CN113303280A - 建立小鼠腹透腹膜损伤模型的方法及BMSCs外泌体的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种建立小鼠腹透腹膜损伤模型的方法，将腹膜炎患者透析后的腹透流出液注射到小鼠腹腔内。进一步以所建立的小鼠腹透腹膜损伤模型为基础，不断研究可治疗腹透相关性腹膜损伤的治疗方法，最后通过动物实验明确外泌体修复腹透腹膜损伤的作用、摸索最优治疗途径、时机、剂量、频次和疗程，为应用外泌体防治腹透腹膜纤维化奠定坚实理论基础，也为未来解决腹透腹膜纤维化导致过早腹膜失功的重要临床问题提供创新有效安全的方法。

Description

建立小鼠腹透腹膜损伤模型的方法及BMSCs外泌体的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及建立小鼠腹透腹膜损伤模型的方法及BMSCs外泌体的应用。

背景技术

腹膜透析(Peritoneal Dialysis，PD)是目前终末期肾病患者广泛采用的重要肾脏替代治疗方式之一，是利用腹膜半透膜生物学特性进行溶质、毒素和水分清除的治疗模式。腹膜透析具有对血流动力学影响小、保护残余肾功能、操作简单、价格相对低廉、保持更好的生活质量等独特优势。随着腹膜透析技术的推广，我国腹膜透析人数和规模呈不断上升的趋势。然而，多数腹透患者往往由于腹透相关性腹膜炎、长期腹透流出液高糖暴露等原因而发生腹膜结构和功能损伤，最终导致腹膜纤维化、超滤衰竭而不得不提前终止腹透治疗。腹膜纤维化发展的主要危险因素是腹膜反复暴露于生物不相容性的腹膜透析液(葡萄糖、葡萄糖降解产物(乙二醛、甲醛、3-脱氧葡糖酮、甲基乙二醛))引起的腹膜间皮细胞功能改变及增殖，以及感染或腹透流出液长期刺激下导致的以免疫细胞浸润为特征的急慢性炎症，二者往往相互促进导致腹膜结构功能进一步损伤。目前，预防或延缓腹透相关性腹膜纤维化尚无有效方法。因此，研发腹透相关性腹膜损伤修复方法和治疗药物显得至关重要。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种建立小鼠腹透腹膜损伤模型的方法，还提供一种BMSCs外泌体在制备腹透腹膜损伤疾病的药物中的新应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.一种建立小鼠腹透腹膜损伤模型的方法，所述方法的具体步骤为：将人腹膜炎腹透流出液注射到小鼠腹腔内。

进一步，所述腹透流出液为腹膜炎患者透析后的液体经离心、细菌过滤得到的。

进一步，腹膜炎患者腹透流出液的纳入标准为：

a.首次入院夜间留腹；b.未使用抗生素；c.腹水培养革兰氏阴性杆菌；d.腹水检测白介素-6>5000pg/ml，降钙素原>0.3ng/ml、内毒素>0.1EU/mL。

进一步，腹腔注射人腹膜炎腹透流出液0.1mL/g，每日1次，持续4-6周。

2.BMSCs外泌体在制备腹透腹膜损伤疾病的药物中的应用。

进一步，所述BMSCs外泌体来源于BMSCs细胞培养上清液。

进一步，所述BMSCs外泌体的制备方法为：取BMSCs细胞培养上清液，2000-3000g 4℃离心30min，取上清；上清经0.22μm滤膜过滤，滤液经100,000-120,000g 4℃超速离心1.5-2h；用相同体积的预冷PBS重悬沉淀，悬液经4℃100,000-120,000g离心1.5-2h；沉淀再用预冷PBS重悬即可。

进一步，所述BMSCs外泌体的制备方法为：取BMSCs细胞培养上清液，2000g 4℃离心30min，取上清；上清经0.22μm滤膜过滤，滤液经120,000g 4℃超速离心2h；用相同体积的预冷PBS重悬沉淀，悬液经4℃120,000g离心2h；沉淀再用预冷PBS重悬即可。

进一步，所述BMSCs外泌体的应用方法为腹腔注射。

进一步，BMSCs外泌体腹腔注射量为按体重计100μg/kg/次。

本发明的有益效果在于：本发明首次通过将腹膜炎患者腹透流出液注射到小鼠腹腔建立起小鼠腹透相关性腹膜损伤模型的方法，为临床研究腹膜透析相关性腹膜损伤相关内容奠定基础。进一步以所建立的小鼠腹透腹膜损伤模型为基础，不断研究可治疗腹膜透析腹膜损伤的方法，最后通过动物实验明确外泌体修复腹透腹膜损伤的作用、摸索最优治疗途径、时机、剂量、频次和疗程，为应用外泌体防治腹透腹膜纤维化奠定坚实理论基础，也为未来解决腹透腹膜纤维化导致过早腹膜失功的重要临床问题提供创新有效安全的方法。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为通过流式细胞术检测BMSCs表面标志(CD29、CD44、CD34、CD11b)的结果，其中A为CD29，B为CD44，C为CD11b，D为CD34的流式检测结果。

图2为BMSCs形态及BMSCs成脂、成骨、成软骨三种诱导分化的鉴定结果，其中A为倒置显微镜下观察BMSCs形态；B为小鼠BMSCs成脂诱导油红O染色；C为小鼠BMSCs成骨诱导茜素红染色；D为小鼠BMSCs成软骨诱导阿利辛蓝染色，×200倍。

图3为BMSCs外泌体的鉴定结果，其中A为透射电镜下观察外泌体形态，B、C、D依次为WB检测外泌体标志蛋白：CD9(22KD)、CD63(26KD)和TSG101(44KD)。

图4为人腹膜炎腹透流出液诱导小鼠腹透腹膜损伤模型的建立及外泌体干预方法的实验流程图。

图5为BMSCs外泌体抑制腹透腹膜损伤小鼠的腹膜纤维化结果。其中A为不同组小鼠腹膜组织的Masson染色，B、C、D依次为α-SMA、Collagen-I、Collagen-III免疫组化染色，字母后面的数字分别指代对应的实验组数，后同。

图6为各实验组数据分析柱形图，其中A为不同组小鼠腹膜厚度比较；B为不同组小鼠腹膜组织免疫组化α-SMA阳性面积百分比；C为不同组小鼠腹膜组织免疫组化Collagen-I阳性面积百分比；D为不同组小鼠腹膜组织免疫组化Collagen-III阳性面积百分比。

图7为不同组小鼠腹膜组织中α-SMA(A)、Collagen-I(B)、Collagen-III(C)、TGF-β1(D)的qRT-PCR数据分析柱形图(*P<0.05或**P<0.01或***P<0.001)。

图8为不同组小鼠腹膜组织的免疫组化染色图和不同组小鼠腹膜组织免疫组化阳性细胞率数据分析图，其中A、B、C组图片依次为CD68、F4/80、MPO染色结果；D、E、F依次为不同组小鼠腹膜组织免疫组化CD68、F4/80、MPO阳性细胞率。

图9为不同组小鼠腹膜组织中IL-1β(A)，IL-6(B)，TNF-α(C)的qRT-PCR分析(*P<0.05或**P<0.01或***P<0.001)，×200。

图10为不同组小鼠腹膜组织的免疫组化染色(CA125)和免疫荧光染色(E-Cadherin、Ki-67共染)结果。其中A为不同组小鼠腹膜组织CA125的免疫组化染色，×200。B-D为不同组小鼠腹膜组织的免疫荧光染色(E-Cadherin、Ki-67共染)，×600。

图11为不同组小鼠腹膜组织GS1-lectin、VEGF表达免疫组化结果，其中A、B依次为不同组小鼠腹膜组织GS1-lectin、VEGF表达的免疫组化染色，C为不同组小鼠腹膜组织免疫组化GS1-lectin阳性面积百分比；D为不同组小鼠腹膜组织免疫组化VEGF阳性面积百分比；E为不同组小鼠腹膜组织中VEGF的qRT-PCR分析(*P<0.05或**P<0.01或***P<0.001)，×200。

图12为BMSCs外泌体保护腹透腹膜损伤小鼠的腹膜超滤功能实验结果，其中A为不同组小鼠腹膜组织AQP-1的免疫组化染色，×200。B为不同组小鼠腹膜超滤功能通过净超滤量来评估。C为不同组小鼠腹膜溶质交换功能葡萄糖浓度比(D/D0)，D为不同组小鼠尿素氮浓度比(D/P)。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

研究对象与标本收集

1、BMSCs提取与鉴定：

(1)小鼠BMSCs(骨髓间充质干细胞)原代分离：

小鼠通过脱颈断髓法处死，在75％乙醇中浸泡10min，转移至超净工作台中，无菌条件下取出双侧胫骨和股骨放入盛有无菌PBS的培养皿中。用剪刀和镊子清除骨头上的肌肉组织，并剪除胫骨和股骨骨骺两端。用1ml无菌空针吸入培养基，再插入骨骺端反复冲洗骨髓腔，用移液枪吹打细胞悬液。静置5min后，分离的原代BMSCs在无菌培养皿中以5％CO₂、恒温(37℃)恒湿的孵箱环境中培养，24h后光镜下观察细胞状态并更换培养基。隔天换液并传代培养至第3代～第4代，24h后留取细胞上清液(共200ml)以提取外泌体，余下细胞进行BMSCs鉴定或液氮冻存备用。

(2)小鼠BMSCs的鉴定：

①流式细胞术鉴定BMSCs表面标志物：BMSCs消化贴壁细胞，终止消化后，用移液枪吹打贴壁细胞，并转移至15ml离心管中，340g离心10min，弃上清。加入500μl无菌PBS重悬细胞，将细胞悬液取出计数，共分5个EP管分装细胞(分别为空白管、CD29、CD44、CD34、CD11b)，最后每管5×10⁶个/100μl。避光条件下将每管荧光抗体按1：100的比例稀释，将加有抗体的EP管用锡箔纸包住，放入37℃培养箱中孵育30min。取出EP管，每管加入1ml无菌PBS后离心92g离心5min。去上清，再加入PBS清洗一遍。去上清，每管加入200μl无菌PBS重悬细胞，流式细胞术鉴定表达情况。

图1为通过流式细胞术检测BMSCs表面标志(CD29、CD44、CD34、CD11b)的结果，其中A为CD29，B为CD44，C为CD11b，D为CD34，结果显示表达CD29、CD44，不表达CD11b、CD34。

②小鼠BMSCs成脂诱导分化培养：根据成脂诱导分化培养试剂盒(MUBMX-90031)说明书进行操作，BMSCs铺皿，细胞融合达100％或过度融合时，弃去原培养基，添加成脂诱导分化培养基。使用成脂诱导分化培养基诱导16-27天，直到脂滴形态足够大、圆。成脂诱导结束，用油红O进行染色。倒置显微镜下观察结果。

③小鼠BMSCs成骨诱导分化培养：根据成骨诱导分化培养试剂盒(MUBMX-90021)说明书进行操作，BMSCs铺皿，细胞融合达80％以上后，弃去原培养基，添加成骨诱导分化完全培养基。诱导分化2-4周后，视细胞形态变化及生长情况，用茜红进行染色。倒置显微镜下观察结果。

④小鼠BMSCs成软骨诱导分化培养：根据成软骨诱导分化培养试剂盒(MUBMX-90041)说明书进行操作，BMSCs铺皿，细胞融合达80％以上后，用胰酶对细胞进行消化并计数。将4×10⁵个细胞转移到15ml离心管中，250g离心5min。吸去上清，重悬上一步所得沉淀。室温下150g离心5min，重复上述步骤，再次清洗。将上一步所得沉淀用成软骨诱导分化培养基重悬，在5％CO₂，37℃的孵箱环境中培养。持续21-28天后，可对软骨球进行固定和石蜡包埋切片，用阿利辛蓝染色。倒置显微镜下观察结果。

图2为BMSCs形态及BMSCs成脂、成骨、成软骨三种诱导分化的鉴定结果，其中A为倒置显微镜下观察BMSCs形态；B为小鼠BMSCs成脂诱导油红O染色；C为小鼠BMSCs成骨诱导茜素红染色；D为小鼠BMSCs成软骨诱导阿利辛蓝染色，放大倍数，×200倍。由图证实所提取细胞为BMSCs。

实施例2

外泌体的分离、提纯与鉴定(与上海吉凯基因医学科技股份有限公司合作)：从小鼠BMSCs上清液中分离提纯外泌体，采用目前使用最为广泛的分离方法即超速离心法，主要依赖其形态学特征、颗粒大小、标志性蛋白(CD9、CD63、TSG101)等对外泌体进行鉴定，本研究主要采用鉴定方法包括：①透射电子显微镜(TEM)；②蛋白质印迹技术(WB)。

(1)超速离心法提取外泌体：200ml BMSCs上清液在4℃或冰上解冻，2000g 4℃离心30min，取上清；上清经0.22μm滤膜过滤，滤液经120,000g 4℃超离2h；小心的吸取上清(备留)，不要搅动沉淀；用相同体积的预冷PBS重悬沉淀，悬液经4℃120,000g离心2h；小心的吸取上清(备留)，沉淀用200μL预冷PBS重悬。从中提取外泌体共计1ml，根据BCA定量计算外泌体浓度为1.7mg/mL,4℃保存(不超过3天)或-20℃/-80℃保存(长期)。

(2)外泌体样品透射电镜观察：取20μl外泌体悬液，滴在固定好的碳网上，室温静置20min；静置20min后，小心的用滤纸将多余的外泌体悬液吸干；取20μl 2％的磷钨酸滴在碳网上，静置20s；小心的用滤纸将多余的磷钨酸吸干，将碳网放到铺有滤纸的玻璃皿中，等待上机观察拍照即可。

(3)外泌体样本WB标志物检测：使用经典外泌体标志物CD9(abcam，ab92726，稀释比例1：500)、CD63(abcam，ab216130，稀释比例1：200)、TSG101(sinobiological，102286-T38，稀释比例1：500)进行外泌体鉴定。按照WB实验步骤进行操作，采用10％浓度SDS-PAGE分离胶，蛋白上样量为40μg，二抗使用Rabbit IgG(Santa Cruz，sc-2004，稀释比例1：2000)，Mouse IgG(Santa Cruz，sc-2005，稀释比例1：2000)。

图3为BMSCs外泌体的鉴定结果，其中A为透射电镜下观察外泌体形态，B、C、D依次为WB检测外泌体标志蛋白：CD9(22KD)、CD63(26KD)和TSG101(44KD)。由图3中A透射电镜结果可见典型的杯托状外泌体结构。B、C、D的WB检测结果可见外泌体标志蛋白CD9、CD63和TSG101均表达，证实所得样品结果符合BMSCs外泌体鉴定标准。

实施例3

人腹膜炎腹透流出液诱导小鼠腹透腹膜损伤模型的建立及外泌体治疗小鼠腹透相关性腹膜损伤

人腹膜炎腹透流出液的选择：收集符合入选标准的腹透相关性腹膜炎病人透析后的腹透流出液，然后进行离心(948g或3000r/min,4℃,15min)、细菌过滤，-80℃分装保存，使用前于37℃恒温水浴箱复温。收集的人腹膜炎腹透流出液纳入标准主要包括：①首次入院夜间留腹；②未使用抗生素；③腹水培养革兰氏阴性杆菌；④腹水检测白介素-6(IL-6)>5000pg/ml,降钙素原(PCT)>0.3ng/ml、内毒素>0.1EU/mL，以及其他生化指标，如糖浓度、尿素、电解质、肌酐、渗透压等，但对本发明意义不大所以未列出。

透析液体主要成分为：钠(132mmol/L)、氯(103mmol/L)、钙(1.25-1.75mmol/L)、镁(0.25-0.75mmol/L)、乳酸钠(40mmol/L)和葡萄糖(1.5％,2.5％和4.25％三种浓度选择，含糖浓度越高，渗透性越大；因高糖刺激大，目前基本不使用4.25％浓度)。

透析方法：原理是将透析液体注入腹腔内，利用腹膜作为透析膜，通过腹膜毛细血管腔内的血液与透析液进行广泛的物质交换，以达到清除体内代谢产物和毒物，纠正水电解质、酸碱平衡失调的目的。患者通过腹透导管每次将2L透析液体灌入成人腹腔并在腹腔内停留一段时间(日间为4-8h，夜间为8-12h)，每次留腹结束后通过腹透导管将液体排出得到腹透流出液，并灌入新鲜的透析液体，此过程每天重复3-5次。

人腹膜炎腹透流出液诱导小鼠腹透腹膜损伤模型的建立及外泌体干预方法：将8周大的雄性C57BL/6小鼠(斯贝福北京生物技术有限公司购入)随机分为3组：(1)第1组(生理盐水(对照组,Saline，n＝8)：腹腔注射生理盐水(0.1mL/g)，每日1次，持续6周；(2)第2组(人腹膜炎腹透流出液组，Peritonitis effluent，n＝34)：腹腔注射人腹膜炎腹透流出液(按小鼠体重计0.1mL/g)，每日1次，持续6周；(3)第3组(人腹膜炎腹透流出液+外泌体组，Peritonitis effluent+Exos，n＝16)：腹腔注射小鼠腹膜炎腹透流出液(0.1mL/g，每天一次，持续6周)，并在第4周末(第28天)、第5周末(第35天)分别予以BMSCs外泌体进行干预一次(100μg/kg/次，溶于2ml生理盐水，腹腔注射)。详见图4。本发明是先通过研究发现在小鼠腹腔注射腹透相关性腹膜炎病人的腹透流出液可建立小鼠腹透腹膜损伤模型，再进一步研究其治疗方法。本着简明扼要及实验平行比较，再此只叙述外泌体治疗小鼠腹透相关性腹膜损伤中实验中的小鼠腹透腹膜损伤模型建立，之前的实验内容不再重复。

样本收集：在第6周末建模结束后留取样本，在处死小鼠之前，进行改良的腹膜平衡试验(详见实施例5中改良腹膜平衡实验)以评估腹膜超滤及溶质转运功能。实验结束后，立即收集颈静脉血样和腹腔内液体。同时收集保存小鼠腹膜组织，将一部分腹膜组织立即放入液氮中急冻，然后保存在-80℃冰箱以备实时定量PCR(qRT-PCR)检测。另一部分用4％多聚甲醛固定，然后进行石蜡包埋，制成3μm石蜡切片，进行组织学、免疫组化和免疫荧光分析。

实施例4

人腹膜炎腹透流出液诱导小鼠腹透腹膜损伤模型的鉴定及外泌体治疗小鼠腹透相关性腹膜损伤的应用

1、组织学、免疫组化与免疫荧光

留取的腹膜组织进行石蜡包埋，制成3μm石蜡切片进行Masson染色和PAS染色，然后在光学显微镜下进行观察。并进行免疫组化染色检测腹膜组织纤维化标志(α-SMA、Collagen-I、Collagen-III)、间皮细胞标志(CA125)、中性粒细胞标志(MPO)、巨噬细胞标志(CD68、F4/80)，血管新生标志(GS1-lectin)、水通道蛋白(AQP-1)。腹膜厚度通过Masson染色测量间皮下弹力纤维厚度(每个样本随机选择8个视野，每个视野计数8次，取平均值)来进行定量评估。免疫组化染色分别通过阳性细胞率(腹膜间皮下区域组化染色阳性细胞数/总细胞数，每个样本随机选择6个视野，取平均值)和阳性面积百分比(阳性区域面积/腹膜间皮下区域总面积，每个样本随机选择6个视野，取平均值)来进行定量评估。免疫荧光进行腹膜间皮标志物E-cadherin和Ki-67共染，验证腹膜间皮细胞有无增殖修复。

2、腹膜组织定量分析

qRT-PCR检测各组小鼠腹膜组织纤维化标志(TGF-β1、α-SMA、Collagen-I、Collagen-III)、炎症标志(IL-1β、IL-6、TNF-α)、血管新生标志(VEGF)基因的mRNA表达。按照说明书的操作步骤，先通过TRIzol方法(Ambion，美国)从冷冻的腹膜组织样品中提取总RNA，然后使用PrimeScript RT试剂盒(Takara,日本)对提取的RNA(2μg)进行反转录。最后使用

qPCR Master Mix试剂盒(Promega，美国)进行PCR扩增，所得结果通过CFXManager^TM Software Version 3.1(Bio-Rad，美国)软件进行分析。利用GAPDH对每个样品的mRNA表达进行校正，并且每个样品重复测量3次。每个样本的qRT-PCR结果都以生理盐水组为参照组，表示为生理盐水组mRNA表达的N倍。所需引物序列详见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

实施例5 BMSCs外泌体治疗小鼠腹透相关性腹膜损伤

1、BMSCs外泌体抑制腹透腹膜损伤小鼠腹膜纤维化

图5为BMSCs外泌体抑制腹透腹膜损伤模型小鼠的腹膜纤维化结果。其中A为不同组小鼠腹膜组织的Masson染色，B、C、D依次为α-SMA、Collagen-I、Collagen-III免疫组化染色，字母后面的数字分别指代对应的实验组数，后同。通过PAS染色和Masson染色方法直接观察小鼠腹膜的组织学特征，包括腹膜的细胞成分和腹膜厚度。Masson染色结果显示人腹膜炎腹透流出液+外泌体组小鼠腹膜厚度明显低于人腹膜炎腹透流出液组(P<0.05)。

细胞外基质成分(如胶原蛋白、纤连蛋白)的过度积聚是腹膜纤维化的特征之一。因此，本研究进行了纤维化标记物α-SMA，胶原蛋白I和胶原蛋白III的免疫组化以验证小鼠模型的纤维化表型。图6为各实验组数据分析柱形图，其中A为不同组小鼠腹膜厚度比较；B为不同组小鼠腹膜组织免疫组化α-SMA阳性面积百分比；C为不同组小鼠腹膜组织免疫组化Collagen-I阳性面积百分比；D为不同组小鼠腹膜组织免疫组化Collagen-III阳性面积百分比。免疫组化结果显示人腹膜炎腹透流出液+外泌体组小鼠纤维化标志物α-SMA(P＝0.0004)、Collagen I(P＝0.008)的阳性表达面积明显低于人腹膜炎腹透流出液组。

qRT-PCR进一步检测小鼠腹膜组织促纤维化基因表达情况。图7为不同组小鼠腹膜组织中α-SMA(A)、Collagen-I(B)、Collagen-III(C)、TGF-β1(D)的qRT-PCR数据分析柱形图(*P<0.05或**P<0.01或***P<0.001)。qRT-PCR结果显示人腹膜炎腹透流出液+外泌体组小鼠促纤维化基因TGF-β1(P＝0.0475)、Collagen-I(P＝0.0003)、Collagen-III(P＝0.0189)的表达明显低于人腹膜炎腹透流出液组。

2、BMSCs外泌体改善腹透腹膜损伤小鼠腹膜炎症

图8和图9的结果充分显示BMSCs外泌体大大改善腹透腹膜损伤小鼠的腹膜炎症情况。

图8为不同组小鼠腹膜组织的免疫组化染色图和不同组小鼠腹膜组织免疫组化阳性细胞率数据分析图，其中A、B、C组图片依次为CD68、F4/80、MPO染色结果；D为不同组小鼠腹膜组织免疫组化CD68阳性细胞率，E为不同组小鼠腹膜组织免疫组化F4/80阳性细胞率，F为不同组小鼠腹膜组织免疫组化MPO阳性细胞率。

图9为不同组小鼠腹膜组织中IL-1β(A)，IL-6(B)，TNF-α(C)的qRT-PCR分析(*P<0.05或**P<0.01或***P<0.001)。放大倍数，×200。

通过免疫组化检测小鼠腹膜炎症细胞浸润情况，图8免疫组化结果显示人腹膜炎腹透流出液+外泌体组小鼠腹膜组织F4/80阳性细胞率明显低于人腹膜炎腹透流出液组(P<0.0001)，充分证明BMSCs外泌体可使小鼠腹膜炎症细胞浸润明显减轻。同样，图9的qRT-PCR结果显示人腹膜炎腹透流出液+外泌体组小鼠腹膜组织促炎基因IL-1β(P＝0.0004)、IL-6(P＝0.0319)的表达明显低于人腹膜炎腹透流出液组，说明BMSCs外泌体可改善小鼠腹膜的炎症水平。

3、BMSCs外泌体促进腹透腹膜损伤小鼠的腹膜间皮细胞修复

图10为不同组小鼠腹膜组织的免疫组化染色和免疫荧光染色(E-Cadherin、Ki-67共染)结果。其中A为不同组小鼠腹膜组织的免疫组化染色(CA125)。放大倍数，×200。B-D为不同组小鼠腹膜组织的免疫荧光染色(E-Cadherin、Ki-67共染)。放大倍数，×600。

免疫组化检测间皮细胞标志CA125，图10中A显示人腹膜炎腹透流出液组未见明显CA125表达，提示间皮细胞脱落、间皮完整性破坏。而人腹膜炎腹透流出液+外泌体组可见间皮细胞标志CA125表达，表明BMSCs外泌体促进腹透腹膜损伤小鼠的腹膜间皮细胞修复。

免疫荧光进行腹膜间皮标志物E-cadherin和细胞增殖标志Ki-67共染，图10中B-D结果进一步提示人腹膜炎腹透流出液+外泌体组腹膜间皮细胞增殖较人腹膜炎腹透流出液组明显。该结果表明BMSCs外泌体可能促进受损的腹膜间皮细胞进行增殖修复。

4、BMSCs外泌体可抑制腹透相关性腹膜损伤小鼠的腹膜血管新生

图11为不同组小鼠腹膜组织GS1-lectin、VEGF表达免疫组化结果，其中A、B依次为不同组小鼠腹膜组织GS1-lectin、VEGF表达的免疫组化染色，C为不同组小鼠腹膜组织免疫组化GS1-lectin阳性面积百分比；D为不同组小鼠腹膜组织免疫组化VEGF阳性面积百分比；E为不同组小鼠腹膜组织中VEGF的qRT-PCR分析(*P<0.05或**P<0.01或***P<0.001)。放大倍数，×200。

图11中A-D免疫组化提示人腹膜炎腹透流出液+外泌体组血管新生皮标志物GS1-lectin(P＝0.0475)和VEGF(P＝0.0058)阳性面积百分比明显低于人腹膜炎透析液组，而图11中E的qRT-PCR结果提示人腹膜炎腹透流出液+外泌体组腹膜血管新生因子表达(VEGF)较人腹膜炎透析液组减少。结果提示人腹膜炎腹透流出液可刺激腹透腹膜损伤小鼠的腹膜血管新生，而BMSCs外泌体可抑制腹透腹膜损伤小鼠的腹膜血管新生。充分说明在损伤情况下因腹膜病理性血管新生增多，导致腹膜纤维化；而外泌体干预后能减少病理性血管新生，防止腹膜纤维化。

实施例6改良腹膜平衡实验

腹透腹膜损伤小鼠模型建模完成处死小鼠前，利用改良腹膜平衡实验(PET)对各组小鼠腹膜超滤和溶质交换功能进行评估。

首先配置2.5mL7％的葡萄糖透析液(4.25％葡萄糖透析液9mL与50％葡萄糖注射液0.58mL配制而成)，然后在小鼠处死前将3ml 7％糖浓度透析液注入腹腔,然后在0小时和2小时收集腹透流出液和血清样品。小鼠腹膜超滤功能通过净超滤量(netultrafiltration,net UF)来评估。净超滤为最终收集的腹透流出液总量减去透析前灌注量(3ml)。小鼠腹膜溶质交换功能通过葡萄糖浓度比(D/D0)和尿素氮浓度比(D/P)来评估。葡萄糖浓度比为2h腹透流出液和0h腹膜透析液(D/D0)的葡萄糖浓度比值以及尿素氮浓度比为2h腹透流出液和2h血浆(D/P)中的BUN浓度比值，用于评估腹膜通透性。

BMSCs外泌体保护腹透腹膜损伤小鼠的腹膜超滤功能

图12为BMSCs外泌体保护腹透腹膜损伤小鼠的腹膜超滤功能实验结果，其中A为不同组小鼠腹膜组织的免疫组化染色(AQP-1)。放大倍数，×200。B-D利用腹膜平衡试验(PET)来检测模型鼠的腹膜超滤与溶质交换功能。B为不同组小鼠的腹膜超滤功能通过净超滤量来评估。C为不同组小鼠的腹膜溶质交换功能通过葡萄糖浓度比(D/D0)，以及D以尿素氮浓度比(D/P)来评估。

由于水通道蛋白在腹膜透析超滤中起到重要作用，进一步行免疫组化检测小鼠腹膜水通道蛋白AQP-1表达情况。图12中A结果显示人腹膜炎腹透流出液组腹膜组织AQP-1表达增强，而人腹膜炎腹透流出液+外泌体组表达较其减弱。该结果可能提示人腹膜炎腹透流出液组腹膜功能受损后AQP-1代偿性增加，而外泌体通过缓解腹膜超滤功能损害后使其表达减弱。

不同组小鼠的腹膜超滤功能通过净超滤量结果显示人腹膜炎腹透流出液组小鼠腹膜超滤量低于对照组，提示其超滤功能受损；而人腹膜炎腹透流出液+外泌体组腹膜超滤量高于人腹膜炎腹透流出液组，提示外泌体治疗可能缓解其超滤功能损害。图12的C-D显示各组间溶质转运功能无明显差异。

数据分析

所有数据采用SPSS 22.0统计软件(IBM,美国)进行数据的统计学处理。正态分布的计量资料以

表示，组间的比较采用单因素方差分析或单因素ANOVA分析；非正态分布的计量资料采用M(1/4，3/4)表示，组间比较采用Kruskal Wallis检验。P<0.05视为差异有统计学意义。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.建立小鼠腹透腹膜损伤模型的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤为：将腹膜炎患者透析后的腹透流出液注射到小鼠腹腔内。

2.根据权利要求1所述建立小鼠腹透腹膜损伤模型的方法，其特征在于，所述腹透流出液为腹膜炎患者透析后的液体经离心、细菌过滤得到的。

3.根据权利要求1或2所述建立小鼠腹透腹膜损伤模型的方法，其特征在于，腹膜炎患者腹透流出液的纳入标准为：

a.首次入院夜间留腹；b.未使用抗生素；c.腹水培养革兰氏阴性杆菌；d.腹水检测白介素-6>5000pg/ml，降钙素原>0.3ng/ml、内毒素>0.1EU/mL。

4.根据权利要求1-3任一项所述建立小鼠腹透腹膜损伤模型的方法，其特征在于，按小鼠体重计，腹腔注射腹膜炎腹透流出液0.1mL/g，每日1次，持续4-6周。

5.BMSCs外泌体在制备腹透腹膜损伤疾病的药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述BMSCs外泌体来源于BMSCs细胞培养上清液。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述BMSCs外泌体的制备方法为：取BMSCs细胞培养上清液，2000-3000g 4℃离心30min，取上清；上清经0.22μm滤膜过滤，滤液经100,000-120,000g 4℃超速离心1.5-2h；用相同体积的预冷PBS重悬沉淀，悬液经4℃100,000-120,000g离心1.5-2h；沉淀再用预冷PBS重悬即可。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述BMSCs外泌体的制备方法为：取BMSCs细胞培养上清液，2000g 4℃离心30min，取上清；上清经0.22μm滤膜过滤，滤液经120,000g4℃超速离心2h；用相同体积的预冷PBS重悬沉淀，悬液经4℃120,000g离心2h；沉淀再用预冷PBS重悬即可。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述BMSCs外泌体的应用方法为腹腔注射。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，BMSCs外泌体腹腔注射量为按体重计100μg/kg/次。

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