BR112019016672A2 - método para gerar progenitores de células t - Google Patents
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Abstract
a invenção refere-se a um método in vitro para gerar os progenitores de células t, compreendendo a etapa de cultivar células cd34+ em meio contendo tnf-alfa e/ou um antagonista do receptor de hidrocarboneto de aril/dioxina, em particular stemregenin 1 (sr1), na presença de um ligante de notch e, opcionalmente, um fragmento de fibronectina.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: MÉTODO
PARA GERAR PROGENITORES DE CÉLULAS T [001] A invenção se refere ao campo da terapia celular, em particular do enxerto de células-tronco
| hematopoiéticas, | transformadas | ou não, | e mais |
| particularmente | da reconstituição | imunológica | após esse |
| enxerto. | |||
| [002] 0 | enxerto de células | progenitoras | e células- |
tronco hematopoiéticas/progenitoras (HSPC) é considerado a melhor opção terapêutica para as deficiências hereditárias imunológicas mais graves, para muitas hemopatias malignas e para vários tumores sólidos.
[003] Atualmente, em situações de aloenxerto com incompatibilidade parcial de HLA, as injeções, em receptores previamente condicionados, de doses crescentes de CD34+ HSPC classificado permitem o transplante de doadores com prevenção eficaz da doença do enxerto contra o hospedeiro (GVH). No entanto, a diferenciação de novos linfócitos T das células CD34+ injetadas requer um periodo mínimo de 4 meses e esses linfócitos T são em número suficiente para desempenhar um papel protetor contra infecções apenas alguns meses após seu aparecimento.
[004] Essa lentidão na reconstituição imunológica leva a inúmeras complicações infecciosas, especialmente virais, mas também a recaídas, que influenciam o prognóstico
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2/58 a longo prazo dos pacientes enxertados.
[005] Além disso, outros protocolos terapêuticos usam uma abordagem de terapia genética, ou seja, um autoenxerto de HSPC transduzido, que demonstrou ser eficaz no tratamento de certas deficiências imunológicas hereditárias. A vantagem dessa estratégia sobre o transplante alogênico de HSPC CD34+ é indiscutível em termos de sobrevivência e morbidade quando nenhum doador compatível com HLA está disponível. No entanto, a experiência clínica mostrou que, para alguns pacientes com infecções graves, a reconstituição do compartimento de linfócitos T é lenta e nunca atinge níveis normais de linfócitos T circulantes. A morbidade e mortalidade associadas a esse contexto específico são importantes.
[006] Devido à alta mortalidade associada a esse tipo de transplante, o desenvolvimento de novas terapias para reduzir o período de imunodeficiência após o transplante é totalmente justificado.
[007] Em particular, é importante acelerar a geração de linfócitos T pela administração de precursores já engajados na via de diferenciação de linfócitos T (progenitores de células T).
[008] Estes precursores de células T são obtidos a partir da diferenciação de CD34+ HSPC e possuem, em particular, o marcador CD7+, que é um marcador de
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3/58 diferenciação na via das células T. Eles também podem ter outros marcadores. Awong et al (Blood 2009; 114: 972-982) descreveram os seguintes precursores de linfócitos T: progenitor timico precoce (ETP), que possuem marcadores (CD34+/CD45RA+/CD7 + ) , células precursoras no estágio proTl (CD7++/CD5-), células precursoras no estágio proT2 (CD7++/CD5+) e células no estágio preT (CD7++/CD5+CDla+). O HSPC adquire esses marcadores de maneira sucessiva ao passar de um estágio para outro, pelo caminho de desenvolvimento das células T. Sabe-se ainda que em humanos, o antígeno CDla distingue a passagem de um progenitor timico muito imaturo para um progenitor claramente envolvido na via T (CavazzanaCalvo et al., MEDECINE/SCIENCES 2006; 22: 151-9).
[009] Um transplante de precursores de células T, concomitante ao enxerto de HSPC, permitiría a produção rápida de um compartimento de linfócitos T maduro e funcional e, assim, ajudaria a evitar o risco de infecções graves, permitindo que o paciente se beneficiasse de alguma imunidade antes da completa reconstituição do sistema imunológico.
[0010] Além disso, é importante poder usar células adultas em vez de células do cordão umbilical, uma vez que é mais fácil e mais barato obter células adultas do que as células do cordão umbilical e uma vez que as células adultas são mais comumente usadas no aloenxerto.
[0011] No entanto, dados publicados na literatura,
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4/58 obtidos em humanos e camundongos, mostram diferenças intrínsecas entre células hematopoiéticas fetais (incluindo sangue do cordão umbilical) e células adultas. Essas diferenças estão relacionadas à sobrevivência, à capacidade de reparar danos ao DNA, à capacidade proliferativa e ao potencial de se diferenciar (ver, por exemplo, Yuan et al., (9 de março de 2012; 335 (6073): 1195-200), que indicam que os ossos adultos as células da medula óssea são menos eficazes do que as células fetais em seu potencial de gerar uma variedade de tipos de células: Lansdorp et al (J Exp Med 1993 1 de setembro; 178 (3): 787-91); Szilvassy et al (Blood, 2001 1 de outubro de 2001), 98 (7): 2108-15), Frassoni et al. (Blood, 1 de agosto de 2003, 102 (3) : 1138-41), Liang et al. 106 (4) : 1479-87) , Six et al. J Exp Med 2007 24 de dezembro de 204 (13): 3085-93)).
[0012] O documento WO 2016/055396 descreve que é possível gerar precursores de células T cultivando células CD34+ na presença de um ligante imobilizado de Notch (em particular o domínio solúvel do ligante do tipo Delta, fundido com uma região Fc de uma proteína IgG) e de um fragmento de uma fibronectina contendo os domínios RGDS (SEQ ID NO: 3, Arginina - Glicina - Aspartato - Serina) e CS-1, bem como o domínio de ligação à heparina (em particular na presença de Retronectina ®). O ligante de Notch usado pode ser referido como DL4/Fc.
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5/58 [0013] Deve-se notar que este documento revela que a presença do ligante imobilizado de Notch e da fibronectina torna possível aumentar a geração de progenitores de linfócitos T (células CD7+), o que já era uma melhoria na técnica, mas que a porcentagem das células CD7+ CD34permanece bastante baixa, como mostrado na Figura 3 do documento WO 2016/055396. No entanto, é interessante e particularmente importante aumentar essa porcentagem, a fim de poder administrar uma quantidade maior de precursor ao paciente em necessidade. Por outro lado, também é importante que as células permaneçam em um estágio inicial de diferenciação para poder fornecer uma imunidade adequada.
[0014] Lembramos que as proteínas de Notch são receptores transmembranares que regulam a resposta celular de um grande número de sinais ambientais. Nos mamíferos, foram descritos quatro receptores de Notch (Notch 1-4) e cinco ligantes (Delta-tipo-1, 3 e 4, Jaggedl, Jaggedí) (Weinmaster Curr Opin Genet Dev 2000: 10: 363-369).
[0015] O ligante tipo Delta 4 pode ser designado como:
(ii) ligante tipo Delta 4 (correspondente ao nome do gene DLL4) (iii) Delta-tipo-4 ou ligante Delta 4 (abreviatura DL-
4) .
[0016] No presente pedido, os ligantes de Notch
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Delta-tipo-1 e Delta-tipo-4 podem ser designados respectivamente por DL1 e DL4 ou por DL-1 e DL-4. As sequências dos ligantes DL-1 e DL-4 são especificadas como SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente.
[0017] Ohishi et al. (BLOOD, vol. 98, N° 5, 2001, pp 1402-1407) se refere ao efeito da sinalização de Notch na diferenciação de monócitos em macrófagos e células dendríticas. As células de monócitos usadas nas experiências divulgadas neste documento eram monócitos do sangue periférico purificados por seleção negativa ou monócitos obtidos após diferenciação in vitro de células-tronco CD34+. As células utilizadas neste documento entraram na via de diferenciação de células de monócitos/macrófagos/ dendríticas, perderam o marcador CD34 (que é um marcador de células-tronco hematopoiéticas) e apresentam o marcador CD14. Essas células são cultivadas na presença do domínio extracelular de Delta-1 e GM-CSF, TNF-alfa (que é usado para induzir a diferenciação de células CDla-CD14+ derivadas de células CD34+ em células dendríticas). Este documento não usa células CD34+ na presença de um ligante de Notch e de TNF-alfa e não se refere à geração de precursores de células T (precursores de linfócitos T CD7 +) .
[0018] SHUKLA et al (NATURE METHODS, vol. 14, no. 5, 2017, 531-538) e WO 2017/173551 divulgam um método para gerar células T progenitoras a partir de células-tronco e/ou
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7/58 células progenitoras, compreendendo a exposição das célulastronco e/ou progenitoras ao ligante de Notch Delta-tipo-4 (DL4) e molécula de adesão vascular 1 (VCAM-1).
[0019] O método descrito no presente pedido permite a geração e o aumento (proliferação) do número de precursores de linfócitos T CD7+, a partir de células-tronco CD34+, sem usar um estroma celular (que não pode ser facilmente considerado em um contexto clínico) . Além disso, o método é particularmente adaptado quando realizado com células CD34+ emitidas por doadores adultos.
[0020] Além disso, as células obtidas através do processo como aqui divulgado, abrigam o marcador Bclllb, que é um importante fator transcricional ativado exclusivamente desde o comprometimento das células T (Kueh et al, 2016, Nat Immunol. 2016 Immunol. 2016 ago; 17 (8) : 956-65. doi: 10.1038/ni.3514).
[0021] Os inventores também mostraram ausência de rearranjo dos locais dos receptores de células T (TCRbeta, TCRgamma ou TCRdelta) nos progenitores obtidos através do processo aqui divulgado.
[0022] Além disso, foi mostrada uma diminuição nos marcadores de apoptose, para os precursores aqui obtidos, em comparação com o processo divulgado no documento WO 2016/055396.
[0023] Em resumo, o processo aqui divulgado torna
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8/58 possível obter um número de precursores de células T altos o suficiente para serem eficientemente usados para um adulto que recebe um transplante de células-tronco.
[0024] Este método também pode ser usado para obter precursores de células T transformados (transduzidos) para terapia gênica, quando um vetor contendo um gene de interesse é usado em algum momento durante o processo aqui divulgado.
[0025] As células obtidas pelo processo aqui divulgado podem ser obtidas para células CD34+ adultas e podem ser usadas para enxertos alogênicos ou autoenxertos, mesmo quando células sanguíneas do cordão umbilical são usadas para esses enxertos.
[0026] Deve-se notar que o método, embora muito eficiente para células CD34+ adultas, também pode ser usado com células CD34+ do sangue do cordão umbilical.
[0027] Em uma modalidade específica, o método aqui divulgado, assim, prende a geração de células T ín vivo após a injeção de progenitores de células T produzidos a partir de HSPC em um sistema de cultura in vitro, combinando uma proteína de fusão imobilizada derivada do ligante de Notch, Delta-4, Retronectina ® e uma combinação de citocinas.
[0028] Este sistema permite, dentro de 7 dias, a geração de progenitores de células T fenotipicamente e molecularmente semelhantes aos precursores de células T tímicas humanas. Além disso, esses progenitores de células
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T são capazes de originar células T maduras em humanos e diversas em camundongos NSG, com uma cinética mais rápida em comparação ao HSPC.
[0029] Os resultados aqui relatados foram obtidos do HSPC de sangue do cordão umbilical (CB) e de adulto (sangue periférico mobilizado, mPB de doadores adultos).
[0030] Os inventores mostraram que a quantidade de precursores de células T pode ser melhorada a partir de células CD34+, expondo as referidas células CD34+ a um ligante de Notch e na presença do TNF-alfa solúvel (fator de necrose tumoral alfa, Uniprot P01375, RefSeq NP_000585, SEQ ID NO: 8) . A referida exposição é feita sob condições adequadas para gerar células T progenitoras. Opcionalmente, as células também são expostas a um fragmento de fibronectina contendo um motivo RDGS e/ou um motivo CS-1 e, opcionalmente, um domínio de ligação à heparina. De preferência, o referido fragmento de fibronectina contém um motivo RDGS, um motivo CS-1 e um domínio de ligação à heparina.
[0031] O TNF é produzido principalmente como uma proteína transmembrana do tipo II de 233 aminoácidos arranjada em homotrímeros estáveis. A forma secretada do TNF-alfa humano assume uma forma de pirâmide triangular e pesa cerca de 17 kDa.
[0032] Como divulgado no documento WO 2016/055396, é possível executar o método aqui divulgado, usando um peptídeo
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RGDS e/ou um peptídeo CS-1 no lugar do fragmento de fibronectina. É preferida uma utilização combinada dos peptídeos RGDS e CS-1, em particular fundidos na mesma proteína. Assim, os peptídeos RGDS e/ou CS-1 podem estar presentes como tal no meio de cultura ou dentro de um polipeptideo ou proteína presente no meio de cultura. Quando o meio de cultura contém apenas o peptídeo RGDS e/ou CS-1 como tal, pode-se relacionar com eles como peptídeo(s) livre (s) no meio de cultura se esses peptídeos não estiverem imobilizados na superfície interna do frasco de cultura. De fato, o(s) peptídeo(s) pode(m) estar em solução ou imobilizado na superfície interna do frasco no qual as células CD34+ estão expostas ao ligante de Notch imobilizado.
[0033] Contudo, como indicado acima, é preferido usar um fragmento de fibronectina, que contém os padrões RGDS e CS-1, bem como um domínio de ligação à heparina. O fragmento de fibronectina pode estar livre em solução ou imobilizado na superfície interna do recipiente de cultura.
[0034] O processo é realizado in vitro, em um recipiente, como uma placa de cultura de células (placa de Petri, conjunto de 24 cavidades ou similar), de preferência com o ligante de Notch imobilizado em sua superfície interna. O ligante de Notch pode, no entanto, ser imobilizado em qualquer outro suporte presente no meio de cultura, tal como na superfície de contas (em particular microesferas). A
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11/58 imobilização do ligante de Notch visa essencialmente estabilizar o ligante, a fim de permitir a ativação do receptor de Notch das células CD34+.
[0035] Por progenitor de células T, pretende-se designar qualquer célula envolvida na via de diferenciação da via linfoide T a partir de um CD34+ HSPC. Esta célula é, portanto, caracterizada por expressar o marcador CD7, que é conhecido por ser um dos primeiros marcadores durante a linfopoiese das células T. Dependendo do estado de diferenciação na via linfóide T, ele pode expressar ou não o marcador CD34 (perda de CD34 durante a diferenciação). Esse progenitor de células T também pode expressar ou não o marcador CD5.
[0036] Entre os progenitores de células T estão aquelas células que podem ser encontradas no timo pós-natal, ou seja, progenitor tímico precoce (ETP) (CD34+/CD45RA+/CD7+), células proTl (CD34+CD45RA+CD7++CD5CDla-), células proT2 (CD34+CD45RA+CD7++CD5+CDla-) e células preT (CD34-CD7 ++/CD5+CDla+). Os locais dos receptores de células T (TCR) reorganizam-se de maneira altamente ordenada (TCRõ-TCRv-TCRp-TCRa). Para notar, os primeiros rearranjos funcionais de TCR ocorrem no estágio da célula CD34-CD7 ++/CD5 + CDla + preT (Dik et al., J Exp Med 2005; 201: 17151723) . Os progenitores de células T são bem conhecidos no estado da técnica. Eles são citados em particular por Reimann
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12/58 et al. (STEM CELLS 2012; 30: 1771-1780.) e per Awong et al (2009, op .cit.) .
[0037] O termo peptideo RGDS se destina a designar qualquer peptideo ou proteína que contenha o padrão RGDS, para que ele possa se ligar à integrina VLA-5. Tal peptideo ou proteína pode ser testado quanto à sua capacidade de se ligar à integrina VLA-5 por métodos conhecidos e relatados na técnica. O peptideo RGDS se liga à integrina VLA-5 (Very Late Antigen-5), que é um dímero composto por CD49e (alfa5) e CD29 (betai) .
[0038] Os domínios de ligação à heparina são conhecidos na técnica e estão presentes em inúmeras proteínas que se ligam à heparina. Sua sequência é geralmente XBBXBX ou XBBBXXBX (B = aminoácido básico; X = aminoácido hidropático; Cardin e Weintraub, Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1989; 9: 21-32, SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5).
[0039] A presença desse domínio de ligação à heparina é particularmente favorável quando as células CD34+ são expostas a um vetor viral (especialmente um retroviral), a fim de transduzi-las e obter progenitores de células T expressando um transgene.
[0040] Um peptideo CS-1 ou padrão CS-1 é um peptideo de 25 aminoácidos (DELPQLVTLPHPNLHGPEILDVPST, SEQ ID NO: 6), descrito por Wayner et ai., 1989, J. Cell Biol. 109: 1321). Esse padrão de CS-1 se liga ao receptor VLA-4 (Very Late
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Antigen-4) . Este antígeno é um dímero de integrina, composto por CD49d (alfa 4) e CD29 (beta 1).
[0041] Em uma modalidade particular, o fragmento de fibronectina está presente no meio de cultura ou imobilizado na parede interna (em particular a parte inferior) do recipiente. A fibronectina é uma proteína que, na sua forma natural, é um dímero grande em forma de V, de 100 nm de comprimento e 460 kDa. Os dois monômeros são conectados por duas pontes dissulfeto em seu terminal C. O termo fibronectina ou fragmento de fibronectina é entendido como a proteína natural da fibronectina (ou seja, qualquer isoforma produzida por splicing alternativo), mas também um monômero dessa proteína ou um fragmento dessa proteína (mas contendo o peptídeo RGDS, como bem como peptídeo CS-1 e local de ligação à heparina) .
[0042] Uma fibronectina que é particularmente adequada para realizar o processo aqui divulgado é Retronectin®. Esta proteína corresponde a um fragmento de uma fibronectina humana (fragmento CH-296, Kimizuka et al., J. Biochem., 1991 ago. 110 (2) : 284-91, Chono et al. , J. Biochem 2001 set 130 (3) : 331-4) e contém os três domínios funcionais que são preferidos para a implementação do método (o domínio C de ligação celular que contém o peptídeo RGDS, o domínio de ligação à heparina e a sequência CS-1). Esta proteína é vendida em particular pela empresa Takara Bio
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Inc. (Shiga, Japão).
[0043] Em uma modalidade particular, o fragmento de fibronectina é imobilizado (isto é, ligado a um suporte sólido e não está presente livre em solução (embora seja possível que certos elementos possam ser encontrados em solução)). Este suporte sólido é de preferência a parede inferior do recipiente no qual o processo é realizado. No entanto, também é possível prever a ligação do fragmento de fibronectina a contas, como contas poliméricas ou magnéticas (com um diâmetro geralmente compreendido entre 1 e 5 pm). A ligação da proteína ou peptídeo a estas contas pode ou não ser covalente. Os métodos para ligar uma proteína ou peptídeo às contas são conhecidos na técnica. Também é possível introduzir o fragmento de fibronectina em um meio semissólido, tal como ágar ou gel.
[0044] Quando o fragmento de fibronectina é imobilizado no suporte (em particular a parede inferior do recipiente no qual o processo é realizado), essa imobilização também pode ser covalente ou não. Em uma modalidade preferida, esta imobilização é realizada de forma não covalente, permitindo que o fragmento de fibronectina seja absorvido no vidro ou plástico que compõe a parede inferior do recipiente.
[0045] Em uma modalidade específica, como visto acima, a diferenciação das células CD34+ em progenitores de
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15/58 células T é realizada juntamente com a transdução ou transfecção (incluindo nucleofection™, um sistema de eletroporação específico desenvolvido por Lonza) das células CD34+ por meio de um vetor (tal como um vetor viral ou um fragmento de ácido nucleico, como sequências de RNA ou DNA plasmídeo ou plasmídico) para introduzir um gene de interesse (ou um sistema para edição de genes) nessas células. Isso significa que as células expostas ao ligante de Notch e ao fragmento de fibronectina, com TNF-alfa, também são expostas a um sobrenadante viral por pelo menos parte de seu tempo de exposição ao ligante de Notch e fragmento de fibronectina, com TNF-alfa.
[0046] Os ensinamentos do documento WO 2016/055396 no que diz respeito às condições operacionais para a realização da transdução celular são expressamente aplicáveis ao presente método e são, portanto, considerados expressamente recitados neste pedido.
[0047] Pode-se citar, em particular:
(iv) Exposição das células ao ligante de Notch, fragmento de fibronectina e TNF-alfa, por algum tempo (de preferência por mais de 4 horas, mais preferencialmente por mais de 6h ou mais de 8h ou lOh, mas menos de 36 h, mais de preferência menos de 30 h ou menos de 24 h) com citocinas apropriadas conhecidas na técnica e divulgadas no documento WO 2016/055396, e adição do sobrenadante viral por um período
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16/58 de tempo apropriado (de preferência mais de 4 horas, mais preferencialmente de mais de 6 h, 8h ou 10 h, e preferencialmente menos de 30 horas, mais preferencialmente menos de 24 h, mais preferencialmente em torno de 16 h).
(v) Segunda transdução, se necessário, conforme ensinado no documento WO 2016/055396 (vi) O uso deste protocolo para enxertos de célulastronco hematopoiéticas autólogas em protocolos de terapia gênica, para que o transgene adicione uma proteína ausente ou deficiente no paciente, a fim de trazer um benefício terapêutico.
(vii) Transgenes utilizáveis: imunodeficiências de correção de genes (em particular imunodeficiências combinadas graves SCID ou não, CID), HIV, adrenoleucodistrofia ligada ao X, hemoglobinopatias, em particular β-talassemia ou doença falciforme. Pode-se também usar, como transgene, um gene que codifica um Receptor de Antígeno Quimérico (CAR), ou seja, uma proteína de superfície celular que reconhece uma proteína de superfície celular que é especificamente expressa por células cancerígenas, a fim de desencadear resposta imune contra as células cancerígenas através das células CAR-T projetadas.
(viii) Uso preferido de um sobrenadante viral para permitir a inserção do transgene dentro do genoma celular, utilizando em particular lentivírus conhecidos e descritos
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17/58 na técnica.
(ix) Introdução do vetor viral no meio de cultura celular após pré-ativação das células CD34+ entre 4 e 36h, preferencialmente entre 6 e 24 h.
(x) Exposição das células ao vetor viral entre 4 e 30h, preferencialmente entre 12 e 24h, mais preferencialmente por volta de 16h, e remoção do vetor viral (colheita e lavagem das células e ressuspensão dessas células na presença do ligante de Notch, o fragmento de fibronectina e o TNF-alfa).
[0048] Como indicado acima, em outra modalidade, as células CD34+ são expostas a um sistema que possibilita a edição de genes. Tais sistemas são agora amplamente conhecidos e descritos na técnica e baseiam-se essencialmente no reparo de quebra de ácido nucleico. Esse sistema de edição de genoma pode usar uma nuclease selecionada do grupo que consiste em meganucleases, nucleases de dedo de zinco (ZFNs), nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição (TALEN) e nucleases CRISPR-Cas. O fato de que as células CD34+ proliferam durante a exposição aos elementos citados acima e, portanto, na presença de TNFalfa, possibilita o uso desses sistemas de edição de genes que requerem proliferação de células.
[0049] Em uma modalidade particular, o ligante de Notch é a proteína Delta-tipo-1 (SEQ ID NO: 1) ou um fragmento do mesmo (domínio solúvel).
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18/58 [0050] Em outra modalidade preferida, o ligante de Notch é a proteína Delta-tipo-4 (SEQ ID NO: 2).
[0051] Em uma modalidade particular, o referido ligante de Notch é uma proteína de fusão compreendendo o domínio solúvel de um ligante de Notch natural fundido com uma região Fc de uma proteína IgG. Como conhecido na técnica, o domínio solúvel de um ligante de Notch representa a porção extracelular do referido ligante. Varnum-Finney et al. (J Cell Sei., 2000 Dec; 113 Pt 23: 4313-8) descreveram uma proteína de fusão da parte solúvel de DL-1 com uma porção Fc de IGgl. Reimann et ai (op cit) descreveram uma proteína de fusão da parte solúvel de DL-4 (aminoácidos 1-526) com o fragmento Fc de uma imunoglobulina IgG2b. É assim preferido quando a proteína IgG é uma IgG2. Em uma modalidade preferida, a sequência do ligante de Notch usada no método aqui divulgado é a SEQ ID NO: 7. Produto comercialmente disponível (Sino Biologicals) compreendendo o domínio extracelular (Met 1-Pro 524) da DLL4 humana (número de acesso de DLL4 de comprimento total NP_061947.1) fundido à região Fc da IgGl humana no terminal C é uma proteína DL4 também é adequada para uso aqui.
[0052] O meio de cultura usado no contexto do método aqui divulgado é qualquer meio adaptado para a cultura de células CD34+ e células T. Em particular, pode-se mencionar a-MEM, DMEM, RPMI 1640, IMDM, BME, 5A de McCoy, StemSpan™,
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19/58 em particular meio SFII (StemCell Technologies) ou meio de Fischer. 0 meio StemSpan™ SFII contém, em particular, MDM de Iscove, albumina de soro bovino, insulina humana recombinante, transferrina humana (saturada com ferro), 2mercaptoetanol.
[0053] Um meio de cultura adequado e preferido para a realização do processo aqui divulgado é o meio X-VIVO™ (Lonza, Basel, Suiça). Este meio foi utilizado em particular por Jonuleit et al. (Eur J. Immunol, 1997, 27, 12, 3135-42) e Luft et al. (J. Immunol, 1998, 161, 4, 1947-53).
[0054] De preferência, é usado um meio basal (isto é, um meio que permite o crescimento das células sem a necessidade de adicionar suplementos), no qual, no entanto, um preferencialmente adiciona soro e/ou fatores de crescimento e citocinas.
[0055] Assim, soro fetal bovino (FBS) ou soro fetal de vitelo (FCS), soro humano autólogo ou soro AB humano é preferencialmente adicionado ao meio de cultura basal. De preferência, este meio é suplementado com pelo menos 15% de soro fetal, mais preferencialmente pelo menos 20%. O FBS é particularmente adequado para a implementação do processo. Em particular, é preferível usar o FBS definido. O FBS definido é um soro de alta qualidade que foi analisado e filtrado para evitar a presença de partículas virais. É vendido como tal por muitos fornecedores, como o Soro Fetal
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Bovino Definido HyClone™ (BBS) da Thermo Scientific™.
[0056] Além do TNF-alfa, o meio de cultura também é preferencialmente complementado com citocinas e fatores de crescimento. Essas citocinas e fatores de crescimento são especialmente selecionados do grupo que consiste em SCF (fator de células-tronco), trombopoietina (TPO, também chamada de fator de crescimento e desenvolvimento de megacariócitos, MGDF), ligante Flt3 (que é um fator de crescimento hematopoiético), interleucina 3 (IL-3), interleucina 7 (IL-7) e SCF (fator de célula-tronco). Em uma modalidade particular, o meio de cultura contém pelo menos três, preferencialmente pelo menos quatro dessas citocinas ou fatores de crescimento, além de TNF-alfa.
[0057] Em uma modalidade preferida, e em particular para a geração de precursores de células T que não são transduzidos com um vetor viral, são adicionadas pelo menos ou exatamente três citocinas. Preferencialmente, estas três citocinas são Interleucina-7 (IL-7), SCF (Fator de CélulasTronco) e Ligante Flt-3 (fator de crescimento hematopoiético).
[0058] Em outra modalidade preferida, são adicionadas quatro citocinas, isto é, as três citocinas mencionadas acima e TPO (trombopoietina).
[0059] Em outra modalidade particular, e em particular para a geração de precursores de células T
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21/58 transduzidos com um vetor viral, a natureza das citocinas e fatores de crescimento pode variar durante a implementação do método.
[0060] Assim, IL-3, IL-7, SCF, TPO e Flt3-L podem ser usadas no meio se a etapa de pré-ativação das células antes da adição do vetor viral e suplementar o meio apenas com IL- 7, SCF, TPO e Flt3-L após a remoção do vetor.
[0061] As citocinas e misturas de fator de crescimento acima mencionadas são suficientes para induzir a diferenciação de células CD34+ em precursores de células T e geralmente o meio de cultura não compreende nenhuma outra citocina ou fator de crescimento, exceto TNF-alfa, que, conforme descrito nos exemplos, torna possível para aumentar o número de precursores de células T.
[0062] No processo aqui previsto, a duração total da exposição das células CD34+ na presença do ligante de Notch, da proteína ou peptídeo que exibe o motivo RGDS e do TNFalfa, geralmente é realizada por um tempo, de preferência superior a 3 dias e inferior a 10 dias.
[0063] Essa exposição pode variar dependendo se as células são transduzidas. Assim, um tempo de exposição de três dias pode ser suficiente para células-tronco adultas não transduzidas, enquanto geralmente será mais longo para células-tronco infantis (cerca de 7 dias) ou quando a transdução for realizada.
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22/58 [0064] As células CD34+ são obtidas a partir de uma punção da medula óssea, do sangue do cordão umbilical ou do sangue periférico de doadores adultos, que foram mobilizados particularmente com G-CSF ou qualquer outro agente mobilizador conhecido na técnica. Os métodos para classificar células CD34+ são conhecidos na técnica. Em particular, contas magnéticas com um anticorpo que reconhece CD34 em sua superfície podem ser usadas para esse fim.
[0065] De preferência, o frasco de cultura de células é preparado imobilizando o ligante de Notch e o fragmento de fibronectina na superfície interna (de preferência a inferior) antes de expor as células CD34+. Retronectin® ou outra fibronectina aderem naturalmente ao plástico da caixa de cultura de células (placa de Petri ou caixa de 24 cavidades ou outra) . Do mesmo modo, se o ligante de Notch for utilizado como uma proteína de fusão com o fragmento Fc de uma imunoglobulina, este fragmento Fc também adere aos plásticos. Portanto, é suficiente deixar o recipiente na presença desses compostos por algumas horas para obter o revestimento apropriado. Um método para revestir esse recipiente de cultura com o ligante de Notch e o fragmento de fibronectina é divulgado em detalhes no documento WO 2016/055396 e pode ser aplicado para implementar o método como aqui divulgado.
[00 66] Lembramos que, de acordo com o documento WO
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2016/055396, cerca de 75% do DL-4 aderirá à superfície do recipiente quando forem utilizados 5 pg/ml, sendo a dose ideal maior ou igual a 1,25 pg/ml e preferencialmente entre 2,5 e 5 pg/ml.
[0067] No que diz respeito ao fragmento de fibronectina, uma concentração de 25 pg/ml é particularmente adaptada (especialmente quando Retronectin® é usado), embora seja possível usar outras concentrações (maiores ou menores).
[0068] Na implementação do processo aqui divulgado, as células CD34+ são adicionadas a uma concentração compreendida entre 106 e 107 células/ml, em particular em torno de 2 x 106 células CD34+ /ml no frasco de cultura.
[0069] Dependendo se as células devem ser transduzidas e das células CD34+, pode-se usar uma placa de 2 a 10 cm2 (isto é, uma placa de 24 a 6 cavidades). Quando se utiliza uma placa de 24 cavidades, adiciona-se entre 104 e 106 células CD34+ em cada cavidade, preferencialmente de 2 x 104 a 4 x 105 células CD34+ por cavidade. Quando uma placa de 6 cavidades é usada, adiciona-se entre 8 x 104 e 2 x 106 células por cavidade.
[0070] A quantidade de células a adicionar é adaptada pelo especialista na técnica, de acordo com o recipiente utilizado.
[0071] As células são colocadas na cavidade, no meio
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24/58 basal selecionado, suplementado com TNF-alfa e preferencialmente suplementado com fatores de crescimento e citocinas, como indicado acima.
[0072] As concentrações de citocinas ou fatores de crescimento estão entre 2 e 300 ng/ml. Preferencialmente, a concentração é superior a 40 ng/ml e inferior a 300 ng/ml ou 200 ng/ml, mais preferencialmente em torno de 100 ng/ml.
[0073] No entanto, quando se deseja gerar progenitores transduzidos de células T e quando as células são pré-ativadas antes de serem expostas ao vetor viral, pode-se usar concentrações mais altas (cerca de 300-400 ng/ml). Nesta modalidade, SCF e Flt3-L podem ser utilizados em concentrações na faixa de 300 ng/ml, TPO e IL-7 na faixa de 100 ng/ml e IL-3 em torno de 40 ng/ml.
[0074] O TNF-alfa é preferencialmente utilizado a uma concentração igual ou superior a 5 ng/ml. De fato, como demonstrado nos exemplos, essa baixa concentração é suficiente para obter a proliferação dos precursores de células T, sem modificar a via de diferenciação.
[0075] No entanto, concentrações mais altas também podem ser usadas. Em particular, a concentração de TNF-alfa pode ser tão alta quanto 300 ng/ml ou 200 ng/ml. Uma concentração apropriada é de cerca de 100 ng/ml. No entanto, outras concentrações como 10 ng/ml, 20 ng/ml ou 50 ng/ml também são adequadas.
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25/58 [0076] A invenção se refere assim a um método in vitro para gerar precursores de células T compreendendo a etapa de cultura de células CD34+ em um meio adequado compreendendo TNF-alfa e na presença de um ligante de Notch imobilizado e, opcionalmente, o fragmento de fibronectina como divulgado acima.
[0077] A invenção se refere, assim, a um método in vitro para expandir precursores de células T compreendendo a etapa de cultura de células CD34+ em um meio adequado compreendendo TNF-alfa e na presença de um ligante de Notch imobilizado e, opcionalmente, o fragmento de fibronectina como divulgado acima.
[0078] A expansão dos precursores de células T significa que existem mais precursores de células T do que quando o TNF-alfa não é usado e/ou que existem mais precursores de células T do que o número de células CD34 + introduzidas no recipiente.
[0079] Em particular, os precursores de células T obtidos pelos métodos acima são precursores de CD34- /CD7+ /CD5-.
[0080] Geralmente, as células também não abrigam o marcador CDla.
[0081] Em uma modalidade preferida, os precursores de células T obtidos pelos métodos acima são precursores de CD34-/ CD7+/ CDla.
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| [0082] | Isso significa que a população de precursores |
de células T obtida pelo presente método expressa o marcador
| CD7, e que | mais de 80% das células que expressam esse |
marcador têm o fenótipo acima (não expressando
| - CD34 | e CDla, ou |
| - CD34 | e CD5, ou |
| - CD34 | e CDla e CD5), |
conforme analisado por citometria de fluxo. Este fenótipo é geralmente obtido após 7 dias de cultura.
| [0083] | Conforme indicado, as células CD34+ não são |
preferencialmente células do cordão umbilical. No entanto, o método também pode ser usado com células CD34+ do sangue do cordão umbilical e também leva a melhores resultados.
| [0084] | 0 método é particularmente interessante |
quando implementado com células CD34+ que foram isoladas de um paciente adulto. 0 referido paciente pode ser um doador saudável ou um doador com uma doença, e particularmente para o qual as células serão corrigidas por transdução viral.
| [0085] | As células podem ser cultivadas por mais de 3 |
dias, e preferencialmente por pelo menos 5 dias, mais preferencialmente por pelo menos ou exatamente 6 dias, mais preferencialmente por pelo menos ou exatamente 7 dias, embora a duração da cultura possa durar mais tempo.
| [0086] | No método aqui divulgado, o TNF-alfa é |
adicionado preferencialmente ao meio de cultura a partir do
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27/58 dia 0 (isto é, no início da cultura de células CD34+) e deve permanecer presente, no meio de cultura, por pelo menos três dias e, de preferência, durante todo o tempo em que as células são cultivadas (ou seja, de preferência cerca de 7 dias) .
[0087] Ao executar o método aqui divulgado, é possível adicionar ainda mais StemRegenin 1 (SR1, 4- (2- (2(Benzo [b] tiofen-3-il) -9-isopropil-9H-purin-6-ilamino)) etil) fenol, CAS 1227 633-4 9-10) no meio de cultura que já contém o TNF-alfa.
[0088] A invenção também se refere a um método para obter progenitores de células T, compreendendo as etapas de
a. executar o método conforme divulgado acima e
b. purificar os progenitores de células T gerados assim obtidos.
[0089] A purificação pode ser realizada lavando as células e ressuspendendo tais em meio basal.
[0090] Este método também pode compreender a etapa de condicionar os progenitores das células T em uma bolsa para injeção a um paciente.
[0091] Nesse caso, é preferível quando essas células são recondicionadas em uma solução salina contendo 5% de HSA, tal como albunorm™ 5% 50 g/L (Octopharma, Lingolsheim, França) .
[0092] Estas células também podem ser congeladas de
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28/58 acordo com métodos conhecidos na técnica.
[0093] A invenção também se refere a uma bolsa para injeção intravenosa, contendo uma população de progenitores de células T (suscetíveis de serem obtidas ou obtidas pelo método descrito acima), entre as quais a proporção de células CD7+ nessa população é superior a 80%, mais preferencialmente superior a 85%.
[0094] A invenção também se refere a uma bolsa para injeção intravenosa, contendo uma população de progenitores de células T CD7+ (suscetíveis de serem obtidas ou obtidas pelo método descrito acima), em que a proporção de células CD34- e CD5- (células que são CD7+ e ambos CD34- e CD5-) nesta população é superior a 80%, mais preferencialmente superior a 85%.
[0095] A invenção também se refere a uma bolsa para injeção intravenosa, contendo uma população de progenitores de células T CD7+ (suscetíveis de serem obtidas ou obtidas por um método descrito acima), em que a proporção de células CD34- (células que são CD7+ e CD34-) nessa população é superior a 50%, mais preferencialmente superior a 60%. Além disso, pelo menos 80% e mais preferencialmente pelo menos 85% das células nesta população são células CDla-.
[0096] A invenção também se refere a um método ín vitro para obter progenitores de células T transformadas, compreendendo as etapas de
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a. cultivar células CD34+ em um meio adequado compreendendo TNF-alfa e na presença de um ligante de Notch imobilizado
b. expor as células a um vetor destinado à transfecção ou transdução de células CD34+.
[0097] Como divulgado acima, e após as etapas de lavagem e cultura novamente das células, são obtidos progenitores de células T transformadas (expressando um transgene, integrado em seu genoma).
[0098] A invenção também se refere a um método ín vitro para obter progenitores de células T modificados, compreendendo as etapas de
a. cultivar células CD34+ em um meio compreendendo TNFalfa e na presença de um ligante de Notch imobilizado
b. expor as células a um vetor ou uma sequência de ácidos nucleicos contendo o elemento apropriado para edição
| de genes | pelo menos | por | algum | tempo durante a cultura |
| celular. | ||||
| [0099 | ] Deste | modo, | são | obtidos progenitores de |
| células T | modificados | por | edição | de genes, após possíveis |
etapas de lavagem e cultura.
[00100] A invenção também se refere a progenitores de células T, em particular como obtidos pelo método aqui divulgado, para seu uso em um paciente imunossuprimido, em particular para permitir a reconstituição imunológica nesse
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30/58 paciente e/ou obter uma proteção imune contra infecções no referido paciente, durante um período de alguns meses (pelo menos dois meses, preferencialmente pelo menos seis meses).
[00101] Em uma modalidade particular, o paciente é um paciente imunossuprimido. Os motivos da deficiência podem ser múltiplos: deficiência imunológica hereditária, quimioterapia para leucemia, condicionamento, enxerto contendo apenas células-tronco, tratamento pós-enxerto para profilaxia de GVH (doença do enxerto contra o hospedeiro), idade do paciente e complicações tais como infecções.
[00102] Em particular, o paciente pode ser imunossuprimido devido ao esgotamento de suas células imunológicas após a terapia antes do transplante de célulastronco hematopoiéticas. Nesta modalidade, o enxerto pode ser um aloenxerto (neste caso, os progenitores de células T são preferencialmente derivados de um doador parcialmente compatível com HLA) ou um autoenxerto (nesse caso, os progenitores de células T têm sido preferencialmente transformados por um vetor em para expressar um gene e/ou uma proteína que permita corrigir um defeito genético no referido paciente).
[00103] Os progenitores de células T são preferencialmente uma população de células CD7 + (isto é, uma população em que pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80% das células da população expressam o marcador
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CD7) . Essa população também faz parte da invenção. Em particular, é suscetível de ser obtida por um método aqui divulgado. Em uma modalidade específica, é obtida por um método aqui divulgado.
[00104] Mais especificamente, os progenitores das células T são preferencialmente uma população de células CD7 + (ou seja, uma população em que pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80% das células da população expressam o marcador CD7) em que a proporção de células CD34e CD5- (células CD7 + e CD34- e CD5-) nessa população é superior a 80%, mais preferencialmente superior a 85%. Essa população também faz parte da invenção. Em particular, é suscetível de ser obtida por um método aqui divulgado. Em uma modalidade específica, é obtida por um método aqui divulgado.
[00105] Em outra modalidade, os progenitores de células T são preferencialmente uma população de células CD7+ (isto é, uma população em que pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 80% das células da população expressam o marcador CD7) . Nesta população, mais de 50%, mais preferencialmente, mais de 60% das células não expressam o marcador CD34. Nesta população, pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85% das células não expressam o marcador CDla. A proporção de células CD7+ CDla- nesta população é preferencialmente de pelo menos 80%. Essa
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32/58 população também faz parte da invenção. Em particular, é suscetível de ser obtida por um método aqui divulgado. Em uma modalidade específica, é obtida por um método aqui divulgado.
[00106] A fim de determinar se uma célula é positiva ou não a um marcador de superfície (CD7, CD34, CD5 ou CDla), deve-se usar qualquer método conhecido na técnica e, em particular, citometria de fluxo, depois que as células forem marcadas com anticorpos fluorescentes direcionados contra o antígeno de superfície. O princípio é que um sinal será emitido, para cada célula da população, com uma dada intensidade, e as células serão consideradas positivas para o antígeno se o sinal for maior que um determinado limite.
[00107] Para CD34: uma população controle composta por uma população de HPSC (tal como uma isolada do sangue do cordão umbilical ou de sangue periférico mobilizado) é usada para determinar os limiares apropriados. Nesta população de células, as células são CD34+ CD7- CD5- ou CD34+ CD7- CDla-. Com esse controle, é possível determinar o limiar para cada antígeno que será usado para determinar se as células de outra população são positivas ou não para esses antígenos.
[00108] A população de controle geralmente contém cerca de 90% das células-tronco CD34+ CD7- CD5- ou CD34 + CD7- CDla- hematopoiéticas. O limite é o nível de intensidade do sinal para o qual as células da população podem ser
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33/58 classificadas na proporção de 90/10.
[00109] Para CD7 (resp. CD5 ou CDla): é utilizada uma população controle, obtida por isolamento de Células Mononucleares do Sangue Periférico (PBMC) por qualquer técnica conhecida na técnica e, em particular, uma técnica de gradiente de densidade como Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare Life Sciences) . As células positivas para CD7 (resp. CD5 ou CDla) são isoladas usando qualquer técnica conhecida na técnica, tal como a técnica de MACS® (Isolamento de Células Magnéticas e Separação de Células, Miltenyi Biotec) que utiliza esferas magnéticas com anticorpo antiCD7 (resp. Anti.CD5 ou anti-CDla). Nesta população, as células serão essencialmente CD7+ (resp. CD5+ ou CDla+), acredita-se que a proporção seja em torno de 90/10.
[00110] Os limiares para avaliar se uma célula é positiva para um antígeno de superfície são determinados usando a população de controle para esse antígeno e seria a intensidade para a qual mais de 90% das células da população de controle têm uma intensidade de sinal mais alta.
[00111] Consequentemente, uma célula é considerada positiva para um antígeno se o sinal de intensidade para esse antígeno for maior que o limiar determinado acima e negativa para o antígeno se o sinal de intensidade para esse antígeno for menor que o limiar determinado acima.
[00112] O fato de a grande maioria dos progenitores
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34/58 de células T na população não expressar o marcador CDla pode ser favorável, pois as células que expressam esse marcador CDla podem não ser muito eficientes para alcançar o timo e, portanto, tão eficientes quanto as células CDla- para repopulação ín vivo. Uma vez que o potencial de reconstituição das células CDla+ é incerto, é preferível diminuir a quantidade dessas células na população.
[00113] A invenção também se refere a um método para o tratamento de um paciente imunossuprimido, em particular com a finalidade de permitir uma reconstituição imunológica, pelo menos temporariamente, neste paciente, compreendendo a etapa de administração aos referidos progenitores de células T do paciente, como descrito acima.
[00114] Este método também pode incluir a etapa de obter esses progenitores expondo as células CD34+ a um ligante de Notch na presença de TNF-alfa (como descrito acima) e preferencialmente a uma proteína ou peptídeo com o motivo RGDS e/ou o motivo CS1, em particular um fragmento de fibronectina como descrito acima, nas condições mencionadas acima.
[00115] Em particular, é administrada uma quantidade terapeuticamente eficaz, isto é, da ordem de 1 a 5 χ 106 de progenitores por kg, o que torna possível fornecer ao paciente células capazes de desempenhar um papel protetor em relação a infecções durante alguns meses (da ordem de cerca
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35/58 de 6 meses).
[00116] De preferência, esta administração de progenitores de células T é realizada imediatamente antes, imediatamente após ou concomitantemente com um transplante de células-tronco hematopoiéticas no referido paciente. Como visto acima, as células injetadas podem ser transformadas por um vetor destinado a permitir a correção de um defeito genético no referido paciente.
[00117] Em outra modalidade, os progenitores de células T são injetados em um paciente que não precisa de um transplante de células-tronco hematopoiéticas. De fato, é possível usar os progenitores de células T transformadas ou transduzidas para tratar algumas imunodeficiências, nas quais apenas as células T são afetadas, pacientes com HIV ou câncer (usando os progenitores modificados para levar às células CAR-T), sem a necessidade de realizar quimioterapia depletiva do sistema imunológico.
[00118] Deve-se notar que os ensinamentos da invenção, como divulgados com TNF-alfa, também são aplicáveis ao derivado de purina StemRegenin 1 (SR1, divulgado em Boitano et al, Science. 2010 Sep 10; 329 (5997) : 1345-8). Assim, SR1 pode ser substituído por TNF-alfa (isto é, usado no lugar de TNF-alfa) para obter progenitores de células T a partir de células CD34+, com um início de diferenciação e expansão das células (aumento no número de
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36/58 células). A concentração de SR1 está preferencialmente na faixa de 750 nM (30 ng/ml), também maior concentração tal como 1500 nM ou 2500 nM (100 ng/ml), ou mesmo 5000 nM (200 ng/ml) ou menor, tal como 500 nM (20 ng/ml) também pode ser considerado. Quando usado sozinho, mas particularmente em combinação com TNF-alfa, podem ser usadas concentrações muito mais baixas, tão baixas quanto 3 ng/ml ou 10 ng/ml. As concentrações adequadas também incluem 30 ng/ml ou 100 ng/ml. Consequentemente, qualquer concentração superior a 3 ng/ml ou superior a 10 ng/ml é adequada para aumentar a diferenciação das células CD34+ em progenitores das células T.
[00119] SR1 é um ligante (antagonista) do receptor de hidrocarboneto de aril/dioxina (AhR). Outros antagonistas do AhR podem ser utilizados isoladamente ou em combinação com o TNF-alfa, para promover a diferenciação das células CD34+ na linhagem progenitora de células T. Pode-se citar resveratrol, omeprazol, luteolina, alfa-naftoflavona, mexiletina, tranilast, 6,2', 4'-trimetoxiflavona, CH 223191 (1-metil-N- [2-metil-4- [2- (2-metilfenil) diazenil] fenillH-pirazol-5-carboxamida, CAS 301326-22-7) . A quantidade de antagonista de AhR deve ser determinada caso a caso por um especialista na técnica, levando em consideração a IC50 do antagonista (SR1 tem uma IC50 de 127 nM, enquanto CH 223191 tem uma IC50 de 30 nM) e o fato de que alguns produtos podem
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37/58 ter uma atividade agonista em relação ao AhR quando usados em altas concentrações (como alfa-naftoflavona) ou dependendo do contexto celular (como omeprazol). Tendo em vista a diferença na IC50 entre SRI e CH 223191, está previsto que uma concentração efetiva de CH 223191 esteja bem abaixo da concentração efetiva de SR1, aqui divulgada.
[00120] Consequentemente, a invenção também se refere a (i) um método in vitro para gerar precursores de células T, compreendendo a etapa de cultura de células CD34+ em um meio compreendendo um antagonista do receptor de hidrocarboneto Aril/Dioxina, em particular StemRegenin 1 (SR1) e na presença de um ligante de Notch imobilizado.
(ii) O método in vitro como acima, em que o meio de cultura contém ainda TNF-alfa.
(iii) O método in vitro como acima, em que o antagonista do receptor hidrocarboneto Aril/Dioxina, em particular SR1, está presente, no meio de cultura, a partir do dia 0 da cultura.
(iv) O método in vitro de qualquer um dos acima, em que as células CD34+ foram isoladas a partir de um doador adulto ou de sangue do cordão umbilical.
(v) O método in vitro de qualquer um dos anteriores, em que as células são cultivadas na presença de um antagonista do receptor de hidrocarboneto de Aril/Dioxina, em particular
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SRI, por no máximo 10 dias.
(vi) O método in vitro de qualquer um dos anteriores, em que as células são cultivadas na presença do antagonista do receptor de hidrocarboneto de Aril/Dioxina, em particular SR1, entre 3 e 7 dias.
(vii) O método in vitro de qualquer um dos itens acima, em que o antagonista do receptor de hidrocarboneto de Aril/Dioxina, em particular SR1, é adicionado à cultura do meio a uma concentração entre 1 ng/ml e 300 ng/ml e, de preferência, maior ou igual a 1 ng/ml, ou maior ou igual a 3 ng/ml, ou maior ou igual a 10 ng/ml, e de preferência inferior a 200 ng/ml, ou 150 ng/ml e geralmente entre 3 ng/ml e 100 ng/ml.
(viii) O método in vitro de qualquer um dos acima, em que o ligante de Notch é o domínio solúvel do ligante Deltatipo-4, fundido a uma região Fc de uma proteína IgG, de preferência uma proteína IgG2.
(ix) O método in vitro de qualquer um dos acima, em que as células também são expostas a um fragmento de fibronectina, em que o referido fragmento compreende os padrões RGDS e CS-1, bem como um domínio de ligação à heparina, de preferência imobilizado na superfície interna do frasco de cultura.
(x) O método in vitro acima, em que o fragmento de fibronectina é Retronectin®, como divulgado acima.
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39/58 (xi) 0 método in vitro de qualquer um dos acima, em que o meio de cultura também contém um vetor destinado à transfecção ou transdução das células CD34+, durante pelo menos algum tempo de exposição das células CD34+ ao ligante de Notch.
(xii) 0 método in vitro de qualquer um dos itens acima, em que o meio de cultura contém pelo menos três, e preferencialmente todas as quatro citocinas ou fatores de crescimento escolhidos a partir do grupo que consiste em Interleucina 7 (IL-7), SCF (Fator de Células-Tronco), trombopoietina (TPO) e ligante Flt3 (FLT3L).
(xiii) Um método (in vitro) para obter progenitores de células T, compreendendo as etapas de
a. executar o método de acordo com qualquer um dos itens acima e
b. purificar os progenitores das células T geradas
c. opcionalmente, condicionar os progenitores das células T em uma bolsa para injeção a um paciente.
(xiv) Um método in vitro para obter progenitores de células T transformadas, compreendendo as etapas de
a. cultivar células CD34+ em um meio compreendendo um antagonista do receptor de hidrocarboneto de Aril/Dioxina, em particular SR1, e na presença de um ligante de Notch imobilizado
b. expor as células a um vetor destinado à transfecção
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40/58 ou transdução de células CD34+.
(xv) Um método in vitro para obter progenitores de células T modificados, compreendendo as etapas de
a. cultivar células CD34+ em um meio compreendendo um antagonista do receptor de hidrocarboneto de Aril/Dioxina, em particular SR1, e na presença de um ligante de Notch imobilizado
b. expor as células a um vetor ou sequências de ácidos nucleicos contendo o elemento apropriado para edição de genes.
[00121] A invenção também se refere a um kit para executar qualquer método como indicado acima, compreendendo:
(i) um meio de revestimento contendo um ligante de Notch (em particular o domínio solúvel do ligante do tipo Delta, fundido com uma região Fc de uma proteína IgG, em particular uma proteína IgG2) e, opcionalmente, um fragmento de fibronectina (ii) um meio adaptado para a cultura (e/ou expansão) de células CD34+ e células T, tal como a-MEM, DMEM, RPMI 1640, IMDM, BME, McCoy’s 5A, StemSpan™ SFII (StemCell Technologies), meio X-VIVO™ ou Meio de Fischer (iii) um meio de expansão progenitor contendo TNF-alfa e preferencialmente três citocinas, em particular selecionadas de SCF, TRO, Flt3L e IL-7. É preferido quando o meio de expansão progenitor contém TNF-alfa e todas as
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41/58 quatro citocinas SCF, TPO, FltSL e IL-7.
[00122] Em outra modalidade, a invenção se refere a um kit que compreende os mesmos elementos (i) e (ii) como indicado acima, e um meio de expansão progenitor (iii) que contém um antagonista do receptor de hidrocarboneto de Aril/Dioxina, em particular SR1, e de preferência três citocinas, em particular selecionadas de SCF, TPO, FltSL e IL-7. É preferido quando o meio de expansão progenitor contém SR1 e todas as quatro citocinas SCF, TPO, FltSL e IL-7.
[00123] Em outra modalidade, o meio de expansão progenitor (iii) contém TNF-alfa e um antagonista do receptor de hidrocarboneto Aril/Dioxina, em particular SR1, e preferencialmente três citocinas, em particular selecionadas de SCF, TPO, Flt3L e IL-7. É preferido quando o meio de expansão progenitor contém TNF-alfa, SR1 e todas as quatro citocinas SCF, TPO, FltSL e IL-7.
[00124] Esse kit é particularmente adaptado e projetado para executar os métodos aqui divulgados.
[00125] O meio de revestimento (i) é usado pela primeira vez para revestir as paredes de um recipiente de cultura.
[00126] O meio (ii) é então usado para cultivar células CD34+ (obtidas ou do sangue do cordão umbilical ou do sangue periférico mobilizado, em particular de um adulto). Esse meio é geralmente e preferencialmente utilizado a uma
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42/58 concentração de lx (isto é, pode ser utilizado sem diluição) .
[00127] O meio (iii) geralmente é apresentado como uma diluição de lOx (ou seja, deve ser diluído em um meio (ii) para uso. O meio reconstituído dos meios (ii) e (iii) é então usado para promover a diferenciação das células CD34+
| aos progenitores de | células T, na | linhagem | de | células T, | |
| como divulgado acima. | |||||
| [00128] A invenção | também se | refere a | um | método para | |
| aumentar o número | de | células T | em um | indivíduo em |
necessidade, o método compreendendo a administração ao indivíduo de um número eficaz de células T progenitoras, como obtido por um método aqui divulgado.
[00129] A invenção também se refere a células T progenitoras, como obtidas por qualquer método aqui divulgado para a sua utilização no tratamento de um indivíduo necessitado de um número aumentado de células T.
[00130] Em particular, o indivíduo é um humano.
[00131] Em particular, as células T progenitoras administradas são autólogas. Em outra modalidade, as células T progenitoras administradas são alogênicas.
[00132] Em particular, o indivíduo necessitado do número aumentado de células T tem uma condição médica que causa ou resulta em linfopenia, em particular câncer, infecção por HIV, timectomia parcial, doença autoimune e/ou transplante de órgãos.
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Descrição das Figuras [00133] Figura 1: Número total de células nucleadas obtidas a partir de 20000 células CD34+ do sangue do cordão umbilical (CB, Figura l.A) ou sangue periférico mobilizado (mPB, Figura l.B), após 3 dias (barras pretas) e 7 dias (preto acumulado e barras cinza) da cultura. NC: não complementado; SR1: adição de StemRegenin 1 (750nM); TNFalfa: adição de TNF-alfa (100 ng/ml) ; + (a), (b), (c) : número de células observadas quando os complementos são adicionados de 0 a 3 dias de cultura (a) , 0 a 7 dias de cultura (b) ou 4 a 7 dias de cultura (c).
[00134] Figura 2: Número de precursores de células T CD7+ obtidos no dia 7, começando com 20000 células CD34+ de sangue do cordão umbilical (CB, Figura 2.A) ou sangue periférico mobilizado (mPB, Figura 2.B) . Barras pretas: células CD34+ CD7+; barras cinzas: células CD34-CD7+. (a), (b) , (c) : número de células observadas guando os complementos são adicionados de 0 a 3 dias de cultura (a), 0 a 7 dias de cultura (b) ou 4 a 7 dias de cultura (c).
[00135] Figura 3: A expressão de Bclllb foi analisada em células vivas após 7 dias de cultura obtidas a partir de células CD34+ de sangue do cordão umbilical (CB) ou sangue periférico mobilizado (mPB) cultivadas na presença (barras cinza) ou ausência (barras pretas) de TNF-alfa.
[00136] Figura 4: Efeito combinado do TNF-alfa e do
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44/58 ligante de Notch DL4 no número de células CD7+ obtidas no dia 7 a partir de células sanguíneas do cordão CD34+ (CB, barras pretas, esquerda) ou sangue periférico mobilizado (mPB, barras cinza, direita) . ( + / - significa presença ou ausência de DL4 ou TNF-alfa).
[00137] Figura 5: Frequência de células mielóides no dia 7 obtidas a partir de células CD34+ de sangue do cordão umbilical (CB) ou sangue periférico mobilizado (mPB) na presença (barras cinza) ou não (barras pretas) de TNF-alfa (Média ± SEM).
[00138] Figura 6: Número total de células CD7+ obtido do dia 3 ao dia 7 em um ensaio de resposta à dose de TNFalfa, começando com células CD34+ do sangue do cordão umbilical (CB, Figura 6.A) ou sangue periférico mobilizado (mPB, Figura 6.B) .
[00139] Figura 7: Proporção de células CD34- CD7+ (barras cinza) vs células CD34+ CD7+ (barras pretas) em um ensaio de resposta à dose de TNF-alfa começando com células CD34+ do sangue do cordão umbilical (CB, Figura 7.A) ou sangue periférico mobilizado (mPB, Figura 7.B).
[00140] Figura 8: Proporção de células nas diferentes fases do ciclo celular. A. CB: células diferenciadas do sangue do cordão umbilical; B. células diferenciadas de células sanguíneas periféricas mobilizadas. NC: não complementado; TNF-alfa: cultivado na presença de TNF-alfa
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45/58 (20 ng/ml); SRI: culturas na presença de SRI (30 ng/ml).
[00141] Figura 9: porcentagem (A) e número total (B) de células CD5 + CD7 + cultivadas a partir de células CD34+ do sangue do cordão umbilical na presença de TNF-alfa e/ou SRI em várias concentrações, após 7 dias de cultura.
Exemplos
Exemplo 1 - Material e métodos
Células humanas [00142] Amostras de sangue do cordão não elegíveis para banco foram usadas para fins de pesquisa, após o consentimento informado da mãe da criança. Amostras de sangue periférico mobilizado (mPB) foram coletadas de doadores saudáveis após a mobilização do G-CSF. As amostras foram enriquecidas diretamente para células CD34+. O consentimento informado foi dado por cada doador (Departamento de Bioterapia, Hospital Necker, Paris).
Exposição de células progenitoras CD34+ ao ligante de Notch DL-4 [00143] Células CD34+ de CB humano ou amostras de sangue periférico mobilizado foram cultivadas em placas de 24 cavidades ou placas de 6 cavidades revestidas com fibronectina humana recombinante (RetroNectin®, Clontech/ Takara) e DL-4 (5 pg/ml, PX' Therapeutics, Grenoble, França) . O revestimento foi realizado por 2 h a 37 °C, as cavidades revestidas com DL-4 foram então bloqueadas com albumina de
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46/58 soro bovino a 2% (BSA) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 30 minutos a 37 °C e lavados com PBS. As culturas foram iniciadas na concentração de 2 x 104 células/cavidade ou 1 x 105 células/cavidade (para placas de 24 e 6 cavidades, respectivamente) em meio a-MEM (Gibco, life Technology), suplementado com NaHCCh (7,5%) (Gibco, life Technology) e soro fetal de bezerro definido a 20% (Hyclone, Thermo Fisher Scientific, Illkirch, França) e as citocinas humanas recombinantes interleucina-7 (IL-7), ligante Flt3 (Flt-3), fator de células-tronco (SCF) e trombopoietina (TPO) (todos a 100 ng/ml e todos adquiridos da PeproTech Inc, Rocky Hill, NJ) com ou sem TNF-α (R&D Systems, EUA). Após 3 dias de cultura, as células foram substituídas pela metade por meio fresco. As células cultivadas foram analisadas por separação celular ativada por fluorescência (FACS) após 3 e 7 dias de cultura em DL-4, respectivamente, para excluir células mielóides CD34-/CD7- das análises subsequentes.
Ensaio de diferenciação de células T in vitro em células OP9/DL1 [00144] O potencial linfóide T de células GB CD34+ nativas e progenitores de células T induzidas por TNF-a gerados pela exposição ao DL-4 foi avaliado em co-culturas OP9/DL-1, como descrito anteriormente (Six et al., Blood Cells Mol Dis. 15 de junho de 2011; 47 (1): 72-8 e Six J Exp
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Med. 24 de dezembro de 2007; 204 (13): 3085-93).
Reações em cadeia da polimerase quantitativa e em tempo real usando a matriz RT2 Profiler [00145] As células CD7 + foram classificadas em Ariall após 7 dias de cultura. 0 RNA total das frações celulares classificadas do dia 3 e 7 foi isolado com o Micro Kit de Rneasy (Qiagen, Courtaboeuf, França). As matrizes de RT2 Profiler PCR foram realizadas seguindo o protocolo detalhado no Manual de Matrizes de RT2 Profiler PCR (SA Biosciences, Frederick MD).
Análise por citometria de fluxo e classificação celular [00146] Os anticorpos monoclonais contra CD34 (AC136), CD3 (BW264/56), CD45 (5B1) foram adquiridos da Miltenyi Biotech (Bergisch Gladbach, Alemanha) e CD4 (SK4), CD7 (M-T701), CD25 (M-A251), 7-aminoactinomicina D (7AAD) eram da BD Biosciences (San José, CA) . O CD8 anti-humano (RPAT8) era da Sony Biotechnology (San Jose, EUA). O anticorpo anti-humano Ctip2 (Bclllb) era de Abeam (Cambridge, Reino Unido).
[00147] As células humanas foram coradas e analisadas usando um analisador Gallios (Beckman Coulter, Krefeld, Alemanha). As células de receptores xenogênicos foram analisadas em um aparelho MACSQuant® (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemanha) . Os dados foram analisados usando o software FlowJo (Treestar, Ashland, OR) após
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48/58 bloqueio em células viáveis, 7AAD-negativas. Os subconjuntos de células foram classificados em um sistema ARIA II.
Ensaios de proliferação celular [00148] Para ensaios de proliferação celular, as células CD34+ de CB e mPB foram marcadas usando o kit CellTrace™ CFSE (Life Technologies, Carlsbad, CA) antes da cultura com DL-4 e TNF-alfa (Life Technologies). A intensidade da coloração das células foi medida antes da cultura, todos os dias, do dia 3 ao dia 7. As células positivas para CFSE foram analisadas em um citômetro de Gallios (Beckman Coulter).
Ensaios do ciclo celular [00149] Para análise do ciclo celular, as células foram coradas com Hoechst33342 (Life Technology) e K167-PC5 (BD Bioscience) após fixadas com reagente fixador do kit PerFix-nc (Beckman Coulter) à temperatura ambiente por 15 min e adicionados reagentes permeabilizantes. Os dados foram analisados usando o software FlowJo (versão 10.2, Treestar, Ashland, OR) após bloqueio em células viáveis, 7AADnegativas.
Transferência adotiva de progenitores de células T gerados in vitro derivados de HSPCs adultos para neonatos NSG [00150] Todas as experiências e procedimentos com animais foram realizados em conformidade com os regulamentos
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49/58 do Ministério da Agricultura francês sobre experiências com animais. A injeção de progenitores de células T humanas geradas in vitro em camundongos NSG foi aprovada pelo Ministério do Ensino Superior e Pesquisa (APAFIS 21012015090411495178v4).
[00151] Os camundongos NSG (NOD-Scid (IL2Rgnu11)) (obtidos do Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, http://www.jax.org) foram mantidos em uma instalação livre de patógenos. A progênie derivada de mPB CD34+ HSPCs em culturas DL-4 de 7 dias com ou sem TNF α (3 x 105 ou 1 x 106) foi injetada intra-hepaticamente em neonatos NSG (0 a 4 dias) . Os camundongos de controle foram injetados com 3 x 105 células mPB CD34+ não cultivadas ou 100 ui de PBS.
[00152] Os níveis médios de enxerto de camundongos NSG foram determinados de 4 a 12 semanas após o transplante. A análise por citometria de fluxo foi realizada em células recém-colhidas do fêmur, timo, sangue periférico e baço. As células foram tratadas com Ix tampão de lise de glóbulos vermelhos (Biolegend, US) e lavadas antes da coloração por anticorpos.
Análise da diversidade de receptores de células T [00153] A análise do rearranjo gênico do TCR foi realizada em duplicata e nos dois subconjuntos purificados independentemente (a média é mostrada).
[00154] A quantificação de TCR-δ (D 52-D 53, D 52-J
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50/58 δΐ e D Õ3-J δΐ) foi realizada com os conjuntos listados de primers e sondas.
[00155] Foram utilizados os seguintes para rearranjos D 52-D δ3:
D δ2, 5'-CAAGGAAAGGGAAAAAGGAAGAA-3' (SEQ ID N° 9);
D δ3, 5’-TTGCCCCTGCAGTTTTTGTAC-3’ (SEQ ID N° 10);
e sonda D’3, 5'-ATACGCACAGTGCTACAAAACCTACAGAGACCT-3’ (SEQ ID N° 11).
[00156] Os seguintes primers e sonda foram utilizados para rearranjos D Õ2-J δΐ:
D δ2, 5'-AGCGGGTGGTGATGGCAAAGT-3' (SEQ ID N° 12);
J δΐ, 5’-TTAGATGGAGGATGCCTTAACCTTA-3’ (SEQ ID N° 13);
e sonda J δΐ, 5'-CCCGTGTGACTGTGGAACCAAGTAAGTAACTC-3’ (SEQ ID N° 14) [00157] Foram utilizados os seguintes para rearranjos D Õ3-J δΐ:
D δ3, 5'-GACTTGGAGAAAACATCTGGTTCTG-3' (SEQ ID N° 15);
Iniciador J δΐ e sonda J δΐ.
[00158] A análise dos rearranjos de TCR por PCR fluorescente multiplex foi realizada por separação de produtos de PCR de suporte único marcados com fluorocromo em um polímero de sequenciamento capilar e detectados por varredura a laser automatizada.
Ensaios de apoptose [00159] As células foram lavadas com PBS frio e
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51/58 ressuspensas em tampão de ligação a uma concentração de 1 milhão de células/ml. Após adição de 5 ul de Anexina V-PE (BD Bioscience) e 2 ul de 7AAD, as células foram incubadas no escuro à temperatura ambiente por 15 minutos. Subsequentemente, as células foram lavadas com 500 ul de tampão de ligação e ressuspensas em 100 ul de tampão de ligação para serem analisadas dentro de 1 hora.
Exemplo 2: Melhoria na expansão e diferenciação de precursores de células T [00160] Quando as células CD34+ são cultivadas com DL-4, a Figura 1 mostra que a adição de TNF-alfa ao meio de cultura celular permite multiplicar o número total de células recuperadas no dia 7 por 10 vezes em comparação com a cultura sem TNF-alfa, ao iniciar com células CD34+ emitidas a partir do sangue do cordão umbilical (Figura l.A) ou do PB (Figura
1. B) .
[00161] A Figura 2 mostra que a adição de TNF-alfa ao meio de cultura celular torna possível multiplicar o número de células CD7+ em 20 a 40 vezes, seja ao iniciar com células CD34+ emitidas a partir de sangue do cordão umbilical (Figura
2. A) ou de PB (Figura 2.B). A melhoria é especialmente alta para a população de células CD34- CD7+.
Exemplo 3: Análise dos marcadores de superfície dos progenitores de células T [00162] Os marcadores de superfície presentes na
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52/58 superfície das células obtidas após 7 dias de cultura foram determinados por citometria de fluxo.
| Sangue | do cordão umbilical | mPB | ||||||
| CD34 + | CD34- | CD34 + | CD34- | CD34 + | CD34- | CD34 + | CD34- | |
| CD7 + | CD7 + | CD7- | CD7- | CD7 + | CD7 + | CD7- | CD7- | |
| -TNFa | 29, 5 | 38,9 | 15, 4 | 16,3 | 15, 1 | 11,3 | 32,9 | 40,7 |
| + TNFa | 0,39 | 95, 6 | 0,76 | 3,22 | 0, 68 | 90, 1 | 2,75 | 6,49 |
| Sangue | do cordão umbilical | mPB | ||||||
| CD5+ | CD5- | CD5+ | CD5- | CD5+ | CD5- | CD5+ | CD5- | |
| CD7 + | CD7 + | CD7- | CD7- | CD7 + | CD7 + | CD7- | CD7- | |
| -TNFa | 1,56 | 66, 8 | 5, 10~3 | 31, 6 | 0, 069 | 26,4 | 0, 027 | 73,5 |
| + TNFa | 0, 66 | 95, 4 | 0, 012 | 3, 97 | 3, 01 | 87,7 | 0,24 | 9, 00 |
[00163] Essas tabelas mostram que a adição de TNFalfa leva a um aumento na proporção de células CD7 + , sem realmente aumentar a proporção de células CD5+.
[00164] Após 7 dias de cultura, os HSPCs se diferenciam em precursores de células T CD34- CD7+ CD5-.
[00165] Os marcadores de superfície presentes na superfície das células obtidos após 10 dias de cultura também foram determinados por citometria de fluxo.
[00166] Nenhuma expressão de CDla foi encontrada
Petição 870190100628, de 08/10/2019, pág. 64/81
53/58 (dados não mostrados).
[00167] A cinética de modificação dos marcadores de superfície foi estudada e verificou-se que a presença de TNF-alfa no meio de cultura aumenta a proporção de CD7 + do dia 4 ao dia 7 (dados não mostrados).
Exemplo 4: rearranjo de receptores de células T [00168] Os precursores de células T DL-4 não exibem sinais de rearranjo do TCR com ou sem TNF-alfa ou SR1 após 7 dias de cultura (dados não mostrados).
[00169] A análise específica de rearranjo foi realizada:
Resultados dos rearranjos do TCRdelta [00170] Detecção dos rearranjos de DÕ2-DÕ3 em CB-NC e CB-SR1. Nenhum outro rearranjo do TCRdelta foi detectado. Os resultados estavam de acordo com a quantificação RQ-PCR
Resultados dos rearranjos de TCRgamma [00171] Nenhum rearranjo de TCRgamma foi detectado.
Resultados dos rearranjos do TCRbeta [00172] Nenhum rearranjo do TCRbeta foi detectado.
Exemplo 5: Compromisso T de precursores de células T induzidos por TNFa [00173] O Bclllb é um importante fator transcricional ativado exclusivamente desde o comprometimento das células T e absolutamente necessário para a diferenciação das células T.
Petição 870190100628, de 08/10/2019, pág. 65/81
54/58 [00174] A coloração intracelular em precursores de células T cultivadas com TNF-alfa mostrou expressão positiva de Bclllb para ambas as células CD34+ emitidas a partir de sangue do cordão umbilical e mPB. A Figura 3 mostra que o TNF-alfa aumenta a proporção de células totais que expressam o fator de transcrição de Bclllb. Quando cultivadas com TNFalfa, a proporção de células que expressam Bclllb foi aumentada.
Exemplo 6: Diferenciação em outras linhagens
| [00175] | A | presença de outros | marcadores | de superfície |
| celular (CD14 | e | CD33) específicos | de outras | linhagens foi |
| avaliada. | ||||
| [00176] | A | Figura 5 mostra que a cultura na presença |
de TNF-alfa tornou essas células não detectáveis, enquanto sua proporção é inferior a 22% quando as células CD34+ são cultivadas sem TNF-alfa.
Exemplo 7: TNF-alfa reduz a apoptose das células Marcadores de apoptose (7 DAA e Anexina 5) foram estudados.
| 7AAD +/- AnexinaV + células apoptóticas (%) | CB | mPB |
| -TNFa | 1, 66 | 10,56 |
| + TNFa | 0,28 | 0, 96 |
[00177] Esta tabela mostra que a cultura na presença
Petição 870190100628, de 08/10/2019, pág. 66/81
55/58 de TNF-alfa reduz a presença dos marcadores de apoptose. Isto é particularmente aparente para mPB.
Exemplo 8: Teste de resposta à dose de TNF-alfa [00178] Foram utilizadas várias doses de TNF-alfa.
[00179] A Figura 6 mostra que o TNFa pode aumentar o número de células CD7 + durante a cultura, quando a concentração é superior a 10 ng/ml, para células CB (Figura 6.A) ou células mPB (Figura 6.B) .
[00180] A cinética da resposta à dose mostrou que o TNF-alfa aumenta a diferenciação de células T após apenas 4 dias de cultura em DL-4. Não houve diferença entre as concentrações 10, 50 e 100 ng/ml (não mostrado).
[00181] Para determinar o limiar da concentração efetiva, foi realizada a análise de concentrações mais baixas (0,01 a 10 ng/ml).
[00182] Verificou-se que o efeito do TNF-alfa no CB e no mPB na diferenciação das células T (porcentagem de células CD34- CD7+) é dependente da concentração em baixa concentração (Figura 7) . O número total de precursores de células T CD7 + não foi diferente de 5 ng/ml a 100 ng/ml.
Exemplo 9: Análise de proliferação durante a cultura [00183] Verificou-se que o TNF-alfa aumenta a proliferação de precursores de células T CD34+ CD7 + desde o dia 3 na cultura de DL-4 em comparação com as condições de cultura sem TNF-alfa (dados não mostrados).
Petição 870190100628, de 08/10/2019, pág. 67/81
56/58
Exemplo 10: sinergia entre TNF-alfa e o ligante de Notch [00184] A Figura 4 mostra que, sem DL4, CB e mPB falharam em se diferenciar em precursores de células T CD7+. Mesmo a complementação do meio com TNF-alfa não conseguiu resgatá-lo.
[00185] Quando o TNF-alfa e o ligante de Notch estão presentes, o efeito observado é muito alto. Parece, portanto, que existe uma sinergia entre esses dois compostos e que o efeito do TNF-alfa na diferenciação de células T provavelmente depende de Notch.
Exemplo 11: A adição de TNF-alfa aumenta a proliferação de progenitores CD7 + [00186] Após 7 dias de cultura na presença de TNFalfa, os subconjuntos CD34+ CD7-, CD34+ CD7 + e CD34-CD7 + foram classificados, corados com CFSE (éster de succinimidil de carboxifluoresceina) e a diluição de CFSE (marcador substituto da proliferação celular) foi seguida do dia 8 ao 10.
[00187] Somente as células CD34+ CD7 + e CD34- CD7+ mostram proliferação aumentada quando cultivadas com TNFalfa. (Dados não mostrados)
Exemplo 12: Análise do Ciclo Celular [00188] A análise do ciclo celular foi realizada. Observou-se que mais células foram liberadas da fase G0 na presença de TNF-alfa nos progenitores CD7+ derivados de CB
Petição 870190100628, de 08/10/2019, pág. 68/81
57/58 e mPB (Figura 8) .
Exemplo 13: Combinação de SRI e TNFa [00189] 0 SRI acelera a diferenciação de células T, conforme mostrado pela presença de células CD5 + CD7 + no dia 7. O número de células CD5 + CD7 + é aumentado pela presença de TNF-alfa e SR1 (Figura 9).
Exemplo 14: dados ín vivo [00190] Os precursores de células T induzidos na presença de TNF-alfa podem em grande parte fixar a reconstituição da linhagem T ín vivo.
[00191] De fato, 4 semanas após o transplante, camundongos receptores injetados com precursores de células T mPB produzidos na presença de TNF-alfa têm timo maior do que camundongos injetados com precursores de células T mPB produzidos sem TNF-alfa. Os precursores de células T induzidos na presença de TNF-alfa podem se diferenciar das células T TCRafB ativadas dentro de 4 semanas ín vivo. (Dados não mostrados) [00192] Em resumo, a adição de TNF-alfa a partir do dia 0 no sistema de cultura DL-4 leva a um aumento de progenitores de células T (definido pela expressão da superfície de CD7) de 40 vezes para mPB HSPC e 20 vezes para CB HSPC no dia 7).
[00193] Os progenitores de células T CD7 + gerados a partir de CB e mPB eram principalmente CD34- e eram negativos
Petição 870190100628, de 08/10/2019, pág. 69/81
58/58 para CDla. As células também eram principalmente CD5 negativas.
[00194] Eles expressaram o Bclllb, que é um importante fator de transformação molecular para comprometimento T e diferenciação adicional de células T.
[00195] Eles não exibiram nenhum sinal de rearranjo do receptor de células T.
[00196] Suas características fenotípicas e moleculares foram semelhantes às dos progenitores de células T CD34- CD7+ obtidos sem TNF-alfa.
[00197] Em relação aos mecanismos envolvidos na ação do TNF-alfa, o TNF-alfa diminui a expressão de marcadores de apoptose e aumenta a proliferação celular durante a cultura. Também inibe a produção de células mielóides.
[00198] O uso de TNF-alfa no sistema de cultura DL4 aumenta em grande medida as quantidades de progenitores de células T produzidas a partir de HSPC de adultos e sangue do cordão umbilical. Assim, pode superar a dificuldade de obter grandes quantidades de progenitores de células T do HSPC adulto. Também pode diminuir o número de HSPC inicial necessário em futuros ensaios clínicos e a quantidade de GMP e outros reagentes necessários, diminuindo assim os custos de produção desses progenitores de células T.
Claims (16)
- REIVINDICAÇÕES1. Método in vitro para a produção de precursores de células T, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de cultivar células CD34+ em um meio compreendendo TNF-alfa e/ou um antagonista do receptor hidrocarboneto de Aril/Dioxina, em particular StemRegenin 1 (SR1) e na presença de um ligante de Notch imobilizado, preferencialmente em que o ligante de Notch é imobilizado na superfície interna de um recipiente de cultura ou na superfície das esferas presentes no meio de cultura.
- 2. Método in vitro, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o TNF-alfa e/ou o antagonista do receptor de hidrocarboneto de Aril/Dioxina está presente, no meio de cultura, a partir do dia 0 da cultura, de preferência em que TNF-alfa está presente em uma concentração superior ou igual a 3 ng/ml, e/ou em que o antagonista do receptor de hidrocarboneto de Aril/Dioxina está presente, no meio de cultura, em uma concentração superior ou igual a 30 ng/ml.
- 3. Método in vitro, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as células CD34+ foram isoladas de um doador adulto.
- 4. Método in vitro, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as células são cultivadas na presença de TNF-alfa e/ou SR1Petição 870190077790, de 12/08/2019, pág. 26/332/5 durante, no máximo, 10 dias, preferivelmente entre 3 e 7 dias.
- 5. Método in vitro, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o ligante de Notch é o domínio solúvel do ligante Delta tipo 4, fundido a uma região Fc de uma proteína IgG, preferencialmente uma proteína IgG2.
- 6. Método in vitro, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que as células são também expostas a um fragmento de fibronectina, em que o referido fragmento compreende os padrões RGDS e CS1, bem como um domínio de ligação à heparina, preferivelmente imobilizado no superfície interna do recipiente de cultura ou em esferas, de preferência em que o fragmento de fibronectina é Retronectin®.
- 7. Método in vitro, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura também contém um vetor destinado à transfecção ou transdução das células CD34+, durante pelo menos algum tempo de exposição das células CD34+ ao ligante de Notch.
- 8. Método in vitro, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o vetor destinado à transfecção ou transdução das células CD34+ é um transgene que codifica para um Receptor de Antígeno Quimérico (CAR).Petição 870190077790, de 12/08/2019, pág. 27/333/5
- 9. Método para obter progenitores de células T, caracterizado pelo fato de compreender as etapas dea. realizar o método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 eb. purificar os progenitores de células T geradosc. opcionalmente condicionar os progenitores de células T em uma bolsa para injeção a um paciente.
- 10. Método in vitro para a obtenção de progenitores de células T transformadas, caracterizado pelo fato de compreender as etapas dea. cultivar as células CD34+ em um meio compreendendo TNF-alfa e na presença de um ligante de Notch imobilizadob. expor as células a um vetor destinado à transfecção ou transdução de células CD34+.
- 11. Método in vitro para obtenção de progenitores de células T modificadas, caracterizado pelo fato de compreender as etapas dea. cultivar as células CD34+ em um meio compreendendo TNF-alfa e na presença de um ligante de Notch imobilizadob. expor as células a um vetor ou sequências de ácidos nucleicos contendo o elemento apropriado para edição de genes.
- 12. População de progenitores de células T CD7+ caracterizada pelo fato de que a proporção de células quePetição 870190077790, de 12/08/2019, pág. 28/334/5 são CD34- e CDla- ou CD34- e CD5-, ou CD34- e CDla- e CD5nesta população é superior a 80%.
- 13. População de progenitores de células T CD7+, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de expressar uma CAR.
- 14. Bolsa para injeção intravenosa, caracterizada pelo fato de conter a população de progenitores de células T como definida na reivindicação 12 ou reivindicação 13.
- 15. Kit para executar o método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de compreender:(i) um meio de revestimento contendo um ligante de Notch e, opcionalmente, um fragmento de fibronectina (ii) um meio adaptado para cultivar células CD34+ e células T (iii) um meio de expansão de progenitor contendo TNFalfa e/ou um antagonista do receptor de hidrocarboneto de Aril/Dioxina e, de um modo preferido, três ou quatro citocinas selecionadas do grupo consistindo em SCF, TPO, Flt3L e IL-7.
- 16. Célula T progenitora obtida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou uma célula T progenitora como definida na reivindicação 12 ou reivindicação 13, caracterizada pelo fato de ser para aumentar o número de células T em um indivíduo em necessidadePetição 870190077790, de 12/08/2019, pág. 29/335/5 da mesma, de um modo preferido para linfopenia, mais preferencialmente para câncer, infecção por HIV, timectomia autoimune, e/ou transplante de órgãos.
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