KR20190132069A - Pde6b 유전자가 결손된 망막 변성 동물 모델 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Pde6b 유전자가 결손된 망막 변성 동물 모델 및 이의 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20190132069A
KR20190132069A KR1020180057284A KR20180057284A KR20190132069A KR 20190132069 A KR20190132069 A KR 20190132069A KR 1020180057284 A KR1020180057284 A KR 1020180057284A KR 20180057284 A KR20180057284 A KR 20180057284A KR 20190132069 A KR20190132069 A KR 20190132069A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
retinal
animal model
degeneration
pde6b
retinal degeneration
Prior art date
Application number
KR1020180057284A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102177174B1 (ko
Inventor
이주용
백인정
성영훈
Original Assignee
울산대학교 산학협력단
재단법인 아산사회복지재단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 울산대학교 산학협력단, 재단법인 아산사회복지재단 filed Critical 울산대학교 산학협력단
Priority to KR1020180057284A priority Critical patent/KR102177174B1/ko
Publication of KR20190132069A publication Critical patent/KR20190132069A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102177174B1 publication Critical patent/KR102177174B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/89—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microinjection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/20—Animal model comprising regulated expression system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 CRISPR-Cpf1 방법을 이용해 PDE6B 유전자가 결손된 망막 변성 동물 모델 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 망막 변성 동물 모델은 유전자 가위를 사용해 특이적으로 표적하는 유전자만이 제거될 수 있으므로 돌연변이 생성이 안정적으로 나타날 수 있다. 또한, 후천적인 요인이 아닌 배아 단계에서 유전자 조작을 통해 선천적인 동물 모델을 제조할 수 있어, 다른 요인에 영향을 받지 않고 균일하게 해당 질병의 증상을 나타내는 동물 모델을 제조할 수 있다.

Description

PDE6B 유전자가 결손된 망막 변성 동물 모델 및 이의 제조 방법{A retinal degenerated animal model by PDE6B gene deletion and the preparation method thereof}
본 발명은 CRISPR-Cpf1 방법을 이용해 PDE6B 유전자가 결손된 망막 변성 동물 모델 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
망막은 안구의 가장 안쪽을 덮고 있는 신경 조직을 가리킨다. 안구 내로 들어온 빛이, 망막의 내층을 지나 망막의 시세포에 감지되면, 시세포는 빛 정보를 전기적 정보로 전환하고 망막 내층의 세포를 통해 시신경을 지나 뇌로 전달되어 시각적 정보를 인식할 수 있게 된다.
망막은 위치에 따라 두께가 다른 얇은 투명한 막으로 나뉠 수 있으며, 망막의 중심부는 중심와, 중심와부근 및 중심와주위부로 다시 나뉜다. 이 중 중심와는 임상적으로 황반이라 통칭된다. 보다 구체적으로, 망막은 조직학적으로 안구의 바깥쪽에서부터 안쪽까지 10개의 층으로 구성될 수 있다. 10 개의 구성층은 각각 망막색소상피층(retinal pigment epithelium), 광수용체층(Photoreceptor Layer), 바깥경계막(outer limiting membrane), 외핵층(outer nuclear layer), 외망상층(outer plexiform lager), 내핵층(inner nuclear layer), 내망상층(inner plexiform lager), 신경절세포층(ganglion cell layer), 신경섬유층(nerve fiber layer) 및 내경계막(internal limiting membrane)이다. 이 중 광수용체 층은 빛을 느끼는 부분으로 원뿔세포와 막대세포의 두 가지 시세포로 이루어져 있다. 평균적으로 인간의 망막은 약 1억 개의 막대세포와 600만 개의 원뿔세포를 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 특히, 망막에는 시신경 유두(optic disk) 및 황반과 같은 특수 부위가 존재하며, 망막의 시각적 자극 인기 지능을 통해 시각적 정보를 받아들이기 때문에, 망막 손상이 발생하면 심각한 시력 장애가 나타날 수 있다. 따라서, 이러한 망막 변성 및 손상에 대한 증상 개선을 위해 다양한 치료 방법이 연구되고 있어, 이러한 연구의 임상적 증상 개선 효과의 확인 등을 위해, 동물 모델의 제작이 필수적으로 요구되고 있다.
동물 모델의 제조 과정에 있어서, 실험 동물을 목표로 하는 질병의 원인이 되는 환경에 노출시키거나 화합물을 투여함을 통해 질병이 유발된 동물 모델을 제조할 수 있는 방법이 다양한 질병 모델에 있어서 사용되고 있다. 그러나, 이러한 경우 동물 모델에서는 후천적으로 질병이 유발됨에 따른 합병증 및 개체별 차이가 크게 영향을 미칠 수 있으므로, 유전정보를 조절함을 통해 선천적으로 목표로 하는 질병이 유발되도록 유도된 동물 모델을 제조하는 방법이 주목받고 있다.
이를 위해서, 유전체 교정(Genome Editing)이라는 방법을 통해 특정 유전자의 결손 또는 과발현을 유도하여 생명체의 유전정보를 자유롭게 교정할 수 있다. 유전체 교정 기술은 인간을 포함하여 동물, 식물 또는 미생물의 유전정보를 변화시켜 그 활용범위가 획기적으로 확장되고 있다는 장점을 가진다. 특히, 이 중 유전자 가위는 원하는 유전정보만을 특이적으로 자를 수 있도록 설계되어 만들어진 분자 도구로, 유전체 교정 기술에서 핵심 역할을 하고 있다. 이러한 유전자 가위를 제조하는 기술에 대하여 다양한 사례가 보고된 바 있다. 대한민국 등록특허 제 10-1842014 호에서는 Cpf1 유전자 가위를 이용해 Prkdc 유전자의 결핍을 유도하여, 형질전환 면역 부전 마우스를 제조하였음이 개시되어 있다(특허문헌 1). 또한, CRISPR-Cas 시스템을 이용해 안구 발달에 영향을 미칠 수 있는 유전자에 대한 연구 결과가 공지된 바 있다(비특허문헌 1).
이에, 본 발명자들은 이러한 유전자 가위 기술을 통해 특이적으로 유전자의 결핍이 유도된 동물 모델을 제조하기 위해 노력한 결과, CRISPR-Cpf1 유전자 가위를 이용해 PDE6B 유전자가 넉아웃된 랫드를 제조하였다. 상기 랫드는 망막 변성의 소견을 유의적으로 나타내므로, 망막 변성에 의한 안과 질병의 동물 모델로서 사용할 수 있을 것으로 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
KR 10-1842014 B1. JP 5087011 B2. KR 10-2018-0028996 A1.
DiCarlo, James E., et al. Translational vision science & technology 6.3 (2017): 13-13. Kim, Yongsub, et al. Nature biotechnology 34.8 (2016): 808. Zhu, Xiaoxiao, et al. Scientific reports 4 (2014): 6420.
본 발명의 목적은 망막 변성 동물 모델 및 이의 제조 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 망막 변성 동물 모델을 이용하여 망막 변성 치료제 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PDE6B 유전자 결손을 유도하는 단계를 포함하는, 망막 변성 동물 모델의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 PDE6B 유전자 결손을 유도하는 단계는 하기 단계 i) 내지 iii)의 단계를 통해 수행되는 것일 수 있다:
i) PDE6B 유전자를 인식하는 crRNA 및 Cpf1 mRNA를 생성하는 단계;
ii) 동물 모델 배아 내로 상기 crRNA 및 Cpf1 mRNA를 주입하는 단계; 및
iii) 배아를 대리모에 이식하는 단계.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 동물은 인간을 제외한 포유 동물인 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 포유 동물은 설치류일 수 있고, 바람직하게는 랫드일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 망막 변성은 망막색소변성, 혈관무늬병증, 드루젠 및 황반 변성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 PDE6B 유전자가 결손된 망막 변성 동물 모델을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 PDE6B 유전자가 결손되는 것은 CRISPR-Cpf1 유전자 가위에 의해 유도되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 동물은 인간을 제외한 포유 동물인 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 포유 동물은 설치류일 수 있고, 바람직하게는 랫드일 수 있다.
아울러, 본 발명은 하기 단계 i) 및 ii)를 포함하는, 망막 변성의 치료제 스크리닝 방법을 제공한다:
i) 본 발명의 망막 변성 동물 모델에 피검 화합물을 처리하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 처리된 동물 모델을 무처리 대조군과 비교하여 망막 변성 증상의 개선 여부를 확인하는 단계.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 단계 ii)의 망막 변성 증상의 개선은, 망막 혈관 형태의 개선, 망막 단층 두께의 증가, 망막 전위도의 증가 및 망막 조직 내 세포수 증가로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 망막 변성은 망막색소변성, 혈관무늬병증, 드루젠 및 황반 변성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
이에, 본 발명은 PDE6B 유전자가 결핍된, 망막 변성 동물 모델 및 이의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 따른 망막 변성 동물 모델은 유전자 가위를 사용해 특이적으로 표적하는 유전자만이 제거될 수 있으므로 돌연변이 생성이 안정적으로 나타날 수 있다. 또한, 후천적인 요인이 아닌 배아 단계에서 유전자 조작을 통해 선천적인 동물 모델을 제조할 수 있어, 다른 요인에 영향을 받지 않고 균일하게 해당 질병의 증상을 나타내는 동물 모델을 제조할 수 있다.
도 1은 PDE6B 유전자를 제거하기 위한 CRISPR-Cpf1 유전자 가위의 제조 과정을 나타낸다.
도 2는 PDE6B 유전자 넉아웃을 확인하기 위한 유전자 형질분석용 프라이머의 디자인 및 이를 통한 유전자 형질분석 결과를 나타낸다.
도 3은 PDE6B 유전자가 넉아웃된 랫드에서 해당 유전자의 서열을 분석한 결과를 나타낸다.
도 4는 PDE6B 유전자 결핍 랫드에 대한 안저 촬영 영상이다.
도 5는 PDE6B 유전자 결핍 랫드에 대한 빛 간섭 단층 촬영 영상이다.
도 6은 PDE6B 유전자 결핍 랫드에 대한 망막 전위도 검사 결과이다.
도 7은PDE6B 유전자 결핍 랫드의 안구 조직을 조직화학분석으로 관찰한 결과이다.
이하, 본 발명에서 사용된 용어를 정의한다.
본 발명의 용어, “동물 모델”이란 사람의 질병과 아주 유사한 형태의 질병을 가진 동물을 말한다. 사람의 질병 연구에 있어 질환 모델 동물이 의미를 갖는 것은 사람과 동물들 간의 생리적 또는 유전적인 유사성에 의한다. 질병 연구에 있어 생체의학 질환모델동물은 질병의 다양한 원인과 발병과정 및 진단에 대한 연구용 재료를 제공해주고, 질환 모델 동물의 연구를 통해 질병에 관련된 유전자들을 알아내며, 유전자들 간의 상호작용을 이해할 수 있게 하고, 개발된 신약후보물질의 실제 효능 및 독성 검사를 통해 실용화 가능성의 여부를 판단하는 기초 자료를 얻을 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 PDE6B 유전자 결손을 유도하는 단계를 포함하는, 망막 변성 동물 모델의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된, 망막 변성 동물 모델을 제공한다.
본 발명의 “망막 변성 동물 모델의 제조 방법”에 있어서, 상기 PDE6B 유전자 결손을 유도하는 단계는, 대한민국 공개특허 제 10-2016-0069362호 및 Kim, Yongsub, et al. Nature biotechnology 34.8 (2016): 808에 공지된 방법을 이용하여 제조된 유전자 가위를 사용해 PDE6B 유전자를 제거하는 것이 바람직하다. 보다 구체적으로, 상기 PDE6B 유전자 결손을 유도하는 단계는 하기 단계 i) 내지 iii)의 단계를 통해 수행되는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다:
i) PDE6B 유전자를 인식하는 crRNA 및 Cpf1 mRNA를 생성하는 단계;
ii) 동물 모델 배아 내로 상기 crRNA 및 Cpf1 mRNA를 주입하는 단계; 및
iii) 배아를 대리모에 이식하는 단계.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 유전자 가위를 이용하는 기술은 원하는 DNA 서열을 인식하여, 이를 자름으로써 유전자의 기능을 없애는 넉아웃(knock-out) 연구 수단을 위해 주로 사용되는 기술로서 당업자에 의해 이해될 수 있다. 상기 유전자 가위를 사용하는 기술은 DNA 염기서열에 변이를 도입하여 유전자 코드 자체의 변이를 달성하고자 하는 기술이다. 따라서, DNA 염기 서열에 직접적인 변이를 도입하여 표적 유전자를 넉다운 시키는 것에 비해 보다 민감하고 효과적으로 표적 유전자의 결핍을 유도할 수 있어, 바람직하다.
본 발명의 방법에 있어서, 망막 변성 동물 모델은 인간을 제외한 포유 동물인 것이 바람직하며, 보다 구체적으로 설치류인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 망막 변성 동물 모델이 설치류일 때, 랫드 또는 마우스인 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 망막 변성은 망막색소변성, 혈관무늬병증, 드루젠 및 황반 변성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 망막의 손상 또는 발달 저해로 인해 유발될 수 있는 질병으로서 당업자에 의해 인정되는 범위라면 제한없이 적용할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계 i) 및 ii)를 포함하는, 망막 변성의 치료제 스크리닝 방법을 제공한다:
i) 본 발명의 망막 변성 동물 모델에 피검 화합물을 처리하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 처리된 동물 모델을 무처리 대조군과 비교하여 망막 변성 증상의 개선 여부를 확인하는 단계.
본 발명의 체료제 스크리닝 방법에 있어서, 본 발명의 망막 변성 동물과의 비교 대상으로서, 피검 화합물을 처리하지 않은 무처리 대조군으로 사용할 수 있으며, PDE6B 결핍이 유도되지 않은 정상 대조군 랫드를 함께 대조군으로서 사용할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 단계 ii)의 망막 변성 증상의 개선은, 망막 혈관 형태의 개선, 망막 단층 두께의 증가, 망막 전위도의 증가 및 망막 조직 내 세포수 증가로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 망막 변성은 망막색소변성, 혈관무늬병증, 드루젠 및 황반 변성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 망막의 손상 또는 발달 저해로 인해 유발될 수 있는 질병으로서 당업자에 의해 인정되는 범위라면 제한없이 적용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다
PDE6B 유전자 결손 랫드 제작을 위한 준비
<1-1> PDE6B 유전자에 특이적인 유전자 가위의 제작
PDE6B 유전자가 결손된 동물 모델을 제작하기 위해서, PDE6B 유전자를 특이적으로 제거할 수 있는 유전자 가위를 준비하였다.
구체적으로, 유전자 가위는 AsCpf1을 사용하여 랫드에서 수행할 수 있는 것으로 공지된 결과를 바탕으로 하여 CRISPR-Cpf1 유전자 가위를 제작하였다(비특허문헌 2). 이를 위해, 먼저 벤칭 소프트웨어(Benchling software, benchling.com)를 이용하여 2개의 CRISPR RNA(Pde6b-CR1: 서열번호 1; 및 Pde6b-CR2: 서열번호 2)를 선별하였다(도 1a). 이를 바탕으로 in vitro transcription template(T7-AsPde6b_CR1: 서열번호 3; 및 T7-AsPde6b_CR2: 서열번호 4)를 디자인하고(도 1b), 이에 상보적으로 결합할 수 있는 DNA 올리고머(도 1c: 서열번호 5 내지 서열번호 7)를 주문하여 in vitro transcription에 사용했다. Cpf1 mRNA 및 CRISPR RNA는 기존에 보고된 방법과 동일하게 진행하였다(비특허문헌 2).
<1-2> 유전자형질분석을 위한 프라이머 선별
PDE6B가 넉아웃된 랫드(rat)의 제작을 위해 유전자 형질분석(genotyping)용 프라이머를 선별하였다. 공지된 실험 방법에 따라, 프라이머 서열을 디자인하여이형2중가닥 DNA(heteroduplex DNA)의 PCR 산물을 제작하였다(비특허문헌 3). 프라이머 서열은 도 2a에 나타난 바와 정방향 프라이머 2개(rPde6b_F1: 서열번호 8; rPde6b_F2: 서열번호 9)와 역방향 프라이머 2 개(rPde6b_R1: 서열번호 10; rPde6b_R2: 서열번호 11)를 제작하였다(도 2a). 각각의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 조합하여 PCR을 수행하면, 도 2b에 정리된 바와 같은 산물 크기가 나올 것으로 예상하였다(도 2b). 그런 다음, 도 2c에 정리된 PCR 조건에 따라 터치다운 PCR을 수행하고, 이형2중가닥 DNA의 PCR 산물을 전기영동을 통해 분리하여 변이체 동정 방법을 수행하였다.
그 결과, 도 2d에서 나타난 바와 같이 PCR 산물을 증폭된 것을 확인하였으며, 이를 바탕으로 이후 유전자 형질분석 과정에서는 rPde6b_F1 및 rPde6b_R1 프라이머쌍을 사용하였다.
망막 변성 랫드 모델의 제작
<2-1> 동물 실험 수행 환경
먼저, 본 발명에서 수행한 모든 동물 실험은 한국 식품의약품안전처(MFDS, Ministry of Food and Drug Safety) 가이드라인과 함께 안과 및 시과학 연구회(Association for Research in Vision and Ophthalmology)에서 규정하고 있는 동물 실험과 관련한 지침을 준수하면서 수행되었다. 서울아산병원 아산생명과학연구원(Asan Institute for Life Sciences, Asan Medical Center) IACUC(Institutional Animal Care and Use Committees)이 프로토콜을 검토하고 승인하였다(Permit Number: 2016-13-182). 모든 랫드를 서울아산병원 질환중심동물자원센터의 SPF(specific pathogen-freefacility) 시설에서 유지시켰다.
<2-2> PDE6B 결손 랫드의 생산
PDE6B 유전자가 결손된 랫드 배아를 마이크로주입 방법으로 제작하여, 대리모를 통해 변이체 랫드를 생산하였다.
구체적으로, 돌연변이 랫드를 제조하기 위한 야생형 랫드로, Sprague Dawley (SD) 랫드를 배아 공여자 및 대리모(foster mother)로서 오리엔트바이오 사로부터 구입하였다. 구입한 랫드를 사육 환경에서 적응시킨 후, 5 내지 6 주령의 암컷 랫드에 40 IU 임신말 혈청성 성선 자극 호르몬 (pregnantmare serum gonadotropin, PMSG, Sigma)을 복강 내로 주입하였다. 그런 다음, 48 시간 간격으로 40 IU 인간 융모성 고나도트로핀 (human chorionic gonadotropin,hCG, Sigma)을 주입하여 과배란을 유도하였다. 과배란이 유도된 암컷 랫드를 SD stud 수컷들과 교배시켜, 난관에서 수정된 수정란을 수득하였다. 수득한 수정란(배아)이 전핵(pronuclear) 단계일 때, 상기 실시예 <1-1>에서 준비한 100 ng/㎖ crRNA 및 50 ng/㎖ Cpf1 mRNA를 배아의 세포질 내로 마이크로주입하였다. 마이크로주입된 배아는 가임신된 대리모의 난관 내로 이동시켜 자궁에 착상되도록 유도하였다.
착상된 배아로부터 세포를 수득하고 상기 실시예 <1-2>에서 제조한 프라이머쌍을 이용해 PCR을 수행하여, PDE6B mutant founer의 여부를 확인하였다. 도 3a에서 나타난 바와 같이 #26 및 #33의 PDE6B mutant founder를 수득하였음을 확인하였으며, 이의 서열분석을 통해 각각의 PDE6B mutant founder가 out-of-frame 변이를 가지는 것으로 확인하였다(도 3b). 각각의 변이체 랫드는 야생형 랫드와 교배하여 F1 랫드를 생산하고, 이 중 얻어진 변이체 랫드를 다시 서열분석하여 founder에서 확인된 변이체의 대립형질(allele)이 생식전달(germline transmission)되었음을 확인하였다.
PDE6B 결손 랫드의 망막변성 여부 확인
<3-1> 안저촬영 (Fundus Photograph)
본 발명에서 제작한 PDE6B 결손 랫드를 망막변성의 동물 모델로서 사용할 수 있는지 확인하기 위해, 망막의 전반적인 소견을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <2-2>에서 제조된 PDE6B KO 랫드 암수 각 2 마리를 실험군으로 하여, 생후 1 일 및 생후 8주 째에 안저 촬영을 시행하였다. PDE6B KO 랫드의 안구를 점안 마취제로 마취하고, 5 ㎎/㎖ 트로피카마이드(Tropicamide) 및 5 ㎎/mℓ 페닐프린 HCl(phenylephrine HCL)을 점안하여 동공의 산동을 유도하였다. 안저 촬영 중 각막의 건조를 방지하기 위해 안과용 인공누액 연고를 사용하였다. 망막 촬영은 Micron IV 안저 카메라를 사용하였다(Phoenix Research Labs, Inc., Pleasanton, CA, USA). 촬영한 모든 안저 영상은 Micron IV software(StreamPix; NorPix, Inc. Montreal, Quebec, Canada)를 이용하여 저장하고 데이터 처리하였다. 정상 대조군으로는, 정상 랫드 암수 각 1 마리씩을 대상으로 하여 생후 1 일 및 생후 8 주째에 동일 방법으로 안저 촬영을 수행하였다.
그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 생후 8주령의 PDE6B KO 랫드의 안저 촬영 소견상 시신경을 중심으로 하여 방사형으로 주행하는 망막 혈관의 형태가 정상 대조군에 비해 불규칙한 양상을 나타내는 것으로 확인하였다(도 4).
<3-2> 빛 간섭 단층 촬영
본 발명에서 제작한 PDE6B 결손 랫드를 망막변성의 동물 모델로서 사용할 수 있는지 확인하기 위해, 스펙트럼 빛 간섭 단층 촬영(Spectral-domainoptical coherence tomography, SD-OCT)을 통해 망막의 단층 소견을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <2-2>에서 제조된 PDE6B KO 랫드 암수 각 2 마리를 실험군으로 하여, 생후 1 일, 생후 3 주째 및 생후 8주 째에 빛 간섭 단층 촬영(Phoenix Research Labs)을 수행하였다. 6 번 반복하여 망막 단층을 스캔하고, 그 값을 평균화하여 영상을 획득하였다. 획득된 영상은 tagged image file (.tif) 형식으로 출력하여, 망막의 두께 및 망막색소상피 (retinal pigment epithelium), 망막의 외핵층 (outer nuclear layer), 외망상층 (outer plexiform layer), 내핵층 (inner nuclear layer) 및 내망막층 (inner plexiform layer) 등의 양상을 비교하였다. 정상 대조군으로는, 정상 랫드 암수 각 1 마리씩을 대상으로 하여 생후 1 일, 생후 3 주째 및 생후 8 주째에 동일 방법으로 빛 간섭 단층 촬영을 수행하였다.
그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이 생후 3 주령 PDE6B KO 랫드에서 전반적인 망막 두께의 감소 및 광수용체층(photoreceptor layer) 및 외핵층 (outer nuclear layer)의 소실이 뚜렷한 양상으로 나타남을 확인하였다. 생후 8 주령에서는 외핵층 및 외망상층과 함께, 이들과 인접한 망막색소상피층도 소실된 소견을 보였다.
<3-3> 망막 전위도 검사 (Electroretinogram)
본 발명에서 제작한 PDE6B 결손 랫드를 망막변성의 동물 모델로서 사용할 수 있는지 확인하기 위해, 망막 전위도 검사를 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <2-2>에서 제조된 PDE6B KO 랫드 암수 각 2 마리를 실험군으로 하여, 생후 1 일, 생후 3 주령 및 생후 8 주령의 랫드에 대하여 망막 전위도 검사를 수행하였다. 망막전위도 검사 전 실험군 랫드는 각각 12 시간 이상 암순응을 유도하였고, 조도(λ) 600 nm 미만의 어두운 환경에서 망막 전위도 측정을 준비하였다. 준비 후, 각각의 실험군 랫드에 Zoletil®(Tiletamine 125 mg/ml and Zolazepam 125 mg/ml, Virbac, France)을 0.01 ㎖씩 복강내 주사하여 마취하였다. 또한, 미드린-피 점안제®(phenylephrine hydro-chloride 5 ㎎/mℓ 및 tropicamide 5 ㎎/mℓ, Santen, Japan)를 점안하여 동공을 산동시켰다. 또한, 안구 마취를 위해 Alcaine®(proparacaine hydrochloride0.5 %, Alcon Laboratories Inc.)을 점안하였다. 마취된 랫드는 실험동물용 지지대에 안정적으로 고정시켜, 재현성 높은 전기생리학적 검사를 위한 체위를 유지하였다.
망막전위도 검사는 Ganzfeld ERG system (Phoenix Research Labs)을 이용하여 빛 자극 및 전기 신호 측정을 시행하였다. 망막전위도 신호는 실험동물 쥐 우안을 활용하였으며, 백색 빛의 강도를 높여가면서 순차적으로 전기 신호를 측정하였다. 빛 노출 시간은 10 msec으로 하였고, 각 빛의 강도에서 10 회의 평균값을 이용해서 전기 신호를 기록하였다. 순금으로 제작된 각막 전극을 각막 주변에 위치하였고, 기준 전극과 접지 전극을 두피와 꼬리 피하에 위치 시켰다. 또한, 망막의 간세포 (rod cell)과 추세포 (cone cell) 각각의 기능을 확인하기 위하여, 암순응, 명순응 반응 a, b 파를 확인하였다. 정상 대조군으로는, 정상 랫드 암수 각 1 마리씩을 대상으로 하여 생후 1 일, 생후 3 주째 및 생후 8 주째에 동일 방법으로 망막 전위도 검사를 수행하였다.
그 결과, 도 6에서 나타난 바와 같이 백색 빛을 이용한 전기 생리학적 검사에서 정상 개체에서 확인되는 암순응과 명순의 반응 a, b 파가 8 주령 PDE6b 결손 랫드에서는 확인되지 않고 평탄한 양상을 나타내는 것으로 확인하였다(도 6).
<3-4> 조직화학적 병리소견 확인
본 발명에서 제작한 PDE6B 결손 랫드를 망막변성의 동물 모델로서 사용할 수 있는지 확인하기 위해, 안구 조직을 고정하여 표본을 제작하고 조직화학적인 관찰을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <2-2>에서 제조된 PDE6B KO 랫드 암수 각 2 마리를 실험군으로 하여, 생후 1 일, 생후 3 주령 및 생후 8 주령의 랫드에 대하여 조직화학적 병리 소견을 확인하였다. 실험용 쥐의 복강 내에 Zoletil® 0.01 ㎖ (Tiletamine 125 ㎎/mℓ and Zolazepam 125 ㎎/mℓ, Virbac, France)을 주사하여 마취한 다음, 안구를 적출하여 4% 파라포름알데히드 용액(pH 7.4)에서 고정하였다. 고정된 안구는 시신경을 중심으로 절개하여 파라핀에 포매한 후, 4 ㎛ 두께로 잘라 H&E 염색(hematoxylin-eosin staining)을 수행하여, 조직화학적 표본을 제작하였다. 제작된 조직 표본을 정상 대조군과 비교하여 조직 병리적인 소견을 확인하였다. 정상 대조군으로는, 정상 랫드 암수 각 1 마리씩을 대상으로 하여 생후 1 일, 생후 3 주째 및 생후 8 주째에 동일 방법으로 조직 병리 소견을 내었다.
그 결과, 도 7에서 나타난 바와 같이 PED6B KO 랫드에서 시간의 경과에 따라 망막의 조직화학적인 변화가 나타나는 것으로 확인하였다.
먼저 생후 1 일째의 정상 대조군 및 실험군 간 모두 외핵층 (outer nuclear layer)와 내핵층 (inner nuclear layer)이 구분되지 않고 함께 뭉쳐 있는 양상을 나타내며, 외핵층 두께의 감소 및 소실의 양상이 뚜렷하게 확인되지 않는 것으로 확인하였다(도 7a).
생후 3 주령 랫드의 경우, 정상 대조군에서는 외핵층과 내핵층이 분리되어 발달되는 양상을 나타내었으나, PDE6B KO 실험군에서는 외핵층의 두께가 전반적으로 얇고 세모의 밀도 또한 정상대조군에 비해 높지 않은 것으로 확인하였다(도 7b).
생후 8 주령 랫드의 경우, 정상 대조군에 비해 PDE6B KO 실험군에서 외핵층이 완전히 사라져 망막 두께가 감소된 것으로 확인하였으며, 인접한 내핵층의 핵 형태가 크며 다소 불규칙한 양상을 나타내는 것을 통해 외핵층 및 외망상층이 완전히 소실된 소견을 나타내는 것으로 확인하였다(도 7c).
생후 17 주령까지 시간 경과에 따른 망막의 형태 변화를 비교하였을 때, PDE6B KO 실험군에서 생후 3 주령부터 외핵층의 세포 수 감소 양상을 나타내며, 생후 8 주령에서는 외핵층이 완전히 소실된 것으로 확인하였다. 이후 17 주령까지 유의한 차이 없어 비슷한 양상이 지속되는 것을 확인하여, 본 발명의 PDE6B 결손 랫드를 망막 변성의 동물 모델로서 안정적으로 사용할 수 있는 것으로 확인하였다.
<110> THE ASAN FOUNDATION UNIVERSITY OF ULSAN FOUNDATION FOR INDUSTRY COOPERATION <120> A retinal degenerated animal model by PDE6B gene deletion and the preparation method thereof <130> 1063855 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pde6b-CR1 <400> 1 agggctcagc ttcttctcaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pde6b-CR2 <400> 2 tcatcttctt ggtctgagcc 20 <210> 3 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7-AsPde6b_CR1 <400> 3 gaaattaata cgactcacta tagggtaatt tctactcttg tagatagggc tcagcttctt 60 ctcaa 65 <210> 4 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7-AsPde6b_CR2 <400> 4 gaaattaata cgactcacta tagggtaatt tctactcttg tagattcatc ttcttggtct 60 gagcc 65 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T7 top strand <400> 5 gaaattaata cgactcacta taggg 25 <210> 6 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-T7-AsPde6b_CR1 <400> 6 ttgagaagaa gctgagccct atctacaaga gtagaaatta ccctatagtg agtcgtatta 60 atttc 65 <210> 7 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-T7-AsPde6b_CR2 <400> 7 ggctcagacc aagaagatga atctacaaga gtagaaatta ccctatagtg agtcgtatta 60 atttc 65 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rPde6b_F1 <400> 8 cagtgaggaa caagtacgca g 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rPde6b_F2 <400> 9 atgggaaccc cacctttgcc 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rPde6b_R1 <400> 10 ctacacggta gccggagatc a 21 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rPde6b_R2 <400> 11 atgcagaaca ctactctaca cgg 23

Claims (13)

  1. PDE6B 유전자 결손을 유도하는 단계를 포함하는, 망막 변성 동물 모델의 제조 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 PDE6B 유전자 결손을 유도하는 단계는 하기 단계 i) 내지 iii)의 단계를 통해 수행되는 것을 특징으로 하는, 망막 변성 동물 모델의 제조 방법:
    i) PDE6B 유전자를 인식하는 crRNA 및 Cpf1 mRNA를 생성하는 단계;
    ii) 동물 모델 배아 내로 상기 crRNA 및 Cpf1 mRNA를 주입하는 단계; 및
    iii) 배아를 대리모에 이식하는 단계.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 동물은 인간을 제외한 포유 동물인 것을 특징으로 하는, 망막 변성 동물 모델의 제조 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 포유 동물은 랫드를 포함하는 설치류인 것을 특징으로 하는, 망막 변성 동물 모델의 제조 방법.

  5. 제 1항에 있어서, 상기 망막 변성은 망막색소변성, 혈관무늬병증, 드루젠 및 황반 변성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 망막 변성 동물 모델의 제조 방법.
  6. PDE6B 유전자가 결손된 망막 변성 동물 모델.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 PDE6B 유전자가 결손되는 것은 CRISPR-Cpf1 유전자 가위에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는, 망막 변성 동물 모델.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 동물은 인간을 제외한 포유 동물인 것을 특징으로 하는, 망막 변성 동물 모델.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 포유 동물은 랫드를 포함하는 설치류인 것을 특징으로 하는, 망막 변성 동물 모델.
  10. 제 6항에 있어서, 상기 망막 변성은 망막색소변성, 혈관무늬병증, 드루젠 및 황반 변성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 망막 변성 동물 모델.
  11. i) 제 6항의 망막 변성 동물 모델에 피검 화합물을 처리하는 단계;
    ii) 상기 단계 i)에서 처리된 동물 모델을 무처리 대조군과 비교하여 망막 변성 증상의 개선 여부를 확인하는 단계;를 포함하는, 망막 변성의 치료제 스크리닝 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 단계 ii)의 망막 변성 증상의 개선은, 망막 혈관 형태의 개선, 망막 단층 두께의 증가, 망막 전위도의 증가 및 망막 조직 내 세포수 증가로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 망막 변성의 치료제 스크리닝 방법.
  13. 제 11항에 있어서, 상기 망막 변성은 망막색소변성, 혈관무늬병증, 드루젠 및 황반 변성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 망막 변성의 치료제 스크리닝 방법.
KR1020180057284A 2018-05-18 2018-05-18 Pde6b 유전자가 결손된 망막 변성 동물 모델 및 이의 제조 방법 KR102177174B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180057284A KR102177174B1 (ko) 2018-05-18 2018-05-18 Pde6b 유전자가 결손된 망막 변성 동물 모델 및 이의 제조 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180057284A KR102177174B1 (ko) 2018-05-18 2018-05-18 Pde6b 유전자가 결손된 망막 변성 동물 모델 및 이의 제조 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190132069A true KR20190132069A (ko) 2019-11-27
KR102177174B1 KR102177174B1 (ko) 2020-11-10

Family

ID=68730014

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180057284A KR102177174B1 (ko) 2018-05-18 2018-05-18 Pde6b 유전자가 결손된 망막 변성 동물 모델 및 이의 제조 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102177174B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102634464B1 (ko) 2021-05-25 2024-02-06 재단법인 아산사회복지재단 망막변성증 동물 모델의 제조 방법

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100121710A (ko) * 2009-04-30 2010-11-18 한국과학기술원 Ｐｔｅｎ의 기능 복구 및 ｐｔｅｎ을 투여하는 단계를 포함하는 망막 변성 예방 또는 치료 방법
JP5087011B2 (ja) 2007-01-23 2012-11-28 馨 井上 眼疾患モデル用非ヒト動物
KR20170137354A (ko) * 2016-06-03 2017-12-13 울산대학교 산학협력단 Cpf1 유전자가위를 이용한 유전자 결손 동물모델 및 이의 제조방법
KR20180028996A (ko) 2015-12-08 2018-03-19 기초과학연구원 Cpf1을 포함하는 유전체 교정용 조성물 및 그 용도

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5087011B2 (ja) 2007-01-23 2012-11-28 馨 井上 眼疾患モデル用非ヒト動物
KR20100121710A (ko) * 2009-04-30 2010-11-18 한국과학기술원 Ｐｔｅｎ의 기능 복구 및 ｐｔｅｎ을 투여하는 단계를 포함하는 망막 변성 예방 또는 치료 방법
KR20180028996A (ko) 2015-12-08 2018-03-19 기초과학연구원 Cpf1을 포함하는 유전체 교정용 조성물 및 그 용도
KR20170137354A (ko) * 2016-06-03 2017-12-13 울산대학교 산학협력단 Cpf1 유전자가위를 이용한 유전자 결손 동물모델 및 이의 제조방법
KR101842014B1 (ko) 2016-06-03 2018-03-26 울산대학교 산학협력단 Cpf1 유전자가위를 이용한 유전자 결손 동물모델 및 이의 제조방법

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DiCarlo, James E., et al. Translational vision science & technology 6.3 (2017): 13-13.
Genomics, Vol. 30, No. 1, pp. 1-7(1995) *
Kim, Yongsub, et al. Nature biotechnology 34.8 (2016): 808.
Mol Ther., Vol. 24, No. 8, pp. 1388-1394(2016) *
The Journal of Neuroscience, Vol. 33, No. 33, pp 13475-13483(2013) *
Zhu, Xiaoxiao, et al. Scientific reports 4 (2014): 6420.

Also Published As

Publication number Publication date
KR102177174B1 (ko) 2020-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Graw Cataract mutations and lens development
Sidman et al. Catalog of the Neurological Mutants of the Mouse
Balling et al. Craniofacial abnormalities induced by ectopic expression of the homeobox gene Hox-1.1 in transgenic mice
KR101750893B1 (ko) Zc4h2 유전자를 녹아웃시킨 형질전환 동물모델 및 이의 용도
Marigo et al. Correlation between the clinical phenotype of MYH9-related disease and tissue distribution of class II nonmuscle myosin heavy chains
Hua et al. Partial interchangeability of Fz3 and Fz6 in tissue polarity signaling for epithelial orientation and axon growth and guidance
CN110100788A (zh) 基于基因操作策略构建疾病模型的方法和应用
CN114747542B (zh) Dsc2基因敲除小鼠模型的构建方法和应用
Zaffran et al. Ectopic expression of Hoxb1 induces cardiac and craniofacial malformations
KR102177174B1 (ko) Pde6b 유전자가 결손된 망막 변성 동물 모델 및 이의 제조 방법
DE69929909T2 (de) Methode zur Herstellung von Choroid Plexus immortalisierten Zelllinien
CN113134076A (zh) 一种利用转录因子再生具备功能的视网膜神经节细胞的方法
CN109022485A (zh) 一种视神经萎缩动物模型的构建方法、试剂盒和应用
Liang et al. Exploring RPE as a source of photoreceptors: differentiation and integration of transdifferentiating cells grafted into embryonic chick eyes
US11653636B2 (en) Method of making a rat model of retinal degeneration and rat model made thereby
KR102634464B1 (ko) 망막변성증 동물 모델의 제조 방법
Yu et al. Myelin regulatory factor deficiency is associated with the retinal photoreceptor defects in mice
Meyer et al. Lack of evidence for GWAS signals of exfoliation glaucoma working via monogenic loss-of-function mutation in the nearest gene
KR102690309B1 (ko) 아벨리노 각막이상증 동물 모델 및 이의 제조 방법
Sunny et al. Ovol2 promoter mutations in mice and human illuminate species-specific phenotypic divergence
Kodati et al. Early-Onset Glaucoma in egl1 Mice Homozygous for Pitx2 Mutation. Biomedicines 2022, 10, 516
KR100517831B1 (ko) ＰＳ２ 돌연변이 유전자 및 ＡＰＰｓｗ 유전자를 발현하는 이중 형질전환 치매 마우스
Mehta Novel Newt Proteins Regulate Evolutionarily Conserved Wingless Signaling Pathway to Rescue Drosophila Eye Mutants
Raiders Mechanisms of Glial Pruning
Azrad Leibovitch et al. A novel GCaMP6f-RCS rat model for studying electrical stimulation in the degenerated retina

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant