CN111467372B

CN111467372B - 间充质干细胞外泌体在制备延缓脊髓小脑性共济失调3型病程进展的药物中的应用

Info

Publication number: CN111467372B
Application number: CN202010138628.3A
Authority: CN
Inventors: 付清玲; 裴中; 尤桦菁; 方淑斌; 吴腾腾
Original assignee: First Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Priority date: 2020-03-03
Filing date: 2020-03-03
Publication date: 2022-09-30
Anticipated expiration: 2040-03-03
Also published as: CN111467372A

Abstract

本发明提供了间充质干细胞来源的外泌体在制备治疗脊髓小脑性共济失调3的药物中的应用以及间充质干细胞来源的外泌体在制备延缓脊髓小脑性共济失调3发病进程的药物中的应用。本发明提供的间充质干细胞来源的外泌体能有效改善脊髓小脑性共济失调3转基因小鼠的运动协调能力，增加与运动功能相关的小脑浦肯野细胞数目，明显减少星形胶质细胞的激活。因此，本发明提供的间充质干细胞来源的外泌体能作为治疗延缓脊髓小脑性共济失调3发病或延缓发病进行的活性物质。为治疗脊髓小脑性共济失调3开发了一种新的药物途径。

Description

间充质干细胞外泌体在制备延缓脊髓小脑性共济失调3型病程进展的药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种间充质干细胞来源的外泌体，并请将其应用于治疗或延缓脊髓小脑性共济失调3型发病的药物中。

背景技术

脊髓小脑性共济失调3(spinocerebellar ataxia 3,SCA3)是一种常染色体显性遗传性神经退行性疾病，因人类第十四号染色体上的MJD1基因中(CAG)重复次数异常扩增所致。全世界发病率为1/40,000-100,000，是中国人群最常见的常染色体显性遗传性共济失调，所占比例高达62.09％。该病患者多在20-50岁之间发病，临床症状主要为小脑性共济失调伴构音障碍、意向性震颤等。一旦发病后，病情呈不可逆性缓慢进展，患者将在10-20年后死亡，对其工作及家庭会造成巨大的负担。遗憾的是，目前临床上仍缺乏对该病特异有效的治疗方法。虽然已有动物研究表明症状前期进行基因治疗可明显改善该疾病动物模型的预后，但昂贵的费用及尚不明确的安全性大大限制了它在临床上的探索及应用。

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells)亦可称为间充质基质细胞(Mesenchymal stromal cells)作为一种多能干细胞，能从多种人体组织如骨髓、脂肪、脐带、胚胎、牙龈、牙髓等中获取，或从胚胎干细胞及诱导性多能干细胞诱导分化而来并大量培养，其具有成脂、成骨、成软骨的分化特性，可以发挥组织替代及免疫调节能力，在多种疾病的动物试验及临床研究中均被证实了其疗效及安全性。而且，间充质干细胞的疗效发挥很大程度上取决于其来源的外泌体所包含的细胞因子，单纯注射外泌体的疗效也已被证实与注射间充质干细胞相仿。因此，目前缺乏一种安全有效延缓脊髓小脑性共济失调3发病及病程进展的治疗手段，而间充质干细胞来源的外泌体能满足这一需求。

发明内容

为获得适用于治疗或延缓脊髓小脑性共济失调3发病及病程进展的外泌体，发明人发现间充质干细胞来源的外泌体能明显延缓SCA3转基因小鼠运动症状的发生，并从间充质干细胞培养基上清液中分离提纯出纯度较高的外泌体进而验证其对上述病症的治疗效果。

实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：利用阴离子层析法分离提纯出间充质干细胞来源的外泌体，明确症状前期注射该类外泌体能否改善SCA3转基因小鼠模型的运动协调能力，并通过观察其密切相关的小脑浦肯野细胞数目、小脑分子层神经轴索脱髓鞘及星形胶质细胞激活等病理改变来进一步验证外泌体的疗效。

本发明的技术方案为：

间充质干细胞外泌体在制备治疗脊髓小脑性共济失调3(SCA3)的药物中的应用。

间充质干细胞外泌体在制备延缓脊髓小脑性共济失调3(SCA3)发病进程的药物中的应用。

优选地，所述间充质干细胞来源的外泌体用量为1.5×10⁹-1.5×10¹³外泌体/个体。

本发明还提供培养所述的间充质干细胞外泌体的培养基，包括以下组分：中国仓鼠卵巢细胞培养基(CD CHO培养基)、次黄嘌呤、胸腺嘧啶、左旋谷氨酸、右旋葡萄糖、非必需氨基酸和维生素。

优选地，所述非必需氨基酸包括：甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸。

优选地，所述维生素包括：维生素B2、氯化胆碱、d-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺素、肌醇。

优选地，所述培养基以中国仓鼠卵巢细胞培养基为基础培养液，还包括以下组分：次黄嘌呤30-150μM/L、胸腺嘧啶5-20μM/L、左旋谷氨酸2-15mM/L、右旋葡萄糖0.5-4g/L、甘氨酸30-120μM/L、L-丙氨酸30-120μM/L、L-天冬酰胺50-150μM/L、L-天冬氨酸50-150μM/L、L-谷氨酸50-150μM/L、L-脯氨酸50-150μM/L、L-丝氨酸50-150μM/L、维生素B2 0.005-0.05mg/L、氯化胆碱0.1-3mg/L、d-泛酸钙0.1-3mg/L、叶酸0.1-3mg/L、烟酰胺0.1-3mg/L、盐酸吡哆醛0.1-3mg/L、核黄素0.1-3mg/L、盐酸硫胺素0.1-3mg/L、肌醇0.5-4mg/L。

优选地，所述培养基，以中国仓鼠卵巢细胞培养基为基础培养液，还包括以下组分：次黄嘌呤100μM/L、胸腺嘧啶16μM/L、左旋谷氨酸8mM/L、右旋葡萄糖2g/L、甘氨酸100μM/L、L-丙氨酸100μM/L、L-天冬酰胺100μM/L、L-天冬氨酸100μM/L、L-谷氨酸100μM/L、L-脯氨酸100μM/L、L-丝氨酸100μM/L、维生素B2 0.01mg/L、氯化胆碱1mg/L、d-泛酸钙1mg/L、叶酸1mg/L、烟酰胺1mg/L、盐酸吡哆醛1mg/L、核黄素1mg/L、盐酸硫胺素1mg/L、肌醇2mg/L。

本发明的有益效果：本发明提供的间充质干细胞外泌体能有效改善SCA3转基因小鼠的运动协调能力，增加与运动功能相关的小脑浦肯野细胞数目，明显减少激活的星形胶质细胞激活。因此，本发明提供的间充质干细胞外泌体能作为治疗延缓脊髓小脑性共济失调3发病或延缓发病进行的活性物质。为治疗SCA3开发了一种新的药物途径。本发明为了减少培养液给后续提取的外泌体造成蛋白干扰，还开发了一种使用于本发明外泌体提取的培养基，其培养的干细胞培养液外泌体含量丰富，蛋白杂质含量低，提高了目的外泌体的纯度和质量。

附图说明

图1为间充质干细胞来源的外泌体鉴定示意图；其中：A为纳米粒子示踪法；B为采用western blot分析外泌体表面标志物CD63、TSG101及Alix均有表达；C：电子显微镜下可见外泌体为双层颗粒，直径约为100nm。

图2为小鼠尾静脉注射间充质干细胞来源的外泌体后，每两周进行一次Rotarod试验的结果及注射8周后各组小鼠浦肯野细胞免疫荧光染色分析：A：Rotarod转棒试验结果示意图，*P＜0.05，n＝8；B为利用Calbindin D28K免疫荧光标记各组同一小脑脑叶层面浦肯野细胞数目示意图；C为采用One-way ANOVA对浦肯野细胞免疫荧光结果进行定量分析结果示意图；*P＜0.05，n＝4。

图3为注射外泌体8周后小脑MBP蛋白免疫荧光及western blot表达结果：A为各组同一小脑脑叶层面分子层中MBP蛋白免疫荧光染色结果；B为采用One-way ANOVA对MBP蛋白免疫荧光结果进行定量分析；C为利用western blot分析各组小鼠小脑中MBP蛋白的表达情况；D为利用Image J软件对各组小鼠小脑中MBP蛋白与GAPDH蛋白的比值进行定量分析；*P＜0.05，n＝3。

图4为注射外泌体8周后小鼠桥脑中激活的星形胶质细胞及突变型ATXN3蛋白核内包涵体免疫荧光染色分析结果示意图；A为星形胶质细胞标志物GFAP与ATXN3蛋白特异性抗体1H9免疫荧光染色结果；B为采用One-way ANOVA对星形胶质细胞标志物GFAP免疫荧光结果进行定量分析；*P≤0.05；**P≤0.01；***P≤0.001；n＝3；C为采用One-way ANOVA对可激活星形胶质细胞或位于星形胶质细胞内的突变型ATXN3蛋白核内包涵体免疫荧光结果进行定量分析；****P≤0.0001；n＝3。

图5为外泌体分离提纯及注射后疗效评估全过程；A：间充质干细胞大量培养、上清液收集、阴离子层析法分离提纯外泌体并进行尾静脉注射的流程图；B：对SCA3转基因小鼠每月注射一次外泌体后每两周进行一次Rotarod试验以及注射8周后取材进行westernblot及免疫荧光染色分析的实验流程图。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例及其附图对本发明做进一步的详细描述。

以下实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

一、实验动物

本研究经中山大学附属第一医院动物伦理委员会批准同意，所有的动物处理措施都尽量减少动物伤害、并减少用于研究的动物数量。采用10周龄同窝生野生型正常小鼠和SCA3转基因小鼠，其中SCA3转基因小鼠的种鼠由中南大学湘雅医院江泓教授在TheJackson Laboratory购买并赠送，在广东省动物监测所饲养并与野生型C57BL/6J小鼠进行交配繁殖。

二、实验方法

1、间充质干细胞输注实验

对十周龄小鼠应用尾静脉注射的方式给予上述间充质干细胞外泌体1.5×10¹⁰/次/小鼠，4周后重复一次。8周后给予小鼠安乐死，取材实验。

2、小鼠旋转(Rotarod)实验

设置Rotarod转动棒速度为4-40rpm，加速时间为5分钟，记录小鼠从转动棒上掉落或四肢抱转动棒旋转超过两圈的时间，注射外泌体前及注射后每两周测试一次。

3、取材切片

注射外泌体8周后，采用4％多聚甲醛心脏灌注，然后用4％多聚甲醛进行后固定12-16小时，切片前用OCT包埋剂进行包埋，冰冻切片机进行冰冻切片，其中一半进行矢状切片，另一半进行冠状切片，厚度为15μm，后用于组织学染色或存放于-80℃冰箱。

4、免疫荧光染色

从-80℃冰箱取出上述切片，复温1小时；在1×PBS中静置1min，溶解残余的OCT包埋剂，将卷起的切片边缘铺平，置于37℃烘箱中烘干2h；置于枸橼酸盐缓冲液中，进行抗原修复，微波炉中火5min，冷水浴冷却20min；采用0.03％PBST(1×PBS+0.3％Triton 100)冰上破膜1小时；PBS洗三次，每次5min；用组化笔在切片周围画圈，加入封闭液，反应1小时；甩干玻片后，加入一抗(1：100-1:300)，将玻片置于湿盒里，4℃冰箱反应过夜；次日室温复温6h；1×PBS洗3次，每次5min；擦干玻片，加入二抗，常温反应1h；1×PBS洗3次，每次5min；采用含DAPI的抗荧光淬灭剂进行封片。

5、Western blot蛋白检测

(1)缓冲液的配制方法

(A)组织蛋白裂解液的配置：将RIPA蛋白裂解液与PMSF蛋白酶抑制剂按照100：1比例配置，在冰上进行，现配现用。

(B)APS的配置：配置10％APS溶液，称取0.1g APS粉剂溶于1ml超纯水中，分装并于-20℃冰箱中保存。

(C)10×的电泳缓冲液：甘氨酸144g+Tris base 30.3g+SDS 10g+去离子水定容至1000ml，室温保存。

(D)1×的电泳缓冲液：取100ml 10×电泳缓冲液，加入900ml去离子水配成1000ml1×电泳缓冲液，现配现用。

(E)10×的转膜缓冲液：甘氨酸144g+Tris base 30.3g+去离子水定容至1000ml，室温保存。

(F)1×的转膜缓冲液：10×的转膜液100ml+甲醇200ml+去离子水700ml，定容至1000ml现配现用。

(G)10×TBS缓冲液：Tris base 24.2g+NaCl 80g+去离子水定容至1000ml，室温保存。

(H)1×TBST缓冲液：10×TBS 100ml+Tween-20 1ml+去离子水定容至1000ml，室温配置保存。

(I)5％脱脂牛奶封闭液：BSA 2.5g+1×TBST定容至50ml现配现用。

(J)浓缩胶配方：ddH₂O 4.1ml+30％聚丙烯酰胺凝胶1.0ml+1M Tris-HCL(pH 6.8)0.+10％SDS 60μl+10％APS 60μl+TEMED 6μl。

(K)10％分离胶配方：ddH₂O 4ml+30％聚丙烯酰胺凝胶3.3ml+1.5M Tris-HCl(pH8.8)+2.5ml 10％SDS 100μl+10％APS 100μl+TEMED 4μl。

(2)蛋白提取

(A)采用冰生理盐水进行小鼠心脏灌注后，取新鲜冰冻脑组织，按照100μl/10mg重量加入RIPA蛋白裂解液并进行研磨，并用超声仪进行超声裂解，静置30min；

(B)4℃离心机12000rpm离心20分钟，上清即为蛋白，将上清吸至另一EP管中-80℃保存。

(C)采用BCA法测蛋白浓度；参照BCA蛋白浓度检测试剂盒说明书配置标准品，浓度分别为0、25、125、250、500、750、1000、1500、2000μg/ml；按50：1的比例将溶剂A与溶剂B混合配置适量的BCA工作液；在96孔板中，标准品及样品均设3个副孔，每孔加入10μl标准品或者1ul待测样品+9ul RIPA蛋白裂解液，每孔加入200μl BCA工作液，37℃孵育30分钟；利用酶标仪测定样品在562nm的吸光光度值并根据标准品绘制的浓度，并确保R²>0.98；根据标准曲线计算出待测样本蛋白3个副孔的平均浓度；采用计算的样本浓度×10/1000及最终浓度单位为μg/ul。

(3)Western blot

(A)蛋白变性：根据浓度，计算50μg蛋白量，并配置至相同体积，加入5×SDSloading buffer使其终浓度为1×，沸水浴5min；根据上述浓缩胶及分离胶配方，或参照PAGE凝胶快速制备试剂盒说明书，分别配置浓缩胶及10％或12.5％的SDS-PAGE胶，室温静置30min待胶凝固；蛋白上样及电泳上样：配制好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳液，拔去齿梳，加入蛋白Marker及蛋白样品；

(B)电泳：与连接恒压电泳仪，浓缩胶电泳时恒压80V，待样品电泳进入分离胶后，将电压改为120V恒压，继续电泳直到溴酚蓝接近于胶底面时停止电泳；

(C)转膜：取下凝胶，将PVDF膜放入甲醇中10s中后，放入1×转膜液中，按从滤纸、胶、膜、滤纸顺序夹好后放入槽内，倒入转膜液，将槽置于冰水泡沫盒中，转膜条件为300mA，90-120min；

(D)封闭：转膜结束后，取出PVDF膜，用封闭液室温摇床上封闭1h；

(E)抗体孵育：抗体用封闭液按适当比例(通常1:1000)配置好后，在抗体孵育盒内4℃孵育过夜。取出膜，用TBST洗涤3次，每次10分钟；用封闭液配置二抗，室温摇床上孵育1小时，然后用TBST洗涤3次，每次10分钟；

(F)显影：将ECL发光液中A液和B液按1:1混合配置显影工作液；取适量滴到PVDF膜上并浸泡数秒，用化学发光分析系统对图像进行采集。

(4)统计学分析

采用IMageJ软件进行细胞数数及western blot条带分析；采用6.0Graphpadprism进行作图，全部数据均在SPSS 21.0软件上进行统计分析，所有数据采用均数±标准差形式显示。对3组小鼠的Rotarod表现、浦肯野细胞数目、MBP蛋白、星形胶质细胞及核内包涵体等生物学指标，采用One-way ANOVA进行统计分析，P≤0.05表示差异存在统计学意义。

实施例1间充质干细胞来源的外泌体分离提纯及鉴定

1.细胞培养上清的获取

复苏一管从诱导性多能干细胞诱导分化来的间充质干细胞到两个150cm²的培养皿中，并在含血清的细胞培养基(cell culture medium，CCM)中培养，2-3天后，细胞密度达到80％时，传代到25个150cm²的培养皿中，继续培养3-4天，细胞用PBS洗三次，将培养液更换为成份明确的无蛋白培养液(chemically-defined and protein-free,CDPF)，6小时后，弃掉细胞上清，再加新的CDPF继续培养42小时，收上清。将离心机预冷至4℃，将细胞培养皿中的CDPF上清转移至50mL离心管中，进行离心(2650g，20min，4℃)；将离心后的细胞培养上清转移到样品收集瓶中，将样品放到4℃冰箱中保存。

CDPF培养液配方如下

表1

表2

成份	分子量	浓度(mg/L)
			Choline chloride，氯化胆碱		100.0
D-Calcium pantothenate，d-泛酸钙	477.0	100.0
			Folic Acid，叶酸	441.0	100.0
Nicotinamide，烟酰胺		100.0
			Pyridoxal hydrochloride，盐酸吡哆醛		100.0
Riboflavin，核黄素		10.0
			Thiamine hydrochloride，盐酸硫胺素		100.0
i-Inositol，肌醇		200.0

此培养液成份明确，而且不含蛋白，不会因培养液给后续提取的外泌体造成蛋白干扰，而且其培养的干细胞培养液外泌体含量丰富。

2.阴离子交换层析法制备干细胞外泌体

(1)所有用品喷酒精后放置入生物安全柜；

(2)在层析柱中加入平衡溶液，将同量凝胶轻柔重悬后均匀加入层析柱中，打开塞子排空层析柱中的液体，使凝胶均匀地沉淀在层析柱底部；

(3)轻柔加入3倍平衡溶液清洗缓冲凝胶，待平衡溶液缓慢流完；

(4)根据样品中外泌体浓度加入适量的样品；

(5)待上样完毕后，缓慢加入10倍平衡溶液体积的洗涤溶液至层析柱中；

(6)缓慢加入洗脱液至层析柱中，将洗脱液收集至样品收集管中，重复上述步骤8次，并依次收集洗脱液；

(7)通过检测样品中考马斯亮蓝法检测蛋白质浓度和ELISA检测CD63的表达水平，对各管洗脱液中外泌体浓度进行鉴定，依据检测结果，确定富含外泌体的洗脱液批次，将高浓度的混合后进行透析；

(8)将外泌体样本用PBS(样本：PBS＝1：100)进行透析过夜；

(9)用蛋白浓缩管浓缩外泌体样本；

(10)利用蛋白质浓度检测法和Nanosight分别检测外泌体样本的蛋白质浓度颗粒浓度；

(11)将样品分装冻存于-80℃。

实施例2间充质干细胞外泌体的鉴定

1.Nanosight检测

(1)用洁净的PBS溶液按1：100稀释干细胞外泌体样本；

(2)将释释后的外泌体样本用NS300 Nanosight仪器进行检测，每个样本检测3次，每次30s；

(3)仪器根据3次检测得到的外泌体浓度进行计算，得出平均的外泌体浓度。

2.电镜分析

(1)将外泌体样本用2％的戊二醛进行固定30min；

(2)吸取10μL固定后的外泌体样本至铜网上，2min后用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体；

(3)滴加3％磷钨酸(pH＝7.0)于铜网，2min后用滤纸从铜网边缘吸去多余的染液；

(4)滴加纯水于铜网，用滤纸从铜网边缘吸取多余的水，等晾干后使用透射电镜(H7650；HITACHI)进行观察拍照。

3.流式分析

(1)将20μL外泌体样本与200μL包被anti-CD63抗体的磁珠于4℃孵育过夜；

(2)用200μL MACS Buffer去除多余的外泌体样本，然后用50μL MACS Buffer重悬磁珠，加入PE-CD9,FITC-CD63和APC-CD81各10μL，孵育30min；

(3)用200μL MACS Buffer去除多余的流式抗体，使用流式分析仪进行分析。

4.Western blot分析

同上，检测外泌体的标记蛋白CD63、TSG101、Alix

实施例3间充质干细胞来源的外泌体延缓运动症状及小脑退行性变的发生

本实施例验证间充质干细胞来源的外泌体对SCA3转基因小鼠的运动功能及与其相关的浦肯野细胞凋亡、脱髓鞘现象有无改善作用。

一、间充质干细胞来源的外泌体对SCA3转基因小鼠的运动疗效评估

1、实验方法

采用上述Rotarod试验对注射了外泌体的SCA3转基因小鼠(Exosome-Tg)、未注射外泌体的SCA3转基因小鼠(Contron-Tg)以及正常小鼠(Contron-Wt)的运动协同能力进行检测。

2、实验结果

小鼠经尾静脉注射上述间充质干细胞外泌体1.5×10¹⁰/次/小鼠2周后3组小鼠的Rotarod表现无明显差异。注射外泌体4周后，未注射外泌体的SCA3转基因小鼠Rotarod表现开始变差，而注射了外泌体的SCA3转基因小鼠与正常小鼠的Rotarod表现均处于正常水平(P>0.05)。注射外泌体6周后，未注射外泌体的SCA3转基因小鼠Rotarod表现进一步恶化，但注射了外泌体的SCA3转基因小鼠与正常小鼠的Rotarod表现仍处于正常水平(P≤0.05)。注射外泌体8周后，注射了外泌体的SCA3转基因小鼠Rotarod表现开始变差，但仍明显优于未注射外泌体的SCA3转基因小鼠(P≤0.05)(图2.A)。

二、间充质干细胞来源的外泌体对SCA3转基因小鼠浦肯野细胞数目的影响

1、实验方法

采用上述免疫荧光染色分析3组小鼠与运动功能相关的小脑浦肯野细胞数目。

2、实验结果

注射外泌体8周后，未注射外泌体的SCA3转基因小鼠浦肯野细胞数目明显减少，而注射了外泌体的SCA3转基因小鼠浦同一小脑脑叶层面的浦肯野细胞数目与正常小鼠相仿(P≤0.05)(图2.B-C)

三、间充质干细胞来源的外泌体对SCA3转基因小鼠脱髓鞘改变的影响

1、实验方法

采用免疫荧光染色及western blot分析3组小鼠小脑脱髓鞘现象。

2、实验结果

注射外泌体8周后，未注射外泌体的SCA3转基因小鼠小脑分子层中神经轴索周围髓鞘中的MBP蛋白明显减少，而注射了外泌体的SCA3转基因小鼠浦同一小脑脑叶层面的MBP蛋白荧光强度及蛋白表达量均与正常小鼠相仿(P≤0.05)(图3.A-D)。

实施例4间充质干细胞来源的外泌体抑制星形胶质细胞激活而对核内包涵体无影响

本实施例验证间充质干细胞来源的外泌体能否减少SCA3转基因小鼠星形胶质细胞激活及突变型ATXN3蛋白核内包涵体。

1、实验方法

采用上述免疫荧光染色分析3组小鼠脑干中星形胶质细胞激活及突变型ATXN3蛋白核内包涵体现象。

2、实验结果

注射外泌体8周后，未注射外泌体的SCA3转基因小鼠脑干中激活的星形胶质细胞较正常小鼠明显增多(P≤0.001)，而注射了外泌体的SCA3转基因小鼠脑干中激活的星形胶质细胞明显少于未注射外泌体的SCA3转基因小鼠(P≤0.01)，但仍明显多于正常小鼠(P≤0.05)(图4.A-B)。然而，上述2组SCA3转基因小鼠脑干中核内包涵体的数目无明显差异(P>0.05)，且均显著多于正常小鼠(P≤0.0001)(图4.A,C)。

实施例5～7

实施例5～7提供一种培养间充质干细胞来源的外泌体培养基，其配方如下表：

上表将实施例1、5～7中的培养基组分进行对比。

对比例1

对比例1与实施例1的唯一区别在于对比例1中的培养基不含有非必需氨基酸。

对比例2

对比例2与实施例1的唯一区别在于对比例1中的培养基不含有维生素。

检测实施例1、5～7培养获得的外泌体的标记蛋白CD63、TSG101、Alix，结果显示，与实施例1、5～7相比，对比例1、2未检测出标记蛋白CD63、TSG101、Alix的表达，同时还含有多种杂质蛋白。由此说明，本发明培养基中的组分具有协同增效作用，缺少其中任一组分均不能成功获得间充质干细胞外泌体。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，如其中间充质干细胞不仅仅限于多能干细胞诱导来源的，其它诸如骨髓、脂肪、脐带、胚胎、牙龈、牙髓、胚胎干细胞等来源或诱导来的间充质干细胞提取的外泌体都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种培养间充质干细胞外泌体的培养基，其特征在于，所述培养基以CD CHO培养基为基础培养液，所述基础培养液中加入以下组分：次黄嘌呤30-150μM/L、胸腺嘧啶5-20μM/L、左旋谷氨酸2-15mM/L、右旋葡萄糖0.5-4g/L、非必需氨基酸混合液和维生素溶液混合液；

所述非必需氨基酸混合液由以下组分组成：甘氨酸30-120μM/L、L-丙氨酸30-120μM/L、L-天冬酰胺50-150μM/L、L-天冬氨酸50-150μM/L、L-谷氨酸50-150μM/L、L-脯氨酸50-150μM/L和L-丝氨酸50-150μM/L；

所述维生素溶液混合液由以下组分组成：维生素B2 0.005-0.05mg/L、氯化胆碱0.1-3mg/L、d-泛酸钙0.1-3mg/L、叶酸0.1-3mg/L、烟酰胺0.1-3mg/L、盐酸吡哆醛0.1-3mg/L、盐酸硫胺素0.1-3mg/L和肌醇0.5-4mg/L。

2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，以CD CHO培养基为基础培养液，所述基础培养液中加入以下组分：次黄嘌呤100μM/L、胸腺嘧啶16μM/L、左旋谷氨酸8mM/L、右旋葡萄糖2g/L、非必需氨基酸混合液和维生素溶液混合液；

所述非必需氨基酸混合液由以下组分组成：甘氨酸100μM/L、L-丙氨酸100μM/L、L-天冬酰胺100μM/L、L-天冬氨酸100μM/L、L-谷氨酸100μM/L、L-脯氨酸100μM/L和L-丝氨酸100μM/L；

所述维生素溶液混合液由以下组分组成：维生素B2 0.01mg/L、氯化胆碱1mg/L、d-泛酸钙1mg/L、叶酸1mg/L、烟酰胺1mg/L、盐酸吡哆醛1mg/L、盐酸硫胺素1mg/L和肌醇2mg/L。

3.间充质干细胞外泌体在制备治疗脊髓小脑性共济失调3型的药物中的应用，其特征在于，所述间充质干细胞外泌体的制备方法为：

(1)复苏从诱导性多能干细胞诱导分化来的间充质干细胞，并在含血清的细胞培养基中培养至细胞密度达到80％时，传代，继续培养3-4天，细胞用PBS洗，将培养基更换为权利要求1或2所述的培养间充质干细胞外泌体的培养基，培养6小时后，弃掉细胞上清，再加权利要求1或2所述培养间充质干细胞外泌体的培养基继续培养42小时，收上清；650g、4℃条件下离心20min；取离心上清，即得外泌体上清；

(2)将所得外泌体上清通过阴离子交换层析法制备干细胞外泌体，即成。

4.间充质干细胞来源的外泌体在制备延缓脊髓小脑性共济失调3型发病进程的药物中的应用，其特征在于，所述间充质干细胞外泌体的制备方法为：

5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞来源的外泌体用量为1.5×10⁹-1.5×10¹³外泌体/个体。