CN105873942A - 使用pten抑制剂治疗损伤的神经 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种通过使所述细胞与磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)脂质磷酸酶接触抑制肽增长或增殖神经细胞的方法。

Description

使用PTEN抑制剂治疗损伤的神经

背景技术

1.技术领域

本申请涉及一种通过在损伤的神经处或附近区域给予神经再生量或神经退化减弱量的磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)脂质磷酸酶抑制肽再生神经或减弱损伤的神经退化的方法。

2.一般背景和本领域的现状

在成年哺乳动物的神经系统中，损伤的神经的再生在响应于神经损伤的愈合中几乎不会发生。成年CNS神经元在受损后不能再生的主要原因有两个-轴突在成年中枢神经系统中不会再生，这不仅因为其在受损后受到分泌的细胞外抑制因子的抑制，还因为丧失了内在轴突生长能力，这种内在轴突生长能力随年龄急剧下降[Schwab et al；1996,Goldberg et al.2002；Filbin et al.2006；Fitch et.al 2008]。然而，神经损伤后分泌的细胞外抑制分子的消除在体内仅触发非常有限的轴突再生[Yiu et.al 2006；Hellal et al.2011]。因此，通过调节内在神经向外生长促进轴突再生过程是目前神经损伤的治疗靶点的焦点。

PTEN(磷酸酶和张力蛋白同源物)蛋白质是一种双磷酸酶，并且被认为是一种重要的通过消极地调节磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号通路的肿瘤抑制剂。PI3K信号通路对于细胞增殖、存活和分化以及蛋白质合成、代谢和运动是一种关键的信号转导[Zhang et al.2010]。作为脂质磷酸酶，PTEN通过对磷脂酰肌醇(3,4,5)三磷酸酯(PIP₃)的3位进行脱磷酸化而催化PIP₃转化为磷脂酰肌醇(4,5)二磷酸酯(PIP₂)，由此通过拮抗PI3K活性而抑制PI3K信号通路[Di Cristofano et.al 2010]。PTEN的缺失或失活增强PI3K活性并且促进PI3K信号通路下游组件(包括PDK1、Akt和哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR))的活化，这导致肿瘤形成[Di Cristofano et.al 2010；Stambolic et al.1998]。

通过PTEN调节PI3K介导的信号也深深地关系到神经系统中的神经再生过程。最近的研究表明，PTEN蛋白的抑制或PTEN基因的缺失促进受损后成年CNS/PNS神经的内在再生向外生长[Park et.al 2008；Liu et.al2010；Sun et.al 2012；Christie et.al 2012]。例如，Park et al.发现，使用有条件的基因敲除小鼠通过再活化PI3K-Akt-mTOR信号通路，在成年大鼠视网膜神经节细胞中PTEN的缺失实际上促进了健全的轴突再生。通过条件基因敲除mTOR通路的另一个负调节子再活化mTOR通路也促进了轴突再生，这表明PBK-mTOR信号的促进可能是恢复内在轴突再生能力的主要因素。另外，Liu et al.报道，在体内CNS损受模型中条件缺失PTEN实际上通过上调PI3K信号通路增加了CNS损伤后减弱的神经元mTOR活性，这导致增强的未受损CST轴突的补偿性发芽和受损CST轴突越过脊髓损伤的成功再生。在PNS损伤的情况下，在体外和体内对PTEN的抑制也提高了轴突向外生长[Christie et.al 2012]。因此，开发用于促进PI3K-mTOR信号通路的PTEN抑制剂是一种用于增强受损神经系统中轴突再生的良好治疗目标，该PTEN抑制剂可以被用在与现存的或新型细胞疗法的联合治疗方法中，所述现存的或新型细胞疗法含有在CNS或PNS损伤后有效于神经再生的其它试剂。

在本研究中，我们开发了通过刺激PI3K信号通路而有效于神经再生和/或防护神经退化的潜在PTEN抑制剂。为了活化作为脂质磷酸酶的PTEN，PTEN必须以合适的方位位于质膜中[Leslie et.al 2008]。因此，我们调查了PTEM膜定位的机制以设计肽形式的潜在PTEN抑制剂候选物。设计并合成了三种不同的肽-TGN-1、TGN-2和TGN-3-作为潜在的PTEN抑制剂，并且使用体外PTEN活性检测调查了它们抑制PTEN活性的能力。我们还通过使用神经元细胞系表征了它们对PI3K信号通路的调节的影响。我们发现，TGN-1和TGN-2肽(它们是模仿PTEN C-末端区域中磷酸化位点的修饰肽)在体外PTEN活性检测中实际上减弱了PTEN脂质磷酸酶活性。TGN-1肽还在PC12细胞中增强了Akt蛋白的活化水平，这表明这些肽有效上调PI3K-Akt信号通路。使用神经元细胞的神经突检测显示，TGN-1和TGN-2肽通过增强神经突微管结构而促进神经突向外生长以及延迟神经突退化。因此，TGN肽作为用于CNS损伤后神经再生的治疗剂是有用的。

发明内容

在一个方面，本发明涉及以下内容：

在一个方面，本发明涉及一种在神经损伤部位再生神经或减弱神经退化的方法，包括在损伤的神经处或附近区域给予神经再生量或神经退化减弱量的磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)脂质磷酸酶抑制肽。该PTEN抑制肽可以是修饰的PTEN或其片段，其中磷酸化位点被修饰以便该磷酸化位点中的丝氨酸或苏氨酸被磷酸化。磷酸化的丝氨酸或苏氨酸可以位于位置Thr-366、Ser-370、Ser-380、Thr-382、Thr-383或Ser-385。磷酸化的丝氨酸或苏氨酸可位于位置Ser-370、Ser-380和/或Ser-385。磷酸化的丝氨酸或苏氨酸可位于位置Ser-370、Ser-380和Ser-385。磷酸化的丝氨酸或苏氨酸可位于位置Ser-380和Ser-385。肽可以是磷酸化位点的肽的片段和/或PDZ结构域结合基序。肽可以进一步包含肽转移结构域(PTD)。神经损伤可以是在中枢神经系统中。

在另一方面，本发明涉及抑制磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)脂质磷酸酶活性的肽。PTEN抑制肽可以是修饰的PTEN肽或其片段，其中磷酸化位点被修饰以便该磷酸化位点中的丝氨酸或苏氨酸被磷酸化。磷酸化的丝氨酸或苏氨酸可位于位置Thr-366、Ser-370、Ser-380、Thr-382、Thr-383或Ser-385。磷酸化的丝氨酸或苏氨酸可位于位置Ser-370、Ser-380和/或Ser-385。磷酸化的丝氨酸或苏氨酸可位于位置Ser-370、Ser-380和Ser-385。磷酸化的丝氨酸或苏氨酸可位于位置Ser-380和Ser-385。肽可以是磷酸化位点的肽的片段和/或PDZ结构域结合基序。肽可进一步包含肽转移结构域(PTD)。神经损伤可以是在中枢神经系统中。

在又另一方面，本发明涉及一种增长、增殖或增强神经细胞的活性的方法，包括使该神经细胞与张力蛋白同源物(PTEN)脂质磷酸酶抑制肽接触。

从本发明的以下描述、随附的参考附图以及随附的权利要求书，将能够更全面地理解本发明的这些及其它目的。

附图说明

从下文给出的详细描述以及附图，本发明将变得能够更全面地被理解，其中附图仅以说明性的方式给出，因此它们不限制本发明，其中：

图1A-1B示出了作为潜在PTEN抑制剂的TGN肽。A)PTEN C-末端区域的图表。TPEN C-末端区域包括C2结构域(AA186～403)、磷酸化位点(AA352～399)和PDZ结构域结合基序(400-403)。含有区域(AA352～403)的磷酸化位点和PDZ结构域结合基序被用作TGN肽设计的模板。B)TGN肽的氨基酸序列。TGN-1、TGN-2和TGN-3模仿PTEN磷酸化位点，其中所指出的残基通过磷酸化被修饰。TGN-4肽是TGN-1的乱序肽(scrambled peptide)，并且TGN-5肽是TGN-2的乱序肽。

图2A-2C示出了使用TGN肽的体外PTEN活性检测。A)使用孔雀石绿检测试剂盒体外PTEN活性检测的机理。C8-PIP₃被用作PTEN底物并且与其它磷脂(DOPC和DOPC)一起被制备为脂质体。通过监测磷酸根离子-孔雀石绿试剂复合物在620nm下的光密度来测量通过PTEN由C8-PIP3产生的磷酸根离子。B)TGN肽抑制体外PTEN活性的效果。通过体外PTEN活性检测来检查TGN-1、TGN-2和TGN-3肽的PTEN抑制效果。在100μL反应体积中使用20ng人重组PTEN蛋白质和0.1mM作为脂质体的C8-PIP₃温育10μΜ每一种肽。TGN-4和TGN-5肽分别用于检查TGN-1和TGN-2/3肽的序列特异性。所有的数据均代表了三重实验的结果。C)TGN-1和TGN-2肽的IC₅₀曲线。IC₅₀值通过体外PTEN活性检测以剂量依赖性方式使用TGN-1和TGN-2肽进行测量，并且通过Prism 5软件进行计算。TGN肽的IC₅₀值为：TGN-1为19.93μΜ，TGN-2为4.83μΜ以及TGN-3为87.12μΜ。

图3A-3C示出了TGN-1肽通过增加体内的Akt活化水平促进PI3K-Akt信号。A)通过使用TGN-1阻断PTEN活性的Akt活化的机理。在PI3K信号通路中引入TGN-1促进了PI3K信号并且促进了Akt活化(磷酸化)水平。B)使用PC12细胞裂解物的蛋白质印迹数据。使用TGN-1肽(10μΜ,100μΜ)或TGN-4肽(10μΜ)处理PC12细胞，并且温育24小时。使用抗-磷酸化Akt抗体的蛋白质印迹数据显示，TGN-1以剂量依赖性方式特异性地促进了内源性Akt的活化水平。C)还监测了作为阳性对照和负载对照的PTEN和β-肌动蛋白的表达水平。

图4A-4B示出了TGN-1和TGN-2肽，该TGN-11和TGN-2肽显示出神经营养作用和抵抗神经突退化的神经保护作用。A)首先使用诺考达唑(0.5μΜ)将分化的PC12细胞处理1小时，以及使用含有NGF(l0ng/mL)和TGN肽(TGN-1和TGN-2,100μΜ/每种)的新鲜培养基温育另外的72小时。使用Image J软件，将相对神经突稳定性计算为来自免疫荧光图像的绿色/红色荧光信号强度的比率。对于每个样品，所有的荧光信号强度均测量至少三次以用于绿色/红色比率计算，并且归一化(仅为培养基＝100％)。B)分化的PC12细胞上的神经突向外生长的定量。使用含有NGF(50ng/ml)的分化培养基将PC12细胞处理24小时，随后使用TGN肽(100μΜ/每一种)温育额外2天。将TGN-4肽用作TGN-1的阴性对照。在第3天使用神经突定量试剂盒(Millipore)以分光光度法进行神经突定量并且归一化(仅为培养基＝100％)。

图5示出了在细胞膜表面上PTEN的界面活化的假想模型。目前据信PTEN具有两种体内构象状态并且拟进行构象变化以位于膜定位中以完全表达其脂质磷酸酶活性。可溶形式的PTEN以“闭合”构象处于失活状态，其中PTEN C-末端区域的磷酸化位点空间上屏蔽PTEN活性位点和C2结构域以防止PTEN膜关联。当“磷酸化位点”中的磷酸化的残基被脱磷酸化时，PTEN将其构象从“闭合”构象改变至“开放”构象。在此阶段，位于PTEN的C2结构域处的多个膜结合基序被暴露并准备与膜关联。PTEN活性位点的结合口袋也可以用于访问驻留在膜表面上的PIP₃底物。膜表面上的PIP₂与N-末端PIP₂结合基序的结合以及C-末端PDZ结构域结合基序至副官蛋白(adjutant protein)(NHERF1)中的PDZ结构域的结合，力求PTEN在产生其脂质磷酸酶活性所需的合适的位置处位于细胞膜表面上。

具体实施方式

在本申请中，“一个(a)”和“一钟(an)”被用来指代单个或多个对象。

如本文中所使用的，将损伤的神经或神经系统“附近”注射细胞是指足够接近注射位点和损伤区域之间的区域，以在损伤部位实现再生神经或防止损伤的神经细胞的退化的有效结果。因此，在损伤的神经处或附近注射细胞包括在损伤部位或对于注射细胞足够接近的任何位置以表达有效的多肽并且该多肽被允许直接或间接地实现神经再生或神经退化预防效果。对于外周神经，特别是脊髓损伤，注射可以在损伤部位的“上游”进行，因为细胞倾向于在损伤部位泄漏出。

如本文中所使用的，“神经突”是指神经元的细胞体的任何突起部。该突起部可以是轴突或树突。当谈起未成熟的或发育中的神经元(特别是培养中的细胞)时频繁地使用该术语，因为在完成分化之前，难以辨别轴突和树突。

如本文中所使用的，“神经再生”是指在中枢神经系统(CNS)或外周神经系统(PNS)中神经损伤后新神经细胞、神经元、神经胶质、轴突、髓鞘或突触的生成。通过经由抑制PTEN活化PI3K-mTOR介导的信号而恢复的内在神经再生能力驱动该再生。

如本文所使用的，神经退化的“弱化”或“防止”是指在中枢神经系统(CNS)或外周神经系统(PNS)中延迟由神经损伤引起的轴突、神经胶质或髓鞘结构的退化。“弱化”或“防止”是通过与PI3K-mTOR-介导的信号紧密相关的神经微管结构稳定来实现的，该PI3K-mTOR-介导的信号由PTEN抑制而激活。

磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)

PTEN氨基酸序列如下：

PTEN蛋白质目前正成为用于开发在成年CNS系统中再生损伤的神经的治疗材料的热门目标，其通过促进PI3K-Akt-mTOR信号而恢复减弱的内在神经再生能力[Park et.al 2008；Liu et.al 2010；Sun et.al 2012]。新型PTEN抑制剂的开发被认为是用于开发PTEN-活性调节分子的良好策略。不幸的是，PTEN蛋白质的X射线晶体结构[Lee et.al 1999]不足以为PTEN-底物(PIP₃)结合状态提供足够的信息，而所述结合状态对于设计直接阻断PTEN-底物结合的有效PTEN抑制剂是关键。替代地，对于PTEN靶向质膜的活性的机理正处于紧张的研究当中。尽管作为PETN酶的底物的磷脂酰肌醇(3,4,5)二磷酸酯(PIP₃)是在细胞膜脂质双层中发现的磷脂的一员，但是PTEN蛋白质起初作为可溶性蛋白而产生，并且必须通过构象改变界面激活其脂质磷酸酶活性，随后以适合取向进行PTEN-膜关联[Das et.al2003；Leslie et.al 2008]。位于PTEN C2结构域中的多种带电荷的氨基酸和结合基序被认为是用于将PTEN蛋白质附接到细胞膜表面上的主要锚[Leeet.al 1999；Georgescu et.al 2000；Leslie et.al 2008]。对于PTEN在细胞膜上的适当取向以便产生PTEN的脂质磷酸酶活性，使用其它结合部分的额外结合也是必要的[Chambell et.al 2003；Walker et.al 2004；Odriozola et.al2007]。

PTEN C-末端区域中的非结构化的部分(AA 352-399)被称为“磷酸化位点”，因为该区域含有称作磷酸化修饰位点的六个丝氨酸/苏氨酸(Thr-366、Ser-370、Ser-380、Thr-382、Thr-383和Ser-385)残基[Lee et.al 1999；Vazquez et.al 2001]。先前的研究表明，该“磷酸化位点”中的这6个残基的突变或缺失导致了更大的肿瘤抑制活性、增强的PTEN膜亲和力、和降低的蛋白质稳定性[Vasquez et.al 2001；Das et.al 2003；Okahara et.al 2004；Rahdar et.al 2009]。

目前，拒信，PTEN蛋白质具有两种构象状态(图4)。在“关闭”构象中，PTEN是失活的，因为包括“磷酸化位点”的PTEN的C-末端遮蔽了(mask)位于C2结构域中的膜结合基序以及PTEN活性位点口袋，这阻止了PTEN与细胞膜的关联以及PIP₃接近该活性位点。另一方面，在PTEN活性位点口袋和C2结构域均未被遮蔽并且完全暴露到细胞膜及其底物PIP₃的情况下，PTEN以其“开放”构象状态变成界面活性的。另外，“磷酸化位点”中该6种丝氨酸/苏氨酸残基的磷酸化状态被认为是PTEN界面活化的关键因素，因为其直接控制PTEN蛋白质从“关闭”构象至“开放”构象的构象变化[Das et.al 2003,Vasquez et.al 2006；Odriozola et.al 2007,Rahdar et.al 2009]。

根据当前提议的模型(图5)，PTEN在膜表面的界面活化需要三个步骤。

1)“磷酸化位点”中磷酸化的丝氨酸/苏氨酸残基的脱磷酸化触发PTEN从“关闭”至“开放”构象的构象变化，这使得PTEN蛋白质能够与细胞膜关联并且将PTEN活性位点口袋暴露给位于细胞膜上的PIP₃底物。

2)然后，C2结构域中的多膜结合基序与细胞膜相互作用以将PTEN蛋白质锚定在膜表面上。

3)同时需要N-末端PIP₂结合位点(AA6-15)和细胞膜中的PIP₂分子之间的额外相互作用[Walker et.al 2004]以及C-末端PDZ结合域结合位点(AA400-403)与副官NHERF1蛋白的PDZ结构域的结合[Takahashi et.al2006；Molina et.al 2010]来调整细胞膜表面上的PTEN取向。

我们基于图4中示出的PTEN膜定位模型，特别是“磷酸化位点”和PDZ结构域结合位点(AA 352-403)，设计了我们的TGN肽作为潜在的PTEN抑制剂。作为潜在PTEN抑制剂的TGN肽的基本概念是，通过遮蔽膜结合所需的PTEN活性位点和C2结构域防止PTEN和细胞膜表面之间的关联。由于Ser370和Ser385优先通过干酪素激酶II磷酸化[Miller et.al 2002]，因此增加了膜定位以及磷酸酶活性，比在其它残基突变时的多[Odriozola et.al 2007]。因此，这两种中的至少一个丝氨酸残基被包括在所有的TGN肽中(Ser370/385在TGN-1中，Ser385在TGN-2/TGN-3中)。此外，在380和385位置处的磷酸化的丝氨酸残基当前被认为是“假底物”的一部分，其遮蔽PTEN活性位点中的催化口袋接近真实的底物PIP₃[Odriozola et.al 2007]。肽被设计成在所有的TGN肽中包括这两种丝氨酸残基(Ser 380和Ser 385)。

TGN-1肽序列模仿PTEN磷酸化位点的AA 365～388区域并且含有四个丝氨酸/苏氨酸残基(Thr366，Ser370，Ser380和Ser385)，其中三个是被磷酸化修饰的残基(Ser370，Ser380和Ser385)。TGN-2和TGN-3肽模仿PTEN蛋白质的AA376-403区域，包括两个磷酸化的丝氨酸残基(Ser380和Ser385)以及C-末端PZD结构域结合基序(ITKV)。在TGN-1和TGN-2中仅丝氨酸被磷酸化以模仿体内PTEN的磷酸化位点，因为苏氨酸残基的磷酸化在体内导致二次修饰并且在突变时对于改变PTEN-膜结合亲和力不那么有效[Odriozola et.al 2007；Rahdar et.al 2009]。在TGN-3肽中，两个丝氨酸残基(Ser380和Ser385)用缬氨酸取代以用于比较。另外，使TGN-1和TGN-2/3肽的序列乱序以检查序列特异性，并且这些肽被分别称为TGN-4和TGN-5肽。

使用重组人PTEN蛋白质和C8-PIP₃作为底物的体外活性检测和IC₅₀检测显示，TGN-1和TGN-2肽在体外以剂量依赖性方式特异地抑制PTEN活性(图2)。C8-PIP₃与其它磷脂分子(DOPC/DOPS)被引入至PTEN蛋白质中作为合成的脂质囊泡-细胞膜脂质双层的模仿系统。活性检测结果暗示，TGN-1和TGN-2肽通过直接与PTEN蛋白质相互作用并且干扰PTEN-囊泡膜关联以防止底物(C8-PIP3)结合PTEN活性位点，可以在体外抑制PTEN活性。事实上，代替脂质体形式而仅直接添加C-8PIP3脂质的体外PTEN活性检测未能显示出PTEN活性(数据未示出)。与TGN-2肽相比，TGN-3肽的大幅降低的抑制效果表明，丝氨酸残基(Ser380和Ser385)上的磷酸化修饰是通过TGN-肽体外对PTEN抑制的重要因素。另外，在体外PTEN活性上，TGN-2肽显示出比TGN-1肽近4倍高的抑制效果(TGN-1的IC₅₀值为19.93μΜ，以及TGN-2为4.83μΜ)。TGN-1和TGN-2肽之间的主要结构差异在于TGN-2肽含有PTEN C-末端区域(AA389～403)的最后15个氨基酸序列，该序列包括PDZ结构域结合基序(AA 399～403)。由于活性检测是在体外条件下进行的，因此可以解释为，存在于TGN-2肽中的最后15个氨基酸序列提供了针对PTEN蛋白质的更高的结合亲和力以更有效地干扰PTEN-囊泡膜关联、或者比TGN-1肽更有效地遮蔽PTEN活性位点中的底物结合口袋。

在神经细胞中，TGN-1肽也有效阻断PTEN活性以调节PI3K-Akt信号通路(图3)。使用TGN-1将含有内源性或过表达的PTEN的PC12细胞温育24小时，并且通过蛋白质印迹使用抗磷酸化Akt抗体检查Akt蛋白质的活化(磷酸化)水平。使用TGN-1肽处理的细胞裂解物中的Akt蛋白质的磷酸化水平远高于使用TGN-4肽或DMSO处理的裂解物中的Akt蛋白质的磷酸化水平，这表明TGN-1肽特异性抑制PTEN以拮抗PI3K活性。因此，TGN-1肽通过抑制PTEN活性有效促进PI3K-Akt信号通路。

由于微管稳定化被认为是对于通过促进轴突再生能力和神经元极化治疗脊髓损伤是关键的[Sengottuvel et al 2011,Hellal et al 2011,Witte et al2008]，因此我们采用了诺考达唑在分化的神经元细胞上诱导神经炎性退化并且测试TGN肽是否显示出通过微管稳定化的神经保护作用。由于微管稳定性与α-微管蛋白乙酰化水平密切相关[Takemura et al 1992]，我们使用抗乙酰化α-微管蛋白抗体对稳定的神经突进行免疫染色。免疫荧光数据(图4A)表明，TGN-1和TGN-2肽实际上稳定了神经突微管结构以延迟神经突退化。再者，添加TGN-1肽特异性促进了神经元细胞分化过程的神经突外生长(图4B)。因此，TGN-1和TGN-2肽显示出神经营养作用以及防止神经突退化的神经保护作用。

在先前的研究中，Odriozola et.Al报道，涵盖了PTEN C-末端磷酸化位点簇(AA368～390)的合成的磷酸化模拟肽(Cp-23,Cp-23DE)，类似于TGN-1肽序列，在体外介导PTEN催化活性的抑制。另外，使用由GFP融合的磷酸化模拟肽转染的293T细胞的检测显示出降低的PTEN-膜关联水平以及改善的磷酸化-Akt水平。然而，Odriozola et al.中使用的磷酸化模拟肽(Cp-23,Cp-23DE)仅模仿了PTEN“磷酸化位点”的AA 368～390区域，但与本TGN肽不同，其不含有磷酸化的丝氨酸残基。事实上，尽管Odriozola肽(Cp23)和TGN-1肽共享了几乎相同的氨基酸序列，但是通过比较体外IC₅₀值(TGN-1的IC₅₀值为19.93μΜ，而Cp23为～1033μΜ)，TGN-1的抑制效力几乎比Odriozola肽(Cp23)高50倍。另外，Odriozola肽(Cp23,1033μΜ)与其乱序肽(Cp23-Der,945μΜ)之间的IC₅₀值几乎没有差异。然而，TGN-1肽比其乱序肽TGN-4显示出更高的抑制效果(图2B)，这表明TGN-1肽显示出了对体外PTEN活性的序列特异性抑制作用，而Odriozola肽(Cp23)则未显示出。另外，TGN-2肽不同于Odriozola肽(Cp23)在于含有包括PDZ结构域结合基序的额外15个氨基酸残基，已经证明其有效于PTEN抑制(TGN-2的IC₅₀值为4.93μΜ)。此外，TGN-1和TGN-2肽在它们的N-末端包括PTD(肽转移结构域)序列，以便这些肽可以被直接引入到细胞中，而Odriozola肽需要与GFP融合并转染到细胞中。因此，TGN-1和TGN-2肽在体外和体内均具有有效的PTEN抑制能力。

我们通过模仿包括“磷酸化位点”的PTEN C-末端区域开发肽。TGN-1和TGN-2在体外显示出对PTEN活性的特异性且有效的抑制作用，并且在神经元细胞中通过阻断PTEN活性而上调PI3K-Akt信号通路。由于已知通过PTEN的抑制促进PI3K-Akt-mTOR信号在CNS损伤后的神经再生中是有效的[Saijilafu et al 2013]，因此本发明的肽作为CNS损伤的治疗剂或处理剂是有用的。使用分化的神经元细胞与TGN肽的神经突检测表明，TGN-1和TGN-2肽明显地显示出神经营养作用以及通过增强神经突微管结构而对退化的神经突的神经保护作用。因此，这些肽是用于神经损伤(包括CNS损伤)后神经再生以及用于延迟神经退化进展的治疗目标。

肽设计

使用PTEN C-末端区域(氨基酸残352～403)作为模板，设计作为PTEN抑制剂的本发明的肽，在本文中也称为“TGN肽”。

优选的是，所有的TGN肽均包括PTD(肽转移结构域)序列，其可以在N-末端包括RRRRRRRR(SEQ ID NO:2)以提高膜渗透性。

TGN肽可以是处于PTEN氨基酸序列SEQ ID NO:1的氨基酸残基352～403内的任何PTEN片段、或包括PTEN氨基酸序列SEQ ID NO:1的氨基酸残基352～403的部分作为序列的一部分的PTEN片段。优选地，TGN肽包括存在于这种肽片段中的丝氨酸或苏氨酸的磷酸化。优选地，丝氨酸或苏氨酸位点处在PTEN蛋白SEQ ID NO:1的366、370、380、382、383或385位。

TGN肽可以为至少10个氨基酸残基的长度，至少15、至少20、至少25、至少30、至少35或至少40个氨基酸残基的长度。优选的是，肽包括丝氨酸或苏氨酸残基或它们的组合的至少一个的磷酸化。

应当认识到的是，在一个方面，TGN肽不受其肽长度的限制。优选的是，所述肽的至少一部分驻留在氨基酸残基352～403内。

在这一点上，示例性的TGN-1肽具有24氨基酸，其中三个为磷酸化的丝氨酸残基VTPDVpSDNEPDHYRYpSDTTDpSDPE(SEQ ID NO:3)，pS＝磷酸化的丝氨酸)。当PTD被附接在N-末端时，看到具有32个氨基酸残基的RRRRRRRR-VTPDVpSDNEPDHYRYpSDTTDpSDPE-酰胺(SEQ IDNO:4)。

另一个示例性的肽是TGN-2肽，其具有28个氨基酸，其中两个为磷酸化的丝氨酸残基，HYRYpSDTTDpSDPENEPFDEDQHTQITKV(SEQ IDNO:5)。当PTD被附接在N-末端时，看到具有36个氨基酸残基的RRRRRRRR-HYRYpSDTTDpSDPENEPFDEDQHTQITKV-酰胺(SEQ IDNO:6)。

TGN-3肽具有与TGN-2肽相同的氨基酸序列，但是没有经修饰的残基，并且两个丝氨酸残基被替换为缬氨酸，HYRYVDTTDVDPENEPFDEDQHTQITKV(SEQ ID NO:7)。当PTD被附接在N-末端时，看到RRRRRRRR-HYRYVDTTDVDPENEPFDEDQHTQITKV-酰胺(SEQ IDNO:8)。

TGN-4肽被设计为TGN-1肽的乱序肽SDDEYTDNPDSRYVSDTPVDTEH(SEQ ID NO:9)。当PTD被附接在N-末端时，看到的是RRRRRRRR-SDDEYTDNPDSRYVSDTPVDTEH-酰胺(SEQ ID NO:10)。并且TGN-5被设计为TGN-2/TGN-3乱序肽DEHDTEYTPDYRQETHFNSQPTDKSDVI(SEQ ID NO:11)。当PTD被附接在N-末端时，看到的是RRRRRRRR-DEHDTEYTPDYRQETHFNSQPTDKSDVI-酰胺(SEQ ID NO:12)。

化学修饰的肽

多肽治疗剂可能具有短的循环半衰期和蛋白水解降解以及低溶解度。为了改善本发明的生物药物的药代动力学和药效动力学特性，可以实施诸如操纵氨基酸序列等方法以降低或提高免疫原性和降低蛋白水解裂解；可以将肽融合或偶联到免疫球蛋白和血清蛋白，诸如白蛋白；还可以并入到用于生物药物(诸如本发明的肽)和抗体的药物递送载体中以保护并减慢释放；并且还设想了偶联到天然或合成聚合物。具体地，对于合成聚合物偶联，还设想了聚乙二醇化或酰化，诸如N-酰化、S-酰化、酰胺化等。

神经组织

神经组织在脊索的影响下源自胚胎外胚层。外胚层被诱导以形成加厚的神经板，然后神经板分化并且其端部最终融合以形成神经管，所有的中枢神经系统源自神经管。中枢神经系统由脑、颅神经和脊髓组成。外周神经系统源自称为神经嵴的神经沟附近的细胞。

神经组织以一个复杂的综合通信网络分布在整个身体中。神经细胞(神经元)与回路(从非常简单到非常复杂的高级回路)中的其它神经元通信。神经元进行实际的信息传输和整合，而被称为神经胶质细胞的其它神经组织细胞通过支持、保持、防护和补养神经元来协助神经元。在脑中，神经胶质细胞比神经元多约10倍。神经胶质细胞创造神经元功能所需的微环境，并且有时它们协助神经处理和活动。神经元是兴奋性细胞。这意味着在适当刺激时，能够启动可以传播跨越细胞膜以传送信息到远处细胞的动作电势。神经元是独立的功能单元，其负责刺激的接收、传输和加工。

一般而言，神经元由三部分组成：细胞体，细胞核和细胞器位于细胞体重；树突，其是由细胞体伸出的从环境或其它神经元接收刺激的突起；和轴突，其是从细胞体伸出的用于将神经脉冲传送到其它细胞的长的单个突起。轴突通常在其远端枝化并且在另一细胞终止的每个枝具有球形端。端球与相邻细胞的相互作用形成称为突触的结构。突触专门用于接收信号并且将其转换为电势。

在人体中发现的大多数神经元是多极的，这意味着它们具有多于两个细胞突起，其中仅有一个是轴突，而其余的突起是树突。视网膜或嗅粘膜的两极神经元具有一个树突突起和从细胞体脱落的轴突。在脊髓神经节中发现的假单极神经元使得由树突获得的感觉脉冲能够直接传输到轴突，而无需通过细胞体。神经元可以根据功能来分类。感觉神经元参与感觉刺激的接收和传送。运动神经元发送脉冲以控制肌肉和腺体。其他神经元、中间神经元作为功能网络的一部分充当神经元之间的中间网络。

突触是专门的功能性细胞接点(junction)，用于传播细胞信号。大多数突触是化学突触，其中突触前末梢中的囊泡含有化学信使，该化学信使在突触前膜被刺激时释放到突触间隙中。化学信使扩散通过突触间隙以结合到突触后膜中的受体。这诱导突触后膜的极化状态的改变，影响细胞行为。一种特殊类型的突触是神经肌肉接点。超过35种神经递质是已知的，并且大多数是小分子(一氧化氮，乙酰胆碱)、儿茶酚胺(去甲肾上腺素，血清素)、或神经活性肽(内啡肽，血管加压素)。一旦使用，神经递质即通过酶分解、扩散或突触前细胞的内吞作用而快速地被清除。

一些神经元被包裹在称为髓鞘的绝缘材料中。这种富含脂质的材料由神经胶质细胞(外周神经系统中的雪旺氏细胞)和中枢神经系统中的少突胶质细胞形成。这种绝缘通过减少必须经退极化的膜表面积使得能够更快速的神经传导。在有髓鞘的神经元中，神经脉冲跨越轴突的长度从一个无髓鞘段跳跃到另一个无髓鞘段。正是组织中的髓鞘并且缺乏神经元细胞体使得一些神经组织在较大的外周神经中呈现为白色以及脑的白质。称为星形细胞的其它神经胶质细胞参与了结构的完整性、神经元营养和维持神经组织的微环境。星形细胞通过间隙接点与另一星形细胞直接通信，并且通过调节局部环境在神经元的照料中能够影响神经元的存活。室管膜细胞沿脊髓和脑室排列并且分泌脑脊髓液。称为小胶质细胞的其它小神经胶质细胞是吞噬细胞，它们与成年中枢神经系统的发炎和修复有关。

神经组织是兴奋性组织，其能够接收和传递电脉冲。中央细胞类型被称为神经元。神经元通常具有细胞体、接收输入的树突、和传递电势的轴突。

神经元可以被分类为感觉神经元、运动神经元、分泌神经元或关联神经元。它们通常通过传导速度、直径和称为髓磷脂的专门化脂蛋白绝缘的存在或不存在来分类。类型A纤维是有髓鞘的并且能够以12-120m/s传导脉冲。类型B也是有髓鞘的纤维，但是它们仅以3-5m/s传送脉冲。类型C纤维是无髓鞘的、直径小且非常慢(2.5m/s)。类型A纤维的一个例子是支配腓肠肌的运动神经元。自主节前传出神经元是类型B纤维的一个例子，并且携带弥温性疼痛信息的感觉神经元是慢类型C纤维的一个例子。

感觉神经元适于从环境检测某些类型的信息。这些包括感知压力或拉伸之类的机械性刺激感受器、温度感受器、视网膜中的光感受器、和化学感受器(诸如味蕾或用于嗅觉的那些)。联络神经元或中间神经元通常存在于脊髓和脑中，其中它们将感觉传入神经元连接到传出运动或分泌神经元。

神经元通过称为突触的结构彼此通信。轴突在含有许多小囊泡的一个或多个末端钮中终止。这些小囊泡充满了称为神经递质的化学物质。虽然依赖于神经元可以使用其它化学物质如去甲肾上腺素、血清素和GABA，但乙酰胆碱是突触处最通常的神经递质。当脉冲从轴突向下移动并到达终钮时，囊泡与神经元膜融合并且释放神经递质。然后，化学物质扩散通过窄突触间隙到接收神经元突触后膜上的该化学物质的特异性接受器。

神经递质与接受器的相互作用导致膜电势的改变，膜电势的变化可以诱导出新的脉冲突触后神经元。酶乙酰胆碱酯酶存在于突触中以分解乙酰胆碱并且终止刺激。其它神经递质被分解或被带回到突触前神经元以终止刺激。

在中枢神经系统中，许多神经元可以聚集在单个神经元上。当突触前神经元的每个将神经递质释放到其具有突触后神经元的突触中时，出现整合和加和的局部膜电势。这些输入信号可以是抑制或刺激。如果得到的加和的膜电势达到了神经元的最小阈值，则将启动动作电势。

动作电势通过跳跃性传导在远离细胞体的一个方向上传送。最快速的神经元被覆盖在髓鞘中，髓鞘以由称为郎飞氏结的赤裸神经元膜的节点分隔开的离散区段排列。在跳跃式传导中，电势从一个节点跳跃到一个节点，由此减少参与动作电势传导的膜面积并且加快传导。

在神经系统中发现的非神经细胞被称为神经胶质细胞。星形细胞是最多的并且提供神经元的支持和营养。小胶质细胞是对神经组织特异的小吞噬细胞。沿脑室系统和脊髓的中央管排列并且制造脑脊髓液的细胞称为室管膜细胞。在中枢神经系统中，少突神经胶质细胞形成多个神经元的髓鞘的区段。在外周神经系统中，髓鞘的每个区段由单一雪旺氏细胞(schwanncell)形成。

中枢神经系统

中枢神经系统(CNS)由脑和脊髓组成。除了由骨颅骨和脊椎提供的保护之外，脑膜(硬脑膜、蛛网膜和软脑膜)也保护和滋养CNS。脑脊髓液存在于珠网膜下腔、脊柱的中央管和脑室中。软脑膜是最内层并且附着到神经组织。软脑膜和硬脑膜之间是蛛网膜层。坚韧的纤维性硬脑膜恰好位于颅骨下方。

脑可以被分为前脑、中脑和脑干三个基本区域。前脑包括丘脑、下丘脑、基底神经节和大脑。大脑负责意识思维、感觉演绎、所有自愿的运动、心智能力和情绪。

脑组织可以分为结构区和功能区。大脑的表面被卷积到脑回(脊)和脑沟(槽)。皮质感觉区域和运动区域可分别映射到中央后回和中央沟。感觉区域接收来自身体的相反侧的丘脑处理后投射的感觉信息。具有更多感觉神经末梢的身体的那些部分通过更多的皮层感觉区表示。运动区控制对侧肢体的随意肌运动，但是联合区对于运动的启动是重要的。

大脑是脑的最大部分并且被分成具有多个叶片的两个半球，左半球和右半球。额叶含有运动区、布洛卡言语区、联合区并且发挥智力和行为的功能。顶叶包含感觉区并且发挥感觉和听觉功能。初级视觉联合区位于枕叶中并且颞叶包含听觉联合、嗅觉和记忆存储。

丘脑位于大脑皮层和脑干之间。除了嗅觉之外的所有感觉输入在投射到大脑的其它区域之前均在此处进行处理。下丘脑位于丘脑下方并且负责处理内部刺激和内部环境的维护。血压、体温、心率、呼吸、水分代谢、渗透压、饥饿和神经内分泌活动的瞬间无意识的控制均在此处处理。从垂体后叶释放催产素和ADH的神经内分泌细胞的细胞核位于下丘脑中。

基底节(尾状核、苍白球、黑质、丘脑底核、红核)是嵌入大脑的每个半球内的神经元群体。它们参与控制复杂的运动控制、信息处理和无意识的总量有意运动。

脑干包括延髓和脑桥。延髓包含用于控制呼吸、心脏和血管舒缩反射的重要功能区和中继中心。脑桥包含参与呼吸调节的呼吸调整中心。

小脑位于脑干上方并且使用别处发生的有关身体的位置、动作、姿势和平衡的感觉信息。运动不是在小脑中启动的，但是其对于协调运动是必要的。

外周神经系统

外周神经系统包括位于脑和脊髓外部的神经、神经节、脊髓神经和脑神经。十二个脑神经起因于位于脑干中的核并且传送到携带脉冲的特定位置，以控制各种自主神经功能如嗅觉、视觉、流涎、心率和皮肤感觉。脑神经通常是混合的，因为它们携带感觉和运动成分，但是它们可以仅具有运动或感觉纤维。下表列出了脑神经以它们的功能。

表1-脑神经

外周神经系统的感觉部分接收来自各种类型的接受器的输入，对其加工并且发送到中枢神经系统。感觉输入可以来自如在本体感觉(关节和肌肉的位置感)中的内部源或来自如皮肤上的压力或热的感觉的外部源。由特定脊髓神经支配的皮肤区域被称为皮区。传入纤维收集感觉输入并传送到脊髓，汇聚于丘脑，并最后结束于大脑的感觉皮层。具有更多感觉接受器的那些区域(即指尖和嘴唇)对应于脑的感觉皮层上的较大区域。携带本体信息的纤维也被分散到小脑。几乎所有的感觉系统将脉冲传送到丘脑的部分。大脑皮层参与意识知觉和感觉刺激的解释。

通过自主神经和躯体传出神经系统发生向肌肉和腺体的运动输入。关节、肌腱和肌肉的CNS神经支配经由躯体传出神经系统传输。一些肌肉响应由脊髓反射处理。这样的一个例子是，当手指接触热炉时看到撤回反射。移除手指的运动在痛觉到达脑之间通过简单的脊髓反射发生。显然，这是一种保护机制，以避免进一步的损伤。运动输入至腺体和平滑肌通常经由自主神经系统发生。

大部分器官接收来自自主神经系统的两个分支的输入。在该器官或组织中，一个分支通常是兴奋性的而另一个是抑制性的。自主神经系统的交感神经分支起到为生理压力准备身体的作用。交感神经分支的刺激像是在身体准备以响应运行或战斗中踩油门。看到了诸如增加的心率、气道扩张和从糖原储备的葡萄糖动员等效果。交感神经从第1脑椎上升到第4腰椎。它们具有短的节前神经元，节前神经元结束于沿脊柱定位的链节之一中。乙酰胆碱是在具有长节后神经元的突触处的神经递质，其然后传送到靶组织，此处在大多数交感神经末梢处释放支甲肾上腺素。少数交感神经节后神经元(诸如支配汗腺或骨骼肌血管的那些)释放乙酰胆碱。

副交感神经分支发挥经由从CNS的头部和骶骨区域出现神经元抵消交感神经分支的作用。例如，副交感神经刺激收缩气道并降低心率。其调节休息活动诸如消化、排尿和勃起。长节前神经元在接近末端器官的突触处释放乙酰胆碱。短节后神经元也在效应器组织上释放乙酰胆碱。

治疗组合物

在一个实施方式中，本发明涉及用于以神经退行性疾病为特征的各种疾病的治疗。以这种方式，通过提供抑制神经元退化的化合物，可以将本发明的治疗化合物给予患有或易于患有该疾病的人类患者。具体地，该疾病与脑的神经变性疾病、神经细胞的损失(特别是在海马和大脑皮质中)、减少的神经递质、脑血管退化、脊椎中的压碎神经和/或认知能力的丧失有关。

治疗化合物的配制在本领域中一般是已知的并且可以方便地参考Remington's Pharmaceutical Sciences,第17版,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,美国。例如，每天每千克体重量可以给予约0.05μg至约20mg。可以调整剂量方案以提供最佳的治疗反应。例如，每天可以给予多个分剂量或者可以根据治疗情况的紧急程度所指出的按比例减少剂量。活性化合物可以以方便的方式给予，例如通过口服、静脉内(在水溶性的情况)、肌内、皮下、腹腔内、经鼻、皮内或栓剂途径或植入(例如，使用缓慢释放分子通过腹膜内途径或通过使用细胞(例如体外致敏的单核细胞和树突状细胞)并继转移到接受者)。根据给药途径，可能需要将肽包覆在材料中以保护其不受酶、酸和可能失活所述成分的其它天然条件的作用。

例如，肽的低亲脂性将使得它们在胃肠道中被能够裂解肽键的酶破坏并且在胃中被酸水解。为了通过除了肠胃外给予之外的方式给予肽，它们将被材料包覆或与材料一起给予以防止其失活。例如，肽可以在佐剂中给予，与酶抑制剂一起给予或在脂质体中给予。本文所考虑的佐剂包括间苯二酚、非离子表面活性剂如聚氧乙烯油醚和正十六烷基聚乙烯醚。酶抑制剂包括胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸酯(DEP)和抑肽酶。脂质体包括水包油包水CGF乳液以及常规的脂质体。

活性化合物也可以胃肠外给予或腹膜内给予。也可以制备处于甘油液体聚乙二醇、以及它们的混合物或在油中的分散体。在普通的存储和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。

适于可注射使用的药物形式包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散体和用于无菌可注射溶液或分散体的临时制备的无菌粉剂。在所有情况下，所述形式必须是无菌的并且必须是流体，其程度是存在易于注射性。其在制造和存储的条件下必须是稳定的，并且必须保存防止微生物如细菌和真菌的污染。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们的合适混合物和植物油。通过使用包衣如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持所需的粒径和通过使用表面活性剂能够维持适当的流动性。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂可以带来对微生物作用的防止，例如氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)可以带来可注射组合物的延长吸收。

通过将所需量的活性化合物与所需的以上列举的各种其它成分并入到适合的溶剂中，然后通过无菌过滤，制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种无菌活性成分并入到无菌赋形剂中制备分散体，该无菌赋形剂含有基础分散介质和所需的来自以上列举的其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从先前的无菌过滤溶液得到活性成分加任何附加所需成分的粉末。

当如上所述适当保护肽时，可以口服给予活性化合物，例如与惰性稀释剂或与可同化的可食用载体一起，或其可以被包封在硬或软明胶胶囊中，或者其可以被压缩成片剂，或其可以被直接并入饮食的食物中。对于口服治疗给药，活性化合物可以与赋形剂合并并且以可摄入的片剂、口含片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、干胶片等的形式使用。此种组合物和制剂应当含有按重量计至少1％的活性化合物。当然，该组合物和制剂的百分比可以改变并且可以方便是为单位重量约5％至约80％。此种治疗有用的组合物中活性化合物的量是使得会获得适合剂量。优选的根据本发明的组合物或制剂经被制备以便口服单位剂型含有约0.1μg至2000mg的活性化合物。

片剂、丸剂、胶囊等可以含有以下成分：粘结剂，如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂，如硬脂酸镁；并且可以添加甜味剂，如蔗糖、乳糖或糖精，或者调味剂诸如薄荷、冬青油、或樱桃调味剂。当单位剂型是胶囊时，除了以上类型的材料，其还可以含有液体载体。各种其它材料可以作为包衣存在或以其它方式修改剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以包衣有虫胶、糖或两者。糖浆或酏剂可含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和丙酯、染料和调味剂如樱桃或橙调味剂。当然，在制备任何单位剂型中使用的任何材料均应当是药用纯的并且在使用量上基本上无毒。另外，活性化合物可以被并入到缓释制剂和配制品中。

如本文中所使用的，“药学上可接受的载体和/或稀释剂”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。将此种介质和试剂用于药物活性物质的用途在本领域中是众所周知的。除非任何常规介质或药剂与活性成分不相容，否则可以预期其在治疗组合物中的使用。补充活性成分也可以并入到该组合物中。

将肠胃外组合物配制成易于给予且剂量均匀的单位剂型是特别有利的。如本文中所使用的单位剂型是指适合作为用于待治疗的哺乳动物受试者的单位剂量的物理离散单元；含有经计算的预定量的活性材料的每个单元与所需的药物载体一起产生所需的治疗效果。本发明的单位剂型的规格由如下条件决定且直接依赖于如下条件：(a)活性材料的独特特性和欲实现的特定治疗效果，和(b)为在患有身体健康受损的疾病病况的活受试者中治疗疾病，复合此种活性成分领域中的固有限制。

为了以有效量方便和有效的给予，将主要活性成分与适合的药学上可接受的载体复合为单位剂型。例如，单位剂量形式可以含有0.5μg至约2000mg的量的主要活性化合物。以比例表示，活性化合物通常以约0.5μg/ml存在于载体中。在含有补充活性成分的组合物的情况下，剂量通过参考通常剂量以及所述成分的给予方式来确定。

递送系统

各种递送系统是已知的并且可以被用来给予本发明的化合物，例如包封在脂质体、微粒、微胶囊，能够表达该化合物的重组细胞、受体介导的内吞作用、作为逆转录病毒或其他载体的一部分的核酸的构建等。引入的方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。该化合物或组合物可以通过任何方便的途径给予，例如通过输注或推注、通过上皮或粘膜皮肤衬里(例如，口腔粘膜，直肠和肠粘膜等)的吸收、或可与其它生物活性剂一起给予。给予可以是全身性的或局部的。另外，可以期望通过任何适合的途径将本发明的药物化合物或组合物引入到中枢神经系统中，适合的途径包括室内和鞘内注射；室内注射可以通过例如附接到贮存器(诸如Ommaya贮存器)的室内导管来协助。还可以采用肺部给予，例如通过使用吸入器或喷雾器以及具有气雾剂的配制品。

在一个具体的实施方式中，可以期望将本发明的药物化合物或组合物局部地给予到需治疗的区域；这可以通过例如但非限制的如下方式实现：在手术过程中局部输注，通过注射、通过导管的方式、通过栓剂的方式、或通过植入物的方式局部应用(例如与手术后的伤口敷料一起)，所述植入物为多孔、非多孔或凝胶状材料并且包括膜例如硅橡胶膜或纤维。优选地，当给予蛋白质(包括抗体或本发明的肽)时，必须小心使用蛋白质不吸收的材料。在另一个实施方式中，该化合物或组合物可以囊泡(特别是脂质体)递送。在又另一个实施方式中，该化合物或组合物可以受控释放系统来递送。在一个实施方式中，可以使用泵。在另一个实施方式中，可以使用聚合材料。在又一个实施方式中，可以将受控释放系统放置靠近治疗靶(即脑)，因此仅需要全身剂量的一小部分。

如果组合物的给予可以被受者动物耐受并且适合给予那个动物，那么该组合物可以被认为是“药理学或生理学上可接受的”。如果给予的量是生理学显著的，那么这样的药剂可以被认为是以“治疗有效量”给予。如果药剂的存在导致了受者患者生理学可检测的变化，那么该药剂是生理学上显著的。

本发明并不限于本文所描述的具体实施方式的范围。确实，除了本文所描述的实施方式，从以上描述和附图中本发明的各种修改对本领域技术人员而言将是显而易见。此种修改旨在落入所附权利要求书的范围内。为了说明本发明提供下列实施例，而非限制。

实施例

实施例1-材料和实验地

实施例1.1

大鼠肾上腺髓质PC12嗜铬细胞瘤神经元细胞购自ATCC(Manassas,VA)。包括Dulbecco改良的Eagle氏培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)和马血清的细胞培养材料购自Mediatech Inc.(Manassas,VA)。2.5S神经生长因子购自BD Biosciences,Inc.(Bedford,MA 01730)。抗神经元类IIIβ-微管蛋白的TUJ-1单克隆兔抗体购自Covance Inc.(Gaithersburg,MD)。抗乙酰化α-微管蛋白的单克隆小鼠抗体购自Santa Cruz Biotech Inc.(Santa Cruz,CA)。山羊血清Texas山羊抗兔IgG抗体、Alexa488山羊抗小鼠IgG抗体、4',6-二脒基-2-苯基吲哚、二乳酸盐(DAPI)和购自Molecular Probes-Invitrogen(Eugene,OR)。诺考达唑购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。神经突向外生长检测试剂盒购自Millipore(Billerica,MA)。所有脂质均购自Avanti Polar Lipids,Inc.(Alabaster,AL 35007)。重组人PTEN蛋白质和孔雀石绿磷酸盐检测试剂盒购自R&D Systems,Inc.(Minneapolis,MN 55413)。人PTEN c-DNA购自OriGene Inc.(Rockville,MD 20850)。Lipofectamine^TM 2000转染试剂购自Invitrogen^TM。Tris-甘氨酸梯度微型凝胶(10～20％)购自Novex^TM。所有抗体均购自Santa Cruz Biotechology,Inc.(Santa Cruz,CA 95060)。所有其它材料均购自Fisher Scientific Inc.。

实施例1.2－肽设计

使用PTEN C-末端区域(AA352～403)作为模板设计了作为潜在PTEN抑制剂的TGN肽。所有的TGN肽在它们的N-末端包括PTD(肽转移结构域)序列(RRRRRRRR)以增加膜渗透性。TGN-1肽具有32个氨基酸，其中三个是磷酸化的丝氨酸残基(MW＝4244.18Da,序列：RRRRRRRR-VTPDVpSDNEPDHYRYpSDTTDpSDPE-酰胺(SEQ ID NO:4)，pS＝磷酸化的丝氨酸)。TGN-2肽具有36个氨基酸，其中两个是磷酸化的丝氨酸残基(MW＝4776.28Da,序列：HYRYpSDTTDpSDPENEPFDEDQHTQITKV-酰胺(SEQ ID NO:6),pS＝磷酸化的丝氨酸)。TGN-3肽与TGN-2肽具有相同的氨基酸序列，但是没有经修饰的残基并且两个丝氨酸残基被替换为缬氨酸(MW＝4640.99Da，序列：RRRRRRRR-HYRYVDTTDVDPENEPFDEDQHTQITKV-酰胺(SEQ IDNO:8))。TGN-4肽被设计为TGN-1肽的乱序肽(MW＝4004.19Da，序列＝RRRRRRRR-SDDEYTDNPDSRYVSDTPVDTEH-酰胺(SEQ ID NO:10))，并且TGN-5肽被设计为TGN-2/TGN-3乱序肽(MW＝4616.88Da，序列＝RRRRRRRR-DEHDTEYTPDYRQETHFNSQPTDKSDVI-酰胺(SEQ ID NO:12))。所有的肽均由21^st Century Biochemicals Inc.(Marlboro,MA 01752)合成。纯度>95％并且由HPLC确认。

实施例1.3－体外PTEN活性检测

设计体外PTEN活性检测以检查将磷脂酰肌醇三磷酸酯(PIP₃)转化为磷脂酰肌醇二磷酸酯(PIP₂)并产生磷酸根离子(P_i)的PTEN脂质磷酸酶活性。将l,2-二辛酰基-sn-丙三氧基-3-二氧磷基-(1’-肌-肌醇-3,4,5-三磷酸酯)(C8-PIP₃)用作PTEN底物并且与其它磷脂一起制备为脂质囊泡(脂质体)，因为作为脂质磷酸酶的PTEN是界面酶。对于脂质体制备，将C8-PIP₃、DOPS(1,2-二油酰基-sn-丙三氧基-磷酸丝氨酸)和DOPC(1,2-二油酰基-sn-丙三氧基-磷酸胆碱)与800μL脂质体缓冲液(50mM Tris,100mM NaCl,10mM MgCl₂,5mM DTT,pH＝8.0)混合在一起，以得到0.1mM C8-PIP₃、0.25mM DOPS和0.25mM DOPC的最终浓度。然后在4℃下将脂质混合物超声处理30分钟以产生脂质体。超声处理之后，短暂离心脂质体溶液以除去残留的脂质。

为了PTEN活性检测，将20ng重组人PTEN蛋白质与40μL完成的脂质体溶液混合。将PTEN检测缓冲液(1mM Tris,20mM DTT和0.5％NP-40,pH＝8.0)添加到100μL最终体积。然后，在37℃水浴中将反应混合物温育30分钟。在温育之后，使用孔雀石绿磷酸盐检测试剂盒检测由PTEN蛋白质产生的无机磷酸根离子。首先，将50或100μL每种反应混合物转移到96-孔板中并且分别加入10或20μL孔雀石试剂A，在室温下温育10分钟。在完成温育之后，再次向每个样品中加入10或20μL孔雀石试剂B，并且在室温下再温育20分钟。通过使用分光光度计在620nm下测量OD(光密度)进行磷酸根离子的检测。为了确定TGN肽(10μΜ)对重组PTEN活性的抑制效果，以1mM浓度制备每种TGN肽的DMSO溶液，并且将1μL TGN肽溶液与重组PTEN蛋白质、脂质体和PTEN检测缓冲液混合，并且通过遵循上述协议检测PTEN活性。

实施例1.4–体外IC50检测

通过使用不同浓度的TGN-1和TGN-2肽进行体外PTEN活性检测来测量IC₅₀值。用于IC₅₀检测的TGN-1或TGN-2肽的浓度范围分别为0.1、1、10、30、60和100μΜ以及0.05、0.1、0.5、1、5、10和100μΜ。所有数据均代表三重试验并且IC₅₀值通过Prism 5软件(GraphPad Software)计算。

实施例1.5–PC12细胞培养

将PC12大鼠嗜铬细胞瘤细胞接种在6-孔板中(0.6xl0⁶细胞/孔)并且使用含有7.5％FBS和7.5％山羊血清的DMEM培养基进行培养。在细胞汇合度达到约60～70％后，向PC12细胞中加入NGF(神经生长因子，50ng/mL)以用于分化并且再温育5天。然后，向每个孔中加入含有不同量TGN肽的DMSO溶液的新鲜培养基，并且再温育24小时。为了PTEN过表达，将PC12细胞接种在6-孔板中(l.0xl0⁶细胞/孔)并且如上所述使用NGF(50ng/mL)进行分化。首先通过将2～2.5μg人PTEN c-DNA加入到500μLOpti-MEM中，随向所上述稀释的DNA溶液中加入3.75-8.75μLLipofectamine 2000^TM试剂，温和地混合并且在室温下温育25分钟，为每孔转染的细胞制备DNA-Lipofectamine 2000混合物。使用新鲜培养基更换6-孔板中PC12细胞的生长培养基并且向每孔中加入500μLDNA-Lipofectamine 2000复合物以进行转染。在转染之后，在37℃下在5.0％CO₂温育箱中将转染的细胞温育24-48小时，然后检测转基因表达。

实施例1.6–使用PC12细胞的神经突检测

在保持在37℃在5％CO₂温育箱中的T-75cm²烧瓶中，向大鼠肾上腺髓质PC12大鼠嗜铬细胞瘤神经细胞补充7.5％牛胎儿血清(FBS)、7.5％马血清(ES)和0.5％青霉素链霉素。在50％汇合度下温和机械地从烧瓶脱附细胞以将细胞分离，并且以分离比1:7培植。

对于神经突保护检测，以2.08xl0⁵细胞/支架的接种密度(凭经验确定为最佳接种密度)将PC12细胞接种于6-孔板中，并且温育24-48小时直到细胞汇合度达60～70％。然后，使用NGF(50ng/mL)将PC12细胞分化72-120小时。为了模仿神经突退化，使用诺考达唑(0.5μΜ)处理分化的PC12细胞。在37℃下温育1小时之后，将含有诺考达唑的旧培养基置换为含有NGF(10ng/mL)和/或TGN肽(100μΜ作为最终浓度)的新鲜培养基，并且再温育72小时。通过以下所述的免疫荧光检测分析残留的神经突。

对于神经突向外生长检测，以1.0x10⁵细胞/孔的接种密度将PC12细胞接种于6-孔板。在细胞汇合度达到60～70％时，通过添加NGF(50ng/mL)启动PC12细胞的分化。温育24小时之后，向6-孔板中的孔中加入TGN肽(50μΜ作为最终浓度)，并且再温育两天。以分光光度计使用下述的神经突向外生长试剂盒(Millipore)对神经突状态定量。

实施例1.7–蛋白质印迹

在培养之后，从6-孔板中收集PC12细胞，并且使用台式离心机离心下来以制备细胞粒料(13,000rpm,在室温下5min)。弃去上清液，并且使用3～500μL 1x PIPA缓冲液(Invitrogen)再悬浮细胞粒料。通过使用液氮和37℃水浴的冻融循环(3-4次)，随后使用27G针重复喷洒再悬浮的细胞，以裂解再悬浮的细胞。在4℃在10,000g下将裂解的细胞离心20分钟，并且收集上清液，使用BCA蛋白浓度试剂盒(Thermo Scientific)检测总蛋白质浓度。

使用抗-磷酸化Akt抗体进行蛋白质印迹以检查PC12细胞中内源性Akt蛋白的磷酸化水平。使用Novex^TM梯度微型凝胶(10～20％)进行SDS-PAGE。将SDS-PAGE凝胶中的细胞裂解物样品和蛋白质转移到PVDF膜上，随后使用封闭液(5％牛乳处在含有0.1％吐温-20的1X TBS缓冲液中)温育。以1:500稀释度(含有0.1％吐温-20的1X TBS缓冲液)将抗磷酸化Akt抗体用作主要抗体。以1:8000稀释因子将HRP-偶联的抗-兔抗体用作次要抗体。还使用抗PTEN抗体(1:400稀释因子)检查了内源性或过表达的PTEN蛋白质的表达水平。将β-肌动蛋白的表达水平检测为负载对照。

实施例1.8–神经突定量

对于总神经突的定量，我们使用神经突向外生长检测试剂盒(Millipore)与分光光度计。在37℃下使用新鲜的细胞外基质(ECM)蛋白质(10μg/mL胶原蛋白)将Millicell插入物(EMD Millipore,Billerica,Massachusetts,USA)的下侧面涂布2小时后，对每个插入物接种PC12细胞，然后将所述插入物放置在24孔板的每个孔中。将细胞在室温下保持15分钟以便附着，然后向每孔中加入总计700μl分化培养基(膜下和膜上分别为600μl和100μl)。使神经突延伸3天，然后使用-200℃甲醇在室温下将插入物固定20分钟，随后通过新鲜PBS冲洗。之后，在室温下将插入物放置在400μl神经突染色液中30分钟，并且在湿润的棉签除去细胞体之后，将每个插入物放置在100μl神经突染色提取液(Millipore)中。最后，将溶液转移到96孔板中并且在分光光度计上读取562nm下的吸光度进行定量。

实施例1.9-免疫荧光

细胞培养后，除去生长培养基，在室温下使用10％福尔马林将细胞固定15分钟。随后，使用0.5M甘氨酸在PBS中的溶液洗涤细胞并且在40℃下使用5％山羊血清和0.2％Triton-X在PBS中的溶液封闭过夜。对于使用主要抗体的免疫染色，在40℃下，使用用于总神经突染色的针对神经元类IIIβ-微管蛋白的TJU-1单克隆兔抗体(1:200稀释)、和用于稳定神经突染色的针对乙酰化α微管蛋白的单克隆小鼠抗体(1:100稀释度)，将细胞温育过夜。一旦使用1X PBS缓冲液将细胞洗涤三次后(10分钟/洗涤)，加入次要抗体-用于TUJ-1抗体的Texas山羊抗兔IgG(1:200稀释度)和用于乙酰化α微管蛋白的Alexa488山羊抗小鼠IgG(1:200稀释度)抗体，并且在40℃温育过夜。随后，将细胞在1X PBS缓冲液和1μg/ml4',6-二脒基-2-苯基吲哚中洗涤三次(10分钟/洗涤)，并且在第二次洗涤步骤之后加入二乳酸盐(DAPI)以染色细胞核。在最终的洗涤后，准备细胞以待使用荧光显微镜检查。Alexa488-IgG(绿)的激发和发射波长是488nm/519nm，而Texas山羊抗兔IgG(红)为595/615nm，并且DAPI为405/461nm。在不同的放大倍数下获取细胞的荧光图像，并且通过"ImageJ"图像处理和分析程序(Public Domain by Wayne Rasband,NIH,Bethesda,Maryland,USA)进行分析。

实施例2–结果

实施例2.1–使用PTEN磷酸化位点作为模板设计TGN肽

已知体内阻断作为脂质磷酸酶的PTEN活性有效于神经损伤后轴突的再生[Park et.al 2008,Christie et.al 2012]。我们研究了PETN-膜关联机理以设计阻断细胞膜表面上PTEN定位的潜在PTEN抑制剂。根据先前的研究[Lee et.al 1999；Leslie et.al 2008]，PTEN蛋白质具有两个功能结构域－磷酸酶结构域和C2结构域－并且还在C-末端区域中具有“磷酸化位点”，该“磷酸化位点”通过磷酸化-脱磷酸化过程充当控制PTEN蛋白质构象变化的“开关”[Das et.al 2003；Leslie et.al 2008]。为了PTEN的完全脂质磷酸酶活性，在“磷酸化位点”的磷酸化的丝氨酸/酪氨酸的脱磷酸化应当发生，以便在PTEN-膜关联之前改变PTEN构象。经由N-末端PIP2结合基序和C-末端PDZ结构域结合基序的额外结合将PTEN蛋白质定位于细胞膜上完全PTEN活性所需的适合位置[Walker et.al 2004；Molina et.al2010]。因此，我们决定使用PTEN“磷酸化位点”加上PDZ-结构域结合基序作为模板，用于设计作为潜在的PTEN抑制剂的TGN肽，其扰乱PTEN-膜关联(图1A)。

TGN-1肽模仿“磷酸化位点”的氨基酸序列(365-388)，并且TGN-2和TGN-3肽模仿包括“磷酸化位点”和PDZ结构域结合基序(399-403)的C-末端区域的氨基酸序列(376-403)。由于“磷酸化位点”中丝氨酸残基的磷酸化对于PTEN构象变化是关键[Leslie et.al 2008；Odriozola et.al 2007]，所以TGN-1肽被修饰以在“磷酸化位点”内部包括三个磷酸化的丝氨酸残基(Ser 370、Ser380和Ser385)。TGN-2肽包括两个磷酸化的丝氨酸残基(Ser380和Ser385)。在TGN-3肽中，两个丝氨酸残基(Ser380和Ser385)被替换为缬氨酸以用于比较。TGN-4和TGN-5肽分别被设计成乱序TGN-1和TGN-2肽序列。所有的TGN肽均被修饰以在N-末端包括八个精氨酸残基作为肽转移结构域(PTD)，从而增加细胞膜渗透性(图1B)。

实施例2.2-TGN-1和TGN-2肽示出对体外PTEN活性的特异性抑制作用

使用体外PTEN活性检测测试了合成TGN肽的PTEN抑制作用。选择二辛酰基磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸酯(二C8-PIP₃)作为PTEN的底物并且用两种不同的磷脂-二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)和二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)制备脂质囊泡(脂质体)。将脂质与脂质体缓冲液混合并且通过超声处理变成脂质体(总脂质浓度＝0.6mM)。使用20ng重组人PTEN蛋白质将制备的脂质体(0.1mM二-C8 PIP₃)在室温下温育30分钟，以通过将C8-PIP3转化为C8-PIP2并且产生磷酸根离子检测PTEN活性。使用孔雀石绿试剂盒测量由PTEN产生的磷酸根离子(图2A)。检查10μΜ每种TGN肽对PTEN活性的抑制作用。如在图2B中看到的，TGN-1肽和TGN-2肽均显著阻断了PTEN活性(与阳性对照相比，使用TGN-1将PTEN活性降低至54％，而使用TGN-2将PTEN活性降低至31％)。另一方面，与TGN-1或TGN-2相比，TGN-2肽显著出有限的抑制(86％)。另外，TGN-4和TGN-5肽均未显示出PTEN活性的显著抑制，这表明TGN-1肽和TGN-2肽的PTEN抑制是序列特异性的。使用重组PTEN蛋白质和二C8-PIP₃脂质分子的体外PTEN活性检测仅未能显示出PTEN活性(数据未示出)。

还以剂量依赖性方式(0～100μΜ范围)使用体外PTEN活性用TGN肽测量了TGN肽的IC₅₀值。TGN-1肽、TGN-2肽和TGN-3肽的计算IC₅₀值分别为19.93μΜ、87.12μΜ和4.83μΜ(图2C)。

实施例2.3–TGN-1肽在体内促进PI3K-Akt信号通路

使用PC12大鼠嗜铬细胞瘤细胞系确定TGN-1肽对神经元细胞中的PI3K信号通路的影响。在37℃下，使用TGN-1肽(10μΜ和100μΜ)或TGN-4肽(10μΜ)将分化的PC12细胞(使用PTEN c-DNA转染以便PTEN过表达，或处于自然状态)温育24小时。如在图3A的图表中看到的，如果TGN-1肽实际上阻断了PTEN活性并且抑制了PTEN对PI3K活性的拮抗作用，那么PI3K信号通路中Akt蛋白质的活化(磷酸化)水平应当增加。使用抗-磷酸化Akt蛋白质抗体的蛋白质印迹数据显示，使用TGN-1肽处理的PC12细胞中内源性Akt蛋白质的活化(磷酸化)水平以TGN-1肽剂量依赖性方式增加(图3B和图3C)。使用TGN-4肽或DMSO处理的PC12细胞未增加AKT蛋白质的活化水平，这表明Akt蛋白质磷酸化水平的促进由TGN-1肽特异性的触发。由于内源性PTEN(图3B)或过表达的PTEN(图3C)的表达水平在使用TGN肽或DMSO处理后未显示出活性差异，所以很显然，TGN-1肽特异性抑制PTEN活性，从而抑制PTEN对PI3K信号通路的下调作用，并且促进PI3K-Akt信号通路。

实施例2.4–TGN-1和TGN-2肽在神经元细胞培养物中显示出神经营养作用，包括神经保护作用

我们在分化的神经元细胞上研究了TGN肽抵抗神经突退化的作用。通过使细胞与诺考达唑接触干扰细胞的神经突微管动力学，以在PC12细胞中诱导神经突退化。首先使用诺考达唑(0.5μΜ)处理分化的大鼠PC12细胞，并且使用含有NGF(50ng/mL)和TGN肽(100μΜ)的新鲜培养基温育72小时。使用两种不同的微管蛋白抗体(用于稳定神经突的乙酰化α-微管蛋白抗体和用于总神经突的TUJ-1β-微管蛋白抗体)的免疫荧光分析表明，TGN-1肽和TGN-2肽经由微管稳定化明显地延迟了诺考达唑-诱导的神经突退化(图4A)。我们进一步研究了TGN肽对PC12细胞的神经突向外生长的影响。向正分化的PC12细胞中加入TGN肽实际上促进了神经突发育(通过TGN-1增量2.4倍，且通过TGN-2增量1.6倍，图4B)。综合来看，我们的TGN-1肽和TGN-2肽显示了神经营养作用以及保护成熟神经突不退化的活性。

参考文献

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所有本文提及的参考文献均通过引证将它们的全部内容并入。

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仅使用常规实验，本领域技术人员将认识或能够确定本文具体描述的本发明具体实施方式的许多等同物。

Claims (18)

1.一种在神经损伤部位再生神经或减弱神经退化的方法，包括在损伤的神经处或附近区域给予神经再生量或神经退化减弱量的磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)脂质磷酸酶抑制肽。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，PTEN抑制肽是经修饰的PTEN肽或它的片段，其中磷酸化位点被修饰以便所述磷酸化位点中的丝氨酸或苏氨酸被磷酸化。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，磷酸化的丝氨酸或苏氨酸位于位置Thr-366、Ser-370、Ser-380、Thr-382、Thr-383或Ser-385。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，磷酸化的丝氨酸或苏氨酸位于位置Ser-370、Ser-380和/或Ser-385。

5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述磷酸化的丝氨酸或苏氨酸位于位置Ser-370、Ser-380和Ser-385。

6.根据权利要求3所述的方法，其中，所述磷酸化的丝氨酸或苏氨酸位于位置Ser-380和Ser-385。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肽是磷酸化位点的肽的片段和/或PDZ结构域结合基序。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肽进一步包含肽转移结构域(PTD)。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述神经损伤处在中枢神经系统中。

10.一种肽，所述肽抑制磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)脂质磷酸酶活性。

11.根据权利要求10所述的肽，其中，所述肽是PTEN肽或它的片段，其中磷酸化位点被修饰以便所述磷酸化位点中的丝氨酸或苏氨酸被磷酸化。

12.根据权利要求11所述的肽，其中，磷酸化的丝氨酸或苏氨酸位于位置Thr-366、Ser-370、Ser-380、Thr-382、Thr-383或Ser-385。

13.根据权利要求12所述的肽，其中，所述磷酸化的丝氨酸或苏氨酸位于位置Ser-370、Ser-380和/或Ser-385。

14.根据权利要求13所述的肽，其中，所述磷酸化的丝氨酸或苏氨酸位于位置Ser-370、Ser-380和Ser-385。

15.根据权利要求13所述的肽，其中，所述磷酸化的丝氨酸或苏氨酸位于位置Ser-380和Ser-385。

16.根据权利要求11所述的肽，其中，所述肽是磷酸化位点的肽的片段和/或PDZ结构域结合基序。

17.根据权利要求11所述的肽，其中，所述肽进一步包含肽转移结构域(PTD)。

18.一种增长、增殖或增强神经细胞的细胞活性的方法，包括使所述神经细胞与磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)脂质磷酸酶抑制肽接触。