ES2914082T3 - Procedimiento de generación de progenitores de células T - Google Patents

Abstract

Procedimiento in vitro para generar progenitores de células T, que comprende la etapa de exponer células CD34+ en un medio en presencia de un ligando de Notch, inmovilizado sobre un soporte, siendo dicho ligando de Notch el dominio soluble del ligando Tipo Delta 4, fusionado a una región Fc de una proteína IgG, y en presencia de un fragmento de una fibronectina, comprendiendo dicho fragmento los motivos RGDS, CS-1 y un dominio de unión a heparina, en donde el tiempo de exposición de las células CD34+ a dicho ligando de Notch en presencia de dicho fragmento de una fibronectina es inferior a 10 días, preferiblemente comprendido entre 3 y 8 días.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento de generación de progenitores de células T

La invención se refiere al campo de la terapia celular y en particular a los trasplantes de células madre hematopoyéticas, transformadas o no, y a la reconstitución inmunitaria tras dichos trasplantes.

El trasplante de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC por Hematopoietic Stem and Progenitor Cells) se considera la mejor opción terapéutica para las inmunodeficiencias hereditarias más graves, para numerosas hemopatías malignas, así como para cierto número de tumores sólidos.

Actualmente, en situaciones de aloinjerto con incompatibilidad de HLA parcial, la inyección de receptores preacondicionados con dosis crecientes de HSPC CD34+ clasificadas permite el injerto del donante con una prevención eficaz de la enfermedad de injerto contra huésped (GVHD). Sin embargo, la diferenciación de nuevos linfocitos T a partir de las células CD34+ inyectadas requiere un período mínimo de 4 meses y estos linfocitos T no están en número suficiente para desempeñar un papel protector frente a infecciones hasta unos meses después de su aparición.

Es a esta lentitud de la reconstitución inmune a la que debemos las numerosas complicaciones infecciosas, especialmente virales, pero también las recaídas, que influyen en el pronóstico a largo plazo de los pacientes trasplantados.

Además, otros protocolos terapéuticos utilizan un enfoque de terapia génica, es decir, un autoinjerto de HPSC transducidas, que ha demostrado su eficacia en el tratamiento de ciertas inmunodeficiencias hereditarias. El interés de esta estrategia frente al trasplante de HSPC CD34+ alogénicas es indiscutible en cuanto a supervivencia y morbilidad cuando no se dispone de donante HLA compatible. No obstante, la experiencia clínica ha demostrado que, para algunos pacientes con infecciones graves, la reconstitución del compartimiento de células T es lenta y nunca alcanza niveles normales de células T circulantes. La morbilidad y mortalidad asociadas a este contexto particular son significativas.

Por el número de pacientes afectados, por la importante morbimortalidad tras este tipo de trasplante, está plenamente justificado el desarrollo de nuevas terapias encaminadas a reducir el período de inmunodeficiencia tras el trasplante.

Por lo tanto, es importante acelerar la generación de linfocitos T mediante la administración de precursores implicados en la vía de diferenciación linfoide T (progenitores de células T).

Estos precursores de células T se derivan de una diferenciación de HSPC CD34+ y, en particular, muestran el marcador CD7+, que es un marcador de diferenciación en la ruta de los linfocitos T. También pueden presentar otros marcadores. Así, Awong et al. (Sangre 2009; 114: 972-982) han descrito los siguientes precursores de linfocitos T: progenitores tímicos tempranos (ETP, “early thymic progenitor”), que presentan los marcadores (CD34+/CD45RA+/CD7+), células en estadio proT1 (CD7++/CD5-), células en estadio proT2 (CD7++/CD5+), células en etapa preT (CD7++/CD5+CD1a+). Por lo tanto, las HSPC adquieren estos marcadores sucesivamente al pasar por estas etapas, durante el desarrollo de las células T.

Un trasplante de precursores T concomitante con el trasplante de HSPC permitiría la producción rápida de un compartimento de linfocitos T maduros y funcionales y, por lo tanto, evitaría el riesgo de infecciones graves, al permitir que el paciente se beneficie de un nivel de inmunidad mínimo antes de la reconstitución total de su sistema inmunológico.

Además, es importante poder utilizar células adultas en lugar de células de sangre de cordón, en la medida en que es más fácil y menos costoso obtener células adultas que células de sangre de cordón y que se utilizan más en aloinjertos.

Sin embargo, los datos publicados en la literatura, obtenidos en humanos y ratones, muestran diferencias intrínsecas entre las células hematopoyéticas fetales (incluida la sangre del cordón umbilical) y las células adultas. Estas diferencias se relacionan con la supervivencia, la capacidad de reparar el daño del ADN, la capacidad proliferativa y el potencial de diferenciación (ver en particular Yuan et al. (Science. 2012 Mar 9; 335(6073): 1195-200), que indican que las células adultas de la médula ósea son menos eficaces que las células fetales en su potencial para generar varios tipos de células; Lansdorp et al. (J Exp Med. 1993 Sep 1;178(3):787-91); Szilvassy et al. (Blood. 2001 Oct 1 ;98(7):2108-15); Frassoni et al. (Blood. 2003 Aug 1; 102(3): 1138-41); Liang et al. (Blood. 2005 Aug 15; 106(4): 1479­ 87); Six et al. (J Exp Med. 2007 Dec 24;204(13):3085-93)).

Las proteínas Notch son receptores transmembrana que regulan la respuesta celular a un gran número de señales ambientales. En los mamíferos, se han descrito 4 receptores Notch (Notch 1-4) y cinco ligandos (Tipo Delta-1, 3 y 4, jagged1, jagged2) (Weinmaster Curr Opin Genet Dev. 2000;10:363-369).

Los ligandos de Notch tienen varios nombres. Por lo tanto, el ligando 4 del ligando similar a Delta se puede denominar como:

- Ligando tipo Delta 4 (correspondiente al nombre del gen DLL4)

- o por simplificación Tipo Delta-4 o ligando Delta 4 (abreviatura DL-4).

En la presente solicitud, los ligandos de Notch Tipo Delta-1 y Tipo Delta-4 pueden designarse, respectivamente, por DL1 y DL4 o por DL-1 y DL-4. Las secuencias de los ligandos d L-1 y DL-4 se especifican como SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 2, respectivamente.

Se ha demostrado que la interacción de Notch-1 con los ligandos DL-1 o DL-4 desempeña un papel importante en la linfopoyesis T temprana.

Así, varios grupos de investigación han conseguido inducir la diferenciación T murina y humana in vitro por cocultivo de progenitores hematopoyéticos, por ejemplo, con células estromales OP9 o Tst-4 transducidas con el ligando DL-1 0 el ligando DL-4. Por lo tanto, se ha demostrado que los precursores así generados permiten la producción de linfocitos T maduros después del trasplante en ratones inmunodeficientes irradiados (ver en particular Zakrzewski et al., Nat Med 2006 12(9): 1039 et Nat Biotech 200826(4): 453; Awongetal., Blood 2009 114 (5) :972; Meeketal., Blood 2010. 115:261-264).

Sin embargo, el uso de un estroma murino modificado genéticamente no puede contemplarse en un contexto clínico.

El objetivo es desarrollar un procedimiento que permita generar y aumentar el número de precursores de linfocitos T CD7+, a partir de células madre hematopoyéticas CD34+ sin utilizar estroma celular. Preferiblemente, las células madre hematopoyéticas se han aislado de un donante adulto.

Con la esperanza de reemplazar el estroma OP9/DL1 con un sistema clínicamente más aceptable, los inventores probaron diferentes ligandos de Notch solubles y demostraron que una forma soluble del ligando DL-4, fusionada con un fragmento Fc de una inmunoglobulina (DL4/Fc), permitió generar células CD7 a partir de progenitores CD34+ de sangre de cordón umbilical (Reimann et al., Stem Cells 2012; 30:1771-1780).

Este trabajo ha demostrado que 7 días de exposición al ligando DL4/Fc permiten obtener un gran número de progenitores T, CD7+CD34+/-. El análisis cuantitativo por Taqman-PCR de las poblaciones generadas para la expresión de los genes diana de Notch y de los genes implicados en la diferenciación de las células T, mostró que los cambios fenotípicos correspondían a un compromiso en la vía de diferenciación linfoide T, en particular con un aumento de pTa, Rag1, IL7Ra y BCL11b, y una disminución de la expresión de factores de transcripción implicados en las vías de diferenciación mieloide y linfoide B (en particular Pax5). Por lo tanto, las poblaciones generadas en DL4/Fc correspondían fenotípica y molecularmente a las poblaciones encontradas en el timo humano.

Este trabajo también mostró la ausencia de reordenamientos de los loci del receptor de células T. Se evaluó el potencial linfoide T de los progenitores generados en cultivo in vitro e in vivo. In vitro, la cuantificación del potencial linfoide T en condición de diluciones limitantes en cultivos secundarios en el estroma OP9 que expresa el ligando DL-1 demostró un aumento de más de 200 veces en comparación con las HPSC CD34+ no cultivadas. In vivo, este potencial se determinó inyectando estas células en ratones NOD/SCID/yc-/- irradiados de 4 semanas de edad o recién nacidos. Se encontró timopoyesis activa en 20/22 ratones que recibieron células cultivadas en DL4/Fc, en comparación con 13/19 ratones que recibieron células CD34+ sin cultivar. Se detectaron linfocitos T maduros solo en receptores de células cultivadas en DL4/Fc. Los estudios de repertorio y las pruebas funcionales demostraron que los linfocitos T generados a partir de precursores T de DL4/Fc exhibían un repertorio policlonal y eran funcionales.

Estos resultados muestran que la exposición de células CD34+ de sangre de cordón umbilical a DL4/Fc permite la inducción del desarrollo linfoide T y la generación de un gran número de precursores T in vitro. Además, los precursores generados promueven la timopoyesis humana in vivo después del trasplante de ratones inmunodeficientes irradiados. Por lo tanto, mientras que las publicaciones anteriores informaron solo de timopoyesis activa, las células T humanas maduras circulan periféricamente en estos ratones muy temprano después del trasplante.

Sin embargo, este sistema presenta una serie de limitaciones:

1) Desde un punto de vista cuantitativo, el sistema DL4/Fc permite obtener aproximadamente 6,5*102 *5 progenitores T a partir de 106 CD34+ de sangre de cordón. Es posible que este número no sea suficiente para un adulto que recibe un trasplante de sangre del cordón umbilical.

2) La molécula DL4/Fc se inmoviliza sobre el plástico de las placas de cultivo. Esta etapa de inmovilización es importante para permitir la participación de las HPSC en la vía linfoide T. Pero este sistema presenta tres límites, en términos de:

- eficiencia de inmovilización

- vida media de la molécula inmovilizada

- unión de DL4/Fc a su receptor Notch en la superficie de HSPC CD34+

Delaney et al. (Nat Med. 2010 February; 16(2): 232) han descrito cultivos de células madre de sangre de cordón umbilical en presencia de un ligando de Notch (DL-1). El objetivo era acelerar la reconstitución hematopoyética después del trasplante. Cabe señalar, sin embargo, que los autores hablan de aumentar el número de “progenitores” y que este término en realidad refleja células madre y progenitores hematopoyéticos multipotentes, especialmente mieloides. Las células se cultivaron durante 17-21 días.

Ohishi et al. (J Clin Invest. 2002 octubre; 110 (8): 1165-74), citado en Delaney et al. también describen un cultivo de células madre derivadas de la sangre del cordón umbilical in vitro para aumentar la capacidad de repoblación del timo y la médula ósea durante un trasplante. Las células también se cultivan durante 17 o 18 días.

Sin embargo, estos autores no describen el uso de células madre de donantes adultos, ni el hecho de cultivar estas células para utilizarlas en la reconstitución de una población de precursores de linfocitos T que permita brindar una protección inmunológica a un receptor, en las semanas después de un trasplante de médula ósea.

Kim y Roy (2009, In: “Biological interactions on materials surfaces”, 2009, Puleo and Bizios, pages 157-171) analizan el uso de biomateriales con ligandos inmovilizados para controlar y orientar la diferenciación de células madre. El cultivo de células madre hematopoyéticas en presencia de microesferas que presentan el ligando Tipo Delta-4 de Notch ayuda a su diferenciación en linfocitos T. La fibronectina inmovilizada sobre el soporte celular mejora la expansión de las células madre. Se obtienen resultados similares con péptidos inmovilizados que comprenden, por ejemplo, los motivos RGDS y CS-1.

El documento WO 2011/068962 describe procedimientos para diferenciar linfocitos T o NK in vitro a partir de células madre hematopoyéticas o células precursoras. La primera etapa en el procedimiento de diferenciación de linfocitos T permite la producción de progenitores de linfocitos T cultivando las células madre en una capa de células alimentadoras OP-9 transformadas que expresan el ligando DL1 de Notch. El primer ejemplo ilustra la generación de progenitores de linfocitos T a partir de células madre murinas de médula ósea.

El documento WO 2014/110353 se refiere a composiciones que comprenden un ligando de Notch osteoinductivo unido a al menos un sustrato biocompatible. También se refiere a procedimientos de tratamiento de pacientes que necesitan una formación de tejido óseo mediante la administración de una composición que comprende un ligando de Notch osteoinductivo unido a al menos un sustrato biocompatible.

Huijskens et al. (2014, Journal of Leukocyte Biology, 96(6) :1165-75) divulgan un procedimiento para obtener células CD7+ a partir de células CD34+ de sangre de cordón umbilical en 3 semanas, cultivadas sin un sistema alimentador, en presencia de ligando de Notch DLL4:Fc y Retronectin® inmovilizados en la placa de cultivo.

Por lo tanto, es necesario desarrollar un nuevo método para mejorar la cantidad de precursores de linfocitos T generados a partir de células CD34+. Además, este método también debería hacer posible la obtención de precursores de linfocitos T, incluso a partir de HSPC CD34+ transducidas, que se pueden aplicar a células CD34+ adultas para trasplantes alogénicos o autoinjertos, lo que permitiría superar el número relativamente alto de células de sangre del cordón umbilical.

Los inventores han demostrado que es posible mejorar la cantidad de precursores de células T a partir de células CD34+ exponiendo dichas células CD34+ a un ligando de Notch inmovilizado sobre un soporte, en presencia de un fragmento de fibronectina, que contiene un motivo RDGS (SEQ ID NO. 3, Arginina - Glicina - Aspartato - Serina), y/o un motivo CS-1 y opcionalmente un dominio de unión a heparina. Preferiblemente, dicho fragmento de fibronectina contiene un motivo RDGS, un motivo CS-1 y un dominio de unión a heparina.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a un proceso in vitro para generar progenitores de células T, que comprende la etapa de exponer células CD34+ en un medio en presencia de un ligando de Notch, inmovilizado sobre un soporte, siendo dicho ligando de Notch el dominio soluble del ligando Tipo Delta-4, fusionado a una región Fc de una proteína IgG, y en presencia de un fragmento de una fibronectina, comprendiendo dicho fragmento los motivos RGDS, CS-1 y un dominio de unión a heparina, en el que el tiempo de exposición de las células CD34+ a dicho ligando de Notch en presencia de dicho fragmento de una fibronectina es inferior a 10 días, preferiblemente está comprendido entre 3 y 8 días.

Esta exposición conjunta de las células CD34+ al ligando de Notch y a este fragmento de fibronectina permite también inducir la diferenciación de las células CD34+ transducidas hacia la vía linfoide T, lo que permite utilizar el procedimiento para injertos en terapia génica.

Se cree que el efecto observado se debe a la presencia del motivo RGDS y/o el motivo CS-1 en el fragmento de fibronectina. Por lo tanto, los procesos y métodos descritos a continuación también son aplicables usando un péptido RGDS y/o un péptido CS-1 en lugar del fragmento de fibronectina. Sin embargo, se prefiere un uso conjunto de los péptidos RGDS y CS-1, en particular dentro de la misma proteína.

Si se utiliza un péptido RGDS y/o un péptido CS-1, pueden estar presentes como tales dentro del medio de cultivo, o presentes dentro de un péptido o una proteína presente en dicho medio. Cuando el medio de cultivo contenga únicamente el péptido RGDS y/o el motivo CS-1 como tal, se hablará de péptido “ libre” en dicho medio si este péptido no está inmovilizado en la pared inferior del recipiente. En efecto, el péptido puede estar presente en solución, o inmovilizado sobre la pared inferior del recipiente en el que se realiza la exposición de las células CD34+ al ligando de Notch.

En la realización preferida, la invención se refiere a un método (o procedimiento) para generar progenitores de células T, que comprende la etapa de exponer células CD34+ en un medio en presencia de un ligando de Notch, en presencia de un fragmento de fibronectina. El ligando de Notch se inmoviliza sobre un soporte. El fragmento de fibronectina contiene un motivo RDGS, un motivo CS-1 y un dominio de unión a heparina.

El proceso así descrito se lleva a cabo in vitro, en un recipiente (como una placa de cultivo celular (placa de Petri, placa de 24 pocillos, etc.)) en cuya pared inferior se inmoviliza el ligando de Notch. El ligando de Notch también se puede inmovilizar sobre cualquier otro soporte presente en el medio de reacción, en particular sobre la superficie de las microperlas. La inmovilización del ligando de Notch pretende esencialmente estabilizar el ligando para permitir la activación del receptor de Notch.

Por “progenitor de células T”, se entiende cualquier célula involucrada en la vía de diferenciación hacia la vía linfoide T a partir de una HSPC CD34+. Por lo tanto, esta célula se caracteriza por expresar el marcador CD7, que se sabe que es uno de los marcadores de aparición más temprana durante la linfopoyesis de células T. Dependiendo del estado de diferenciación en la vía linfoide T, puede expresar o no el marcador CD34 (pérdida de c D34 durante la diferenciación).

Entre los ejemplos de “progenitores de células T”, se mencionan las células que se pueden encontrar en el timo posnatal, es decir, células tímicas progenitoras tempranas (early thymic progenitor, ETP) (CD34+/CD45RA+/CD7+), células proT1 (CD34+CD45RA+CD7++CD5-CD1a-),células proT2 (CD34+CD45RA+CD7++CD5+CD1a-) y células preT (CD34-CD7++/CD5+CD1a+). Estas células son bien conocidas en el estado de la técnica. Son mencionadas en particular por Reimann et al. (2012, Op. cita.), y por Awong et al. (2009, op.cit).

Por péptido RGDS, se entiende cualquier péptido o cualquier proteína que contenga el motivo RGDS, de modo que pueda unirse a la integrina VLA-5 (véase más adelante). Dicho péptido o proteína se puede ensayar en cuanto a su capacidad para suprimir la interacción de la fibronectina con esta integrina VLA-5, mediante métodos ampliamente documentados en la técnica.

El péptido RGDS se une a la integrina VLA-5 (Very Late Antigen-5), que es un dímero compuesto por CD49e (alfa5) y CD29 (beta1).

Los dominios de unión a heparina se conocen en la técnica y están presentes en muchas proteínas de unión a heparina. Por lo general, vienen en forma de XBBXBX y XBBBXXBX (B = aminoácido básico; X = aminoácido hidropático; Cardin y Weintraub, Arterioscler Thromb Vase Biol. 1989;9:21-32, SEQ ID NO. 4 y SEQ ID NO. 5).

La presencia de tal dominio de unión a heparina es particularmente ventajosa cuando las células CD34+ también se exponen a un vector retroviral con el fin de transducirlas, para obtener progenitores de células T que expresen un transgén.

Un péptido CS-1 o motivo CS-1 es un péptido de 25 aminoácidos (DELPQLVTLPHPNLHGPEILDVPST, SEQ ID NO.

6), que fue descrito por Wayner et al., 1989, J. Cell Biol. 109: 1321). Este motivo CS-1 se une al receptor VLA-4 (Very Late Antigen-4). Este antígeno es una integrina dimérica, compuesta por CD49d (alfa 4) y CD29 (beta 1).

En una realización particular, el fragmento de fibronectina está presente en el medio de cultivo o inmovilizado en la pared inferior del recipiente. La fibronectina es una proteína que, en su forma natural, es un dímero grande en forma de v de 100 nm de largo y 460 kDa. Los dos monómeros están unidos por dos puentes disulfuro en su extremo C-terminal. Por “fibronectina”, se entiende la proteína fibronectina natural (es decir, cualquier isoforma producida por empalme alternativo), pero también un monómero de esta proteína, o un fragmento de esta proteína (pero que contiene el péptido RGDS, así como el péptido CS-1 y el sitio de unión a heparina).

Una fibronectina particularmente adecuada para implementar el procedimiento así descrito es Retronectin®. Esta proteína corresponde a un fragmento de una fibronectina humana (fragmento CH-296; Kimizuka et al., J Biochem.

1991 Aug;110(2):284-91; Chono et al., J Biochem. 2001 Sep; 130(3):331-4) y contiene los tres dominios funcionales preferidos en el contexto de la implementación del procedimiento (el dominio C de unión celular que contiene el péptido RGDS, el dominio de unión a heparina y la secuencia CS-1). Esta proteína ya se utiliza para mejorar la transducción mediante vectores retrovirales (Chono et al., op cit), al permitir la colocalización de células diana (que se unen a las integrinas VLA-4 y VLA-5) y viriones (que se unen al dominio de unión a heparina). Esta proteína es comercializada en particular por la empresa Takara Bio Inc. (Shiga, Japón).

Es sorprendente e inesperado que esta proteína también pueda mejorar la diferenciación de células CD34+ en progenitores de células T, incluso cuando se desea obtener dichos progenitores para células transducidas por un vector viral, en el contexto de la terapia génica, así como para células adultas.

Como se discutió con anterioridad, pero sin querer limitarse a esta teoría, esta mejora en la diferenciación de las células CD34+ probablemente esté relacionada con la presencia del motivo RGDS que se une a la integrina VLA-5, presente en las células y/o del motivo CS-1 que se une al receptor VLA-4.

En una realización particular, el fragmento de fibronectina está inmovilizado (es decir, está unido a un soporte sólido y no está presente libremente en solución (aunque es posible que ciertos elementos se puedan encontrar allí si se desprenden del soporte). Este soporte sólido es preferiblemente la pared inferior del recipiente en el que se implementa el procedimiento. Sin embargo, también se puede considerar la unión del fragmento de fibronectina a perlas, tales como perlas poliméricas o perlas magnéticas (de un diámetro generalmente comprendido entre 1 pm y 5 pm). La unión de la proteína o del péptido a estas perlas puede ser covalente o no. Los métodos para unir una proteína o un péptido a una perla son bien conocidos en la técnica. También es posible introducir este fragmento de fibronectina en un medio semisólido, como un agar o un gel.

Cuando el fragmento de fibronectina está inmovilizado sobre el soporte (en particular, la pared inferior del recipiente en el que se implementa el procedimiento), esta inmovilización también puede ser covalente o no. En una realización preferida, esta inmovilización se realiza de manera no covalente dejando absorber el fragmento de fibronectina sobre el vidrio o el plástico que forma la pared inferior del recipiente.

En una realización particular, como se ha visto con anterioridad, se efectúa tanto la diferenciación de células CD34+ en progenitores de células T, como la transducción de dichas células CD34+ utilizando un vector viral para introducir un gen de interés en estas células. Esto significa que las células expuestas al ligando de Notch y al fragmento de fibronectina también están expuestas al sobrenadante viral, durante al menos parte de su tiempo de exposición al ligando de Notch y al fragmento de fibronectina.

De hecho, los inventores pudieron demostrar que, cuando las células previamente transducidas se exponen al ligando de Notch (en particular, DL-4), la producción de linfocitos T in vivo es más lenta que cuando la transducción se realiza al mismo tiempo que la exposición a DL-4. Por lo tanto, la exposición conjunta permite así acelerar la producción de células T in vivo (después del trasplante).

Una segunda ventaja de esta exposición conjunta de las células al sobrenadante viral y al ligando de Notch (en particular DL-4) es acortar el período de cultivo (7 días en lugar de 11 días).

Cabe señalar que una exposición conjunta de las células al sobrenadante viral y al ligando de Notch (en particular DL-4) sin la presencia del fragmento de fibronectina también permite acelerar la producción de progenitores de células T.

Por lo tanto, en una realización preferida, las células se exponen primero al ligando de Notch y al fragmento de fibronectina durante cierto tiempo (preferiblemente más de 4 horas, más preferiblemente, más de 6 horas, o incluso más de 8 horas o más de 10 horas, pero preferiblemente menos de 36 horas, más preferiblemente, menos de 30 h, más preferiblemente, menos de 24 h), en presencia de citoquinas, lo que permite que las células entren en el ciclo de división (preactivación), luego se agrega el sobrenadante viral por un tiempo determinado (preferiblemente mayor de 4 horas, más preferiblemente mayor de 6 horas, o incluso mayor de 8 horas o mayor de 10 horas, pero preferiblemente menor de 30 horas, más preferiblemente, menor de 24 h, más preferiblemente, menor de 16 h en promedio).

Si se observa que el número de células transducidas es insuficiente, se puede realizar una segunda transducción, exponiendo nuevamente las células al vector viral según las modalidades descritas con anterioridad.

Esta realización se implementa en particular cuando se desea realizar un trasplante autólogo de células madre hematopoyéticas en el marco de un protocolo de terapia génica. Así, el transgén introducido por transducción con el sobrenadante viral pretende expresar una proteína que está ausente o deficiente en el paciente para proporcionarle un beneficio terapéutico. Entre los transgenes que se pueden utilizar (sin que esta lista sea limitativa ni exhaustiva), se pueden mencionar los genes que permiten la terapia de las inmunodeficiencias (en particular las inmunodeficiencias combinadas graves, SCID o no, ClD), del VIH, de la adrenoleucodistrofia ligada a X, hemoglobinopatías, en particular p-talasemia o anemia de células falciformes. Las inmunodeficiencias innatas o adquiridas, como el sida, debido al VIH son, por lo tanto, enfermedades que pueden ser objeto de estrategias de terapia génica.

La transducción se realiza preferiblemente con un sobrenadante retroviral que permite la inserción del transgén en el genoma de la célula. Los vectores, en particular los vectores lentivirales, presentes en dicho sobrenadante, son particularmente adecuados para este tipo de aplicación y han sido ampliamente descritos en la literatura.

Así, el medio también puede contener un vector viral destinado a la transducción de dichas células CD34+, en la implementación del procedimiento aquí descrito. En una realización particular, este vector viral se introduce tras un período de preactivación de las células en el medio (cultivo en presencia de citoquinas que permite a las células entrar en el ciclo de división), comprendido entre 4 h y 36 h, preferiblemente entre 6 h y 24 horas. El vector viral se mantiene en el medio en contacto con las células durante un período de entre 4 h y 30 h, preferiblemente entre 12 h y 24 h, más preferiblemente, durante aproximadamente 16 h, luego se retira del medio. Para “retirar” el vector viral del medio, las células se recogen, se lavan y se vuelven a poner en cultivo en presencia del ligando de Notch y el fragmento de fibronectina.

En una realización particular, dicho ligando de Notch es la proteína Tipo Delta-1 (SEQ ID NO. 1) o un fragmento (dominio soluble).

En otra realización, el ligando de Notch es la proteína Tipo Delta-4 (SEQ ID NO: 2).

En una realización particular, dicho ligando de Notch es una proteína de fusión que comprende el dominio soluble de un ligando de Notch natural, fusionado a una región Fc de una proteína IgG. El dominio soluble de un ligando de Notch representa la parte extracelular de dicho ligando. Ella es bien conocida. Así, Varnum-Finney et al. (J Cell Sci. 2000 Dec;113 Pt 23:4313-8) describieron una proteína de fusión de la parte soluble de DL-1 con una porción Fc de una IGg1. Reimann et al. (op. cit) describieron una proteína de fusión de la parte soluble de DL-4 (aminoácidos 1-526) con el fragmento Fc de una inmunoglobulina IgG2b. Por lo tanto, se prefiere que la proteína IgG sea una IgG2.

El medio de cultivo utilizado en el contexto del presente procedimiento es cualquier medio capaz de cultivar células CD34+ y células T. Se pueden citar en particular a-MEM, Dm EM, RPMI 1640, Im Dm , BME, 5A de McCoy, StemSpan™ (Stem Technologies) o medio de Fischer. Un medio de cultivo perfectamente adecuado y preferido para implementar el procedimiento aquí descrito es el medio X-VIVO™ 20 (Lonza, Basilea, Suiza). Este medio ha sido utilizado en particular por Jonuleit et al. (Eur J Immunol, 1997, 27, 12, 3135-42) y Luft et al. (J Immunol, 1998, 161, 4, 1947-53).

Preferiblemente se utiliza un medio basal (es decir, que permita el crecimiento celular sin necesidad de añadir suplementos) que, sin embargo, se suplementará con suero, así como con factores de crecimiento y citoquinas.

Por lo tanto, al medio de cultivo basal, se le añade preferiblemente suero bovino fetal (FBS) o suero bovino fetal (FCS), suero humano autólogo o suero humano AB. Preferiblemente, este medio se complementa con al menos un 15 % de suero fetal, más preferiblemente, al menos un 20 %. El FBS es particularmente adecuado para la implementación de este procedimiento. En particular, se prefiere usar FBS definido. El FBS definido es un suero de alta calidad que ha sido analizado y filtrado para evitar la presencia de partículas virales. Muchos proveedores lo venden como tal, como el HyClone™ Defined Fetal Bovine Serum (FBS) de Thermo Scientific™.

El medio de cultivo también se complementa preferiblemente con citoquinas y factores de crecimiento. Estas citoquinas y factores de crecimiento se seleccionan en particular del grupo que consiste en SCF (Factor de Células Madre), Trombopoyetina (TPO, también llamado factor de crecimiento y desarrollo de megacariocitos, MGDF), ligando Flt3 (que es un factor de crecimiento hematopoyético), interleuquina 3 (IL-3), interleuquina 7 (IL-7) y SCF (factor de células madre). En una realización particular, el medio de cultivo contiene al menos tres, preferiblemente al menos cuatro de estas citoquinas o factores de crecimiento.

En una realización preferida, y en particular para la generación de precursores de linfocitos T no transducidos por un vector viral, se añaden al menos o exactamente tres citoquinas.

Preferiblemente, estas tres citoquinas son interleuquina-7 (IL-7), SCF (factor de células madre) y ligando Flt-3 (factor de crecimiento hematopoyético).

En otra realización preferida, se añaden cuatro citoquinas, es decir, las tres citoquinas mencionadas con anterioridad y TPO (trombopoyetina).

En otra realización particular, y en especial para la generación de precursores de linfocitos T transducidos por un vector viral, la naturaleza de las citoquinas y factores de crecimiento puede variar durante la implementación del procedimiento.

Por lo tanto, IL-3, IL-7, SCF, TPO y Flt3-L se pueden usar en el medio, si la etapa de preactivación celular se lleva a cabo antes de agregar el vector viral, luego complementar el medio solo con IL-7, SCF, TPO y Flt3-L, después de eliminar el vector.

Las mezclas de citoquinas y factor de crecimiento mencionadas con anterioridad son suficientes para inducir la diferenciación de células CD34+ en precursores de linfocitos T y, generalmente, el medio de cultivo no contiene ninguna otra citoquina o factor de crecimiento.

En el contexto del procedimiento, la duración total de la exposición de las células CD34+ en presencia del ligando de Notch y de la proteína o del péptido que presenta el motivo RGDS se realiza generalmente durante una duración preferiblemente superior a 3 días e inferior a 10 días.

Esta exposición puede variar dependiendo de si las células se transducen o no. Así, un período de exposición de tres días puede ser suficiente para las células madre adultas no transducidas, mientras que generalmente será más largo en el caso de transducción o de células infantiles (aproximadamente 7 días).

Las células CD34+ se obtienen de una muestra de sangre de un donante, de una punción de médula ósea o de sangre de cordón umbilical. Los métodos para clasificar las células CD34+ son conocidos en la técnica. En particular, es posible utilizar perlas magnéticas que tengan un anticuerpo que reconozca CD34+ en su superficie para hacer esto.

Preferiblemente, el recipiente de cultivo celular se prepara inmovilizando el ligando de Notch y el fragmento de fibronectina en la superficie inferior, antes de exponer las células CD34+.

La Retronectin® u otra fibronectina se adhiere naturalmente al plástico de la placa de cultivo celular (placa de Petri o placa de 24 pocillos, u otra).

De manera similar, si se usa un ligando de Notch como proteína de fusión con el fragmento Fc de una inmunoglobulina, este fragmento Fc también se adhiere al plástico.

Por lo tanto, es suficiente dejar el recipiente en presencia de estos compuestos durante algunas horas para obtener el recubrimiento adecuado.

En particular, se puede usar el siguiente protocolo para recubrir la superficie inferior con ligando de Notch fusionado con un fragmento Fc y Retronectin®:

- preparar una solución que contenga ligando de Notch (5 pg/ml) y Retronectin® (25 a 50 pg/ml) en PBS (solución salina tamponada con fosfato). Sin embargo, también se pueden utilizar cantidades de Retronectin® tan bajas como 10-15 pg/ml sin disminuir los resultados;

- recubrir los pocillos de una placa de cultivo celular con esta solución: 0,5 ml para una placa de 24 pocillos; 1,0 ml para una placa de 6 pocillos;

- dejar reposar las proteínas durante 24 horas a 4 °C (o incluso de 48 a 72 horas), o durante unas 2 horas a 37 °C; - lavar con PBS (a temperatura de trabajo);

- utilizar un agente bloqueante (PBS 2 % de BSA (albúmina de suero bovino o humano) o HA (hemaglutinina humana) (0,5 ml para placas de 24 pocillos; 2 ml para placas de 6 pocillos) durante 1 hora a 37 ° C;

- lavar con PBS a 37 °C.

Está claro que el desarrollo de otras concentraciones u otras condiciones de recubrimiento es rutinario para el experto en la técnica, si utiliza otras proteínas u otros recipientes de cultivo celular (frascos, bolsillos, etc.).

En particular, los inventores han demostrado que, a una concentración de 5 pg/ml, aproximadamente el 75 % de DL-4 se une a la superficie del recipiente. Se han ensayado diferentes dosis de DL-4 y es preferible que la concentración sea mayor o igual a 1,25 pg/ml, estando comprendida una concentración óptima entre 2,5 y 5 pg/ml.

Acerca de la Retronectin®, la concentración de 25 pg/ml es perfectamente adecuada, aunque también pueden ser adecuadas otras concentraciones (superiores o inferiores).

Por lo tanto, la presente divulgación también se refiere a un recipiente de cultivo celular, caracterizado porque al menos una de sus superficies está cubierta con un ligando de Notch y con una proteína o péptido que tiene el motivo RGDS y/o CS-1, y en particular un fragmento de fibronectina como se describió con anterioridad.

El ligando de Notch puede ser la parte soluble del ligando de Notch natural (en particular DL-1 o DL-4) y estar fusionado con un fragmento Fc de una inmunoglobulina (tal como una IgG1 o una IgG2).

Por ejemplo, se trata de DL-4. El fragmento Fc se puede derivar de una IgG2. El ligando de Notch inmovilizado en la superficie de la placa de cultivo (y utilizado en el contexto del procedimiento descrito con anterioridad) puede tener la secuencia SEQ ID NO. 7.

La proteína que presenta el motivo RGDS puede ser como se describió con anterioridad. Se trata preferiblemente de una fibronectina y en particular de Retronectin®.

Así, la placa de cultivo celular puede presentar al menos una superficie que ha sido recubierta con una proteína de fusión DL-4/fragmento Fc de una IgG2 y de Retronectin®.

Las concentraciones son las mencionadas con anterioridad, y el recipiente se obtuvo, en particular por el método descrito con anterioridad, es decir, una etapa de adición de una solución que contiene el ligando de Notch, la proteína o el péptido que presenta el motivo RGDS y/o CS-1, en particular el fragmento de fibronectina en dicho recipiente, una etapa de reposo que permite que las proteínas se asienten y se adhieran a las paredes del recipiente, seguido de etapas de enjuague y preferiblemente de bloqueo de las paredes del recipiente con una proteína no reactiva (como la albúmina sérica).

En la implementación del procedimiento descrito con anterioridad, las células se agregan a una concentración comprendida entre 106 y 107 células CD34+/ml, en particular del orden de 2x106 células CD34+/ml en el recipiente de cultivo. Dependiendo de la cantidad de CD34+ por transducir, se puede utilizar una placa de 2 x 10 cm2 (respectivamente, una placa que va de 24 pocillos a 6 pocillos). Preferiblemente, cuando se utiliza una placa de 24 pocillos, cada pocillo se inocula con entre 105 y 106 células CD34+ por pocillo, preferiblemente alrededor de 2,105 a 4,105 células CD34+ por pocilio. En el caso de una placa de cultivo de 6 pocilios, se prefiere utilizar entre 8,105 y 2,106 células por pocillo.

La cantidad de células por inocular puede ser fácilmente adaptada por un experto en la técnica según el recipiente que utilice.

Las células se colocan en el pocillo en el medio basal elegido, preferiblemente suplementado con citoquinas o factores de crecimiento, como se vio con anterioridad.

Las concentraciones de estas citoquinas o factores de crecimiento están comprendidas entre 2 y 300 ng/ml.

Preferiblemente, las citoquinas se añaden a una concentración generalmente superior a 40 ng/l e inferior a 300 ng/ml o 200 ng/l, más preferiblemente, a una concentración del orden de 100 ng/ml.

Sin embargo, cuando se desea generar progenitores de células T transducidas y cuando las células se preactivan antes de ponerlas en presencia del vector viral, se pueden utilizar concentraciones más altas (del orden de 300-400 ng/ml). En esta realización, es posible utilizar SCF y Flt3-L a concentraciones del orden de 300 ng/ml, TPO e IL-7, a concentraciones del orden de 100 ng/ml, y la IL-3, a aproximadamente 40 ng/ml.

En una realización preferida, la duración de la exposición de las células al ligando de Notch y al fragmento de fibronectina es preferiblemente superior o igual a 3, o incluso superior o igual a 5 días. Generalmente es inferior a 10 días, o incluso inferior a 8 días. Una duración ventajosa está comprendida preferiblemente entre 5 y 8 días, es decir, aproximadamente 7 días. Si se desea superar los 7 días de cultivo, es preferible transferir las células a nuevos recipientes recubiertos con el ligando de Notch y el fragmento de fibronectina. Esta duración depende en particular del origen de las células CD34+. Por lo tanto, el tiempo de exposición puede ser más corto para las células CD34+ obtenidas de un adulto que para las células obtenidas de un niño o de la sangre del cordón umbilical. Esto es particularmente sorprendente, en vista de la técnica anterior y la capacidad a priori de menor diferenciación de células madre adultas. Las células transducidas generalmente se exponen durante más tiempo que las células no transducidas.

Después de haber generado los progenitores de células T, por el procedimiento descrito con anterioridad, es posible purificar estos progenitores de células T así generados. Esta purificación se realiza lavando las células y suspendiéndolas en un medio basal adecuado.

Estos progenitores de células T también se pueden empaquetar en una bolsa para que se puedan inyectar en un paciente. En este caso, estas células se reacondicionan en una solución salina que contiene un 5 % de HSA como albunorm™ 5% 50 g/L (Octopharma, Lingolsheim, Francia).

Estas células también pueden congelarse según métodos conocidos en la técnica.

La presente divulgación también describe progenitores de células T para su uso en un paciente inmunodeprimido, en particular para permitir la reconstitución inmune en este paciente y/u obtener protección inmune contra infecciones en dicho paciente durante un período del orden de algunos meses (alrededor de al menos dos meses, preferiblemente alrededor de al menos seis meses). El paciente puede ser un paciente inmunodeprimido. Las razones de la deficiencia pueden ser múltiples: inmunodeficiencia hereditaria, quimioterapia para la leucemia, acondicionamiento, injerto que contiene solo células madre, tratamiento postrasplante en la profilaxis de la GVH (reacción de injerto contra huésped), edad del receptor y complicaciones de tipo infecciones. En particular, puede estar inmunodeprimido debido al agotamiento de sus células inmunitarias después de la terapia antes del trasplante de médula ósea. El injerto puede ser un aloinjerto (en este caso, los progenitores de células T se derivan preferiblemente de un donante HLA parcialmente compatible con el paciente) o un autoinjerto (en cuyo caso los progenitores de células T se han transformado preferiblemente mediante un vector para expresar un gen y/o una proteína que permita corregir un defecto genético en dicho paciente).

Los progenitores de células T pueden haberse obtenido exponiendo células CD34+ en presencia de un ligando de Notch (como se describió con anterioridad) y una proteína o péptido que presenta el motivo RGDS y/o el motivo CS1, en particular un fragmento de fibronectina como se describió con anterioridad, en las condiciones antes mencionadas. La exposición puede ser menor o igual a 10 días.

Los progenitores de células T previstos presentan en particular el marcador CD7 y pueden o no expresar el marcador CD34.

La presente divulgación también describe un método para tratar a un paciente inmunodeprimido, en particular con vistas a permitir una reconstitución inmune, al menos temporalmente, en este paciente, que comprende la etapa de administrar a dicho paciente progenitores de células T, tal como se describió con anterioridad. Este método también puede incluir la etapa de obtención de dichos progenitores mediante la exposición de células CD34+ a un ligando de Notch (como se describió con anterioridad) y una proteína o un péptido que presenta el motivo RGDS y/o el motivo CS1, en particular un fragmento de fibronectina como se describió con anterioridad en las condiciones antes mencionadas. En particular, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz, es decir, del orden de 1 a 5x106/kg de progenitores, lo que permite proporcionar al paciente células capaces de desempeñar un papel protector frente a infecciones durante algunos meses (en el orden de los 6 meses).

Esta administración de progenitores de células T se realiza justo antes, justo después o concomitantemente con un trasplante de células madre hematopoyéticas en dicho paciente. Como se ha visto con anterioridad, las células inyectadas pueden ser transformadas por un vector destinado a permitir la corrección de un defecto genético en dicho paciente.

Descripción de las figuras

Figura 1: comparación del número y porcentaje de células CD7+CD34+/- obtenidas tras cultivo de células CD34+ en ausencia (-RN) o presencia (+RN) de Retronectin® (RN). A. Análisis por citometría de flujo de la expresión de los marcadores CD34, CD7. B. Representación del número de células CD34-CD7+ (para seis experimentos independientes).

Figura 2: comparación de la expresión (en comparación con el control GAPDH (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa)) de genes implicados en la diferenciación de células CD34+ en linfocitos T. A. Genes Tcf-7 (transcription factor 7) y Lef-1 (lymphoid enhancer-binding factor 1). B. Genes Bcl11b (B-cell CLL/lymphoma 11B) y LCK (lymphocyte-specific protein tyrosine kinase).

Figura 3: comparación del porcentaje de células CD7+CD34+/- obtenidas tras cultivo en presencia o ausencia de Retronectin® (análisis por citometría de flujo de la expresión de los marcadores CD34, CD7), obtenidos mediante cultivo de células CD34+ a partir de sangre de donantes movilizados.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Materiales y Métodos

a) Preparación de células CD34+

Las células CD34+ se aíslan mediante separación de células mononucleares en un gradiente de Ficoll y clasificación inmunomagnética, como se describe en la técnica anterior (Six et al., J Exp Med 2007204:3085).

b) Preparación del ligando de Notch soluble

El ligando de Notch soluble es una proteína de fusión generada mediante la clonación de la parte soluble del ligando de Notch y la parte constante de la inmunoglobulina humana, como se describe en Reimann. et al. (2012, sobre. cit.). La secuencia de la proteína de fusión es SEQ ID NO: 7.

c) Preparación de los recipientes

i. Sin Retronectin®

El recipiente está compuesto por un pocillo de cultivo que contiene medio de cultivo, sobre el que se ha inmovilizado el ligando de Notch soluble según la técnica descrita en Reimann. et al. (2012, op. cit.).

ii. Con Retronectin®

La Retronectin® se inmoviliza junto con el ligando de Notch soluble en el pocillo de cultivo. Concentración de Retronectin® es de 25 a 50 pg/ml. Se trabaja a temperatura ambiente o a 4 °C, bajo estaciones de seguridad microbiológica (PSM).

d) Exposición de células CD34+

Las células CD34+ se cultivan en el recipiente a una concentración entre 2 * 104y 1,5 * 105 células/ml. El cultivo dura entre 3 y 10 días, como se describe en Reimann et al. (2012, sobre. cit.).

e) Análisis de células CD34+

El análisis de las células cultivadas incluye: un recuento de las células vivas, un análisis por citometría de flujo de la expresión de los marcadores CD34, CD7 y posiblemente CD5 y CD1a y por un cocultivo secundario en condiciones de dilución limitante en un estroma OP9/DL-1 que permite cuantificar los precursores T generados por el cultivo (Reimann C Stem Cells 2012, 30(8): 1771-80).

Posiblemente se complemente con un análisis del perfil de expresión génica mediante RT-PCR cuantitativa sobre moléculas importantes para el compromiso y la diferenciación de células CD34+ en linfocitos T (TCF7, GATA3, RAG1, IL7R, BCL11B, LEF1, PTCRA).

Ejemplo 2 - Comparación de los resultados obtenidos en presencia o no de Retronectin® en ausencia de transducción celular

1. Resultados obtenidos con células CD34+ de sangre de cordón (6 experimentos)

Se observa un aumento del porcentaje y número de células CD7+CD34/- obtenidas tras cultivo en presencia de Retronectin® (Figura 1).

También se observa un aumento de la frecuencia de precursores T presente en el cultivo en D7 y medida en dilución límite por cocultivo en OP9/DL-1 (Tabla I).

Tabla I

También se puede observar un aumento en la expresión (en comparación con el gen endógeno GAPDH (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa)) de genes implicados en la diferenciación de células CD34+ en linfocitos T (Figura 2).

2. Resultados obtenidos con células CD34+ de sangre de donantes movilizadas

Se observa un aumento del porcentaje de células CD7+CD34/- tras cultivo en presencia de Retronectin® en comparación con lo que se obtiene tras el cultivo en ausencia de Retronectin® (Figura 3).

También se observa un aumento en la frecuencia de precursores de T presentes en el cultivo en J7 y medidos en dilución límite por cocultivo en OP9/DL-1 (Tablas II y III).

Resultados obtenidos de 105 CD34+

Tabla II

Tabla III

3. Conclusión

Estos resultados muestran claramente que la presencia conjunta de Retronectin® y el ligando DL-4 mejora la generación de precursores implicados en la vía de diferenciación linfoide T (progenitores de células T) a partir de células madre CD34+.

Ejemplo 3 - Resultados obtenidos en presencia de Retronectin®, para células transducidas

Las células CD34+ de la médula ósea del paciente se preactivan durante 24 horas a una concentración de 2 * 106 células/en un medio X-VIVO20 que contiene SCF 300 ng/ml, Flt3-L 300 ng/ml, TPO 100 ng/ml, IL-340 ng/ml, IL-7 100 ng/ml y suero al 20 % sobre un sustrato obtenido después de haber recubierto las placas de cultivo con una solución de Retronectin® 50 pg/ml y DL4/Fc 5 pg/ml.

Entre D y D2, las células se someten a transducción utilizando el vector viral en el medio de preactivación enriquecido con sulfato de protamina a 4 pg/ml.

El D3, las células se recogen, se lavan y se vuelven a cultivar hasta D7 en un sustrato de proteína DL4/Fc en un medio suplementado con suero (20 %), SCF (100 ng/ml), Flt3-L (100 ng/ml), TPO (100 ng /ml) e IL-7 (100 ng/ml).

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento in vitro para generar progenitores de células T, que comprende la etapa de exponer células CD34+ en un medio en presencia de un ligando de Notch, inmovilizado sobre un soporte, siendo dicho ligando de Notch el dominio soluble del ligando Tipo Delta 4, fusionado a una región Fc de una proteína IgG, y en presencia de un fragmento de una fibronectina, comprendiendo dicho fragmento los motivos r Gd S, CS-1 y un dominio de unión a heparina, en donde el tiempo de exposición de las células CD34+ a dicho ligando de Notch en presencia de dicho fragmento de una fibronectina es inferior a 10 días, preferiblemente comprendido entre 3 y 8 días.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dichas células CD34+ se aislaron de un paciente adulto.

3. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque la duración de la exposición de las células al ligando de Notch y al fragmento de fibronectina está comprendida entre 3 y 8 días.

4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicha proteína IgG es una IgG2.

5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque dicho fragmento de fibronectina es el fragmento CH-296 de fibronectina humana.

6. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho fragmento de fibronectina se inmoviliza en la superficie inferior del recipiente de cultivo.

7. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dicho medio también contiene un vector viral destinado a la transfección de dichas células CD34+, durante al menos parte del tiempo de exposición de dichas células CD34+ a dicho ligando de Notch y a dicho fragmento de fibronectina.

8. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el medio contiene al menos un 15 % de FBS, preferiblemente al menos un 20 % de FBS.

9. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el medio comprende al menos tres citoquinas o factores de crecimiento seleccionados del grupo que consiste en interleuquina 7 (IL-7), el SCF (factor de células madre), trombopoyetina (TPO) y el ligando Flt3 (FLT3L).

10. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el medio comprende interleuquina 7, SCF, trombopoyetina y ligando Flt3.

11. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque el medio no comprende ninguna otra citoquina o factor de crecimiento.

12. Procedimiento para la preparación de progenitores de células T, que comprende las etapas de llevar a cabo el procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 11, y purificar los progenitores de células T generados.

13. Procedimiento de acuerdo con reivindicación 12, caracterizado porque también comprende una etapa de acondicionamiento de dichos progenitores de células T en una bolsa para inyectar a un paciente.