CN108290930A - Pink1 c末端结构域多肽及其用于癌症治疗的方法 - Google Patents

Pink1 c末端结构域多肽及其用于癌症治疗的方法 Download PDF

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Abstract

本公开包括PINK1‑C末端结构域(PINK1‑CTD)多肽，该多肽结合至ERBB酪氨酸激酶结构域(ERBB‑TKD)并因此妨碍ERBB的二聚体化和激活。该PINK1‑CTD多肽抑制、预防、及/或治疗表达ERBB的癌症。本公开演示了PINK1‑CTD的抗肿瘤功能，提供一个治疗表达ERBB的癌症的新方向。

Description

PINK1 C末端结构域多肽及其用于癌症治疗的方法
相关申请的交叉引用
本申请主张2015年5月1日提交的美国临时申请案US 62/155,520的优先权，该临时申请通过引用而以其整体并入本文。
技术领域
本公开涉及用于癌症治疗的多肽及使用该多肽治疗癌症的方法。更特别地，本公开涉及用于治疗表达ERBB的癌症的PINK1C末端结构域(PINK1-CTD)。
背景技术
2004年，对表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶结构域(TKD)激活突变的鉴别将肺癌的治疗引入了一个新纪元。突变的EGFR在50％的亚洲肺腺癌患者和10％的白种人肺腺癌患者中作为肺癌致癌作用的驱动基因而起作用。不同于野生型EGFR的传统的配体依赖性激活，EGFR突变体被持续地激活。被激活的EGFR突变体最普遍为外显子21L858R替换(L858R)或外显子19缺失(Ex19Del)，荷有该突变体的患者通常对EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)具有良好的初始响应，但平均在12个月后最终发展为疾病恶化。后天性T790M突变的占比超过这些有抵抗力的例子的半数。此外，原生性的T790M大约占EGFR-TKI原发性肺腺癌例子的25％，且预测对于EGFR-TKI的初始响应持续时间短。EGFR T790M突变造成ATP结合袋的构型改变，使其对于其天然基质ATP的受体亲和性增加，对于肺腺癌治疗仍属于未解决的问题(C.H.Yun et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105,2070-2075(2008))。
2001年，由于PTEN诱导的假定激酶1(PINK1)通过癌细胞中的PTEN被上调，PINK1被鉴定为潜在的肿瘤阻抑因子(M.Unoki,Y.Nakamura.Oncogene.22,2172-2185(2003))。PINK1在遗传性早发型帕金森症中的角色被报导后开始广泛的被硏究。PINK1编码581个氨基酸的蛋白质，其具有线粒体导向序列、保守的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域、和C末端结构域。它是用于线粒体质量控制的主要调节子，且通过该PI3K-AKT-mTOR信号传递链或自体吞噬途径而拥有细胞保护功能和抗细胞凋亡功能(H.Murata et al.J.Biol.Chem.286,7182-7189(2011)；G.Arena et al.Cell.Death.Differ.20,920-930(2013))。
某种程度上，对PINK1在癌症生物学中角色的报导是矛盾的。缺乏支持其肿瘤阻抑角色的直接证据。尽管PINK1基因位于染色体1p36——一个被假设为含有肿瘤阻抑活性的区域，且与肿瘤阻抑因子PTEN、FOXO3a、Beclin-1和帕金(Parkin)有关联，但其抗增殖效应无法证实,(Y.Mei et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.106,5153-5158(2009)；Y.Gong etal.Nat.Genet.46,588-594(2014))。另一方面，相当多的研究提出了PINK1的致癌角色。高通量RNA干扰筛查显示了PINK1敲除(knowdown)与紫杉醇(Taxol)敏感性之间的关系，并将PINK1鉴别为用于具有DNA错配修复缺陷的恶性肿瘤的治疗目标(S.A.Martin,M.Hewish,D.Sims,C.J.Lord,A.Ashworth.Cancer.Res.71,1836-1848(2011))。而且，已经发现，PINK1对于IGF-1依赖性AKT信号传递的最佳活化是必需的，以提升经由mTORC2进行的AKT-S473磷酸化，且调节癌细胞内的细胞循环。研究显示，PINK1在抗细胞凋亡、促进细胞运动性、和调节癌细胞内的细胞循环方法起作用(H.Murata et al.J.Biol.Chem.286,7182-7189(2011)；R.S.Akundi,L.Zhi,H.Büeler.Neurobiol.Dis.45,469-478(2012)；C.H.O'Flanagan,V.A.Morais,W.Wurst,B.De Strooper,C.O'Neill.Oncogene.(2014))。
积累的证据支持PINK1牵涉入癌症生物学中，但其确切角色仍不明。EGFR是过去十年中被研究得最多的受体酪氨酸激酶，但仍未完全理解其活化机制。对EGFR突变的鉴别和对EGFR-TKI的研发是肺癌治疗中的尖端突破，但耐药性仍是未解决的问题。因而值得通过探索PINK1与EGFR之间相互影响而研发一种治疗表达EGFR的癌症的新药剂。
发明内容
一方面，本公开提供一种结合至ERBB酪氨酸激酶结构域(ERBB-TKD)的非天然多肽。于一个具体例中，本公开提供一种包含氨基酸序列的非天然多肽或其生物学活性变体，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的一致性为至少10％，其中，该多肽结合至ERBB-TKD，且限制条件为排除与SEQ ID No:2一致的氨基酸序列。另一具体例中，本公开提供一种非天然多肽或其生物学活性变体，该多肽包含具有SEQ ID NO:1的约3个至约72个连续氨基酸残基的片段，其中，该多肽结合至ERBB-TKD。
另一方面，本公开揭露一种药物组合物，其包含治疗有效量的本公开的多肽，以及药学可接受的载剂。于一具体例中，该药学可接受的载剂是胶束、脂质体等。
一方面，本公开提供一种妨碍EGFR二聚体化和活化的方法，其包含给药治疗有效量的本公开的PINK1-CTD多肽至有此需要的受试者。于一具体例中，本公开提供一种抑制、预防及/或治疗癌症(优选表达ERBB的癌症)的方法，其包含给药治疗有效量的本公开的非天然多肽至受试者。该癌症优选为肺癌，该肺癌更优选为肺腺癌。
附图说明
图1A至1C显示了肺腺癌细胞内PINK1与EGFR的相互作用。图1A：CL1-5、PC9、H1975和H3255细胞中的内源性EGFR-pY1068、EGFR和PINK1的免疫印迹分析；图1B：免疫沉淀反应，显示了内源性PINK1与EGFR的相互作用；以及，图1C：在CL1-5细胞内共同过度表达野生型EGFR-GFP(绿色)和PINK1-myc(红色)。共聚焦图像表明EGFR与PINK1的共定位(淡黄色)(I和II)。3D结构照明显微镜图像具体揭露了细胞浆膜下的相互作用(III和IV)。
图2A至2E显示了PINK1对EGFR二聚体化和内化的抑制。图2A：免疫印迹分析，表明了在CL1-5、PC9、H1975和H3255细胞内，总EGFR随着PINK1敲除而减少；图2B和2C：RT-qPCR，显示EGFR mRNA未减少，但PINK1mRNA显著减少；图2D：EGFR二聚体化试验，表明了当将各对照组和敲除组中的EGFR单体归一化为与相等时，在PINK1敲除下的EGFR二聚体与单体的比增加；以及，图2E：在PINK1敲除下，EGFR蛋白的膜性部分减少而EGFR蛋白的细胞质部分增加，表明受体内化的增加。
图3A至3E显示PINK1-CTD与EGFR-TKD的直接相互作用。图3A：9标记融合EGFR构造的示意图，该构造含有氨基酸1至1210、1至378、1至621、1至644、1至690、1至954、645至1210、645至954、和955至1210；图3B：免疫沉淀反应结果，显示了仅含有该酪氨酸激酶结构域的构造E、F、G和I(A中的星号)与PINK1相互作用；图3C：8myc融合PINK1构造的示意图，该构造含有氨基酸1至581、1至509、1至155、156至509、156至309、310至428、429至581和78至581；图3D：免疫沉淀反应结果，显示仅含有该C末端结构域的构造A、G和H(C中的星号)与EGFR相互作用；图3E：体外GST断开试验，论证了PINK1-CTD与EGFR-TKD的直接相互作用。MTS：线粒体导向序列。TM：跨膜结构域。
图4显示了PINK1敲除对EGFR途径的影响。免疫印迹分析显示，在PINK1敲除下，全部测试细胞内的EGFR-Y1068磷酸化均增加。PINK1敲除加强了EGFR成瘾(EGFR-addicted)的PC9、H1975和H3255细胞中的EGFR途径活化，但衰减了CL1-5细胞中的AKT-S473磷酸化和A549细胞中的STAT3-Y705磷酸化。
图5A至5C显示，PINK1-CTD抑制肺癌细胞内的HER1(EGFR)和HER2磷酸化。图5A：2μMCTD多肽有效地抑制了CL1-5、HOP62、PC9和H1975中的EGFR磷酸化；图5B：CTD处置，显示了对CL1-5细胞内的HER2磷酸化的剂量依赖性抑制；图5C：ERBB1至ERBB4的酪氨酸激酶结构域(HER1至HER4)的氨基酸序列对准，显示了高度序列同源性。R9：由9个精氨酸残基组成的肽。
图6A至6L显示了稳定表达shPINK1、PINK1和PINK1-CTD的肺癌细胞移植瘤。图A、D、G和J：PINK1过度表达加重了CL1-5细胞内的肿瘤生长，但阻抑了PC9、H1975和H3255细胞内的肿瘤生长；图B、E、H和K：PINK1-CTD过度表达抑制了所有测试细胞内的肿瘤生长；图C、F、I和L：PINK1敲除抑制了CL1-5细胞内的肿瘤生长，但促进了PC9、H1975和H3255细胞内的肿瘤生长。各组中N＝7。
图7A至7C显示PINK1对EGFR二聚体化的抑制。图7A：免疫印迹分析，论证了在CL1-5、PC9、H1975和H3255细胞内，总EGFR随着PINK1过度表达而增加；图7B：EGFR mRNA的RT-qPCR分析，显示当PINK1被过度表达时，EGFR mRNA无明显改变；以及，图7C：CL1-5、PC9、H1975和H3255细胞的EGFR二聚体化试验，表明当将各对照组和过度表达组中的EGFR单体归一化为相等时，在PINK1过度表达下，EGFR二聚体与单体的比下降。
图8显示PINK1过度表达对EGFR途径的影响。免疫印迹分析表明，所有测试细胞内，EGFR-Y1068随着PINK1过度表达而衰减。在EGFR成瘾的PC9和H1975细胞内，PINK1过度表达与STAT3-Y705、AKT-S473、或ERK-T202/Y204的磷酸化同步进行。在H3255细胞内，PINK1过度表达衰减了STAT3-Y705和AKT-S473磷酸化，但提升了ERK-T202/Y204磷酸化。在EGFR非成瘾(EGFR non-addicted)的CL1-5和A549细胞内，PINK1过度表达增加了STAT3-Y705、AKT-S473、或ERK-T202/Y204的磷酸化，但EGFR-Y1068磷酸化被阻抑。
图9A和9B显示PINK1-CTD对EGFR二聚体化和活化的阻碍。图9A：CL1-5、PC9、H1975和H3255细胞的EGFR二聚体化试验，论证了当将个对照组和过度表达组中的EGFR单体归一化为相等时，在PINK1-CTD过度表达下，EGFR二聚体与单体的比下降；以及，图9B：免疫印迹分析结果，显示在分析的所有细胞内，磷酸化的EGFR-Y1068与总EGFR的比均下降。在EGFR成瘾的PC9、H1975和H3255细胞内，在PINK1-CTD过度表达下，EGFR下游信号传递被同步下调。在野生型EGFR CL1-5细胞内，当EGFR-Y1068磷酸化被PINK1-CTD衰减时，仅STAT3-Y705磷酸化有所下降。
图10显示瘤的异种移植汇总图。PINK1过度表达加重了CL1-5细胞内的肿瘤生长，但阻抑了PC9、H1975和H3255细胞内的肿瘤生长。在所有测试细胞内，PINK1-CTD过度表达均抑制肿瘤生长。PINK1敲除抑制CL1-5细胞内的肿瘤生长，但促进PC9和H1975细胞内的肿瘤生长。每组中N＝7。
图11A至11C显示，CTD处置抑制了肿瘤生长。图11A和11B：CTD处置抑制了CL1-5和H1975肺癌鼠异种移植物模型中的体内肿瘤生长。图11C：CTD处置减少了癌细胞存活率，如体外MTT试验所论证。R9：由9个精氨酸残基组成的肽。
具体实施方式
对EGFR突变的鉴别和对EGFR-TKI的研发是肺癌治疗中的尖端突破，但耐药性仍是未解决的问题。本公开至少基于ERBB与PINK1的相互影响，且剖析PINK1在表达ERBB的癌症中扮演的角色。本公开论证了PINK1C末端结构域(PINK1-CTD)的抗肿瘤功能，提供一个治疗表达ERBB的癌症的新方向。
定义
在揭露并阐述本发明的核苷酸、多肽、组合物、物件、装置、及/或方法之前，应理解，本公开并非受限于具体的合成方法、具体的处置方案、或特定的纯化过程，当然，就其本身而言，可改变。也应理解，本文中使用的术语仅用于描述特定具体例的目的，而非意图对其加以限制。
本文中，除非上下文中明确排除，单数形式“一”和“该”包括复数个对象。因此，例如，“一多肽”的说法包括多肽的混合物，“一药学载剂”的说明包括两种或更多载剂的混合物，等等。
本文中，术语“多肽”是优选仅仅通过肽键结合在一起的氨基酸残基的聚合物，而无论其是天然产生的或是合成的。通过非宿主DNA分子的表达而生产的多肽是“异源性”肽或多肽。“氨基酸残基”可以是天然或非天然的氨基酸残基，通过肽键或不同于肽键的键链接。该氨基酸残基可以是D构型或L构型。
本文中，术语“分离的多肽”或“纯化的多肽”是基本上不含污染性细胞成分如碳水化合物、脂质、或在天然环境中与该多肽相关联的多肽性杂质的多肽。典型地，分离的多肽制剂含有高度纯化形式的多肽。一种显示特定多肽制剂含有分离的多肽的途径为，在对该多肽制剂进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析并以考马斯亮蓝染色该凝胶后，出现单一条带。但是，术语“分离的”并不排除以其它物理形式如二聚体或其它糖基化或衍生形式存在的相同多肽。
本文中，术语“氨基端”与“羧基端”用来指示多肽内的位置。若上下文允许，则这些术语参考多肽的特定序列或部分使用，以指示大概位置或相对位置。例如，定位为多肽内参考序列羧基端的某一序列，是位于最接近该参考序列的羧基端处，但并非一定是该完整多肽的羧基末端。
本文中，术语“序列一致性”或，例如，包含“具有10％的序列一致性”是指，在整个比较窗口中，序列以一个接一个核苷酸或一个接一个氨基酸为基准的一致性程度。因此，可通过下述计算“序列一致性的百分比”：比较在比较窗口内两个最适宜地对准的序列，确定两个序列中出现一致的核酸碱基(如，A、T、C、G、I)或一致的氨基酸残基(如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置数，得到匹配位置数，该匹配位置数除以比较窗口内位置的总数(即，窗口尺寸)，结果再乘以100，得到序列一致性的百分比。所包括的是与本文中揭示的任何参考序列(见，如，序列表)具有至少约10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列一致性的核苷酸和多肽，典型地，该多肽变体保持该参考多肽的至少一种生物学活性。
本文中，术语“表达”是指基因产物的生物合成。例如，在结构性基因的例子中，表达牵涉该结构性基因转录入mRNA中且将mRNA转译为一种或多种多肽。
本文中，术语“核酸”意图包括DNA分子(如，cDNA或基因组DNA)和RNA分子(如，mRNA)以及使用核苷酸类似物生成的DNA或RNA的类似物。该核酸可以是单链的或双链的。
本文中，术语“受试者”或“患者”可互换地使用，且指动物。一种具体具体例中，受试者是哺乳动物。另一具体例中，受试者是人。
本文中，术语“治疗”和“疗法”可指任何可用于预防或治疗癌症或疾病或与其相关联的症状的方案、方法、组合物、制剂、及/或剂。某些具体例中，术语“治疗”和“疗法”指生物学疗法、支持疗法、及/或该领域技术人员已知的其它可用于治疗或预防癌症或疾病或与其相关联的症状的疗法。
本文中，术语“治疗有效量”是指，足以导致对癌症及其一种或多种症状的发展、复发或发病的预防的量，以提升或改善另一疗法的预防性效果、减轻癌症严重性并缩短持续时间、缓解癌症的一种或多种症状、防止癌症前行、造成癌症的退行、及/或提升或改善另一疗法的治疗性效应。
本文中，在将一疗法给予受试者的上下文中，术语“合用”是指使用超过一种疗法(如，预防性及/或治疗性)。术语“合用”的使用并不限制疗法的次序，可同时或依次将第二种疗法给予曾患、正患或易患癌症的受试者。一些具体例中，这些疗法依次且在一定时间跨度内给予受试者，因此疗法可一起作用。于于一具体例中，这些疗法依次且在一定时间跨度内给予受试者，因此它们提供比以其它方式给予者增加的益处。任何额外的疗法可以任何次序与其它额外疗法给予至受试者。
本文中，在将一疗法给予受试者的上下文中，术语“预防”(prevent、preventing和prevention)是指，由给予疗法(如，预防剂或治疗剂)或疗法的组合(如，预防剂或治疗剂的组合)而导致的对受试者体内脑癌及其症状的复发、发病、及/或发展的预防或抑制。
本文中，该PTEN诱导假定激酶1(PINK1)是由PINK1基因编码的线粒体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。PINK1活性造成帕金蛋白(parkin protein)结合至去极化的线粒体，以诱导那些线粒体的自我吞噬。
本文中，成红细胞白血病病毒致癌基因同源物(ERRB)包括四个成员：EGFR(EGF受体)/ErbB1/Her1(神经调节蛋白(heregulin)1)、ErbB2/Her2(神经调节蛋白2)、ErbB3/Her3(神经调节蛋白3)、和ErbB4/Her4(神经调节蛋白4)。ErbB过度表达与乳腺、前列腺、卵巢、肝、膀胱、食道、喉、胃、结肠、和肺的肿瘤发生有关联。
本文中，表皮生长因子(EGFR；在人体内也称为ErbB-1和HER1)是用于细胞外蛋白配体的表皮生长因子受体家族(EGF家族)成员的细胞表面受体。
本文中，术语“突变体”或“突变”是指，具有不同于野生型分子结构的分子(如，多肽或多核苷酸)。其结构与野生型分子的不同之处包括，而不限于，不同的序列(如，不同的氨基酸序列或核苷酸序列)、额外的序列、缺少的序列(即，该序列的一部分缺少了)、修饰的改变(甲基化、磷酸化等)、及/或野生型分子的一部分或全部与另一分子的融合。术语“野生型”是指一种基因或基因产物(如，多肽)，其具有当该基因或基因产物从天然来源分离时所具有的特征。野生型基因或基因产物是最频繁见于种群中的基因或基因产物，并因此被任意地设计为该基因的“正常”或“野生型”形式。
PINK1C末端结构域(PINK1-CTD)多肽
本公开包含PINK1-CTD多肽，该多肽结合至ERBB酪氨酸激酶结构域(ERBB-TKD)并因此妨碍EGFR的活化。该PINK1-CTD多肽的功能为抑制、预防及/或治疗表达ERBB的癌症。特别地，仅使用该PINK1-CTD多肽即可直接抑制野生型和突变体EGFR细胞内的EGFR活化并阻抑肿瘤生长。本公开揭露，PINK1与HER1物理性联合并阻抑其信号传导，且暗示PINK1-CTD在治疗表达ERBB的癌症中的治疗性潜力。
一方面，本公开提供一种结合至ERBB酪氨酸激酶结构域(ERBB-TKD)的多肽。
于一具体例中，本公开提供一种包含氨基酸序列的多肽或其生物学活性变体，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的序列一致性为至少10％，其中，该多肽结合至EGFR-TKD。又一具体例中，本公开提供一种包含氨基酸序列的多肽或其生物学活性变体，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的序列一致性为至少10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
于一具体例中，本公开提供一种多肽，其包含具有一个或多个替换、缺失、加成及/或插入的经修饰的SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中，该多肽结合至ERBB-TKD。
于一具体例中，本公开提供一种多肽或其生物学活性变体，该多肽包含具有SEQID NO:1的约3至约72个连续氨基酸残基的片段，其中，该多肽结合至ERBB-TKD。于一具体例中，该ERBB-TKD是EGFR-TKD。一些具体例中，该多肽是3至10、10至15、10至20、10至25、10至30、10至40、10至50、或10至60、10至70个氨基酸通过共价酰胺键链接的聚合物。一些具体例中，该多肽包含约3至约70、约3至约60、约3至约50、约3至约40、约3至约30、约3至约20、约10至约70、约10至约60、约10至约50、约10至约40、约10至约30、或约10至约20、约10至约15个氨基酸残基。多肽可以是8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、71、72、或更多个氨基酸通过共价酰胺键链接的聚合物。
于一具体例中，本公开提供一种进一步包含一个或多个额外的氨基酸序列的多肽。于一具体例中，该额外的氨基酸序列可以是肽、蛋白质标签序列、导向序列、穿透肽序列(如，细胞穿透序列)、或链接序列(如，可由蛋白酶如蛋白内切酶降解的序列)。又一具体例中，该肽或蛋白质标签可以是多组氨酸-标签。一些具体例中，该传统肽序列可包括用于膜依附和内化的9个精氨酸残基。
SEQ ID NO:1的氨基酸序列如下：
SLWGEHILALK NLKLDKMVGW LLQQSAATLL ANRLTEKCCV ETKMKMLFLA NLECETLCQAALLLCSWRAA L(SEQ ID NO:1)
本公开的PINK-CTD多肽位于从PINK1的氨基酸510至581的PINK1C末端结构域。PINK1的序列如下：
可使用标准DNA重组技术来制备本公开的多肽。于一具体例中，可通过PINK1片段序列的聚合酶链反应(PCR)扩增而获得编码该PINK1-CTD片段的DNA(见，Erlich编纂的《PCR技术：原理和在DNA扩增中的应用》(PCR Technology:Principles and Applications forDNA Amplification,Erlich(ed.)),Stockton Press(1989))。随后，可轻易地将所扩增的PINK1-CTD片段DNA插入表达载体内。载体可以是任何数目的核酸，所希望的序列可通过限制和结扎插入载体中，以用于在不同遗传环境或之间运输或用于在宿主细胞内表达。载体典型由DNA构成，但也可使用RNA载体。载体包括，但不限于，质粒和噬菌粒。克隆载体是能在宿主细胞内复制的载体，其进一步的特征是一个或多个核酸内切酶限制位点，该载体可在该位点为切割为可确定的样式，且可将所希望的DNA序列结扎入该位点，从而新的重组载体保留其在宿主细胞内复制的能力。可通过在宿主细胞内表达给编码核酸而生产本公开的PINK1-CTD分离的多肽。该核酸可转化或转染至宿主细胞内。据此，本公开的一些方面包括编码该PINK1-CTD分离的多肽的核酸的转化及/或转染。转化是将外源或异源核酸引入原核细胞的内部。转染是将外源或异源核酸引入真核细胞的内部。转化或转染核酸可整合或不整合(共价链接)入构成该细胞基因组的染色体DNA中。在原核生物体内，例如，转化核酸可依靠游离基因元件如质粒或病毒载体供养。至于真核细胞，被稳定转染的细胞是转染核酸已经变为被整合入染色体内的细胞，因此该转染核酸通过染色体复制而被子细胞所继承。这一稳定性通过真核细胞构建由含有所转染的核酸的子细胞群体所构成的细胞系或克隆体的能力得以证明。
另一种制备编码多肽氨基酸序列的核酸分子的手段为，使用该领域技术人员所熟知的方法如Engels et al.,1989,Angew.Chem.Intl.Ed.28:716-34中揭示的那些方法进行化学合成。这些方法包括，尤其是，用于核酸合成的磷酸三酯、亚磷酰胺、和H-磷酸酯方法。用于此类化学合成的优选方法是使用标准亚磷酰胺化学进行的聚合物支持合成。也可使用该领域技术人员所知的其它方法。
根据本公开，仅使用本公开的PINK1-CTD多肽即可直接抑制野生型和突变体EGFR细胞内的EGFR活化，并阻抑体内肿瘤生长，借以暗示PINK1-CTD在癌症治疗中的治疗性潜力。
EGFR中的激活突变将其转变为表达EGFR的癌症中的驱动子致癌基因。“EGFR突变体”包括EGFR分子中任何类型的使得该EGFR突变体不同于野生型EGFR的突变(即，改变)。一些具体例中，该突变增加EGFR分子的激酶活性剂/或使得肿瘤细胞对一种或多种EGFR抑制剂敏感。一些具体例中，该突变位于EGFR的激酶结构域内。一些具体例中，该突变位于人EGFR基因的外显子18至21中的一个内。最常见的EGFR突变时外显子19内的缺失(如，外显子19中的15-bp核苷酸框内缺失(Del E746-A750)和外显子21中的密码子858内以精氨酸替代亮氨酸的点突变(L858R)。对癌细胞中突变基因产物进行检测的能力可鉴别最有可能从此类疗法中获益的患者，且做出更有效的临床试验并获得更多信息。
可通过该领域已知的标准手段检测EGFR突变体。例如，可通过定序、使用引物及/或对野生型或突变体序列为特异性的探针进行核酸扩增、以及用以检测缺失性突变体的扩增和长度分析，来检测突变体。例示性的测定EGFR突变状态的方法揭露于Rosell et al.,2009,N.Engl.J.Med.,361:958-967和Li et al.,2011,PLoS ONE,6:e28204中。用于核酸分析的试剂盒可商购，如EGFR Pyro试剂盒(QIAGEN)、EGFR PCR试剂盒(QIAGEN)、和EGFR RGQPCR试剂盒(QIAGEN)。该EGFR RGQ PCR试剂盒能检测EGFR基因中的29种突变，包括外显子19、T790M、L858R、L861A、S768I、和G719X中的19处缺失(检测G719S、G719A、或G719C的存在，但不对它们进行区分)。
特异性EGFR突变体可使用突变体特异性抗体如EGF受体(E746-A750del特异性)(6B6)XP.RTM.兔mAb或EGF受体(L858R突变体特异性)(43B2)兔mAb(两种受体均来自CellSignaling Technology,Inc.(Danvers,Mass.))或突变特异性AQUA肽(Stemmann et al.,2001,
Cell,107:715-726)在多肽水平上(如，通过蛋白质印迹分析或免疫组化分析)检测。突变体特异性抗体可制备为特异性地结合至其它已鉴别的突变体EGFR多肽。
给药和药物组合物
另一方面，本公开提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的本公开的PINK1-CTD分离的多肽。于一具体例中，本公开的药物组合物是阻抑因子，其通过物理关联而抑制HER活化。于一具体例中，本公开的药物组合物进一步包含额外的抗癌剂。该额外的抗癌剂优选为EGFR抑制剂。多种EGFR抑制剂是已知的且可用于本文中揭露的方法中，该抑制剂包括吉非替尼(gefitinib)、埃罗替尼(erlotinib)、西妥昔单抗(cetuximab)、阿法替尼(afatinib)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、PF299804(Janneet al.,2011,Clin.Cancer Res.,17:1131-39)、RO5083945(糖工程化抗EGFR单克隆抗体；Hoffmann-La Roche；Markman et al.,2010,J.Clin.Oncol.,28:15s,abstr 2522)、ABT-806(人源化抗EGFR单克隆抗体；Abbott)、NVP-TAE684(Katayama et al.,2011,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,108:7535-40)、和AP26113。
一方面，本公开提供一种妨碍EGFR二聚体化和活化的方法，其包含给药治疗有效量的本公开的PINK1-CTD分离的多肽至受试者。于一具体例中，本公开提供一种抑制、预防及/或治疗癌症的方法，其包含给药治疗有效量的本公开的PINK1-CTD分离的多肽至受试者。于一具体例中，该癌症是表达ERBB的癌症，如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、食道癌、喉癌、胃癌、结肠癌、和肺癌；更优选为肺癌；该肺癌更优选为肺腺癌。一些具体例中，该肺癌是小细胞肺癌(SCLC)或非小细胞肺癌(NSCLC)。
该药物组合物可进一步包含药学可接受的载剂、赋形剂、或该领域已知的稳定剂(通常见于Remington,(2005)The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams and Wilkins)。制剂被作成适用于给药模式。通常，给药蛋白质的方法是该领域技术人员已知的，且可用于本公开的多肽的给药。
通过任何常用于将分子引入最终于血液或组织细胞接触的途径给药。在本公开的上下文中，将这些多肽给药至受试者的适当方法是可用的，且尽管超过一种路径可用来给药特定的组合物，特定的途径一般可提供比另一途径更即时且更有效的作用或反应。
药学可接受的载剂可部分地通过待给药的特定组合物而定，以及通过待用来给药该组合物的特定方法而定。据此，本公开适当的药物组合物的制剂存在各种变化。
本公开的PINK1-CTD分离的多肽可通过适用于蛋白质或肽的任何传统路径给药，包括但不限于，适用于口服给药、直肠给药、外用给药、吸入给药(包括但不限于，经由气溶胶给药)、颊腔给药(包括但不限于，舌下给药)、阴道给药、肠道外给药(包括但不限于，皮下、肌肉内、皮内、关节内、胸膜内、腹膜内、脑内、鞘内、动脉内、或静脉内给药)、外用给药(即，皮肤和粘膜表面，包括气管表面)、肺部给药、眼内给药、鼻内给药、和透皮给药，但任何给定情形中最适当的路径将取决于待治疗病症的特性和严重性。给药可以是局部的或全身的。本公开的PINK1-CTD分离的多肽可与其它剂或疗法合用。
适用于肠胃外给药如，举例而言，关节内(在关节内部)、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内和皮下途径的制剂，包括水性和非水性的、等渗的无菌注射液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、以及令该制剂与预定接收者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性的无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、和防腐剂。本公开的PINK1-CTD分离的多肽的制剂可作为密封在容器如安瓿和小瓶内的单剂或多剂形式而存在。
在本公开的上下文中，依据应用，给药至受试者的剂量足以在患者体内随时间而具备有益的治疗性响应、或其它适宜的活性。通过本公开的特定PINK1-CTD分离的多肽或制剂的效力、所采用的多肽的活性、该受试者的情况以及待治疗的该受试者的体重或表面积，从而确定剂量。也通过伴随给药特定载体、制剂等至特定受试者体内的任何副作用的存在、特性和程度，从而确定剂量的大小。
所给药的剂量典型处于与目前使用的治疗性蛋白质等效的范围内，根据所改变的活性和相关组合物的血浆半衰期而调整。本公开的PINK1-CTD分离的多肽或本公开的药物组合物可通过任何传统疗法补充处置条件，该疗法包括放疗、化疗、免疫疗法、给药抗体、给药疫苗、或给药细胞毒性剂等。例如，化疗包含给药额外的抗癌剂至受试者。
[实施例]
实施例1：肺腺癌中PINK1与EGFR的相互作用
为了测定肺腺癌中PINK1与EGFR是否相互作用，首先通过免疫印迹分析在荷有不同类型EGFR的四种肺腺癌细胞系中检查内源性PINK1和EGFR，四种细胞系为：CL1-5(野生型)、PC9(Ex19Del)、H1975(L858R+T790M)和H3255(L858R)(图1A)。随后，使用EGFR单克隆抗体对总细胞裂解液进行免疫沉淀分析，并使用PINK1抗体进行免疫印迹分析。结果表明，在四种免疫沉淀物中均检测到PINK1，表明内源性蛋白复合物的形成(图1B)。为了形象化PINK1与EGFR蛋白的相互作用，将野生型EGFR-GFP与PINK1-myc在CL1-5细胞内共同过度表达。结果显示，这两种蛋白质被共定位在CL1-5细胞内，且该共定位大多出现在刚好处于细胞质膜下方的位置(图1C)。这些数据暗示，无论EGFR是否为突变状态，这两种蛋白激酶之间都可能存在相互作用。
实施例2.PINK1对EGFR二聚体化和内化的抑制
由于PINK1与EGFR之间可能存在相互作用，接着研究PINK1在EGFR中的潜在角色。将CL1-5、PC9、H1975和H3255细胞内的PINK1敲除，发现总EGFR蛋白质下降，而EGFR mRNA表达未同步下调(图2A、2B和2C)。蛋白质水平下降而mRNA表达未同时下滑暗示了蛋白质周转的增广。基于目前的知识，EGFR周转由受体二聚体化和内化介导(A.V.Vieira,C.Lamaze,S.L.Schmid.Science.274,2086-2089(1996)；R.Heukers et al.J.Cell.Sci.126,4900-4912(2013)；和A.Tomas,C.E.Futter,E.R.Trends.Cell.Biol.24,26-34(2014))。因此，研究PINK1是否在这些过程中扮演角色。为了评估EGFR二聚体化在PINK1操纵下的改变，使用溶酶体抑制剂(20mM NH4Cl)和蛋白酶体抑制剂(10μM MG132)处理PINK1敲除细胞和实验性对照细胞6小时后，使用BS3进行基于细胞的蛋白质二聚体化。对于CL1-5细胞，在收割细胞前的20分钟给药EGF(50ng/mL)。通过梯度SDS-PAGE进行的分析和免疫印迹分析显示，EGFR二聚体与单体的比随着PINK1敲除而增加。观察荷有不同类型EGFR的CL1-5、PC9、H1975和H3255细胞的情况(图2D)。为了测定EGFR内化是否与增加的二聚体与单体的比一起提升，将总细胞裂解液分为细胞膜性部分和细胞质部分，以查验EGFR的亚细胞分布。如通过CL1-5和H1975细胞所论证的，在PINK1敲除下，EGFR的膜性部分下降而EGFR的细胞质部分增加，表明受体内化的增加(图2E)。数据显示，PINK1敲除促进了EGFR二聚体化和内化，这导致总EGFR蛋白水平的下降。
此后，为了阐明过量的PINK1蛋白是否导致相反的现象，将PINK1在CL1-5、PC9、H1975和H3255细胞内过度表达。结果显示，总EGFR蛋白增加，而EGFR mRNA表达没有显著变化(图7A和7B)。同样，当PINK1过度表达时，EGFR二聚体与单体的比有所下降(图7C)。总体来看，这些数据暗示，PINK1通过其在EGFR蛋白二聚体化、内化和周转中扮演的角色而影响EGFR总蛋白水平。
实施例3.PINK1-CTD与EGFR-TKD的直接相互作用
为了剖析PINK1与EGFR的相互作用，随后研究了这两种蛋白激酶是否直接相互作用且通过其相互影响的结构域而相互作用。基于不同的EGFR功能性结构域(氨基酸1至378、1至621、1至644、1至690、1至954、645至1210、645至954、955至1210)，构建标记融合的全长度EGFR构造、EGFR-标记(氨基酸1至1210)和8个逐级截短的EGFR-标记构造(图3A)。将这9种构造各自在HEK293细胞内与全长度PINK1共同过度表达。通过抗-标记抗体对细胞裂解液进行免疫沉淀分析，并通过PINK1抗体对免疫沉淀物进行免疫印迹分析。数据显示，仅全长度EGFR-标记构造和含有氨基酸1至954、645至1210、和655至954的构造与PINK1相互作用，表明EGFR-TKD对于PINK1结合是重要的区域(图3B)。同时，构建myc-融合的全长度PINK1构造和另外7个分别含有氨基酸1至509、1至155、156至509、156至309、310至428、429至581和78至581的截短的PINK1-myc构造(图3C)。将这8种构造各自在HEK293细胞内与全长度EGFR-标记共同转染。通过抗-myc抗体对细胞裂解液进行免疫沉淀分析，并使用抗-标记抗体进行免疫印迹分析。数据表明，PINK蛋白的氨基酸510至581是潜在的与EGFR-TKD相互作用的区域(图3D)。为了进一步验证EGFR-TKD与PINK1-CTD之间存在直接的相互反应，实施体外GST抓取试验。使用His示踪的EGFR-TKD(氨基酸645至954)单独地孵化重组GST融合PINK1-CTD(氨基酸510至581)与阴性对照构造GST融合PINK1310-428(氨基酸310至428)，并使用抗His抗体进行免疫印迹分析(图3E)。结果显示，PINK1-CTD直接键结至EGFR-TKD。这些数据表明，PINK1通过PINK1-CTD和EGFR-TKD直接与EGFR相互作用。这一相互作用在EGFR受体二聚体化、内化和周转中扮演角色。
实施例4.PINK1-CTD对HER1和HER2磷酸化的抑制
为了测定PINK1-CTD与HER1或HER2的相互作用，将PINK1-CTD多肽与CL1-5、HOP62、PC9或H1975细胞共同培养。本实施例中，所使用的PINK1-CTD是由GenmedkiaBiotechnology Corp.合成的，其它与9个精氨酸残基缀合用于依附细胞膜和内化。使用其中细胞与仅具有9个精氨酸残基的肽(R9)共同培养的组别作为对照组。结果显示，CTD多肽有效地抑制了CL1-5、HOP62、PC9和H1975细胞内的EGFR(HER1)磷酸化(图5A)。另外，CTD多肽以剂量依赖性模式抑制CL1-5细胞内的HER2磷酸化(图5B)。实施ERBB1至ERBB4的酪氨酸激酶结构域(HER1至HER4)的氨基酸序列对准，结果显示，ERBB1至ERBB4显现了高度序列同源性(图5C)。
实施例5.在EGFR非成瘾的细胞内，PINK1加重体内肿瘤生长
在分子信号传递的研究中，代表性的体内表型变异特别重要。有报导指出，PINK1敲除减少了若干野生型EGFR细胞模型中的细胞增殖(C.H.O'Flanagan,V.A.Morais,W.Wurst,B.De Strooper,C.O'Neill.Oncogene.(2014))。为了检查野生型EGFR肺腺癌细胞内是否存在这一现象，使用稳定表达shPINK1和PINK1的EGFR野生型CL1-5细胞评估体内肿瘤生长。结果显示，PINK1敲除迟滞了肿瘤生长，而PINK1过度表达加重了肿瘤生长(图6A和6C，和图10)。观察结果与免疫印迹分析结果相符，且与PINK1在肿瘤发生中起致癌基因作用的通常理解相一致(图4和图8)(H.Murata et al.J.Biol.Chem.286,7182-7189(2011)；J.P.MacKeigan,L.O.Murphy,J.Blenis.Nat.Cell.Biol.7,591-600(2005)；S.A.Martin,M.Hewish,D.Sims,C.J.Lord,A.Ashworth.Cancer.Res.71,1836-1848(2011)；R.S.Akundi,L.Zhi,H.Büeler.Neurobiol.Dis.45,469-478(2012)；和C.H.O'Flanagan,V.A.Morais,W.Wurst,B.De Strooper,C.O'Neill.Oncogene.(2014))。
实施例6.EGFR成瘾的细胞内，PINK1对体内肿瘤生长的抑制
尽管PINK1促进CL1-5细胞内的肿瘤生长，其形势与EGFR成瘾的突变体细胞PC9、H1975和H3255相反。在移植瘤实验中使用稳定表达ShPINK1和PINK1的细胞。结果显示，PINK1敲除加速肿瘤生长，这与免疫印迹分析所显示的提升EGFR途径活化(图6F、6I和6L，图4，和图10)相一致。相比之下，PINK1过度表达似乎迟滞肿瘤生长，包括表达EGFR T790M突变体的H1975异种移植物的生长(图6D、6G和6J，图8，和图10)。由此而论，PINK1充当了肿瘤阻抑因子，该角色本来在其首次鉴别时即被提出但一直未被核实(M.Unoki,Y.Nakamura.Oncogene.22,2172-2185(2003))。总之，这些数据提示，所观察到的不同细胞类型间的差异可归因于是否EGFR成瘾。
实施例7.PINK1-CTD对EGFR成瘾的细胞和EGFR非成瘾的细胞的抗肿瘤效应
此后，研究未定表达PINK1-CTD的CL1-5、PC9、H1975和H3255细胞内的体内肿瘤生长。已经显示，PINK1-CTD抑制EGFR活化。它不仅下调EGFR成瘾的PC9、H1975和H3255细胞内的EGFR下游信号传递，而且衰减EGFR非成瘾的CL1-5细胞内的STAT3-Y705磷酸化(图9A和9B)。与免疫印迹分析结果一致，体内移植瘤证实，PINK1-CTD在所有测试细胞内发挥抑制效应(图6B、6E、6H和6K)。此外，在鼠异种移植物模型中使用合成多肽PINK1-CTD(GenmedkiaBiotechnology Corp.)。每天或每两天，将2μM的CTD多肽或R9肽(作为对照组)注射入该鼠体内(如图11A和11B中箭头所示)。结果显示，PINK1-CTD处置抑制了CL1-5和H1975肺癌鼠异种移植物模型中的体内肿瘤生长(图11A和11B)。这一观察结果与体外MTT试验结果不矛盾，体外MTT试验结果显示，2μM的CTD多肽减少了CL1-5、H1975、PC9和Hop62的存活率(图11C)。
这些结果强化了下述推测：PINK1的致癌功能存在于其C末端结构域之外的区域内，且PINK1-CTD的肿瘤抑制效应依赖于细胞对EGFR信号传递的依赖性。即使CL1-5是EGFR非成瘾的，所观察到的PINK1-CTD的肿瘤制动效应暗示了CL1-5细胞内畸变EGFR-STAT3信号传递的重要性，因此，该结果指向PINK1-CTD在肺腺癌中的治疗潜力。
序列表
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Ser Leu Trp Gly Glu His Ile Leu Ala Leu Lys Asn Leu Lys Leu Asp
1 5 10 15
Lys Met Val Gly Trp Leu Leu Gln Gln Ser Ala Ala Thr Leu Leu Ala
20 25 30
Asn Arg Leu Thr Glu Lys Cys Cys Val Glu Thr Lys Met Lys Met Leu
35 40 45
Phe Leu Ala Asn Leu Glu Cys Glu Thr Leu Cys Gln Ala Ala Leu Leu
50 55 60
Leu Cys Ser Trp Arg Ala Ala Leu
65 70
<210> 2
<211> 581
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Met Ala Val Arg Gln Ala Leu Gly Arg Gly Leu Gln Leu Gly Arg Ala
1 5 10 15
Leu Leu Leu Arg Phe Thr Gly Lys Pro Gly Arg Ala Tyr Gly Leu Gly
20 25 30
Arg Pro Gly Pro Ala Ala Gly Cys Val Arg Gly Glu Arg Pro Gly Trp
35 40 45
Ala Ala Gly Pro Gly Ala Glu Pro Arg Arg Val Gly Leu Gly Leu Pro
50 55 60
Asn Arg Leu Arg Phe Phe Arg Gln Ser Val Ala Gly Leu Ala Ala Arg
65 70 75 80
Leu Gln Arg Gln Phe Val Val Arg Ala Trp Gly Cys Ala Gly Pro Cys
85 90 95
Gly Arg Ala Val Phe Leu Ala Phe Gly Leu Gly Leu Gly Leu Ile Glu
100 105 110
Glu Lys Gln Ala Glu Ser Arg Arg Ala Val Ser Ala Cys Gln Glu Ile
115 120 125
Gln Ala Ile Phe Thr Gln Lys Ser Lys Pro Gly Pro Asp Pro Leu Asp
130 135 140
Thr Arg Arg Leu Gln Gly Phe Arg Leu Glu Glu Tyr Leu Ile Gly Gln
145 150 155 160
Ser Ile Gly Lys Gly Cys Ser Ala Ala Val Tyr Glu Ala Thr Met Pro
165 170 175
Thr Leu Pro Gln Asn Leu Glu Val Thr Lys Ser Thr Gly Leu Leu Pro
180 185 190
Gly Arg Gly Pro Gly Thr Ser Ala Pro Gly Glu Gly Gln Glu Arg Ala
195 200 205
Pro Gly Ala Pro Ala Phe Pro Leu Ala Ile Lys Met Met Trp Asn Ile
210 215 220
Ser Ala Gly Ser Ser Ser Glu Ala Ile Leu Asn Thr Met Ser Gln Glu
225 230 235 240
Leu Val Pro Ala Ser Arg Val Ala Leu Ala Gly Glu Tyr Gly Ala Val
245 250 255
Thr Tyr Arg Lys Ser Lys Arg Gly Pro Lys Gln Leu Ala Pro His Pro
260 265 270
Asn Ile Ile Arg Val Leu Arg Ala Phe Thr Ser Ser Val Pro Leu Leu
275 280 285
Pro Gly Ala Leu Val Asp Tyr Pro Asp Val Leu Pro Ser Arg Leu His
290 295 300
Pro Glu Gly Leu Gly His Gly Arg Thr Leu Phe Leu Val Met Lys Asn
305 310 315 320
Tyr Pro Cys Thr Leu Arg Gln Tyr Leu Cys Val Asn Thr Pro Ser Pro
325 330 335
Arg Leu Ala Ala Met Met Leu Leu Gln Leu Leu Glu Gly Val Asp His
340 345 350
Leu Val Gln Gln Gly Ile Ala His Arg Asp Leu Lys Ser Asp Asn Ile
355 360 365
Leu Val Glu Leu Asp Pro Asp Gly Cys Pro Trp Leu Val Ile Ala Asp
370 375 380
Phe Gly Cys Cys Leu Ala Asp Glu Ser Ile Gly Leu Gln Leu Pro Phe
385 390 395 400
Ser Ser Trp Tyr Val Asp Arg Gly Gly Asn Gly Cys Leu Met Ala Pro
405 410 415
Glu Val Ser Thr Ala Arg Pro Gly Pro Arg Ala Val Ile Asp Tyr Ser
420 425 430
Lys Ala Asp Ala Trp Ala Val Gly Ala Ile Ala Tyr Glu Ile Phe Gly
435 440 445
Leu Val Asn Pro Phe Tyr Gly Gln Gly Lys Ala His Leu Glu Ser Arg
450 455 460
Ser Tyr Gln Glu Ala Gln Leu Pro Ala Leu Pro Glu Ser Val Pro Pro
465 470 475 480
Asp Val Arg Gln Leu Val Arg Ala Leu Leu Gln Arg Glu Ala Ser Lys
485 490 495
Arg Pro Ser Ala Arg Val Ala Ala Asn Val Leu His Leu Ser Leu Trp
500 505 510
Gly Glu His Ile Leu Ala Leu Lys Asn Leu Lys Leu Asp Lys Met Val
515 520 525
Gly Trp Leu Leu Gln Gln Ser Ala Ala Thr Leu Leu Ala Asn Arg Leu
530 535 540
Thr Glu Lys Cys Cys Val Glu Thr Lys Met Lys Met Leu Phe Leu Ala
545 550 555 560
Asn Leu Glu Cys Glu Thr Leu Cys Gln Ala Ala Leu Leu Leu Cys Ser
565 570 575
Trp Arg Ala Ala Leu
580

Claims (20)

1.一种结合至ERBB酪氨酸激酶结构域(ERBB-TKD)的非天然多肽、或其生物学活性变体，包含氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID NO:1的序列一致性至少为10％，限制性条件为排除与SEQ ID NO:2一致的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的非天然多肽，其特征在于，该ERBB是ERBB1、ERBB2、ERBB3或ERBB4。
3.如权利要求1所述的非天然多肽，其特征在于，该ERBB-TKD是EGFR-TKD。
4.如权利要求1所述的非天然多肽，其特征在于，该氨基酸序列是SEQ ID NO:1的修饰序列，具有一个或多个氨基酸替代、缺失、加成及/或插入。
5.如权利要求1所述的非天然多肽，其特征在于，该氨基酸序列包含具有SEQ ID NO:1的约3个至约72个连续氨基酸残基的片段。
6.如权利要求1所述的非天然多肽，其特征在于，该氨基酸序列是SEQ ID NO:1。
7.如权利要求1所述的非天然多肽，进一步包含一个或多个额外的氨基酸序列。
8.如权利要求7所述的非天然多肽，其特征在于，该额外的氨基酸序列选自导向序列、细胞渗透序列、标签序列和链接序列。
9.一种药物组合物，包含治疗有效量的如权利要求1所述的非天然多肽，及其药学可接受的载剂。
10.如权利要求9所述的药物组合物，进一步包含额外的抗癌剂。
11.如权利要求10所述的药物组合物，其特征在于，该额外的抗癌剂是ERBB抑制剂或EGFR抑制剂。
12.如权利要求11所述的药物组合物，其特征在于，该EGFR抑制剂选自吉非替尼、埃罗替尼、西妥昔单抗、阿法替尼、耐昔妥珠单抗、尼妥珠单抗、PF299804、RO5083945、ABT-806、NVP-TAE684、及其组合所组成的群组。
13.一种妨碍EGFR激活的用于抑制、预防及/或治疗癌症的方法，包含给药治疗有效量的如权利要求1所述的非天然多肽至有此需要的受试者。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，该癌症是表达ERBB的癌症。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，该表达ERBB的癌症选自乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、食道癌、喉癌、胃癌、结肠癌、肺癌、及其组合所组成的群组。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，该表达ERBB的癌症是肺癌。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，该肺癌是肺腺癌、小细胞肺癌(SCLC)或非小细胞肺癌(NSCLC)。
18.如权利要求13所述的方法，进一步包含给予至少一种额外的癌症疗法至该受试者。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，该额外的癌症疗法选自放疗、化疗、免疫疗法、及其组合所组成的群组。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，该化疗包含给药额外的抗癌剂至该受试者。
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