CN102212517B - 用于鉴定或调控细胞多能性的关键基因、microRNA、其它非编码RNA或其组合 - Google Patents
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及用于鉴定或调控细胞多能性的关键基因、microRNA、其它非编码RNA，或其组合，其特征在于，在具有完全多能性的干细胞中高表达，而在不具备完全多能性的干细胞中的表达显著被抑制或沉默。所述基因、microRNA和其它非编码RNA为定位在小鼠12号染色体长臂的名为Dlk1-Dio3的染色体印记区域的基因、microRNA和其它非编码RNA，及其在其它哺乳动物基因组共线性区域中具有70％-100％同源性的同源基因、microRNA和其它非编码RNA。本发明还涉及本发明的基因、microRNA和其它非编码RNA或其组合在鉴定干细胞多能性及在细胞多能性调控中的用途；在干细胞分型中的用途；在细胞多能性调控，调节细胞的多能性状态和水平中的用途；在疾病治疗中的用途；在肿瘤治疗的药物靶点开发，或抗肿瘤药物研发中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及鉴定或调控细胞多能性的关键基因、microRNA或其它非编码RNA或其组合。本发明还涉及本发明的基因和非编码小RNA在鉴定干细胞多能性及在干细胞分型中的用途；在细胞多能性调控，调节细胞的多能性状态和水平中的用途；在疾病治疗中的用途；在肿瘤治疗的药物靶点开发，或抗肿瘤药物研发中的用途。
背景技术
多能性细胞(pluripotent cells)是指具有经过分裂、分化形成人和动物个体各种组织和细胞的具有多向分化潜能的一类细胞。目前，胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)是最为人们熟知的多能性细胞。胚胎干细胞是由哺乳类动物胚胎发育早期囊胚期内细胞团细胞分离后，经特定条件下体外培养，所获得的特殊细胞系。这类细胞具有保持未分化状态和无限增殖的能力。如今，已经可成功地在体外将胚胎干细胞诱导分化为神经元、肝细胞、内皮细胞、心肌细胞、胰腺β细胞和造血细胞等几乎所有种类的细胞。干细胞与再生医学的发展对发育生物学和组织器官移植、基因治疗、细胞治疗、药物研发等领域起到重要的推动作用，有望解决人类面临的心脑血管疾病、糖尿病、神经系统疾患等医学难题，以此带动的生命科学与生物技术的新突破和发展将带来人口健康与医药领域的革命性变化，并将成为21世纪具有巨大潜力的新兴高科技产业。
传统胚胎干细胞在再生医学应用中有两个不易攻克的瓶颈，首先获取胚胎干细胞的方法需要使用早期胚胎，牵涉到伦理问题，其次是将所得到的胚胎干细胞应用于临床时病人还会面临免疫排斥问题。为了克服免疫排斥的难题，人们首先面临的问题是如何通过各种方法将病人的体细胞重编程为多能性细胞，进而分化为所需类型的细胞用于细胞治疗和器官移植。1997年克隆绵羊″多莉″的诞生证实了卵母细胞具有把分化的哺乳动物成体细胞重编程到胚胎期全能性状态的能力，可以产生多能性干细胞以及发育成新个体。然而卵母细胞的缺少以及胚胎使用涉及的伦理问题限制了这一技术在再生医学领域的发展。2006年Yamanaka首次证实利用四个外源转录因子的强制表达，就能将体细胞重编程为多能性干细胞，即诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS cells)(Takahashiet al.，2007；Takahashi and Yamanaka，2006；Yu et al.，2007)。这一发现使体细胞重编程研究具体到了基因层面，同时还拓展了重编程研究的方向。从技术角度，iPS细胞来自于体细胞而非胚胎，避免了人类胚胎干细胞所面临的伦理争议。细胞重编程的研究已经形成了包括体细胞核移植、iPS技术等手段，包括细胞融合以及小分子化合物诱导等多种研究方法在内的多个重要领域。
多年以来，胚胎干细胞的多能性的鉴定都依赖于动物嵌合实验；但人的嵌合实验由于法律限制及伦理问题是无法开展实施的，因此，人的胚胎干细胞的多能性鉴定缺乏一个真正有力的标准。人们一直试图寻找适宜的标记物来区分干细胞的发育潜能，但迄今为止仍未获成功。
完全重编程的iPS细胞具有真正的多能性，能够分化为所有种类的体细胞，并且能够通过四倍体胚胎补偿的方法生出具有正常繁殖能力的小鼠(Zhao et al.，2009)。然而，通过四倍体胚胎补偿的方式筛选完全重编程的iPS细胞有较高的技术要求，并且成功率非常 低，严重延缓了iPS技术的发展和应用。由于伦理道德的限制，不能用四倍体胚胎补偿的方式来验证人iPS细胞的多能性，这使iPS细胞最终走向临床面临重大障碍。因此，需要一种新的iPS细胞分级标准，来筛选具有真正多能性的iPS细胞。
针对以上问题，本发明首先采用传统的干细胞多能性验证方法，将不同的iPS细胞分为能够通过四倍体胚胎补偿的方法获得动物(以下称为4N iPS细胞)和只能通过二倍体嵌合的方法获得动物(以下称为2N iPS细胞)两类。通过基因芯片和小RNA测序比较这两类iPS细胞的基因和非编码RNA的表达差异，发现了一组在4N iPS细胞中表达较高，而在2N iPS细胞中不表达或表达非常低的基因、microRNA簇和其它非编码RNA。这簇基因、microRNA簇和其它非编码RNA位于12号染色体的一个印记区域内，包含五个编码基因、三个非编码基因，一个C/D box snoRNA基因簇，一个包含多个非常保守的microRNA的microRNA簇，和一些其它非编码RNA。并证明该区域不仅反映了细胞的多能性状态，而且决定了细胞的发育潜能。这一结果已在多种不同来源的细胞系中得到验证。针对该区域的非编码小RNA设计的芯片，可以作为检验多能性细胞发育潜能的鉴定标准。相比传统的四倍体补偿方式来讲，本发明技术要求低，操作周期短，并且不涉及道德伦理因素，在iPS领域有广泛的应用前景。
由于这些基因和非编码小RNA在哺乳动物中非常保守，这一簇基因、microRNA和其它非编码RNA在人类胚胎干细胞和其它哺乳动物中也可能具有同样重要的功能。这一成果第一次明确地提出多能性细胞鉴定的有效标志；并且可能通过对这一簇基因的调控，调整细胞的多能性状态和水平，可能会革命性地改变干细胞和iPS技术，改变国际干细胞研究格局；也可能会在肿瘤等疾病发病机理研究方面获得新的突破；并发现潜在的肿瘤治疗的药物靶点，开发 出抗肿瘤新药。并且，本发明中没有在小鼠染色体上的其它位置筛选出明显区分细胞多能性状态的其它基因簇，很有可能这一印记区域内编码的基因、microRNA簇和其它非编码RNA是决定细胞多能性状态的唯一关键标识，因此意义非常重大。
发明内容
继在国际上首次证明iPS细胞具有全能性之后，发明人首次发现并明确证实决定小鼠细胞多能性的关键基因、microRNA簇及其它非编码RNA。这些基因、microRNA簇及其它非编码RNA位于12号染色体，是一个非常保守的microRNA聚集区，在这一区域内基因和非编码RNA高表达的细胞表现出完全的分化潜能，而在具有部分分化全能性的细胞中这一区域的表达被显著抑制或沉默；该区域不仅反映了细胞的多能性状态，而且决定了细胞的发育潜能。由于该区域编码的microRNA簇仅在哺乳动物基因组中存在，并且非常保守，这一簇microRNA在包括人类胚胎干细胞在内的哺乳动物中也可能具有同样重要的功能。这一成果第一次明确地提出多能性细胞鉴定的有效标志；并且可能通过对这一簇基因的调控，调整细胞的多能性状态和水平，可能会革命性地改变干细胞和iPS技术；可能会在肿瘤等疾病发病机理研究方面获得新的突破；并发现潜在的肿瘤治疗的药物靶点，开发出抗肿瘤新药。
本发明发现用于鉴定或调控细胞多能性的关键基因、microRNA、其它非编码RNA或其组合，在具有完全多能性(fullpluripotency)的干细胞中高表达，在不具备完全多能性的干细胞中的表达被显著抑制或沉默。
本发明包含的基因、microRNA、其它非编码RNA，或其组合，在能够种系嵌合的多能性干细胞中的表达量高于不能种系嵌合的多能性干细胞中的表达量。
本发明包含的基因，microRNA、其它非编码RNA，或其组合，其特征在于，本发明包含的基因、microRNA和其它非编码RNA包括定位在小鼠12号染色体长臂Dlk1-Dio3印记区域(包含Dlk1和Dio3基因以及这段区域到上游Begain基因和下游Ppp2r5c基因间的基因间区)的所有基因、microRNA和其它非编码RNA及其在其它哺乳动物基因组共线性区域中的多核苷酸序列具有70％和70％以上同源性的同源基因、microRNA和其它非编码RNA。Dlk1-Dio3染色体印记区域大约1380kb。本发明包括的基因、microRNA和其它非编码RNA或其组合，其特征在于，本发明包含的microRNA为SEQ ID 1-72所列出的所有microRNA。
本发明包含上述区域在其它哺乳动物基因组共线性区域中的同源基因、microRNA和其它非编码RNA。
本发明包含的基因组区域包括Dlk1、Rtl1、1110006E14Rik、B830012L14Rik和Dio3五个基因，三个非编码基因Meg3、Rian和Mirg，一个C/D box snoRNA基因簇，一个microRNA簇和多个其它非编码RNA。
本发明还涉及本发明包含的基因、microRNA、其它非编码RNA、或其组合在鉴定干细胞多能性或在细胞多能性调控中的用途；在细胞多能性调控，调节细胞的多能性状态和水平中的用途、在干细胞分型中的用途；在疾病治疗中的用途；在研究肿瘤治疗中的药物靶点用途。
本发明包含的microRNA簇在哺乳动物中非常保守。在人类和小鼠中，这一区域印记基因的表达异常会引起一些胚胎和胎盘发育异常。这说明在哺乳动物中，这一簇microRNA的功能是保守的。因此，发明人推测这一簇microRNA在人类胚胎干细胞中也同样具有重要的功能。
到目前为止，人的诱导多能性干细胞(hiPS)的多能性受限以及分化能力不强是目前所面临的一个严重问题(Hu et al.)，而且人胚胎干细胞的多能性仍然无法检测，也缺乏有效的手段区分发育潜能不同的iPS以及胚胎干细胞。由于这一区域microRNA簇的表达对于胚胎发育具有重要的影响，通过对这一区域microRNA的表达情况的检测，就可以对人胚胎干细胞的多能性加以区分，选择这一区域microRNA高表达，也就是多能性较强、具有最高发育潜能级别的多能性细胞进行细胞治疗等应用。不仅如此，由于哺乳动物中这一区域microRNA簇的高度保守，那么其他大动物的多能性细胞的鉴定也可以通过检测这些microRNA的表达来完成，这将大大简化了多能性干细胞的验证工作。
发明人可以通过检测这一区域microRNA的表达，来鉴定小鼠、大鼠、人及其他大动物的胚胎干细胞及诱导多能性干细胞(iPSC)的多能性。
附图说明
图1示出了本发明包括的microRNA簇在具有完全和不完全多能性的干细胞系中存在表达差异。A、10个多能性干细胞的microRNA测序结果聚类分析。B、胚胎干细胞(ES细胞)与四倍体诱导多能性干细胞(4n-iPS细胞)中microRNA的表达情况无明显差异。C、本发明包括的microRNA簇在ES细胞与二倍体诱导多能性干细胞(2n-iPS细胞)中存在明显表达差异(为红色圆圈标出)。D、本发明包括的microRNA簇在4n-iPS细胞与2n-iPS细胞中存在明显表达差异(为红色圆圈标出)。ES，4n-iPS和2n-iPS三组细胞系组内microRNA原始克隆次数归一化后取平均值，再转化为以2为底的对数值用于作图。
图2示出了本发明包含的基因组Dlk1-Dio3区域及其上下游临近基因的表达和保守情况。A、完全多能性细胞(ES和2n-iPS)与部分多能性细胞(4n-iPS)在Dlk1-Dio3区域及其临近区域的表达差异。与不完全多能性细胞相比，完全多能性细胞中高表达的基因用绿色长方形(即黑白图中印记区内的灰色长方形)表示，表达相当的基因用灰色长方形表示，检测中没有包含的基因用白色长方形表示。发夹型图案表示microRNA，五角形表示其它短的非编码RNA，发夹型图案与五角形的线条与填充颜色的深浅与表达量正相关。B、Dlk1-Dio3区域及其上下游临近基因的保守情况。红色小菱形表示保守的microRNA，粉色小菱形表示不保守的microRNA，绿色方框表示其它基因。microRNA簇仅在哺乳动物中存在，并且高度保守。
图3示出了基因组Dlk1-Dio3区段microRNAs(A)，其它非编码小RNAs(B)及蛋白质编码基因(C)表达情况聚类分析。C板中还包括Dlk1-Dio3核心区段周围紧邻基因表达情况。表达值使用的是SOLEXA测序及表达谱芯片原始信号值转化为以2为底的对数值。聚类图使用R中的hclust package绘制。
图4示出了Dlk1-Dio3核心区段microRNAs表达量在具有种系嵌合能力2n-iPS细胞系与非种系嵌合2n-iPS细胞系间存在差异。具有种系嵌合能力2n-iPS细胞系IP20D-3中microRNA的表达情况用蓝色柱表示，非种系嵌合2n-iPS细胞系IP36D-3中microRNA的表达情况用红色柱表示。
图5示出了Dlk1-Dio3区段的microRNA调控PRC2复合体的机制示意模型。A.PRC2复合体通过三甲基化组蛋白H3K27位点抑制基因及microRNA的表达。B.在完全多能性干细胞中，Dlk1-Dio3区段microRNA表达，并通过抑制PRC2复合体中的三个蛋白而阻止PRC2复合体的形成，从而进一步促进microRNA及Dlk1-Dio3区段其它基因的表达。
具体实施方式
发明人的研究基于严谨的动物实验，将具有不同发育潜能的胚胎干细胞和多能性干细胞鉴定分类，并通过大规模的Solexa测序和基因芯片数据，追溯这些多能性干细胞之间的差异，从而发现位于Dlk1-Dio3区段的基因、microRNA和其它非编码RNA在发育潜能最高的完全多能性细胞中高表达，而在发育潜能较低的不完全多能性干细胞中被显著抑制或沉默；通过先检测这一簇基因和非编码小RNA再验证多能性的办法得到的结果，也完全吻合这一结论。因此，在小鼠中，这一簇基因的表达是干细胞多能性的一个重要标记。
MicroRNA(miRNA)是指前体具有发夹型二级结构，可以与对应靶信使RNA(mRNA)的序列互补，从而在转录后翻译水平调控基因沉默的长度多为22个核苷酸的短链small RNA。
材料与方法：
1.iPS细胞系及多能性鉴定
目前评判小鼠多能性干细胞发育潜能的标准有：一、多能性标志(Marker)的表达，如pou5f1、Nanog、Rex1等；二、拟胚体(EB)及畸胎瘤形成，证明可以向三个胚层分化；三、体外定向诱导向多种细胞类型分化，如神经元、心肌细胞、胰岛细胞等；四、获得嵌合体动物(2N)；五、能够获得种系嵌合的嵌合体动物，即可以进种系，发育为精子或卵子(GLT)；六、四倍体补偿动物的健康出生(4N)，这是最为严格的标准(黄金标准)，但由于伦理问题只有前三项适用于人类多能性干细胞的评价。发明人选择了四、五、六三种级别的小鼠干细胞进行实验。
本实验按照常规的方法进行多能性基因的表达及核型分析。然后进行体内外实验的检测，包括形成EB，畸胎瘤，及嵌合体形成和四倍体胚胎补偿。将多能性的干细胞注射到CD-1二倍体小鼠胚胎中获得嵌合体小鼠，这些小鼠长大后与CD-1小鼠交配生下仔鼠，看毛色决定是否有种系嵌合鼠的出生。四倍体胚胎补偿是检测干细胞多能性的最严格的标准，通过将多能性干细胞注射到四倍体胚胎中获得全部来自于ES或iPS来源的小鼠。
选择如下细胞系提取总RNA并进行测序：1、可以种系嵌合并可以四倍体补偿的2个ES细胞系和6个iPS细胞系(4n)；2、一个只能种系嵌合的iPS细胞系(GLT)；3、一个不能种系嵌合但可以获得嵌合体动物的iPS细胞系(2n)。
2.细胞总RNA提取及RNA完整性检测
用trizol(invitrogen)提取细胞的总RNA，提取的总RNA经过Agilent 2100检测其完整性，合格的RNA应符合RIN值≥8.0，并且28s：18s≥1。
3.小RNA的高通量测序
3.1非编码小RNA的分离
取10ug检测合格的总RNA，在15％聚丙烯酰胺(7M尿素)的变性PAGE凝胶上进行分离，切胶回收18-30nt的小RNA。
3.2连接5′端接头
将回收后的非编码小RNA连接上5′端接头，连接产物在15％聚丙烯酰胺(7M尿素)的变性PAGE凝胶上进行分离，切胶回收40-60nt的连接产物。
3.3连接3′端接头
将回收后的连接产物再与3′端接头进行连接，连接产物在10％聚丙烯酰胺(7M尿素)的变性PAGE凝胶上进行分离，切胶回收70-90nt的连接产物。
3.4RT-PCR
回收后的连接产物经过特异性引物反转录得到cDNA，该cDNA通过15轮的PCR扩增，扩增得到的产物在10％聚丙烯酰胺的非变性PAGE凝胶上进行分离，切胶回收90bp的特异条带。
3.5高通量测序
回收的PCR产物由Illumina公司的高通量测序仪进行测序。
4.数据分析
得到从公司返回的原始数据，通过生物信息手段初步处理，去除测序质量不符合标准的测序结果，得到高质量的非冗余序列及其表达值。通过序列比对把序列定位在基因组上，在不同多能性标准(以能否获得四倍体补偿动物为标准)的多能性干细胞之间，根据基因组上的位置分区段比较、筛选特异的非编码小RNA簇，得到可以指示胚胎干细胞或者诱导多能性干细胞符合四倍体补偿最高多能性标准的表征。
5.基因表达谱芯片以及差异表达基因分析
使用R语言环境中的生物芯片数据和基因组数据分析软件包Bioconductor对所有细胞系的表达谱芯片结果进行处理。芯片原始杂交信号值经RMA方法归一化后转化为以2为底的对数值。结合 FDR校正，用Student′s t-test筛选在两组细胞系间存在表达差异的基因(P＜0.05)。使用R中的heatmap.2 package软件包绘制所研究的印记区段的基因和非编码小RNA表达的热图。
结果：
本研究发现了在哺乳动物中特异表达的一簇基因、microRNA和其它非编码RNA对于小鼠胚胎干细胞的多能性有重要影响。小鼠第12号染色体区段Dlk1-Dio3印记区域(包含Dlk1和Dio3基因以及这段区域到上游Begain基因和下游Ppp2r5c基因间的基因间区)的所有基因、microRNA和其它非编码RNA在能获得四倍体补偿动物的完全多能性干细胞中高表达，而在不能获得四倍体补偿动物的部分多能性干细胞中被抑制或沉默。
iPS细胞系及多能性鉴定
对本实验用于测序的iPS和ES进行多能性基因的表达、核型分析、形成EB、畸胎瘤及二倍体嵌合能力和四倍体胚胎补偿的检测，检测结果见表1。
表1.多能性干细胞的鉴定。
注：√表示有，×表示无。
非编码小RNA深度测序发现一簇microRNA在不同发育潜能的干细胞中差异表达
为了在分子水平找出评价多能性干细胞能否四倍体补偿的关键指标，发明从2个ES细胞系，6个4N-iPS细胞系和2个2N-iPS细胞系中收集了18nt至30nt的非编码小RNA，并且进行测序。聚类分析方法证明无论是ES细胞还是iPS细胞，可以四倍体补偿的多能性干细胞较2N-iPS细胞差异极大，但4N-ES细胞和4N-iPS细胞间无显著差异(如图1所示)。进一步研究发现，有75个microRNA在2N与4N间变化倍数超过2倍。其中，有62个microRNA在2N-iPS细胞系中普遍低表达或不表达，而这些microRNA在4N-ES/4N-iPS细胞系中普遍高表达。
印记区段Dlk1-Dio3高活性是全能性的重要表征
图2示出了小鼠第12号染色体Dlk1-Dio3印记区域(包含Dlk1和Dio3基因以及这段区域到上游Begain基因和下游Ppp2r5c基因间的基因间区)的所有基因、microRNA和其它非编码RNA。在2n-iPS细胞与4n-ES/iPS在此区段基因表达存在差异。用绿色矩形表示在4n-ES/iPS细胞中表达上调的基因和其它非编码RNA，未变化的基因用印记区外的灰色矩形表示，空白方框代表未检测到的基因。发卡结构代表这一区域产生大量microRNA，颜色越深说明该microRNA在4n-ES/iPS细胞中表达量越高。五角形代表其它非编码小RNAs，颜色深浅与其表达量变化趋势与上述microRNA一致。Dlk1-Dio3印记区段所有基因、microRNA和其它非编码RNAs在4n-ES/iPS细胞中均处于活化状态。
值得注意的是，检测到的差异表达miRNA多在2N-iPS中低表达的microRNAs都定位在小鼠12号染色体长臂的Dlk1-Dio3印记区域。这一区域大约1380kb；包括Dlk1，Rtl1，1110006E14Rik，B830012L14Rik，Dio3，五个基因、三个非编码基因Meg3，Rian和Mirg，一个C/D box snoRNA基因簇，72个microRNAs和多个其他的非编码小RNA(如图2所示)。早先研究发现这一区段的基因和microRNAs的表达仅限于小鼠胚胎和成鼠脑中，但具体功能还不清楚。
前述的五个基因和三个非编码基因如下表2所示：
表2：小鼠12号染色体长臂Dlk1-Dio3印记区域的基因及在基因组的位置
| 基因名称 基因组位置(loci on chr12) Dlk1 110691059-110698901 Meg3 110779211-110809936 Rtl1 110828379-110833613 1110006E14Rik 110833609-110835408 Rian 110884339-110890480 B830012L14Rik 110933796-110936926 Mirg 110968996-110987668 Dio3 111517470-111518918 |
前述的72个microRNAs，如下表3所示：
表3.小鼠12号染色体长臂Dlk1-Dio3印记区域的microRNA及其序列
| mmu-miR-1188 SEQ ID1：UGGUGUGAGGUUGGGCCAGGA mmu-miR-1193 SEQ ID2：UAGGUCACCCGUUUUACUAUC mmu-miR-1197 SEQ ID3：UAGGACACAUGGUCUACUUCU mmu-miR-127 SEQ ID4：UCGGAUCCGUCUGAGCUUGGCU mmu-miR-127＊ SEQ ID5：CUGAAGCUCAGAGGGCUCUGAU mmu-miR-134 SEQ ID6：UGUGACUGGUUGACCAGAGGGG mmu-miR-136 SEQ ID7：ACUCCAUUUGUUUUGAUGAUGG mmu-miR-136＊ SEQ ID8：AUCAUCGUCUCAAAUGAGUCUU mmu-miR-154 SEQ ID9：UAGGUUAUCCGUGUUGCCUUCG mmu-miR-154＊ SEQ ID10：AAUCAUACACGGUUGACCUAUU mmu-miR-299 SEQ ID11：UAUGUGGGACGGUAAACCGCUU mmu-miR-299＊ SEQ ID12：UGGUUUACCGUCCCACAUACAU mmu-miR-300 SEQ ID13：UAUGCAAGGGCAAGCUCUCUUC mmu-miR-300＊ SEQ ID14：UUGAAGAGAGGUUAUCCUUUGU mmu-miR-323-3p SEQ ID15：CACAUUACACGGUCGACCUCU mmu-miR-323-5p SEQ ID16：AGGUGGUCCGUGGCGCGUUCGC mmu-miR-329 SEQ ID17：AACACACCCAGCUAACCUUUUU mmu-miR-337-3p SEQ ID18：UUCAGCUCCUAUAUGAUGCCU mmu-miR-337-5p SEQ ID19：GAACGGCGUCAUGCAGGAGUU mmu-miR-341 SEQ ID20：UCGGUCGAUCGGUCGGUCGGU mmu-miR-369-3p SEQ ID21：AAUAAUACAUGGUUGAUCUUU mmu-miR-369-5p SEQ ID22：AGAUCGACCGUGUUAUAUUCGC mmu-mi R-370 SEQ ID23：GCCUGCUGGGGUGGAACCUGGU mmu-miR-376a SEQ ID24：AUCGUAGAGGAAAAUCCACGU mmu-miR-376a＊ SEQ ID25：GGUAGAUUCUCCUUCUAUGAGU mmu-miR-376b SEQ ID26：AUCAUAGAGGAACAUCCACUU mmu-miR-376b＊ SEQ ID27：GUGGAUAUUCCUUCUAUGGUUA mmu-miR-376c SEQ ID28：AACAUAGAGGAAAUUUCACGU mmu-miR-376c＊ SEQ ID29：GUGGAUAUUCCUUCUAUGUUUA mmu-miR-377 SEQ ID30：AUCACACAAAGGCAACUUUUGU mmu-miR-379 SEQ ID31：UGGUAGACUAUGGAACGUAGG mmu-miR-380-3p SEQ ID32：UAUGUAGUAUGGUCCACAUCUU mmu-miR-380-5p SEQ ID33：AUGGUUGACCAUAGAACAUGCG mmu-miR-381 SEQ ID34：UAUACAAGGGCAAGCUCUCUGU mmu-miR-382 SEQ ID35：GAAGUUGUUCGUGGUGGAUUCG mmu-miR-382＊ SEQ ID36：UCAUUCACGGACAACACUUUUU mmu-miR-409-3p SEQ ID37：GAAUGUUGCUCGGUGAACCCCU |
| mmu-miR-409-5p SEQ ID38：AGGUUACCCGAGCAACUUUGCAU mmu-miR-410 SEQ ID39：AAUAUAACACAGAUGGCCUGU mmu-miR-411 SEQ ID40：UAGUAGACCGUAUAGCGUACG mmu-miR-411＊ SEQ ID41：UAUGUAACACGGUCCACUAACC mmu-miR-412 SEQ ID42：UUCACCUGGUCCACUAGCCG mmu-miR-431 SEQ ID43：UGUCUUGCAGGCCGUCAUGCA mmu-miR-431＊ SEQ ID44：CAGGUCGUCUUGCAGGGCUUCU mmu-miR-433 SEQ ID45：AUCAUGAUGGGCUCCUCGGUGU mmu-miR-433＊ SEQ ID46：UACGGUGAGCCUGUCAUUAUUC mmu-miR-434-3p SEQ ID47：UUUGAACCAUCACUCGACUCCU mmu-miR-434-5p SEQ ID48：GCUCGACUCAUGGUUUGAACCA mmu-miR-485 SEQ ID49：AGAGGCUGGCCGUGAUGAAUUC mmu-miR-485＊ SEQ ID50：AGUCAUACACGGCUCUCCUCUC mmu-miR-487b SEQ ID51：AAUCGUACAGGGUCAUCCACUU mmu-miR-493 SEQ ID52：UGAAGGUCCUACUGUGUGCCAGG mmu-miR-494 SEQ ID53：UGAAACAUACACGGGAAACCUC mmu-miR-495 SEQ ID54：AAACAAACAUGGUGCACUUCUU mmu-miR-496 SEQ ID55：UGAGUAUUACAUGGCCAAUCUC mmu-miR-539 SEQ ID56：GGAGAAAUUAUCCUUGGUGUGU mmu-miR-540-3p SEQ ID57：AGGUCAGAGGUCGAUCCUGG mmu-miR-540-5p SEQ ID58：CAAGGGUCACCCUCUGACUCUGU mmu-miR-541 SEQ ID59：AAGGGAUUCUGAUGUUGGUCACACU mmu-miR-543 SEQ ID60：AAACAUUCGCGGUGCACUUCUU mmu-miR-544 SEQ ID61：AUUCUGCAUUUUUAGCAAGCUC mmu-miR-665 SEQ ID62：ACCAGGAGGCUGAGGUCCCU mmu-miR-666-3p SEQ ID63：GGCUGCAGCGUGAUCGCCUGCU mmu-miR-666-5p SEQ ID64：AGCGGGCACAGCUGUGAGAGCC mmu-miR-667 SEQ ID65：UGACACCUGCCACCCAGCCCAAG mmu-miR-668 SEQ ID66：UGUCACUCGGCUCGGCCCACUACC mmu-miR-673-3p SEQ ID67：UCCGGGGCUGAGUUCUGUGCACC mmu-miR-673-5p SEQ ID68：CUCACAGCUCUGGUCCUUGGAG mmu-miR-679 SEQ ID69：GGACUGUGAGGUGACUCUUGGU mmu-miR-758 SEQ ID70：UUUGUGACCUGGUCCACUA mmu-miR-770-3p SEQ ID71：CGUGGGCCUGACGUGGAGCUGG mmu-miR-770-5p SEQ ID72：AGCACCACGUGUCUGGGCCACG |
上文提到Dlk1-Dio3区段的microRNA在2N-iPS细胞系中普遍低表达，相对于2N-iPS，microRNAs在4N-ES/iPS细胞系中普遍高表达。相邻区域另外两个mir-342 and mir-345也有相似趋势(如 图3A所示)。更值得注意的是此区段一大批内源的siRNA也具有相同表达情况(如图3B所示)。除此之外，利用表达谱芯片分析转录情况，发现除B830012L14Rik之外，这一位置的所有基因在4N-ES/iPS细胞系中普遍高表达，而在2N-iPS中被抑制(如图3C所示)。由此发明人得出结论，印记区段Dlk1-Dio3高活性是真正多能性的重要表征。
部分重编程后具有或不具有种系嵌合能力细胞系的微小表达差异
本研究中的两个2n iPS细胞系多能性也存在差异，IP20D-3具有种系嵌合能力，而IP36D-3不具有这一能力。正如发明人推测的，尽管Dlk1-Dio3区域编码的microRNA在这两个2n iPS中表达量极低或不表达，在这些有限的表达中，IP20D-3的表达量普遍高于IP36D-3(如图4所示)。与IP20D-3的种系嵌合能力相对应，极有可能由于来自这一印记区域的microRNA的量较高，赋予了这个细胞系更高的发育潜能。
激活的microRNA簇正向反馈调节PRC2复合物，使Dlk1-Dio3区域去甲基化
2n诱导多能性干细胞(iPS)与胚胎干细胞(ES)及4n iPS细胞系的表达谱芯片数据表明，有1638个基因在ES及4n iPS中比2n iPS表达上调，3467个基因表达下调。由于microRNA通常对其靶基因起到负调控的作用，ES和4n iPS表达下调的基因中应该包括了发明人鉴定获得的microRNA簇的靶基因。发明人分析了mRNA中3′UTR区包含至少两个与microRNA 5′2-8个核酸的种子区域可互补结合的位点，发现28个中等或高表达的microRNA有717个潜在的靶点基因在ES及4n iPS系中表达下调。
基因本体(Gene ontology，GO)分析表明丰度较高的microRNA推测的靶基因与生长、分化代谢以及发育过程调控等多个表型相关，表明完全多能性细胞中高表达microRNA簇可能通过抑制发育相关基因发挥功能。
信号通路分析表明核心蛋白复合体(polycomb repressivecomplex 2，PRC2)的三个组成元件：HDAC2、RBAP48和EED是预测的microRNA靶基因。PRC2可以引发组蛋白3赖氨酸27位三甲基化，导致基因沉默。在PRC2引发甲基化之前，需要先激活组蛋白去乙酰化酶HDAC2来去除组蛋白3的乙酰化修饰。我们的研究结果证明，在ES及4n iPS细胞中，Dlk1-Dio3区域编码的microRNA的表达抑制了HDAC2、RBAP48和EED的表达，导致PRC2形成的减少以及基因组去甲基化。在ES及iPS细胞中PRC2形成的减少会导致Dlk1-Dio3区域去甲基化，与我们研究结果中基因及microRNA表达增加相吻合。(如图5所示)microRNA的表达进一步通过靶定hdac2、rbap48和eed的转录抑制PRC2的形成，最终形成一个正向反馈调节信号通路。
图5示出了Dlk1-Dio3区段的microRNA调控PRC2复合体机制示意模型。A.PRC2复合体通过三甲基化组蛋白H3K27位点抑制基因及microRNA表达。B.在部分多能性干细胞中，Dlk1-Dio3区段microRNA表达受到PRC2复合体介导的组蛋白H3k27甲基化抑制。在完全多能性干细胞中，Dlk1-Dio3区段的microRNA处于激活状态。因此，用于指导HDAC2，RBAP48和EED三个蛋白合成的mRNA无法正常行使功能，细胞不能组成PRC2复合体从而导致Dlk1-Dio3区段的去甲基化，并进一步促进Dlk1-Dio3区段microRNA的表达，形成正反馈调节通路。
功能验证实验结果：
用real-time qPCR和Northern的方法检测了6个4N-ES细胞系、7个4N-iPS细胞系、4个GLT-iPS细胞系、1个2N-iPS细胞和1个2N-ES细胞中Dlk1-Dio3区的基因和microRNA的表达。结果表明，Dlk1-Dio3区的基因和microRNA在6个4N-ES细胞系、7个4N-iPS细胞系中高表达；在4个GLT-iPS细胞系中有一定程度的表达，但表达量不高；在2N-iPS细胞和2N-ES细胞中不表达或低表达。证明了Dlk1-Dio3区的基因和microRNA调控着细胞的多能性。如果该区域的基因和microRNA高表达则细胞具有更好的发育潜能。
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Claims (2)
1.基因、microRNA、其它非编码RNA在鉴定干细胞多能性和在干细胞分型中的用途，所述基因、microRNA和其它非编码RNA为定位在小鼠12号染色体长臂的名为Dlk1-Dio3的染色体印记区域的基因、microRNA和其它非编码RNA或其在其它哺乳动物基因组共线性区域中基因、microRNA和其它非编码RNA，所述Dlk1-Dio3的染色体印记区域为Dlk1和Dio3基因以及这段区域到上游Begain基因和下游Ppp2r5c基因间的基因间区，所述基因、microRNA和其它非编码RNA为Dlk1、Rtl1、1110006E14Rik、B830012L14Rik、Dio3五个基因，三个非编码基因Meg3、Rian和Mirg，一个C/D box snoRNA基因簇，所有这个区域编码的microRNA和其它非编码RNA。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述microRNA为SEQ ID 1-72所列出的所有microRNA。
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