KR20100121710A - Ｐｔｅｎ의 기능 복구 및 ｐｔｅｎ을 투여하는 단계를 포함하는 망막 변성 예방 또는 치료 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 망막 색소 상피(RPE: Retinal pigment epithelium) 세포에서 특이적으로 유도된 망막 변성을 억제하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 PTEN(phosphatase and tensin homolog)의 기능을 복구하거나 PTEN을 투여하는 단계를 포함하는 망막의 퇴행성 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 노인황반변성(AMD: age-related macular degeneration), 당뇨성 망막증(diabetic retinopathy), 망막박리(retinal detachment) 또는 망막색소변성증(RP: retinitis pigmentosa) 등과 같은 망막의 퇴행성 질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

망막 색소 상피(RPE: Retinal pigment epithelium) 세포, PTEN(phosphatase and tensin homolog), 망막 변성, 노인황반변성(AMD: age-related macular degeneration), 당뇨성 망막증(diabetic retinopathy), 망막박리(retinal detachment), 망막색소변성증(RP: retinitis pigmentosa)

Description

ＰＴＥＮ의 기능 복구 및 ＰＴＥＮ을 투여하는 단계를 포함하는 망막 변성 예방 또는 치료 방법{Method for prevention and treatment of Retinal degeneration comprising activity regulation and administration of PTEN}

RPE 세포에서 특이적으로 유도된 망막 변성을 억제하는 방법에 관한 것이다.

척추동물의 "신경망막(neural retina)"은 신경 및 신경교 세포가 정교하게 조직된 것으로, 최종적으로 뇌로 시각 정보를 전달한다. 그러나 시지각(Visual perception)에는 추가로 눈 뒤에 위치하는, 신경상피로부터 유래한 일련의 세포인 망막 색소 상피(RPE: Retinal pigment epithelium) 세포가 필요하다. RPE 세포는 로돕신 및 옵신을 포함하는 망막 광수용체의 외부 단편과 첨단부 미세융모(apical microvili)를 통하여 광범위하게 접촉되어 있다. RPE 세포는 이러한 접촉을 통해, 독성 대사물질의 제거, 광색소의 교환, 광수용체 외부 구조의 식세포 재생 및 광수용체로 영양소를 전달하여 시각화 과정을 가능하게 한다. 또한, 상기 RPE 세포는 광수용체 외부 단편의 말단에서 일단위로 식균작용을 수행하는데, 상기 식균작용에 문제가 생기면 광수용체 사멸을 유도하기 때문에, 상기 항상성 식균작용이 중요하 다. 또한, RPE 세포는 산화적 스트레스에 매우 민감하게 반응하여 손상되는 망막 광수용체의 주변에 존재하면서, 산화적 손상으로부터 이를 보호하기 위한 항상성 기작들을 수행한다.

RPE 세포는 반투성 상피층을 형성하고 있어야만 광수용체를 성공적으로 도울 수 있다. 상기 RPE 세포는 세포구조의 분극화된 분포 및 세포간 연접의 존재 등의 특징을 나타낸다. RPE 세포층은 첨단부의 광수용체와 관련된 미세융모와 기측부의 브루흐 막(Bruch's membrane)에 부착한 접힘 사이에 존재하며, 상기 브루흐 막은 기측부에서 망막 외부로 향하는 혈관으로부터 RPE 세포를 분리한다(도 11 참조). 상기 RPE의 분극화된 특징 및 분화된 세포간 연접은 항상성 기능에 필수적이다(Jin M et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 43:2782-2790, 2002). 연접 구조는 부착 복합체를 형성하기 위해 세포골격 단백질을 연결하는 세포질 링커 단백질들에 의존한다. 예를 들면, 부착연접(AJ: adherens junction)은 캐드헤린 및 이의 세포질 아답터인 β-카테닌; 및 데스모솜(desmosome) 및 이의 아답터인 데스모플라킨(desmoplakin)을 포함하며, 액틴 필라멘트와 결합함으로써 RPE 세포의 측면에 위치하고, 필라멘트 세포골격 네트워크를 중재한다. 밀착연접(TJ: tight junctions)은 ZO1(zona occludens 1)), Par-3 및 JAM-A(junctional adhesion molecule-A) 등을 포함하며, RPE 세포의 첨단부 및 측면의 주변부에 위치하여 RPE 경계선을 둘러싼다.

RPE 세포는 혈망막 장벽(BRB: blood retinal barrier)의 중요한 성분을 생성하기 때문에, RPE 손상 또는 소실은 늘 망막변성을 유발한다. RPE 구조적 완전성 의 장애로 인해 노인황반변성(AMD: age-related macular degeneration) 및 망막색소변성증(RP: retinitis pigmentosa)과 같은 망막의 퇴행성 질환을 유도하는 것으로 알려져 있어도, RPE 구조를 조절하는 분자 기작은 여전히 알려져 있지 않다. AMD의 주요 원인 중 하나는 광변환(photo-transduction) 과정 중에 내재적으로 발생하거나, 다양한 외재적 손상에 의해서 생성되는 산화적 스트레스이다. AMD를 유도하는 산화적 스트레스는 PI3 키나아제(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)/Akt 신호전달을 손상시키는 것으로 보고되었는데(Yang P et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 47:4598-4606, 2006), 상기 경로는 산화적 스트레스의 유해한 영향으로부터 RPE 세포를 보호하는 것으로 제안되었다(Defoe DM & Grindstaff RD, Exp Eye Res 79:51-59, 2004). 즉, PI3K가 활성화되면 PIP3(phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate)의 생성이 촉진되어 원형질막에서 PIP3 수준이 증가하고(Cantley LC, Science 296:1655-1657, 2002), PIP3는 Akt 활성화를 위해 원형질막으로 이동시킨다(Osaki M et al., Apoptosis 9(6):667-676, 2004).

PTEN(phosphatase and tensin homolog)은 PI3(phosphoinositide 3)의 탈인산화 활성을 가지며, 상기 활성에 의해, PI3 인산화 효소에 의해 유도된 증폭성 신호전달 캐스케이드에 대항하여 종양을 억제하는 것으로 알려져 있다. 그러나 최근에 PTEN이 PI3 탈인산화 활성과 독립적으로, 단백질(비지질) 기질의 탈인산화 활성을 갖으며, 이를 통해 종양 항원인 p53과 상호작용하는 것으로 보고되었다(Freeman DJ et al., Cancer Cell 3:117-130, 2003). 즉, PIP2(phosphatidylinositol-4,5 bisphosphates) 생산을 위해 PIP3의 3번 위치에서 작용하는, 지질을 기질로 사용하 는 탈인산화 활성 및 친화적으로 인산화티로신 잔기를 탈인산화하는 단백질 탈인산화 활성을 갖는다(Myers et al., Proc Natl Acad Sci 94:9052-9057, 1997). 상기 다양한 항-종양 활성에 기인하여, PTEN의 유전적 돌연변이체들은 다양한 종양을 유발하며, PI3K-Akt 신호전달 경로의 항세포사멸 활성과 길항작용 함으로써 수행된다. 이러한 기능들은 세포 증식(cell proliferation), 세포 생존(cell survival), 세포 이동(cell migration), 세포 침입(cell invasion) 등을 조절하여 PTEN이 종양 억제물질로서의 기능을 하도록 하는 것으로 알려져 있다.

PTEN의 치료적 응용에 관하여, 국제공개특허 제 99/02704호에 PTEN 단백질, PTEN을 코딩하는 핵산 분자를 이용하여 전립선암, 유방암 등과 같은 과증식성 질환을 치료하는 방법이 개시되어 있으며, 최근 미국등록특허 제 6,020,199호에는 PTEN을 코딩하는 핵산에 표적화되어 PTEN의 발현을 조절하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 이를 이용하여 PTEN 발현과 관련된 질환, 예를 들어 당뇨병 및 과증식성 질환을 치료하는 방법에 관하여 개시된 바 있다. 그러나 아직까지 상기 PTEN의 RPE 세포 특이적 결실이 망막의 변성을 유도하는 것을 바탕으로, 상기 PTEN을 망막 변성의 보호에 이용한 보고는 없다.

이에, 본 발명자들은 pten(phosphatase and tensin homolog) 유전자가 RPE 세포에서 특이적으로 녹아웃된 마우스를 제조하였고, 상기 RPE 특이적 PTEN의 불활성화를 통해 망막 탈색소 및 광수용체의 진행성 변성이 유도되었으며; 망막의 퇴행성 질환과 관련된 뮬러 신경교세포가 과생산 되었으며; 세포간 부착성이 소실되는 것을 확 인하였다. 또한, 유전적 또는 화학적으로 산화적 스트레스가 유도된 마우스의 RPE 세포에서 상기 PTEN이 생리적으로 불활성화된 것을 확인하였다. 이로부터 상기 PTEN이 퇴행성 또는 산화적 스트레스에 의해 유도된 망막 변성을 보호하는 데 중요한 역할을 수행하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 PTEN(phosphatase and tensin homolog) 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 망막 변성 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 PTEN을 이용한 망막 변성 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 RPE 세포에서 특이적으로 pten 발현이 녹아웃된 마우스 또는 C-말단의 PDZ 결합 도메인이 결실된 pten을 발현하는 마우스 또는 이로부터 유래한 RPE 세포를 이용하여, 망막 변성을 억제하는 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 망막 변성이 유도된 정상마우스의 망막 내 RPE 세포에서 PTEN의 활성을 촉진하는 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 RPE 세포에서 PTEN의 활성을 촉진하는 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 스크리닝된 물질을 유효성분으로 포함하는 망막 변성 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PTEN(phosphatase and tensin homolog), PTEN의 C-말단의 PDZ 결합 도메인 및 상기 PTEN의 작용제로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 망막 변성 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 망막 색소 상피(RPE: Retinal pigment epithelium) 세포에서 특이적으로 작동하는 프로모터 및 PTEN을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 유전자컨스트럭트를 포함하는, RPE에서 특이적으로 PTEN을 발현하는 발현벡터를 유효성분으로 포함하는, 망막 변성 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 PTEN, PTEN의 C-말단의 PDZ 결합 도메인 및 상기 PTEN의 작용제로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 투여하는 단계를 포함하는 망막 변성 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 RPE 세포에서 특이적으로 pten 발현이 녹아웃된 마우스 또는 C-말단의 PDZ 결합 도메인이 결실된 pten을 발현하는 마우스를 이용하여, 망막 변성을 억제하는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 RPE 세포에서 PTEN의 활성을 촉진하는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 pten 발현이 녹아웃된 RPE 세포 또는 C-말단의 PDZ 결합 도메인이 결실된 pten을 발현하는 RPE 세포를 이용하여, RPE 세포의 진행성 변성을 억제하는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 방법으로 스크리닝된 물질을 유효성분으로 포함하는 망막 변성 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, "플록스된(floxed; lox P 사이에 위치하는)" pten 대립형질을 갖는, PTEN^flox 마우스(fl/fl: Suzuki A et al., Immunity 14:523-534, 2001)를 티로시나아제 관련 단백질 1(TRP1; tyrosinase-related protein 1) 프로모터의 조절하에서, RPE에 제한된 Cre 재조합효소를 발현하는, TRP1-Cre 마우스(+/+;T1Cre: Mori M et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 43:1384-1388, 2002)와 교배하여, 망막의 RPE 세포에서만 특이적으로 PTEN의 발현이 억제된 마우스를 제조하였다(도 1 참조). 상기 돌연변이 마우스의 망막은 시간이 지날수록 진행성 변성되었는데, 광범위한 탈색소 영역 및 분열이 관측되었고, 라미나 구조를 형성하지 못하였고(도 2 참조), 광수용체도 현저하게 감소하였다(도 3 참조). 또한, 활성화된 뮬러 신경교세포(MG; Muller glia)가 증식되었는데(도 4 참조), 돌연변이 망막에서 MG의 과생산은 많은 망막의 퇴행성 질환에서 일반적이다(Bringmann A & Reichenbach A, Front Biosci 6:E72-E92, 2001). 또한, 상기 돌연변이 마우스의 망막의 RPE 세포는 정상 마우스와 상이한 미세구조를 나타내었는데, 구체적으로 광수용체가 심하게 퇴행된 영역이 발견되었고, "기포"가 상당히 증가하였으며, 기측부의 RPE 부착은 완벽하게 소실되었고, 상대적으로 손상되지 않은 첨단부 밀착연접(TJ: tight junctions)에서는 세포간 접촉의 얇은 밴드만을 남겼다(도 5 참조). 그러나 상기 돌연변이 마우스의 RPE 세포의 첨단부 미세융모(MV: microvilli)는 정상적으로 돌출되었고, 광수용체 외부 구조(OS)와 정상적으로 접촉하였다. 상기 초미세구조적 변화와 함께 부착연접(AJ: adherens junction) 또는 TJ의 마커 단백질의 비정상적인 세포내 분포를 수반하였는데, 구체적으로 기측부 AJ 성분에서는 이상이 발견되었으나, 첨단부 TJ 성분은 정상이었다(도 6 참조). PTEN은 RPE 세포의 첨단부 막에서 특이 우점적이고, 많은 다른 상피세포에 존재하는 것으로 알려져 있는데(Pinal N et al., Curr Biol 16:140-149, 2006; Martin-Belmonte et al., Cell 128:383-397, 2007), 본 발명자들에 의해 PTEN이 P0기에서 RPE 세포의 세포질에 분산되어 있으나, P8기에서는 첨단부로 농축되는 것이 확인됨으로써(도 7 참조) 기측부 구조가 PTEN 결실에 가장 민감한 것을 재확인하였다. 이로부터 PTEN 결실에 의한 진행성 RPE 변성 및 이후의 광수용체 변성은 기측부 연접 구조에서의 결손과 함께 시작하였고, 이로 인해 첨단부 구조의 붕괴 및 연속적인 전체 혈망막 장벽(BRB: blood retinal barrier)의 완전성 소실이 시사되었다.

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 PTEN의 두 가지 탈인산화효소 활성(지질 탈인산화효소 활성/단백질 탈인산화 효소 활성) 중 RPE 세포에서 기측부 구조의 유지에 단백질 탈인산화 효소 활성이 관여하는 것과(도 8A-D 및 도 9 참조), 특히, PTEN에 의한 AJ의 유지에는 PDZ 도메인을 포함하는 연접 단백질의 상호작용이 필요한 것이 제안되었다(도 8E, F 및 도 9 참조)

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 본 발명의 PTEN 발현이 녹아웃된 마 우스의 RPE 세포에서 세포간 부착에 포함된 유전자, 세포증식 억제에 관련된 유전자, ECM(extracellular matix) 조절 유전자, 열충격 단백질 및 세포간 샤페론을 암호화하는 유전자들의 발현량이 현저하게 감소하였고, 반대로 세포이동과 관련된 유전자의 발현이 현저하게 증가한 것을 확인함으로써 구조적 변형을 유도할 수 있는 분자 수준의 사건들을 이해하였다(표 1 참조). 특히, 가장 극적으로 변화된 크리스탈린(crystallins) 및 HSP는 온도 향상 및 AMD와 같은 망막의 퇴행성 질환의 주요 원인 중 하나인 활성산소종과 같은 단백질 불안정화 스트레스들로부터 세포를 보호하는 것으로 보고되었다(Wang K & Spector A, Eur J Biochem 267:4705-4712, 2000).

아울러, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 AMD 동물 모델로 개발된 CC 케모카인(chemokine) 수용체 2-결핍 (ccr2 ^-/-) 마우스(Ambati J et al., Nat Med 9:1390-1397, 2003) 및 산화 스트레스 유도 물질로 처리된 마우스를 대상으로, 본발명의 PTEN 결핍 RPE 세포 및 AMD RPE 세포간의 표현형이 유사하며, 유전적 또는 생리적으로 유도된 PTEN의 불활성화는 마우스에서 AMD를 유발할 수 있는 것을 제안하였고, 상기 PTEN의 불활성화 및 그에 따른 AJ의 붕괴는 산화적 스트레스에 따른 RPE 변성에 대한 일반적인 기작인 것을 시사하였다(도 10 참조).

이에, 본 발명의 RPE 세포에서 특이적으로 PTEN의 발현이 녹아웃된 마우스 또는 C-말단의 PDZ 결합 도메인이 결실된 pten을 발현하는 마우스는, 망막내 RPE 세포의 기측부에서 부착연접의 소실을 예방 또는 억제하는 물질 및 망막의 RPE 세 포에서 PTEN의 활성을 촉진하는 물질의 스크리닝에 유용하게 이용될 수 있고, 이로부터 선별된 물질은 망막 변성 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

이에, 본 발명은 PTEN(phosphatase and tensin homolog), PTEN의 C-말단의 PDZ 결합 도메인 및 상기 PTEN의 작용제로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 망막 변성 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 망막 변성은 퇴행성 또는 산화적 스트레스에 의해 유도된 것으로, 구체적인 예로는 노인황반변성(AMD: age-related macular degeneration), 당뇨성 망막증(diabetic retinopathy), 망막박리(retinal detachment) 또는 망막색소변성증(RP: retinitis pigmentosa) 등이 있다.

상기 PTEN의 작용제는 PTEN의 상동체 또는 유사체 또는 변형 PTEN을 포함한다.

상기 조성물은 인간 의약 또는 수의 의약으로 치료학적 적용을 위하여 사용될 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 주입가능한 용액과 같은 액제, 크림, 연고, 정, 현탁액 등과 같은 형태일 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 함유한다. 약학적으로 허용되는 부형제는 기술 분야에 알려져 있으며 약학적 활성 물질의 투여를 용이하게 해주는 비교적 불활성인 물질이다. 예컨대, 부형제는 형상이나 점도를 부여할 수 있고 또는 희석제 역할도 할 수 있다. 적절한 부형제로는 안정화제, 보습제, 및 유화제, 오스몰 농도를 변화시킬 수 있는 염류, 캡슐화제 제, 완충액, 피부침투 촉진제를 들 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 경구 및 비경구용 약물 전달용 부형제 및 포뮬레이션은 Remington, The Science and Practice of Pharmacy 제20판, Mack Publishing(2000)에 제시되어 있다.

본 발명의 조성물은 실제 투여 시에 경구 및 비경구의 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 PTEN, PTEN의 C-말단의 PDZ 결합 도메인 또는 상기 PTEN의 작용제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구 투여될 수 있으 며, 구체적으로 비경구 투여의 경우 (1) 수양액, 공막, 결막, 망막, 망막과 망막 색소 상피세포 사이의 영역에 주사하여 국소 투여하는 방법(그러나 이에 한정되지는 않음); 또는 (2) 직장, 질, 근육내, 복막내, 동맥내, 경막내, 기관지내, 조내, 피부, 피하, 피내, 경피, 정맥내, 자궁경관내, 복강내, 두개내, 안내, 폐내, 흉곽내, 기관내, 코, 협측, 설하에 주사하거나, 또는 에어로졸 추진제를 사용한 분무 또는 에어로졸화하여 전신 투여하는 방법으로 수행될 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 PTEN, PTEN의 C-말단의 PDZ 결합 도메인 또는 상기 PTEN의 작용제의 양을 기준으로 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 망막 색소 상피(RPE: Retinal pigment epithelium) 세포에서 특이적으로 작동하는 프로모터 및 PTEN을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 유전자컨스트럭트를 포함하는, RPE에서 특이적으로 PTEN을 발현하는 발현벡터를 유효성분으로 포함하는, 망막 변성 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 RPE 세포에서 특이적으로 작동하는 프로모터는 티로시나아제 관련 단백질 1(TRP1; tyrosinase-related protein 1) 프로모터, VMD2(vitelliform macular dystrophy) 프로모터 등이 있다.

본 발명의 조성물에서 PTEN을 망막에 지속적으로 공급하기 위해 사용될 수 있는 벡터로는 레트로바이러스(retrovirus) 벡터, 아데노바이러스(adenovirus) 벡터, 백시니아 바이러스, 폭스 바이러스(Pox virus), 신드비스 바이러스(Sindbis virus) 벡터, 아데노 관련 바이러스(adeno-associated virus) 벡터 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus) 벡터와 같은 바이러스 유래 벡터와, pCXN2(Gene, 108:193-200, 1991), PAGE207(일본 특허공개 제 소6-4684호)와 같이 동물의 체내에서 발현될 수 있는 플라스미드 및 이들의 변형 벡터가 이용될 수 있다.

본 발명의 발현벡터의 유효농도는 원하는 효과, 예를 들면 상기 발현벡터의 부재 하에서 검출되는 정상 발현 수준에 비해 pten 유전자의 발현의 증가를 제공하기에 충분한 양이다. 상기 발현벡터는 세포 하나 당 적어도 하나의 카피의 전달을 허용하는 양으로 도입될 수 있다. 이중 가닥 물질의 도입량이 많을수록 (예컨대, 세포 하나 당 5개 이상, 10 개 이상, 100개 이상, 500개 이상 또는 1000개 이상의 카피), 억제 효율이 더 높아질 수 있고, 특이적인 응용에는 도입량이 적은 것이 유리할 수 있다.

추가로, 상기 벡터는 세포주에 형질도입된 뒤, 이를 유전자 치료에 사용되는 기재와 혼합함으로써 제조할 수 있다(Crystal RG et al., Nature Genet. 8:42-51, 1994).

상기 형질도입된 세포주는 대상에게서 망막 변성을 억제하기에 효과적인 양으로 투여할 수 있다. 예를 들어, 상기 형질도입된 세포주는 인간에게 일 회 내지 수회로 투여될 수 있고, 투여량은 세포 수가 1×10³ 개/kg ~ 1×10⁹/kg 개, 바람직하게는 1×10⁴ 개/kg ~ 1×10⁸ 개/kg 이다.

유전자 치료에 사용되는 기재는 주사제에서 통상적으로 사용되는 어떠한 기재라도 사용 가능하다. 예를 들어, 기재는 증류수, 염화나트륨 염 용액, 염화나트륨 및 무기물염의 혼합물 또는 그와 유사한 혼합물, 만니톨, 락토스, 덱스트란, 글루코스 등의 용액, 글리신, 아르기닌 같은 아미노산 용액, 유기산 용액 또는 염용액 및 글루코스 용액의 혼합 및 이와 유사한 용액 등을 포함한다. 또한, 주사제는 통상의 방법으로 삼투압 조절제, pH 조절제, 참기름이나 콩기름 같은 식물성 기름, 또는 레시친, 비이온성 표면활성제 같은 표면활성제를 상기한 기재에 첨가하여 용액, 현탁액 또는 콜로이드 용액 등으로 제조할 수 있다. 이러한 주사제는 분말형, 동결건조형 등으로 제조하여 사용하기 바로 전에 용해하여 쓸 수도 있다.

본 발명의 조성물은 고체상인 경우 유전자 치료 바로 전에 필요에 따라 미리 멸균한 기재에 용해하여 사용하거나, 액상인 경우 별도의 처리 없이 그대로 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 PTEN, PTEN의 C-말단의 PDZ 결합 도메인 및 상기 PTEN의 작용제로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 투여하는 단계를 포함하는 망막 변성 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) RPE 세포에서 특이적으로 pten 발현이 녹아웃된 마우스 또는 C-말단의 PDZ 결합 도메인이 결실된 pten을 발현하는 마우스에 피검물질을 투여하는 단계;

2) 상기 처리된 마우스의 망막 변성 정도를 측정하는 단계; 및,

3) 피검물질 미처리 마우스(대조군)에 비해 단계 2)의 변성 정도가 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 망막 변성 치료제 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 피검물질은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 피검물질은 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다.

단계 2)의 망막 변성 정도는 ① 상기 망막 또는 이로부터 분리된 RPE 세포의 기측부에서 부착연접(AJ: adherens junction) 마커 단백질의 발현량을 측정하는 방법; ② 상기 망막 또는 이로부터 분리된 RPE 세포에서 PTEN의 발현량을 측정하는 방법; ③ 망막의 탈색소 영역을 측정하는 방법; ④ 망막의 광수용체를 정량하는 방법; ⑤ 망막에서 활성형 뮬러 신경교세포(MG; Muller glia)의 증식을 정량하는 방법; ⑥ 망막 내 신생 혈관 형성 관찰법; ⑦ 망막 내 혈구 세포 침윤 관찰법; 또는 ⑧ 전자현미경을 이용한 망막 색소 상피세포의 형태 분석법 등으로 측정될 수 있 다. 이때, 상기 부착연접 마커 단백질은 β-카테닌(β-catenin) 또는 E-캐드헤린인 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 마우스에서 적출한 눈으로부터 분리한 망막 또는 상기 망막으로부터 분리된 RPE 세포층을 대상으로, 형광체로 표지된 항-AJ 마커단백질 항체, 항-PTEN 항체, 로돕신 또는 옵신 등의 광수용체의 외부 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 활성형 뮬러 신경교세포를 표지하는 항-GFAP(Glial Fibrillary Acidic Protein) 항체를 이용하여 면역염색한 후, 형광현미경에서 상기 형광체를 검출함으로써 수행될 수 있다. 또는, 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin) 염색을 통해 탈색소 영역을 측정하여 수행될 수 있다. 망막 내 신생 혈관 생성은 CD31/PECAM-1(platelet/endothelial cell adhesion molecule-1) 특이적 항체를 이용한 면역 염색법으로 검출할 수 있으며, 백혈구 침윤은 MaMo(macrophage-monocyte) 특이적 항체나 F4/80 항체를 이용한 면역 염색법으로 검출할 수 있다.

또한, 본 발명은

1) 망막 변성이 유도된 개체에 피검물질을 투여하는 단계;

2) 상기 처리된 마우스의 망막 내 RPE 세포에서 PTEN의 활성을 측정하는 단계; 및,

3) 피검물질 미처리 마우스(대조군)에 비해 단계 2)의 PTEN의 활성을 촉진하는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 망막 내 RPE 세포에서 PTEN의 활성을 촉진하는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 망막 변성은 유전적으로 또는 화학적으로 유도될 수 있으며, 망막 변성이 유도된 개체의 구체적인 예로는, AMD 동물 모델로 개발된 CC 케모카인(chemokine) 수용체 2-결핍(ccr2 ^-/-) 마우스(Ambati J et al., Nat Med 9:1390-1397, 2003) 또는 산화 스트레스 유도 물질의 처리에 의해 망막변성이 유도된 마우스 등이 있으며, 이때, 상기 산화 스트레스 유도 물질로는 NaIO₃(sodium iodate), 리포푸신(lipofuscin)의 구성인자인 A2E 등이 있다.

PTEN의 활성은 PTEN의 단백질 탈인산화 활성을 척도로 하여 측정되거나, PTEN 단백질 C-말단의 인산화를 불활성의 척도로 하여 측정될 수 있다.

분리된 PTEN 단백질의 탈인산화 활성은 Maehama & Dixon(J. Biol. Chem. 273:1337513378, 1998)의 방법에 따라서, PTEN이 이노시톨 인지질[예, Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate(PtdIns(3,4,5)P3)]을 탈인산화하는 정도를 측정함으로써 확인할 수 있다. 또한, PTEN 단백질 C-말단 부위의 인산화는 항-phospho-PTEN(Ser380/Thr382/383) 특이적 항체를 이용하여 측정할 수 있다.

또한, 본 발명은

1) pten 발현이 녹아웃된 RPE 세포 또는 C-말단의 PDZ 결합 도메인이 결실된 pten을 발현하는 RPE 세포의 배양액에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 처리된 RPE 세포의 진행성 변성을 측정하는 단계; 및,

3) 피검물질 미처리 RPE 세포(대조군)에 비해 단계 2)의 진행성 변성을 억제 하는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, RPE 세포의 진행성 변성을 억제하는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

단계 2)의 진행성 변성의 측정은 ① 상기 RPE 세포의 기측부에서 AJ 마커 단백질의 발현량을 측정하는 방법; ② 상기 RPE 세포가 마트리겔(Matrigel) 배양막을 통과하는 능력을 측정하는 방법; 또는 ③ RPE 세포가 자라는 마트리겔 배양막 사이의 배지 통과 효율을 측정하는 방법 등으로 수행될 수 있다.

또한, 본 발명은

1) 진행성 변성이 유도된 RPE 세포의 배양액에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 처리된 RPE 세포의 PTEN의 단백질 탈인산화 활성을 측정하는 단계; 및,

3) 피검물질 미처리 RPE 세포(대조군)에 비해 단계 2)의 PTEN의 활성을 촉진하는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, RPE 세포의 진행성 변성을 억제하는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 진행성 변성은 유전적으로 또는 화학적으로 유도될 수 있으며, 진행성 변성이 유도된 RPE 세포의 구체적인 예로는, 망막변성이 유도된 마우스 유래의 RPE 세포 또는 산화 스트레스 유도 물질로 처리된 RPE 세포 등이 있다.

아울러, 본 발명은 상기 방법으로 스크리닝된 물질을 유효성분으로 포함하는 망막 변성 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 방법은 노인황반변성(AMD: age-related macular degeneration), 당뇨성 망막증(diabetic retinopathy), 망막박리(retinal detachment) 또는 망막색소변성증(RP: retinitis pigmentosa) 등과 같은 망막의 퇴행성 질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> pten 유전자의 RPE-특이적 녹아웃

본 발명자들은 10번 염색체에서 pten(phosphatase and tensin homolog) 유전자가 특이적으로 마우스 RPE 세포에서 녹아웃된 마우스를 제조하였다.

<1-1> PTEN 단백질의 위치 확인

3개월령 성체 마우스를 트리브로보에탄올(1 ㎎/㎏; Aldrich, USA)으로 마취시킨 후, 4% PFA/PBS를 살포하였다. 상기 마우스를 희생시켜서 수술로 눈을 적출하여 4% PFA/PBS 용액에서 1시간 동안 고정한 후, 20% 자당/PBS 용액에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 고정된 눈을 OCT 냉동보존 배지에서 얼린 후, 초퍼 를 사용하여 10-16 ㎛ 두께로 잘랐다. 상기 눈의 동결된 절편을 차단용액(0.1% Triton X-100이 포함된 PBS에 녹인, 10% 정상 당나귀 혈청 또는 10% 정상 염소 혈청 용액)에서 1시간 동안 배양한 후, 4℃에서 16시간 동안 일차항체로 염색하였다.

항-PTEN 항체(녹색; BD Pharmingen, USA) 및 DAPI(파란색; 핵염색)로 염색한 결과, 도 1A에 나타난 바와 같이 PTEN은 망막의 RPE(retinal pigment epithelium; 망막 색소 상피) 층에 집중되어 있었다.

* OS: 광수용체 외부 구조(photoreceptor outer segments); IS: 광수용체 내부 구조(inner segment); ONL: 광수용체 외과립층[outer nuclear layer (photoreceptor nuclei)]; OPL: 광수용체 외망상층(outer plexiform layer); INL: 내과립층(inner nuclear layer); IPL: 내망상층(inner plexiform layer); 및, GCL: 망막 신경절세포층(retinal ganglion cell layer).

<1-2> pten 이 녹아웃된 마우스의 제조 및 검증

ⅰ) "플록스된(floxed; lox P 사이에 위치하는)" pten 대립형질을 갖는, PTEN^flox 마우스(fl/fl: Suzuki A et al., Immunity 14:523-534, 2001)를

ⅱ) 티로시나아제 관련 단백질 1(TRP1; tyrosinase-related protein 1) 프로모터의 조절하에서, RPE에 제한된 Cre 재조합효소를 발현하는, TRP1-Cre 마우스(+/+;T1Cre: Mori M et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 43:1384-1388, 2002)와 교배한 후,

ⅲ) 상기 자손(fl/+;T1Cre)을 교차교배하여;

ⅳ) PTEN^flox/flox;TRP1-Cre(fl/fl;T1Cre) 마우스를 제조하였다.

1) 상기 ⅰ) 내지 ⅳ) 마우스로부터 실시예 1-1의 방법으로 망막을 분리하였다. 상기 분리된 망막을 항-PTEN 항체 및 DAPI로 염색한 결과, 도 1B(상단부 점선: 기측부 경계, 하단부 점선: 첨단부 경계)에 나타난 바와 같이 fl/fl 마우스에서 PTEN이 망막 RPE 층의 첨단부 미세융모(*: apical microvilli) 및 기측부 영역(화살머리: basolateral area)에 집중되어 있는 것이 발견되었다. fl/fl;T1Cre 마우스는 PTEN이 RPE 세포에서 검출되지 않았으나, 맥락막(CRD: choroid), 공막(sclera) 및 망막(retina)에서는 온전하였다.

2) ① 또한, 상기 망막으로부터 이전의 기술(Bonilha VL et al., J Cell Biol 147:1533-1548, 1999; Prasad D et al., Mol Cell Neurosci 33:96.108, 2006)대로 RPE 세포를 분리하였다. 간략하게는 눈에서 핵을 제거한 후, 상기 망막을 조심스럽게 밀어내어 디스파제(Dispase)(100 U/㎖)로 처리하였다. 분리된 RPE 세포로부터 페놀 추출법으로 DNA를 추출한 후, 상기 DNA를 주형으로 pten 유전자의 4번 및 5번 엑손의 Cre- 관련 결실을 검출하도록 증폭할 수 있는 서열번호 1(5'-GTCACCAGGATGCTTCTGAC-3') 및 서열번호 2(5'-ACTATTGAACAGAATCAACCC-3')로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다.

② 또한, 상기 ⅰ) 내지 ⅳ) 마우스의 꼬리로부터 페놀 추출법으로 DNA를 추출한 후, Cre 유전자를 발현하지 않는 상기 꼬리 DNA를 주형으로, 첫 번째 loxP 염 기서열의 도입에 의해 증가되는 염기쌍 수를 검출하도록 증폭할 수 있는 서열번호 3(5'-CTCCTCTACTCCATTCTTCCC-3') 및 서열번호 4(3'-ACTCCCACCAATGAACAAAC-5')로 기재되는 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하면서, 유전자형을 분석하였다.

③ 아울러, 상기 분리된 RPE 세포를 100 mM Tris(pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.1% SDS 및 단백질 억제제 칵테일(Roche)을 포함하는 용액에서 용해하였다. 15,000 g에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 수득한 후, 항-PTEN 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 수행하였다.

그 결과, 도 1C에서 나타난 바와 같이 예상된 바와 같이 lox P 사이에 위치하는, pten 유전자의 4번 및 5번 엑손은 PTEN^fl/fl;TRP1-Cre 마우스로(이하, fl/fl;T1Cre)부터 분리된 RPE 세포에서 결실되었고, 상기 세포는 PTEN 단백질을 발현하지 않았다. 상기 돌연변이 마우스는 배아 발달 또는 재생에서 어떠한 결손도 발견되지 않았다(데이타는 기재하지 않았음). 즉, 의도한 데로 fl/fl;T1Cre 마우스는 RPE 세포에서만 특이적으로 pten 유전자가 제거되었고, 그 결과 PTEN 단백질이 생성되지 않았다.

<실시예 2> RPE 특이적 pten 녹아웃 마우스의 진행성 망막 탈색소 및 광수용체 변성 관찰

RPE 세포로부터 PTEN의 소실은 배아 또는 신생아(PO)의 눈에서는 형태학적 변형을 유발하지 않았으나, 망막에서 진행성 변성을 유발하는 것으로 관찰되었다.

구체적으로, 1) fl/fl과 fl/fl;T1Cre를 대상으로 출생일에 따라, 즉 출생 후 8(P8), 30(P30) 및 90(P90)일째에 실시예 1-1의 방법으로 동결된 절편을 수득한 후, 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin) 염색을 하여 현미경에서 조직학적 변화를 관찰하였다(도 2A-F).

또한, 2) 상기 동결된 절편을 대상으로 실시예 1-1의 방법으로 항-로돕신 항체(녹색; Chemicon, USA) 또는 항-옵신 항체(녹색; Chemicon, USA) 및 DAPI(파란색; 핵염색)로 염색하여, 현미경에서 광수용체의 핵의 분포 및 RPE 세포 개수를 관찰하였다(도 2I 및 도 3).

또한, 3) 상기 1개월령 마우스의 동결된 절편을 대상으로 사산화오스뮴(Osmium tetroxide) 염색을 수행하여, 현미경에서 RPE 세포의 형태를 확인하였다(도 2G-H).

아울러, 4) RPE 세포수 감소의 원인이 세포사멸에 의한 것인지 확인하기 위해, TUNEL 분석을 수행하였다. 구체적으로, 4℃에서 10 분간 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에서 고정하였으며, 0.1% 트리톤(Triton) X-100(Sigma)으로 세포막 투과도를 증가시켰다. 형광물질이 표지된 UTP를 TdT(Roche, Germany)와 함께 첨가하였으며, 37℃에서 1 시간 반응시킨 후 레이저 스캐닝 공초점 현미경(Bio-Rad, USA)으로 관찰하였다(데이타는 기재되지 않았음).

그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이 fl/fl;T1Cre의 망막은 시간이 지날수록 진행성 변성되었다. 이러한 변화는 1주째에 처음 발견되었고(P8), 돌변변이된 눈의 17%에서 RPE 세포 및 맥락막(choroid)의 국부 붕괴와 관련된 국부 탈색소가 검 출되었다. 또한 비록 모든 망막 세포 유형이 존재하더라도 ONL(outer nuclear layer) 두께(도 2A 및 2B) 및 광수용체의 개수도 감소하였다(도 3). 형태적 변화는 1개월령에서 더욱 잘 나타났고, 망막(retinal laminae)의 광범위한 탈색소 영역 및 분열이 쉽게 관측되었고(도 2C 및 2D), 광수용체의 전체 개수가 현저히 감소하였다(도 3). 3개월령까지 fl/fl;T1Cre 망막에서 광수용체가 극적으로 감소하였고, 잔류 망막 세포는 눈에 띄는 라미나 구조를 형성하지 못하였다(도 2E 및 2F). 대부분의 돌연변이 눈(~78%)은 상기 시점에서 현저하게 탈색되는 것이 관측되었다(도 2E', 2F' 및 2G, H). RPE 세포의 90% 이상은 3개월령 돌연변이 눈에서는 소실되었으나(도 2I) 상기 세포 소실은 세포자살로부터 나타나지 않았는데, 이는 TUNEL-양성 또는 활성화된 카스파제 3-양성 세포의 개수의 증가(야생형에 비교하여)가 모든 단계의 fl/fl;T1Cre 마우스에서 검출되었기 때문이다(데이타는 기재되지 않았음).

<실시예 3> 망막 신경아교증

광수용체의 현저한 소실에도(도 3), 3개월령 돌연변이체 망막의 전반적인 두께(도 2E 및 2F)는 야생형과 비교하여 조금 감소됐을 뿐이다.

성상교세포 및 활성형 뮬러 신경교세포(MG; Muller glia)를 표지하는 항-글루타민 합성효소(GS; Sigma, USA; 도 4A-B) 항체 또는 MG를 표지하는 항-GFAP(Glial Fibrillary Acidic Protein; Dako, 일본; 도 4C-D) 항체 및 DAPI(파란색; 핵염색)를 이용하여 실시예 1-1의 방법으로 3개월령 마우스의 동결된 절편을 염색하여, 현미경에서 뮬러 신경교세포의 증식을 관찰하였다.

그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 활성화된 뮬러 신경교세포(MG; Muller glia)가 증식된 것을 확인하였다. 돌연변이 망막에서 MG의 과생산은 많은 망막의 퇴행성 질환에서 일반적이다(Bringmann A & Reichenbach A, Front Biosci 6:E72-E92, 2001).

<실시예 4> 세포간 부착의 소실

<4-1> 초미세구조적 변화 관찰

상기 퇴행성 사건(도 4)의 기원을 결정하기 위해, 본 발명자들은 4주령 fl/fl;T1Cre 마우스 및 fl/+;T1Cre 마우스로부터 수득한 RPE 세포의 초미세구조(ultrastructure)를 전자현미경(EM; electron microscopy)으로 관찰하였다.

그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이 fl/fl;T1Cre 마우스의 RPE 세포에서 초기단계 망막 변성이 관찰되었다(도 5A-C). fl/fl;T1Cre에서는 RPE 세포 및 많은 광수용체가 심하게 퇴행된 영역이 있었으나, 상대적으로 손상되지 않은 RPE-광수용체 공유 영역도 있었다(도 5B 및 C). 상기 손상되지 않은 영역을 확대하여 관찰한 결과, fl/+;T1Cre 마우스의 RPE 세포에서 발견되는 것과 상이한 세포 구조가 확인되었다(도 5D 및 E).

구체적으로, fl/+;T1Cre의 RPE 세포는 기저 측면에서는 각각 부착연접(AJ; adherens junction) 및 데스모솜(desmosome)과 접촉하였고, 첨단 측면에서는 온전한 밀착연접(TJ; tight junction)과 접촉하였다(도 5A 및 D). 또한, 브루흐 막(BM: Bruch's membrane)에 접촉한 기저 표면을 따라 통상의 막 접힘을 형성하였 다. fl/+;T1Cre의 RPE 세포의 측면 사이의 작은 혈관 "기포"는 드물지 않게 존재하였는데, 이것들은 fl/fl;T1Cre RPE 세포에서 상당히 증가하였다(도 5A 및 B의 괄호). fl/fl;T1Cre에서 기측부의 RPE 부착은 완벽하게 소실되었고, 첨단부 TJ에서 세포간 접촉의 얇은 밴드만을 남겼다(도 5E 및 F). 대조적으로 상기 fl/fl;T1Cre RPE 세포의 첨단부 미세융모(MV: microvilli)는 정상적으로 돌출되었고, 광수용체 외부 구조(OS)와 정상적으로 접촉하였다(도 5E 및 F).

<4-2> 마커 단백질의 관찰

AJ 구성성분인 β-카테닌(β-catenin; Cell Signaling Technology, USA), E-캐드헤린(E-cadherin; R&D systems, USA); 첨단부 미세융모 구성성분인 에즈린(Ezrin; Chemicon, USA); TJ 구성성분인 ZO1(zona occludens 1; BD Transduction Laboratories, USA), Crb3(Crumb3; Makarova O et al., Gene, 302(1-2):2 21-29, 2003)에 대한 항체를 이용하여 실시예 1-1의 방법으로 면역염색을 수행하였다.

그 결과, 도 6에서 나타난 바와 같이 상기 초미세구조적 변화와 함께 AJ 또는 TJ의 마커 단백질의 비정상적인 세포내 분포를 수반하였다. AJ 성분인 β-카테닌 및 E-캐드헤린의 연접한 위치는 fl/fl;T1Cre RPE 세포에서 결함이 있었으나(도 6A 내지 D), TJ와 관련된 단백질(도 6G 내지 J)인 ZO1(zona occludens 1) 및 Crb3(Crumb3)와 마찬가지로 변성되지 않은 fl/fl;T1Cre RPE 세포의 미세융모에서 에즈린(Ezrin)의 첨단부 위치는 정상이었다(도 6E 및 F). 상기 결과로부터 fl/fl;T1Cre 마우스에서 진행성 RPE 변성 및 이후의 광수용체 변성은 기측부 연접 구조에서의 결손과 함께 시작하였고, 이로 인해 첨단부 구조의 붕괴 및 연속적인 전체 혈망막 장벽(BRB: blood retinal barrier)의 완전성 소실이 시사된다.

<실시예 5> 연접 지역에서 PTEN의 위치

PTEN은 RPE 세포의 첨단부 막에서 특이 우점적이고, 많은 다른 상피세포에 존재하기 때문에(Pinal N et al., Curr Biol 16:140-149, 2006; Martin-Belmonte et al., Cell 128:383-397, 2007), 본 발명자들은 기측부 구조가 PTEN 결실에 가장 민감할 수 있다고 기대하지 않았다. 이에, 본 발명자들은 생체내 및 일차 배양된 RPE 세포에서 PTEN의 세포내 분포를 재확인하였다.

<5-1> 생체내 RPE 세포에서 PTEN의 세포내 분포

실시예 1-2에서 분리된 RPE 세포를 항-PTEN 항체 단독 및 항-PTEN 항체+DAPI로 염색한 결과, PTEN은 P0기에서 RPE 세포의 세포질에 분산되어 있으나, P8기에서는 첨단부로 농축되었다(도 7A-D). PTEN은 첨단부(*)에 유지되었고, P28때까지 미세융모를 따라서 확장하였다(도 7E 및 F). 또한 PTEN은 P8 및 P28 RPE 세포의 기측부(화살머리) 표면에서 관측될 수 있었다(도 1B; 도 7C-F).

<5-2> 일차 배양된 RPE 세포에서 PTEN의 세포내 분포

실시예 1-2에서 분리된 RPE 세포(∼10³)를 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지와 함께 10 ㎜ 마트리겔로 코팅된 트랜스 웰 플레이트(BD, USA)에 접종하여 충분히 배양한 후,

1) 상기 마트리겔 막을 4% PFA/PBS-CM(Ca²⁺/Mg²⁺가 첨가된 PBS)에서 10분 동 안 고정한 후, 4% PFA/PBS-CM과 Triton X-100을 15분 동안 처리한 후, 10,000 g로 원심분리하여 상등액으로부터 세포 내 구조체들에 고정되지 않은 수용성 단백질을 추출하거나;

또는 2) 상기 마트리겔 막을 Triton X-100으로 처리하여 수용성 단백질을 추출한 후, 4% PFA/PBS-CM에서 고정하였다.

이후, 항-PTEN 항체로 염색한 후 공초점 현미경을 이용하여 형광을 관찰하였다. 구체적으로, 공초점 현미경을 이용한 z축 탐색(z-axis scanning)을 통해 각 1 ㎛ 간격으로 배양된 RPE 세포의 첨단부에서 기측부까지를 탐색하여 형광 이미지를 저장하였다. 이때, 기축부는 마트리겔에 의해 제공되는 형광 반사(fluorescent reflection)를 기준으로 판단하였다. 그 결과, 기측부 PTEN은 마트리겔에서 단일층으로 배양된 마우스 RPE 세포에서 더욱 많이 발견되었다(도 7G-I).

Triton X-100 용액을 이용하여 수용성 단백질을 추출 후 고정 경우는(7K) 세포 내 구조체와 결합하지 않은 수용성 PTEN 단백질이 제거된 후 나머지 단백질이 고정되었으므로, 상대적으로 기측부의 구조체에 붙어 있는 PTEN 단백질이 고정된 후 Triton X-100 용액으로 수용성 단백질이 추출된 경우(7J)보다 명확히 나타났다.

아울러, 동일한 조건의 단백질 추출 조건에서 Triton X-100 수용성 및 불용성 분획의 웨스턴 블랏팅에 의한 밴드 감도의 덴시토미터 측정에 의해 평가된 PTEN 발현량의 정량화 결과는, 기측부 PTEN이 RPE 세포에서 전체 PTEN의 25%인 것으로 나타내었다(도 7L).

<실시예 6> 연접과 관련된 PTEN 도메인의 확인

<6-1> 탈인산화효소 활성의 공헌도 확인

RPE 세포에서 기측부 구조의 유지를 위한 PTEN의 두 가지 탈인산화효소 활성(지질 탈인산화효소 활성/단백질 탈인산화 효소 활성)의 상대적인 공헌도를 평가하기 위해, 인간 PTEN의 다양한 아형을 발현하는 레트로바이러스를 이용하여 fl/fl;T1Cre 마우스에서 분리된 배양된 PTEN 결핍 RPE 세포를 감염시킨 후, 기측부 구조의 AJ 성분인 β-카테닌의 세포내 분포를 감시하였다.

구체적으로, 본 발명의 fl/fl;T1Cre 마우스로부터 분리한, 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 배양한 RPE 세포에, 야생형 또는 돌연변이형 PTEN을 발현하는 레트로바이러스를 생산하는 pBabe-Puro 벡터를 형질감염하였다.

1) 음성대조군: pBabe-Puro 벡터(Addgene, USA);

2) 양성대조군: 야생형 PTEN 발현 벡터(Furnari FB et al., Proc Natl Acad Sci 94:12479-12484, 1997);

3) 실험군 1: 지질 탈인산화효소 결여 돌연변이형 G129E PTEN 발현 벡터(Myers MP et al., Proc Natl Acad Sci 95:13513-13518, 1998); 및,

4) 실험군 2: 탈인산화효소 기능이 제거된 돌연변이형 G129R PTEN 발현 벡터(Furnari et al., 1997).

48시간 후, 배양액을 0.45-μm 필터(Millipore, USA)로 필터링 한 후, 10 ㎍/㎖ 폴리브렌(polybrene; Specialty Media, USA)과 혼합하였다. 상기 혼합액을 일 차 배양된 RPE 세포에 12시간 동안 처리한 후 새로운 배지로 갈아주고 추가로 24시간 동안 배양하였다. 이후 항-β-카테닌 항체(빨간색) 및 항-PTEN 항체(녹색)으로 면역염색함으로써 RPE 세포에서 β-카테닌의 위치를 확인하였다.

가는 점선은 패널 밑부분에 나타낸 직각의 Z-스택(Z-stack)에 대한 구역의 위치를 나타내며, 점선 상의 화살표 머리는 패널 밑부분의 도면의 화살표 머리에 상응한다. Api 및 bas는 Z-스택의 첨단면 및 기측면을 나타낸다.

그 결과, 도 8 및 도 9에서 나타난 바와 같이 양성대조군(야생형)에서는 PTEN 결핍 RPE 세포의 세포 및 핵에서 β-카테닌이 AJ로 재편성되었다(도 8A 및 B). 비록 야생형보다는 덜 효과적이었지만, 지질 탈인산화효소 활성이 결여된 돌연변이 PTEN(G129E)도 β-카테닌을 AJ로 재편성할 수 있었다(도 8C). 그러나 지질 및 단백질 탈인산화효소 활성이 모두 결여된 PTEN(G129R)은 β-카테닌을 AJ로 재편성할 수 없었다(도 8D). 상기 지질 탈인산화 효소 활성이 결여된 PTEN(G129E) 변이체에 의한 AJ 구조의 부분 회복 결과로부터, PTEN에 의해 보호되는 RPE 세포 간 연접구조는 PTEN 기질 단백질의 탈인산화 및 PTEN 기질 지질인 PIP3의 탈인산화 모두가 필요한 현상인 것을 제안하였다.

<6-2> PTEN에 의한 기능적 도메인 확인

또한, 본 발명자들은 PTEN은 인지질 및 이의 C2 도메인에 결합하거나 연접성 PDZ 도메인을 포함하는 단백질과 이의 C-말단 PDZ-결합 도메인의 상호작용을 통해서 AJ를 위치시킬 것으로 예상하였고(Georgescu et al., 1999, 2000; Lee et al., 1999; Leslie et al. 2000), 상기 두 가지 도메인을 대상으로 β-카테닌을 AJ로 재 국지화하는 것을 촉진하는 PTEN에 의한 기능적 도메인을 정의하고자 하였다.

구체적으로, 하기 실험군 3 및 실험군 4의 벡터를 이용한 것을 제외하고, 실시예 6-1과 동일한 방법으로 실시하였다.

5) 실험군 3: 지질 결합 C2 도메인이 제거된 돌연변이형 M-CBR3 PTEN 발현 벡터(Leslie 박사로부터 제공받은 인간 pten 유전자 변이체를 pBabe-puro 벡터에 도입하여 제작함)(Lee JO et al., Cell 99:323-334, 1999; Leslie NR et al., Biochem J 346:827-833, 2000); 및,

6) 실험군 4: C-말단의 PDZ 결합 도메인이 제거되도록 잘라진 돌연변이형 Q399X PTEN 발현 벡터(Leslie 박사로부터 제공받은 인간 pten 유전자 변이체를 pBabe-puro 벡터에 도입하여 제작함)(Leslie NR et al., 2000).

그 결과, 도 8 및 도 9에서 나타난 바와 같이 C2 도메인이 제거된 돌연변이형 PTEN(M-CBR3)은 야생형보다 더욱 효과적으로 β-카테닌을 AJ로 재국지화하였다(도 8E). 반대로 C-말단 PDZ-결합 도메인이 제거된 난센스 돌연변이형 PTEN(Q399X)은 세포질 β-카테닌을 AJ로 전달할 수 없었다(도 8F). 상기 결과로부터 PTEN에 의한 AJ의 유지에는 PDZ 도메인을 포함하는 연접 단백질의 상호작용이 필요한 것이 제안되었다.

<실시예 7> 망막 변성 중인 마우스에서 PTEN의 RPE의 불활성화

상기 기술된 구조적 변형을 유도할 수 있는 분자 수준의 사건들을 이해하기 위해, 본 발명자들은 P21 야생형 또는 PTEN 결핍 RPE 세포로부터 전체 RNA를 추출 하였고, Affymetrix 마이크로어레이를 이용하여 유전자 발현양상을 분석하였다.

그 결과, 표 1에서 나타난 바와 같이 돌연변이 RPE 세포에서 손상된 연접 구조의 발견과 일치되게, E-캐드헤린, 데스모플라킨(desmoplakin) 및 플라코필린 3(plakophilin 3)을 포함하는 세포간 부착에 포함된 유전자들의 발현량이 돌연변이 RPE 세포에서 현저하게 감소하였다. 그 외의, 감소된 유전자들로는 Trp63(transformation-related protein 63), p107Rb 및 c-Cbl과 같은 세포증식 억제에 관련된 유전자; 트롬보스폰딘 4(thrombospondin 4), 더마토스폰딘(dermatospondin) 및 신데칸1(syndecan1)과 같은 ECM(extracellular matix) 조절 유전자; 및 Hspa1a, Hspa1b, Hspb1과 같은 열충격 단백질 및 Dnaja4와 같은 세포간 샤페론을 암호화하는 유전자들이었다. 반대로, α-SMA/ActA2a(α-smooth muscle actin/Actin A2a) 및 미오신 경쇄(myosin heavy chains) Myh1 및 Myh4와 같은 세포이동과 관련된 유전자의 발현은 돌연변이 RPE 세포에서 현저하게 증가하였다.

가장 극적으로 변화된 유전자는 크리스탈린(crystallins) 및 HSP를 암호화하는 것들이었다. HSP 및 크리스탈린은 온도 향상 및 활성산소종과 같은 단백질 불안정화 스트레스들로부터 세포를 보호한다(Wang K & Spector A, Eur J Biochem 267:4705-4712, 2000). RPE 세포는 광화학 반응의 대사 중간물질로부터 산화적 스트레스에 지속적으로 노출되고, 과량의 산화적 스트레스는 AMD와 같은 망막의 퇴행성 질환의 주요 원인 중 하나로 알려져 있다(Winkler BS et al ., Mol Vis 5:32, 1999).

Unigene #	Avg Ratio	Gene Title	Gene Symbol	Cellular Function
Mm.1228	-39.4	crystallin, alpha A	Cryaa	Chaperone
Mm.42246	-36.76	phosphoenolpyruvate carboxykinase 1, cytosolic	Pck1
Mm.27202	-24.25	crystallin, gamma D	Crygd	Chaperone
Mm.103738	-20	claudin 9	Cldn9	Adhesion
Mm.22830	-13.93	crystallin, beta A1	Cryba1	Chaperone
Mm.261602	-12.5	hypermethylated in cancer 2	Hic2	Cancer
Mm.40324	-9.19	crystallin, beta A4	Cryba4	Chaperone
Mm.245210	-9	leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 1	Lrig1	Surface/ECM
Mm.20176	-8.57	crystallin, gamma A	Cryga	Chaperone
Mm.29488	-8	crystallin, beta B1	Crybb1	Chaperone
Mm.28369	-8	F-box only protein 15	Fbxo15
Mm.4783	-8	killer cell lectin-like receptor, subfamily A, member 2	Klra2	Surface/ECM
Mm.314703	-7.7	desmoplakin	Dsp	Adhesion, EMT(-)
Mm.156727	-7.6	hyperparathyroidism 2 homolog (human)	Hrpt2	Disease
Mm.4005	-6.96	ephrin B2	Efnb2	Signaling
Mm.5014	-6.96	Norrie disease homolog	Ndph	Wnt
Mm.1215	-6.5	crystallin, beta B2	Crybb2	Chaperone
Mm.6253	-6.5	crystallin, gamma S	Crygs	Chaperone
Mm.4641	-6.5	trefoil factor 3, intestinal	Tff3
Mm.6838	-6.06	crystallin, gamma B	Crygb	Chaperone
Mm.4041	-5.66	dual-specificity tyrosine-(Y)-phosphorylation regulated kinase 1a	Dyrk1a	Signaling
Mm.30374	-5.28	crystallin, gamma C	Crygc	Chaperone
Mm.86656	-4.92	crystallin, beta A2	Cryba2	Chaperone
Mm.57029	-4.92	cytochrome P450, 7a1	Cyp7a1	Metabolism
Mm.20865	-4.59	thrombospondin 4	Thbs4	Adhesion
Mm.1428	-4.29	GATA binding protein 4	Gata4	Transcription
Mm.1225	-4.29	procollagen, type XVII, alpha 1	Col17a1	Cytoskeleton
Mm.42203	-4.1	kinesin family member 11	Kif11	Transport/Channel
Mm.250392	-3.8	FXYD domain-containing ion transport regulator 4	Fxyd4	Transport/Channel
Mm.29603	-3.73	plakophilin 3	Pkp3	Adhesion, EMT(-)
Mm.2580	-3.73	syndecan 1	Sdc1	Surface/ECM, EMT (-)
Mm.258883	-3.6	coronin, actin binding protein 2A	Coro2a	Cytoskeleton
Mm.57250	-3.6	hypermethylated in cancer 1	Hic1	Cancer
Mm.8473	-3.48	alcohol dehydrogenase 7 (class IV), mu or sigma polypeptide	Adh7	Metabolism
Mm.34043	-3.48	aquaporin 3	Aqp3	Adhesion
Mm.4712	-3.48	integrin beta 1 (fibronectin receptor beta)	Itgb1	Adhesion
Mm.320560	-3.3	coronin, actin binding protein 1C	Coro1c	Cytoskeleton
Mm.21389	-3.03	deiodinase, iodothyronine, type II	Dio2	Metabolism
Mm.6228	-3.03	keratocan	Kera	Surface/ECM
Mm.215096	-3.03	lymphocyte antigen 6 complex, locus G6C	Ly6g6c	Surface/ECM
Mm.19946	-3.03	S100 calcium binding protein A5	S100a5	Transport/Channel
Mm.14455	-3.03	transforming growth factor, beta induced, 68 kDa	Tgfbi	Signaling
Mm.272210	-3	ciliary neurotrophic factor receptor	Cntfr	Signaling
Mm.219648	-3	THO complex 1	Thoc1	Transcription
Mm.154994	-2.9	dystonia 1	Dyt1	Disease
Mm.3267	-2.83	annexin A8	Anxa8	Surface/ECM
Mm.40616	-2.83	crystallin, beta B3	Crybb3	Chaperone
Mm.1231	-2.83	cysteine rich protein 61	Cyr61	Chaperone
Mm.52319	-2.83	DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily A, member 4	Dnaja4	Chaperone
Mm.196559	-2.83	heat shock protein 1A	Hspa1a	Chaperone
Mm.22261	-2.83	neuroepithelial cell transforming gene 1	Net1
Mm.4622	-2.83	serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade B, member 5	Serpinb5	Surface/ECM
Mm.256926	-2.8	liver glycogen phosphorylase	Pygl	Metabolism
Mm.8473	-2.64	alcohol dehydrogenase 7 (class IV), mu or sigma polypeptide	Adh7	Metabolism
Mm.120807	-2.64	carboxylesterase 3	Ces3	Metabolism
Mm.52319	-2.64	DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily A, member 4	Dnaja4	Chaperone
Mm.42472	-2.64	UDP-glucuronosyltransferase 1 family, member 1	Ugt1a1	Metabolism
Mm.247651	-2.6	kinesin family member 2C	Kif2c	Cytoskeleton
Mm.130701	-2.5	claudin 19	Cldn19	Adhesionhesion
Mm.158662	-2.5	claudin 3	Cldn3	Adhesion, EMT(-)
Mm.86652	-2.48	claudin 13	Cldn13	Adhesion
Mm.2706	-2.46	activating transcription factor 3	Atf3	Transcription
Mm.35290	-2.46	ankyrin repeat domain 3	Ankrd3	Adhesion
Mm.34043	-2.46	aquaporin 3	Aqp3	Transport
Mm.120807	-2.46	carboxylesterase 3	Ces3	Metabolism
Mm.56950	-2.46	cytochrome P450, 4a12	Cyp4a12	Metabolism
Mm.10724	-2.46	ets homologous factor	Ehf	Transcription
Mm.18618	-2.46	glycine C-acetyltransferase (2-amino-3-ketobutyrate-coenzyme A ligase)	Gcat	Metabolism
Mm.5903	-2.46	GPI anchor attachment protein 1	Gpaa1	Surface/ECM
Mm.6388	-2.46	heat shock protein 1B	Hspa1b	Chaperone
Mm.128106	-2.46	tripartite motif protein 6	Trim6
Mm.42472	-2.46	UDP-glucuronosyltransferase 1 family, member 1	Ugt1a1	Metabolism
Mm.25646	-2.4	carbohydrate (N-acetylglucosamine 6-O) sulfotransferase 5	Chst5	Surface/ECM
Mm.290950	-2.4	loss of heterozygosity, 11, chromosomal region 2, gene A homolog (human)	Loh11cr2a	Disease
Mm.260076	-2.33	crumbs homolog 3 (Drosophila)	Crb3	Adhesion
Mm.4094	-2.3	cytochrome P450, steroid inducible 3a13	Cyp3a13	Metabolism
Mm.2982	-2.3	DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily B, member 1	Dnajb1	Chaperone
Mm.190619	-2.3	endothelial differentiation, sphingolipid G-protein-coupled receptor, 8	Edg8	Signaling
Mm.299813	-2.3	expressed in non-metastatic cells 1, protein	Nme1	Cancer
Mm.39472	-2.3	farnesyl diphosphate synthetase	Fdps	Metabolism
Mm.6375	-2.3	glycogenin 1	Gyg1
Mm.13849	-2.3	heat shock protein 1	Hspb1	Chaperone
Mm.228	-2.3	homer homolog 2 (Drosophila)	Homer2	Adhesion
Mm.482	-2.3	Jun oncogene	Jun	Transcription
Mm.30262	-2.3	Kruppel-like factor 5	Klf5	Transcription
Mm.214599	-2.3	mucin 4	Muc4	Surface/ECM
Mm.20450	-2.3	nucleosome binding protein 1	Nsbp1
Mm.22621	-2.3	procollagen, type I, alpha 1	Col1a1	Cytoskeleton
Mm.34171	-2.3	prominin 2	Prom2	Cytoskeleton
Mm.353214	-2.3	runt related transcription factor 1	Runx1	transcription
Mm.278689	-2.3	schlafen 2	Slfn2	Cancer
Mm.29675	-2.3	thioredoxin-like 2	Txnl2	Chaperone
Mm.25743	-2.3	transmembrane protease, serine 2	Tmprss2	Surface/ECM
Mm.28419	-2.3	tripartite motif protein 29	Trim29
Mm.154045	-2.3	tumor-associated calcium signal transducer 2	Tacstd2	Transport/Channel
Mm.279780	-2.2	RAB17, member RAS oncogene family	Rab17	Signaling
Mm.1408	-2.14	adrenomedullin	Adm
Mm.81698	-2.14	Casitas B-lineage lymphoma c	Cblc	Signaling
Mm.41887	-2.14	chondroitin 4-sulfotransferase	C4st-pending	Surface/ECM
Mm.23793	-2.14	cyclic nucleotide gated channel, cGMP gated	Cncg	Transport/Channel
Mm.28935	-2.14	dermatopontin	Dpt
Mm.27670	-2.14	DNA segment, Chr 11, ERATO Doi 672, expressed	D11Ertd672e
Mm.33240	-2.14	epithelial V-like antigen	Eva	Surface/ECM
Mm.51426	-2.14	GPI-anchored metastasis-associated protein homolog	C4.4a-pending/LYPD3	Surface/ECM
Mm.95398	-2.14	guanine nucleotide binding protein (G protein), gamma 1 subunit	Gng1	Signaling
Mm.4987	-2.14	integrin binding sialoprotein	Ibsp	Surface/ECM
Mm.13052	-2.14	kidney androgen regulated protein	Kap
Mm.196204	-2.14	myc induced nuclear antigen	Mina
Mm.3608	-2.14	paired box gene 6	Pax6	Transcription
Mm.26994	-2.14	RAB25, member RAS oncogene family	Rab25	Signaling
Mm.20894	-2.14	transformation related protein 63	Trp63	Cancer, EMT(-)
Mm.14455	-2.14	transforming growth factor, beta induced, 68 kDa	Tgfbi
Mm.25264	-2.1	DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 21	Ddx21	transcription/chromatin
Mm.89935	-2.1	desmocollin 3	Dsc3	Adhesion
Mm.37787	-2.1	discoidin, CUB and LCCL domain containing 2	Dcbld2	Adhesion
Mm.35290	-2	ankyrin repeat domain 3	Ankrd3
Mm.301147	-2	basic transcription factor 3	Btf	transcription
Mm.35605	-2	cadherin 1	Cdh1	Adhesion, EMT(-)
Mm.4863	-2	CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP), beta	Cebpb	Transcription
Mm.6417	-2	CD24a antigen	Cd24a	Surface/ECM
Mm.4137	-2	chromogranin A	Chga	Surface/ECM
Mm.2903	-2	DNA primase, p49 subunit	Prim1	Cell cycle
Mm.33484	-2	EGL nine homolog 3 (C. elegans)	Egln3
Mm.26091	-2	FBJ osteosarcoma oncogene B	Fosb	Transcription
Mm.193099	-2	fibronectin 1	Fn1	Surface/ECM, EMT (+)
Mm.90003	-2	gap junction membrane channel protein beta 3	Gjb3
Mm.1360	-2	growth arrest and DNA-damage-inducible 45 beta	Gadd45b	Cell cycle
Mm.1360	-2	growth arrest and DNA-damage-inducible 45 beta	Gadd45b	Cell cycle
Mm.1546	-2	guanine nucleotide binding protein, alpha 15	Gna15	Chaperone
Mm.8877	-2	hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 2	Hsd17b2
Mm.6974	-2	keratin complex 1, acidic, gene 14	Krt1-14	Cytoskeleton
Mm.4325	-2	Kruppel-like factor 4 (gut)	Klf4	Transcription
Mm.196204	-2	myc induced nuclear antigen	Mina
Mm.196461	-2	NS1-associated protein 1-like	Nsap1l-pending
Mm.42138	-2	nuclear factor, erythroid derived 2, like 3	Nfe2l3
Mm.226821	-2	periplakin	Ppl	Adhesion
Mm.29603	-2	plakophilin 3	Pkp3	Adhesion, EMT(-)
Mm.22621	-2	procollagen, type I, alpha 1	Col1a1	Cytoskeleton
Mm.18565	-2	proteolipid protein 2	Plp2
Mm.2994	-2	retinoblastoma-like 1 (p107)	Rbl1	Cancer
Mm.679	-2	rod outer segment membrane protein 1	Rom1
Mm.4622	-2	serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade B, member 5	Serpinb5	Surface/ECM
Mm.258200	-2	similar to Serine/threonine protein kinase 24 (STE20-like kinase MST3) (MST-3) (Mammalian STE20-like protein kinase 3)	LOC223255	Signaling
Mm.1538	-2	similar to Transcription factor BTF3 (RNA polymerase B transcription factor 3)	LOC218490
Mm.25660	-2	synaptotagmin-like 1	Sytl1	Transport/Channel
Mm.14455	-2	transforming growth factor, beta induced, 68 kDa	Tgfbi
Mm.24280	-2	ubiquitin specific protease 15	Usp15
Mm.2654	-2	WD repeat domain 1	Wdr1
Mm.4159	-1.98	thrombospondin 1	Thbs1	Surface/ECM
Mm.322506	-1.9	CEA-related cell adhesion molecule 1 /// CEA-related cell adhesion molecule 2	Ceacam1 /// Ceacam2	Adhesion
Mm.38444	-1.9	cell division cycle 25 homolog B (S. cerevisiae)	Cdc25b	Cell cycle
Mm.109930	-1.9	cell division cycle 26	Cdc26	Cell cycle
Mm.299774	-1.9	junction plakoglobin	Jup	Adhesion
Mm.278357	-1.9	kinesin 2	Kns2	Cytoskeleton
Mm.250558	-1.9	myotubularin related protein 4	Mtmr4	Disease
Mm.308500	-1.9	protocadherin alpha 1 /// protocadherin alpha 10 /// protocadherin alpha 11 /// protocadherin alpha 12 /// protocadherin alpha 2 /// protocadherin alpha 3 /// protocadherin alpha 4 /// protocadherin alpha 5 /// protocadherin alpha 6 /// protocadherin alph	Pcdha1 /// Pcdha10 /// Pcdha11 /// Pcdha12 /// Pcdha2 /// Pcdha3 /// Pcdha4 /// Pcdha5 /// Pcdha6 /// Pcdha7 /// Pcdha8 /// Pcdha9 /// Pcdhac1 /// Pcdhac2	Adhesion
Mm.7883	-1.8	adenomatosis polyposis coli (total)	Apc	Wnt, EMT (-)
Mm.221757	-1.8	Kruppel-like factor 3 (basic)	Klf3	Transcription
Mm.7373	-1.7	period homolog 1 (Drosophila)	Per1	Transcription
Mm.293683	-2.38	envoplakin	Evpl	Adhesion
Mm.289707	-2.17	fascin homolog 1, actin bundling protein (Strongylocentrotus) purpuratus)	Fscn1
Mm.88819	-1.92	synaptotagmin 7	Syt7	Transport/Channel
Mm.213002	-1.92	synaptotagmin 8	Syt8	Transport/Channel
Mm.280547	-1.88	desmocollin 2	Dsc2	Adhesion, EMT(-)
Mm.28507	-1.88	Rho GTPase activating protein 21	Arhgap21	Signaling
Mm.28147	-1.81	deleted in polyposis 1-like 1	Dp1l1	Cancer
Mm.263847	-1.75	FXYD domain-containing ion transport regulator 3	Fxyd3	Transport/Channel
Mm.255596	-1.75	neurofibromatosis 1	Nf1
Mm.330428	-1.72	CD44 antigen	Cd44	Cancer/surface
Mm.21974	-1.69	c-src tyrosine kinase	Csk	Signaling
Mm.330428	-1.56	CD44 antigen	Cd44	Cancer/surface
NM_007392	1.6	actin, alpha 2, smooth muscle, aorta	Acta2	Cytoskeleton, EMT (+)
Mm.754	1.7	angiotensin converting enzyme	Ace	Surface/ECM
Mm.42855	1.7	prostate tumor over expressed gene 1	Ptov1	Cancer/differentiation
Mm.250631	1.72	protein-tyrosine sulfotransferase 2	Tpst2
Mm.274463	1.79	endothelin converting enzyme 1	Ece1	Surface/ECM
Mm.333406	1.8	cyclin D2	Ccnd2	Cell cycle
Mm.182434	1.8	follistatin-like 1	Fstl1	Surface/ECM
Mm.134516	1.8	orthodenticle homolog 2 (Drosophila)	Otx2	Transcription
Mm.347948	1.8	RAB, member of RAS oncogene family-like 5	Rabl5	Signaling
Mm.280156	1.81	tissue inhibitor of metalloproteinase 2	Timp2	Surface/ECM
Mm.207391	1.83	CCR4-NOT transcription complex, subunit 3	Cnot3	Transcription
Mm.30438	1.86	tyrosinase-related protein 1	Tyrp1
Mm.24662	1.87	S100 calcium binding protein A1	S100a1	Transport/Channel
Mm.150064	1.88	chemokine-like factor super family 8	Cklfsf8	Signaling
Mm.340214	1.88	heparan sulfate (glucosamine) 3-O-sulfotransferase 3A1	heparan sulfate (glucosamine) 3-O-sulfotransferase 3A2	Surface/ECM
Mm.272085	1.9	cathepsin K	Ctsk	Proteolysis
Mm.2619	1.9	cholecystokinin	Cck	Surface/ECM
Mm.32870	1.92	RAB2B, member RAS oncogene family	Rab2b	Signaling
Mm.595	1.93	bone morphogenetic protein 7	Bmp7	Development
Mm.347405	1.93	melanoma inhibitory activity	Mia	Cancer
Mm.272278	1.93	microfibrillar-associated protein 4	Mfap4	Adhesion
Mm.143818	1.93	NIMA (never in mitosis gene a)-related expressed kinase 6	Nek6	Signaling
Mm.6813	1.94	bone morphogenetic protein 4		Development
Mm.290924	1.94	ciliary neurotrophic factor /// zinc finger protein 91	Cntf /// Zfp91	Signaling
Mm.45506	1.96	naked cuticle 2 homolog (Drosophila)	Nkd2	Cytoskeleton
Mm.282556	1.99	Niemann Pick type C2	Npc2	Surface/ECM
Mm.235230	2	bone morphogenetic protein 2	Bmp2	Development
Mm.4606	2	branched chain aminotransferase 1, cytosolic	Bcat1	Metabolism
Mm.3619	2	cathepsin S	Ctss	Proteolysis
Mm.347409	2	choline kinase beta	Chkb	Metabolism
Mm.4575	2	chondroitin sulfate proteoglycan 2	Cspg2	Surface/ECM
Mm.175612	2	cyclin L1	Ccnl1	Cell cycle
Mm.2065	2	cytidine 5'-triphosphate synthase 2	Ctps2
Mm.4866	2	ets variant gene 1	Etv1	Transcription
Mm.40466	2	F-box only protein 32	Fbxo32/atrogin-1
Mm.87312	2	glia maturation factor, beta	Gmfb
Mm.1239	2	glial fibrillary acidic protein	Gfap
Mm.2938	2	insulin-like growth factor 2 receptor	Igf2r	Signaling, EMT (+)
Mm.6718	2	interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1	Ifit1
Mm.27680	2	myosin, light polypeptide kinase	Mylk	Cytoskeleton, EMT (+)
Mm.46724	2	poliovirus receptor-related 3	Pvrl3
Mm.141312	2	procollagen, type IX, alpha 3	Col9a3	Cytoskeleton
Mm.30156	2	protease, serine, 11 (Igf binding)	Prss11/HTRA1	Proteolysis
Mm.20954	2	regulator of G-protein signaling 5	Rgs5	Signaling
Mm.140672	2	SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of chromatin, subfamily d, member 3	Smarcd3
Mm.2006	2	transgelin	Tagln
Mm.1365	2	tyrosinase	Tyr
Mm.287544	2	wingless-related MMTV integration site 5A	Wnt5a	Wnt
Mm.33779	2.03	myosin IXb	Myo9b	Cytoskeleton, EMT (+)
Mm.209715	2.04	procollagen, type XI, alpha 1	Col11a1	Cytoskeleton
Mm.167586	2.06	Musashi homolog 2 (Drosophila)	Msi2h	Transcription
Mm.283370	2.07	neurocalcin delta	Ncald	Transport/Channel
Mm.260698	2.07	receptor (calcitonin) activity modifying protein 2	Ramp2	Transport/Channel
Mm.41678	2.08	Dullard homolog (Xenopus laevis)	Dullard	Surface/ECM
Mm.138876	2.08	moesin	Msn	Cytoskeleton
Mm.1561	2.14	BCL2/adenovirus E1B 19 kDa-interacting protein 1, NIP2	Bnip2	Signaling
Mm.123110	2.14	beta-spectrin 2, non-erythrocytic	Spnb2	Cytoskeleton
Mm.28623	2.14	calmodulin-like 4	Calml4	Signaling
Mm.2770	2.14	insulin-like growth factor 1	Igf1	Signaling, EMT (+)
Mm.2639	2.14	lymphocyte antigen 86	Ly86	Surface/ECM
Mm.336040	2.14	odd Oz/ten-m homolog 1 (Drosophila)	Odz1
Mm.1268	2.14	proteolipid protein (myelin)	Plp	Lipid metabolism
Mm.33721	2.14	sorting nexin associated golgi protein 1	Snag1	Transport/Channel
Mm.2795	2.14	surfeit gene 4	Surf4
Mm.28585	2.14	thyroid hormone responsive SPOT14 homolog (Rattus)	Thrsp
Mm.46301	2.14	TYRO protein tyrosine kinase binding protein	Tyrobp	Signaling
Mm.348053	2.15	protocadherin beta 21	Pcdhb21	Adhesion
Mm.153272	2.15	transforming growth factor beta 1 induced transcript 4	Tgfb1i4	Cancer
Mm.259191	2.16	O-linked N-acetylglucosamine (GlcNAc) transferase (UDP-N-acetylglucosamine:polypeptide-N-acetylglucosaminyl transferase)	Ogt	Surface/ECM
Mm.2560	2.16	Rap2 interacting protein	Rap3 interacting protein	Signaling
Mm.1318	2.17	v-abl Abelson murine leukemia oncogene 1	Abl1	Cancer
Mm.275864	2.19	RAB34, member of RAS oncogene family	Rab34	Signaling
Mm.258910	2.2	ADP-ribosylation factor GTPase activating protein 3	Arfgap3	Signaling
Mm.2570	2.2	complement component 1, q subcomponent, beta polypeptide	C1qb	Surface/ECM
Mm.255637	2.2	matrix metalloproteinase 24	Mmp24	Proteolysis
Mm.4871	2.21	tissue inhibitor of metalloproteinase 3	Timp3	Proteolysis
Mm.34598	2.24	cytoglobin/stellate cell activation-associated protein(STAP)	Cygb	Transport/Channel
Mm.29344	2.24	tumor differentially expressed 2	Tde2	Cancer
Mm.108550	2.3	a disintegrin and metalloprotease domain 33	Adam33	Proteolysis
Mm.46051	2.3	bicaudal C homolog 1 (Drosophila)	Bicc1
Mm.38021	2.3	carbohydrate (keratan sulfate Gal-6) sulfotransferase 1	Chst1	Surface/ECM
Mm.15711	2.3	cyclic nucleotide phosphodiesterase 1	Cnp1	Metabolism
Mm.68712	2.3	frizzled homolog 4 (Drosophila)	Fzd4	Wnt
Mm.100641	2.3	microphthalmia-associated transcription factor	Mitf	Transcription
Mm.5157	2.3	mouse homolog of human ocular albinism 1 (Nettleship-Falls)	Oa1
Mm.46016	2.3	procollagen C-endopeptidase enhancer 2	Pcolce2	Cytoskeleton
Mm.21830	2.3	reversion induced LIM gene	Ril-pending
Mm.192991	2.31	metallothionein 1	Mt1	Transport
Mm.290995	2.34	collapsin response mediator protein 1	Crmp1	Proteolysis
Mm.1151	2.35	dipeptidylpeptidase 4	dipeptidylpeptidase 5	Proteolysis
Mm.307887	2.36	transforming growth factor, beta 3	Tgfb3	Cancer, EMT (+)
Mm.266341	2.42	neuropilin 2	Nrp2	Adhesion
Mm.234200	2.46	complement component 4 (within H-2S)	C4	Surface/ECM
Mm.29466	2.46	Kruppel-like factor 7 (ubiquitous)	Klf7	Transcription
Mm.2992	2.46	myelin basic protein	Mbp	Lipid metabolism
Mm.14526	2.46	myosin light chain, phosphorylatable, fast skeletal muscle	Mylpf	Cytoskeleton, EMT (+)
Mm.3434	2.46	surfeit gene 5	Surf5
Mm.39469	2.46	troponin I, skeletal, fast 2	Tnni2	Cytoskeleton, EMT (+)
Mm.193	2.52	integral membrane protein 2A	Itm2a	surface/receptor
Mm.239655	2.53	c-mer proto-oncogene tyrosine kinase	Mertk	cell cycle
Mm.28013	2.53	opioid growth factor receptor-like 1	Ogfrl1	Surface/ECM
Mm.3085	2.53	plexin D1	Plxnd1	Signaling
Mm.263355	2.56	PR domain containing 5	Prdm5
Mm.1371	2.6	paired box gene 3	Pax3	Transcription
Mm.13787	2.64	ceruloplasmin	Cp
Mm.3841	2.64	cytochrome c oxidase, subunit VIIIb	Cox8b	Metabolism
Mm.2992	2.64	myelin basic protein	Mbp	Lipid metabolism
Mm.37214	2.64	transferrin	Trf	Transport/Channel
Mm.6856	2.68	pituitary tumor-transforming 1	Pttg1	Cancer
Mm.2064	2.74	metallothionein 3	Mt3	Transport/Channel
Mm.253564	2.77	striamin	Strm
Mm.4575	2.83	chondroitin sulfate proteoglycan 2	Cspg2	Surface/ECM
Mm.34345	2.83	fatty acid desaturase 3	Fads3	Lipid metabolism
Mm.23662	2.83	sema domain, transmembrane domain (TM), and cytoplasmic domain, (semaphorin) 6C	Sema6c	Signaling
Mm.2108	2.83	transthyretin	Ttr
Mm.44736	2.88	dynamin	Dnm	Cytoskeleton
Mm.253518	2.9	bone marrow stromal cell antigen 2 /// bromodomain containing 4	Bst2 /// Brd4
Mm.44752	3.03	double cortin and calcium/calmodulin-dependent protein kinase-like 1	Dcamkl1
Mm.235023	3.03	E26 avian leukemia oncogene 1, 5' domain	Ets1	Transcription
Mm.6800	3.03	keratin complex 2, basic, gene 8	Krt2-8	Cytoskeleton
Mm.2992	3.03	myelin basic protein	Mbp	Lipid metabolism
Mm.2992	3.03	myelin basic protein	Mbp	Lipid metabolism
Mm.5259	3.03	myelin-associated oligodendrocytic basic protein	Mobp	Lipid metabolism
Mm.754	3.22	angiotensin converting enzyme	Ace	Proteolysis
Mm.9537	3.25	lipocalin 2	Lcn2/NGAL	Lipid metabolism
Mm.5259	3.25	myelin-associated oligodendrocytic basic protein	Mobp	Lipid metabolism
Mm.5259	3.25	myelin-associated oligodendrocytic basic protein	Mobp	Lipid metabolism
Mm.46242	3.25	titin	Ttn
Mm.121878	3.25	tropomyosin 1, alpha	Tpm1	Cytoskeleton, EMT (+)
Mm.44995	3.36	DIRAS family, GTP-binding RAS-like 1	Diras1	Signaling
Mm.332720	3.36	protein-tyrosine sulfotransferase 1	Tpst1	Transport/Channel
Mm.2992	3.48	myelin basic protein	Mbp	Lipid metabolism
Mm.1716	3.73	troponin C, fast skeletal	Tncs	Cytoskeleton, EMT (+)
Mm.40599	4.26	odd Oz/ten-m homolog 2 (Drosophila)	Odz2	Signaling
Mm.55320	4.29	triadin	Trdn
Mm.298728	4.96	nischarin	Nisch	Signaling
Mm.19131	4.97	complement component 3	C3	Surface/ECM
Mm.213025	5.06	actin, alpha 2, smooth muscle, aorta	Acta2	Cytoskeleton, EMT (+)
Mm.213397	5.18	interleukin 17 receptor C	Il17rc	Signaling
Mm.30191	5.2	RAB, member of RAS oncogene family-like 4	Rabl4	Signaling
Mm.259312	5.83	trans-acting transcription factor 4	Sp4	Transcription
Mm.24105	6.08	nuclear distribution gene E homolog 1 (A nidulans)	Nde1	Cytoskeleton
Mm.42156	6.96	myosin, heavy polypeptide 1, skeletal muscle, adult	Myh1	Cytoskeleton, EMT (+)
Mm.269995	7.11	ets variant gene 6 (TEL oncogene)	Etv6	Transcription
Mm.4083	7.68	sema domain, immunoglobulin domain (Ig), short basic domain, secreted, (semaphorin) 3B	Sema3b	Signaling
Mm.5001	7.8	DNA methyltransferase 3A	Dnmt3a	Cancer
Mm.22562	8.57	gamma-aminobutyric acid (GABA-A) transporter 2	Gabt2
Mm.218857	9.19	erythroid associated factor	Eraf
Mm.3924	9.5	caveolin 3	Cav3	Lipid metabolism
Mm.57051	13	chemokine (C-C motif) receptor 1	Ccr1	Surface/ECM
Mm.30841	13.93	calcium channel, voltage-dependent, alpha2/delta subunit 1	Cacna2d1	Transport/Channel
Mm.35531	18.38	myosin, heavy polypeptide 4, skeletal muscle	Myh4	Cytoskeleton, EMT (+)

<실시예 8> PTEN 결핍 RPE 세포 및 AMD RPE 세포간 표현형의 유사성 평가

PTEN 결핍 RPE 세포 및 AMD RPE 세포간 표현형의 유사성을 평가하였다.

<8-1> AMD 동물 모델을 이용한 평가

본 발명자들은 AMD 동물 모델로 개발된 CC 케모카인(chemokine) 수용체 2-결핍 (ccr2 ^-/-) 마우스(Ambati J et al., Nat Med 9:1390-1397, 2003)의 RPE 세포에서 PTEN 및 마커 단백질의 분포 및 발현량을 감시하였다.

구체적으로, 11개월령 야생형 마우스 또는 ccr2 ^-/- 마우스를 희생하여 실시예 1-1의 방법으로 눈의 동결된 절편을 수득한 후, 항-PTEN 항체, 항-β-카테닌 항체 및 항-에즈린 항체를 이용하여 면역염색하였다. 또한, 실시예 1-2의 방법으로 RPE 세포로부터 단백질을 분리한 후, 항-pPTEN(S380/T382/T383) 항체(Cell Signaling Technology, USA), 항-PTEN 항체, 항-pAkt(S473) 항체(Cell Signaling Technology, USA), 항-Akt 항체(Cell Signaling Technology, USA), 항-RPE65 항체(Novus Biologicals, USA), 항-α-크리스탈린 항체(Santa Cruz, USA) 및 항-β-액틴 항체(Abchem, USA)를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 수행하였다.

그 결과, PTEN 결핍 RPE 세포에서 에즈린이 첨단부 미세융모에 정상적으로 위치(도 6F)하였고, 세포질에서 β-카테닌의 분포가 증가(도 6B)한 것과 유사한 결과가, ccr2 ^-/- 마우스의 RPE 세포의 세포질에서도 관찰되었고, 첨단부 및 기측부 영역에서 PTEN 검출도 현저하게 감소하였다(도 10A; 화살표 머리는 확대된 부분을 지시한다.). 그러나 RPE 세포에서 전체 PTEN의 양은 현저하게 변화하지 않았다(도 10B). 반면에 효소 활성 및 PDZ 도메인 단백질과의 관련성을 감소시키는 PTEN의 S380, T382 또는 T383(pPTEN)의 탈인산화 정도는 ccr2 ^-/- RPE 세포에서 향상되었다(도 10B). 상기 결과는 ccr2 ^-/- RPE 세포의 PTEN은 C-말단 PDZ-결합 도메인을 통한 연접 구조를 완성할 수 없는 것을 제안하였다. 또한 유전적 또는 생리적으로 유도된 PTEN의 불활성화는 마우스에서 AMD를 유발할 수 있는 것을 제안한다.

<8-2> 산화 스트레스 유도 물질을 이용한 평가

본 발명자들은 연접 영역에서 PTEN의 불활성화가 AMD-촉진 자극에 의해 유도되는 것인지, 또는 RPE 변성과 관련되지 않은 Ccr2-활성화 신호전달의 결함에 의한 것인지를 판단하기 위해, 산화적 스트레스를 통해 RPE 변성을 유도하였다. 산화 스트레스 유도 물질인 NaIO₃(sodium iodate)를 이용하여 RPE의 선택적인 변성을 유도하여 망막변성을 유도하였다(Kiuchi K et al., Curr Eye Res 25:373-379, 2002).

구체적으로, 2 내지 3개월령 C57BL/6 마우스(Charles River, USA)의 꼬리 정맥에 30 ㎎/㎏의 NaIO₃를 정맥주사하였다. 24시간 후, 상기 처리된 마우스를 희생하여 실시예 1-1의 방법으로 눈의 동결된 절편을 수득하였고, 실시예 1-2의 방법으로 RPE 세포로부터 단백질을 분리한 후, 실시예 8-1의 방법으로 면역염색 및 웨스턴 블랏팅을 수행하였다.

그 결과, 상기 NaIO₃가 투여된 마우스의 RPE 세포에서도 PTEN의 감소 및 연접영역으로부터 β-카테닌의 세포질로의 방출이 관찰되었고(도 10C), 이는 PTEN-결핍 또는 ccr2 ^-/- RPE 세포와 유사하였다. 또한 상기 결과는 PTEN 및 Akt의 증가된 딸인산화에 의해서도 수행되었다(도 10D). 상기 결과는 PTEN의 불활성화 및 그에 따른 AJ의 붕괴는ccr2 ^-/- -특이적 사건은 아니었으나, 산화적 스트레스에 따른 RPE 변성에 대한 일반적인 기작인 것을 시사한다.

도 1은 pten 유전자의 RPE-특이적 녹아웃을 확인한 도이다:

A: RPE 층에 집중된 PTEN; 및,

B, C: fl/fl;T1Cre 마우스의 RPE 세포에서 PTEN 녹아웃.

도 2는 fl/fl;T1Cre의 망막에서 진행성 변성을 확인한 도이다:

A-F: P8-P90에서 형태적 변형;

G, H: 탈색; 및,

I: RPE 세포의 소실.

도 3은 fl/fl;T1Cre의 망막에서 광수용체의 감소를 확인한 도이다:

A: 로돕신; 및,

B: 옵신.

도 4는 fl/fl;T1Cre의 망막에서 뮬러 신경교세포(MG; Muller glia)가 증식된 것을 확인한 도이다:

A, B: 글루타민 합성효소(GS); 및,

C, D: GFAP(Glial Fibrillary Acidic Protein).

도 5는 fl/fl;T1Cre 마우스의 RPE 세포에서 초기단계 망막 변성을 확인한 도 이다:

A: fl/fl;

B, C: fl/fl;T1Cre; 및,

D-F: A-C의 확대.

도 6은 fl/fl;T1Cre 마우스의 RPE 세포에서 AJ 또는 TJ의 마커 단백질의 비정상적인 세포내 분포를 확인한 도이다:

A, B: β-카테닌;

C, D: E-캐드헤린;

E, F: 에즈린;

G, H: ZO1; 및,

I, J: Crb3.

도 7은 연접 지역에서 PTEN의 위치를 확인한 도이다:

A-F: P8-P90에서 위치;

G-K: 단일층으로 배양된 마우스 RPE 세포에서 PTEN의 위치; 및,

J, K: RPE 세포에서 PTEN의 위치; 및,

L: 기측부 PTEN이 RPE 세포에서 PTEN 발현량.

도 8 및 9는 탈인산화효소 활성의 공헌도 및 PTEN에 의한 기능적 도메인을 확인한 도이다:

8A: Mock; 8B: 야생형; 8C: G129E; 8D: G129R; 8E: M-CBR3; 및, 8F: Q399X.

도 10은 PTEN 결핍 RPE 세포 및 AMD RPE 세포간 표현형의 유사성을 평가한 도이다:

A, B: AMD 동물 모델을 이용한 평가; 및,

C, D: 산화 스트레스 유도 물질을 이용한 평가.

도 11은 RPE 세포를 포함하는 망막의 구조를 나타낸 도이다.

<110> KIM, JIN WOO Lemke, Greg KANG, KYUNG HWA Burrola, Patrick Mak, Tak W. <120> Method for prevention and treatment of Retinal degeneration comprising activity regulation and administration of PTEN <130> 9p-03-15 <150> US61/174,282 <151> 2009-04-30 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cre deletion forward primer <400> 1 gtcaccagga tgcttctgac 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cre deletion reverse primer <400> 2 actattgaac agaatcaacc c 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> loxP insertion forward primer <400> 3 ctcctctact ccattcttcc c 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> loxP insertion reverse primer <400> 4 actcccacca atgaacaaac 20

Claims (25)

1. PTEN(phosphatase and tensin homolog), PTEN의 C-말단의 PDZ 결합 도메인 및 상기 PTEN의 작용제로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 망막 변성 예방 또는 치료용 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 망막 변성은 퇴행성 또는 산화적 스트레스에 의해 유도된 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 2항에 있어서, 노인황반변성(AMD: age-related macular degeneration), 당뇨성 망막증(diabetic retinopathy), 망막박리(retinal detachment) 및 망막색소변성증(RP: retinitis pigmentosa)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 상기 PTEN의 작용제는 PTEN의 상동체 또는 유사체 또는 변형 PTEN인 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 망막 색소 상피(RPE: Retinal pigment epithelium) 세포에서 특이적으로 작동하는 프로모터 및 PTEN을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 유전자컨스트럭트를 포함하는, RPE에서 특이적으로 PTEN을 발현하는 발현벡터를 유효성분으로 포함하는, 망막 변성 예방 또는 치료용 조성물.
6. 제 5항에 있어서, 프로모터는 티로시나아제 관련 단백질 1(TRP1; tyrosinase-related protein 1) 프로모터 또는 VMD2(vitelliform macular dystrophy)인 것을 특징으로 하는 조성물.
7. PTEN, PTEN의 C-말단의 PDZ 결합 도메인 및 상기 PTEN의 작용제로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 투여하는 단계를 포함하는 망막 변성 예방 또는 치료 방법.
8. 제 7항에 있어서, 투여 방법은 경구 또는 비경구 투여되는 것을 특징으로 하는 예방 또는 치료 방법.
9. 제 8항에 있어서, 비경구 투여는 수양액, 공막, 결막, 망막 및 망막과 망막 색소 상피세포 사이의 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 한 곳에 주사하여 국소 투여되는 것을 특징으로 하는 예방 또는 치료 방법.
10. 제 9항에 있어서, 비경구 투여는 직장, 질, 주입, 근육내, 복막내, 동맥내, 경막내, 기관지내, 조내, 피부, 피하, 피내, 경피, 정맥내, 자궁경관내, 복강내, 두개내, 안내, 폐내, 흉곽내, 기관내, 비내, 협측 및 설하로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 한 곳에 주사하는 방법; 또는 에어로졸 추진제를 사용하여 분무 또는 에어로졸화하는 방법으로 전신 투여되는 것을 특징으로 하는 예방 또는 치료 방법.
11. 1) RPE 세포에서 특이적으로 pten 발현이 녹아웃된 마우스 또는 C-말단의 PDZ 결합 도메인이 결실된 pten을 발현하는 마우스에 피검물질을 투여하는 단계;

    2) 상기 처리된 마우스의 망막 변성 정도를 측정하는 단계; 및,

    3) 피검물질 미처리 마우스(대조군)에 비해 단계 2)의 변성 정도가 감소된 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 망막 변성 치료제 후보 물질의 스크리닝 방법.
12. 제 11항에 있어서, 피검물질은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
13. 제 11항에 있어서, 단계 2)의 망막 변성 정도는 ① 상기 망막 또는 이로부터 분리된 RPE 세포의 기측부에서 부착연접(AJ: adherens junction) 마커 단백질의 발현량을 측정하는 방법; ② 상기 망막 또는 이로부터 분리된 RPE 세포에서 PTEN의 발현량을 측정하는 방법; ③ 망막의 탈색소 영역을 측정하는 방법; ④ 망막의 광수용체를 정량하는 방법; ⑤ 망막에서 활성형 뮬러 신경교세포(MG; Muller glia)의 증식을 정량하는 방법; ⑥ 망막 내 신생 혈관 형성 관찰법; ⑦ 망막 내 혈구 세포 침윤 관찰법; 및 ⑧ 전자현미경을 이용한 망막 색소 상피세포의 형태 분석법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
14. 제 13항에 있어서, 상기 부착연접 마커 단백질은 β-카테닌(β-catenin) 또는 E-캐드헤린인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
15. 1) 망막 변성이 유도된 개체에 피검물질을 투여하는 단계;

    2) 상기 처리된 마우스의 망막 내 RPE 세포에서 PTEN의 활성을 측정하는 단계; 및,

    3) 피검물질 미처리 마우스(대조군)에 비해 단계 2)의 PTEN의 활성을 촉진하는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, 망막 내 RPE 세포에서 PTEN의 활성을 촉진하는 물질의 스크리닝 방법.
16. 제 15항에 있어서, 상기 망막 변성은 유전적으로 또는 화학적으로 유도되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
17. 제 15항에 있어서, 망막 변성이 유도된 개체는, AMD 동물 모델로 개발된 CC 케모카인(chemokine) 수용체 2-결핍(ccr2 ^-/-) 마우스(Ambati J et al., Nat Med 9:1390-1397, 2003) 또는 산화 스트레스 유도 물질의 처리에 의해 망막변성이 유도된 마우스인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
18. 제 17항에 있어서, 상기 산화 스트레스 유도 물질은 NaIO₃(sodium iodate)인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
19. 제 15항에 있어서, 상기 PTEN의 활성은 PTEN의 단백질 탈인산화 활성을 척도로 하여 측정되거나, PTEN 단백질 C-말단의 인산화를 불활성의 척도로 하여 측정되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
20. 1) pten 발현이 녹아웃된 RPE 세포 또는 C-말단의 PDZ 결합 도메인이 결실된 pten을 발현하는 RPE 세포의 배양액에 피검물질을 처리하는 단계;

    2) 상기 처리된 RPE 세포의 진행성 변성을 측정하는 단계; 및,

    3) 피검물질 미처리 RPE 세포(대조군)에 비해 단계 2)의 진행성 변성을 억제하는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, RPE 세포의 진행성 변성을 억제하는 물질의 스크리닝 방법.
21. 제 20항에 있어서, 단계 2)의 진행성 변성의 측정은 ① 상기 RPE 세포의 기측부에서 AJ 마커 단백질의 발현량을 측정하는 방법; ② 상기 RPE 세포가 마트리 겔(Matrigel) 배양막을 통과하는 능력을 측정하는 방법; 및 ③ RPE 세포가 자라는 마트리겔 배양막 사이의 배지 통과 효율을 측정하는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
22. 1) 진행성 변성이 유도된 RPE 세포의 배양액에 피검물질을 처리하는 단계;

    2) 상기 처리된 RPE 세포의 PTEN의 단백질 탈인산화 활성을 측정하는 단계; 및,

    3) 피검물질 미처리 RPE 세포(대조군)에 비해 단계 2)의 PTEN의 활성을 촉진하는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는, RPE 세포의 진행성 변성을 억제하는 물질의 스크리닝 방법.
23. 제 22항에 있어서, 상기 진행성 변성은 유전적으로 또는 화학적으로 유도되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
24. 제 22항에 있어서, 상기 진행성 변성이 유도된 RPE 세포는 망막 변성이 유도된 마우스 유래의 RPE 세포 또는 산화 스트레스 유도 물질로 처리된 RPE 세포인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
25. 제 11항 내지 제 24항 중 어느 한 항의 방법으로 스크리닝된 물질을 유효성분으로 포함하는 망막 변성 예방 또는 치료용 조성물.

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