンド（造血成長因子である）、インターロイキン3（IL-3）、インターロイキン7（IL-7）およびSCF（幹細胞因子）からなる群より選択される。1つの特定の態様において、培養培地は、少なくとも3種、好ましくは少なくとも4種の、これらのサイトカインまたは成長因子を含有する。

1つの好ましい態様において、および特に、ウイルスベクターで形質導入されていないTリンパ球前駆細胞を生成するために、少なくともまたは正確に3種のサイトカインを添加する。

好ましくは、これらの3種のサイトカインは、インターロイキン-7（IL-7）、SCF（幹細胞因子）、およびFlt-3リガンド（造血成長因子）である。

別の好ましい態様において、4種のサイトカイン、すなわち、上述の3種のサイトカインおよびTPO（トロンボポエチン）を添加する。

別の特定の態様において、および特に、ウイルスベクターで形質導入されたTリンパ球前駆細胞を生成するために、サイトカインおよび成長因子の性質を、方法の実行中に変動させることができる。

したがって、ウイルスベクターを添加する前に細胞予備活性化工程を実施する場合には、培地においてIL-3、IL-7、SCF、TPO、およびFlt3-Lを使用することが可能であり、次いで、ベクターを除去した後、培地にIL-7、SCF、TPO、およびFlt3-Lのみを補給することが可能である。

上述のサイトカインおよび成長因子の混合物は、CD34+細胞のTリンパ球前駆細胞への分化を誘導するのに十分であり、概して、培養培地は他のサイトカインまたは成長因子を含まない。

方法の文脈において、NotchリガンドおよびRGDSモチーフを有するタンパク質またはペプチドの存在下でのCD34+細胞の全曝露時間は、概して、好ましくは3日より長く、かつ10日未満の期間である。

この曝露は、細胞が形質導入されるか否かによって変動し得る。例を挙げると、形質導入されていない成体幹細胞については、3日間の曝露時間が十分であると判明し得るが、他方、形質導入または乳児幹細胞の場合には、概してより長くなる（およそ7日間）。

CD34+細胞は、ドナー由来の血液試料から、骨髄穿刺から、または臍帯血から取得される。CD34+細胞を選別するための方法は、当技術分野において公知である。その表面のCD34+を認識する抗体を有する磁気ビーズを、特に、このために使用することができる。

好ましくは、細胞培養容器は、CD34+細胞を曝露する前に、Notchリガンドおよびフィブロネクチン断片を下面に固定化することによって調製される。

Retronectin（登録商標）または別のフィブロネクチンは、細胞培養ディッシュ（ペトリディッシュまたは24ウェルプレートなど）のプラスチックに自然に接着する。

同様に、Notchリガンドを免疫グロブリンのFc断片との融合から作られた融合タンパク質として使用する場合には、このFc断片もまたプラスチックに接着する。

したがって、適切なコーティングを得るのには、容器をこれらの化合物の存在下で数時間放置すれば十分である。

特に、以下のプロトコルを、Fc断片と融合されたNotchリガンド、およびRetronectin（登録商標）で下面を覆うために使用することができる：
‐Notchリガンド（5μg/ml）およびRetronectin（登録商標）（25〜50μg/ml）をPBS（リン酸緩衝生理食塩水）中に含有する溶液を調製する。しかし、結果を低減することなく、10〜15μg/mlといった低いRetronectinの量を使用することも可能である；
‐細胞培養ディッシュのウェルをこの溶液で覆う：24ウェルプレートについて0.5 ml；6ウェルプレートについて1.0 ml；
‐4℃で24時間（もしくはさらに48〜72時間）、または37℃でおよそ2時間放置して、タンパク質を沈着させる；
‐PBSで（作業温度で）洗浄する；
‐ブロッキング剤（PBS＋2％ BSA（ウシもしくはヒト血清アルブミン））またはHA（ヒト赤血球凝集素）剤（24ウェルプレートについて0.5 ml；6ウェルプレートについて2 ml）を37℃で1時間使用する；
‐PBSで37℃で洗浄する。

当業者が、他のタンパク質または他の細胞培養容器（フラスコ、バッグなど）を使用する場合、コーティングのための他の濃度または他の条件の設定が、彼らにとって日常的な作業であることは、明らかである。

特に、本発明者らは、5μg/mlの濃度で、DL-4のおよそ75％が容器の表面に結合することを示している。種々の用量のDL-4が試験されており、濃度が1.25μg/mlより高いかまたは同等であることが好ましく、最適濃度は2.5〜5μg/mlである。

Retronectinに関しては、25μg/mlの濃度が完全に適しているが、他の濃度（より高いかまたはより低い）もまた適している可能性がある。

本発明は、したがってまた、その表面のうちの少なくとも1つが、Notchリガンド、ならびにRGDSおよび／またはCS-1モチーフを有するタンパク質またはペプチド、特に上記のようなフィブロネクチン断片で覆われていることを特徴とする、細胞培養容器にも関連する。

好ましくは、Notchリガンドは、天然Notchリガンド（特にDL-1またはDL-4）の可溶性部分であり、免疫グロブリン（IgG1またはIgG2など）のFc断片と融合されている。

好ましくは、それはDL-4である。好ましくは、Fc断片はIgG2に由来する。1つの好ましい態様において、培養ディッシュの表面に固定化される（かつ、本発明による方法の文脈において使用される）Notchリガンドは、配列SEQ ID No. 7を有する。

好ましくは、この態様において、RGDSモチーフを有するタンパク質は、上記のようである。それは、好ましくは、フィブロネクチン、特にRetronectin（登録商標）である。

したがって、好ましくは、細胞培養ディッシュは、DL-4/IgG2 Fc断片融合タンパク質およびRetronectin（登録商標）で覆われている少なくとも1つの表面を有する。

濃度は、上述のようであり、容器は、特に、上記の方法、すなわち、Notchリガンド、RGDSおよび／またはCS-1モチーフを有するタンパク質またはペプチド、特にフィブロネクチン断片を含有する溶液を、該容器に添加する工程、静置してタンパク質を容器の壁に沈着および接着させる工程、それに続く、容器の壁を非反応性タンパク質（血清アルブミンなど）ですすぎ、好ましくはブロッキングする工程によって取得される。

本発明による方法の実行において、細胞を、10⁶〜10⁷ CD34+細胞/ml、特に約2×10⁶ CD34+細胞/mlの濃度で培養容器に添加する。形質導入されるべきCD34+の量に応じて、2〜10 cm²の範囲にわたるディッシュ（またはそれぞれ、24ウェル〜6ウェルの範囲にわたるプレート）を使用してもよい。好ましくは、24ウェルプレートを使用する際には、各ウェルに、ウェルあたり10⁵〜10⁶個のCD34+細胞、好ましくはウェルあたり約2×10⁵〜4×10⁵個のCD34+細胞を接種する。6ウェル培養プレートの場合には、ウェルあたり8×10⁵〜2×10⁶個の細胞を代わりに使用する。

接種すべき細胞の量は、当業者が使用する容器に応じて、彼らが容易に調整することができる。

細胞を、上記に見られるようなサイトカインまたは成長因子を好ましくは補給した、選択された基本培地中のウェルに入れる。

これらのサイトカインまたは成長因子の濃度は、2〜300 ng/mlである。

好ましくは、サイトカインを、概して、40 ng/lより高く、かつ300 ng/mlまたは200 ng/l未満の濃度で、より好ましくは、約100 ng/mlの濃度で添加する。

しかし、形質導入されたT細胞前駆細胞を生成することが望ましく、細胞をウイルスベクターの存在下に置く前に予備活性化する際には、（約300〜400 ng/mlの）より高い濃度を使用することが可能である。この態様において、SCFおよびFlt3-Lを約300 ng/mlの濃度で、TPOおよびIL-7を約100 ng/mlの濃度で、およびIL-3をおよそ40 ng/mlで使用することができる。

1つの好ましい態様において、細胞のNotchリガンドおよびフィブロネクチン断片への曝露時間は、好ましくは、3日より長いかもしくは同等、またはさらに、5日より長いかもしくは同等である。それは概して、10日未満、またはさらに8日未満である。有利な時間は、好ましくは5〜8日、すなわちおよそ7日である。7日間を超える培養が望ましい場合には、Notchリガンドおよびフィブロネクチン断片でコーティングした新たな容器中に細胞を移すことが好ましい。この時間は、特に、CD34+細胞の起源に依存する。このように、曝露時間は、成人から取得したCD34+細胞について、小児または臍帯血から取得した細胞についてよりも短いことが可能である。これは、先行技術および成体幹細胞の分化の先験的なより低い能力に照らして、特に驚くべきことである。形質導入された細胞は、概して、形質導入されていない細胞よりも長い時間曝露される。

上記の方法によってT細胞前駆細胞を生成した後に、このように生成されたこれらのT細胞前駆細胞を精製することが可能である。この精製は、細胞を洗浄し、適した基本培地に懸濁することによって実施される。

これらのT細胞前駆細胞はまた、患者に注射することができるように、バッグにパッケージングすることもできる。この場合には、これらの細胞を、5％ albunorm（商標）50 g/l（Octopharma、ランゴルサイム、フランス）などの、HSAを5％で含有する生理食塩溶液において再パッケージングする。

これらの細胞はまた、当技術分野において公知の方法にしたがって凍結することもできる。

本発明はまた、免疫抑制された患者における使用のため、特に、この患者における免疫再構成を可能にするため、および／または約数か月（およそ少なくとも2か月、好ましくはおよそ少なくとも6か月）の期間にわたって該患者において感染症に対する免疫防御を取得するためのT細胞前駆細胞にも関連する。1つの特定の態様において、患者は免疫抑制された患者である。不全には多くの理由があり得る：遺伝性免疫不全、白血病のための化学療法、コンディショニング、幹細胞のみを含有する移植、GVH（移植片対宿主疾患）のための移植後の予防的処置、レシピエントの年齢、および感染タイプの合併症。患者は、このように、骨髄移植前の治療に続くその免疫細胞の枯渇のために、特に免疫抑制され得る。この態様において、移植は、同種異系移植（この場合、T細胞前駆細胞は、好ましくは、患者と部分的にHLA適合性であるドナー由来である）、または自己移植（その場合には、該患者における遺伝的欠損を補正することを可能にする遺伝子および／またはタンパク質を発現させるために、T細胞前駆細胞が、好ましくは、ベクターで形質転換されている）であり得る。

1つの特定の態様において、T細胞前駆細胞は、CD34+細胞を、（上記のような）Notchリガンド、ならびに、RGDSモチーフおよび／またはCS1モチーフを有するタンパク質またはペプチド、特に上記のようなフィブロネクチン断片の存在下で、上述の条件の下で曝露することによって取得されている。この態様において、したがって、曝露は、10日未満またはそれと同等であることが好ましい。

構想されるT細胞前駆細胞は、特にCD7マーカーを呈し、CD34マーカーを発現してもよいし、または発現しなくてもよい。

本発明は、免疫抑制された患者を、特にこの患者において少なくとも一時的な免疫再構成を可能にすることを目指して処置するための方法であって、該患者に上記のようなT細胞前駆細胞を投与する工程を含む方法に関連する。この方法はまた、CD34+細胞を、（上記のような）Notchリガンド、ならびに、RGDSモチーフおよび／またはCS1モチーフを有するタンパク質またはペプチド、特に上記のようなフィブロネクチン断片に、上述の条件の下で曝露することによって、そのような前駆細胞を取得する工程も含むことができる。治療的有効量、すなわち、約1〜5×10⁶/kgの前駆細胞が、特に投与され、それによって、患者に、数か月間（約6か月間）感染症に対する防御的役割を果たす能力を有する細胞を提供することを可能にする。

好ましくは、T細胞前駆細胞のこの投与は、患者における造血幹細胞移植の直前に、直後に、または同時に実施される。上記に見られるように、注射する細胞は、患者における遺伝的欠損の補正を可能にするベクターで形質転換することができる。

Retronectin（RN）の非存在下（-RN）または存在下（+RN）でCD34+細胞を培養した後に得られたCD7+CD34+/-細胞のパーセンテージおよび数の、数とパーセンテージの比較。A．CD34、CD7マーカーの発現のフローサイトメトリー解析。B．CD34-CD7+細胞の数の表示（6回の独立した実験について）。 CD34+細胞のTリンパ球への分化に関与する遺伝子の（GAPDH（グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ）対照に対する）発現の比較。A．Tcf-7（転写因子7）およびLef-1（リンパ系エンハンサー結合因子1）遺伝子。B．Bcl11b（B細胞CLL/リンパ腫11B）およびLCK（リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ）遺伝子。動員されたドナー血液CD34+細胞の培養により取得された、Retronectinの存在下または非存在下で培養した後に得られたCD7+CD34+/-細胞のパーセンテージの比較（CD34、CD7マーカーの発現のフローサイトメトリー解析）。

実施例1‐材料および方法
a）CD34+細胞の調製
CD34+細胞を、先行技術において記載されているように、Ficoll勾配上での単核細胞の分離、および免疫磁気選別によって単離する（Six et al., J Exp Med 2007 204:3085）。

b）可溶性Notchリガンドの調製
可溶性Notchリガンドは、Reimann et al.（2012、前掲書）に記載されているように、Notchリガンドの可溶性部分およびヒト免疫グロブリンの定常部分をクローニングすることによって生成された融合タンパク質である。融合タンパク質の配列は、SEQ ID No. 7である。

c）容器の調製
i．Retronectinなし
容器は、Reimann et al.（2012、前掲書）に記載されている技術にしたがって可溶性Notchリガンドが固定化されている、培養培地を含有する培養ウェルから構成されている。
ii．Retronectinあり
Retronectinが、培養ウェルにおいて可溶性Notchリガンドと同時に固定化されている。Retronectin濃度は、25〜50μg/mlである。作業は、周囲温度または4℃で、微生物学安全キャビネット（MSC）において実施する。

d）CD34+細胞の曝露
CD34+細胞を、2×10⁴〜1.5×10⁵細胞/mlの濃度で、容器中の培養物中に入れる。培養は、Reimann et al.（2012、前掲書）に記載されているように、3〜10日間続ける。

e）CD34+細胞の解析
培養した細胞の解析は、以下を含む：生細胞の計数、CD34、CD7、および任意でCD5およびCD1aマーカーの発現のフローサイトメトリーによる、ならびに、培養により生成されるT前駆細胞を定量することを可能にするOP9/DL-1間質上での限界希釈条件の下での二次共培養による解析（Reimann C Stem Cells 2012, 30(8):1771-80）。それは任意で、CD34+細胞のTリンパ球へのコミットメントおよび分化にとって重要である分子（TCF7、GATA3、RAG1、IL7R、BCL11B、LEF1、PTCRA）に関連する定量RT-PCRによる遺伝子発現プロファイルの解析によって、完了する。

実施例2‐細胞の形質導入のない状態での、Retronectinの存在下または非存在下で得られた結果の比較
1．臍帯血CD34+細胞で得られた結果（6回の実験）
Retronectinの存在下での培養後に得られるCD7+CD34+/-細胞のパーセンテージおよび数における増大が、観察される（図1）。

7日目において、培養物中に存在し、OP9/DL-1上での共培養により限界希釈条件の下で測定されるT前駆細胞の頻度における増大もまた、観察される（表1）。

CD34+細胞のTリンパ球への分化に関与する遺伝子の（GAPDH（グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ）内在性遺伝子と比較した）発現における増大もまた、観察することができる（図2）。

2．動員されたドナー血液CD34+細胞で得られた結果
Retronectinの非存在下での培養後に得られるものに対して、Retronectinの存在下での培養後のCD7+CD34+/-細胞のパーセンテージにおける増大が、観察される（図3）。

7日目において、培養物中に存在し、OP9/DL-1上での共培養により限界希釈条件の下で測定されるT前駆細胞の頻度における増大もまた、観察される（表2および表3）。

10⁵ CD34+から得られた結果

3．結論
これらの結果により、RetronectinおよびDL-4リガンドの共同の存在が、CD34+幹細胞からのTリンパ球分化経路に関与する前駆体（T細胞前駆細胞）の生成を改善するのを可能にすることが、明らかに示される。

実施例3‐形質導入された細胞についてRetronectinの存在下で得られた結果
患者の骨髄のCD34+細胞を、300 ng/ml SCF、300 ng/ml Flt3-L、100 ng/ml TPO、40 ng/ml IL-3、100 ng/ml IL-7、および20％血清を含有するX-vivo20培地中2×10⁶細胞の濃度で、培養プレートを50μg/mlのRetronectin（登録商標）および5μg/mlのDL4/Fcの溶液で覆った後に得られた支持体上で、24時間予備活性化する。

1日目と2日目の間に、細胞を、4μg/mlの硫酸プロタミンで強化した予備活性化培地において、ウイルスベクターを用いた形質導入に供する。

3日目に、細胞を収集し、洗浄して、血清（20％）、SCF（100 ng/ml）、Flt-3L（100 ng/ml）、TPO（100 ng/ml）、およびIL-7（100 ng/ml）を補給した培地中のDL4/Fcタンパク質支持体上での培養に7日目まで戻す。

これにより、CD34+前駆細胞がT分化経路に入ることが可能になり、これは、CD7マーカーを有する多数の細胞の出現によって証明される。

このコミットメントの証拠は、Tリンパ球の相当に加速された産生によって確認される。

インビトロの実験により、CD34+ HSCの形質導入の終わりに、DL4/FcおよびRetronectin断片の存在下での培養物が、CD34+/-CD7+ Tリンパ球前駆細胞（14％）を含有することが判明した。二重陽性のCD4+CD8+ Tリンパ球（8％）およびCD3+ Tリンパ球（8％）の出現もまた、25日目から観察され、他方、形質導入のみの従来プロトコル（DL4/Fc＋Retronectin（登録商標）への曝露なし）は、25日目に1％未満の（CD4+CD8+またはCD3+）Tリンパ球を取得するのを可能にするだけである。

インビボでは、規定されたプロトコルにしたがって生成された前駆細胞のNOD/SCID/γc koマウスへの移植により、形質導入されてDL-4/Fc＋Retronectin（登録商標）に曝露された細胞の移植のおよそ6週間後に、ヒト胸腺細胞新生の誘導が示される。

従来の条件の下で形質導入された細胞のレシピエントにおいて、胸腺細胞新生は観察されない。

Claims

支持体上に固定化された、IgGタンパク質のFc領域に融合されたDelta様-4リガンドの可溶性ドメインであるNotchリガンドの存在下で、ならびに、RGDSおよびCS-1モチーフとヘパリン結合ドメインとを含むフィブロネクチンの断片の存在下で、培地においてCD34+細胞を曝露する工程を含む、T細胞前駆細胞を生成するためのインビトロの方法。
CD34+細胞が、成人患者から単離されていることを特徴とする、請求項1記載の方法。
フィブロネクチンの断片の存在下でのCD34+細胞のNotchリガンドへの曝露時間が、10日未満であることを特徴とする、請求項1および2のいずれか記載の方法。
前記細胞のNotchリガンドおよびフィブロネクチン断片への曝露時間が、3〜8日間であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
IgGタンパク質がIgG2であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
フィブロネクチン断片がRetronectin（登録商標）であることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
フィブロネクチン断片が培養容器の下面に固定化されていることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
培地が、CD34+細胞のNotchリガンドへの曝露時間の少なくとも一部の期間中での該CD34+細胞のトランスフェクションを目的とするウイルスベクターもまた含有することを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
培地が、少なくとも15％のFBS、好ましくは少なくとも20％のFBSを含有することを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
培地が、インターロイキン7（IL-7）、SCF（幹細胞因子）、トロンボポエチン（TPO）、およびFlt3リガンド（FLT3L）からなる群より選択される少なくとも3種のサイトカインまたは成長因子を含むことを特徴とする、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
培地が、インターロイキン7、SCF、トロンボポエチン、およびFlt3リガンドを含むことを特徴とする、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
培地が、他のサイトカインまたは成長因子を含まないことを特徴とする、請求項11記載の方法。
請求項1〜12のいずれか一項記載の方法を実施する工程、および生成されたT細胞前駆細胞を精製する工程を含む、T細胞前駆細胞を調製するための方法。
患者への注射のために前記T細胞前駆細胞をバッグにパッケージングする工程もまた含むことを特徴とする、請求項13記載の方法。
IgGタンパク質のFc領域に融合された、Delta様-4リガンドの可溶性ドメインであるNotchリガンド、ならびに、RGDSおよびCS-1モチーフとヘパリン結合ドメインとを含むフィブロネクチンの断片が、その表面の少なくとも1つに固定化されていることを特徴とする、細胞培養容器。