CN110506110A - 产生t细胞祖细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及产生T细胞祖细胞的体外方法，其包括步骤：在Notch配体和任选的纤连蛋白片段存在下,在含有TNF‑α和/或芳烃/二噁英受体拮抗剂特别是StemRegenin 1(SR1)的培养基中，培养CD34+细胞。

Description

产生T细胞祖细胞的方法
本发明涉及细胞治疗领域，特别是转化或未转化的造血干细胞移植领域，更特别是这类移植后的免疫重建。
对于最严重的遗传性免疫缺陷、许多恶性血液病以及许多实体瘤，祖细胞和造血干/祖细胞(HSPC)的移植被认为是最佳治疗选择。
目前，在具有部分HLA不相容性的同种异体移植的情况下，向先前条件化的接受者注射增加剂量的分选CD34+HSPC可使供体移植有效防止移植物抗宿主病(GVH)。然而，来自注射的CD34+细胞的新T淋巴细胞的分化需要最少4个月的时间，并且这些T淋巴细胞的数目足以在其出现后仅几个月发挥抗感染的作用。
这种缓慢的免疫重建不仅导致众多感染性并发症，尤其是病毒性感染，还导致复发，这影响了移植患者的长期预后。
此外，其他治疗方案使用基因治疗方法，即转导的HSPC的自体移植物，且已证明可有效治疗某些遗传性免疫缺陷。当没有可用的HLA相容供体时，该策略相对HSPC CD34+同种异体移植在存活率和发病率方面的优势是无可争辩的。然而，临床经验表明，对于一些患有严重感染的患者，T淋巴细胞区室的重建是缓慢的并且从未达到循环T淋巴细胞的正常水平。与这种特定情形相关的发病率和死亡率是重要的。
由于与这种类型的移植相关的高发病率和死亡率，完全有理由开发出移植后的免疫缺陷期减少的新疗法。
特别地，重要的是通过施用已经参与T淋巴细胞分化途径的祖细胞(T细胞祖细胞)来加速T淋巴细胞的产生。
这些T细胞祖细胞获自CD34+HSPC分化，并且特别具有CD7+标记物，其是T细胞途径分化的标记物。它们也可能具有其他标记物。Awong等(Blood 2009；114:972-982)描述了以下T淋巴细胞前体：早期胸腺祖细胞(ETP)，其具有标记物(CD34+/CD45RA+/CD7+)，proT1阶段的前体细胞(CD7++/CD5-)，proT2阶段的前体细胞(CD7++/CD5+)和preT阶段的细胞(CD7++/CD5+CD1a+)。当在T细胞发育途径从一个阶段进入另一个阶段时，HSPC以连续方式获得这些标记物。还已知在人类中，CD1a抗原区分从非常不成熟的胸腺祖细胞到明显参与T途径的祖细胞的过渡(Cavazzana-Calvo等,MEDECINE/SCIENCES 2006；22:151-9)。
伴随HSPC移植的T细胞前体移植可以快速产生成熟的功能性T淋巴细胞区室，从而通过允许患者在完全重建免疫系统之前从一些免疫力获益而有助于防止严重感染的风险。
此外，能够使用成年细胞而非脐带血细胞这一点是重要的，因为获得成年细胞比脐带血细胞更容易且更便宜，并且因为成年细胞更常用于同种异体移植。
然而，文献中公布的在人和小鼠中获得的数据显示了胎儿造血细胞(包括脐带血)和成年细胞之间的内在差异。这些差异与存活率、修复DNA损伤的能力、增殖能力和分化潜力有关(参见，例如，Yuan等,(2012年3月9日；335(6073):1195-200)，其表明成人骨髓细胞在产生多种细胞类型方面不如胎儿细胞有效：Lansdorp等,(J Exp Med 1993年9月1日；178(3):787-91)；Szilvassy等(Blood,2001年10月1日,98(7):2108-15)，Frassoni等(Blood,2003年8月1日,102(3):1138-41)，Liang等,106(4):1479-87)，Six等(J Exp Med,2007年12月24日,204(13):3085-93))。
WO2016/055396描述了可能通过在固定的Notch配体(特别是融合到IgG蛋白的Fc区的δ样配体的可溶性结构域)、含有RGDS(SEQ ID NO：3，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸)和CS-1结构域的纤连蛋白片段以及肝素结合结构域(特别是在存在下)的存在下培养CD34+细胞，产生T细胞前体。使用的Notch配体可称为DL4/Fc。
值得注意的是，该文献公开了固定的Notch配体和纤连蛋白二者的存在使得可以增加T淋巴细胞前体(CD7+细胞)的产生，这已经是本领域的一项改进，但是CD7+CD34-细胞百分比仍然非常低，如WO 2016/055396的图3所示。然而，增加该百分比是有意义且特别重要的，以便能够向有此需要的患者施用更高量的前体。另一方面，细胞保持在分化的早期阶段以便能够提供适当的免疫力也是重要的。
需要注意的是，Notch蛋白是跨膜受体，其调控细胞对大量环境信号的反应。在哺乳动物中，已经描述了四种Notch(Notch 1-4)受体和五种配体(δ样1、3和4，Jagged1，Jagged2)(Weinmaster Curr Opin Genet Dev 2000:10:363-369)。
δ样配体4可以称为：
(ii)δ样配体4(对应于DLL4基因的名称)
(iii)δ样4或δ配体4(缩写DL-4)。
在本申请中，Notchδ样1和δ样4配体可分别称为DL1和DL4或DL-1和DL-4。配体DL-1和DL-4的序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
Ohishi等(BLOOD.vol.98,no.5,2001,pp 1402-1407)涉及Notch信号传导对单核细胞分化成巨噬细胞和树突细胞的影响。在该文献公开的实验中使用的单核细胞是通过阴性选择纯化的外周血单核细胞，或者是在CD34+干细胞体外分化后获得的单核细胞。因此，该文献中使用的细胞已经进入了单核细胞/巨噬细胞/树突细胞分化途径，丧失了CD34标记物(其为造血干细胞标记物)并呈递CD14标记物。在存在δ1的细胞外结构域和GM-CSF、TNF-α(其用于诱导CD34+细胞衍生的CD1a-CD14+细胞分化成树突细胞)的情况下，培养这些细胞。该文献在存在Notch配体和TNF-α的情况下未使用CD34+细胞，并且不涉及T细胞前体(CD7+T淋巴细胞前体)的产生。
SHUKLA等人(NATURE METHODS,vol.14,no.5,2017,531-538)和WO 2017/173551公开了从干细胞和/或祖细胞产生祖T细胞的方法，包括将干细胞和/或祖细胞暴露于Notch配体δ样4(DL4)和血管贴附分子1(VCAM-1)。
本申请中描述的方法允许从CD34+干细胞产生(增殖)CD7+ T淋巴细胞前体并增加其数目，而无需使用细胞基质(其在临床背景下不容易面对)。此外，当用成年供体产生的CD34+细胞进行时，该方法特别适合。
此外，通过本文公开的方法获得的细胞含有Bcl11b标记物，其是自T细胞定型唯一打开的重要转录因子(Kueh等,2016,Nat Immunol.2016年8月；17(8):956-65.Doi:10.1038/ni.3514)。
本发明人还证明，在通过本文公开的方法获得的祖细胞中不存在T细胞受体基因座(TCRβ、TCRγ或TCRδ)的重排。
此外，与WO 2016/055396中公开的方法相比，显示本文获得的前体的凋亡标记物减少。
总之，本文公开的方法使得可获得足以有效用于接受干细胞移植的成人的高数目的T细胞前体。
当在本文公开方法过程的某些时间点使用含有目的基因的载体时，该方法也可用于获得用于基因治疗的转化的(转导的)T细胞前体。
通过本文公开的方法获得的细胞可以获得用于成年CD34+细胞，并且可以用于同种异体移植或自体移植，甚至当脐带血细胞用于这种移植时也是如此。
应注意，该方法尽管对成年CD34+细胞非常有效，但也可与脐带血CD34+细胞一起使用。
在具体实施方案中，本文公开的方法因此加速了T细胞祖细胞注射后体内T细胞的产生，其中所述T细胞祖细胞是在体外培养系统中由PSPC产生的，并且组合了来自Notch配体、δ4、和细胞因子组合的固定的融合蛋白。
该系统可以在7天内产生与人胸腺T细胞前体在表型和分子上相似的T细胞祖细胞。此外，这些T细胞祖细胞能够在NSG小鼠中产生成熟且多样化的人T细胞，其与HSPC相比具有更快的动力学。
本文报道的结果获自脐带血(CB)和成人(来自成人供体的动员的外周血，mPB)HSPC二者。
本发明人已经证明，通过在可溶性TNF-α(肿瘤坏死因子α，Uniprot P01375，RefSeq NP_000585，SEQ ID NO：8)存在下将CD34+细胞暴露于Notch配体，可以从所述CD34+细胞增加T细胞前体的量。所述暴露在适于产生祖细胞T细胞的条件下进行。任选地，细胞也暴露于含有RDGS基序和/或CS-1基序和任选的肝素结合结构域的纤连蛋白片段。优选地，所述纤连蛋白片段含有RDGS基序、CS-1基序和肝素结合结构域。
TNF主要作为长233个氨基酸且以稳定的同源三聚体排列的II型跨膜蛋白产生。人TNF-α的分泌形式呈三棱锥形，重约17kDa。
如WO 2016/055396中所公开的，可以使用RGDS肽和/或CS-1肽代替纤连蛋白片段来实施本文公开的方法。优选组合使用RGDS和CS-1肽，特别是融合在同一蛋白中。因此，RGDS和/或CS-1肽可以原样存在于培养基中或在存在于培养基中的多肽或蛋白内。当培养基仅含有原样存在的RGDS和/或CS-1肽时，如果这些肽未固定在培养容器的内表面上，则可以将这些肽作为培养基中的“游离”肽。实际上，肽可以在溶液中或固定在容器的内表面上，CD34+细胞在其中暴露于固定的Notch配体。
然而，如上所述，优选使用含有RGDS和CS-1形式(pattern)以及肝素结合结构域的纤连蛋白片段。纤连蛋白片段可以处于溶液中的游离状态或固定在培养容器的内表面上。
该过程在容器中体外进行，例如细胞培养板(培养皿，24孔阵列等)，优选Notch配体固定在其内表面上。然而，Notch配体可以固定在培养基中存在的任何其他支持物上，例如珠子(特别是微珠)的表面上。Notch配体的固定实质上旨在稳定配体，以允许Notch受体激活CD34+细胞。
“T细胞祖细胞”是指参与从CD34+HSPC至T淋巴途径的分化途径的任何细胞。因此，该细胞的特征在于它表达CD7标记物，已知其是T细胞的淋巴细胞生成期间最早的标记物之一。根据T淋巴途径中的分化状态，它可以表达或不表达CD34标记物(分化过程中CD34丧失)。这种T细胞祖细胞也可以表达或不表达CD5标记物。
“T细胞祖细胞”是可以在出生后胸腺中发现的那些细胞，即早期胸腺祖细胞(ETP)(CD34+/CD45RA+/CD7+)、proT1细胞(CD34+CD45RA+CD7++CD5-CD1a-)、proT2细胞(CD34+CD45RA+CD7++CD5+CD1a-)和preT细胞(CD34-CD7++/CD5+CD1a+)。T细胞受体(TCR)基因座以高度有序的方式重排(TCRδ-TCRγ-TCRβ-TCRα)。值得注意的是，第一次功能性TCR重排发生在CD34-CD7++/CD5+CD1a+preT细胞阶段(Dik等,J Exp Med 2005；201:1715-1723)。T细胞祖细胞在现有技术中众所周知。它们尤其由Reimann等(STEM CELLS 2012；30:1771-1780.)和Awong等(2009，如前所引用)引用。
术语“RGDS肽”旨在表示含有RGDS形式的任何肽或蛋白，以使其可以结合整联蛋白VLA-5。可以通过本领域已知和报道的方法测试这种肽或蛋白结合VLA-5整联蛋白的能力。RGDS肽与整联蛋白VLA-5(极晚期抗原-5)结合，后者是由CD49e(α5)和CD29(β1)组成的二聚体。
肝素结合结构域是本领域已知的并且存在于与肝素结合的许多蛋白中。它们的序列通常是XBBXBX或XBBBXXBX(B＝碱性氨基酸；X＝亲水性氨基酸(acide aminéhydropathique)；Cardin和Weintraub,Arterioscler Thromb Vasc Biol.1989；9:21-32，SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5)。
当CD34+细胞暴露于病毒(特别是逆转录病毒)载体以转导它们并获得表达转基因的T细胞祖细胞时，这种肝素结合结构域的存在是特别有利的。
CS-1肽或CS-1形式是25个氨基酸的肽(DELPQLVTLPHPNLHGPE ILDVPST，SEQ IDNO：6)，由Wayner等,1989,J.Cell Biol.109:1321公开。该CS-1形式与VLA-4(极晚期抗原-4)受体结合。该抗原是二聚体整联蛋白，由CD49d(α4)和CD29(β1)组成。
在一个具体实施方案中，纤连蛋白片段存在于培养基中或固定在容器的内壁(特别是底部)上。纤连蛋白是一种蛋白，其天然形式是100nm长和460kDa的V形大二聚体。这两个单体在其C-末端通过两个二硫键连接。术语“纤连蛋白”或“纤连蛋白片段”应理解为天然纤连蛋白(即通过选择性剪接产生的任何同种型)，但也指该蛋白的单体，或该蛋白的片段(但含有肽RGDS以及CS-1肽和肝素结合位点)。
特别适用于实施本文公开的方法的纤连蛋白是该蛋白对应于人纤连蛋白的片段(CH-296片段，Kimizuka等,J Biochem.,1991年8月.110(2):284-91，Chono等,J Biochem 2001年9月,130(3):331-4)并含有优选用于实施该方法的三个功能结构域(含有RGDS肽的细胞结合C结构域、肝素结合结构域和CS-1序列)。该蛋白特别是由TakaraBio Inc.公司(Shiga，日本)出售。
在一个具体实施方案中，对纤连蛋白片段进行固定(即结合到固体支持物上并且不游离存在于溶液中(尽管可能在溶液中发现某些成分))。该固体载体优选是在其中实施所述方法的容器的底壁。然而，还可以将纤连蛋白片段结合到珠子上，例如聚合物或磁珠(直径通常在1和5μm之间)。蛋白或肽与这些珠子的结合可以是或可以不是共价的。将蛋白或肽连接到珠子上的方法是本领域已知的。还可以将纤连蛋白片段引入半固体培养基，例如琼脂或凝胶。
当纤连蛋白片段固定在支持物上(特别是在其中进行该方法的容器的底壁)时，该固定也可以是共价的或不是共价的。在一个优选的实施方案中，通过使纤连蛋白片段吸附到构成容器底壁的玻璃或塑料上而非共价地进行这种固定。
在一个具体实施方案中，如上所述，CD34+细胞向T细胞祖细胞的分化与利用载体(例如病毒载体或核酸片段，例如质粒或质粒RNA或DNA序列)转导或转染(包括nucleofectionTM，其是由Lonza开发的特异性电穿孔系统)CD34+细胞一起进行，以将目的基因(或基因编辑系统)引入这些细胞。这意味着暴露于Notch配体、纤连蛋白片段和TNF-α的细胞也暴露于病毒上清液的时间是暴露于Notch配体、纤连蛋白片段和TNF-α的时间的至少一部分。
对于进行细胞转导的操作条件，WO 2016/055396的教导明确适用于本方法，并因此被认为在本申请中明确记载了。
人们可以引用，特别是：
(iv)将细胞暴露于Notch配体、纤连蛋白片段和TNF-α一段时间(优选超过4小时，更优选超过6小时，或超过8小时或10小时，但少于36小时，更多优选少于30小时或少于24小时)，使用本领域已知的并在WO2016/055396中公开的适当细胞因子，并加入病毒上清液适当的持续时间(优选超过4小时，更优选超过6小时、8小时或10小时，并优选少于30小时，更优选少于24小时，更优选约16小时)。
(v)如WO 2016/055396中所教导的，如果需要，进行第二次转导。
(vi)将该方案用于基因治疗方案中的自体造血干细胞移植，以使转基因添加患者中不存在或缺陷的蛋白，从而带来治疗益处。
(vii)可用的转基因：纠正免疫缺陷的基因(特别是严重联合免疫缺陷SCID或不严重的，CID)，HIV，X-连锁肾上腺脑白质营养不良，血红蛋白病，特别是β-地中海贫血或镰状细胞病。人们还可以使用编码嵌合抗原受体(CAR，即识别由癌细胞特异性表达的细胞表面蛋白的细胞表面蛋白)的基因作为转基因，以通过工程化的CAR-T细胞引发针对癌细胞的免疫应答。
(viii)优选使用病毒上清液以允许将转基因插入细胞基因组中，特别是使用本领域已知并描述的慢病毒。
(ix)在CD34+细胞预活化4至36小时，优选6至24小时后，在细胞培养基中引入病毒载体。
(x)将细胞暴露于病毒载体4至30小时，优选12至24小时，更优选约16小时，并除去病毒载体(收获和洗涤细胞，并在Notch配体、纤连蛋白片段和TNF-α存在下重悬这些细胞)。
如上所述，在另一个实施方案中，将CD34+细胞暴露于使得可以进行基因编辑的系统。此类系统现在广为人知并在本领域中有所描述，并且基本上基于核酸双断裂修复。这种基因组编辑系统可以使用选自下组的核酸酶：大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)和CRISPR-Cas核酸酶。在暴露于如上所述的成分以及因此存在TNF-α期间CD34+细胞增殖的事实，使得可以使用这些需要细胞增殖的基因编辑系统。
在具体实施方案中，Notch配体是δ样1蛋白(SEQ ID NO：1)或其片段(可溶性结构域)。
在另一个优选的实施方案中，Notch配体是δ样4蛋白(SEQ ID NO：2)。
在具体实施方案中，所述Notch配体是融合蛋白，其包含与IgG蛋白Fc区融合的天然Notch配体的可溶性结构域。如本领域所知，Notch配体的可溶性结构域代表所述配体的细胞外部分。Varnum-Finney等(J Cell Sci.,2000年12月；113Pt 23:4313-8)描述了DL-1的可溶性部分与IGg1的Fc部分的融合蛋白。Reimann等(如上引用的)描述了DL-4的可溶性部分(氨基酸1-526)与IgG2b免疫球蛋白的Fc片段的融合蛋白。因此，当IgG蛋白是IgG2时，它是优选的。在优选的实施方案中，本文公开的方法中使用的Notch配体的序列是SEQ IDNO：7。包含与人IgG1的Fc区在C末端融合的人DLL4(全长DLL4登录号NP_061947.1)的细胞外结构域(Met 1-Pro524)的市售产品(Sino Biologicals)是DL4蛋白，其也适用于本发明。
在本文公开方法的上下文中使用的培养基是适于培养CD34+细胞和T细胞的任何培养基。尤其可以提及的是α-MEM、DMEM、RPMI 1640、IMDM、BME、McCoy's 5A、StemSpanTM，特别是SFII(StemCell Technologies)培养基或Fischer培养基。StemSpanTM SFII培养基尤其含有Iscove的MDM、牛血清白蛋白、重组人胰岛素、人转铁蛋白(铁饱和的)、2-巯基乙醇。
用于实施本文公开的方法的合适且优选的培养基是X-VIVOTM培养基(Lonza，Basel，瑞士)。该培养基尤其由Jonuleit等(Eur J Immunol,1997,27,12,3135-42)和Luft等(J Immunol,1998,161,4,1947-53)使用。
优选地，使用基础培养基(即，允许细胞生长而不需要添加补充物的培养基)，然而，其中优选添加血清和/或生长因子和细胞因子。
因此，优选将胎牛血清FBS或胎牛血清FCS、自体人血清或人AB血清加入基础培养基中。优选地，该培养基补充有至少15％的胎牛血清，更优选至少20％。FBS特别适合于该方法的实施。特别的，优选使用特级FBS(defined FBS)。特级FBS是高质量的血清，其已经过分析和过滤以避免存在病毒颗粒。它由许多供应商原样销售，例如Thermo ScientificTM的HyCloneTM Defined Fetal Bovine Serum(FBS)。
除TNF-α外，培养基还优选补充有细胞因子和生长因子。这些细胞因子和生长因子尤其选自SCF(干细胞因子)、血小板生成素(TPO，也称为巨核细胞生长和发育因子，MGDF)、Flt3配体(其是造血生长因子)、白介素3(IL-3)、白介素7(IL-7)和SCF(干细胞因子)。在具体实施方案中，除TNF-α外，培养基还含有至少三种，优选至少四种这些细胞因子或生长因子。
在优选的实施方案中，特别是对于不用病毒载体转导的T细胞前体的产生，加入至少或恰好三种细胞因子。优选地，这三种细胞因子是白介素-7(IL-7)、SCF(干细胞因子)和Flt-3配体(造血生长因子)。
在另一个优选的实施方案中，加入四种细胞因子，即上述三种细胞因子和TPO(血小板生成素)。
在另一个具体实施方案中，特别是用于产生用病毒载体转导的T细胞前体，细胞因子和生长因子的性质可以在该方法的实施过程中变化。
因此，如果在添加病毒载体之前有预先激活细胞的步骤，则IL-3、IL-7、SCF、TPO和Flt3-L可用于培养基中，并随后在去除载体后向培养基补充仅IL-7、SCF、TPO和Flt3-L。
上述细胞因子和生长因子混合物足以诱导CD34+细胞分化成T细胞前体，并且通常培养基不包含除TNF-α之外的其它细胞因子或生长因子，如实施例中所述，这使得可能增加T细胞前体的数量。
在本文预见的方法中，CD34+细胞在Notch配体、呈现RGDS基序的蛋白或肽和TNF-α存在下的总暴露时间通常进行一段时间，优选大于3天并少于10天。
该暴露可以根据细胞是否被转导而变化。因此，对于未转导的成年干细胞，3天的暴露时间可能是足够的，而对于婴儿干细胞或进行转导时，通常更长(约7天)。
CD34+细胞获自骨髓穿刺、脐带血或来自成人供体的外周血，其已经特别用G-CSF或本领域已知的任何其他动员剂进行动员。用于分选CD34+细胞的方法是本领域已知的。特别地，具有识别其表面的CD34的抗体的磁珠可用于此目的。
优选地，通过在暴露CD34+细胞之前将Notch配体和纤连蛋白片段固定在内部(优选下部)表面上来制备细胞培养容器。或其他纤连蛋白天然贴附于细胞培养箱的塑料上(培养皿或24孔盒或其他)。类似地，如果Notch配体用作与免疫球蛋白Fc片段的融合蛋白，则该Fc片段也贴附于塑料上。因此，这足以使容器在这些化合物存在下保持几小时，以获得合适的包被。在WO 2016/055396中详细公开了用Notch配体和纤连蛋白片段包被这种培养容器的方法，并且可以应用于实施本文公开的方法。
需要注意的是，根据WO 2016/055396，当使用5μg/ml时，约75％的DL-4将贴附到容器表面，最佳剂量高于或等于1.25μg/ml并优选在2.5和5μg/ml之间。
关于纤连蛋白片段，特别适合的浓度是25μg/ml(特别是当使用时)，尽管可以使用其他浓度(更高或更低)。
在本文公开的方法的实施中，在培养容器中以106至107细胞/ml，特别是约2×106CD34+细胞/ml的浓度添加CD34+细胞。
根据细胞是否被转导以及是否是CD34+细胞，可以使用2至10cm2的板(即24至6个孔的板)。当使用24孔板时，在每个孔中加入104至106个CD34+细胞，优选每孔加入2×104至4×105个CD34+细胞。当使用6孔板时，每孔将添加8×104至2×106个细胞。
根据所使用的容器，本领域技术人员可以调整添加的细胞数量。
如上所述，将细胞置于孔中，在补充有TNF-α，并优先补充有生长因子和细胞因子的选定的基础培养基中。
细胞因子或生长因子的浓度为2至300ng/ml。优选地，浓度高于40ng/l且低于300ng/ml或200ng/l，更优选约100ng/ml。
然而，当人们希望产生转导的T细胞祖细胞时，并且当细胞在暴露于病毒载体之前被预活化时，可以使用更高的浓度(约300-400ng/ml)。在该实施方案中，使用的SCF和Flt3-L浓度范围可以为300ng/ml，TPO和IL-7的浓度范围为100ng/ml，IL-3为约40ng/ml。
TNF-α优选以等于或高于5ng/ml的浓度使用。实际上，如实施例中所证明的，这种低浓度足以获得T细胞前体的增殖，而不改变分化途径。
但是，也可以使用更高的浓度。特别地，TNF-α浓度可高达300ng/ml或200ng/ml。适当的浓度为约100ng/ml。然而，其他浓度如10ng/ml、20ng/ml或50ng/ml也是合适的。
因此，本发明涉及用于产生T细胞前体的体外方法，其包括在固定的Notch配体和任选的如上公开的纤连蛋白片段存在下，在包含TNF-α的合适培养基中，培养CD34+细胞的步骤。
因此，本发明涉及扩增T细胞前体的体外方法，其包括在固定的Notch配体和任选的如上公开的纤连蛋白片段存在下，在包含TNF-α的合适培养基中，培养CD34+细胞的步骤。
扩增T细胞前体意指与不使用TNF-α时相比，存在更多T细胞前体，和/或存在比容器中引入的CD34+细胞数更多的T细胞前体。
特别地，通过上述方法获得的T细胞前体是CD34-/CD7+/CD5-前体。
通常，细胞也不含有CD1a标记物。
在优选的实施方案中，通过上述方法获得的T细胞前体是CD34-/CD7+/CD1a-前体。
这意味着如通过流式细胞术分析的，通过本方法获得的T细胞前体群表达CD7标记物，并且表达该标记物的超过80％的细胞具有上述表型(不表达
-CD34和CD1a，或
-CD34和CD5，或
-CD34和CD1a和CD5)。该表型通常在培养7天后获得。
如所指出的，CD34+细胞优选不是脐带血细胞。然而，该方法也可以与脐带血CD34+细胞一起使用并且适用于脐带血CD34+细胞，并且它还产生改善的结果。
当用从成年患者分离的CD34+细胞实施时，该方法特别吸引人。所述患者可以是健康供体，或患有疾病的供体，并且特别是通过病毒转导来纠正细胞的供体。
细胞可以培养超过3天，优选至少5天，更优选至少或恰好6天，最优选至少或恰好7天，尽管培养持续时间可以持续更长时间。
在本文公开的方法中，优选从第0天(即在CD34+细胞培养开始时)将TNF-α添加到培养基中，并且在培养基中保持存在至少3天，优选培养细胞的全部时间(即优选约7天)。
当进行本文公开的方法时，可以在已经含有TNF-α的培养基中进一步添加StemRegenin 1(SR1，4-(2-(2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-异丙基-9H-嘌呤-6-基氨基)乙基)苯酚，CAS 1227633-49-10)。
本发明还涉及获得T细胞祖细胞的方法，其包括以下步骤：
a.执行上面公开的方法和
b.纯化由此获得的产生的T细胞祖细胞。
可以通过洗涤细胞并将其重悬于基础培养基中来进行纯化。
该方法还可包括在患者注射用小袋中对T细胞祖细胞条件化的步骤。
在这种情况下，优选的是将这些细胞在含有5％HSA的盐水溶液中再条件化，例如albunormTM 5％50g/L(Octopharma，Lingolsheim，法国)。
也可以根据本领域已知的方法冷冻这些细胞。
本发明还涉及一种用于静脉内注射的小袋，其含有T细胞祖细胞群(易于获得或通过上述方法获得)，其中该群中CD7+细胞的比例高于80％，更优选高于85％。
本发明还涉及用于静脉内注射的小袋，其含有CD7+T细胞祖细胞群(易于获得或通过如上所述的方法获得)，其中CD34-且CD5-的细胞(CD7+且均CD34-和CD5-的细胞)在该群中的比例高于80％，更优选高于85％。
本发明还涉及用于静脉内注射的小袋，其含有CD7+T细胞祖细胞群(易于获得或通过如上所述的方法获得)，其中CD34-细胞(CD7+且CD34-的细胞))在该群中的比例高于50％，更优选高于60％。此外，该群中至少80％，更优选至少85％的细胞是CD1a-细胞。
本发明还涉及获得转化的T细胞祖细胞的体外方法，其包括以下步骤：
a.在固定的Notch配体存在下，在含有TNF-α的合适培养基中培养CD34+细胞
b.将细胞暴露于用于转染或转导CD34+细胞的载体。
如上所述，并且在再次洗涤和培养细胞的步骤之后，获得转化的T细胞祖细胞(表达整合在其基因组内的转基因)。
本发明还涉及获得修饰的T细胞祖细胞的体外方法，其包括以下步骤：
a.在固定的Notch配体存在下，在含有TNF-α的培养基中培养CD34+细胞
b.在细胞培养期间将细胞暴露于含有适于基因编辑的元件的载体或核酸序列至少一段时间。
因此，在可能的洗涤和培养步骤之后，获得通过基因编辑修饰的T细胞祖细胞。
本发明还涉及T细胞祖细胞，特别是通过本文公开的方法获得的T细胞祖细胞，其用于免疫抑制的患者，特别是用于该患者中的免疫重建和/或在所述患者中获得针对感染的免疫保护，在几个月的期间(至少两个月，最好是至少六个月)。
在具体实施方案中，患者是免疫抑制的患者。缺陷的原因可能是多方面的：遗传性免疫缺陷，白血病化疗，条件化(conditioning)，仅含有干细胞的移植，用于预防GVH(移植物抗宿主病)的移植后治疗，患者年龄和并发症如感染。
特别地，在造血干细胞移植之前的治疗之后，患者由于免疫细胞耗尽而可以被免疫抑制。在该实施方案中，移植物可以是同种异体移植物(在这种情况下，T细胞祖细胞优选衍生自部分HLA相容的供体)，或自体移植物(在这种情况下，T细胞祖细胞优选被载体转化，以表达可以纠正所述患者中遗传缺陷的基因和/或蛋白)。
T细胞祖细胞优选是CD7+细胞群(即群中至少75％，更优选至少80％的细胞表达CD7标记物的群)。该群也是本发明的一部分。特别是，它易于通过本文公开的方法获得。在具体实施方案中，它通过本文公开的方法获得。
更具体地，T细胞祖细胞优选是CD7+细胞群(即，群中至少75％，更优选至少80％的细胞表达CD7标记物的群)，其中该群中CD34-且CD5-细胞(CD7+且CD34-和CD5-的细胞)的比例高于80％，更优选高于85％。该群也是本发明的一部分。特别是，它易于通过本文公开的方法获得。在具体实施方案中，它通过本文公开的方法获得。
在另一个实施方案中，T细胞祖细胞优选是CD7+细胞群(即群中至少75％，更优选至少80％的细胞表达CD7标记物的群)。在该群中，超过50％，更优选超过60％的细胞不表达CD34标记物。在该群中，至少80％，更优选至少85％的细胞不表达CD1a标记物。该群中CD7+CD1a-细胞的比例优选为至少80％。该群也是本发明的一部分。特别是，它易于通过本文公开的方法获得。在具体实施方案中，它通过本文公开的方法获得。
为了确定细胞是否对表面标记物(CD7、CD34、CD5或CD1a)呈阳性，可以使用本领域已知的任何方法，特别是在用针对表面抗原的荧光抗体标记细胞后，使用流式细胞术。原理是对于群的每个细胞，将以给定强度发射信号，并且如果信号高于给定阈值，则认为细胞对抗原呈阳性。
对于CD34：使用由HPSC群(例如从脐带血或从动员的外周血分离的)组成的对照群来确定适当的阈值。在该细胞群中，细胞是CD34+CD7-CD5-或CD34+CD7-CD1a-。通过该对照，可以确定将用于确定另一群中的细胞是否对这些抗原呈阳性的每种抗原的阈值。
对照群通常含有约90％的CD34+CD7-CD5-或CD34+CD7-CD1a-造血干细胞。阈值是可以以90/10比例对群的细胞进行分选的信号强度水平。
对于CD7(分别地，CD5或CD1a)：使用通过本领域已知的任何技术，特别是密度梯度技术，例如Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare Life Sciences)分离外周血单核细胞(PBMC)获得的对照群。CD7(分别地，CD5或CD1a)阳性细胞使用本领域已知的任何技术分离，例如技术(磁性细胞分离和细胞分离，Miltenyi Biotec)，其使用具有抗CD7(分别地，抗CD5或抗CD1a)抗体的磁珠。在该群中，细胞基本上是CD7+(分别地，CD5+或CD1a+)，据信该比例为约90/10。
用于评估细胞是否对表面抗原呈阳性的阈值是使用该抗原的对照群来确定的，并且将是对照群中超过90％的细胞具有更高信号强度的强度。
因此，如果该抗原的强度信号高于如上确定的阈值，则认为细胞对抗原呈阳性，并且如果该抗原的强度信号低于如上确定的阈值，则认为对抗原呈阴性。
群中绝大多数T细胞祖细胞不表达CD1a标记物的事实可证明是有利的，因为表达该CD1a标记物的细胞可能不是非常有效地到达胸腺并且因此对于体内再群体化(repopulation)而言与CD1a-细胞效率一样。由于CD1a+细胞的重建潜力是不确定的，因此优选降低群中此类细胞的量。
本发明还涉及治疗免疫抑制患者的方法，特别是为了允许至少暂时地对该患者进行免疫重建，其包括给所述患者施用如上所述的T细胞祖细胞的步骤。
该方法还可包括在上述条件下通过在TNF-α(如上所述)存在下，将CD34+细胞暴露于Notch配体并且优选暴露于具有RGDS基序和/或CS1基序的蛋白或肽，特别是如上所述的纤连蛋白片段，来获得此类祖细胞的步骤。
特别地，施用治疗有效量，即每kg 1至5×106个祖细胞的数量级，这使得可以为患者提供能够在几个月内(大约6个月的数量级)发挥针对感染的保护作用的细胞。
优选地，T细胞祖细胞的这种施用恰好在所述患者中进行造血干细胞移植之前、之后或同时进行。如上所述，注射的细胞可以用旨在允许纠正所述患者中的遗传缺陷的载体进行转化。
在另一个实施方案中，将T细胞祖细胞注射到不需要造血干细胞移植的患者。实际上，可以使用转化或转导的T细胞祖细胞来治疗一些其中只有T细胞受到影响的免疫缺陷、HIV或癌症患者(使用修饰以导致CAR-T细胞的祖细胞)，而无需执行免疫系统耗尽的化疗。
应注意，如用TNF-α所公开的本发明的教导也适用于嘌呤衍生物StemRegenin 1(SR1，在Boitano等,Science.2010年9月10日；329(5997):1345-8)。因此，SR1可以取代TNF-α(即代替TNF-α使用)以从CD34+细胞(具有分化的开始和细胞的扩增(细胞数量的增加))获得T细胞祖细胞。SR1的浓度优选在750nM(30ng/ml)的范围内，也可以更高的浓度，例如1500nM或2500nM(100ng/ml)，或甚至5000nM(200ng/ml)，或较低的浓度，例如500nM(20ng/ml)。当单独使用，特别是与TNF-α组合使用时，可以使用低得多的浓度，低至3ng/ml或10ng/ml。合适的浓度还包括30ng/ml或100ng/ml。因此，任何高于3ng/ml或高于10ng/ml的浓度都适合于增加CD34+细胞向T细胞祖细胞的分化。
SR1是芳烃/二噁英受体(AhR)的配体(拮抗剂)。其他AhR拮抗剂可单独使用，或与TNF-α联合使用，以促进CD34+细胞分化为T细胞祖细胞谱系。可以引用白藜芦醇(resveratrol)、奥美拉唑(omeprazole)、木犀草素(Luteolin)、α-萘黄酮(alpha-naphthoflavone)、美西律(mexiletine)、曲尼司特(tranilast)、6,2',4'-三甲氧基黄酮、CH 223191(1-甲基-N-[2-甲基-4-[2-(2-甲基苯基)二氮烯基]苯基-1H-吡唑-5-甲酰胺，CAS 301326-22-7)。考虑到拮抗剂的IC50(SR1的IC50为127nM，而CH 223191的IC50为30nM)以及一些产品在高浓度(如α-萘黄酮)或依赖于细胞环境(如奥美拉唑)使用时可能对AhR具有激动剂活性的事实，本领域技术人员根据具体情况确定AhR拮抗剂的量。鉴于SR1和CH223191之间IC50的差异，可以预见CH 223191的有效浓度将远低于本文公开的SR1的有效浓度。
因此，本发明还涉及
(i)一种产生T细胞前体的体外方法，其包括在固定的Notch配体存在下，在含有芳烃/二噁英受体拮抗剂，特别是StemRegenin 1(SR1)的培养基中培养CD34+细胞的步骤。
(ii)如上所述的体外方法，其中培养基还含有TNF-α。
(iii)如上所述的体外方法，其中芳烃/二噁英受体的拮抗剂，特别是SR1，从培养的第0天开始存在于培养基中。
(iv)上述任一项所述的体外方法，其中CD34+细胞已从成年供体或脐带血分离。
(v)上述任一项所述的体外方法，其中细胞在芳烃/二噁英受体拮抗剂，特别是SR1存在下培养至多10天。
(vi)上述任一项所述的体外方法，其中细胞在芳烃/二噁英受体拮抗剂，特别是SR1存在下培养3至7天。
(vii)上述任一项所述的体外方法，其中将芳烃/二噁英受体的拮抗剂，特别是SR1，以1ng/ml至300ng/ml，并且优选高于或等于1ng/ml，或高于或等于3ng/ml，或高于或等于10ng/ml，并且优选低于200ng/ml，或150ng/ml，并通常在3ng/ml至100ng/ml之间的浓度加入培养基中。
(viii)上述任一项所述的体外方法，其中Notch配体是与IgG蛋白优选IgG2蛋白的Fc区融合的δ样4配体的可溶性结构域。
(ix)上述任一项所述的体外方法，其中所述细胞也暴露于纤连蛋白片段，其中所述片段包含RGDS和CS-1形式以及肝素结合结构域，优选固定在培养容器内表面上。
(x)上述体外方法，其中纤连蛋白片段是如上公开的
(xi)上述任一项所述的体外方法，其中培养基在CD34+细胞暴露于Notch配体的至少一段时间内还含有用于转染或转导CD34+细胞的载体。
(xii)上述任一项所述的体外方法，其中培养基含有至少三种，优选全部四种细胞因子或生长因子，其选自白介素7(IL-7)、SCF(干细胞因子)的、血小板生成素(TPO)和Flt3配体(FLT3L)。
(xiii)一种获得T细胞祖细胞的(体外)方法，其包括以下步骤：
a.进行上述任一项所述的方法和
b.纯化产生的T细胞祖细胞
c.任选地在患者注射用小袋中条件化T细胞祖细胞。
(xiv)一种获得转化的T细胞祖细胞的体外方法，其包括以下步骤：
a.在固定的Notch配体存在下，在含有芳烃/二噁英受体拮抗剂特别是SR1的培养基中，培养CD34+细胞
b.将细胞暴露于用于转染或转导CD34+细胞的载体。
(xv)一种获得修饰的T细胞祖细胞的体外方法，其包括以下步骤：
a.在固定的Notch配体存在下，在含有芳烃/二噁英受体拮抗剂特别是SR1的培养基中，培养CD34+细胞
b.将细胞暴露于包含适于基因编辑的元件的载体或核酸序列。
本发明还涉及用于进行如上所述的任何方法的试剂盒，其包括：
(i)含有Notch配体(特别是与IgG蛋白特别是IgG2蛋白的Fc区融合的δ样配体的可溶性结构域)和任选的纤连蛋白片段的包被培养基
(ii)适于培养(和/或扩增)CD34+细胞和T细胞的培养基，例如α-MEM、DMEM、RPMI1640、IMDM、BME、McCoy's 5A、StemSpanTM SFII(StemCell Technologies)培养基、X-VIVOTM培养基或Fischer培养基
(iii)含有TNF-α和优选的三种细胞因子的祖细胞扩增培养基，特别是选自SCF、TPO、Flt3L和IL-7的细胞因子。当祖细胞扩增培养基含有TNF-α和所有四种细胞因子SCF、TPO、Flt3L和IL-7时是优选的。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含上述的相同的成分(i)和(ii)和祖细胞扩增培养基(iii)的试剂盒，所述祖细胞扩增培养基(iii)包含芳烃/二噁英受体拮抗剂，特别是SR1，和优选的三种细胞因子，特别是选自SCF、TPO、Flt3L和IL-7。当祖细胞扩增培养基含有SR1和所有四种细胞因子SCF、TPO、Flt3L和IL-7时是优选的。
在另一个实施方案中，祖细胞扩增培养基(iii)含有TNF-α和芳烃/二噁英受体拮抗剂，特别是SR1，和优选的三种细胞因子，特别是选自SCF、TPO、Flt3L和IL-7。当祖细胞扩增培养基含有TNF-α、SR1和所有四种细胞因子SCF、TPO、Flt3L和IL-7时是优选的。
这种试剂盒特别改造和设计用于进行本文公开的方法。
首先使用包被培养基(i)包被培养容器的壁。
然后使用培养基(ii)培养CD34+细胞(从脐带血或从动员的外周血获得，特别是从成人获得)。这种培养基通常并且优选以1x浓度使用(即它可以不经稀释使用)。
培养基(iii)通常以10倍稀释度提供(即必须稀释于培养基(ii)中才能使用)。然后如上所述，将来自培养基(ii)和(iii)的重构培养基用于促进CD34+细胞向T细胞谱系中的T细胞祖细胞的分化。
本发明还涉及增加有此需要的受试者中T细胞数量的方法，该方法包括给受试者施用有效数目的通过本文公开的方法获得的祖细胞T细胞。
本发明还涉及通过本文公开的任何方法获得的祖细胞T细胞，用于治疗需要增加T细胞数量的受试者。
特别地，受试者是人类。
特别地，施用的祖细胞T细胞是自体的。在另一个实施方案中，施用的祖细胞T细胞是同种异体的。
特别地，需要增加T细胞数量的受试者具有引起或导致淋巴细胞减少的医学病况，特别是癌症、HIV感染、部分胸腺切除术、自身免疫疾病和/或器官移植。
附图说明
图1：培养3天(黑条)和7天(累积黑色和灰色柱)后，用来自脐带血(CB，图1A)或动员的外周血(mPB，图1B)的20000个CD34+细胞开始获得的总有核细胞数。NC：没有补充；SR1：添加StemRegenin 1(750nM)；TNF-α：添加TNF-α(100ng/ml)；+(a)、(b)、(c)：当培养0-3天(a)、培养0-7天(b)或培养4-7天(c)添加补足物时观察到的细胞数量。
图2：以来自脐带血(CB，图2A)或动员的外周血(mPB，图2B)的20000个CD34+细胞开始，在第7天获得的CD7+T细胞前体的数量。黑条：CD34+CD7+细胞；灰色柱：CD34-CD7+细胞，(a)、(b)、(c)：当培养0-3天(a)、培养0-7天(b)或培养4-7天(c)加入补足物时观察到的细胞数量。
图3：以在存在(灰色柱)或不存在(黑色柱)TNF-α下培养的来自脐带血(CB)或动员的外周血(mPB)的CD34+细胞开始，在获得的培养7天后的活细胞上分析Bcl11b的表达。
图4：TNF-α和Notch配体DL4对从CD34+脐带血细胞(CB，黑色柱，左侧)或动员的外周血(mPB，灰色柱，右侧)开始在第7天获得的CD7+细胞数量的组合效应。(+/-表示存在或不存在DL4或TNF-α)。
图5：以在存在(灰色柱)或不存在(黑色柱)TNF-α的情况下来自脐带血(CB)或动员的外周血(mPB)的CD34+细胞开始，获得的第7天的骨髓样细胞的频率(平均值±SEM)。
图6：在TNF-α的剂量反应测定中从第3天至第7天获得的总CD7+细胞数，从来自脐带血(CB，图6A)或动员的外周血(mPB，图6B)的CD34+细胞开始。
图7：从来自脐带血(CB，图7A)或动员的外周血(mPB，图7B)的CD34+细胞开始，在TNF-α剂量反应测定中CD34-CD7+细胞(灰色柱)与CD34+CD7+细胞(黑色柱)的比例。
图8：细胞周期不同阶段的细胞比例。A.CB：自脐带血分化的细胞；B.自动员的外周血细胞分化的细胞。NC：非补充；TNF-α：在TNF-α存在下(20ng/ml)培养的；SR1：存在SR1(30ng/ml)时的培养物。
图9：以在各种浓度的TNF-α和/或SR1存在下来自脐带血的CD34+细胞开始，培养7天后，培养的CD5+CD7+细胞的百分比(A)和总数(B)。
实施例
实施例1-材料和方法
人细胞
在儿童母亲提供知情同意后，将不符合建库要求的脐带血样本用于研究目的。在G-CSF动员后从健康供体收集动员的外周血(mPB)样品。直接富集样品的CD34+细胞。每个捐赠者(Biotherapy Department，Necker Hospital，巴黎)都给出了知情同意书。
将CD34+祖细胞暴露于Notch配体DL-4
来自人CB或动员的外周血样品的CD34+细胞在24孔板或6孔板中培养，所述板已经用重组人纤连蛋白(Clontech/Takara)和DL-4(5μg/ml，PX'Therapeutics，Grenoble，法国)包被。包被在37℃下进行2小时，然后将DL-4包被的孔用在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的2％牛血清白蛋白(BSA)在37℃封闭30分钟并用PBS洗涤。在补充有NaHCO3(7,5％)(Gibco，life Technology)和20％特级胎牛血清(Hyclone，ThermoFisher Scientific，lllkirch，法国)和重组人细胞因子白介素-7(IL-7)、Flt3配体(Flt-3)、干细胞因子(SCF)和血小板生成素(TPO)(均为100ng/ml，全部购自PeproTech Inc，Rocky Hill，NJ)且有或没有TNF-α(R&D Systems，US)的α-MEM培养基(Gibco，lifeTechnology)中，以2×104个细胞/孔或1×105个细胞/孔(分别针对24孔和6孔板)的浓度开始培养。培养3天后，用新鲜培养基替换一半细胞。在DL-4上分别培养3和7天后，通过荧光激活细胞分选(FACS)分析培养的细胞，以在随后的分析中排除CD34-/CD7-骨髓样细胞。
OP9/DL1细胞上的体外T细胞分化测定
如先前所述(Six等,Blood Cells Mol Dis.,2011年6月15日；47(1):72-8和Six JExp Med.2007年12月24日；204(13):3085-93)，在OP9/DL-1共培养中评估了天然CD34+CB细胞和通过暴露于DL-4而产生的TNF-α诱导的T细胞祖细胞的T淋巴潜能(potential)。
使用RT2 Profiler阵列进行实时定量聚合酶链反应
培养7天后，在Ariall上分选CD7+细胞。用Rneasy Micro Kit(Qiagen，Courtaboeuf，法国)分离来自第3天和第7天的分选细胞级分的总RNA。按照RT2 ProfilerPCR Array Handbook(SA Biosciences，Frederick MD)中详述的方案进行RT2 ProfilerPCR阵列。
流式细胞术分析和细胞分选
抗人CD34(AC136)、CD3(BW264/56)、CD45(5B1)的单克隆抗体购自MiltenyiBiotech(Bergisch Gladbach，德国)，并且CD4(SK4)、CD7(M-T701)、CD25(M-A251)、7-氨基放线菌素D(7AAD)来自BD Biosciences(San Jose，CA)。抗人CD8(RPAT8)来自SonyBiotechnology(San Jose，USA)。抗人Ctip2(Bcl11b)抗体来自Abcam(Cambridge，UK)。
对人细胞进行染色并使用Gallios分析仪(Beckman Coulter，Krefeld，德国)进行分析。来自异种接受者的细胞在设备(Miltenyi Biotech，BergischGladbach，德国)上进行分析。在对活的7AAD阴性细胞进行门控后，使用FlowJo软件(Treestar，Ashland，OR)分析数据。细胞亚群在ARIA II系统上分选。
细胞增殖测定
对于细胞增殖测定，在用DL-4和TNF-α(Life Technologies)培养之前，使用CellTraceTM CFSE试剂盒(Life Technologies，Carlsbad，CA)标记来自CB和mPB的CD34+细胞。从第3天至第7天的每天在培养前测量细胞的染色强度。在Gallios细胞计数器(BeckmanCoulter)上分析CFSE阳性细胞。
细胞周期测定
对于细胞周期分析，在室温下用PerFix-nc试剂盒(Beckman Coulter)的固定试剂固定15分钟后，用Hoechst33342(Life technology)和Ki67-PC5(BD Bioscience)染色细胞，并加入透化试剂。在对活的7AAD阴性细胞进行门控后，使用FlowJo软件(版本10.2，Treestar，Ashland，OR)分析数据。
将源自成人HSPC的体外产生的T细胞祖细胞过继转移到NSG新生小鼠中
所有动物实验和程序均按照法国农业部关于动物实验的规定进行。在NSG小鼠中注射体外产生的人T细胞祖细胞已得到高等教育和研究部(Ministry of HigherEducation and Research)的批准(APAFIS2101-2015090411495178v4)。
将NSG(NOD-Scid(IL2Rg空))小鼠(获自Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME，http：//www.jax.org)保持在无病原体设施中。将来自具有或不具有TNFα的7天DL-4培养物中mPB CD34+HSPC的子代(3×105或1×106)肝内注射到NSG新生小鼠(0-4天龄)中。对照小鼠注射3×105个非培养的mPB CD34+细胞或100ul PBS。
在移植后4至12周测定NSG小鼠的平均植入水平。对从股骨、胸腺、外周血和脾中收集的新鲜细胞进行流式细胞术分析。细胞用1x红细胞裂解缓冲液(Biolegend，US)处理并洗涤，然后用抗体染色。
T细胞受体多样性分析
一式两份并在两个独立纯化的亚组上进行TCR基因重排分析(显示平均值)。
用列出的引物和探针组进行TCR-δ定量(Dδ2-Dδ3，Dδ2-Jδ1和Dδ3-Jδ1)。
以下用于Dδ2-Dδ3重排：
Dδ2，5'-CAAGGAAAGGGAAAAAGGAAGAA-3'(SEQ ID No.9)；
Dδ3，5'-TTGCCCCTGCAGTTTTTGTAC-3'(SEQ ID No.10)；
和D'3探针，5'-ATACGCACAGTGCTACAAAACCTACAGAGACCT-3'(SEQ ID No.11)。
以下引物和探针用于Dδ2-Jδ1重排：
Dδ2，5'-AGCGGGTGGTGATGGCAAAGT-3'(SEQ ID No.12)；
Jδ1，5'-TTAGATGGAGGATGCCTTAACCTTA-3'(SEQ ID No.13)；
和Jδ1探针，5'-CCCGTGTGACTGTGGAACCAAGTAAGTAACTC-3'(SEQ ID No.14)
以下用于Dδ3-Jδ1重排：
Dδ3，5'-GACTTGGAGAAAACATCTGGTTCTG-3'(SEQ ID No.15)；
Jδ1引物和Jδ1探针。
通过多重荧光PCR分析TCR重排是通过在毛细管测序聚合物中分离荧光染料标记的单一PCR产物来进行的，并通过自动激光扫描来检测。
细胞凋亡检测
细胞用冷PBS洗涤，并以1百万细胞/ml的浓度重悬于结合缓冲液中。加入5ulAnnexin V-PE(BD Bioscience)和2ul 7AAD后，将细胞在室温下避光孵育15分钟。随后，用500ul结合缓冲液洗涤细胞，并重悬于100ul结合缓冲液中，以在1小时内进行分析。
实施例2：改善T细胞前体的扩增和分化
当CD34+细胞用DL-4培养时，图1显示，不管是从脐带血来源的(图1A)还是从PB来源的(图1B)CD34+细胞开始，与没有TNF-α的培养相比，向细胞培养基中加入TNF-α使得可以在第7天时增加回收的细胞总数10倍。
图2显示，不管是从脐带血来源的(图2A)还是从PB来源的(图2B)CD34+细胞开始，向细胞培养基中添加TNF-α使得可能将CD7+细胞的数量增加20至40倍。CD34-CD7+细胞群的增加尤其高。
实施例3：T细胞祖细胞的表面标记物的分析
通过流式细胞术测定培养7天后获得的细胞表面上存在的表面标记物。
这些表显示，添加TNF-α导致CD7+细胞比例增加，而实际上没有增加CD5+细胞的比例。
培养7天后，HSPC分化成CD34-CD7+CD5-T细胞前体。
还通过流式细胞术测定了培养10天后获得的细胞表面上存在的表面标记物。
未发现CD1a的表达(数据未显示)。
研究了表面标记物修饰的动力学，发现培养基中TNF-α的存在从第4天到第7天增加了CD7+的比例(数据未显示)。
实施例4：T细胞受体的重排
在培养7天后，在有或没有TNF-α或SR1的情况下，DL-4T细胞前体没有表现出任何TCR重排的迹象(数据未显示)。
进行重排的具体分析：
TCRδ重排的结果
检测CB-NC et CB-SR1中的Dδ2-Dδ3重排。没有检测到其他TCRδ重排。结果与RQ-PCR定量一致。
TCRγ重排的结果
未检测到TCRγ重排。
TCRβ重排的结果
没有检测到TCRβ重排。
实施例5：TNFα诱导的T细胞前体的T-定型
Bcl11b是自T细胞定型以来唯一打开的重要转录因子，并且是T细胞分化所必需的。
用TNF-α培养的T细胞前体的细胞内染色显示Bcl11b对脐带血和mPB来源的CD34+细胞均呈阳性表达。图3显示TNF-α增加表达Bcl11b转录因子的总细胞的比例。当与TNF-α一起培养时，表达Bcl11b的细胞的比例增加。
实施例6：其他谱系的分化
评估了其他谱系特异性的其他细胞表面标记物(CD14和CD33)的存在。
图5显示存在TNF-α的培养物使得这样的细胞不可检测，而当CD34+细胞在没有TNF-α的情况下培养时，它们的比例小于22％。
实施例7：TNF-α减少细胞的凋亡
研究了凋亡标记物(7AAD和Annexin5)。
该表显示存在TNF-α的培养物减少了凋亡标记物的存在。这对于mPB尤其明显。
实施例8：TNF-α的剂量反应测定
使用各种剂量的TNF-α。
图6显示，不管对于CB细胞(图6A)还是mPB细胞(图6B)，当浓度超过10ng/ml时，TNFα都可以在培养期间增加CD7+细胞数量。
剂量反应的动力学显示，在DL-4中培养仅4天后，TNF-α就增加了T细胞分化。浓度10、50和100ng/ml之间没有差异(未显示)。
为了确定有效浓度的阈值，进行较低浓度(0.01-10ng/ml)的分析。
发现TNF-α对CB和mPB在T细胞分化(CD34-CD7+细胞百分比)上的影响在低浓度下是浓度依赖性的(图7)。CD7+ T细胞前体的总数从5ng/ml至100ng/ml没有差异。
实施例9：培养期间的增殖分析
与没有TNF-α的培养条件相比，发现TNF-α自DL-4培养的第3天起增加CD34+CD7+ T细胞前体的增殖(数据未显示)。
实施例10：TNF-α和Notch配体之间的协同作用
图4显示，没有DL4，CB和mPB都不能分化成CD7+ T细胞前体，这甚至用TNF-α补足培养基也无法挽救。
当存在TNF-α和Notch配体时，观察到的效果非常高。因此，看起来这两种化合物之间存在协同作用，并且TNF-α对T细胞分化的影响可能是Notch依赖的。
实施例11：加入TNF-α增加了CD7+祖细胞的增殖
在TNF-α存在下培养7天后，分选CD34+CD7-、CD34+CD7+和CD34-CD7+亚群，用CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)染色，并且从第8天到第10天进行CFSE(细胞增殖的替代标记物)的稀释。
当与TNF-α一起培养时，仅CD34+CD7+和CD34-CD7+细胞显示出增加的增殖。(数据未显示)
实施例12：细胞周期分析
进行细胞周期分析。观察到在存在TNF-α时，在CB和mPB衍生的CD7+祖细胞上，更多细胞从G0期释放(图8)。
实施例13：SR1和TNFα的组合
SR1加速T细胞分化，如第7天CD5+CD7+细胞的存在所示。TNF-α和SR1二者的存在增加了CD5+CD7+细胞的数量(图9)。
实施例14：体内数据
在TNF-α存在下诱导的T细胞前体可以极大地加速T-谱系在体内的重建。
实际上，移植后4周，注射了在TNF-α存在下产生的mPB T细胞前体的受体小鼠具有比注射没有TNF-α时产生的mPB T细胞前体的小鼠更大的胸腺。在TNF-α存在下诱导的T细胞前体可在体内4周内分化成活化的TCRaβT细胞。(数据未显示)
总之，在DL-4培养系统中从第0天开始添加TNF-α导致在第7天时，mPB HSPC来源的T细胞祖细胞(由CD7的表面表达定义)增加40倍，CB HSPC为20倍。
从CB和mPB二者产生的CD7+ T细胞祖细胞大多数是CD34-并且是CD1a阴性。细胞也主要是CD5阴性。
他们表达Bcl11b，其是T-定型和进一步的T细胞分化的重要精细调节分子。
他们没有表现出任何T细胞受体重排的迹象。
它们的表型和分子特征与没有TNF-α时获得的CD34-CD7+ T细胞祖细胞相似。
关于TNF-α作用涉及的机制，在培养期间，TNF-α降低凋亡标记物的表达并增加细胞增殖。它还抑制骨髓样细胞的产生。
在DL4培养系统中使用TNF-α很大程度上增加了由成人和脐带血HSPC产生的T细胞祖细胞的量。因此它可以克服从成人HSPC获得大量T细胞祖细胞的困难。它还可以减少未来临床试验中所需的起始HSPC的数量以及GMP等级和其他试剂的量，从而降低这些T细胞祖细胞的生产成本。
序列表
<110> 巴黎公共救济院(ASSISTANCE PUBLIQUE HOPITAUX DE PARIS)
理想基金会-遗传疾病研究所(FONDATION IMAGINE - INSTITUT DES MALADIES GéNéTIQUES)
巴黎笛卡尔大学(UNIVERSITE PARIS DESCARTES)
法国国家健康和医学研究院(INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHEMédicale
(INSERM))
<120> 产生T细胞祖细胞的方法
<130> BRV 126 - WO
<150> EP 17305161.6
<151> 2017-02-13
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 723
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人Delta -1 (可溶部分: 1-536) G502可以是R
<400> 1
Met Gly Ser Arg Cys Ala Leu Ala Leu Ala Val Leu Ser Ala Leu Leu
1 5 10 15
Cys Gln Val Trp Ser Ser Gly Val Phe Glu Leu Lys Leu Gln Glu Phe
20 25 30
Val Asn Lys Lys Gly Leu Leu Gly Asn Arg Asn Cys Cys Arg Gly Gly
35 40 45
Ala Gly Pro Pro Pro Cys Ala Cys Arg Thr Phe Phe Arg Val Cys Leu
50 55 60
Lys His Tyr Gln Ala Ser Val Ser Pro Glu Pro Pro Cys Thr Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Ala Val Thr Pro Val Leu Gly Val Asp Ser Phe Ser Leu Pro Asp
85 90 95
Gly Gly Gly Ala Asp Ser Ala Phe Ser Asn Pro Ile Arg Phe Pro Phe
100 105 110
Gly Phe Thr Trp Pro Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Ala Leu His
115 120 125
Thr Asp Ser Pro Asp Asp Leu Ala Thr Glu Asn Pro Glu Arg Leu Ile
130 135 140
Ser Arg Leu Ala Thr Gln Arg His Leu Thr Val Gly Glu Glu Trp Ser
145 150 155 160
Gln Asp Leu His Ser Ser Gly Arg Thr Asp Leu Lys Tyr Ser Tyr Arg
165 170 175
Phe Val Cys Asp Glu His Tyr Tyr Gly Glu Gly Cys Ser Val Phe Cys
180 185 190
Arg Pro Arg Asp Asp Ala Phe Gly His Phe Thr Cys Gly Glu Arg Gly
195 200 205
Glu Lys Val Cys Asn Pro Gly Trp Lys Gly Pro Tyr Cys Thr Glu Pro
210 215 220
Ile Cys Leu Pro Gly Cys Asp Glu Gln His Gly Phe Cys Asp Lys Pro
225 230 235 240
Gly Glu Cys Lys Cys Arg Val Gly Trp Gln Gly Arg Tyr Cys Asp Glu
245 250 255
Cys Ile Arg Tyr Pro Gly Cys Leu His Gly Thr Cys Gln Gln Pro Trp
260 265 270
Gln Cys Asn Cys Gln Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asn Gln Asp
275 280 285
Leu Asn Tyr Cys Thr His His Lys Pro Cys Lys Asn Gly Ala Thr Cys
290 295 300
Thr Asn Thr Gly Gln Gly Ser Tyr Thr Cys Ser Cys Arg Pro Gly Tyr
305 310 315 320
Thr Gly Ala Thr Cys Glu Leu Gly Ile Asp Glu Cys Asp Pro Ser Pro
325 330 335
Cys Lys Asn Gly Gly Ser Cys Thr Asp Leu Glu Asn Ser Tyr Ser Cys
340 345 350
Thr Cys Pro Pro Gly Phe Tyr Gly Lys Ile Cys Glu Leu Ser Ala Met
355 360 365
Thr Cys Ala Asp Gly Pro Cys Phe Asn Gly Gly Arg Cys Ser Asp Ser
370 375 380
Pro Asp Gly Gly Tyr Ser Cys Arg Cys Pro Val Gly Tyr Ser Gly Phe
385 390 395 400
Asn Cys Glu Lys Lys Ile Asp Tyr Cys Ser Ser Ser Pro Cys Ser Asn
405 410 415
Gly Ala Lys Cys Val Asp Leu Gly Asp Ala Tyr Leu Cys Arg Cys Gln
420 425 430
Ala Gly Phe Ser Gly Arg His Cys Asp Asp Asn Val Asp Asp Cys Ala
435 440 445
Ser Ser Pro Cys Ala Asn Gly Gly Thr Cys Arg Asp Gly Val Asn Asp
450 455 460
Phe Ser Cys Thr Cys Pro Pro Gly Tyr Thr Gly Arg Asn Cys Ser Ala
465 470 475 480
Pro Val Ser Arg Cys Glu His Ala Pro Cys His Asn Gly Ala Thr Cys
485 490 495
His Glu Arg Gly His Gly Tyr Val Cys Glu Cys Ala Arg Gly Tyr Gly
500 505 510
Gly Pro Asn Cys Gln Phe Leu Leu Pro Glu Leu Pro Pro Gly Pro Ala
515 520 525
Val Val Asp Leu Thr Glu Lys Leu Glu Gly Gln Gly Gly Pro Phe Pro
530 535 540
Trp Val Ala Val Cys Ala Gly Val Ile Leu Val Leu Met Leu Leu Leu
545 550 555 560
Gly Cys Ala Ala Val Val Val Cys Val Arg Leu Arg Leu Gln Lys His
565 570 575
Arg Pro Pro Ala Asp Pro Cys Arg Gly Glu Thr Glu Thr Met Asn Asn
580 585 590
Leu Ala Asn Cys Gln Arg Glu Lys Asp Ile Ser Val Ser Ile Ile Gly
595 600 605
Ala Thr Gln Ile Lys Asn Thr Asn Lys Lys Ala Asp Phe His Gly Asp
610 615 620
His Ser Ala Asp Lys Asn Gly Phe Lys Ala Arg Tyr Pro Ala Val Asp
625 630 635 640
Tyr Asn Leu Val Gln Asp Leu Lys Gly Asp Asp Thr Ala Val Arg Asp
645 650 655
Ala His Ser Lys Arg Asp Thr Lys Cys Gln Pro Gln Gly Ser Ser Gly
660 665 670
Glu Glu Lys Gly Thr Pro Thr Thr Leu Arg Gly Gly Glu Ala Ser Glu
675 680 685
Arg Lys Arg Pro Asp Ser Gly Cys Ser Thr Ser Lys Asp Thr Lys Tyr
690 695 700
Gln Ser Val Tyr Val Ile Ser Glu Glu Lys Asp Glu Cys Val Ile Ala
705 710 715 720
Thr Glu Val
<210> 2
<211> 724
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人delta-4多不 (可溶部分1-526)
<400> 2
Met Ala Ala Ala Ser Arg Ser Ala Ser Gly Trp Ala Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
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20 25 30
Gln Leu Gln Glu Phe Ile Asn Glu Arg Gly Val Leu Ala Ser Gly Arg
35 40 45
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Phe Gln Ala Val Val Ser Pro Gly Pro Cys Thr Phe Gly Thr Val Ser
65 70 75 80
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85 90 95
Gly Gly Gly Arg Asn Pro Leu Gln Leu Pro Phe Asn Phe Thr Trp Pro
100 105 110
Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Ala Trp His Ala Pro Gly Asp Asp
115 120 125
Leu Arg Pro Glu Ala Leu Pro Pro Asp Ala Leu Ile Ser Lys Ile Ala
130 135 140
Ile Gln Gly Ser Leu Ala Val Gly Gln Asn Trp Leu Leu Asp Glu Gln
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Thr Ser Thr Leu Thr Arg Leu Arg Tyr Ser Tyr Arg Val Ile Cys Ser
165 170 175
Asp Asn Tyr Tyr Gly Asp Asn Cys Ser Arg Leu Cys Lys Lys Arg Asn
180 185 190
Asp His Phe Gly His Tyr Val Cys Gln Pro Asp Gly Asn Leu Ser Cys
195 200 205
Leu Pro Gly Trp Thr Gly Glu Tyr Cys Gln Gln Pro Ile Cys Leu Ser
210 215 220
Gly Cys His Glu Gln Asn Gly Tyr Cys Ser Lys Pro Ala Glu Cys Leu
225 230 235 240
Cys Arg Pro Gly Trp Gln Gly Arg Leu Cys Asn Glu Cys Ile Pro His
245 250 255
Asn Gly Cys Arg His Gly Thr Cys Ser Thr Pro Trp Gln Cys Thr Cys
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Gln Arg Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Arg Pro Gly Tyr Thr Gly Val Asp
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325 330 335
Gly Ser Cys Lys Asp Gln Glu Asp Gly Tyr His Cys Leu Cys Pro Pro
340 345 350
Gly Tyr Tyr Gly Leu His Cys Glu His Ser Thr Leu Ser Cys Ala Asp
355 360 365
Ser Pro Cys Phe Asn Gly Gly Ser Cys Arg Glu Arg Asn Gln Gly Ala
370 375 380
Asn Tyr Ala Cys Glu Cys Pro Pro Asn Phe Thr Gly Ser Asn Cys Glu
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450 455 460
Thr Cys Pro Ala Gly Phe Ser Gly Arg Arg Cys Glu Val Arg Thr Ser
465 470 475 480
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485 490 495
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<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RGDS形式
<400> 3
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1
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肝素结合结构域XBBXBX; B =碱性氨基酸; X = 亲水性氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<400> 4
Xaa Asx Asx Xaa Asx Xaa
1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肝素结合结构域XBBBXXBX; B =碱性氨基酸; X = 亲水性氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(6)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可以为任何天然存在的氨基酸
<400> 5
Xaa Asx Asx Asx Xaa Xaa Asx Xaa
1 5
<210> 6
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CS-1形式
<400> 6
Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly
1 5 10 15
Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr
20 25
<210> 7
<211> 754
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白人delta 4 - Fc受体
<400> 7
Met Ala Ala Ala Ser Arg Ser Ala Ser Gly Trp Ala Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Val Ala Leu Trp Gln Gln Arg Ala Ala Gly Ser Gly Val Phe Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Gln Glu Phe Ile Asn Glu Arg Gly Val Leu Ala Ser Gly Arg
35 40 45
Pro Cys Glu Pro Gly Cys Arg Thr Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys His
50 55 60
Phe Gln Ala Val Val Ser Pro Gly Pro Cys Thr Phe Gly Thr Val Ser
65 70 75 80
Thr Pro Val Leu Gly Thr Asn Ser Phe Ala Val Arg Asp Asp Ser Ser
85 90 95
Gly Gly Gly Arg Asn Pro Leu Gln Leu Pro Phe Asn Phe Thr Trp Pro
100 105 110
Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Ala Trp His Ala Pro Gly Asp Asp
115 120 125
Leu Arg Pro Glu Ala Leu Pro Pro Asp Ala Leu Ile Ser Lys Ile Ala
130 135 140
Ile Gln Gly Ser Leu Ala Val Gly Gln Asn Trp Leu Leu Asp Glu Gln
145 150 155 160
Thr Ser Thr Leu Thr Arg Leu Arg Tyr Ser Tyr Arg Val Ile Cys Ser
165 170 175
Asp Asn Tyr Tyr Gly Asp Asn Cys Ser Arg Leu Cys Lys Lys Arg Asn
180 185 190
Asp His Phe Gly His Tyr Val Cys Gln Pro Asp Gly Asn Leu Ser Cys
195 200 205
Leu Pro Gly Trp Thr Gly Glu Tyr Cys Gln Gln Pro Ile Cys Leu Ser
210 215 220
Gly Cys His Glu Gln Asn Gly Tyr Cys Ser Lys Pro Ala Glu Cys Leu
225 230 235 240
Cys Arg Pro Gly Trp Gln Gly Arg Leu Cys Asn Glu Cys Ile Pro His
245 250 255
Asn Gly Cys Arg His Gly Thr Cys Ser Thr Pro Trp Gln Cys Thr Cys
260 265 270
Asp Glu Gly Trp Gly Gly Leu Phe Cys Asp Gln Asp Leu Asn Tyr Cys
275 280 285
Thr His His Ser Pro Cys Lys Asn Gly Ala Thr Cys Ser Asn Ser Gly
290 295 300
Gln Arg Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Arg Pro Gly Tyr Thr Gly Val Asp
305 310 315 320
Cys Glu Leu Glu Leu Ser Glu Cys Asp Ser Asn Pro Cys Arg Asn Gly
325 330 335
Gly Ser Cys Lys Asp Gln Glu Asp Gly Tyr His Cys Leu Cys Pro Pro
340 345 350
Gly Tyr Tyr Gly Leu His Cys Glu His Ser Thr Leu Ser Cys Ala Asp
355 360 365
Ser Pro Cys Phe Asn Gly Gly Ser Cys Arg Glu Arg Asn Gln Gly Ala
370 375 380
Asn Tyr Ala Cys Glu Cys Pro Pro Asn Phe Thr Gly Ser Asn Cys Glu
385 390 395 400
Lys Lys Val Asp Arg Cys Thr Ser Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Gln
405 410 415
Cys Leu Asn Arg Gly Pro Ser Arg Met Cys Arg Cys Arg Pro Gly Phe
420 425 430
Thr Gly Thr Tyr Cys Glu Leu His Val Ser Asp Cys Ala Arg Asn Pro
435 440 445
Cys Ala His Gly Gly Thr Cys His Asp Leu Glu Asn Gly Leu Met Cys
450 455 460
Thr Cys Pro Ala Gly Phe Ser Gly Arg Arg Cys Glu Val Arg Thr Ser
465 470 475 480
Ile Asp Ala Cys Ala Ser Ser Pro Cys Phe Asn Arg Ala Thr Cys Tyr
485 490 495
Thr Asp Leu Ser Thr Asp Thr Phe Val Cys Asn Cys Pro Tyr Gly Phe
500 505 510
Val Gly Ser Arg Cys Glu Phe Pro Val Gly Leu Pro Pro Ser Thr Met
515 520 525
Val Arg Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
530 535 540
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
545 550 555 560
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
565 570 575
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Met Glu Val His
580 585 590
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
595 600 605
Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
610 615 620
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu
625 630 635 640
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
645 650 655
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
660 665 670
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
675 680 685
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met
690 695 700
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
705 710 715 720
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
725 730 735
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
740 745 750
Gly Lys
<210> 8
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人可溶性TNF-alpha
<400> 8
Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val
1 5 10 15
Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg
20 25 30
Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu
35 40 45
Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala
85 90 95
Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys
100 105 110
Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys
115 120 125
Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe
130 135 140
Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
145 150 155
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于检测TCR重排的引物
<400> 9
caaggaaagg gaaaaaggaa gaa 23
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于检测TCR重排的引物
<400> 10
ttgcccctgc agtttttgta c 21
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于检测TCR重排的探针
<400> 11
atacgcacag tgctacaaaa cctacagaga cct 33
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于检测TCR重排的引物
<400> 12
agcgggtggt gatggcaaag t 21
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于检测TCR重排的引物
<400> 13
ttagatggag gatgccttaa cctta 25
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于检测TCR重排的探针
<400> 14
cccgtgtgac tgtggaacca agtaagtaac tc 32
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于检测TCR重排的引物
<400> 15
gacttggaga aaacatctgg ttctg 25

Claims (20)

1.一种产生T细胞前体的体外方法，其包括步骤：在固定的Notch配体存在下，在含有TNF-α的培养基中培养CD34+细胞。
2.一种产生T细胞前体的体外方法，其包括步骤：在固定的Notch配体存在下，在含有芳烃/二噁英受体拮抗剂特别是StemRegenin 1(SR1)的培养基中，培养CD34+细胞。
3.根据权利要求1或2所述的体外方法，其中培养基含有TNF-α和芳烃/二噁英受体拮抗剂二者。
4.根据权利要求1至3任一项所述的体外方法，其中从培养的第0天开始，在培养基中存在TNF-α和/或芳烃/二噁英受体拮抗剂。
5.根据权利要求1至4任一项所述的体外方法，其中CD34+细胞已从成年供体中分离。
6.根据权利要求1至5任一项所述的体外方法，其中所述细胞在TNF-α和/或SR1存在下培养至多10天。
7.根据权利要求1至6任一项所述的体外方法，其中所述细胞在TNF-α和/或芳烃/二噁英受体拮抗剂存在下培养3至7天。
8.根据权利要求1至7任一项所述的体外方法，其中将TNF-α和/或芳烃/二噁英受体拮抗剂以大于或等于3ng/ml的浓度加入培养基中。
9.根据权利要求1至8任一项所述的体外方法，其中所述Notch配体是与IgG蛋白且优选IgG2蛋白的Fc区融合的δ样-4配体的可溶性结构域。
10.根据权利要求1至9任一项所述的体外方法，其中所述细胞也暴露于纤连蛋白片段，其中所述片段包含RGDS和CS-1模式以及肝素结合结构域，所述纤连蛋白片段优选固定在培养容器内表面上。
11.根据权利要求10所述的体外方法，其中纤连蛋白片段是
12.根据权利要求1至11任一项所述的体外方法，其中在CD34+细胞暴露于Notch配体的至少一些时间内，所述培养基还含有用于转染或转导CD34+细胞的载体。
13.根据权利要求1至12任一项所述的体外方法，其中所述培养基含有选自白介素7(IL-7)、SCF(干细胞因子)、血小板生成素(TPO)和Flt3配体(FLT3L)的至少三种，优选全部四种的细胞因子或生长因子。
14.一种获得T细胞祖细胞的方法，其包括步骤：
a.进行权利要求1至13任一项所述的方法，和
b.纯化产生的T细胞祖细胞，
c.任选地在用于向患者注射的小袋中条件化T细胞祖细胞。
15.一种CD7+T细胞祖细胞群，其中该群中CD34-和CD1a-的细胞比例高于50％。
16.一种静脉注射用小袋，其含有权利要求15所述的T细胞祖细胞群。
17.一种获得转化的T细胞祖细胞的体外方法，其包括步骤：
a.在固定的Notch配体存在下，在含有TNF-α的培养基中培养CD34+细胞，
b.将细胞暴露于用于转染或转导CD34+细胞的载体。
18.一种获得修饰的T细胞祖细胞的体外方法，其包括步骤：
a.在固定的Notch配体存在下，在含有TNF-α的培养基中培养CD34+细胞，
b.将细胞暴露于含有适于基因编辑的元件的载体或核酸序列。
19.一种实施权利要求1至14、17或18任一项所述的方法的试剂盒，其包含：
(i)含有Notch配体和任选的纤连蛋白片段的包被培养基，
(ii)适于培养CD34+细胞和T细胞的培养基，
(iii)含有TNF-α和优选地三种或四种选自SCF、TPO、Flt3L和IL-7的细胞因子的祖细胞扩增培养基。
20.一种实施权利要求1至14、17或18任一项所述的方法的试剂盒，其包含：
(i)含有Notch配体和任选的纤连蛋白片段的包被培养基，
(ii)适于培养CD34+细胞和T细胞的培养基，
(iii)含有芳烃/二噁英受体拮抗剂和优选地三种或四种选自SCF、TPO、Flt3L和IL-7的细胞因子的祖细胞扩增培养基。
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