WO2010116899A1 - Pten のリン酸化抑制剤又は脱リン酸化剤 - Google Patents

Abstract

PI3K/AKT情報伝達系の活性化あるいはその逆作用を病因のひとつとする疾病の予防薬、進展抑制薬、又は治療薬を提供する。PTENタンパク質のリン酸化部位T382、T383、及びS380からなる群より選択される少なくともひとつの部位のリン酸化を阻害する作用および／または脱リン酸化する作用を有するリン酸化阻害および／または脱リン酸化剤を調製する。あるいは、試験物質における、PTENタンパク質のリン酸化部位T382、T383、及びS380からなる群より選択される少なくとも１つの部位のリン酸化阻害能力または脱リン酸化能力を確認する工程を含む、ＰＴＥＮのリン酸化阻害または脱リン酸化剤のスクリーニングを行う。さらに、得られたＰＴＥＮのリン酸化阻害または脱リン酸化剤に対する抗体に例示される、ＰＴＥＮのリン酸化阻害または脱リン酸化と逆の作用を有する物質を得る。

Description

PTEN のリン酸化抑制剤又は脱リン酸化剤

本発明は、PTEN のリン酸化抑制剤又は脱リン酸化剤に関する。より詳細には、PI3K/AKT情報伝達系を制御するPTEN（Phosphatase and Tensin Homolog Deleted on Chromosome 10）のリン酸化阻害および／または脱リン酸化剤に関し、これを有効成分とする、PI3K/AKT情報伝達系関連疾病の予防薬、進展抑制薬に関する。

PTEN遺伝子は、染色体上の10q23.3に位置し、腫瘍抑制因子として同定されている（非特許文献1および2）。PTENタンパク質は広く全身の細胞に発現しており、イノシトールリン脂質であるフォスファティジルイノシトール　3,4,5-トリフォスフェイト（phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate；PIP3）の脱リン酸化反応を触媒する酵素として知られている。PIP3は、PI3キナーゼ(PI3K)により細胞内で合成され、プロテインキナーゼB(PKB)/ AKTの活性化を引き起こす。PTENは、このPIP3の脱リン酸化反応を担い、フォスファティジルイノシトール　4,5-ビスフォスフェイト（phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate；PIP2に変換する働きがあるとされている。

このようにPTENは、PI3K/AKT情報伝達系を負に制御する（非特許文献3）。逆に、PTENの活性が阻害されると、細胞内にPIP3が蓄積し、PI3K/AKT情報伝達系が活性化する。このようなPI3Ｋ/AKT情報伝達系の恒常的な活性化は、糖尿病、自閉症、いくつかの癌に関与していることが示唆されている(特許文献４)。また、PTEN分子の修飾により、その活性が変化することがわかってきている（非特許文献５および６）。PTENの活性を維持することは、種々の疾患の診断や治療にとって重要である。

Steck PA, Pershouse MA, Jasser SA, Yung WK, Lin H, Ligon AH, Langford LA, Baumgard ML, Hattier T, Davis T, Frye C, Hu R, Swedlund B, Teng DH and Tavtigian SV.(1997)"Identification of a candidate tumour suppressor gene, MMAC1, at chromosome 10q23.3 that is mutated in multiple advanced cancers."Nat.Genet.15, 356-362. Li J, Yen C, Liaw D, Podsypanina K, Bose S, Wang SI, Puc J, Miliaresis C, Rodgers L, McCombie R, Bigner SH, Giovanella BC, Ittmann M, Tycko B, Hibshoosh H, Wigler MH, Parsons R.(1997)"PTEN, a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain, breast, and prostate cancer."Science. 275,1943-7 Li DM, Sun H. (1998) PTEN/MMAC1/TEP1 suppresses the tumorigenicity and induces G1 cell cycle arrest in human glioblastoma cells. Proc. Nat. Acad. Sci. 95: 15406-15411 Vivanco I, Sawyers CL. (2002)The phosphatidylinositol 3-Kinase AKT pathway in human cancer. Nat Rev Cancer. 2: 489-501. Review. Keniry M, Parsons R. (2008) The role of PTEN signaling perturbations in cancer and in targeted therapy. Oncogene 27: 5477-5485. Review. Leslie NR, Downes CP. (2004) PTEN function: how normal cells control it and tumour cells lose it. Biochem J. 2004;382:1-11. Review

　本発明の目的は、PTENのリン酸化阻害および／または脱リン酸化剤またはPTENのリン酸化作用を有する物質を提供することにある。

さらに本発明の目的は、PTENのリン酸化によるPI3Ｋ/AKT情報伝達系の活性化または不活性化を病因とする種々の疾患の予防薬、進展抑制薬、及び治療薬を提供することにある。

そこで、本発明者らは、鋭意検討を行い、PTENの活性の保持にリン酸化阻害および／または脱リン酸化が有効であることを実証し、それに伴うPI3Ｋ/AKT情報伝達系の活性化抑制に、このようなリン酸化阻害および／または脱リン酸化剤が有効であることを見出し、さらにそれと逆作用を有する物質を得ることにも成功し、本発明に至った。

　本発明は、PTENタンパク質のリン酸化部位T382、T383、及びS380からなる群より選択される少なくともひとつの部位のリン酸化を阻害する作用および／または脱リン酸化する作用を有するリン酸化阻害および／または脱リン酸化剤、に関する。

上記リン酸化阻害および／または脱リン酸化剤は、NDRG2タンパク質またはそのペプチド断片であり得る。

　本発明はまた、NDRG2をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入され得る形態で含むPTENのリン酸化阻害および／または脱リン酸化剤、に関する。

本発明はまた、上記いずれかのリン酸化阻害および／または脱リン酸化剤を有効成分とする、PTENのリン酸化によるPI3K/AKT情報伝達系の活性化を病因のひとつとする疾病の予防薬、進展抑制薬又は治療薬、に関する。

上記疾病は、成人T細胞白血病（ＡＴＬ）、膵臓癌、自閉症、皮膚癌、悪性リンパ腫、前立腺癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、卵巣癌、頭頸部扁平上皮癌、食道癌、胆管癌、前立腺癌、褐色細胞腫、陰茎癌、骨肉腫、および精巣癌からなる群より選択される１種であり得る。

　本発明はまた、試験物質における、PTENタンパク質のリン酸化部位T382、T383、及びS380からなる群から選択される少なくとも１つの部位のリン酸化阻害能力または脱リン酸化能力を確認する工程を含む、PTENのリン酸化阻害または脱リン酸化剤のスクリーニング方法、に関する。

上記スクリーニング方法において、試験物質を、PTENタンパク質のリン酸化部位T382、T383、及びS380からなる群から選ばれる少なくとも１つの部位を含むPTENタンパク質または該リン酸化部位を含むPTENタンパク質のペプチド断片と接触させる工程；該試験物質を、PTENタンパク質のリン酸化部位T382、T383、及びS380からなる群から選択される少なくともいずれか１つの部位を脱リン酸化あるいはリン酸化を阻害することを指標に選択する工程が含まれ得る。

上記スクリーニング方法は、PI3K/AKT情報伝達系の活性化を防ぐ薬剤のスクリーニングに用いられ得る。

　本発明はまた、NDRG2タンパク質又はそのペプチド断片に対する抗体を含むPTENのリン酸化促進剤、に関する。

　本発明はまた、上記PTENのリン酸化促進剤を含む、PTENの脱リン酸化によるPI3K/AKT情報伝達系の不活性化を病因の１つとする疾病の治療薬、に関する。

　上記疾病は、糖尿病であり得る。

　本発明はまた、HTLV１又はATL細胞中のPTEN遺伝子のT382、T383、およびS380からなる群より選択される少なくともひとつの部位のリン酸化を阻害および／または脱リン酸化する方法であって、HTLV１又はATL細胞にNDRG2をコードするポリヌクレオチドを導入する工程を含む方法、に関する。

　本発明はまた、KLM-1又はPK45-P細胞中のPTEN遺伝子のT382、T383、およびS380からなる群より選択される少なくともひとつの部位のリン酸化を阻害および／または脱リン酸化する方法であって、KLM-1又はPK45-P細胞にNDRG2をコードするポリヌクレオチドを導入する工程を含む方法、に関する。

本発明によれば、PTENのリン酸化の抑制、あるいはリン酸化したPTENを活性状態に回復することが可能となり、PI3K/AKT情報伝達系の活性化を病因のひとつとする各種の疾病の発症予防、進展抑制、及び治療効果が期待できる。あるいは、それと逆作用を有するリン酸化促進剤の場合には、PI3K/AKT情報伝達系の不活性化を病因とする疾病の発症予防、進展抑制、及び治療効果が期待できる。

PTENタンパク質のリン酸化関連部位を示す。 NDRG2のドメイン構造を示す模式図である。 ATLの進展と細胞の花弁化を示す写真である。 PTENとPI3K/AKT情報伝達系におけるNDRG2をも含めた関与図で、PI3K/AKT情報伝達系の正常な状態（Ａ）とがん化状態（Ｂ）を示す。 (A)はT細胞系の白血病細胞株におけるPTEN遺伝子の発現を示すグラフ、(B)は急性型ATL細胞におけるPTEN遺伝子の発現を示すグラフである。 (Ａ)は白血病細胞株あるいは患者由来細胞におけるPTEN遺伝子の点突然変異検索の結果を示す表、(Ｂ)はATL細胞に対して、PTENが存在する領域のゲノム解析をした結果を示す模式図である。 NDRG2タンパク質の発現低下とPI3K/AKT情報伝達系の活性化の関係を示すウエスタンブロット法による写真で、(A)はATL細胞株及びHTLV-1細胞株におけるPI3K/AKT情報伝達系の活性化状態、(B)は急性ATL細胞株におけるPI3K/AKT情報伝達系の活性化状態を示す。 NDRG2の発現低下によるPI3K/AKT情報伝達系の活性化を示すもので、(A)はPC;膵臓癌、HCC;肝細胞がん、NB;神経芽細胞腫、GC;胃癌におけるウエスタンブロット法による各タンパク質の発現を示す写真であり、(B)は(A)以外の肝臓癌、脳腫瘍、乳癌、大腸癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、口腔扁平上皮癌における同写真である。 ATL細胞におけるPTENとNDRG2タンパク質の状態を示すもので、(A)は293T細胞でPTEN/NDRG2両者を強制発現させた場合のPTEN/NDRG2結合を示す免疫沈降ウエスタンブロット法による写真、(B)はT-ALL細胞株MOLT4における内在性のNDRG2とPTENの通常状態における結合を示す免疫沈降ウエスタンブロット法による写真である。 KK1-ATL細胞におけるNDRG2とPTENタンパク質の局在を示す抗体蛍光染色写真である。 NDRG2の酵素的性質を検討したもので、(A)はpNPPアッセイによる脱リン酸化酵素としての性質を示すグラフ、(B)はフォスファターゼ阻害剤による酵素学的検討を示すグラフと表である。 (Ａ)はNDRG2タンパク質によるPTENの脱リン酸化酵素特異性を示すグラフであり、(Ｂ) はNDRG2タンパク質によるPTENの脱リン酸化酵素特異性を示すウエスタンブロット法による写真である。 (Ａ) はDOTBLOT法によるPTENリン酸化ペプチドに対するNDRG2の脱リン酸化反応の結果を示す写真。(Ｂ)はPTENタンパク質のリン酸化部位のアミノ酸置換によるPI3K/AKT情報伝達系の活性化レベルへの影響を示すウエスタンブロット法の写真である。 PTENの脱リン酸化による細胞増殖能亢進を示すグラフである。 ATL細胞株におけるNDRG2の高発現の作用を示すもので、(A)はPI3K/AKT情報伝達系の活性阻害を示すウエスタンブロット法による写真、(B)は細胞増殖能の低下を示すグラフである。 (Ａ)はNDRG2高発現ATL細胞株を移植したNOGマウスにおける移植細胞の生存期間を示すグラフ、(Ｂ)はNDRG2高発現ATL細胞株における転写調節因子FOXO1タンパク質の回復を示す写真である。 (Ａ)はNDRG2高発現ATL細胞株における核変形の回復を示すグラフと写真、(Ｂ)はNDRG2高発現ATL細胞株におけるTublin重合阻止による核の開放を示す写真である。 NDRG2の発現低下によるPI3K/AKT情報伝達系の活性化を示すもので、(Ａ)は膵臓癌におけるウエスタンブロット法による各タンパク質の発現を示す写真、（Ｂ）は、NDRG２強制発現による同膵臓癌の増殖抑制効果を示すグラフである。 NDRG2遺伝子の発現抑制がもたらす作用を示すもので、(A)はT-ALL細胞に対するNDRG2遺伝子の発現抑制がPI3K/AKT情報伝達系の活性化を促すことを示すウエスタンブロット法による写真、(B)は同細胞の増殖亢進を示すグラフである。

　本発明においては、まず、PTENがリン酸化されるのを阻害する作用のある物質および／または、一旦リン酸化されたPTENを脱リン酸化する作用のある物質を提供する。

本明細書でいう「PTEN遺伝子」は、生体内では、染色体上の10q23.3に位置し、腫瘍抑制因子として同定されている。PTENタンパク質は、この遺伝子によってコードされるタンパク質をいい、フォスファティジルイノシトール　3,4,5-トリフォスフェイト（PIP3）の脱リン酸化反応を触媒する酵素として知られている。また、本明細書においては、特に明示がない場合に、単に「PTEN」という場合には、このようなPTEN遺伝子がコードする全長タンパク質およびPTENタンパク質のペプチド断片のいずれも指す。

「PTENタンパク質のリン酸化部位」とは、特に限定はされないが、本発明との関連においては、PTENのタンパク質を構成するアミノ酸中、少なくとも第３８０番目のセリン残基（本明細書では、Ｓ３８０ともいう）、第３８２番目のスレオニン残基（本明細書では、Ｔ３８２ともいう）および第３８３番目のスレオニン残基（本明細書では、Ｔ３８３ともいう）を指し、これらのアミノ酸部位からなる群より選択される１箇所あるいは２箇所以上においてリン酸化されることを「PTENがリン酸化する」あるいは「PTENタンパク質がリン酸化する」という。「脱リン酸化」とは、特にこれらの残基で一旦リン酸化された部位の１箇所か２箇所、またはすべての箇所のリン酸化がリン酸化されていない状態になることを指す（図１）。このような機能は、リン酸化されたPTENタンパク質、あるいはリン酸化部位を含む該タンパク質のペプチド断片に対する脱リン酸化あるいはリン酸化阻害作用の有無を検出することで、調べることができる。

本発明においては、このようなPTENがリン酸化されるのを阻害する作用のある物質および／または、一旦リン酸化されたPTENを脱リン酸化する作用のある物質の好ましい例として、NDRG2またはそれをコードする遺伝子あるいはそれらの断片が挙げられるが、これに限定されない。

　NDRG2遺伝子
ここで、 NDRG2は、N-mycの発現により転写が抑制されるNDRG1遺伝子のファミリーとして発見されたものである。このNDRGファミリーには4種類があり、アミノ酸配列の相同性は57-65%である。図２はNDRG2遺伝子のドメイン構造を示すもので、中央に共通したndr領域があり、エステラーゼ＆リパーゼスーパーファミリーに属する構造を有する。この共通ドメイン(ndr領域)の類似ドメインは同α/β-hydrolaseである。本発明者らは、NDRG2は、esterase、α/β-hydrolase 類似ドメインを有することから、それ自体phosphatase活性を有する可能性に着眼した。エステラーゼ及びリパーゼは、菌性リパーゼやコリンエステラーゼなどを含んでいる。これらの酵素は、カルボキシエステル(EC:3.1.1.-)に作用する。触媒には、三つの残基（３組の触媒）が係わると考えられる。すなわち、セリン、グルタミン酸塩又アスパラギン酸塩、ヒスチジンである。これらの触媒残基は、エステル結合のカルボニル炭素原子に対する求核作用に関与している可能性がある。その他のα/β加水分解酵素フォルドファミリーメンバーとは対照的に、p-ニトロベンジルエステラーゼ及びアセチルクロリンエステラーゼは、活性サイトカルボン酸塩に、Aspの代わりにGluを持っている。このシーケンスについての最適スコアヒットはpfam03096である。

NDRG2タンパク質
本発明におけるNDRG2タンパク質は、アクセッション番号、NP_057334.1、NP_963293.1、 NP_963294.1、NP_963831.1、NP_963832.1、NP_963833.1、NP_963834.1、またはNP_963835.1で示されるいずれのタンパク質でもよい。本発明において、「NDRG2」という表記は、NDRG2をコードする遺伝子もしくはmRNA（GenBank登録番号 NM_016250.2、NM_201535.1、NM_201536.1、NM_201537.1、NM_201538.1、NM_201539.1、NM_201540.1、またはNM_201541.1）を表す記号を含み、タンパク質、遺伝子、mRNAのいずれに対しても互換可能に使用する。さらに、本発明者らにより、NDRG2ゲノム領域の塩基置換を解析した結果では、ATL38症例中2例(MT2、ATL185でエクソン1上流-89塩基(C>T)、同様に38症例中2例(SO4、ATL202)、イントロン4中に147塩基目(T>C)の変異を認められる。さらに38例中1例(HUT102)にエクソン5内　NDRG2 a型 第77塩基(A>G)、第26アミノ酸残基(グルタミン>グリシン)置換が認められる。これらの遺伝子、タンパク質、その他に見いだされ得る塩基又はアミノ酸の変異を含む遺伝子、タンパク質、それらの断片も、本発明におけるNDRG2の定義に含まれる。

NRDG2の機能
NDRG2は、脳細胞、筋細胞、腎臓細胞など、様々な種類の組織細胞において発現している（Hu, et al., Cell Tissue Res., 325:67-76,2006、Qu, et al., Mol. Cell. Biochem., 229: 35-44, 2002など）。前述のように、NDRG遺伝子は４種類に分類され、相同性が高いが、個人の発達と成長によっては発現が異なる。NDRG2は、肝臓癌、膵臓癌、髄膜腫、乳癌細胞株、肺癌細胞株で発現が低下していることが報告されており、さらに肝癌細胞株、髄膜腫においてNDRG2プロモーター領域のDNAメチル化が証明されている（Xiao-Lan H, Xin-Ping L et al.NDRG2 expression and mutation in human liver and pancreatic Cancers. W J Gastroenterol 2004;10(23):3518-3521; Eriks AL, Arie P et al. Integrative Genomic Analysis Identifies NDRG2 as a Candidate Tumor Suppressor Gene Frequently Inactivated in Clinically Aggressive Meningioma. Cancer Res 2005; 65: (16) 7121- 7126））。

本発明のPTENがリン酸化されるのを阻害する作用のある物質および／または、一旦リン酸化されたPTENを脱リン酸化する作用のある物質は、PI3K／AKT情報伝達系の活性化を病因の１つとする疾患の予防薬、進展抑制薬、または治療薬として有効である。

PI3K／AKT情報伝達系の活性化を病因の１つとする疾患には、自閉症または癌などが含まれるが、これに限定されない。さらには、本発明者らにより、これまで関係が明らかではなかったＨＴＬＶ－１感染および／またはＡＴＬ発症における、PTENリン酸化阻害剤の有効性も確認され、このような疾患も本発明の範囲に含まれる。

自閉症は、対人相互反応の質的な障害、意思伝達の著しい異常またはその発達の障害、活動と興味の範囲の著しい限局性などにより特徴付けられる病態である。

癌には、皮膚癌、悪性リンパ腫、前立腺癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、卵巣癌、頭頸部扁平上皮癌、食道癌、胆管癌、前立腺癌、褐色細胞腫、陰茎癌、骨肉腫、および精巣癌からなる群より選択される１種が含まれる。さらに、ＡＴＬが含まれる。

ＡＴＬ（成人T細胞白血病：Adult T-cell leukemia）は、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ－１）がＴ細胞に感染することにより引き起こされるウイルス性白血病をいい、ＨＴＬＶ－１感染Ｔ細胞が腫瘍化した疾患である。５０歳から６０歳代に発症のピークがあり、亜急性から慢性に経過し末期に急激に進行し予後は不良であり、腫瘍細胞の起源はT細胞で、末梢血中に切れ込みや分葉核を有する白血病細胞（花弁状細胞；flower like cell）が出現し、リンパ節腫大、肝腫大、脾腫大を認める頻度が高く、しばしば皮膚病変を有す、という特徴的な臨床所見を持つ。ATLの進展に伴う、細胞核の花弁状化の様子を、図３に示す。

ここで、ＨＴＬＶ－１は、ヒトレトロウィルスで、宿主であるヒトのＴ細胞内では核内に移行し、ＲＮＡからｃＤＮＡを逆転写により生成し、ｃＤＮＡは宿主ゲノムＤＮＡへインテグレーションする。

本発明はまた、PTENのリン酸化剤にも関し、そのような薬剤は、PI3K／AKT情報伝達系の不活性化を病因の１つとする疾病の予防、進展抑制、または治療薬として有効である。

このような疾病には、糖尿病が含まれる。糖尿病は、糖代謝の異常によって起こり、血糖値が病的に上昇するという病態を示す。さらに、血糖値の上昇は、様々な合併症を引き起こす。PTEN の遺伝子多型は日本人における２型糖尿病患者に多く認められ、PTEN の発現が亢進することでインスリンシグナルが低下してインスリン抵抗性を惹起し、２型糖尿病の発症に関与する可能性などが示唆されている。

NDRG2リン酸化阻害および／または脱リン酸化剤、及び治療剤の範囲
本発明で提供するPTENのリン酸化阻害および／または脱リン酸化剤、及びこれを有効成分とするPI3K/AKT情報伝達経路の活性化を病因のひとつとする治療薬には、NDRG2 をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入され得る形態で含む遺伝子治療剤、NDRG2タンパク質、及びNDRG2タンパク質のペプチド断片が含まれる。このNDRG2遺伝子には、例えば、ヒトT－ALL由来の細胞株（MOLT4）、ヒト末梢血の単球あるいは臍帯血幹細胞から分化した樹状細胞に由来するNDRG2（PCT/KR2004/000634）等を使用することができる。NDRG2のタンパク質や、NRDG2タンパク質又はそのペプチド断片に対する抗体は、定法に基づき化学的または遺伝子工学的に合成してもよい。

なお、本発明において、「治療」とは、完全治癒に加えて、症状を改善させることも含む。

遺伝子薬剤の調製方法
　PTENの活性を制御し得る物質として、NRDG2遺伝子を有効成分とするPTENのリン酸化阻害および／または脱リン酸化剤、及びこのリン酸化阻害および／または脱リン酸化剤を有効成分とする疾病治療薬（以下「遺伝子薬剤」という）は、例えば以下の方法により調製することができる。ここでいう遺伝子薬剤は、NDRG2をコードするポリヌクレオチドが細胞内に導入され得る形態で含まれ、かつmRNAやタンパク質を強制発現させることができるものであればよい。NDRG2をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入可能な形態とするには、慣用的な方法を採用できる。例えば、ポリヌクレオチドを直接導入したり（米国特許第5,580,859号参照）、あるいは組換えウイルスベクターの形態で製剤化して導入したりする。また、非ウイルスによる導入法も知られており、本発明では、これらを適宜選択して使用できる。

NDRG2遺伝子薬剤の調製方法
細胞導入に好適なウイルスベクターとしては、例えば、バキョロウイルス科、パルボウイルス科、ピコルノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科、パラミクソウイルス科またはピコルナウイルス科から選ばれるウイルスのゲノム由来のものを使用する。各々の親ベクターの都合のよい長所を利用したキメラベクターもまた用いることができる。このようなウイルスゲノムは、複製欠損性か、条件により複製するか、または複製コンピテントへ改変され得る。より具体的には、ベクターがアデノウイルスの場合は、例えば、ヒトアデノウイルスゲノムに由来する複製非コンピテントベクター（米国特許第6,096,718号；6,110,458号；6,113,913号；5,631,236号参照）、アデノ随伴ウイルスなどが使用できる。レトロウイルスゲノムに由来するベクターの場合、マウス白血病ウイルス（MuLV）、テナガザル白血病ウイルス（GaLV）、サル免疫不全ウイルス（SIV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、及びそれらの組合せを主成分とするものが含まれる（例えば、米国特許第6,117,681号；6,107,478号; 5,658,775号; 5,449,614号；Buchscher（1992）J. Virol. 66:2731-2739; Johann（1992）J. Virol. 66:1635-1640参照）。また、パラミクソウイルス科に含まれるセンダイウイルス（ＨＶＪ）なども好適に使用できる。この場合、生体より取り出した組織あるいは細胞にポリヌクレオチド発現ベクターを導入した後に、生体に戻すようにしてもよい（ex vivo法）。例えば、ポリヌクレオチドを組込んだ発現ベクターを、マイクロインジェクション法やエレクトロポーレーション法等の慣用的なトランスフェクション法により細胞内に導入する。

NDRG2遺伝子薬剤の使用方法
ウイルスベクターや発現ベクターにおいて、ポリヌクレオチドは、それが全身性または血液細胞特異的に発現するような任意のプロモーター支配下で連結されるようにして適用できる。その他、エマルションＤＤＳ法、リポソーム法などの公知の薬剤送達法を駆使することで、NDRG2遺伝子を所望の細胞に送達させ、効率よく発現させることが可能である。

NDRG2タンパク質薬剤の調製方法
NDRG2タンパク質を有効成分とするPTENの脱リン酸化剤、及びこの脱リン酸化剤を有効成分とするがん治療薬（以下「タンパク質薬剤」という）の調製には、NDRG2タンパク質（ポリペプチド）を抽出するか作製することが必要である。大量に安価に作製するには、NDRG2をコードするポリヌクレオチドを用いた遺伝子工学的方法によるのが好適である。またNDRG2ポリペプチドは、このポリヌクレオチドを公知の方法により適当な発現ベクターに組換えれば、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞の発現産物として得ることができる。またNDRG2ポリペプチドは、周知の化学合成法（例えば、Merrifield, R.B. J. Solid phase peptide synthesis I. The synthesis of tetrapeptide. J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963； Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. A Practical Approach. Chan, W.C. and White, P.D., Oxford University Press, 2000）等に準じて、合成することも可能である。

NDRG2タンパク質薬剤の調製方法
このタンパク質薬剤には、「ペプチド誘導体」も含まれる。この誘導体は、体内に導入された場合の物理的、化学的安定化を促進するための修飾、生体内の代謝に対する安定性と不安定性、条件付けの等の活性化修飾等を含んでいてもよい。ペプチド誘導体とするための修飾には、アセチル化、アシル化、ADP－リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、交差架橋、環化、ジスルフィド結合、脱メチル化、交差架橋共有結合形成、シスチン形成、ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマーカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質加水分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、脂質結合、硫酸化、セレノイル化等が含まれる。NDRG2ポリペプチドの活性を保持したまま含有する組成物に毒性を与えない範囲において、アミノ酸残基の側鎖またはＮ末端基もしくはＣ末端基として生じる機能性基として調製することができる。例えば、血液あるいは細胞中でポリペプチドの残存を延長するポリエチレングリコール側鎖を含む誘導体、あるいはカルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアとまたは第１級もしくは第２級アミンと反応することによるカルボキシル基のアミド、アシル部分（たとえば、アルカノイル基またはカルボサイクリックアロイル基）と形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ－アシル誘導体またはアシル部分と形成される遊離の水酸基（たとえば、セリルまたはスレオニル残基の水酸基）のＯ－アシル誘導体等である。

NDRG2タンパク質薬剤の調製方法
NDRG2を含む薬剤として、薬理学的に許容し得る「塩」も含むことができる。この塩は、ポリペプチドのカルボキシル基の塩およびアミノ基の酸付加塩の両者を意味する。カルボキシル基の塩は、周知の方法によって形成することができる。例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄または亜鉛などの無機塩、およびトリエタノールアミン、アルギニンまたはリジン、ピペリジン、プロカインなどのようなアミンを用いて形成されたような有機塩基との塩が含まれる。酸付加塩としては、たとえば塩酸または硫酸などの鉱酸との塩およびたとえば酢酸またはシュウ酸などの有機酸との塩を含む。このようなあらゆる塩は、NDRG2活性を保持した形で提供し得る。

NDRG2タンパク質薬剤の使用方法
NDRG2ポリペプチドを細胞内に導入可能な形態に製剤化するには、周知の手段を採用できる。例えば、ポリペプチドのＮ末端側に細胞膜通過ペプチドを連結させた融合ポリペプチドの使用である。融合ポリペプチドは、融合ポリヌクレオチドを用いて、遺伝子工学的に作製することができる。また、ex vivo法によるNDRG2ポリペプチドの細胞内導入の場合には、脂質（BioPORTER：Gene Therapy Systems社、米国、Chariot：Active Motif社、米国等）による導入も可能である。
NDRG2抗体薬剤
本発明ではまた、NDRG2タンパク質またはそのペプチド断片に対する抗体を有効成分とするPTENのリン酸化剤を有効成分とする治療薬（以下「抗体薬剤」という）を調製することもできる。この調製には、周知の方法を用いることができる。ここにおいて、NDRG2タンパク質またはそのペプチドに対する抗体とは、免疫反応において、NDRG2の抗原の刺激により生体内に作られ、NDRG2タンパク質と特異的に結合するタンパク質またはその改変体をいう。ポリクローナル抗体でも、モノクローナル抗体でも使用し得るが、特にモノクローナル抗体が好適である。さらに、ヒト抗体、ヒト化抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ抗体、ならびにそれらの断片、例えばＦ（ab’）2およびFab断片、ならびにその他の組換えにより生産された結合体を含む。さらにこのような抗体を、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、αガラクトシダーゼなどに共有結合させ、又は組換えにより融合させたものであってもよい。

抗体は、通常、NDRG2タンパク質あるいは抗原を含むそのペプチド断片を、適切な動物に投与して免疫することによって生成される。モノクローナル抗体には、全免疫グロブリン分子ならびにFab分子、F（ab’）2フラグメント、Fvフラグメント、およびもとのモノクローナル及び抗体分子の免疫学的結合特性を示す他の分子を含む。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を作製する方法は、周知の方法によることができる。

例えば、ポリクローナル抗体は、NDRG2タンパク質を構成するポリペプチドの全長または部分断片精製標品、タンパク質の一部のアミノ酸配列を有するペプチドなどを抗原として用い、動物に投与して作製する。抗体を生産する場合、投与する動物として、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスター等を用いることができる。NDRG2タンパク質の断片であるペプチドを用いる場合には、スカシガイヘモシアニンまたはウシチログロブリン等のキャリアタンパク質に共有結合させたものを抗原とすることもできる。その抗原の投与は、１回目の投与の後1～2週間おきに2～10回行う。各投与後、3～7日目に採血し、その血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法等で確認する。血清が充分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物より血清を取得し、その血清を用い周知の方法でポリクローナル抗体を分離、精製することができる。

一方、モノクローナル抗体の調製は、例えば、まずNDRG2タンパク質またはその断片ポリペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したラットを抗体産生細胞の供給源として使用し、骨髄腫細胞との融合により、ハイブリドーマの作製を行う。その後、酵素免疫測定法になどによって、NDRG2タンパク質またはその断片ポリペプチドに特異的に反応するハイブリドーマを選択する。得られたハイブリドーマから、所望の性質のモノクローナル抗体を得て、抗体薬剤とすることができる。

　本発明はまた、試験物質における、PTENタンパク質のリン酸化部位T382、T383、及びS380からなる群から選択される少なくとも１つの部位のリン酸化阻害能力または脱リン酸化能力を確認する工程を含む、PTENのリン酸化阻害または脱リン酸化剤のスクリーニング方法を提供する。ここで、試験物質は、合成または天然の低分子化合物、遺伝子、タンパク質、抗体などの生体由来物質のいずれでもよい。

　本発明のスクリーニング方法において用いられるPTENは、特に限定はされず、リン酸化部位T382、T383、及びS380を含む短い合成ペプチド断片あるいはPTENタンパク質自体のいずれも使用することができる。このうち、比較的短い合成ペプチドは、取り扱いが容易であり好ましい。または、PTENタンパク質自体を使用する場合、例えばＡＴＬ細胞株が発現するPTENタンパク質を免疫沈降法などで精製して用いることも可能である。あるいはリン酸化され得る状態におけるPTEN発現細胞と試験物質とを接触させることもでき、さらには、PTENの機能的箇所に対応するＤＮＡと試験物質に対応するＤＮＡとを同じ細胞に強制発現させて接触させることもできる。接触は、同じ反応液中に混合すること、培養液に入れること、同じ細胞内で保持することなどの公知のあらゆる手段を用いて行われ得る。反応の条件は特に限定はされず、室温程度（２０℃～４０℃）や培養に適する温度にて、数分から数時間で行われ得る。反応後に、PTENのリン酸化状態を測定することにより、試験物質の脱リン酸化作用あるいはリン酸化阻害作用を確認することが可能である。このような測定は、特に限定はされないが、例えば測定したい部位に対応する各種のPTENリン酸化抗体を用いて、抗体との反応の状態を調べることで行い得る。

　本発明においては、PTENタンパク質のリン酸化部位T382、T383、及びS380からなる群から選択される少なくとも１つの部位のリン酸化阻害能力または脱リン酸化能力を確認することで、試験物質のPTENのリン酸化抑制および／または脱リン酸化作用を調べることができる。もし、試験物質が、上記部位のうちいずれか１つでも脱リン酸化させる能力を有していれば、当該試験物質は、PTENの活性を回復させることが可能であり、かつPI3K/AKT情報伝達系を不活性の状態に制御することができる。このことは、ひいては、このような化合物が、PI3K/AKT情報伝達系が活性化することによって誘導される疾病の予防、進展、または治療に有効であることを示す。

本発明者らは、NDRG2のPI3K/AKT情報伝達経路における役割を見出したことで、このようなスクリーニング方法を開発した。すなわち、本発明によって、PI3K/AKT情報伝達経路関連の新たな知見が得られた。図４は、PI3K/AKT情報伝達経路を示す。図４(A)において、通常状態の多くの細胞では、NDRG2が十分な量存在し、PTENの第380番セリン残基、第382スレオニン残基、第383番スレオニン残基(S380/T382/T383)の脱リン酸化状態を保ち、PTENは自身が有するPIP3脱リン酸化酵素活性が活性型となっている。この状態ではPI3K以下の情報伝達に関して、PTENによる作用により基質であるPIP3をPIP2に脱リン酸化し、そのためPIP3の量が減少、AKTに至る情報伝達が阻害されてしまう。しかし、図４(B)に示すように、ATLを含むいくつかのがんにおいて、NDRG2がゲノム異常により発現が低下すると、PTENタンパク質を脱リン酸化型として保持することができず、何らかのPTENリン酸化酵素によりPTEN(S380/T382/T383)がリン酸化され、PTENタンパク質は構造が変化しPTENの有するPIP3脱リン酸化酵素としての酵素活性が不活化型のタンパク質となってしまう。そうなるとレセプターからの情報によりPI3Kが活性化されると、PIP3の生成が上昇し、AKTリン酸化が促進し、その下流における細胞増殖能やアポトーシス阻害能が上昇し、細胞の不死化につながる。一般的に、PI3Kがインシュリンや増殖因子によって活性化されるとリン脂質であるPIP2をリン酸化してPIP3 にし、PIP3はPDK1をリン酸化して、これを活性化する。活性化されたPDK1はAKTをリン酸化して活性化する。活性化されたAKTは細胞の分化増殖を促す。PTENは、既述のように、このPIP3を脱リン酸化してPIP2に戻す脱リン酸化酵素で、PI3K/AKT情報伝達経路を負に制御する。

本願発明では、このようなPI3K/AKT情報伝達経路における負の制御の乱れを正す物質を、スクリーニングすることが可能である。従って、本願発明のスクリーニング方法は、PI3K/AKT情報伝達経路が関与する、疾病の予防、治療、進展抑制に用いることのできる薬剤のスクリーニング方法でもある。このような疾病には、限定はされないが、自閉症、皮膚癌、悪性リンパ腫、前立腺癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、卵巣癌、頭頸部扁平上皮癌、食道癌、胆管癌、前立腺癌、褐色細胞腫、陰茎癌、骨肉腫、および精巣癌が含まれる。

　本発明のPTENのリン酸化阻害および／または脱リン酸化剤、またはPTENのリン酸化剤は、非経口あるいは経口剤として、提供される。非経口の場合には、遺伝子導入法等が有効に使用され得るが、これに限定はされない。

　非経口の場合には、適切な賦形剤、アジュバント、および／または薬学的に受容可能なキャリアーと混合して、単独で、あるいは他の薬剤と組み合わせて患者に投与され得る。特に好ましく用いられ得るキャリアーには、限定はされないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、および水等が含まれる。本発明の一実施形態において、薬学的に受容可能なキャリアーは薬学的に不活性である。

非経口投与の場合、動脈内（例えば、頚動脈を介する）、筋肉内、皮下、髄内、クモ膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻孔内へなされうる。

経口の為の製剤は、散剤 、顆粒剤 、細粒剤 、ドライシロップ剤 、錠剤 、カプセル剤 、注射剤 、液剤などのいずれの形態にもなり得る。また、その剤型に応じ、製剤学的に公知の手法により、適切な賦形剤 ；崩壊剤；結合剤；滑沢剤；希釈剤；リン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、および他の有機酸またはそれらの塩のような緩衝剤緩衝剤；等張化剤；防腐剤；湿潤剤；乳化剤；分散剤；安定化剤；溶解補助剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、またはイムノグロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニン）；単糖、二糖および他の炭水化物（セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；対イオン（例えば、ナトリウム）；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート、ポロキサマー）、などの医薬品添加物と適宜混合または希釈・溶解することにより調剤することができる。等張性および化学的安定性を増強するこのような物質は、使用された投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性である。

処方および投与のための技術は、例えば、日本薬局方の最新版および最新追補、「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳＣＩＥＮＣＥＳ」（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）の最終版に記載されている。

本発明のリン酸化阻害および／または脱リン酸化剤は、目的の薬剤が意図する目的を達成するのに有効な量で含有される薬剤であり、「治療的有効量」または「薬理学的有効量」は当業者に十分に認識され、薬理学的結果を生じるために有効な薬剤の量をいう。治療的有効用量の決定は十分に当業者に知られている。

治療的有効量とは、投与により疾患の状態を軽減する薬剤の量をいう。このような化合物の治療効果および毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。用量は、好ましくは、毒性をほとんどまたは全くともなわないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。この用量は、使用される投与形態、患者の感受性、および投与経路に依存してこの範囲内で変化する。一例として、複合体の投与量は、年齢その他の患者の条件、疾患の種類、使用する複合体の種類等により適宜選択される。

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。しかしながら、本実施例は、本発明の具体例を示すのみで、本発明は、下記実施例に限定されるものではない。

[ATLを含む各種がん細胞におけるPTENタンパク質リン酸化異常の同定]

１．定量的real time RT-PCR
PTEN特異的プライマー(Forward5’-CAGCCATCATCAAAGAGATCG-3’（配列表の配列番号１）、Reverse 5’-AAAAGGATATTGTGCAACTCTGC-3’（配列表の配列番号２）)、β-actin特異的プライマー(Forward 5’-GACAGGATGCAGAAGGAGATTACT-3’（配列表の配列番号３）、 Reverse 5’-TGATCCACATCTGCTGGAAGGT-3’（配列表の配列番号４）)、SYBR GREEN(R) PCR Master Mix(Applied biosystems)、鋳型cDNAを混合し、ABI PRISM(R) 7000 Sequence Detection SystemでPCR反応40サイクル(95度、10秒間、60度 60秒間)を行った。データは増幅曲線と閾値の交点からCt(Threshold Cycle)値を求めるCrossing Point法を用いて解析した。得られたCt値と標準サンプル(MOLT4細胞由来のcDNA)の段階希釈液を用いて作成した検量線に基づいてPTEN mRNAとβ-actin mRNAの発現量を算出し、それぞれの検体で、PTEN遺伝子の発現量/β-actin遺伝子の発現量を算出し、基準となる検体の値で割る事で補正した。

２．PTEN遺伝子発現解析
　PTEN mRNA発現を定量的real time RT-PCR法により、T-ALL細胞株4株(Jurkat、MOLT4、MKB-1、KAWAI)、HTLV-1感染細胞株2株（HUT102、MT2）及びATL細胞株6株（ED-40515(-)、Su9T-01、S1T、KOB、KK1、SO4）を用いて定量した。その結果T-ALL細胞株4株と比較してHTLV-1感染細胞株及びATL細胞株8株では発現量やや増加傾向にあった[図５(A)]。さらに健常人由来CD4陽性T細胞5例と患者由来急性型ATL細胞7例を用いて定量的real time RT-PCR法によるPTEN遺伝子発現解析を行なったところ、発現量に優位な差が認められなかった[図５(B)]。

３．点突然変異の解析
　ゲノム DNA 200 ngを鋳型として、PTEN遺伝子の各エキソンに対するプライマーを作製し(表１参照：配列表の配列番号５～２６)、PCR反応(98度、10秒間、各エキソン特異的アニーリング温度30秒間、72度、45秒間)を40サイクルにより増幅した。PCR産物をフェノール・クロロホルム処理後エタノール沈殿により精製し、それぞれのエキソン特異的なプライマーでsequence PCR反応を行ないApplied biosystem 3130 Genetic Analyzerにより塩基配列を決定した。解析にはClustal X(http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/)により登録塩基配列と比較した。

その結果研究に用いた細胞株、並びに患者検体のゲノムDNAを用いて各エクソン塩基配列を求めて点突然変異検索を行った結果、T－ALL細胞株Jurkat細胞株において、2塩基欠失を含む9塩基挿入(234アミノ酸残基)と、終止コドンを含む39塩基挿入（246アミノ酸残基）が認められたが、他の細胞株においては、すべてゲノム異常は認められなかった[図６(Ａ)]。

４．多蛍光染色体分析(Spectral karyotyping SKY) とDAPI 結合解析 
染色体異常の解析にはKakazuらの発表 (Kakazu N, Taniwaki M, Horiike S, et al. Combined spectral karyotyping and DAPI banding analysis of chromosome abnormalities in myelodysplastic syndrome. Gene Chromosome Cancer. 1999; 26: 336-345.)に基づき、多蛍光染色体分析(spectral karyotyping SKY)とジアミドフェニルインドールジハイドロクロライド(4, 6-diaminido-2-phenylindole dihydrochloride、DAPI) 染色を組み合わせて解析した。細胞より染色体固定されたスライドガラス上で変性後SKY用プローブ(Applied Spectral Imaging Inc)を37 度・2 日間ハイブリダイゼーションさせた。SKYシグナル検出はApplied Spectral Imaging Inc社のプロトコールに従った。染色体染色はDAPIと抗フェード溶液 (Vectaschield; Vector Laboratories)の組み合わせで対比染色した。画像は、SKY-1光学フィルター (Chroma Technology)付きOlympus BX50-RF (Olympus) 搭載SD200 Spectracube (Applied Spectral Imaging)を用いて取得した。それぞれ 10から20の分裂中期染色体像を解析し、核型の記載はISCN1995に従った。

５．高密度SNPアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション(アレイCGH)解析
全ゲノムDNAは制限酵素XbaIにより切断、アダプター連結後単一プライマーを用いてPCR増幅した。DNase I処理後、 PCR産物40μgをビオチン標識し、アレイにハイブリダイゼーションさせた。SNPはGTYPE 4.1 software (Affymertix)によりスコア化した。染色体コピー数とLOH(Loss of heterozygosity) はACUE 2.1 (Mitsui Knowledge Industry, Tokyo, http://bio.mki.co.jp/en/product/acue2/index.html)とCNAG 2.0(Nannya Y, Sanada M, Nakazaki K, et al. A Robust Algorithm for Copy Number Detection Using High-Density Oligonucleotide Single Nucleotide Polymorphism Genotyping Arrays. Cancer Res. 2005; 65: 6071-6079.)によって算出した。正常検体6例を基準としてデータの標準化を行なった。またアレイ上のプローブのゲノム位置はNCBI genome map build 35.1による。

６．10q23領域ゲノム異常の解析
ATL白血病細胞に対して、PTENの存在する10q23領域に対してSNPアレイCGH法ならびに、SKY/FISH法によるゲノム解析を61症例に対して行い、この領域にはゲノム欠失などゲノム異常の集積は認められなかった（図６(Ｂ)）。

７．ATLにおけるPTENリン酸化異常、NDRG2タンパク質発現低下の同定
(1) 供試抗体
　ウサギ抗ヒトNDRG2抗体は、NDRG2ペプチド(NDRG2 B型 (NP_057334 ) 17-31 アミノ酸残基 PGQTPEAAKTHSVET )を合成し、家兎に免疫、さらに免疫後血清よりIgG分画を精製し、ペプチド固層カラムを用いた精製を行ない作製した。その他の抗体としてマウス抗β-actin (AC-15) モノクローナル抗体 (A5441)、マウス抗α-tubulin (DM1A) モノクローナル抗体(T9026)、ウサギ抗FLAGポリクローナル抗体 (F7425)、マウス抗FLAG (M2)モノクローナル抗体 (F1804) (SIGMA ALDRICH)、マウス抗PTEN (26H9)モノクローナル抗体 (#9556)、ウサギ抗Phospho-PTEN (Ser380/Thr382/383)ポリクローナル抗体 (#9554)、ウサギ抗phospho-AKT (Ser473) ポリクローナル抗体 (#9271)、ウサギ抗 phospho-AKT (Thr308) ポリクローナル抗体 (#9275)、ウサギ抗 AKT ポリクローナル抗体 (#9272)、ウサギ抗phospho-PTEN(Ser380) ポリクローナル抗体 (#9551) ウサギ抗FoxO1 ポリクローナル抗体 (#9462) (Cell Signaling TECHNOLOGY)、ウサギ抗phospho-PTEN(Ser370) ポリクローナル抗体07-889)、ウサギ抗phospho-PTEN(Ser385) ポリクローナル抗体(07-890) (Upstate (Millipore))、マウス抗SHIP1 (P1C1)モノクローナル抗体 (sc-8425)を使用した。また二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識抗マウス IgG 抗体(NA931V) (GE Healthcare) HRP標識抗ウサギ IgG 抗体(P0399) (Dako Cytomation)、及びAlexaFluor 546標識抗ヤギ抗マウスIgG (重鎖、軽鎖)抗体、AlexaFluor 488標識ヤギ抗ウサギIgG (重鎖、軽鎖)抗体(invitrogen(Molecular Probe))を使用した。

(2) ウエスタンブロット法
　細胞1 x 10⁶個を回収後、リン酸緩衝生理食塩水 (10 mM リン酸緩衝液, 120 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 7.6 )(PBS)緩衝液で洗浄し、150 μlの1x SDS サンプル緩衝液(62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2% SDS, 10% グリセロール, 50 mM DTT, 0.01% ブロモフェノールブルー)を加え細胞を溶解した。95 度で5 分間煮沸後、8 x 10⁴細胞/レーンに相当するサンプルを10％ポリアクリルアミドゲル(アクリルアミド:ビスアクリルアミド=36.5:1)電気泳動に供した。ミニプロテアン3セル (Bio-Rad)により定電圧100 V・２時間時間泳動した。ゲルはミニトランスブロットセル(Bio-Rad) (400 mA・3時間)を用いてPVDF 膜 (Millipore)に転写し、転写膜は1％ ウシ血清アルブミン (BSA)添加トリス緩衝生理食塩水/Tween 20(TBS/T)緩衝液(150 mM NaCl、10 mM Tris-HCl (pH 7.4)、0.1% Tween20)により室温、２ 時間ブロッキング反応を行なった。 Can Get signal(R) Solution1(TOYOBO)で2000倍希釈後の一次抗体液を用いて4度で一晩反応させ、TBS/T 緩衝液にて５分×3回洗浄した。さらに Can Get signal(R) Solution2(TOYOBO)にて3000倍希釈後の二次抗体液にて室温で1時間反応させ、その後TBS/T緩衝液にて５分×3回洗浄した。洗浄後Lumi light^PLUSWestern Blotting kit (Roche Applied Science)にて化学発光させ、ルミノイメージアナライザーLAS-3000 (Fujifilm)で画像解析を行った。

　Tリンパ性急性白血病(T-ALL)細胞株(Jurkat, MOLT4, MKB1, KAWAI)、HTLV-1感染細胞株(HUT102, MT2)、ATL細胞株(ED, KOB, KK1, SO4, Su9T-01, S1T)を用いてウエスタンブロット法によりNDRG2、PTEN、AKTタンパク質発現を解析した[図７(A)]。その結果、T-ALL細胞株(Jurkat、MOLT4、MKB1、KAWAI)においてNDRG2タンパク質の発現が認められたが、HTLV-1感染細胞株、及びATL細胞株ではNDRG2発現の顕著な低下が認められた。PTENタンパク質の発現はJurkatを除くT-ALL細胞株で認められたが、HTLV-1感染細胞、ATL細胞株ではその発現の低下が認められた。一方、PTENのリン酸化修飾はHTLV-1感染細胞、及びATL細胞株において亢進しており、これに同調してAKTのリン酸化修飾の亢進もまた認められた。JurkatにおいてはPTEN遺伝子の点突然変異を認めており、これによりPTENタンパク質発現の損失、AKTリン酸化の亢進が起こっているものと考えられた。

　健常人由来CD4陽性T細胞、及び急性型ATL患者由来ATL細胞を用いてウエスタンブロット法によりNDRG2、PTEN、AKTタンパク質発現を解析した。対照である健常人由来CD4陽性T細胞と比較して急性型ATL患者由来ATL細胞においてNDRG2タンパク質、及びPTENタンパク質発現の顕著な低下が認められた。AKTのリン酸化修飾の亢進もまた急性型ATL患者の全例において認められた[図７(B)]。

ATL以外の次のがん細胞株を用いて、ウエスタンブロット法により、NDRG2、PTEN、AKTタンパク質発現を解析した。
膵臓癌(PC)細胞株(KLM-1、PK9、PK45P)；肝細胞がん(HCC)細胞株(HepG2、HuH-7、HLF)；胃癌(GC)細胞株(MKN28、MKN45、KATO-III)；神経芽細胞腫(NB)細胞株(NH-6、NH-12)；肺癌細胞株(A549)；脳腫瘍細胞株(A172)；乳癌細胞株(SK-BR-3)；大腸癌細胞株(COLO205)；子宮癌細胞株(HeLa)；卵巣癌細胞株(SKOV3)；前立腺癌細胞株(PC3)；口腔扁平上皮癌細胞株(HO-1-u-1)。

その結果、神経芽細胞腫細胞株、肺癌細胞株以外の固形がん細胞株においてNDRG2、PTEN発現の顕著な低下が認められた。一方、PTENのリン酸化修飾もこれらにおいて亢進しており、これに同調してAKTのリン酸化修飾の亢進もまた認められた（図８(A)、図８(B)）。

[NDRG2タンパク質のPTEN脱リン酸化作用]

１．NDRG2タンパク質とPTENタンパク質の結合
(1) 試料の作成
細胞をPBS緩衝液で洗浄後、500 μlの RIPA 緩衝液(50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1mM EDTA(pH8.0), 2% Triton X-100, 0.1% SDS)を加え細胞を溶解した。1 μgの特異抗体を加え4℃で、一晩反応させた後、TBST緩衝液で洗浄し50 μl のProteinG SepharoseTM4 fast flow(GE Healthcare)を加え4℃で、一時間反応させた。その後PBS緩衝液で洗浄し、50 μl のSDS サンプル緩衝液を加え、95度で5分間煮沸した後ウエスタンブロット解析に使用した。

(2) ウエスタンブロット法解析
293T細胞にFLAG-NDRG2またはGFP-PTEN発現ベクターを単独もしくは同時に導入し、48時間の培養を行った。細胞抽出液を調製後、抗FLAG抗体による免疫沈降を行った。導入した遺伝子の発現は抗FLAG抗体、抗PTEN抗体を用いたウエスタンブロットで確認した[図９(A), panel(A)]。免疫沈降産物を抗PTEN抗体でウエスタンブロットしたところPTENに相当するバンドが検出されたことから[図９(A), panel B]、PTENとNDRG2は結合することが判った。確認実験として抗PTEN抗体を用いた免疫沈降においても同様なPTEN-NDRG2の結合が認められた（図９(A)、panel C)。

(3) 免疫沈降法試験
内在性のNDRG2とPTENは結合して存在するかを調べるために、MOLT4細胞抽出液を用いた免疫共沈降試験を行った。抗NDRG2抗体免疫沈降産物を抗PTEN抗体でウエスタンブロットしたところPTENが検出されたことから、両者は内在において相互作用していることが判った。逆に抗NDRG2抗体免疫沈降産物を抗PTEN抗体でウエスタンブロットした実験においても同様な結果が得られた（図９(B)）。

(4) 免疫染色法試験
免疫蛍光染色法により細胞内のNDRG2とPTENタンパク質の局在が一致しているかを調べた。ATL細胞株KK1をAlexa fluor 488(緑)でNDRG2を、Alexa fluor 546(赤)でPTENを検出した結果、NDRG2の発現量に関わらず共局在していることが判った。NDRG2低発現KK1細胞においてNDRG2とPTENは細胞質に存在し局在は一致した。NDRG2を強発現させると、NDRG2もPTENも同時に核内に局在が変化し、核の形も丸みを帯びた（図１０）。

２．精製NDRG2タンパク質のPTEN脱リン酸化作用
(1)GST(glutathione S-transferase)融合NDRG2タンパク質の作製
NDRG2/pCMV26を鋳型として、GST-NDRG2-5’ BamHIプライマー (5’-CCCAAGCTTATGGCGGAGCTGCAGGAGGTGC-3’（配列表の配列番号27）)及びNDRG2-3’ -EcoRI プライマー (5’-GCGAATTCTCAACAGGAGACCTCCATG-3’（配列表の配列番号28）)を用いてNDRG2コード領域を増幅した。PCRはPrime star MAX DNA polymerase kit (TAKARA)も使用し (98度、10秒間、55度、5秒間、72度、15秒間の温度サイクルを25サイクル行った。得られたPCR産物をpGEX-6P-1 (GE Healthcare)のBamHI部位とEcoRI部位に挿入した(NDRG2/pGEX-6P-1)。NDRG2/pGEX-6P-1を大腸菌BL21DE3に形質転換し、1 mM IPTG、30度で3時間の条件で融合タンパク質の発現を誘導した。大腸菌を遠心回収しTBST緩衝液で懸濁した後、超音波粉砕を行った。遠心分離後、上清を回収しTBSTで置換したGlutathione Sepharose TM 4B (GE Healthcare)を加えて4度で1時間反応させ、溶出緩衝液(50 mM Tris-HCl (pH8.0)、10 mM glutathione)でGST-NDRG2タンパク質の溶出を行なった。

(2) pNPP (p-Nitrophenyl Phosphate) assay
100 mM 酢酸ナトリウム、0.8 mM DTT、10 mM pNPP、pH5.0から成る反応液にGST-NDRG2タンパク質を10 ngから250 ng加え30度で10分間反応させた。500 μlの0.5 M NaOHを加え反応を停止させ、pNP (p-Nitrophenol)の吸収波長であるOD 410 nmを測定した。pNP　0.2 -1.6 nmolの濃度で標準曲線を作製し、吸光度をpNP濃度に変換し酵素活性を求めた。

その結果、GSTタンパク質ではpNPの産生は認められなかったが、脱リン酸化酵素として知られるPP2Aを用いた反応では予想どおりのpNP産生が認められた（図１１(A)）。GST-NDRG2タンパク質はpNPの産生を促進したことから、NDRG2は脱リン酸化酵素としての性質を有することが判った。

(3) フォスファターゼ阻害剤によるNDRG2の酵素学的検討
NDRG2が脱リン酸化酵素であるかを調べるため脱リン酸化酵素阻害剤を用いた。阻害剤にはフッ化ナトリウム (NaF)、ピロリン酸ナトリウム、オルトバナジウム酸ナトリウム(vanadate)、Okadaic acidを用いた。その結果、NDRG2の酵素活性はフッ化ナトリウム (NaF)、ピロリン酸ナトリウムにより阻害され,そのIC50はNDRG2タンパク質が25ng/ulの濃度のときそれぞれ383.4nM、5219.3nMであった（図１１(Ｂ)）。

(4) Phosphopeptide phosphatase assay（リン酸化ペプチドを用いた脱リン酸化反応系）
 　20 mM 酢酸マグネシウム、300μg/ml BSA、30μM EDTA、0.03% β-メルカプトエタノール、25ng/ml GST-NDRG2から成る反応液に10 ngから500 ngの各種リン酸化PTENペプチド(Non-phospho PTEN (373-EPDHYRYSDTTDSDPENE-382（配列表の配列番号29）)、pSer380 PTEN  (EPDHYRYpSDTTDSDPENE)、 pThr382 PTEN  (EPDHYRYSDpTTDSDPENE)、pThr383 PTEN (EPDHYRYSDTpTDSDPENE)、 pThr382/pThr 383 PTEN (EPDHYRYSDpTpTDSDPENE)、 pSer380/pThr382/pThr 383 PTEN (EPDHYRYpSDpTpTDSDPENE)を加え30度で10分間反応させた。その後、140 μl のBIOMOL GREEN(BIOMOL)と530 μlの蒸留水を加えOD 620nmを測定した。0.2 nmolから1.6 nmolの遊離リン酸液を用いてBIOMOL GREEN反応にて標準曲線を作製し、吸光度からリン酸基濃度に換算しVmax、Km値を求めた。

その結果、NDRG2はPTENのThr382のリン酸化を含むペプチドに対して脱リン酸化活性を示した（図１２(Ａ)）。Thr382/Thr383ペプチドとSer380/ Thr382/Thr383ペプチドにおいてThr382リン酸化単独と比較してリン酸基産生量の増加が認められたことから、NDRG2のSer380とThr383への間接的な脱リン酸化作用が示された。

(5) NDRG2によるPTENの脱リン酸化試験
・ATL細胞株由来PTENタンパク質の精製
　ATL細胞株Su9T-01細胞1 x 10⁷個に対して20 μgのPTEN/pCMV26発現ベクターをエレクトロポレーション法により遺伝子導入した。導入2日後、細胞を回収し、500 μlのRIPA緩衝液を加え細胞抽出液を調製し、50 μl のAnti-FLAG M2 affinity Gel(SIGMA)を加え4度、一晩反応させた。PBS緩衝液で洗浄後、3×FLAGペプチド(100μg/ml)で溶出した。

・in vitro脱リン酸化実験
　20 mM 酢酸マグネシウム、300 μg/ml BSA、30μM EDTA、0.03% β-メルカプトエタノール、10 ng/ml FLAG-PTENから成る反応液に25 ngのGSTまたはGST-NDRG2、もしくは1単位のbacterial alkaline phosphatase (BAP) (TAKARA)から成る反応液を30度、30分間反応させた。各リン酸化に特異的な抗PTEN抗体を用いたウエスタンブロット法によりPTENのリン酸化状態を解析した。

その結果、GSTタンパク質ではPTENの脱リン酸化は認められなかったが、陽性コントロールとして用いたBAP、GST-NDRG2に脱リン酸化効果が認められた[図１２(Ｂ)]。特に、Thr382残基の脱リン酸化機能がNDRG2に有ることが内在PTENタンパク質を用いて示された。

(6) Dot plot phosphatase assay PTENリン酸化ペプチドに対するNDRG2の脱リン酸化試験
　20 mM 酢酸マグネシウム、 300 mg/ml BSA、30 mM EDTA、0.03% β-メルカプトエタノール、25 ng/ml GST-NDRG2タンパク質から成る反応液に、10 μMの各種リン酸化PTENペプチドを加え30度で10分間反応させた。反応液をPVDF膜に滴下し風乾後、1％ BSA或は5% skim milk 添加TBS/T緩衝液により室温、２時間のブロッキング反応を行った。Can Get signal(R) Solution1(TOYOBO)で2000倍希釈後の一次抗体液を用いて4度、一晩反応させ、TBS/T 緩衝液にて５分×3回洗浄した。続いて、Can Get signal(R) Solution2(TOYOBO)にて3000倍希釈後の二次抗体液にて室温で1時間反応させ、その後TBS/T緩衝液にて５分×3回洗浄した。Lumi light^PLUS Western Blotting kit(Roche Applied Science)にて化学発光させ、ルミノイメージアナライザーLAS-3000 (Fujifilm)で画像解析を行った。

　ウサギ抗Phospho-PTEN (Ser380/Thr382/Thr383)ポリクローナル抗体で検出した結果、NDRG2タンパク質との反応によりThr382とThr382/Thr383とSer380/Thr382/Thr383のリン酸化ペプチドにおいてシグナルが消失した[図１３(Ａ)]。ウサギ抗phospho-PTEN(Ser380)ポリクローナル抗体で検出した結果、NDRG2との反応によりSer380/Thr382/Thr383のリン酸化ペプチドにおいてシグナルが消失した。よってNDRG2はPTENのThr382の脱リン酸化だけでなくSer380、Thr383も同時に脱リン酸化する可能性を示唆した。

(7) PTENタンパク質への点突然変異の導入によるPI3K/AKT情報伝達系の活性化試験
・変異型PTEN遺伝子発現ベクターの作製
　PTENタンパク質のリン酸化部位であるS380、T382、T383について、点突然変異を有する変異型PTEN発現ベクターを作製した。PTEN/pCMV26を鋳型とし、S380A変異PTENプライマー(ATAGATATGCTGACACC)（配列表の配列番号30）、PTEN T382A変異PTEN プライマー(ATTCTGACGCCACTGAC) （配列表の配列番号31）、PTEN T383A変異PTEN プライマー(TATAGATATTCTGACACCGCTGACTCTGAT) （配列表の配列番号32）、PTEN S380A,T382変異PTENプライマー(TAAGATATGCTGACGCCACTGAC) （配列表の配列番号33）、PTEN S380A,T383変異PTENプライマー(TATAGATATGCTGACACCGCTGACTC) （配列表の配列番号34）、PTEN T382A,T383変異PTENプライマー(TATTCTGACGCCGCTGACTCTG) （配列表の配列番号35）、PTEN S380A,T382A,T383変異PTENプライマー(TATAGATATGCTGACGCCGCTGACTCTG) （配列表の配列番号36）、を用いて変異導入PCRを行った。PCRはPrimestar Max DNA polymerase (TAKARA)を使用し、98度、10秒間、55度、5秒間、72度、90秒間の温度サイクルを35サイクル行った。DNAシークエンシングにより変異の導入を確認した。

　・ウエスタンブロット法
作製したPTEN変異型遺伝子発現ベクターをHTLV1感染細胞株HUT102にAmaxa Nucleofectorにより導入し、PI3K/AKT情報伝達系の活性化レベルをウエスタンブロット法により検討した[図１３(Ｂ)]。その結果、S380、T382、T383の3カ所のどれか一箇所でもリン酸化がない状態のPTENタンパク質が存在すれば、AKTは脱リン酸化されており、PTENの機能が回復することが判った。すなわち、PTEN機能を低下させるためには3カ所ともにリン酸化されている必要があることが示された。

(8) 細胞増殖試験
・細胞増殖解析
遺伝子導入12時間後、100μlの細胞(1 x 10⁴個/ml)を96穴プレートで各種条件下において培養し、24時間間隔でcell counting kit-8(DOJINDO)を添加し420nmの吸光度を測定し細胞増殖能の解析を行った。細胞は37度、5% CO2条件下で静置培養した。

その結果、変異型PTENタンパク質の存在により細胞増殖が優位に抑制された（図１４）。変異の箇所により細胞増殖能に差が見られ、S380、T382、T383の3カ所全てに変異をもつPTENタンパク質で最も増殖が抑制された。

[NDRG2によるATLの治療試験]

１．NDRG2遺伝子発現ベクターの作製
　MOLT4 cDNAを鋳型として、NDRG2-5’-HindIIIプライマー(5’-CCCAAGCTTATGGCGGAGCTGCAGGAGGTGC-3’（配列表の配列番号37）), NDRG2-3’ -EcoRI プライマー (5’-GCGAATTCTCAACAGGAGACCTCCATG-3’（配列表の配列番号38）)を用いてNDRG2コード領域を増幅した。PCRはEx Taq DNA polymerase (TAKARA)を使用し、98度、10秒間、55度、30秒間、72度、75秒間の温度サイクルを30サイクル行った。得られたPCR産物をpCMV26(SIGMA ALDRICH)のFLAG‐tag下流HindIII部位とEcoRI部位に導入した(NDRG2/pCMV26)。DNAシークエンシングにより単離したNDRG2 cDNAは、B型 (NM_016250)であることが判った。

２．NDRG2安定発現ATL細胞株の作製
　ATL細胞株KK1、及びSu9T-01細胞1 x 10⁷個に対して20 μgのDNA (NDRG2/pCMV26またはpCMV26)をエレクトロポレーション法により遺伝子導入した。GENE PLUSER II (Bio-Rad)を用いて、220 V、950 μFの条件下で行なった。導入2日後、培養液にG418(GIBCO)を800 μg/mlの濃度で添加し、１週間のG418薬剤選択を行い，NDRG2遺伝子安定導入ATL細胞クローンを得た。安定発現株樹立後は培地にG418を200 μg/mlの濃度で添加し継代を行った。作製した細胞株はpCMV26を導入したKK1細胞株(KK1/pCMV26-#7、KK1/pCMV26-#11)、NDRG2/pCMV26発現ベクターを導入したKK1細胞株(KK1/NDRG2-#5、KK1/NDRG2-#6)、pCMV26を導入したSu9T-01細胞株(Su9T-01/pCMV26-#2、Su9T-01/pCMV26-#4)、NDRG2/pCMV26発現ベクターを導入したSu9T-01細胞株(Su9T-01/NDRG2-#5、Su9T-01/NDRG2-#6)である。

３．ウエスタンブロット法解析
樹立したNDRG2安定発現ATL細胞株を用いて、ウエスタンブロット法によりNDRG2、PTEN、AKTタンパク質発現を解析した（図１５（Ａ））。NDRG2タンパク質の発現は親株(Pt)、及びpCMV26を導入した細胞株(Mock)ではMOLT4と比較して顕著な低下が認められるが、NDRG2/pCMV26を導入した細胞株(NDRG2)においてNDRG2タンパク質の発現が認められた。PTEN、AKTタンパク質の量においては対照株と NDRG2/pCMV26細胞株に顕著な差は認められなかったが、リン酸化PTEN、及びリン酸化AKTタンパク質の減少がNDRG2安定発現ATL細胞株において認められた。

４．細胞増殖解析
細胞を1 x 10⁵個/mlの密度でまき24時間間隔でトリパンブルー染色法による生細胞数の算出を行った。2日間隔で10分の１倍希釈継代し２週間の培養を行なった。細胞は37度、5% CO2条件下で静置培養した。NDRG2安定発現ATL細胞株(KK1/NDRG2、Su9T-01/NDRG2)は親株、及びpCMV26を導入した細胞株に比べ、細胞増殖能の有為な低下が認められた（図１５(B)）。

５．腫瘍形成能のIn vivo試験
Su9T-01/pCMV26-#4細胞株またはSu9T-01/NDRG2-#6細胞株(1 x 10⁷ 個)を免疫不全マウス(NOD/Shi-scid, IL-2Rγ^null(NOG))に経静脈及び腹腔投与を行なった。その結果、NDRG2が低下したATLコントロール細胞移植群（黒丸）では、約160日で10匹全個体死亡、50％生存期間67日であったが、NDRG2強制発現ATL細胞移植群（白丸）では、約308日で10匹全個体死亡、50％生存期間217日と有為(p<0.01)な生存期間の延長が見られた（図１6(Ａ)）。

６．免疫蛍光染色試験
細胞をPBSで洗浄し4%パラホルムアルデヒド溶液で固定、0.1% TritonX100/PBSで透過処理を行った後、1% BSA添加TBS/T緩衝液を用いてブロッキング反応を行なった。TBS/Tで3回洗浄後、一次抗体液(1% BSA添加TBS/Tで400倍希釈)で室温、2時間反応させた。TBS/T緩衝液で3回洗浄後、AlexaFluor 488蛍光標識ヤギ抗ウサギIgG(1000倍希釈)、AlexaFluor 546標識抗ヤギ抗マウスIgG(1000倍希釈)、DAPI (SIGMA ALDORICH) (0.2 μg/ml)を加え遮光して室温、1時間反応させた。TBS/T緩衝液で3回洗浄後、蛍光封入剤(DAKO)を用いて封入し、倒立型落射型蛍光顕微鏡(HAL100)(Carl Zeiss)、もしくは倒立型共焦点レーザー顕微鏡(DMIRE2)(Leica)で観察した。

NDRG2によるPI3K/AKT情報伝達系の抑制作用をさらに検証するため、リン酸化AKTの標的分子であるFOXOタンパク質の局在状態を免疫蛍光染色により解析した（図１６(Ｂ)）。対照のATL細胞株(KK1/pCMV26-#11)では、AKTの活性化に伴いFOXO1/4タンパク質は細胞質に局在するが、NDRG2発現ATL細胞株(KK1/NDRG2-#5)ではFOXO1/4タンパク質が核内に局在することが見出された。

　ATL細胞の特徴として花弁状の異常な核形が知られている。KK1/pCMV26-#11の核は空豆状のくびれや変形を有する細胞の増加傾向が認められた。そこでさらに詳細に核形について検討を行った（図１７(Ａ)]。核変形の度合いを4種類に分け、細胞をDAPI染色し、蛍光顕微鏡下で100個ずつ2回、分類分けを行った。ATL細胞株であるKK1、Su9T-01対照のATL細胞株(KK1/pCMV26-#7、Su9T-01/pCMV26-#4)は、核の変形が認められたが(KK1; 78%、Su9T-01; 68%)、NDRG2安定発現細胞株では正常に近い丸い核形をもつ細胞が、KK1において22%から93%、Su9T-01で32%から53%と増加した。従って、NDRG2遺伝子の発現低下はFlower様の核形成に関連することが示唆された。 

抗α-tubulin抗体による免疫蛍光染色によりNDRG2発現ATL細胞株では、tubulin重合の亢進が抑制されていることが明らかになった（図１７(Ｂ)） 。

[NDRG2による膵臓癌治療試験]

１．NDRG2安定発現膵がん細胞株の作製
100 μlのRPMI1640に1 μgのNDRG2/pCMV26またはpCMV26プラスミドと3 μl のhilymax(DOJINDO)を加え室温で15分間反応させ、膵がん細胞株２種(KLM-1、PK45-P)に遺伝子導入した。導入2日後、培養液にG418を600μg/mlの濃度で添加し２週間のG418薬剤選択を行い，NDRG2遺伝子安定導入膵がん細胞クローンを得た。安定発現株樹立後はそれぞれの培地にG418を200 μg/mlの濃度で継代培養した。作製した細胞株はpCMV26を導入したKLM-1細胞株(KLM-1/pCMV26-#1、KLM-1/pCMV26-#2)、NDRG2/pCMV26発現ベクターを導入したKLM-1細胞株(KLM-1/NDRG2-#1、KLM-1/NDRG2-#2)、pCMV26を導入したPK45-P細胞株(PK45-P/pCMV26-#1、PK45-P/pCMV26-#2)、NDRG2/pCMV26発現ベクターを導入したSu9T-01細胞株(PK45-P/NDRG2-#1、PK45-P/NDRG2-#2)である。

２．ウエスタンブロット法解析
樹立したNDRG2安定発現膵がん細胞株を用いて、ウエスタンブロット法によりNDRG2、PTEN、AKTタンパク質発現を解析した（図１８(Ａ)）。ATL細胞株と同様に、NDRG2タンパク質の発現は親株(Pt)、及びpCMV26を導入した細胞株(Mock)においてMOLT4と比較して顕著な低下が認められるが、NDRG2/pCMV26を導入した細胞株(NDRG2)においてNDRG2タンパク質の発現が認められた。PTEN、AKTタンパク質の量においては対照株とNDRG2/pCMV26細胞株に顕著な差は認められなかったが、PTEN脱リン酸化、及びAKT脱リン酸化の亢進がNDRG2安定発現ATL細胞株において認められた。

３．細胞増殖試験
細胞(1 x 10⁵個/ml) 100μlを96穴プレートで培養、24時間間隔でcell counting kit-8(DOJINDO)を添加し420nmの吸光度を測定し細胞増殖能の解析を行なった。細胞は37度、5% CO2条件下で静置培養した。NDRG2安定発現膵がん細胞株(KLM-1/NDRG2、PK-45P/NDRG2)は親株、及びpCMV26を導入した細胞株に比べ、細胞増殖能の有為な低下が認められた（図１８(Ｂ)）。

[NDRG2による各種がんの予防試験]

１．NDRG2発現抑制T-ALL細胞株の作製
T-ALL細胞株、MOLT4、KAWAI細胞2 x 10⁶個にNDRG2 siRNA (5’-GGUGGAGAGGGCAUAUGCAtt-3’（配列表の配列番号３９）)またはAllstars negative control siRNA (QIAGEN)をNucleofector solution V (Amaxa biosystems)を用いて、プログラムS-018の条件下で導入した。

２．ウエスタンブロット法解析
NDRG2 siRNAを導入した細胞では、対照である親細胞(Pt)、及びnegative control siRNAを導入した細胞(ANC)と比較して、ウエスタンブロット法による解析でNDRG2タンパク質の顕著な発現低下が認められた。これらの細胞ではPTENのリン酸化が促進しており、AKTリン酸化の亢進が認められた（図１９(A)）。

３．細胞増殖試験
細胞(1 x 10⁵個/ml) 100μlを96穴プレートにより各種条件下で培養し、cell counting kitを用いて生細胞数を算出、24時間間隔で3日間行った。細胞は37度、5% CO2条件下で静置培養した。NDRG2発現抑制T-ALL細胞は、親細胞(Parental)、及びnegative control siRNAを導入した細胞(ANC)と比較して細胞増殖の促進が認められた（図１９(B)） 。

　上記の実施例１から５までから得られた知見により、以下のことがいえる。

ATL細胞におけるPTEN遺伝子の発現
図５は、ATLとPTEN遺伝子の関係を示す。図５(A)に示すように、ATLを含むT細胞系白血病細胞株におけるPTEN遺伝子の発現は、ATL、HTLV-1感染細胞株ではそれ以外のT細胞系白血病細胞株に比べ、PTENのmRNA発現は比較的高くなっている。図５(B)に示すように、急性型ATL患者白血病細胞でのPTEN遺伝子の発現においては、mRNAの発現は、健常人末梢血CD4陽性リンパ球と比較して低下していない。また図６ (Ａ)に示すように、PTEN遺伝子の点突然変異検索研究に使用した細胞株と患者検体のゲノムDNAとを用いて、各エクソン塩基配列を求めて点突然変異検索を行うと、T－ALL細胞株のJurkat細胞株においては点突然変異が認められるが、他の細胞株においては認められない。

ATL細胞株におけるNDRG2とPTENとAKTとの関係
本発明者らの知見によれば、ATL細胞株においては、図７に示すように、PTENのSer380、Thr382、Thr383のリン酸化が亢進している。PTENがリン酸化されると、PTEN本来の活性が低下することはすでに示唆されている(Leslie NR, Downes CP. (2004) PTEN function: how normal cells control it and tumour cells lose it. Biochem J. 2004;382:1-11. Review)。これらのことから、本発明者らは、ATL細胞株におけるNDRG2とPTENとAKTの挙動をウエスタンブロット法により対応するタンパク質の発現を観察、その結果、図７(A)に示すように、ATL細胞株では、PTENのリン酸化(p-PTEN)に伴い、AKTのリン酸化(p-AKT)が亢進している。またPTENのリン酸化による活性低下と同様に、NDRG2の発現の低下も認められる。同様なことは、急性型ATL細胞においても、図７(B)に示すように、NDRG2、PTENタンパク質の発現低下、PTENのリン酸化、AKTリン酸化の亢進が認められる。

NDRG2遺伝子の薬理作用；PTENの脱リン酸化作用
本発明者らは、図７におけるNDRG2の発現低下とPTENのリン酸化の関連を調べるため、ATL細胞株であるKK1、Su9T-01にNDRG2遺伝子を導入し、NDRG2安定発現ATL細胞を樹立して、同様のウエスタンブロット法により解析した。図１５はその結果である。図１５(A)に示すように、NDRG2安定発現ATL細胞株（KK1、Su9T-01）においてNDRG2を高発現させると、リン酸化PTEN(pPTEN)が減少するとともに、リン酸化AKT(pAKT)も減少する。また図１５(B)に示すように、同じATL細胞株におけるNDRG2タンパク質の高発現は、細胞増殖能の低下を引きおこす。図１６(Ａ)は、ATL細胞株においてNDRG2タンパク質を強制発現させ、NOGマウスに移植、その後の経過を観察しもので、NDRG2の発現が低下したATLコントロール細胞移植群（黒丸）では50％生存期間67日であったが、NDRG2強制発現ATL細胞移植群（白丸）では50％生存期間217日と有意な生存期間の延長が見られる。図６(D)のFOXO遺伝子群は、細胞の基本的な状況に応じた細胞増殖、代謝、細胞死、細胞修復における転写因子としての転写調節を行っている。通常状態では、FOXOは核に存在し、細胞周期の抑制、細胞死に関わる遺伝子群の転写活性化などを行うが、細胞増殖因子による刺激がくると、PI3K/AKT情報伝達系が活性化される。リン酸化AKTの刺激は、FOXOタンパク質をリン酸化し、核から細胞質に移行し、転写因子としての働きをなくし、ブレーキが利かなくなる。ATLの細胞では、PI3K/AKTが活性化された状態にあって、FOXO1タンパク質は細胞質にある。それに対して、NDRG2を高発現させたATL細胞では、PI3K/AKT情報伝達系が抑制され、AKTリン酸化が抑制されて、FOXOは核に戻り、細胞周期の抑制、細胞死を誘発する。そのために細胞増殖が抑制され、図１５(B)、１６(Ａ)の現象が起こることを示唆している。図１７(Ａ)では、ATL細胞にNDRG2を高発現させると、ATL細胞の大きな特徴である核の変形がなくなり、末梢血リンパ球でみられるような丸い正常な核の細胞に戻る。また図１７(Ｂ)が示すように、ATL細胞ではTubulinの重合が促進され核はmicrotubulusにより囲まれているため、核形が変形していることがわかる。それに対してNDRG2を入れた細胞では、その重合が消失し、核がtubulinから開放されていることがわかる。これらの一連のNDRG2のPTEN脱リン酸化作用は、本発明におけるNDRG2のATL治療薬としての可能性を十分に示している。

図１９は、図１５～１７とは逆の面から、NDRG2の脱リン酸化作用を示すものである。すなわち、図１９(A)が示すように、T-ALL細胞株においてNDRG2の発現を抑制すると、PTEN及びAKTのリン酸化(pPTEN、pAKT)が亢進する。図１９(B)における細胞の増殖曲線からも明らかなように、NDRG2の発現抑制により、コントロール細胞に比べて細胞増殖能が有意に亢進している。図１５～１７及び図１９をあわせ考えると、ATL細胞株にNDRG2遺伝子を導入、高発現させると、PTEN本来の活性を回復し、AKTのリン酸化による活性を抑制する。これらのことは、本発明のNDRG2を有効成分とするPTENの脱リン酸化剤が、遺伝子治療薬として実用し得ることを示唆している。

NDRG2タンパク質の薬理作用；PTENの脱リン酸化
本発明によれば、図１１に示すように、大腸菌由来のNDRG2タンパク質によっても、NDRG2遺伝子同様にATL細胞由来のリン酸化PTENタンパク質の脱リン酸化作用が認められる。すなわち、図１１(A)に示すように、pNPPアッセイ法により、NDRG2はフォスファターゼPP2Aと同様の脱リン酸化酵素としての性質を持つ。また4種類のフォスファターゼ阻害剤を用いて、pNPPアッセイ法によるNDRG2の酵素としての検討をみたところ、図１１(B)に示すように、プロテインフォスファターゼ2A(PP2A)をコントロールとした場合、Ser/Thr フォスファターゼ阻害剤のみが酵素阻害活性を有している。このことから、NDRG2はSer/Thr フォスファターゼとしての活性を有する酵素である。

さらに、PTENタンパク質のS380/T382/T383領域を含む16アミノ酸ペプチドに対して、それぞれ３箇所にリン酸化された合成ペプチドを作製、NDRG2タンパク質による脱リン酸化酵素特異性の検討の結果では、図１２(Ａ)に示すように、S382、S382/T383、S380/T382/T383が選択的にNDRG2による脱リン酸化反応を呈している。一方、ATL細胞株によりPTENタンパク質を免疫沈降法にて精製し、大腸菌にて作製したGFP融合NDRG2タンパク質と混合し、反応後各種PTENリン酸化抗体を用いてPTENタンパク質のリン酸化状態を検討したところ、図１２(Ｂ)に示すように、PTENタンパク質は、ATL細胞内ではS370、 S385を含み、S380/T382/T383もリン酸化されているが、NDRG2との混合によりS380、T382、T383のみが脱リン酸化され、S370とS385は変化しない。図１３(Ａ)は、DOTBLOT法によるリン酸化ペプチドに対するNDRG2の脱リン酸化反応を示しており、各種PTENリン酸化ペプチドを合成し、NDRG2タンパク質と混合し、DOTBLOT法により、2種類のPTENリン酸化抗体を用いてペプチドの脱リン酸化反応を検討した結果である。この結果から、NDRG2が脱リン酸化できるのは、T382、T382/T383、S380/T382/T383リン酸化ペプチドであり、S380のみ、T383のみのリン酸化ペプチドについては脱リン酸化することはできない。従って、NDRG2は、T382のリン酸化状態を含むPTENタンパク質のみを認識し、基質と反応するPTENのフォスファターゼである。さらに、PTENタンパク質のリン酸化部位であるS380、T382、T383について、それぞれの組み合わせで点突然変異をいれ、アミノ酸置換を行い、このPTEN変異遺伝子をHUT102細胞に導入し、PI3K/AKT情報伝達系の活性化レベルを検討した結果、図１３(Ｂ)に示すように、この3箇所のどれか一箇所でもリン酸化がない状態のPTENタンパク質が存在すれば、AKTは脱リン酸化されている。したがって、PTENは本来の機能は回復している。換言すれば、少なくともAKTのリン酸化の観点からは、PTENは3箇所ともにリン酸化されている必要があり、逆に言えば、NDRG2はPTENの前記3箇所のうち、少なくとも1箇所脱リン酸化すれば、AKTの脱リン酸化を図ることができる。図１４は、図１３(Ｂ）で行った実験を細胞増殖能の観点から検討したもので、PTENの3箇所のリン酸化部位が一箇所でも脱リン酸化されると、有意に細胞増殖能の低下が見られ、図１３(Ｂ)の結果が裏付けられている。NDRG2のかかる脱リン酸化作用は、ATL以外の他のPI3K/AKT情報伝達系を病因のひとつとするがんにおいても有効である。

NDRG2タンパク質の薬理作用；制がん作用
図８は、多くのがん細胞におけるNDRG2の制がん作用あるいはがんの予防、進展抑制、治療剤としての可能性を示唆する試験結果である。たとえば、図８(A)に示すように、多くの固形がん、PC;膵臓癌、HCC;肝細胞がん、GC;胃癌において、NDRG2及びPTENタンパク質発現低下、PTENタンパク質のリン酸化異常が存在し、AKTのリン酸化、すなわちPI3K/AKT情報伝達経路の活性化が見られる。同様に図８(B)からは、図８(A) 以外の肝臓癌、脳腫瘍、乳癌、大腸癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、口腔扁平上皮癌の細胞においても、NDRG2及びPTENタンパク質発現低下、PTENタンパク質のリン酸化異常が存在あり、AKTのリン酸化、すなわちPI3K/AKT情報伝達系の活性化が認められる。図１８(Ａ)は、膵臓癌細胞株においても、NDRG2の高発現はPTENの脱リン酸化を示している。

これらの一連の知見は、本発明のNDRG2を有効成分とするPTENの脱リン酸化剤は、ATLのみならず、PI3K/AKT情報伝達経路の活性化を病因とする種々の浮遊がん、固形がんに対して有効である。ちなみに、PI3K/AKT情報伝達系の活性化を病因とするがんには、卵巣癌、肺癌：Bellacosa A, Testa JR et al. Molecular alterations of the AKT2 oncogene in ovarian and breast carcinomas. Int. J. Cancer 64, 280-285 (1995)、卵巣癌：Shayesteh L, Gray JW et al. PIK3CA is implicated as an oncogene in ovarian cancer. Nature Genet. 21, 99-102 (1999)；Philp AJ, Phillips WA et al. The phosphatidylinositol 3′-kinase p85α gene is an oncogene in human ovarian and colon tumors. Cancer Res. 61, 7426-7429 (2001)；Ringel MD, Saji M et al. Overexpression and overactivation of Akt in thyroid carcinoma. Cancer Res. 61, 6105-6111 (2001)、膵臓癌：Cheng JQ, Testa JR et al. Amplification of AKT2 in human pancreatic cells and inhibition of AKT2 expression and tumorigenicity by antisense RNA. Proc. Natl Acad. Sci. USA 93, 3636-3641 (1996)、膵臓導管腺がん：Ruggeri BA, Testa JR et al. Amplification and overexpression of the AKT2 oncogene in a subset of human pancreatic ductal adenocarcinomas. Mol. Carcinog. 21, 81-86 (1998)）、胃癌：Byun DS, Chi SG et al. Frequent monoallelic deletion of PTEN and its reciprocal association with PIK3CA amplification in gastric carcinoma. Int. J. Cancer 104, 318-327(2003)、急性骨髄性白血病： Min YH, Ko YW et al. Constitutive phosphorylation of Akt/PKB protein in acute myeloid leukemia,its significance as a prognostic variable. Leukemia 17, 995-997 (2003)、肺癌、気管支病変：Balsara BR, Testa JR et al. Frequent activation of AKT in non-small cell lung carcinomas and preneoplastic bronchial lesions. Carcinogenesis 25, 2053-2059 (2004)などが知られている。

NDRG2とPTENの相互作用
　本発明らは、前記NDRG2のリン酸化阻害・脱リン酸化作用を確認するため、NDRG2とPTENの分子間相互作用の検討を行った。まず293T細胞にFLAG-tag付きのNDRG2及びPTENを単独、もしくは同時に遺伝子導入し、過剰発現の有無を確認した。図９(A)、パネルAは、その結果を示す。同図に示すように、Anti FLAG antibody、anti PTEN antibodyにおいて、NDRG2及びPTENはそれぞれ過剰発現している。次に、293T細胞にFLAG-tag付きのNDRG2及びPTENを単独もしくは同時に導入し過剰発現させたものを、anti FLAG 又はanti PTEN antibodyで免疫沈降を行ない、それぞれの抗体で検出を試みた。図９(A)、パネルBはその結果を示す。同図に示すように、anti Flagで免疫沈降を行い、antibodyでの検出によっても、バンドが確認できる。さらにanti PTEN antibodyで免疫沈降を行なった結果、図９(A),パネルCに示すように、同様にバンドの確認ができる。これらのことから、NDRG2の高発現系においては、NDRG2とPTENとの間には相互作用があり、NDRG2の高発現により、PTENのリン酸化阻害・脱リン酸化が行われると推認できる。

NDRG2とPTENの結合
図９(B)は、MOLT4(T-ALL)細胞株における内在性のNDRG2/PTENのタンパク質の結合を示している。すなわち、図９(B)から明らかなように、免疫共沈降法によれば、NDRG2とPTENの一方を沈降させても他方が随伴して沈降しており、両者は内在的に結合している。さらに図１０は、免疫蛍光染色法による細胞内のNDRG2とPTENの局在の一致を示している。同図においては、緑色で標識したNDRG2と赤色で標識したPTENを観察した結果、黄色く重なり合う部分が観察される。これは、NDRG2とPTENの局在が一致していることを示す。興味深いことに、NDRG2を高発現させることにより、NDRG2とPTENの局在の分布が変化し、核の形が花弁型から正常な円形に近づく。PTENはNEDD4-1によってmono ubiquitinationされることにより核移行することが報告されている(Trotman LC et al. Ubiquitination regulates PTEN nuclear import and tumor suppression. Cell. 2007; 128: 141-156)が、今回の観察によって、NDRG2もPTENの核移行に関与している可能性がある。

Claims (13)

1. PTENタンパク質のリン酸化部位T382、T383、及びS380からなる群より選択される少なくともひとつの部位のリン酸化を阻害する作用および／または脱リン酸化する作用を有するリン酸化阻害および／または脱リン酸化剤。
2. 前記リン酸化阻害および／または脱リン酸化剤が、NDRG2タンパク質またはそのペプチド断片である、請求項１記載のリン酸化阻害および／または脱リン酸化剤。
3. 　NDRG2をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入され得る形態で含むPTENのリン酸化阻害および／または脱リン酸化剤。
4. 　請求項１から３までのいずれかに記載のリン酸化阻害および／または脱リン酸化剤を有効成分とする、PTENのリン酸化によるPI3K/AKT情報伝達系の活性化を病因のひとつとする疾病の予防薬、進展抑制薬又は治療薬。
5. 前記疾病が、成人T細胞白血病（ＡＴＬ）、膵臓癌、自閉症、皮膚癌、悪性リンパ腫、前立腺癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、卵巣癌、頭頸部扁平上皮癌、食道癌、胆管癌、前立腺癌、褐色細胞腫、陰茎癌、骨肉腫、および精巣癌からなる群より選択される１種である、請求項４記載の予防薬、進展抑制薬又は治療薬。
6. 試験物質における、PTENタンパク質のリン酸化部位T382、T383、及びS380からなる群より選択される少なくとも１つの部位のリン酸化阻害能力または脱リン酸化能力を確認する工程を含む、PTENのリン酸化阻害または脱リン酸化剤のスクリーニング方法。
7. 試験物質を、PTENタンパク質のリン酸化部位T382、T383、及びS380からなる群より選択される少なくとも１つの部位がリン酸化されたPTENタンパク質またはペプチド断片と接触させる工程；該試験物質を、PTENタンパク質のリン酸化部位T382、T383、及びS380からなる群より選択される少なくともいずれか１つの部位を脱リン酸化することを指標に、選択する工程を含む、請求項６記載のスクリーニング方法。
8. PI3K/AKT情報伝達系の活性化を防ぐ薬剤のスクリーニングに用いられる請求項６または７に記載のスクリーニング方法。
9. NDRG2タンパク質又はそのペプチド断片に対する抗体を含むPTENのリン酸化促進剤。
10. 請求項９記載のPTENのリン酸化促進剤を含む、PTENの脱リン酸化によるPI3K/AKT情報伝達系の不活性化を病因の１つとする疾病の治療薬。
11. 前記疾病が糖尿病である、請求項１０記載の治療薬。
12. HTLV１又はATL細胞中のPTEN遺伝子のT382、T383、およびS380からなる群より選択される少なくともひとつの部位のリン酸化を阻害および／または脱リン酸化する方法であって、HTLV１又はATL細胞にNDRG2をコードするポリヌクレオチドを導入する工程を含む方法。
13. KLM-1又はPK45-P細胞中のPTEN遺伝子のT382、T383、およびS380からなる群より選択される少なくともひとつの部位のリン酸化を阻害および／または脱リン酸化する方法であって、KLM-1又はPK45-P細胞にNDRG2をコードするポリヌクレオチドを導入する工程を含む方法。

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