KR102405411B1 - Ｐｔｅｎ 저해제를 사용한 손상된 신경의 치료 - Google Patents

Ｐｔｅｎ 저해제를 사용한 손상된 신경의 치료 Download PDF

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Abstract

본 출원은 신경 세포를 포스파타제 및 텐신 호모로그(phosphatase and tensin homolog; PTEN) 지질 포스파타제 저해 펩타이드와 접촉시킴으로써, 신경 세포를 성장 또는 증식시키는 방법을 개시한다.

Description

ＰＴＥＮ 저해제를 사용한 손상된 신경의 치료{TREATMENT OF DAMAGED NERVE WITH PTEN INHIBITOR}
본 출원은, 손상된 신경에 또는 손상된 신경 근처의 영역에, 포스파타제 및 텐신 호모로그(phosphatase and tensin homolog; PTEN) 지질 포스파타제 저해 펩타이드를, 신경을 재생시키는 양 또는 신경 퇴행을 약화시키는 양으로 투여함으로써, 신경을 재생시키거나 손상된 신경의 퇴행을 약화시키는 방법에 관한 것이다.
성체 포유류 신경계에서, 손상된 뉴런의 재생은 신경 손상에 대한 치유 반응에서 거의 발생하지 않는다. 성체의 CNS 뉴런이 손상 후 재생에 실패하는 데에는 2가지 주요한 이유가 있다 - 손상 시 분비된 세포외 저해 인자에 의한 재생 저해뿐만 아니라, 노화를 통해 빠르게 저하되는 내재성 축삭(axon) 성장 능력의 상실로 인해, 축삭이 성체의 중추신경계에서 재생되지 못한다[Schwab et al; 1996, Goldberg et al. 2002; Filbin et al. 2006; Fitch et. al 2008]. 그러나, 신경 손상 시 분비되는 세포외 저해 분자의 제거는 생체 내에서 매우 한정된 축삭 재생을 유도할 뿐이다[Yiu et. al 2006; Hellal et al. 2011]. 따라서, 내재성 신경 성장(outgrowth)의 조절에 의해 축삭 재생 과정을 촉진하는 것이 현재, 신경 손상 치료에 대한 치료적 표적의 초점이다.
PTEN(포스파타제 및 텐신 호모로그) 단백질은 이중(dual) 포스파타제이며, 포스파티딜이노시톨3-키나제(PI3K) 신호전달 경로를 음성적으로 조절함으로써 종양 억제자로서 중요한 것으로 여겨진다. PI3K 신호전달 경로는 세포의 증식, 생존 및 분화뿐만 아니라 단백질의 합성, 대사 및 이동(motility)에 중요한 신호전달 경로이다[Zhang et al. 2010]. PTEN은 지질 포스파타제로서, PIP3의 3-위치를 탈인산화시킴으로써 포스파티딜이노시톨(3,4,5) 트리포스페이트(PIP3)의 포스파티딜이노시톨(4,5) 다이포스페이트(PIP2)로의 전환을 촉매하며, 이로써 PI3K 활성을 길항(antagonizing)시킴으로써 PI3K 신호전달 경로를 억제한다[Di Cristofano et. al 2010]. PTEN의 결실 또는 불활성화는 PI3K 활성을 증강시키고, PDK1, Akt, 및 라파마이신의 포유류 표적(mammalian target of rapamycin; mTOR)을 비롯한 PI3K 신호전달 경로의 다운스트림 성분의 활성화를 촉진하여, 종양 형성을 초래한다[Di Cristofano et. al 2010; Stambolic et al. 1998].
PTEN에 의한 PI3K-매개 신호전달의 조절은 또한, 신경계에서 신경 재생 과정과 깊은 관련이 있다. 최근의 연구들은, PTEN 단백질의 저해 또는 PTEN 유전자의 결실이, 손상 시, 성체의 CNS/PNS 신경의 내재성 재생 성장을 용이하게 함을 보여준다[Park et. al 2008; Liu et. al 2010; Sun et. al 2012; Christie et. al 2012]. 예를 들어, Park 등은, 조건부(conditional) 녹아웃 마우스를 사용하여 성체 래트의 망막 신경절 세포(retinal ganglion cell; RGC)에서 PTEN을 결실시키는 것은, PI3K-Akt-mTOR 신호전달 경로를 재활성화시킴으로써, 시신경 손상 후 강력한 축삭 재생을 사실상 촉진함을 확인하였다. mTOR 경로의 또 다른 음성 조절자의 조건부 녹아웃에 의한 mTOR 경로의 재활성화 또한, 축삭 재생을 초래하며, 이는, PI3K-mTOR 신호전달의 촉진이 내재성 축삭 재생 능력을 복구시키는 중요한 인자일 수 있음을 가리킨다. 또한, Liu 등은, 생체 내 CNS 손상 모델에서 PTEN의 조건부 결실이 PI3K 신호전달 경로를 상향조절함으로써, CNS 손상 시, 뉴런의 감소된 mTOR 활성을 사실상 증가시켜, 비-손상된 CST 축삭의 보상적인 발아(sprouting) 및 척수 병변을 지나는 손상된 CST 축삭의 성공적인 재생을 증강시킨다. PNS 손상의 경우, 시험관 내 및 생체 내에서의 PTEN의 저해 또한, 축삭의 성장을 증가시킨다[Christie et. al 2012]. 따라서, PI3K-mTOR 신호전달 경로 촉진용 PTEN 저해제의 개발은 손상된 신경계에서 축삭 재생을 증가시키기 위한 양호한 치료적 표적이다. PTEN 저해제는, CNS 손상 또는 PNS 손상 후 신경 재생용의 다른 효과적인 시약을 함유하는 기존의 세포 치료법 또는 신규 세포 치료법과 조합된 치료 방법에서 사용될 수 있다.
본 연구에서, 본 발명자들은, PI3K 신호전달 경로를 자극함으로써 신경 재생 및/또는 신경 퇴행으로부터 보호하는 데 효과적인 잠재적인 PTEN 저해제를 개발하였다. PTEN을 지질 포스파타제로서 활성화시키기 위해서는, PTEN이 원형질막에 적절한 배향으로 위치해야 한다[Leslie et. al 2008]. 따라서, 본 발명자들은, 잠재적인 PTEN 저해 후보물질을 펩타이드 형태로 설계하기 위해 PTEN 막 위치화의 메커니즘을 조사하였다. 3가지 서로 다른 펩타이드 - TGN-1, TGN-2 및 TGN-3 -를 잠재적인 PTEN 저해제로서 설계 및 합성하였으며, 시험관 내 PTEN 활성 분석법을 이용하여 PTEN 활성에 대한 이들의 저해 활성을 조사하였다. 본 발명자들은 또한, 뉴런 세포주를 사용하여 PI3K 신호전달 경로의 조절에 대한 이들의 효과를 특정하였다. 본 발명자들은, PTEN C-말단 영역에서 인산화 부위를 모방하는 변형된 펩타이드인 TGN-1 펩타이드 및 TGN-2 펩타이드가 시험관 내 PTEN 활성 분석법에서 PTEN 지질 포스파타제 활성을 사실상 감소시켰음을 발견하였다. TGN-1 펩타이드는 또한, PC12 세포에서 Akt 단백질의 활성화 수준을 증강시켰으며, 이는 이들 펩타이드가 PI3K-Akt 신호전달 경로를 상향조절하는 데 효과적임을 가리킨다. 뉴런 세포를 이용한 신경 돌기(neurite) 분석법은, TGN-1 펩타이드 및 TGN-2 펩타이드가 신경 돌기 미세소관 구조를 증강시킴으로써, 신경 돌기 성장을 촉진시켰을 뿐만 아니라 신경 돌기 퇴행을 지연시켰음을 보여주었다. 따라서, TGN 펩타이드는 CNS 손상 후, 신경 재생 치료제로서 유용하다.
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일 측면에서, 본 발명은 하기에 관한 것이다:
일 측면에서, 본 발명은 손상된 신경에 또는 손상된 신경 근처의 영역에, 포스파타제 및 텐신 호모로그(PTEN) 지질 포스파타제 저해 펩타이드를, 신경을 재생시키는 양 또는 신경 퇴행을 약화시키는 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 신경 손상 부위에서 신경을 재생시키거나 신경 퇴행을 약화시키는 방법에 관한 것이다. PTEN 저해제 펩타이드는, 인산화 부위 내의 세린 또는 트레오닌이 인산화되도록 인산화 부위가 변형된, 변형된 PTEN 펩타이드 또는 이의 분절일 수 있다. 인산화된 세린 또는 트레오닌은 위치 Thr-366, Ser-370, Ser-380, Thr-382, Thr-383 또는 Ser-385에 위치할 수 있다. 인산화된 세린 또는 트레오닌은 위치 Ser-370, Ser-380 및/또는 Ser-385에 위치할 수 있다. 인산화된 세린 또는 트레오닌은 위치 Ser-370, Ser-380 및 Ser-385에 위치할 수 있다. 인산화된 세린 또는 트레오닌은 위치 Ser-380 및 Ser-385에 위치할 수 있다. 펩타이드는 인산화 부위 및/또는 PDZ 도메인 결합 모티프(domain binding motif)의 펩타이드의 분절일 수 있다. 펩타이드는 펩타이드 전달 도메인(PTD)을 추가로 포함할 수 있다. 신경 손상은 중추신경계에 존재할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 포스파타제 및 텐신 호모로그(PTEN) 지질 포스파타제 활성을 저해하는 펩타이드에 관한 것이다. PTEN 저해제 펩타이드는, 인산화 부위 내의 세린 또는 트레오닌이 인산화되도록 인산화 부위가 변형된, 변형된 PTEN 펩타이드 또는 이의 분절일 수 있다. 인산화된 세린 또는 트레오닌은 위치 Thr-366, Ser-370, Ser-380, Thr-382, Thr-383 또는 Ser-385에 위치할 수 있다. 인산화된 세린 또는 트레오닌은 위치 Ser-370, Ser-380 및/또는 Ser-385에 위치할 수 있다. 인산화된 세린 또는 트레오닌은 위치 Ser-370, Ser-380 및 Ser-385에 위치할 수 있다. 인산화된 세린 또는 트레오닌은 위치 Ser-380 및 Ser-385에 위치할 수 있다. 펩타이드는 인산화 부위 및/또는 PDZ 도메인 결합 모티프의 펩타이드의 분절일 수 있다. 펩타이드는 펩타이드 전달 도메인(PTD)을 추가로 포함할 수 있다. 신경 손상은 중추신경계에 존재할 수 있다.
보다 다른 측면에서, 본 발명은 신경 세포를 텐신 호모로그(PTEN) 지질 포스파타제 저해 펩타이드와 접촉시키는 단계를 포함하는, 신경 세포를 성장, 증식 또는 활성을 증강시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 이들 및 다른 목적들은 본 발명의 하기 상세한 설명, 본원에 첨부된 참조 도면 및 본원에 첨부된 청구항으로부터 보다 완전히 이해될 것이다.
본 발명은 본원 하기에 주어지는 상세한 설명, 및 예시로써만 주어지므로 본 발명을 제한하는 것이 아닌 첨부된 도면으로부터 보다 완전히 이해될 것이며, 여기서:
도 1A 내지 도 1B는 TGN 펩타이드를 잠재적인 PTEN 저해제로서 설계한 것을 도시한 것이다. A) PTEN C-말단 영역의 다이어그램. PTEN C-말단 영역은 C2 도메인(AA186 ~ 403), 인산화 부위(AA352 ~ 399) 및 PDZ 도메인 결합 모티프(400~403)를 포함한다. 인산화 부위 및 PDZ 도메인 결합 모티프를 함유하는 영역(AA352 ~ 403)을 TGN 펩타이드 설계용 주형으로서 사용하였다. B) TGN 펩타이드의 아미노산 서열. TGN-1, TGN-2 및 TGN-3 펩타이드는, 지시된 잔기가 인산화에 의해 변형된, PTEN 인산화 부위를 모방한다. TGN-4 펩타이드는 TGN-1에 대한 무작위 혼합된(scrambled) 펩타이드이며, TGN-5 펩타이드는 TGN-2에 대한 무작위 혼합된 펩타이드이다.
도 2A 내지 도 2C는 TGN 펩타이드를 이용한 시험관 내 PTEN 활성 분석법을 도시한 것이다. A) 말라카이트 그린(Malachite Green) 분석법 키트를 사용한, 시험관 내 PTEN 활성 분석법의 메커니즘. C8-PIP3를 PTEN 기질로서 사용하였으며, 다른 인지질(DOPC 및 DOPC)과 함께 리포좀으로서 제조하였다. C8-PIP3로부터 PTEN에 의해 생산되는 포스페이트 이온을, 620 nm에서 포스페이트 이온-말라카이트 그린 시약 복합체의 광학 밀도를 모니터링함으로써 측정하였다. B) 시험관 내 PTEN 활성에 대한, TGN 펩타이드의 효과. TGN-1, TGN-2 및 TGN-3 펩타이드를 시험관 내 PTEN 활성 분석법을 통해 이들의 PTEN 저해 효과에 대해 시험하였다. 10 μM의 각각의 펩타이드를 100 ㎕의 반응 부피에서 20 ng의 인간 재조합 PTEN 단백질 및 리포좀으로서 0.1 mM의 C8-PIP3와 함께 인큐베이션하였다. TGN-4 및 TGN-5 펩타이드를 TGN-1 및 TGN-2/3 펩타이드에 대한 서열 특이성을 각각 체크하기 위해 사용하였다. 모든 데이터는 3회 중복 실험의 결과를 나타낸다. C) TGN-1 및 TGN-2 펩타이드에 대한 IC50 곡선. IC50 값을, TGN-1 및 TGN-2 펩타이드를 용량-의존적 방식으로 사용하는 시험관 내 PTEN 활성 분석법을 통해 측정하였으며, Prism 5 소프트웨어를 통해 계산하였다. TGN 펩타이드에 대한 IC50 값은 TGN-1의 경우 19.93 μM, TGN-2의 경우 4.83 μM 및 TGN-3의 경우 87.12 μM이다.
도 3A 내지 도 3C는, TGN-1 펩타이드가 생체 내에서 Akt 활성화 수준을 증가시킴으로써 PI3K-Akt 신호전달을 촉진함을 도시한 것이다. A) TGN-1을 사용하여 PTEN 활성을 차단함으로써 Akt를 활성화시키는 메커니즘. PI3K 신호전달 경로에 TGN-1을 도입하는 것은 PI3K 신호전달을 용이하게 하고, Akt 활성화(인산화) 수준을 촉진한다. B) PC12 세포 용해물을 사용한 웨스턴 블롯 데이터. PC12 세포를 TGN-1 펩타이드(10 μM, 100 μM) 또는 TGN-4 펩타이드(10 μM)로 처리한 다음, 24시간 동안 인큐베이션하였다. 항-포스포 Akt 항체를 사용한 웨스턴 블롯 데이터는, TGN-1이 내인성 Akt 활성화 수준을 용량-의존적인 방식으로 특이적으로 촉진함을 보여주었다. C) PTEN 및 β-액틴의 발현 수준을 또한, 양성 대조군 및 로딩 대조군으로서 모니터링하였다.
도 4A 내지 도 4B는 신경 돌기 퇴행에 대한 신경영양성(neurotrophic) 효과 및 신경보호 효과를 보여주는 TGN-1 및 TGN-2 펩타이드를 도시한 것이다. A) 분화된 PC12 세포를 우선, 노코다졸(Nocodazole)(0.5 μM)로 1시간 동안 처리한 다음, NGF(10 ng/mL) 및 TGN 펩타이드(TGN-1 및 TGN-2, 각각 100 μM)를 함유하는 새로운 배지와 함께 72시간 더 인큐베이션하였다. 상대적인 신경 돌기 안정성을, Image J 소프트웨어를 사용하여, 면역형광 이미지로부터의 그린/레드 형광 신호 강도의 비율로서 계산하였다. 모든 형광 신호 강도를, 그린/레드 비율 계산을 위해 각각의 검체 당 적어도 3회 측정하였으며, 표준화하였다(배지 단독 = 100%). B) 분화된 PC12 세포에서의 신경 돌기 성장의 정량화. PC12 세포를 NGF(50 ng/ml)를 함유하는 분화 배지로 24시간 동안 처리한 다음, TGN 펩타이드(각각 100 μM)와 함께 2일 더 인큐베이션하였다. TGN-4 펩타이드를 TGN-1에 대한 음성 대조군으로서 사용하였다. 신경 돌기 정량화를 3일째에 신경 돌기 정량화 키트(Millipore)를 사용하여 분광광도법에 의해 수행하였으며, 표준화하였다(배지 단독 = 100%).
도 5는 세포막 표면에서 PTEN의 계면적(interfacial) 활성화의 가설적인 모델을 도시한 것이다. PTEN은 현재, 생체 내에서 2가지 형태를 가지는 것으로 간주되며, 이의 지질 포스파타제 활성을 완전히 발현하기 위해 막 위치화에서 위치화하도록 형태 변화를 수행하는 것으로 제안된다. 가용성 형태의 PTEN은 "닫힌" 형태의 불활성화 상태로 있으며, 여기서, PTEN C-말단 영역의 인산화된 부위는 PTEN 활성 부위 및 C2 도메인을 공간적으로 가려서, PTEN과 막의 결합을 예방한다. "인산화 부위" 내의 인산화된 잔기가 탈인산화되는 경우, PTEN은 "닫힌" 형태로부터 "열린" 형태로 이의 형태를 변화시킨다. 이 단계에서, PTEN의 C2 도메인에 위치하는 다수의 막-결합 모티프들은 노출되고, 막과 결합할 준비가 된다. PTEN 활성 부위의 결합 포켓 또한, 막 표면상에 존재하는 PIP3 기질을 접근시키는 데 이용가능하다. PTEN이 이의 지질 포스파타제 활성이 일어나는 데 필요한 적절한 위치에서 세포막 표면 상에 위치된 후, 막 표면상의 PIP2와 N-말단 PIP2 결합 모티프와의 결합뿐만 아니라 부관 단백질(adjutant protein)(NHERF1) 내의 PDZ 도메인으로의 C-말단 PDZ 도메인 결합 모티프의 결합이 일어난다.
본 출원에서, 단수형("a" 및 "an")은 물체의 단수형 및 복수형을 둘 다 지칭하는 데 사용된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 손상된 신경 또는 신경계의 "부근에" 세포를 주사하는 것은, 손상된 부위에서 신경을 재생시키거나 손상된 신경 세포의 퇴행을 예방하는 효과적인 결과에 영향을 줄 정도로 주사 부위와 손상 영역 사이가 충분히 가까운 영역을 의미한다. 따라서, 손상된 신경 또는 손상된 신경 부근에 세포를 주사하는 것은, 손상 부위, 또는 주사된 세포가 효과적인 폴리펩타이드를 발현시키기에 충분할 정도로 가까운 임의의 장소를 포함하며, 폴리펩타이드는 신경 재생 또는 신경 퇴행 예방 결과에 직접 또는 간접적으로 영향을 주게 된다. 말초 신경, 특히 척수 손상 시 말초 신경의 경우, 세포는 손상 부위에서 새어 나오는 경향이 있기 때문에, 주사는 손상 부위의 "업스트림"에서 시행될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "신경 돌기"는 뉴런 세포체로부터 돌출되는 임의의 돌출부를 지칭한다. 이러한 돌출부는 축삭 또는 수상 돌기일 수 있다. 이러한 용어는, 분화가 완료되기 전에는 축삭과 수상 돌기를 구별해서 지칭하기가 어려울 수 있기 때문에, 미성숙 뉴런 또는 발달중의 뉴런, 특히 배양 중의 세포를 말할 때 빈번하게 사용된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "신경 재생"은, 중추신경계(CNS) 또는 말초신경계(PNS)에서의 신경 손상 시, 새로운 신경 세포, 뉴런, 신경교세포(glia), 축삭, 수초 또는 시냅스의 발생을 의미한다. 재생은 PTEN의 저해에 의한 PI3K-mTOR-매개 신호전달의 활성화를 통해 복구된 내재성 신경재생 능력에 의해 유도된다.
본원에 사용되는 바와 같이, 신경 퇴행의 "약화" 또는 "예방"은 중추신경계(CNS) 또는 말초신경계(PNS)에서의 신경 손상 시 유발되는 축삭, 신경교세포 또는 수초 잠행 구조물의 퇴행을 지연시키는 것을 의미한다. "약화" 또는 "예방"은 PI3K-mTOR-매개 신호전달과 밀접하게 관련된 뉴런의 미세소관 구조 안정화에 의해 달성되며, 이는 PTEN 저해에 의해 활성화된다.
포스파타제 및 텐신 호모로그(PTEN)
PTEN 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure 112018072993913-pat00001
PTEN 단백질은 현재, PI3K-Akt-mTOR 신호전달을 촉진함으로써, 감소된 내재성 신경 재생 능력을 복구하여 성체의 CNS에서 손상된 신경을 재생시키기 위한 치료 물질의 개발을 위한 인기있는 표적이 되고 있다[Park et. al 2008; Liu et. al 2010; Sun et. al 2012]. 신규 PTEN 저해제의 개발은 PTEN-활성 조절 분자를 개발하기 위한 양호한 전략인 것으로 여겨진다. 불행하게도, PTEN 단백질의 X-선 결정 구조[Lee et. al 1999]는, PTEN-기질 결합을 직접적으로 차단하는 효과적인 PTEN 저해제를 설계하는 데 중요한 PTEN-기질(PIP3) 결합 상태에 대한 충분한 정보를 제공하기에 충분하지 않다. 다른 예로, PTEN이 이의 활성을 위해 원형질막을 표적화하는 메커니즘은 심도있는 조사중에 있다. PTEN 효소의 기질인 포스파티딜이노시톨(3,4,5) 다이포스페이트(PIP3)가 세포막 지질 이중층에서 발견되는 인지질의 한 요소이긴 하지만, PTEN 단백질은 본래 가용성 단백질로서 생산되며, 이의 지질 포스파타제 활성을 위해 형태 변화를 통해 계면적으로 활성화된 다음, PTEN-막 결합이 적절한 배향으로 이루어져야 한다[Das et. al 2003; Leslie et. al 2008]. PTEN C2 도메인에 위치한 몇몇 하전된 아미노산 및 결합 모티프는 PTEN 단백질을 세포막 표면 상에 부착시키기 위한 주요 고정자(anchor)인 것으로 여겨진다[Lee et. al 1999; Georgescu et. al 2000; Leslie et. al 2008]. 다른 결합 모이어티를 사용하는 부가적인 결합 또한, PTEN의 지질 포스파타제 활성이 발생하도록, PTEN을 세포막 상에 적절하게 배향시키는 데 필요하다[Chambell et. al 2003; Walker et. al 2004; Odriozola et. al 2007].
PTEN C-말단 영역에서 비-구조화된 부분(unstructured part)(AA 352-399)은, 이 영역이 인산화 변형 부위로서 알려진 6개의 세린/트레오닌(Thr-366, Ser-370, Ser-380, Thr-382, Thr-383 및 Ser-385) 잔기를 함유하기 때문에, "인산화 부위"로 지칭된다[Lee et. al 1999; Vazquez et. al 2001]. 이전의 연구들은, 이러한 "인산화 부위" 내의 이들 6개의 잔기의 돌연변이 또는 결실이 종양 억제자 활성을 증가시키며, PTEN 막 친화성을 증강시키고, 단백질 안정성을 감소시킨다고 언급하였다[Vasquez et. al 2001; Das et. al 2003; Okahara et. al 2004; Rahdar et. al 2009].
현재, PTEN 단백질은 2개의 형태 상태를 가진다고 생각된다(도 4). "닫힌" 형태에서, PTEN은, "인산화 부위"를 포함하는 PTEN의 C-말단 영역이 C2 도메인에 위치한 막-결합 모티프뿐만 아니라 PTEN 활성 부위 포켓을 가려서, PTEN과 세포막과의 결합 및 활성 부위로의 PIP3의 접근을 방지하기 때문에, 불활성이다. 반면, PTEN은 "열린" 형태 상태에서 계면적으로 활성으로 되며, 여기서, PTEN 활성 부위 포켓 및 C2 도메인은 둘 다 가려지지 않고 세포막 및 이의 기질인 PIP3에 완전히 노출된다. 또한, "인산화 부위" 내 이들 6개의 세린/트레오닌 잔기의 인산화 상태는, "닫힌" 형태로부터 "열린" 형태로의 PTEN 단백질의 형태 변화를 직접 조절하기 때문에, PTEN 계면적 활성화에 중요한 인자인 것으로 생각된다[Das et. al 2003, Vasquez et. al 2006; Odriozola et. al 2007, Rahdar et. al 2009].
현재 제시된 모델(도 5)에 따르면, 막 표면에서 PTEN의 계면적 활성화에 필요한 3개의 단계가 있다.
1) "인산화 부위" 내 인산화된 세린/트레오닌 잔기의 탈인산화는 PTEN의 형태를 "닫힌" 형태에서 "열린" 형태로 변화되도록 유발하며, 이러한 형태 변화는 PTEN 단백질을 세포막과 결합시키고, PTEN 활성 부위 포켓을 세포막 상에 위치한 PIP3 기질에 노출시킬 수 있다.
2) 그런 다음, C2 도메인 내의 다수의 막-결합 모티프들은 세포막과 상호작용하여, PTEN 단백질을 막 표면 상에 고정시킨다.
3) N-말단의 PIP2 결합 부위(AA6-15)와 세포막에서의 PIP2 분자 간의 부가적인 상호작용[Walker et. al 2004]뿐만 아니라 C-말단의 PDZ 도메인 결합 부위(AA400-403)와 부관 NHERF1 단백질의 PDZ 도메인과의 결합[Takahashi et. al 2006; Molina et. al 2010] 둘 다가 또한, 세포막 표면상에서 PTEN의 배향을 조정하는 데 필요하다.
본 발명자들은, 도 4에 도시된 PTEN 막 위치화 모델, 특히 "인산화 부위" 및 PDZ 도메인-결합 부위(AA 352-403)를 토대로, 본 발명자들의 TGN 펩타이드를 잠재적인 PTEN 저해제로서 설계하였다. 잠재적인 PTEN 저해제로서의 TGN 펩타이드의 기본적인 개념은 막 결합에 필요한 PTEN 활성 부위 및 C2 도메인을 가림으로써, PTEN과 세포막 표면 간의 결합을 방지하는 것이다. Ser370 및 Ser385가 카제인 키나제 II를 통해 바람직하게 인산화되기 때문에[Miller et. al 2002], 막 위치화뿐만 아니라 포스파타제 활성은 다른 잔기가 돌연변이 될 때보다 더 증가된다[Odriozola et. al 2007]. 따라서, 이들 2개 중 적어도 하나의 세린 잔기는 모든 TGN 펩타이드에 포함되었다(TGN-1에 Ser370/385, TGN-2/TGN-3에 Ser385). 또한, 380 위치 및 385 위치에서의 인산화된 세린 잔기는 현재, 실제 기질인 PIP3에 접근하지 못하도록 PTEN 활성 부위 내의 촉매적 포켓을 가리는 "슈도-기질(pseudo-substrate)"의 부분인 것으로 생각된다[Odriozola et. al 2007]. 모든 TGN 펩타이드에 이들 2개의 세린 잔기(Ser 380 및 Ser 385)를 포함하도록 펩타이드를 설계하였다.
TGN-1 펩타이드 서열은 PTEN 인산화 부위의 AA 365~388 영역을 모방하고, 4개의 세린/트레오닌 잔기(Thr366, Ser370, Ser380 및 Ser385)를 함유하며, 3개는 인산화된 변형된 잔기(Ser370, Ser380 및 Ser385)이다. TGN-2 및 TGN-3 펩타이드는 2개의 인산화된 세린 잔기(Ser380 및 Ser385)뿐만 아니라 C-말단의 PDZ 도메인-결합 모티프(ITKV)를 포함하는, PTEN 단백질의 AA376-403 영역을 모방한다. 트레오닌 잔기의 인산화는 생체 내에서 이차 변형을 유도하며 돌연변이화되는 경우 PTEN-막 결합 친화성을 변경하는 데 덜 효과적이기 때문에, 생체 내에서 PTEN의 인산화 부위를 모방하기 위해 TGN-1 및 TGN-2 펩타이드 둘 다에서 세린 잔기만 인산화되었다[Odriozola et. al 2007; Rahdar et. al 2009]. 비교를 위해, TGN-3 펩타이드에서, 2개의 세린 잔기(Ser380 및 Ser385)를 발린으로 치환하였다. 부가적으로, TGN-1 및 TGN-2/3 펩타이드의 서열을 무작위 혼합하여, 서열 특이성을 시험하였으며, 이들 펩타이드를 각각 TGN-4 및 TGN-5 펩타이드로 지정하였다.
재조합 인간 PTEN 단백질 및 기질로서 C8-PIP3를 사용하는 시험관 내 활성 분석법 및 IC50 분석법은, TGN-1 및 TGN-2 펩타이드가 시험관 내에서 PTEN 활성을 용량-의존적인 방식으로 특이적으로 저해함을 보여주었다(도 2). C8-PIP3를 PTEN 단백질에, 합성된 지질 소낭 - 세포막 지질 이중층의 모방 시스템-으로서 다른 인지질 분자(DOPC/DOPS)와 함께 도입하였다. 활성 분석법의 결과는, TGN-1 및 TGN-2 펩타이드가 PTEN 단백질과 직접 상호작용하고 PTEN-소낭 막 결합을 방해하여, 기질(C8-PIP3)이 PTEN 활성 부위에 결합하는 것을 방지함으로써, 시험관 내에서 PTEN 활성을 저해할 수 있음을 내포하였다. 사실상, 리포좀 형태 대신 C-8 PIP3 지질만 직접 첨가하는 시험관 내 PTEN 활성 분석법은 PTEN 활성을 나타내는 데 실패한다(데이터는 도시되지 않음). TGN-2 펩타이드와 비교하여 TGN-3 펩타이드에 의한 크게 감소된 저해 효과는, 세린 잔기(Ser380 및 Ser385) 상에서의 인산화 변형이 TGN-펩타이드에 의한 시험관 내 PTEN 저해에 중요한 인자임을 제시한다. 또한, TGN-2 펩타이드는 시험관 내 PTEN 활성에 대해, TGN-1 펩타이드보다 거의 4-배 더 높은 저해 효과를 나타내었다(TGN-1에 대한 IC50 값은 19.93 μM이고, TGN-2에 대한 IC50 값은 4.83 μM임). TGN-1 펩타이드와 TGN-2 펩타이드 간의 주요한 구조 차이는, TGN-2 펩타이드는 PDZ 도메인 결합 모티프(AA 399 ~ 403)를 비롯하여 PTEN C-말단 영역의 마지막 15개의 아미노산 서열(AA389 ~ 403)을 함유하는 것이다. 활성 분석법을 시험관 내 조건에서 수행하였기 때문에, TGN-2 펩타이드에 존재하는 마지막 15개의 아미노산 서열은 PTEN 단백질에 대해 더 높은 결합 친화성을 가져서, TGN-1 펩타이드보다 PTEN-소낭 막 결합을 더욱 효율적으로 방해하거나, PTEN 활성 부위에서 기질 결합 포켓을 더욱 효과적으로 가리는 것으로 설명될 수 있다.
TGN-1 펩타이드는 또한, 뉴런 세포에서 PI3K-Akt 신호전달 경로를 조절하기 위해, PTEN 활성을 차단하는 데 효과적이다(도 3). 내인성 PTEN 또는 과발현된 PTEN을 함유하는 PC12 세포를 TGN-1과 함께 24시간 동안 인큐베이션하고, Akt 단백질의 활성화(인산화) 수준을 항-포스포 Akt 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅에 의해 시험하였다. TGN-1 펩타이드로 처리한 세포 용해물에서 Akt 단백질의 인산화 수준은 TGN-4 펩타이드 또는 DMSO로 처리한 용해물보다 훨씬 더 높았으며, 이는, TGN-1 펩타이드가, PTEN을 특이적으로 저해하여 PI3K 활성을 길항시킴을 가리킨다. 따라서, TGN-1 펩타이드는 PTEN 활성을 억제함으로써, PI3K-Akt 신호전달 경로를 촉진하는 데 효과적이다.
미세소관 안정화는 축삭의 재생 능력 및 뉴런의 극성화(neuronal polarization)를 촉진함으로써, 척수 손상을 치료하는 데 중요한 것으로 생각되기 때문에[Sengottuvel et al 2011, Hellal et al 2011, Witte et al 2008], 본 발명자들은 분화된 뉴런 세포에서 신경 돌기의 퇴행을 유도하기 위해 노코다졸을 이용하였으며, TGN 펩타이드가 미세소관 안정화를 통해 신경보호 효과를 나타내는지 시험하였다. 미세소관 안정성은 α-튜불린의 아세틸화 수준과 밀접한 관련이 있으므로[Takemura et al 1992], 본 발명자들은 안정한 신경 돌기를 항-아세틸화된 α-튜불린 항체를 사용하여 면역염색하였다. 면역형광 데이터(도 4A)는, TGN-1 및 TGN-2 펩타이드가 실제로 신경 돌기 미세소관 구조를 안정화시켜, 신경 돌기 퇴행을 지연시켰음을 입증하였다. 더욱이, TGN-1 펩타이드의 첨가는 뉴런 세포 분화 과정에 있어서 신경 돌기 성장을 특이적으로 촉진한다(도 4B). 따라서, TGN-1 및 TGN-2 펩타이드는 신경영양성 효과뿐만 아니라 신경 돌기 퇴행에 대한 신경보호를 나타낸다.
이전의 연구에서, Odriozola 등은, TGN-1 펩타이드 서열과 유사하며 PTEN C-말단 인산화 부위 클러스터(AA368 ~ 390)를 포함하는 합성된 포스포미믹(phosphomimic) 펩타이드(Cp-23, Cp-23DE)가 시험관 내에서 PTEN 촉매 활성의 억제를 매개함을 보고하였다. 또한, GFP-융합된 포스포미믹 펩타이드로 형질감염시킨 293T 세포를 이용한 분석법은 PTEN-막 결합의 수준을 감소시키고 포스포-Akt 수준을 향상시키는 것으로 나타났다. 그러나, Odriozola 등에서 사용된 포스포미믹 펩타이드(Cp-23, Cp-23DE)는 PTEN "인산화 부위"의 AA 368~390 영역만 모방할 뿐이며, 본 발명의 TGN 펩타이드에서와 같이 인산화된 세린 잔기를 함유하지 않는다. 사실상, Odriozola 펩타이드(Cp23) 및 TGN-1 펩타이드가 거의 동일한 아미노산 서열을 공유하긴 하지만, 시험관 내 IC50 값을 비교하면(TGN-1에 대한 IC50 값은 19.93 μM이고, Cp23에 대한 IC50 값은 약 1033 μM임), TGN-1 펩타이드의 저해 능력이 Odriozola 펩타이드(Cp23)보다 거의 50배 이상 더 높다. 더욱이, Odriozola 펩타이드(Cp23, 1033 μM)와 이의 무작위 혼합된 펩타이드(Cp23-Der, 945 μM) 사이에 IC50 값의 차이가 거의 없었다. 그러나, TGN-1 펩타이드는 이의 무작위 혼합된 펩타이드 TGN-4보다 훨씬 더 높은 저해 효과를 나타내었으며(도 2B), 이는, Odriozola 펩타이드(Cp23)가 실패하였을 때, TGN-1 펩타이드가 시험관 내 PTEN 활성에 대해 서열-특이적인 저해 효과를 나타냄을 가리킨다. 부가적으로, TGN-2 펩타이드는 PDZ 도메인-결합 모티프를 비롯하여 부가적인 15개의 아미노산 잔기를 함유함으로써 Odriozola 펩타이드(Cp23)와 상이하며, 이는 이미 PTEN 저해에 효과적인 것으로 나타나 있다(TGN-2에 대한 IC50 값은 4.93 μM임). 또한, TGN-1 및 TGN-2 펩타이드는 이들의 N-말단에 PTD(펩타이드 전달 도메인) 서열을 포함하므로, 이들 펩타이드가 세포 내에 직접 도입될 수 있는 반면, Odriozola 펩타이드는 GFP와 융합된 다음 세포 내로 형질감염될 필요가 있다. 따라서, TGN-1 및 TGN-2 펩타이드는 시험관 내 및 생체 내에서 효과적인 PTEN 저해 능력을 가진다.
본 발명자들은, "인산화 부위"를 포함하는 PTEN C-말단 영역을 모방함으로써 펩타이드를 개발하였다. TGN-1 및 TGN-2는 시험관 내에서 PTEN 활성에 대해 특이적이며 효과적인 저해 효과를 나타내었으며, 뉴런 세포에서 PTEN 활성을 차단함으로써 PI3K-Akt 신호전달 경로를 상향조절하였다. PTEN의 억제에 의해 PI3K-Akt-mTOR 신호전달을 용이하게 하는 것은 CNS 손상 시 신경 재생에 효과적인 것으로 알려져 있기 때문에[Saijilafu et al 2013], 본 발명의 펩타이드는 CNS 손상에 대한 치유제 또는 치료제로서 유용하다. 분화된 뉴런 세포를 TGN 펩타이드와 함께 사용하는 신경 돌기 분석법은, TGN-1 및 TGN-2 펩타이드가 명백하게도 신경영양성 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 신경 돌기 미세소관 구조를 증강시킴으로써 퇴행된 신경 돌기에 대해 신경보호 효과를 보여줌을 입증하였다. 따라서, 이들 펩타이드는 CNS 손상을 비롯한 신경 손상 후, 신경을 재생시킬 뿐만 아니라 신경퇴행 과정을 지연시키기 위한 치료제이다.
펩타이드 설계
본원에서 "TGN 펩타이드", PTEN 저해제로도 지칭되는 본 발명의 펩타이드를, PTEN C-말단 영역(아미노산 잔기 352 ~ 403)을 주형으로서 사용하여 설계하였다.
모든 TGN 펩타이드들은, 막 투과성을 증가시키기 위해 N-말단에 RRRRRRRR(SEQ ID NO:2)을 포함할 수 있는 PTD(펩타이드 전달 도메인) 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
TGN 펩타이드는, SEQ ID NO:1의 PTEN 아미노산 서열의 아미노산 잔기 352 ~ 403 내의 PTEN의 임의의 분절, 또는 이의 서열의 부분으로서 SEQ ID NO:1의 PTEN 아미노산 서열의 아미노산 잔기 352 ~ 403의 일부를 포함하는 PTEN의 분절일 수 있다. 바람직하게는, TGN 펩타이드는 이러한 펩타이드 분절에 존재하는 세린 또는 트레오닌의 인산화를 포함한다. 바람직하게는, 세린 또는 트레오닌 부위는 SEQ ID NO:1의 PTEN 단백질의 366, 370, 380, 382, 383 또는 385이다.
TGN 펩타이드는 적어도 10개의 아미노산 잔기, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 35개 또는 적어도 40개의 아미노산 잔기 길이일 수 있다. 세린 잔기, 트레오닌 잔기 또는 이들의 조합 중 적어도 하나의 인산화가 펩타이드 내에 포함되는 것이 바람직하다.
일 측면에서, TGN 펩타이드는 이의 펩타이드 길이에 의해 제한되지 않음을 인지해야 한다. 펩타이드 잔기의 적어도 일부가 아미노산 잔기 352 내지 403 내에 존재하는 것이 바람직하다.
이에 대하여, 예시화된 TGN-1 펩타이드는 3개의 인산화된 세린 잔기를 포함하여 24개의 아미노산 VTPDVpSDNEPDHYRYpSDTTDpSDPE(SEQ ID NO:3, pS = 인산화된 세린)를 가진다. PTD가 N-말단에 부착되는 경우, RRRRRRRR-VTPDVpSDNEPDHYRYpSDTTDpSDPE-아미드(SEQ ID NO:4)가 32개의 아미노산 잔기를 가지는 것으로 보인다.
또 다른 예시화된 펩타이드는 TGN-2 펩타이드이며, 이는 2개의 인산화된 세린 잔기를 포함하여 28개의 아미노산 HYRYpSDTTDpSDPENEPFDEDQHTQITKV(SEQ ID NO:5)를 가진다. PTD가 N-말단에 부착되는 경우, RRRRRRRR-HYRYpSDTTDpSDPENEPFDEDQHTQITKV-아미드(SEQ ID NO:6)는 36개의 아미노산 잔기를 가지는 것으로 보인다.
TGN-3 펩타이드는 TGN-2 펩타이드와 동일한 아미노산 서열을 가지지만, 어떠한 잔기도 변형되어 있지 않으며 2개의 세린 잔기는 발린으로 치환된, HYRYVDTTDVDPENEPFDEDQHTQITKV(SEQ ID NO:7)이다. PTD가 N-말단에 부착되는 경우, RRRRRRRR-HYRYVDTTDVDPENEPFDEDQHTQITKV-아미드(SEQ ID NO:8)가 나타난다.
TGN-4 펩타이드를 TGN-1 펩타이드의 무작위 혼합된 펩타이드 SDDEYTDNPDSRYVSDTPVDTEH(SEQ ID NO:9)로서 설계하였다. PTD가 N-말단에 부착되는 경우, RRRRRRRR-SDDEYTDNPDSRYVSDTPVDTEH-아미드(SEQ ID NO:10)가 나타난다. 또한, TGN-5 펩타이드를 TGN-2/TGN-3 무작위 혼합된 펩타이드에 대해 DEHDTEYTPDYRQETHFNSQPTDKSDVI(SEQ ID NO:11)로 설계하였다. PTD가 N-말단에 부착되는 경우, RRRRRRRR-DEHDTEYTPDYRQETHFNSQPTDKSDVI-아미드(SEQ ID NO:12)가 나타난다.
화학적으로 변형된 펩타이드
폴리펩타이드 치료제는 짧은 순환 반감기, 단백용해성 분해 및 낮은 용해성때문에 문제가 될 수 있다. 본 발명의 생물약제의 약물동력학 및 약력학 특성을 향상시키기 위해, 아미노산 서열의 조작과 같은 방법들이 수행되어 면역원성을 감소 또는 증가시키고 단백용해성 절단을 감소시킬 수 있으며; 면역글로불린 및 알부민과 같은 혈청 단백질로의 펩타이드의 융합 또는 접합(conjugation)이 수행될 수 있으며; 본 발명의 펩타이드 및 항체와 같은 생물약제의 보호 및 느린 방출을 위한 약물 전달 비히클 내로의 혼입 또한 수행될 수 있고; 천연 중합체 또는 합성 중합체로의 접합 또한 고려된다. 특히, 합성 중합체 접합, 폴리에틸렌글리콜화(pegylation) 또는 아실화, 예컨대 N-아실화, S-아실화, 아미드화 등도 고려된다.
신경 조직
신경 조직은 척색(notochord)의 영향하에 배아의 외배엽으로부터 유래된다. 외배엽은 두꺼워진 신경판을 형성하도록 유도되며, 그런 다음, 이 신경판은 분화하고, 결국에는 말단들이 융합되어, 신경관(neural tube)을 형성하며, 이 신경관으로부터 모든 중추신경계가 유래된다. 중추신경계는 뇌, 뇌신경 및 척수로 이루어진다. 말초신경계는 신경구(neural groove) 옆의 신경릉(neural crest)이라고 하는 세포로부터 유래된다.
신경 조직은 복잡한 통합된 소통 네트워크(complex integrated communications network)에서 신체에 전반적으로 분포된다. 신경 세포(뉴런)는 매우 간단한 회로 내지 매우 복잡한 고차원의 회로 범위의 회로에서 다른 뉴런들과 소통한다. 뉴런은 실제적인 메세지 전달 및 통합을 수행하는 한편, 신경교세포라고 하는 신경 조직 세포는 뉴런의 지지, 보호, 방어 및 영양공급에 의해 뉴런을 돕는다. 뇌에는 뉴런보다 약 10배 더 많은 신경교세포들이 존재한다. 신경교세포는 뉴런의 기능에 필요한 미세환경을 형성하며, 종종 이들은 신경 처리 및 활성에 일조한다. 뉴런은 흥분성(excitable) 세포이다. 이는, 적절하게 자극되는 경우, 활동 전위가 개시될 수 있으며, 이러한 활동 전위는 세포막에 걸쳐 전파되어, 원거리의 세포에 정보를 전달할 수 있음을 의미한다. 뉴런은 자극의 수용, 전달 및 처리에 관여하는 독립적인 기능성 단위이다.
일반적으로, 뉴런은 3 부분으로 이루어진다; 핵 및 세포 소기관이 위치하는 세포체; 환경 또는 다른 뉴런으로부터 자극을 수용하는 세포체로부터 연장되는 돌기인 수상 돌기; 및 신경 자극을 다른 세포로 전달하기 위해 세포체로부터 연장되는 하나의 긴 돌기인 신경 축삭. 축삭은 통상적으로 이의 원거리 말단에서 분지화되며, 또 다른 세포 상에서 종결되는 각각의 분지는 구형(bulbous) 말단을 가진다. 신경 종말구(end bulb)와 인접한 세포와의 상호작용은 시냅스라고 하는 구조를 형성한다. 시냅스는 신호를 수용하고 이를 전기적 전위(electrical potential)로 변환하도록 특수화된다.
인간의 신체에서 발견되는 대부분의 뉴런은 다극성이며, 이는 이들이 2개 초과의 세포 돌기들을 가지고 있으며, 이 중 하나만 축삭이고 나머지 돌기들은 수상 돌기임을 의미한다. 망막 또는 후각 점막의 양극성 뉴런은 세포체로부터 나오는 하나의 수상 돌기 및 하나의 축삭을 가진다. 척수 신경절 세포에서 발견되는 가단극(pseudounipolar) 뉴런은 수상 돌기에 의해 취해지는 감각 자극을 세포체를 통과하지 않고 축삭으로 바로 보낼 수 있다. 뉴런은 또한, 기능에 따라 분류될 수 있다. 감각 뉴런은 감각 자극의 수용 및 전달에 관여한다. 운동 뉴런은 자극을 보내 근육 및 분비샘을 조절한다. 다른 뉴런인 개재 뉴런(interneuron)은 기능적 네트워크의 일부인 뉴런들 사이에서 중재자로서 작용한다.
시냅스는 세포의 신호를 전파하는 특수화된 기능성 세포 접합부이다. 대부분의 시냅스는 화학적 시냅스이며, 여기서, 시냅스전(presynaptic) 말단의 소낭은 화학적 메신저를 함유하며, 이 메신저는 시냅스전 막이 자극받을 때 시냅스틈(synaptic cleft)으로 방출된다. 화학적 메신저는 시냅스틈을 가로질러 확산되어, 시냅스후(postsynaptic) 막에 있는 수용체에 결합한다. 이는 세포 작용에 영향을 미치는 시냅스후 막의 극성화 상태에 변화를 유도한다. 특수한 유형의 시냅스는 신경근 접합부(neuromuscular junction)이다. 35가지가 넘는 신경전달물질(neurotransmitter)이 알려져 있으며, 대부분은 소분자(산화질소, 아세틸콜린), 카테콜아민(노르에피네프린, 세로토닌) 또는 신경활성 펩타이드(엔돌핀, 바소프레신)이다. 일단 사용되고 나면, 신경전달물질은 효소적 분해, 확산 또는 엔도사이토시스(endocytosis)에 의해 시냅스전 세포로 빠르게 제거된다.
일부 뉴런은 수초라고 하는 절연 물질로 싸여 있다. 이러한 지질이 풍부한 물질은 신경교세포에 의해 형성되며: 말초신경계에서는 슈반 세포(Schwann cell)이고 중추신경계에서는 희소돌기세포(oligodendrocyte)이다. 절연은, 탈분극되어야 하는 막 표면적을 감소시킴으로써 신경 전도를 더 빠르게 할 수 있다. 수초화(myelinated) 뉴런에서, 신경 자극은 축삭의 길이에 걸쳐 하나의 비-수초화(unmyelinated) 단편으로부터 다른 비-수초화 단편으로 점프한다. 이는 수초이며, 조직 내에 뉴런 세포체가 없어서, 일부 신경 조직으로 하여금 큰 말초 신경 및 뇌의 백색질에서와 같이 백색으로 보이게 한다. 성상세포(astrocyte)라고 하는 다 경교세포는 구조적 온건성, 뉴런의 영양공급, 및 신경 조직의 미세환경을 유지하는 데 관여한다. 성상세포는 간극 연접을 통해 직접 서로 소통하며, 국소 환경의 조절에 의해 이들의 케어에서 뉴런의 생존에 영향을 미칠 수 있다. 뇌실막 세포(ependymal cell)는 척수 및 뇌의 뇌실을 따라 존재하며, 뇌척수액을 분비한다. 소교세포(microglia)라고 하는 다른 작은 신경교세포는 성인의 중추신경계에서 염증 및 복구에 관여하는 식세포이다.
신경 조직은 전기적 자극을 수용 및 전달할 수 있는 흥분성 조직이다. 중심 세포의 유형은 뉴런이라고 한다. 뉴런은 통상 세포체, 입력(input)을 수용하는 수상 돌기, 및 전기적 전위를 전달하는 축삭을 가진다.
뉴런은 감각 뉴런, 운동 뉴런, 분비 뉴런 또는 연합 뉴런으로서 분류될 수 있다. 이들은 종종, 전도 속도, 직경, 및 수초라고 하는 특수화된 지질단백질 절연물질의 존재 또는 부재에 의해 분류된다. A형 섬유는 수초화되고, 자극을 12 m/sec 내지 120 m/sec로 전도할 수 있다. B형 섬유 또한 수초화 섬유이지만, 이들은 자극을 3 m/sec 내지 5 m/sec로 전도할 뿐이다. C형 섬유는 비-수초화되며, 직경이 작고, 매우 느리다(2.5 m/sec). A형 섬유의 일례는 비복근(gastrocnemius)을 신경지배(innervation)하는 운동 뉴런이다. 자율신경계의 신경절전 원심성 뉴런은 B형 섬유의 일례이고, 확산성 통증(diffuse pain)에 대한 정보를 전달하는 감각 뉴런은 느린 C형 섬유의 일례이다.
감각 뉴런은 환경으로부터 특정한 유형의 정보를 탐지하도록 되어 있다. 이들은 압력 또는 신장(stretch)과 같은 것들을 감지하는 기계 수용기(mechanoreceptor), 열 수용기, 망막의 광 수용기, 및 미뢰 또는 후각의 그러한 것들과 같은 화학 수용기를 포함한다. 연합 뉴런 또는 개재 뉴런은 통상 척수 및 뇌에서 발견되며, 여기서 이들은 구심성 감각 뉴런을 원심성 운동 뉴런 또는 원심성 분비 뉴런에 연결한다.
뉴런은 시냅스라고 하는 구조를 통해 서로 소통한다. 축삭은 작은 소낭들을 많이 함유하는 하나 이상의 종말 단추(terminal button)에서 종결된다. 이들 작은 소낭은 신경전달물질이라고 하는 화학적 성분으로 충전된다. 아세틸콜린이 시냅스에서 가장 자주 있는 신경전달물질이긴 하지만, 뉴런에 따라 노르에피네프린, 세로토닌 및 GABA와 같은 다른 화학물질들도 사용될 수 있다. 자극은 축삭 쪽으로 하향 이동하고 종말 단추에 도달하는 경우, 소낭은 뉴런의 막과 융합하고, 신경전달물질이 방출된다. 그런 다음, 화학물질은 좁은 시냅스틈을 가로질러, 수용기 뉴런의 시냅스후 막 상의 화학물질에 대한 특이적인 수용체로 확산된다.
신경전달물질과 수용체와의 상호작용은 막 전위를 변화시켜, 새로운 자극을 시냅스후 뉴런에 유도할 수 있다. 아세틸콜린에스터라제 효소는 시냅스에 존재하여, 아세틸콜린을 분해하고, 자극을 종료한다. 다른 신경전달물질들은 분해되거나 또는 시냅스전 뉴런으로 다시 되돌아가, 자극을 종료한다.
중추신경계에서, 많은 뉴런들이 단일 뉴런 상에 수렴될 수 있다. 각각의 시냅스전 뉴런이 시냅스후 뉴런과의 시냅스 내로 신경전달물질을 방출하는 경우, 국소적인 막 전위가 발생되고, 통합 및 합해진다. 이들 입력 신호(incoming signal)는 저해성이거나 자극성일 수 있다. 생성되는 합해진(summed) 막 전위가 해당 뉴런에 대한 최소 역치에 도달하게 되면, 활동 전위가 개시될 것이다.
활동 전위는 도약 전도에 의해 세포체로부터 한 방향으로 멀리 운동한다. 가장 빠른 뉴런은, 랑비에르 결절(nodes of Ranvier)이라고 하는 벗겨진(naked) 뉴런의 막의 결절에 의해 분리된 개별 단편들에 배열되는 수초로 덮여 있다. 도약 전도에서, 전기적 전위는 결절에서 결절로 점프하며, 이로써 활동 전위의 전도에 관여하는 막 영역을 감소시키고 전도 속도를 증가시킨다.
신경계에서 발견되는 비-신경 세포는 신경교세포라고 한다. 성상세포가 가장 풍부하며, 뉴런의 지지 및 영양공급을 제공한다. 소교세포는 신경 조직에 특이적인 작은 식세포이다. 뇌실 시스템 및 척수의 중심관(central canal)을 따라 존재하고 뇌척수액을 생산하는 세포는 뇌실막 세포라고 한다. 중추신경계에서, 희소돌기세포는 다수의 뉴런의 수초 단편들을 형성한다. 말초신경계에서, 수초의 각각의 단편은 단일 슈반 세포에 의해 형성된다.
중추신경계
중추신경계(CNS)는 뇌 및 척수로 이루어진다. 뇌척수막(meninges)(경막(dura mater), 거미막(arachnoid) 및 유막(pia mater))은 CNS를 보호하고 영양공급을 할 뿐만 아니라, 두개골 및 척추에 의해 보호된다. 뇌척수액은 거미막하(subarachnoid) 공간, 척주(spinal column)의 중심관 및 뇌의 뇌실에서 발견된다. 유막은 가장 안쪽 층이며, 신경 조직에 인접해 있다. 유막과 경막 사이에 거미막 층이 존재한다. 질긴(tough) 섬유성 경막이 두개골 바로 아래에 존재한다.
뇌는 3개의 기본 영역인 전뇌, 중뇌 및 뇌간으로 구분될 수 있다. 전뇌는 시상, 시상하부, 기저핵 및 대뇌를 포함한다. 대뇌는 의식적 사고, 감각의 해석, 모든 수의 운동, 지능(mental faculty) 및 감정에 관여한다.
뇌 조직은 구조적 영역 및 기능적 영역으로 구분될 수 있다. 대뇌 표면은 대뇌이랑(gyri)(대뇌릉(ridge)) 및 고랑(sulci)(홈(groove))으로 구불구불하게 되어 있다. 피질의 감각 영역 및 운동 영역은 각각 중심뒤이랑(post central gyrus) 및 중심고랑(central sulcus)으로 지도화(mapping)될 수 있다. 감각 영역은, 시상 처리(thalamic processing) 후 투영되는(projected) 신체의 반대편으로부터 감각 정보를 수용한다. 감각 신경 말단이 더 많은 신체 부위는 피질 감각 영역이 더 많은 것으로 나타난다. 운동 영역은 대측성 신체 부위의 수위근 운동을 조절하지만, 연합 영역은 운동의 개시에 중요하다.
대뇌는 뇌의 가장 큰 부분이며, 2개의 반구(hemisphere)인 우측 반구 및 좌측 반구로 나뉘며, 몇몇의 엽(lobe)을 가진다. 전두엽은 운동 영역, 브로카 언어 영역(Broca's speech area), 연합 영역을 함유하며, 지능 및 행동에 작용한다. 두정엽은 감각 영역을 함유하며, 기분(feeling) 및 듣기에 작용한다. 일차적인 시각적 연합 영역은 후두엽에 위치하며, 측두엽은 청각 연합, 냄새 및 기억 저장을 위한 영역들을 함유한다.
시상은 대뇌 피질과 뇌간 사이에 위치한다. 후각을 제외한 모든 감각 입력은 시상에서 처리된 다음, 뇌의 다른 영역들로 투영된다. 시상하부는 시상 아래에 위치하며, 내부 자극의 처리 및 내부 환경의 유지에 관여한다. 혈압, 온도, 심박동수, 호흡, 수분 대사, 삼투질 농도, 배고픔 및 신경내분비성(neuroendocrine) 활성의 무의식적인 조절에 의한 운동은 시상하부에서 수행된다. 뇌하수체 후엽으로부터 옥시토신 및 ADH를 방출하는 신경내분비성 세포의 핵은 시상하부에 위치한다.
기저핵(미상핵(caudate nuclei), 담창구(globus palladus), 흑색질(substantia nigra), 시상밑부(subthalamus) 핵, 적색핵(red nucleus))은 대뇌의 각각의 반구 내에 끼워 넣어진 뉴런의 그룹이다. 이들은 복잡한 운동 조절, 정보 처리 및 무의식적인 총괄적인 의도적 운동(unconscious gross intentional movement)의 조절에 관여한다.
뇌간은 연수 및 뇌교를 포함한다. 연수는 호흡, 심장 반사 및 혈관 운동 반사의 조절에 중요한 기능성 영역 및 중계소(relay center)를 함유한다. 뇌교는 호흡 조절에 관여하는 호흡조절중추를 함유한다.
소뇌는 뇌간 위에 위치하며, 신체의 위치, 운동, 자세 및 평형에 대해 처리된 감각 정보를 사용한다. 운동은 소뇌에서 개시되지 않지만, 조화된 운동에 필요하다.
말초신경계
말초신경계는 뇌 및 척수 바깥쪽에 위치하는 신경, 신경절 세포, 척수 신경 및 뇌신경을 포함한다. 12개의 뇌신경이 뇌간에 위치하는 핵으로부터 나와서, 냄새, 시야, 타액 분비, 심박동수 및 피부 감각과 같은 다양한 자율신경계 기능을 조절하기 위해 자극을 운반하는 특정 위치로 이어진다. 뇌신경은 종종, 이들이 감각 성분과 운동 성분을 운반하지만 오로지 하나의 운동 섬유 또는 감각 섬유를 가질 수 있다는 점에서, 혼합된다. 하기의 표는 뇌신경 및 이들의 기능을 열거한 것이다.
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말초신경계의 감각 구분은 다양한 유형의 수용체들로부터 입력을 취하고, 이를 처리한 다음, 중추신경계로 보낸다. 감각 입력은 자기 수용(proprioception)에서와 같이 내부 공급원(관절 및 근육의 위치 감각) 또는 피부 상에서의 압력 또는 열의 감각에서와 같이 외부 공급원으로부터 유래될 수 있다. 특이적인 척수 신경에 의해 신경지배되는 피부 영역을 피부절(dermatome)이라고 한다. 구심성 섬유는 감각 입력을 모아, 척수까지 이어진 다음, 시상에서 수렴되고, 마지막으로 대뇌의 감각 피질 상에서 종결된다. 감각 수용체를 더 많이 가진 영역들, 즉, 손가락 끝 또는 입술은 뇌의 감각 피질 상의 더 넓은 영역에 상응한다. 자기 수용 정보를 운반하는 섬유 역시 소뇌로 분산된다. 거의 모든 감각계가 시상의 부분에 자극을 전달한다. 대뇌 피질은 감각 자극의 의식적인 인지 및 해석에 관여한다.
근육 및 분비샘으로의 운동 입력은 자율신경계 및 원심성 체성신경계를 통해 발생한다. 관절, 힘줄 및 근육의 CNS 신경지배는 원심성 체성신경계를 통해 이어진다. 일부 근육 반응은 척수 반사를 통해 취급된다. 이의 일례는 손가락을 핫 스토브(hot stove)에 갖다 댈 때 나타나는 도피 반사이다. 손가락을 후퇴시키기 위한 운동은, 통증의 감각이 뇌에 도달하기 훨씬 전에, 간단한 척수 반사를 통해 발생한다. 명백하게도, 이는 추가적인 손상을 피하기 위한 보호 메커니즘이다. 분비샘 및 평활근으로의 운동 입력은 통상 자율신경계를 통해 발생한다.
대부분의 기관(organ)은 자율신경계의 두 분지 모두로부터의 입력을 수용한다. 하나의 분지는 일반적으로 해당 기관 또는 조직에서 흥분성일 것이며, 한편 나머지 다른 한 분지는 억제성이다. 자율신경계의 교감신경 분지는 생리학적 스트레스에 대해 신체를 준비시키는 작용을 한다. 교감신경 분지의 자극은, 신체가 반응에 대해 달리거나 싸울 준비를 한다는 점에서, 가속화하는 것과 같다. 심박동수 증가, 기도 확장, 및 글리코겐 저장소로부터의 포도당 이동과 같은 효과들이 나타난다. 교감신경은 1번 흉추에서 4번 요추까지 이어진다. 이들은 척주를 따라 존재하는 사슬 신경절 세포 중 하나에서 종결되는 짧은 신경절전 뉴런을 가진다. 아세틸콜린은 긴 신경절후 뉴런과의 시냅스에서의 신경전달물질이며, 표적 조직으로 이동하며, 표적 조직에서 노르에피네프린이 대부분의 교감신경 종단부에서 방출된다. 땀샘 또는 골격근 맥관 구조를 신경지배하는 것들과 같은 몇몇 교감신경 신경절후 뉴런이 아세틸콜린을 방출한다.
부교감신경 분지는 CNS의 두개골(cranial) 영역 및 천골(sacral) 영역으로부터 나오는 뉴런을 통해 교감신경 분지를 상쇄하는 작용을 한다. 예를 들어, 부교감신경 자극은 기도를 수축시키고, 심박동수를 감소시킨다. 이는 소화, 배뇨 및 발기와 같은 휴식기 활동을 조절한다. 긴 신경절전 뉴런은 말단 기관에 근접한 시냅스에서 아세틸콜린을 방출한다. 짧은 신경절후 뉴런 또한, 효과기 조직상에 아세틸콜린을 방출한다.
치료 조성물
일 실시 형태에서, 본 발명은 신경퇴행을 특징으로 하는 다양한 질환들에 대한 치료에 관한 것이다. 이러한 방식으로, 본 발명의 치료 화합물은, 뉴런의 퇴행을 저해하는 화합물을 제공함으로써, 질환을 앓고 있거나 질환을 앓기 쉬운 인간 환자에게 투여될 수 있다. 특히, 이러한 질환은 뇌의 신경퇴행성 장애, 특히 해마 및 대뇌 피질에서 신경 세포의 소실, 신경전달물질의 감소, 뇌혈관 퇴행, 척추에서의 신경 압착(crushed nerve) 및/또는 인지 능력의 상실과 연관 있다.
치료 화합물의 제형은 일반적으로 당업계에 알려져 있으며, 편리하게는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., USA]를 참조할 수 있다. 예를 들어, 하루에 체중 1 kg 당 약 0.05 ㎍ 내지 약 20 mg을 투여할 수 있다. 투약 계획은 최적 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 분할된 투약량이 매일 투여될 수 있거나, 치료 상황의 긴급성(exigency)에 의해 나타나는 바와 같이 비례적으로 감소될 수 있다. 활성 화합물은 경구, 정맥내(수용성인 경우), 근육내, 피하, 비내, 피내 또는 좌제(suppository) 경로, 또는 이식(예, 서방성 분자를 복강내 경로에 의해 사용하거나, 시험관 내에서 감작되고 수여자에게 적응 전달되는 단핵구 또는 수지상세포와 같은 세포를 사용함으로써)과 같은 종래의 방식으로 투여될 수 있다. 투여 경로에 따라, 펩타이드는, 펩타이드를 상기 성분을 불활성화시킬 수 있는 효소, 산 및 다른 자연적인 조건의 작용으로부터 보호하기 위한 물질로 코팅될 필요가 있을 수 있다.
예를 들어, 펩타이드의 낮은 친유성(lipophilicity)은 펩타이드를, 펩타이드 결합을 절단할 수 있는 효소에 의해 위장관에서 파괴시키고, 산 가수분해에 의해 위에서 파괴시킬 수 있다. 비경구 투여가 아닌 다른 투여에 의해 펩타이드를 투여하기 위해, 펩타이드는, 이의 불활성화를 방지하는 물질에 의해 코팅되거나 이러한 물질과 함께 투여될 것이다. 예를 들어, 펩타이드는 보강제 내에서 투여되거나, 효소 저해제 또는 리포좀과 공동-투여될 수 있다. 본원에서 고려되는 보강제로는, 레조르시놀, 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르 및 n-헥사데실 폴리에틸렌 에테르와 같은 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 효소 저해제로는, 췌장 트립신 저해제, 다이이소프로필플루오로포스페이트(DEP) 및 트라실롤(trasylol)을 포함한다. 리포좀으로는, 수-중-유-중-수 CGF 에멀젼뿐만 아니라 종래의 리포좀을 포함한다.
활성 화합물은 또한, 비경구 또는 복강내로 투여될 수 있다. 또한, 글리세롤 액체 폴리에틸렌 글리콜, 이들의 혼합물 및 오일 내에서 분산액이 제조될 수 있다. 통상적인 보관 및 사용 조건하에, 이들 조제물은 미생물의 성장을 방지하기 위해 방부제를 함유한다.
주사용에 적합한 약제학적 형태는, 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액, 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석(extemporaneous) 제조용 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우, 형태는 멸균되어야 하며, 용이한 주사가능성(syringability)이 존재하는 범위까지 유동성이어야 한다. 이는 제조 및 보관 조건하에 안정해야 하며, 박테리아 및 진균류와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물 및 식물유를 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제의 사용, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 테오머살(theomersal) 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제에 의해 유도될 수 있다. 많은 경우, 당 또는 염화나트륨과 같은 등장성제를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 조성물을 사용함으로써 유도될 수 있다.
멸균 주사 용액은, 활성 화합물을 필요한 양으로 적절한 용매 내에 상기 열거된 다양한 다른 성분들과 함께 혼입하고, 필요에 따라 멸균 여과함으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은, 다양한 멸균 활성 성분들을, 기본적인(basic) 분산 배지 및 상기 열거된 것들 중에서 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액 제조용 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조 기술이며, 이러한 기술에 의해 활성 성분에 더하여 이전에 멸균 여과된 용액으로부터의 부가적으로 요망되는 임의의 성분의 분말이 수득된다.
펩타이드가 상기 기술된 바와 같이 적합하게 보호되는 경우, 활성 화합물은 예를 들어, 불활성 희석제 또는 동화성(assimilable) 식용 담체와 함께 경구 투여될 수 있거나, 활성 화합물은 경갑(hard shell) 또는 연갑(soft shell) 젤라틴 캡슐 내에 밀봉될 수 있거나, 활성 화합물은 식이 식품과 함께 직접 혼입될 수 있다. 경구 치료 투여의 경우, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입되고, 섭취성 정제(ingestible tablet), 버컬정(buccal tablet), 트로키(troche), 캡슐, 엘릭셔(elixir), 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 조성물 및 조제물은 활성 화합물을 적어도 1 중량% 함유해야 한다. 물론, 조성물 및 조제물의 백분율은 다양할 수 있으며, 통상적으로 단위 중량의 약 5% 내지 약 80%일 수 있다. 이러한 치료학적으로 유용한 조성물 내의 활성 화합물의 양은, 적합한 투약량이 수득될 정도의 양이다. 본 발명에 따른 바람직한 조성물 또는 조제물은, 경구 투약 단위 형태가 활성 화합물을 약 0.1 ㎍ 내지 2000 mg 함유하도록 제조된다.
정제, 알약, 캡슐 등은 또한, 하기를 함유할 수 있다: 검 트라가칸트, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 같은 결합제; 다이칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등과 같은 붕해제(disintegrating agent); 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제; 및 수크로스, 락토스 또는 사카린과 같은 감미제가 첨가될 수 있거나, 또는 페퍼민트, 윈터그린(wintergreen) 오일 또는 체리향과 같은 향료(flavoring agent)가 첨가될 수 있다. 투약 단위 형태가 캡슐인 경우, 이는 상기 유형의 물질들 외에도, 액체 담체를 함유할 수 있다. 다양한 다른 물질들이 코팅제로서 존재할 수 있거나, 그렇지 않다면 투약 단위의 물리적 형태를 변형시키도록 존재할 수 있다. 예를 들어, 정제, 알약 또는 캡슐은 셸락(shellac), 당 또는 둘 다에 의해 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭셔는 활성 화합물, 감미제로서 수크로스, 방부제로서 메틸 및 프로필파라벤, 염료, 및 체리향 또는 오렌지향과 같은 향료를 함유할 수 있다. 물론, 임의의 투약 단위 형태를 제조하는 데 사용되는 임의의 물질은 약제학적으로 순수하고, 적용되는 양에서 실질적으로 무독성이어야 한다. 또한, 활성 화합물은 서방성 조제물 및 제형 내에 혼입될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제"는 임의의 모든 용매, 분산 배지, 코팅성 항균제 및 항진균제, 등장성제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약제학적 활성 성분에 대해 이러한 배지 및 제제를 사용하는 것은 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 종래의 배지 또는 제제가 활성 성분과 비융화성인 경우를 제외하고, 치료 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 보조적인 활성 성분 또한, 조성물에 혼입될 수 있다.
투여의 용이성 및 투약의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투약 단위 형태로 제형하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용되는 바와 같이 투약 단위 형태는 치료받는 포유류 개체에 대한 단일 투약량으로서 적합화된 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 요망되는 치료 효과를 낳도록 계산된 예정된 양의 활성 물질을 필요한 약제학적 담체와 함께 함유한다. 본 발명의 투약 단위 형태에 대한 사양(specification)은 (a) 활성 물질의 독특한 특징 및 달성되어야 하는 특정한 치료 효과, 및 (b) 신체적 건강이 손상된 질환을 앓고 있는 살아 있는 개체에서 질환의 치료를 위해 이러한 활성 물질을 컴파운딩(compounding)하는 분야에 내재된 한계에 의해 지시되고 이에 직접 의존한다.
기본 활성 성분은, 투약 단위 형태 내에서 효과적인 양으로, 약제학적으로 허용가능한 적합한 담체와 함께 편리하고 효과적인 투여를 위해 컴파운딩된다. 단위 투약 형태는 예를 들어, 기본 활성 화합물을 약 0.5 ㎍ 내지 2000 mg 범위의 양으로 함유할 수 있다. 비율로서 표현되는 경우, 활성 화합물은 일반적으로 담체의약 0.5 ㎍으로부터 존재한다. 보조 활성 성분을 함유하는 조성물의 경우, 투약량은 통상적인 용량 및 상기 성분의 투여 방식을 참조로 하여 결정된다.
전달 시스템
리포좀에서의 캡슐화, 미세입자, 미세캡슐, 화합물을 발현시킬 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개 엔도사이토시스, 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 부분으로서의 핵산의 구축 등과 같은 다양한 전달 시스템이 알려져 있으며, 본 발명의 화합물을 투여하기 위해 사용될 수 있다. 도입 방법으로는, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비내, 경막외 및 경구 경로를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 화합물 또는 조성물은 임의의 편리한 경로, 예를 들어 투입(infusion) 또는 볼루스 주사(bolus injection), 상피 또는 피부점막 라이닝(lining)(예, 구강 점막, 직장 점막 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있으며, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 투여 또는 국소 투여일 수 있다. 또한, 본 발명의 약제학적 화합물 또는 조성물을 뇌실내(intraventricular) 및 척추강내(intrathecal) 주사를 비롯한 임의의 적합한 경로에 의해 중추신경계 내로 도입하는 것이 바람직할 수 있으며; 뇌실내 주사는 뇌실내 카테터, 예를 들어 Ommaya 레저보어(reservoir)와 같은 레저보어에 부착된 뇌실내 카테터에 의해 용이하게 수행될 수 있다. 폐로의 투여 또한, 예를 들어, 흡입기 또는 분무기, 및 에어로졸화제(aerosolizing agent)를 동반한 제형의 사용에 의해 적용될 수 있다.
구체적인 실시 형태에서, 본 발명의 약제학적 화합물 또는 조성물을 치료가 필요한 영역에 국소 투여하는 것이 바람직할 수 있으며; 이는 예를 들어 비제한적으로, 수술 도중의 국소 투입, 주사 요법, 국소 적용, 예를 들어 수술 후 상처 드레싱과 함께 국소 적용, 카테터, 좌제 또는 임플란트에 의해 적용될 수 있으며, 상기 임플란트는 예를 들어 시알라스틱(sialastic) 막과 같은 막을 포함하는 다공성, 비다공성 또는 젤라틴성 물질 또는 섬유일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체 또는 펩타이드를 비롯한 단백질을 투여하는 경우, 단백질이 흡수되지 않는 물질을 사용하는 데에 주의를 기울여야 한다. 또 다른 실시 형태에서, 화합물 또는 조성물은 소낭, 특히 리포좀에서 전달될 수 있다. 보다 다른 실시 형태에서, 화합물 또는 조성물은 조절형 방출 시스템에서 전달될 수 있다. 일 실시 형태에서, 펌프가 사용될 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, 중합체성 물질이 사용될 수 있다. 보다 다른 실시 형태에서, 조절형 방출 시스템은 치료 표적, 즉 뇌의 근처에 위치할 수 있으며, 따라서, 전신 투약량의 일부만 필요로 할 수 있다.
조성물은, 이의 투여가 수여자 동물에 의해 관용성일 수 있으며 그렇지 않더라도 해당 동물에의 투여에 적합하다면, "약물학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한" 것이라고 한다. 이러한 제제는, 투여되는 양이 생리학적으로 유의미한 경우, "치료적 유효량"으로 투여된다고 한다. 제제는, 이의 존재로 인해 수여 환자의 생리학에 검출가능한 변화가 초래되는 경우, 생리학적으로 유의미하다.
본 발명은 본원에 기술된 구체적인 실시 형태에 의해 범위가 제한되는 것이 아니다. 사실상, 본원에 기술된 것들 외에도 본 발명의 다양한 변형들은 상기 상세한 설명 및 첨부되는 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부되는 청구항의 범위 내에 속하고자 한다. 하기 실시예는 본 발명의 예시에 의해 제공될 뿐, 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예
실시예 1 - 물질 및 실험 방법
실시예 1.1
래트의 부신 수질 PC12 크롬 친화성 세포종 뉴런 세포를 ATCC(미국 버지니아 머내서스)로부터 구매하였다. Dulbecco's Modified Eagle's 배지(DMEM), 태아 소 혈청(FBS) 및 말 혈청을 비롯한 세포 배양 물질을 Mediatech Inc.(미국 버지니아 머내서스)로부터 구매하였다. 2.5 S 신경 성장 인자를 BD Biosciences, Inc.(미국 매사추세츠 베드포드 01730)로부터 구매하였다. 뉴런의 III형 β-튜불린에 대한 TUJ-1 모노클로날 토끼 항체를 Covance Inc.(미국 메릴랜드 게이더스버그)로부터 구매하였다. 아세틸화된 α-튜불린에 대한 모노클로날 마우스 항체를 Santa Cruz Biotech Inc.(미국 캘리포니아 샌타크루즈)로부터 구매하였다. 염소 혈청, Texas Red® 염소 항-토끼 IgG 항체, Alexa Fluor® 488 염소 항-마우스 IgG 항체, 4',6-다이아미디노-2-페닐인돌, 다이락테이트(DAPI) 및 AlamarBlue®를 Molecular Probes-Invitrogen(미국 오리건 유진)으로부터 구매하였다. 노코다졸을 Sigma-Aldrich(미국 미주리 세인트루이스)로부터 구매하였다. 신경 돌기 성장 분석법 키트를 Millipore(미국 매사추세츠 빌레리카)로부터 구매하였다. 모든 지질들을 Avanti Polar Lipids, Inc.(미국 앨라배마 엘라베스터 35007)로부터 구매하였다. 재조합 인간 PTEN 단백질 및 말라카이트 그린 포스페이트 검출 키트를 R&D Systems, Inc.(미국 미네소타 미니애폴리스 55413)로부터 구매하였다. 인간 PTEN c-DNA를 OriGene Inc.(미국 메릴랜드 록빌 20850)로부터 구매하였다. 리포펙타민TM 2000 형질감염 시약을 InvitrogenTM으로부터 구매하였다. Tris-글리신 농도구배 미니 겔(10% 내지 20%)을 NovexTM로부터 구매하였다. 모든 항체들을 Santa Cruz Biotechology, Inc.(미국 캘리포니아 샌타크루즈 95060)로부터 구매하였다. 모든 다른 물질들을 Fisher Scientific Inc.로부터 구매하였다.
실시예 1.2 - 펩타이드 설계
PTEN C-말단 영역(AA352 ~ 403)을 주형으로서 사용하여, TGN 펩타이드를 잠재적인 PTEN 저해제로서 설계하였다. 모든 TGN 펩타이드는 막 투과성을 증가시키기 위해 PTD(펩타이드 전달 도메인) 서열(RRRRRRRR)을 이들이 N-말단에 포함하였다. TGN-1 펩타이드는 3개의 인산화된 세린 잔기와 더불어 32개의 아미노산을 가진다(MW = 4244.18 Da, 서열: RRRRRRRR-VTPDVpSDNEPDHYRYpSDTTDpSDPE-아미드 (SEQ ID NO:4), pS = 인산화된 세린). TGN-2 펩타이드는 2개의 인산화된 세린 잔기와 더불어 36개의 아미노산을 가진다(MW = 4776.28 Da, 서열: HYRYpSDTTDpSDPENEPFDEDQHTQITKV-아미드 (SEQ ID NO:6), pS = 인산화된 세린). TGN-3 펩타이드는 어떠한 잔기도 변형되지 않으며 2개의 세린 잔기가 발린으로 치환된 점을 제외하고는, TGN-2 펩타이드와 동일한 아미노산 서열을 가진다(MW = 4640.99 Da, 서열: RRRRRRRR-HYRYVDTTDVDPENEPFDEDQHTQITKV-아미드 (SEQ ID NO:8)). TGN-4 펩타이드는 TGN-1 펩타이드의 무작위 혼합된 펩타이드로서 설계하였으며(MW = 4004.19 Da, 서열 = RRRRRRRR-SDDEYTDNPDSRYVSDTPVDTEH-아미드 (SEQ ID NO:10)), TGN-5 펩타이드를 TGN-2/TGN-3 무작위 혼합된 펩타이드로서 설계하였다(MW = 4616.88 Da, 서열 = RRRRRRRR-DEHDTEYTPDYRQETHFNSQPTDKSDVI-아미드 (SEQ ID NO:12)). 모든 펩타이드들은 21st Century Biochemicals Inc.(미국 매사추세츠 말버러 01752)에 의해 합성되었다. 순도는 95% 초과였으며, HPLC에 의해 확인하였다.
실시예 1.3 - 시험관 내 PTEN 활성 분석법
포스파티딜이노시톨 트리포스페이트(PIP3)를 포스파티딜이노시톨 다이포스페이트(PIP2)로 변환시키고 포스페이트 이온(Pi)을 생산하는 PTEN 지질 포스파타제 활성을 검사하기 위해 시험관 내 PTEN 활성 분석법을 설계하였다. 1,2-다이옥타노일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-마이오-이노시톨-3,4,5-트리포스페이트)(C8-PIP3)를 PTEN 기질로서 사용하였으며, 다른 인지질들과 함께 지질 소낭(리포좀)으로서 제조하였는데, 이는 지질 포스파타제로서의 PTEN은 계면적 효소이기 때문이다. 리포좀 제조에 있어서, C8-PIP3, DOPS(1,2-다이오엘로일-sn-글리세로-포스포세린) 및 DOPC (1,2-다이오엘로일-sn-글리세로-포스포콜린)을 리포좀 완충제(50 mM Tris, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, pH = 8.0) 800 μL와 함께 최종 농도가 0.1 mM C8-PIP3, 0.25 mM DOPS 및 0.25 mM DOPC가 되도록 혼합하였다. 그런 다음, 지질 혼합물을 4℃에서 30분 동안 소니케이션(sonication)해서, 리포좀을 생산하였다. 소니케이션 후, 리포좀 용액을 간단히 원심분리해서, 잔여 지질을 제거하였다.
PTEN 활성 분석법에 있어서, 재조합 인간 PTEN 단백질 20 ng을 완전 리포좀 용액 40 ㎕와 함께 혼합하였다. PTEN 분석법 완충제(1 mM Tris, 20 mM DTT 및 0.5% NP-40, pH = 8.0)를 최종 부피가 100 ㎕ 이하가 되도록 첨가하였다. 그런 다음, 반응 혼합물을 37℃ 수조에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, PTEN 단백질에 의해 생산되는 무기 포스페이트 이온을 말라카이트 그린 포스페이트 검출 키트를 사용하여 검출하였다. 우선, 각각의 반응 혼합물 50 ㎕ 또는 100 ㎕를 96-웰 플레이트에 옮기고, 말라카이트 시약 A를 각각 10 ㎕ 또는 20 ㎕ 첨가하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 종료된 후, 말라카이트 시약 B 10 μL 또는 20 μL를 다시 각각의 검체에 첨가하고, 실온에서 20분 더 인큐베이션하였다. 포스페이트 이온의 검출은, 620 nm에서 분광광도계를 사용하여 OD(광학 밀도)를 측정함으로써 수행하였다. 재조합 PTEN 활성에 대한 TGN 펩타이드(10 μM)의 저해 효과를 확인하기 위해, 각각의 TGN 펩타이드를 DMSO 용액에서 1 mM 농도로 제조하였으며, TGN 펩타이드 용액 1 μL를 재조합 PTEN 단백질, 리포좀 및 PTEN 분석법 완충제와 혼합하고, 상기 프로토콜에 따라 PTEN 활성에 대해 분석하였다.
실시예 1.4 - 시험관 내 IC 50 분석법
IC50 값은, 상이한 농도의 TGN-1 및 TGN-2 펩타이드를 사용한 시험관 내 PTEN 활성 분석법을 수행함으로써 측정하였다. IC50 분석법을 위한 TGN-1 또는 TGN-2 펩타이드의 농도 범위는 각각 0.1 μM, 1 μM, 10 μM, 30 μM, 60 μM 및 100 μM, 및 0.05 μM, 0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM 및 100 μM이었다. 모든 데이터는 3회 중복 실험을 나타내며, IC50 값은 Prism 5 소프트웨어(GraphPad 소프트웨어)에 의해 계산하였다.
실시예 1.5 - PC 12 세포 배양
PC12 래트 크롬 친화성 세포종 세포를 6-웰 플레이트(0.6x106 세포/웰)에 접종하고, 7.5% FBS 및 7.5% 염소 혈청을 함유하는 DMEM 배지와 함께 배양하였다. 세포 포화도(cell confluency)가 약 60% 내지 70%에 도달한 후, NGF(신경 성장 인자, 50 ng/mL)를 분화를 위해 PC12 세포에 첨가하고, 5일 이상 인큐베이션하였다. 그런 다음, DMSO 용액 내에 TGN 펩타이드를 상이한 양으로 함유하는 신선한 배지를 각각의 웰에 첨가하고, 24시간 더 인큐베이션하였다. PTEN 발현을 위해, PC12 세포를 6-웰 플레이트(1.0x106 세포/웰)에 접종하고, 상기와 같이 NGF(50 ng/mL)를 사용하여 분화시켰다. 우선, 인간 PTEN c-DNA 2 ㎍ 내지 2.5 ㎍을 Opti-MEM 500 ㎕에 첨가함으로써, 형질감염되어야 하는 각각의 웰의 세포에 대해 DNA-리포펙타민 2000 혼합물을 제조하였다. 다음, 리포펙타민 2000™ 시약 3.75 ㎕ 내지 8.75 ㎕를 상기 희석된 DNA 용액에 첨가하고, 부드럽게 혼합한 다음, 실온에서 25분 동안 인큐베이션하였다. 6-웰 플레이트 내의 PC12 세포의 성장 배지를 신선한 배지로 교환하고, DNA-리포펙타민 2000 복합체 500 ㎕를 형질감염을 위해 각각의 웰에 첨가하였다. 형질감염된 세포를 형질감염-후 24시간 내지 48시간 동안 37℃, 5.0% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션한 다음, 이식 유전자(transgene) 발현에 대해 분석하였다.
실시예 1.6 - PC12 세포를 이용한 신경 돌기 분석법
37℃, 5.0% CO2 인큐베이터에서 유지시킨 T-75cm2 플라스크에서 래트의 부신 수질 PC12 래트 크롬 친화성 세포종 뉴런 세포에 7.5% 우태아 혈청(FBS), 7.5% 말 혈청(ES) 및 0.5% 페니실린 스트렙토마이신을 보충하였다. 세포의 포화도가 50%에 도달했을 때 세포를 플라스크로부터 부드럽게 기계적으로 탈착시킴으로써 세포를 분할하고, 1:7의 분할비(split ratio)로 증식시켰다.
신경 돌기 보호 분석법에 있어서, PC12 세포를 2.08x105 세포/스캐폴드(경험적으로 최적의 접종 밀도로서 확인됨)의 접종 밀도로 6-웰 플레이트에 접종하였으며, 세포의 포화도가 60% 내지 70%에 도달할 때까지 24시간 내지 48시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, PC12 세포를 NGF(50 ng/mL)를 사용하여 72시간 내지 120시간 동안 분화시켰다. 신경 돌기 퇴행을 모방하기 위해, 분화된 PC12 세포를 노코다졸(0.5 μM)로 처리하였다. 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 노코다졸을 함유하는 오래된 배지를 NGF(10 ng/mL) 및/또는 TGN 펩타이드(최종 농도로서 100 μM)를 함유하는 신선한 배지로 교환하고 72시간 더 인큐베이션하였다. 잔여 신경 돌기를 하기 기술되는 면역형광 분석법을 통해 분석하였다.
신경 돌기 성장 분석법에 있어서, PC12 세포를 6-웰 플레이트에 1.0x105 세포/웰의 접종 밀도로 접종하였다. 세포의 포화도가 60% 내지 70%에 도달한 후, NGF (50 ng/mL)를 첨가함으로써 PC12 세포의 분화를 개시하였다. 24시간 동안 인큐베이션한 후, TGN 펩타이드(최종 농도로서 50 μM)를 6-웰 플레이트의 웰에 첨가하고, 2일 더 인큐베이션하였다. 신경 돌기 상태를 하기 기술되는 신경 돌기 성장 키트(Millipore)를 사용하여 분광광도계에 의해 정량화하였다.
실시예 1.7 - 웨스턴 블로팅
배양 후, PC12 세포를 6-웰 플레이트로부터 수집하고, 벤치-탑 원심분리기를 사용한 원심분리(실온, 13,000 rpm에서 5분)에 의해 침강시켜, 세포 펠렛을 제조하였다. 상층액을 폐기하고, 세포 펠렛을 1x PIPA 완충제(Invitrogen) 3 ㎕ 내지 500 ㎕와 함께 재현탁시켰다. 재현탁화된 세포를 액체 질소 및 37℃ 수조를 사용한 동결-해동 사이클(3회 내지 4회)에 의해 용해시키고, 재현탁화된 세포를 27G 바늘이 장착된 주사기를 사용하여 반복해서 분무하였다. 용해된 세포를 4℃, 10,000g에서 20분 동안 원심분리하고, 상층액을 수집한 다음, BCA 단백질 농도 키트(Thermo Scientific.)를 사용하여 총 단백질 농도를 분석하였다.
웨스턴 블로팅을 수행하여, PC12 세포에서 내인성 Akt 단백질의 인산화 수준을 항-포스포 Akt 항체를 사용하여 조사하였다. SDS-PAGE를 NovexTM 농도구배 미니 겔(10% 내지 20%)을 사용하여 수행하였다. SDS-PAGE 겔 내의 세포 용해물 검체 및 단백질을 PVDF 막으로 옮기고, 블로킹 용액(blocking solution)(0.1% Tween-20을 함유하는 1X TBS 완충제 중 5% 밀크)과 함께 인큐베이션하였다. 항-포스포 Akt 항체를 1:500 희석(0.1% Tween-20을 함유하는 1X TBS 완충제)시켜 일차 항체로서 사용하였다. HRP-공액된 항-토끼 항체를 1:8000의 희석률로 희석시켜 이차 항체로서 사용하였다. 내인성 PTEN 단백질 또는 과발현된 PTEN 단백질의 발현 수준 또한, 항-PTEN 항체(1:400 희석률)를 사용하여 조사하였다. 로딩 조절을 위해, β-액틴 발현 수준을 또한 분석하였다.
실시예 1.8 - 신경 돌기 정량화
총 신경 돌기의 정량화를 위해, 본 발명자들은 분광광도계와 함께 신경 돌기 성장 분석법 키트(Millipore)를 사용하였다. Millicell 인서트(EMD Millipore, 미국 매사추세츠 빌레리카)의 하면(underside)을 신선한 세포외 매트릭스(ECM) 단백질(10 ㎍/mL 콜라겐)로 37℃에서 2시간 동안 코팅한 후, PC12 세포를 24 웰 플레이트의 각 웰에 둔 인서트 당 접종하였다. 세포를 부착을 위해 실온에서 15분 동안 유지시킨 다음, 분화 배지 총 700 ㎕(각각 막의 하부에 600 ㎕ 및 막의 상부에 100 ㎕)를 웰 당 첨가하였다. 신경 돌기가 연장되도록 3일 동안 방치한 다음, 인서트를 실온에서 20분 동안 -200℃ 메탄올로 고정시키고, 신선한 PBS로 헹구었다. 다음, 인서트를 400 ㎕ 신경 돌기 염색 용액에 실온에서 30분 동안 넣고, 세포체를 적셔진 면봉으로 제거한 후, 각각의 인서트를 100 ㎕ 신경 돌기 염색 추출 완충제(Millipore)에 두었다. 마지막으로, 용액을 96-웰 플레이트에 옮긴 다음, 분광광도계에서 562 nm에서 흡광을 판독함으로써 정량화하였다.
실시예 1.9 - 면역형광
세포 배양 후, 성장 배지를 제거하고, 세포를 실온에서 15분 동안 10% 포르말린으로 고정시켰다. 이후, 세포를 PBS 중 0.5 M 글리신 용액으로 세정하고, 40℃에서 PBS 중 5% 염소 혈청 및 0.2% Triton-X 용액을 사용하여 밤새 차단하였다. 일차 항체를 사용하는 면역염색을 위해, 세포를 총 신경 돌기 염색에 대한 뉴런 III형 β-튜불린에 대한 TUJ-1 모노클로날 토끼 항체(1:200 희석) 및 안정한 신경 돌기 염색에 대한 아세틸화된 α-튜불린에 대한 모노클로날 마우스 항체(1:100 희석)와 함께 40℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 일단 세포를 1X PBS 완충제(10분/세정)로 3회 세정한 다음, 이차 항체 - TUJ-1 항체에 대한 Texas Red® 염소 항-토끼 IgG(1:200 희석) 및 아세틸화된 α-튜불린 항체에 대한 Alexa Fluor® 488 염소 항-마우스 IgG(1:200 희석) -를 첨가하고, 40℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그런 다음, 세포를 1X PBS 완충제(10분/세정)로 3회 세정하고, 세포핵 염색을 위해 4',6-다이아미디노-2-페닐인돌; 다이락테이트(DAPI) 1 ㎍/ml를 제2 세정 단계 후에 첨가하였다. 마지막 세정 후, 형광 현미경을 사용하여 조사하기 위해 세포를 준비하였다. 여기 파장 및 방출 파장은 Alexa Fluor® 488-IgG(녹색)의 경우 488 nm/519 nm였으며, Texas Red® 염소 항-토끼 IgG(적색)의 경우 595 nm/615 nm였고, DAPI의 경우 405 nm/461 nm였다. 세포의 형광 이미지는 상이한 배율에서 수득하였으며, "ImageJ" 이미지 처리 및 분석 프로그램(미국 메릴랜드 베서스다의 Wayne Rasband, NIH에 의한 공공 도메인)에 의해 분석하였다.
실시예 2 - 결과
실시예 2.1 - TGN 펩타이드를, PTEN 인산화 부위를 주형으로서 사용하여 설계하였다 .
생체 내에서 지질 포스파타제로서의 PTEN 활성을 차단하는 것은 신경 손상 후 축삭 재생에 효과적인 것으로 알려져 있다[Park et. al 2008, Christie et. al 2012]. 본 발명자들은, 세포막 표면상에서 PTEN 위치화를 차단하는 잠재적인 PTEN 저해제를 설계하기 위해 PTEN-막 결합 메커니즘을 연구하였다. 이전의 연구들에 따르면[Lee et. al 1999; Leslie et. al 2008], PTEN 단백질은 2가지 기능성 도메인 - 포스파타제 도메인 및 C2 도메인 -을 가지며, 또한 인산화-탈인산화 과정을 통해 PTEN 단백질의 형태 변화를 조절하는 "스위치"로서 작동하는 "인산화 부위"를 C-말단 영역에 가진다[Das et. al 2003; Leslie et. al 2008]. PTEN의 총 지질 포스파타제 활성에 있어서, PTEN-막 결합 전에 PTEN 형태를 변화시키기 위해서는, "인산화 부위"에서 인산화된 세린/티로신 잔기의 탈인산화가 발생해야 한다. N-말단 PIP2 결합 모티프 및 C-말단 PDZ 도메인 결합 모티프를 통한 부가적인 결합은 PTEN 단백질을 세포막 상에서 총 PTEN 활성에 필요한 적절한 위치에 위치시킨다[Walker et. al 2004; Molina et. al 2010]. 따라서, 본 발명자들은, PTEN-막 결합을 방해함으로써 TGN 펩타이드를 잠재적인 PTEN 저해제로서 설계하기 위한 주형으로서, PTEN "인산화 부위" + PDZ-도메인 결합 모티프를 사용하기로 결정하였다(도 1A).
TGN-1 펩타이드는 "인산화 부위"의 아미노산 서열(365-388)을 모방하고, TGN-2 및 TGN-3 펩타이드는 "인산화 부위"를 포함하는 C-말단 영역의 아미노산 서열(376-403) 및 PDZ 도메인 결합 모티프(399-403)를 모방한다. "인산화 부위" 내의 세린 잔기에서의 인산화가 PTEN 형태 변화에 중요하기 때문에[Leslie et. al 2008; Odriozola et. al 2007], TGN-1 펩타이드는 "인산화 부위" 내에 3개의 인산화된 세린 잔기(Ser 370, Ser380 및 Ser385)를 포함하도록 변형된다. TGN-2 펩타이드는 2개의 인산화된 세린 잔기(Ser380 및 Ser385)를 포함한다. 비교를 위해, TGN-3 펩타이드에서, 2개의 세린 잔기(Ser380 및 Ser385)를 발린으로 치환하였다. TGN-4 및 TGN-5 펩타이드는 각각 TGN-1 및 TGN-2 펩타이드 서열을 무작위 혼합하도록 설계하였다. 모든 TGN 펩타이드들은 또한, 세포막 투과성을 증가시키기 위해, N-말단에 펩타이드 전달 도메인(PTD)으로서 8개의 아르기닌 잔기를 포함하도록 변형시켰다(도 1B).
실시예 2.2 - TGN-1 및 TGN-2 펩타이드는 시험관 내 PTEN 활성에 대해 특이적인 저해 효과를 나타낸다.
합성된 TGN 펩타이드를, 시험관 내 PTEN 활성 분석법을 사용하여 이들의 PTEN 저해 효과에 대해 시험하였다. 다이-옥타노일 포스파티딜이노시톨 3,4,5 트리포스페이트(diC8-PIP3)를 PTEN에 대한 기질로서 선택하였으며, 2개의 상이한 인지질 -다이올레오일 포스파티딜콜린(DOPC) 및 다이올레오일 포스파티딜세린(DOPS)을 가진 지질 소낭(리포좀)으로서 제조하였다. 지질을 리포좀 완충제와 혼합하고, 소니케이션(총 지질 농도 = 0.6 mM)에 의해 리포좀으로 제조하였다. 제조된 리포좀(0.1 mM의 다이-C8 PIP3)을 실온에서 재조합 인간 PTEN 단백질 20 ng과 30분 동안 인큐베이션하여, C8-PIP3를 C8-PIP2로 변환시키고 포스페이트 이온을 생산하는 PTEN의 활성에 대해 분석하였다. PTEN에 의해 생산되는 포스페이트 이온을 말라카이트 그린 시약 키트(도 2A)를 사용하여 측정하였다. 10 μM의 각각의 TGN 펩타이드를 PTEN 활성에 대한 이의 저해 효과에 대해 조사하였다. 도 2B에 도시된 바와 같이, TGN-1 및 TGN-2 펩타이드는 둘 다 PTEN 활성을 유의미하게 차단하였다(PTEN 활성이 양성 대조군과 비교하여, TGN-1을 사용한 경우 54%로 감소하였고 TGN-2를 사용한 경우 31%로 감소하였음). 한편, TGN-2 펩타이드는 TGN-1 또는 TGN-2(86%)와 비교하여 제한된 저해를 나타내었다. 또한, TGN-4 및 TGN-5 펩타이드는 둘 다 PTEN 활성의 유의미한 저해를 나타내지 않았으며, 이는, TGN-1 및 TGN-2 펩타이드에 의한 PTEN 저해가 서열-특이적임을 가리킨다. 재조합 PTEN 단백질 및 다이-C8-PIP3 지질 분자를 사용한 시험관 내 PTEN 활성 분석법만이 PTEN 활성을 나타내는 데 실패하였다(데이터는 도시되지 않음).
TGN 펩타이드에 대한 IC50 값을 또한, TGN 펩타이드를 용량-의존적인 방식(0 μM 내지 100 μM 범위)으로 이용한 시험관 내 PTEN 활성을 사용하여 측정하였다. TGN-1, TGN-2 및 TGN-3 펩타이드에 대해 계산된 IC50 값은 각각 19.93 μM, 87.12 μM 및 4.83 μM이었다(도 2C).
실시예 2.3 - TGN-1 펩타이드는 생체 내에서 PI3K-Akt 신호전달 경로를 촉진한다.
뉴런 세포에서 PI3K 신호전달 경로에 대한 TGN-1 펩타이드의 효과를 PC12 래트 크롬 친화성 세포종 세포주를 사용하여 확인하였다. PTEN 과발현을 위해 PTEN c-DNA로 형질감염시킨 분화된 PC12 세포 또는 자연 상태의 분화된 PC12 세포를 TGN-1 펩타이드(10 μM 및 100 μM) 또는 TGN-4 펩타이드(10 μM)와 함께 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 도 3A에서 다이어그램으로 도시된 바와 같이, TGN-1 펩타이드가 사실상 PTEN 활성을 차단하고 PI3K 활성에 대한 PTEN의 길항 효과를 억제한다면, PI3K 신호전달 경로에서 Akt 단백질의 활성화(인산화) 수준은 증가되어야 한다. 항-포스포 Akt 단백질 항체를 사용한 웨스턴 블롯 데이터는, TGN-1 펩타이드로 처리한 PC12 세포에서 내인성 Akt 단백질의 활성화(인산화) 수준이 TGN-1 펩타이드 용량-의존적인 방식으로 증가하였음을 보여주었다(도 3B 및 도 3C). TGN-4 펩타이드 또는 DMSO로 처리한 PC12 세포는 AKT 단백질의 활성화 수준을 증가시키지 않았으며, 이는, Akt 단백질 인산화 수준의 촉진이 TGN-1 펩타이드에 의해 특이적으로 유도되었음을 제시한다. 내인성 PTEN(도 3B) 또는 과발현된 PTEN(도 3C)의 발현 수준이 TGN 펩타이드 또는 DMSO로 처리 시 활성의 차이를 나타내지 않았기 때문에, TGN-1 펩타이드는 PTEN 활성을 특이적으로 저해하여, PI3K 신호전달 경로에 대한 PTEN의 하향조절 효과를 억제하고 PI3K-Akt 신호전달 경로를 촉진한다는 것이 명확하다.
실시예 2.4 - TGN-1 및 TGN-2 펩타이드는 뉴런 세포 배양물에서 신경보호를 비롯한 신경영양성 효과를 보여준다.
본 발명자들은, 분화된 뉴런 세포에서 신경 돌기 퇴행에 대한 TGN 펩타이드의 효과를 조사하였다. 신경 돌기 퇴행은 PC12 세포에서, 세포를 노코다졸과 접촉시킴으로써 세포의 신경 돌기의 미세소관 동역학(dynamics)을 방해함으로써 유도되었다. 분화된 래트 PC12 세포에 우선 노코다졸(0.5 μM)을 처리하고, NGF(50 ng/mL) 및 TGN 펩타이드(100 μM)를 함유하는 신선한 배지와 함께 72시간 동안 인큐베이션하였다. 2개의 상이한 튜불린 항체(안정한 신경 돌기에 대한 아세틸화된 α-튜불린 항체, 및 총 신경 돌기에 대한 TUJ-1 β-튜불린 항체)를 사용하는 면역형광 분석은, TGN-1 및 TGN-2 펩타이드가 노코다졸-유도성 신경 돌기 퇴행을 미세소관 안정화를 통해 분명하게 지연시켰음을 보여주었다(도 4A). 본 발명자들은 PC12 세포의 신경 돌기 성장에 대한 TGN 펩타이드의 효과를 더 조사하였다. TGN 펩타이드를 분화중인 PC12 세포에 첨가하면, 신경 돌기 발달을 사실상 촉진하였다(TGN-1에 의해 2.4배 증가 및 TGN-2에 의해 1.6배 증가, 도 4B). 종합하자면, 본 발명자들의 TGN-1 및 TGN-2 펩타이드는 신경영양성 효과뿐만 아니라, 성숙한 신경 돌기를 퇴행으로부터 보호하는 활성을 나타낸다.
본원에서 인용되는 모든 참조문헌들은 그 전체가 원용에 의해 포함된다.
당업자는, 일상적인 실험들을 통해, 본원에 구체적으로 언급된 본 발명의 구체적인 실시 형태들의 많은 등가물을 인지하거나 확인할 수 있을 것이다.
<110> KOLON TissueGene, Inc. <120> NERVE DAMAGE TREATMENT REGENERATION WITH PTEN INHIBITOR <130> 55293-54PCT <150> US 61/899,795 <151> 2013-11-04 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 403 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTEN amino acid sequence <400> 1 Met Thr Ala Ile Ile Lys Glu Ile Val Ser Arg Asn Lys Arg Arg Tyr 1 5 10 15 Gln Glu Asp Gly Phe Asp Leu Asp Leu Thr Tyr Ile Tyr Pro Asn Ile 20 25 30 Ile Ala Met Gly Phe Pro Ala Glu Arg Leu Glu Gly Val Tyr Arg Asn 35 40 45 Asn Ile Asp Asp Val Val Arg Phe Leu Asp Ser Lys His Lys Asn His 50 55 60 Tyr Lys Ile Tyr Asn Leu Cys Ala Glu Arg His Tyr Asp Thr Ala Lys 65 70 75 80 Phe Asn Cys Arg Val Ala Gln Tyr Pro Phe Glu Asp His Asn Pro Pro 85 90 95 Gln Leu Glu Leu Ile Lys Pro Phe Cys Glu Asp Leu Asp Gln Trp Leu 100 105 110 Ser Glu Asp Asp Asn His Val Ala Ala Ile His Cys Lys Ala Gly Lys 115 120 125 Gly Arg Thr Gly Val Met Ile Cys Ala Tyr Leu Leu His Arg Gly Lys 130 135 140 Phe Leu Lys Ala Gln Glu Ala Leu Asp Phe Tyr Gly Glu Val Arg Thr 145 150 155 160 Arg Asp Lys Lys Gly Val Thr Ile Pro Ser Gln Arg Arg Tyr Val Tyr 165 170 175 Tyr Tyr Ser Tyr Leu Leu Lys Asn His Leu Asp Tyr Arg Pro Val Ala 180 185 190 Leu Leu Phe His Lys Met Met Phe Glu Thr Ile Pro Met Phe Ser Gly 195 200 205 Gly Thr Cys Asn Pro Gln Phe Val Val Cys Gln Leu Lys Val Lys Ile 210 215 220 Tyr Ser Ser Asn Ser Gly Pro Thr Arg Arg Glu Asp Lys Phe Met Tyr 225 230 235 240 Phe Glu Phe Pro Gln Pro Leu Pro Val Cys Gly Asp Ile Lys Val Glu 245 250 255 Phe Phe His Lys Gln Asn Lys Met Leu Lys Lys Asp Lys Met Phe His 260 265 270 Phe Trp Val Asn Thr Phe Phe Ile Pro Gly Pro Glu Glu Thr Ser Glu 275 280 285 Lys Val Glu Asn Gly Ser Leu Cys Asp Gln Glu Ile Asp Ser Ile Cys 290 295 300 Ser Ile Glu Arg Ala Asp Asn Asp Lys Glu Tyr Leu Val Leu Thr Leu 305 310 315 320 Thr Lys Asn Asp Leu Asp Lys Ala Asn Lys Asp Lys Ala Asn Arg Tyr 325 330 335 Phe Ser Pro Asn Phe Lys Val Lys Leu Tyr Phe Thr Lys Thr Val Glu 340 345 350 Glu Pro Ser Asn Pro Glu Ala Ser Ser Ser Thr Ser Val Thr Pro Asp 355 360 365 Val Ser Asp Asn Glu Pro Asp His Tyr Arg Tyr Ser Asp Thr Thr Asp 370 375 380 Ser Asp Pro Glu Asn Glu Pro Phe Asp Glu Asp Gln His Thr Gln Ile 385 390 395 400 Thr Lys Val <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD (peptide transfer domain) <400> 2 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 3 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TGN-1 peptide <400> 3 Val Thr Pro Asp Val Ser Asp Asn Glu Pro Asp His Tyr Arg Tyr Ser 1 5 10 15 Asp Thr Thr Asp Ser Asp Pro Glu 20 <210> 4 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD and TGN-1 <400> 4 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Val Thr Pro Asp Val Ser Asp Asn 1 5 10 15 Glu Pro Asp His Tyr Arg Tyr Ser Asp Thr Thr Asp Ser Asp Pro Glu 20 25 30 <210> 5 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD and TGN-2 <400> 5 His Tyr Arg Tyr Ser Asp Thr Thr Asp Ser Asp Pro Glu Asn Glu Pro 1 5 10 15 Phe Asp Glu Asp Gln His Thr Gln Ile Thr Lys Val 20 25 <210> 6 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD and TGN-2 <400> 6 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg His Tyr Arg Tyr Ser Asp Thr Thr 1 5 10 15 Asp Ser Asp Pro Glu Asn Glu Pro Phe Asp Glu Asp Gln His Thr Gln 20 25 30 Ile Thr Lys Val 35 <210> 7 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD and TGN-3 <400> 7 His Tyr Arg Tyr Val Asp Thr Thr Asp Val Asp Pro Glu Asn Glu Pro 1 5 10 15 Phe Asp Glu Asp Gln His Thr Gln Ile Thr Lys Val 20 25 <210> 8 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD and TGN-3 <400> 8 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg His Tyr Arg Tyr Val Asp Thr Thr 1 5 10 15 Asp Val Asp Pro Glu Asn Glu Pro Phe Asp Glu Asp Gln His Thr Gln 20 25 30 Ile Thr Lys Val 35 <210> 9 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD and TGN-4 <400> 9 Ser Asp Asp Glu Tyr Thr Asp Asn Pro Asp Ser Arg Tyr Val Ser Asp 1 5 10 15 Thr Pro Val Asp Thr Glu His 20 <210> 10 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD and TGN-4 <400> 10 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ser Asp Asp Glu Tyr Thr Asp Asn 1 5 10 15 Pro Asp Ser Arg Tyr Val Ser Asp Thr Pro Val Asp Thr Glu His 20 25 30 <210> 11 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD and TGN-5 <400> 11 Asp Glu His Asp Thr Glu Tyr Thr Pro Asp Tyr Arg Gln Glu Thr His 1 5 10 15 Phe Asn Ser Gln Pro Thr Asp Lys Ser Asp Val Ile 20 25 <210> 12 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD attached at the N-terminus of TGN-5 <400> 12 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Asp Glu His Asp Thr Glu Tyr Thr 1 5 10 15 Pro Asp Tyr Arg Gln Glu Thr His Phe Asn Ser Gln Pro Thr Asp Lys 20 25 30 Ser Asp Val Ile 35

Claims (14)

  1. 서열번호 3 내지 6 중 어느 하나의 서열로 표시되는 포스파타제 및 텐신 호모로그(phosphatase and tensin homolog; PTEN) 지질 포스파타제 저해 펩타이드를 포함하며, 상기 펩타이드의 모든 세린잔기가 인산화된 것을 특징으로 하는, 손상된 신경 또는 손상된 신경 근처의 영역에서 작용하는, 신경 재생 또는 신경 퇴행 억제용 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 인산화 부위 및 PDZ 도메인 결합 모티프(domain binding motif) 중 하나 이상을 포함하는 펩타이드의 분절인 것인, 신경 재생 또는 신경 퇴행 억제용 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 펩타이드가 펩타이드 전달 도메인(peptide transfer domain; PTD)을 추가로 포함하는 것인, 신경 재생 또는 신경 퇴행 억제용 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 신경 손상은 중추신경계 내의 신경 손상인 것인, 신경 재생 또는 신경 퇴행 억제용 약학적 조성물.
  8. 서열번호 3 내지 6 중 어느 하나의 서열로 표시되며, 상기 서열의 모든 세린잔기가 인산화된 것이며, 포스파타제 및 텐신 호모로그(PTEN) 지질 포스파타제 활성을 저해하는 것인, 펩타이드.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제8항에 있어서, 상기 펩타이드는 인산화 부위 및 PDZ 도메인 결합 모티프(domain binding motif) 중 하나 이상을 포함하는 펩타이드의 분절인 것인, 펩타이드.
  13. 제8항에 있어서,
    상기 펩타이드는 펩타이드 전달 도메인(PTD)을 추가로 포함하는 것인, 펩타이드.
  14. 서열번호 3 내지 6 중 어느 하나의 서열로 표시되는 포스파타제 및 텐신 호모로그(PTEN) 지질 포스파타제 저해 펩타이드를 포함하는, 신경 세포 성장 촉진 또는 신경 세포 활성 촉진용 약학적 조성물로서, 상기 펩타이드의 모든 세린잔기가 인산화된 것인, 조성물.
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