CN110151790A - 一种组合物用于制备治疗腹膜受损后胶原蛋白异常增生的药物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种组合物用于制备在有需求的个体治疗腹膜及/或腹膜覆盖器官受损后胶原蛋白异常增生的症状或病症的药物的用途，其中该组合物包含脐带间充质干细胞。本发明并提供一种组合物用于制备在有需求的个体治疗腹膜及/或腹膜覆盖器官受损后胶原蛋白异常增生的症状或病症的药物的用途，其中该组合物包含脐带间充质干细胞外泌体。

Description

一种组合物用于制备治疗腹膜受损后胶原蛋白异常增生的药 物的用途
技术领域
本发明是关于一种组合物用于制备在有需求的个体治疗腹膜及/或腹膜覆盖器官受损后胶原蛋白异常增生的症状或病症的药物的用途，其中该组合物包含脐带间充质干细胞或脐带间充质干细胞外泌体(exsosome)。
背景技术
腹膜(peritoneum)是覆盖于腹壁、盆壁内面和腹腔、盆腔各脏器表面的浆膜，其中，内衬于腹壁、骨盆壁和横膈下表面的腹膜称壁层腹膜(parietal peritoneum)，而覆盖于脏器表面的腹膜称为脏层腹膜(visceral peritoneum)，腹膜具有支持、固定、保护、防御等功能。根据腹膜覆盖内脏器官的程度不同，可将腹腔与骨盆腔内的脏器分为两大类，第一大类是腹膜内器官(intra-peritoneal organs)，即器官完全、或大部份被腹膜所包覆，如胃、十二指肠上部、空肠、回肠、盲肠、阑尾、横结肠、乙状结肠、脾、卵巢、输卵管、肝胆、升降结肠、直肠上部、膀胱、子宫。第二大类是腹膜后器官(retro-peritoneal organs)，此类器官仅有一小部分被腹膜覆盖，如肾、胰、输尿管、直肠下部。
当腹膜上的间皮细胞(mesothelial cells)受到感染或其他伤害后，受损的间皮细胞会变得肥大，最后，腹膜上的间皮细胞会脱落，移行到间皮细胞下方的结缔组织(sub-mesothelial connective tissue)，称为上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymaltransition)。受损的腹膜会释出炎症因子，吸引更多白血球的浸润，进一步，导致变形的间皮细胞大量繁殖、并转变成为活化态的纤维母细胞(myo-fibroblast)。此时，存在于间皮细胞下方结缔组织中的大量活化态的纤维母细胞会合成并释出更多的胶原蛋白，导致间皮下层结缔组织(sub-mesothelial connective tissue)增多，因此腹膜增厚，造成所谓的腹膜纤维化(peritoneal fibrosis)。腹膜纤维化会造成腹膜变厚、硬化、甚至钙化，而纤维化的腹膜包覆着内脏器官，导致腹腔内的脏器彼此沾黏、脏器蠕动出现障碍、严重时会造成器官缺氧坏死。因此，病人会出现食欲不振、腹胀、腹痛、恶心、呕吐、便秘、甚至引发脏器坏死、与败血。
造成腹膜纤维化的原因有许多，基因、自体免疫疾病、药物、肿瘤、外伤或手术、放射线、腹骨盆腔内器官出血、胃肠炎症、阑尾炎，憩室炎、各种感染(如结核，组织胞浆菌病，梅毒等)、腹膜透析等因素，都会造成腹膜纤维化，此即所谓继发性腹膜纤维化；另外，还有非常大比例的病患是不明原因造成腹膜纤维化，亦即所谓特发性腹膜纤维化。
截至目前为止，临床上并没有任何药物可以有效治愈已经纤维化的腹膜，仅能透过给予病患类固醇等药物来抑制腹膜发炎反应，此类药物必需长时间服用，同时并伴随相当大的副作用，尽管如此，这类药物仅能降低腹膜纤维化的恶化速率，并无法将已经纤维化的腹膜加以治疗使其回复到原有的状态。因此，寻找治疗、反转腹膜纤维化是当务之急。
发明内容
本发明是关于移植新生儿脐带中瓦顿氏凝胶(Wharton’s jelly)内的脐带间充质干细胞到已经腹膜纤维化的大白鼠体内，探讨治疗、逆转腹膜纤维化的可行性、与治疗机制。
每天以含有20毫摩尔浓度(mM)葡萄糖代谢产物甲基乙二醛(methylglyoxal，MGO)的高糖透析液(peritoneal dialysis buffer，简称PD，含4.25％葡萄糖)的高糖透析混合液(PD/MGO)灌注大白鼠的腹腔内，连续三星期，诱发大白鼠产生腹膜纤维化之后，隔天，分别进行低剂量(106)、与高剂量(108)进行人类脐带间充质干细胞的移植，一个月后，观察腹膜纤维化改变的情形。结果显示，PD/MGO处理三周组的大白鼠，腹腔呈现腹茧的生成，壁层及脏层腹膜均有增厚的情形，且腹膜内胶原蛋白也明显增加。在PD/MGO处理连续三周后，如果不给予治疗，一个月后，大白鼠的腹膜会变得更厚、胶原蛋白堆积更多。但是，移植108人类脐带间充质干细胞到腹膜纤维化大白鼠的腹腔中，一个月后，大白鼠腹膜的厚度、与腹膜纤维化的程度，均有显著的降低。人类脐带间充质干细胞治疗的机制是一方面抑制发炎反应，减少纤维母细胞的活化，以避免新的胶原蛋白继续地产生。二方面，增加基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13，MMP-13，又称胶原蛋白分解酶-3，collagenase-3)的产量，以加速分解已经存在的胶原蛋白。经由这两个途径，才能治疗腹膜纤维化。
进一步，取培养在正常氧浓度(20％)、与低氧浓度(1％)的人类脐带间充质干细胞的条件培养液，打入已经腹膜纤维化大白鼠的腹腔中，每周两次，连续四周，结果显示，正常氧培养之条件培养液、及低氧培养之条件培养液，都有降低腹膜厚度、与治疗腹膜纤维化的效果。因此推测，移植人类脐带间充质干细胞治疗、反转腹膜纤维化，主要的治疗机制是通过包含多种生物激素的干细胞释出物，因而条件培养液亦具有治疗腹膜纤维化的效果。
本发明是关于一种组合物用于制备在有需求的个体治疗腹膜及/或腹膜覆盖器官受损后胶原蛋白异常增生的症状或病症的药物的用途，其中该组合物包含脐带间充质干细胞。
于一实施例中，该脐带间充质干细胞是来自脐带瓦顿氏凝胶。
于另一实施例中，该脐带瓦顿氏凝胶来源物种是与该有需求的个体物种相同或不同。
于一实施例中，该脐带间充质干细胞的治疗有效剂量为106个细胞。
于一实施例中，该脐带间充质干细胞的治疗有效剂量为108个细胞。
于一实施例中，该组合物进一步包含脐带间充质干细胞外泌体(exsosome)。
于一实施例中，该腹膜是指壁层腹膜(parietal peritoneum)。
于一实施例中，该腹膜是指脏层腹膜(visceral peritoneum)。
于一实施例中，该腹膜是指腹膜反折(peritoneal reflections)构造，包含(但不限于)网膜、肠系膜、及韧带。
于另一实施例中，该网膜包含(但不限于)大网膜(Greater Omentum)、小网膜(Lesser Omentum)、及网膜囊(Omental Bursa)。
于另一实施例中，该肠系膜系包含(但不限于)小肠系膜(mesentery proper)、横结肠肠系膜(transvese mesocolon)、乙状结肠肠系膜(sigmoid mesocolon)、阑尾系膜(meso appendix)。
于另一实施例中，该韧带系包含(但不限于)镰状韧带(falciform ligament)、肝圆韧带(ligamentum teres hepatis)、冠状韧带(coronary ligament)、静脉韧带(ligamentum venosus)、膈结肠韧带(phrenicocolic ligament)、胃脾韧带(gastrosplenic or gastrolienal ligament)、脾肾韧带(splenorenal or lienorenalligament)。
于另一实施例中，该腹膜覆盖器官是指腹膜内器官，包含(但不限于)胃、十二指肠上部、空肠、回肠、盲肠、阑尾、横结肠、乙状结肠、脾、卵巢、及输卵管。
于另一实施例中，该腹膜覆盖器官是指腹膜间器官，包含(但不限于)肝胆、升降结肠、直肠上部、膀胱、及子宫。
于另一实施例中，该腹膜覆盖器官是指腹膜后器官，包含(但不限于)十二指肠降部和水平部、肾上腺、肾、胰、输尿管、及直肠下部。
于一实施例中，该胶原蛋白异常增生的症状或病症包含(但不限于)腹膜增厚、腹膜纤维化、沾黏、及腹茧。
于另一实施例中，该腹膜纤维化是由免疫缺陷、药物、肿瘤、外伤、手术、出血、尿外渗、腹膜透析、辐射、感染、或炎症所引起。
于另一实施例中，该腹膜纤维化包含特发性腹膜纤维化及继发性腹膜纤维化。
于另一实施例中，该腹膜纤维化是指包囊性腹膜硬化症。
于一实施例中，该组合物增加胶原酶(collagenase)表现量。
于另一实施例中，该胶原酶为基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase)。
于另一实施例中，该基质金属蛋白酶为基质金属蛋白酶-13(matrixmetalloproteinase-13)。
于一实施例中，该组合物抑制发炎反应。
于一实施例中，该组合物降低纤维母细胞的活化。
于一实施例中，该组合物降低巨噬细胞的数量。
本发明并关于一种组合物用于制备在有需求的个体治疗腹膜及/或腹膜覆盖器官受损后胶原蛋白异常增生的症状或病症的药物的用途，其中该组合物包含脐带间充质干细胞外泌体(exsosome)。
于一实施例中，该脐带间充质干细胞外泌体源自于在含氧浓度不超过20％的环境下培养脐带间充质干细胞后的培养液。
于另一实施例中，该脐带间充质干细胞外泌体源自于在含氧浓度不超过1％的环境下培养脐带间充质干细胞后的培养液。
于一实施例中，该药物以每周两次的频率施予该有需求的个体。
于一实施例中，该药物以腹腔内注射的方式施予该有需求的个体。
于一实施例中，该组合物进一步包含脐带间充质干细胞。
于一实施例中，该腹膜是指壁层腹膜(parietal peritoneum)。
于一实施例中，该腹膜是指脏层腹膜(visceral peritoneum)。
于一实施例中，该腹膜是指腹膜反折(peritoneal reflections)构造，包含(但不限于)网膜、肠系膜、及韧带。
于另一实施例中，该网膜包含(但不限于)大网膜(Greater Omentum)、小网膜(Lesser Omentum)、及网膜囊(Omental Bursa)。
于另一实施例中，该肠系膜包含(但不限于)小肠系膜(mesentery proper)、横结肠肠系膜(transvese mesocolon)、乙状结肠肠系膜(sigmoid mesocolon)、阑尾系膜(mesoappendix)。
于另一实施例中，该韧带包含(但不限于)镰状韧带(falciform ligament)、肝圆韧带(ligamentum teres hepatis)、冠状韧带(coronary ligament)、静脉韧带(ligamentum venosus)、膈结肠韧带(phrenicocolic ligament)、胃脾韧带(gastrosplenic or gastrolienal ligament)、脾肾韧带(splenorenal or lienorenalligament)。
于另一实施例中，该腹膜覆盖器官是指腹膜内器官，包含(但不限于)胃、十二指肠上部、空肠、回肠、盲肠、阑尾、横结肠、乙状结肠、脾、卵巢、及输卵管。
于另一实施例中，该腹膜覆盖器官是指腹膜间器官，包含(但不限于)肝胆、升降结肠、直肠上部、膀胱、及子宫。
于另一实施例中，该腹膜覆盖器官是指腹膜后器官，包含(但不限于)十二指肠降部和水平部、肾上腺、肾、胰、输尿管、及直肠下部。
于一实施例中，该胶原蛋白异常增生的症状或病症包含(但不限于)腹膜增厚、腹膜纤维化、沾黏、及腹茧。
于另一实施例中，该腹膜纤维化是由免疫缺陷、药物、肿瘤、外伤、手术、出血、尿外渗、腹膜透析、辐射、感染、或炎症所引起。
于另一实施例中，该腹膜纤维化包含特发性腹膜纤维化及继发性腹膜纤维化。
于另一实施例中，该腹膜纤维化是指包囊性腹膜硬化症。
于一实施例中，该组合物增加胶原酶(collagenase)表现量。
于另一实施例中，该胶原酶为基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase)。
于另一实施例中，该基质金属蛋白酶为基质金属蛋白酶-13(matrixmetalloproteinase-13)。
于一实施例中，该组合物抑制发炎反应。
于一实施例中，该组合物降低纤维母细胞的活化。
于一实施例中，该组合物降低巨噬细胞的数量。
图式说明
图1、移植人类脐带间充质干细胞至腹膜纤维化病鼠的实验流程图。
图2、由大白鼠腹腔巨观显示，移植人类脐带间充质干细胞治疗腹膜纤维化病鼠的腹膜增厚、沾黏、与腹茧。各组大白鼠未灌流之前(A-E)、与灌流固定后(a-e)，解剖腹壁，拍照显示各组大白鼠的腹腔巨观变化。正常组(A，a)、PD/MGO组(B，b)、PD/MGO+溶剂组(C，c)、PD/MGO+HUMSCs(LD)组(D，d)、PD/MGO+HUMSCs(HD)组(E，e)。结果显示，移植人类脐带间充质干细胞治疗腹膜纤维化病鼠腹膜的增厚、沾黏、与腹茧。
图3、移植人类脐带间充质干细胞，降低腹膜纤维化病鼠的腹膜厚度。各组大白鼠腹直肌上的壁层腹膜(A-E)、与肝脏表面的脏层腹膜(G-K)，经H&E染色，图像显示正常组(A，G)、PD/MGO组(B，H)、PD/MGO+溶剂组(C，I)、PD/MGO+HUMSCs(LD)组(D,J)、PD/MGO+HUMSCs(HD)组(E，K)。(F，L)定量结果显示，PD/MGO处理三周，腹膜厚度均有明显的增加，隔天，移植高剂量人类脐带间充质干细胞可以降低腹膜纤维化病鼠的腹膜厚度。比例尺：200微米(μm)。*表示相较于正常组p值小于0.05；#表示相较于PD/MGO组p值小于0.05；◆表示相较于PD/MGO+溶剂组p值小于0.05；表示相较于PD/MGO+MSCs(LD)组p值小于0.05。
图4、移植人类脐带间充质干细胞，降低腹膜纤维化病鼠腹膜内的胶原蛋白。各组大白鼠腹直肌上的壁层腹膜(A-E)、与肝脏表面的脏层腹膜(G-K)，经天狼星红(siriusred)染色，胶原蛋白则被标识出。图像显示正常组(A，G)、PD/MGO组(B，H)、PD/MGO+溶剂组(C，I)、PD/MGO+HUMSCs(LD)组(D，J)、PD/MGO+HUMSCs(HD)组(E，K)。(F，L)定量结果显示，PD/MGO处理三周，增厚的腹膜内胶原蛋白含量明显的增加，隔天，移植高剂量人类脐带间充质干细胞可以降低腹膜纤维化病鼠腹膜内的胶原蛋白。比例尺：200微米(μm)。*表示相较于正常组p值小于0.05；#表示相较于PD/MGO组p值小于0.05；◆表示相较于PD/MGO+溶剂组p值小于0.05；表示相较于PD/MGO+MSCs(LD)组p值小于0.05。
图5、移植人类脐带间充质干细胞，降低腹膜纤维化病鼠腹膜内纤维母细胞的活化。为了了解腹膜内的发炎反应，取各组大白鼠腹直肌上的壁层腹膜进行anti-αSMA组织免疫染色(A-E，下排为方框的放大图)，anti-αSMA抗体则标识出活化的纤维母细胞。图像分别是正常组(A)、PD/MGO组(B)、PD/MGO+溶剂组(C)、PD/MGO+HUMSCs(LD)组(D)、PD/MGO+HUMSCs(HD)组(E)。结果显示，PD/MGO处理三周，增厚的腹膜内活化的纤维母细胞数量明显的增加，隔天，移植高剂量人类脐带间充质干细胞可以降低腹膜纤维化病鼠腹膜内活化纤维母细胞的数目。
图6、移植人类脐带间充质干细胞，降低腹膜纤维化病鼠腹膜内巨噬细胞的数量。为了了解腹膜内的发炎反应，取各组大白鼠腹直肌上的壁层腹膜进行anti-ED1(A-E，下排为方框的放大图)组织免疫染色，anti-ED1抗体标识出巨噬细胞。图像分别是正常组(A)、PD/MGO组(B)、PD/MGO+溶剂组(C)、PD/MGO+HUMSCs(LD)组(D)、PD/MGO+HUMSCs(HD)组(E)。结果显示，PD/MGO处理三周，增厚的腹膜内标识到的巨噬细胞数量明显的增加，隔天，移植高剂量人类脐带间充质干细胞可以降低腹膜纤维化病鼠腹膜内的巨噬细胞数目。
图7、移植人类脐带间充质干细胞，增进腹膜纤维化病鼠分解腹膜内胶原蛋白的能力。为了了解腹膜内分解胶原蛋白的情形，取各组大白鼠新鲜腹膜，分别进行anti-MMP13进行蛋白质印迹法(Western Blot)分析。MMP-13可以分解胶原蛋白。结果显示，PD/MGO处理三周，腹膜内MMP-13含量明显的减少，隔天，移植高剂量人类脐带间充质干细胞可以增加腹膜纤维化病鼠腹膜内的MMP-13生成量。
图8、给予培养过人类脐带间充质干细胞的条件培养液至腹膜纤维化病鼠的实验流程图。
图9、由大白鼠腹腔巨观显示，给予培养过人类脐带间充质干细胞的条件培养液，能够治疗腹膜纤维化病鼠的腹膜增厚、沾黏、与腹茧。各组大白鼠灌流固定后(A-E)，解剖腹壁，拍照显示各组大白鼠的腹腔巨观变化。正常组(A)、PD/MGO组(B)、PD/MGO+DMEM组(C)、PD/MGO+Normaxia CM组(D)、PD/MGO+Hypoxia CM组(E)。结果显示，给予培养过人类脐带间充质干细胞的条件培养液可以治疗腹膜纤维化病鼠腹膜的增厚、沾黏、与腹茧。
图10、给予培养过人类脐带间充质干细胞的条件培养液，降低腹膜纤维化病鼠的腹膜厚度。各组大白鼠腹直肌上的壁层腹膜(A-E)、与肝脏表面的脏层腹膜(G-K)，经H&E染色，图像显示正常组(A，G)、PD/MGO组(B，H)、PD/MGO+DMEM组(C，I)、PD/MGO+Normaxia CM组(D，J)、PD/MGO+Hypoxia CM组(E，K)。(F，L)定量结果显示，PD/MGO处理三周，腹膜厚度均有明显的增加，给予培养过人类脐带间充质干细胞的条件培养液可以降低腹膜纤维化病鼠的腹膜厚度。比例尺：200微米(μm)。*表示相较于正常组p值小于0.05；#表示相较于PD/MGO组p值小于0.05；◆表示相较于PD/MGO+DMEM组p值小于0.05；表示相较于PD/MGO+NormaxiaCM组p值小于0.05。
图11、给予培养过人类脐带间充质干细胞的条件培养液，降低腹膜纤维化病鼠腹膜内的胶原蛋白。各组大白鼠腹直肌上的壁层腹膜(A-E)、与肝脏表面的脏层腹膜(G-K)，经天狼星红染色，胶原蛋白则被标识出。图像显示正常组(A，G)、PD/MGO组(B，H)、PD/MGO+DMEM组(C，I)、PD/MGO+Normaxia CM组(D，J)、PD/MGO+Hypoxia CM组(E，K)。(F，L)定量结果显示，PD/MGO处理三周，增厚的腹膜内胶原蛋白含量明显的增加，给予培养过人类脐带间充质干细胞的条件培养液可以降低腹膜纤维化病鼠腹膜内的胶原蛋白。比例尺：200微米(μm)。*表示相较于正常组p值小于0.05；#表示相较于PD/MGO组p值小于0.05；◆表示相较于PD/MGO+DMEM组p值小于0.05；表示相较于PD/MGO+Normaxia CM组p值小于0.05。
具体实施方式
以下的实施例非为限定用途，仅用以呈现此发明的多种面向。
材料与方法
腹膜纤维化大白鼠动物模式的建立
将含有20毫摩尔浓度(mM)的甲基乙二醛(methylglyoxal，MGO)的4.25％葡萄糖透析混合液(4.25％葡萄糖透析液购自Baxter公司)，经由PE160的埋管，注入到大白鼠的腹腔内，打入的总体积依据每公斤大白鼠体重注入100毫升(ml)透析混合液的比例，每天一次，连续三周。
人类脐带间充质干细胞的分离与培养
将分娩后的脐带以无菌方式收集并保存于4℃的汉克斯平衡盐溶液(HBSS，Hanks'Balanced Salt Solution)的缓冲溶液中，24小时内进行脐带间质细胞的分离培养，实验器械皆经由高温高压灭菌后使用，实验中全程以75％酒精消毒，并于使用前过火。于无菌操作台内将脐带取出，并以75％酒精浸泡进行消毒后，置于HBSS缓冲溶液。接着，用已灭菌的器械分离并切碎脐带间质组织(瓦顿氏凝胶，Wharton’s jelly)，以每分钟4000转速(rpm)离心5分钟。移除上清液，再将脐带间质组织加入胶原酶(Collagenase)、及胰蛋白酶(Trypsin)作用，接着，加入FBS(Gibco 10437-028)终止胰蛋白酶反应。此时，脐带间质组织已经处理成为人类脐带间充质干细胞(Human Umbilical Mesenchymal Stem Cell；简称HUMSCs)。最后，将脐带间充质干细胞加入适量10％FBS DMEM打散细胞，计算细胞数，并进行细胞培养。
人类脐带间充质干细胞的植入
大白鼠处理三周PD/MGO透析液建立腹膜纤维化模式后，将106或108人类脐带间充质干细胞溶于生理食盐水中，注入腹腔内。实验流程图请参见图1。
移植干细胞的实验动物分组
第一组为正常组，大白鼠给予生理食盐水(normal saline)(每公斤体重100毫升)，连续三周，隔天，仅给予10毫升生理食盐水注入腹腔，一个月后牺牲观察；第二组为PD/MGO组，大白鼠连续注入含有20毫摩尔浓度MGO的4.25％葡萄糖透析混合液(每公斤体重100毫升)于腹腔中，连续三周，即刻牺牲观察；第三组为PD/MGO+溶剂组，大白鼠连续注入含有20毫摩尔浓度MGO的4.25％葡萄糖透析混合液(每公斤体重100毫升)于腹腔中，连续三周。隔天，将10毫升生理食盐水注入大白鼠腹腔，一个月后牺牲观察；第四组为PD/MGO+HUMSCs(LD)组，大白鼠给予含有20毫摩尔浓度MGO的4.25％葡萄糖透析混合液(每公斤体重100毫升)，连续三周。隔天，将106人类脐带间充质干细胞溶于10毫升生理食盐水，注入大白鼠腹腔内，一个月后牺牲观察；第五组为PD/MGO+HUMSCs(HD)组，大白鼠给予含有20毫摩尔浓度MGO的4.25％葡萄糖透析混合液(每公斤体重100毫升)，连续三周。隔天，将108人类脐带间充质干细胞溶于10毫升生理食盐水，注入大白鼠腹腔内，一个月后牺牲观察。
苏木紫-伊红染色(Hematoxylin&Eosin Stain，简称HE stain或H&E染色)
大白鼠麻醉后，灌流固定，将腹壁肌肉、及肝脏取出，进行组织切片和HE stain，以便观察壁层腹膜(parietal peritoneum)、与脏层腹膜(visceral peritoneum)厚度、和病理的变化情形。
组织胶原蛋白染色
大白鼠麻醉后，灌流固定，将腹壁肌肉、及肝脏取出，进行组织切片、并以溶于苦味酸(picric acid)的0.1％天狼星红(sirius red)染色6分钟，以便观察壁层腹膜(parietalperitoneum)、与脏层腹膜(visceral peritoneum)内胶原蛋白的变化情形。胶原蛋白，染色后呈现红色，定量红色胶原蛋白所占的面积。
抗α-平滑肌肌动蛋白抗体与抗ED1抗体的组织免疫染色或蛋白质印迹法分析(Western blotting)
抗α-平滑肌肌动蛋白抗体(αsmooth muscle actin antibody，简称anti-αSMA)是标识活化的纤维母细胞，而抗ED1抗体(ED1antibody)是标识活化的淋巴细胞与单核细胞，目的是侦测腹膜内发炎反应的改变情形。
将含有壁层腹膜的腹壁组织切片、与脏层腹膜的肝脏组织切片，进行抗α-平滑肌肌动蛋白抗体、与抗ED1抗体组织免疫染色。
抗MMP-13抗体进行蛋白质印迹法分析
基质金属蛋白酶-13(Matrix metallopeptidase-13，MMP-13)已有论文发表，可以帮助胶原蛋白的分解。取壁层腹膜、或脏层腹膜，分别与抗MMP-13抗体(MMP-13antibody)进行蛋白质印迹法分析，以定量MM-P13蛋白质的合成量。
人类脐带间充质干细胞的条件培养液移植
大白鼠处理三周PD/MGO透析液建立腹膜纤维化模式后，将培养过人类脐带间充质干细胞的培养液，即称为干细胞条件培养液，由PE管注入大白鼠腹腔内。
干细胞条件培养液的实验动物分组
本实验共分五组、与实验流程图参见图7：第一组为正常组，即大白鼠给予正常浓度生理食盐水(每公斤体重100毫升)，连续三周。接着，每周两次，每次10毫升生理食盐水注入大白鼠腹腔中，连续四周，最后牺牲观察；第二组为PD/MGO组，即大白鼠连续注入含有20mM MGO的4.25％葡萄糖透析混合液(每公斤体重100毫升)于腹腔中，连续三周，即刻牺牲观察；第三组为PD/MGO+DMEM组，即大白鼠连续注入含有20mM MGO的4.25％葡萄糖透析混合液(每公斤体重100毫升)于腹腔中，连续三周，接着，每周两次，每次10毫升DMEM注入大白鼠腹腔中，连续四周，最后牺牲观察；第四组为PD/MGO+Normoxia-CM组，即大白鼠给予三周PD/MGO透析液后，接着，将正常氧环境培养下的人类脐带间充质干细胞的条件培养液(Normoxia-conditioned medium，简称Normoxia-CM)，每周两次，每次10毫升的Normoxia-CM注入大白鼠腹腔中，连续四周，最后牺牲观察；第五组为PD/MGO+Hypoxia-CM，即大白鼠给予三周PD/MGO透析液后，接着，将低氧环境培养下的人类脐带间充质干细胞的条件培养液(Hypoxia-conditioned medium，简称Hypoxia-CM)，每周两次，每次10毫升的Hypoxia-CM注入大白鼠腹腔中，连续四周，最后牺牲观察。
实施例1、由巨观显示，移植人类脐带间充质干细胞可以治疗腹膜纤维化病鼠的腹膜沾黏、与腹茧
取未经灌流固定(图2A-E)、与灌流固定后(图2a-e)的各组大白鼠，将其腹壁剪开，观察外观。结果显示，正常组腹腔内的腹膜清晰，紧紧贴附在脏器上，因此，肝脏、与小肠表面呈现光滑(图2A及a)。PD/MGO组大白鼠，处理PD/MGO三周，内脏表面的腹膜明显可见，肝脏边缘变得厚厚肿肿的，小肠因为食物堆积而变得肥大(图2B及b)。PD/MGO+溶剂组大白鼠，处理PD/MGO三周，隔天仅给予生理食盐水，一个月后，发现脏层腹膜与壁层腹膜都明显地变厚、也彼此沾黏，腹膜包覆整个腹腔，形成腹茧(图2C及c)。PD/MGO+HUMSCs(LD)组大白鼠，处理PD/MGO三周，隔天，移植低剂量的干细胞一次，一个月后，大白鼠增厚的腹膜并没有明显的改善(图2D及d)。PD/MGO+HUMSCs(HD)组大白鼠，处理PD/MGO三周，隔天，移植一次高剂量的干细胞，一个月后，大白鼠腹腔没有发现腹茧的生成，也没有看见增厚的腹膜，脏器表面也较平滑，小肠也恢复正常的型态(图2E及e)。
实施例2、移植人类脐带间充质干细胞，可以降低已经腹膜纤维化病鼠的壁层腹膜与脏层腹膜的增厚
取灌流固定后的各组大白鼠壁层腹膜(图3A-E)、与脏层腹膜(图3G-K)，进行H&E染色，观察腹膜厚度的变化情形。结果显示，正常组不论是腹直肌表面上的壁层腹膜、或肝脏表面上的脏层腹膜，都仅是薄薄的一层(图3A及G)。PD/MGO组，处理PD/MGO三周，腹膜厚度均明显增厚(图3B及H)。PD/MGO+溶剂组的脏层腹膜与壁层腹膜厚度，又较PD/MGO组明显地增加、也彼此沾黏(图3C及I)。
PD/MGO+HUMSCs(LD)组，大白鼠腹膜厚度并没有明显的改善(图3D及J)。PD/MGO+HUMSCs(HD)组，不论是大白鼠的壁层腹膜、或脏层腹膜厚度，均呈现明显的降低，和正常组的厚度相当，并没有统计差异(图3E及K)。统计结果显示，移植高剂量人类脐带间充质干细胞可以改善腹膜纤维化病鼠的腹膜厚度(图3F及L)。
实施例3、移植人类脐带间充质干细胞，可以降低腹膜纤维化病鼠壁层腹膜与脏层腹膜内的胶原蛋白
取灌流固定后的各组大白鼠壁层腹膜(图4A-E)、与脏层腹膜(图4G-K)，进行天狼星红染色，胶原蛋白则被标识出，以便观察腹膜内胶原蛋白的变化情形。结果显示，正常组的壁层腹膜、或脏层腹膜内存有少量的胶原蛋白(图4A及G)。PD/MGO组，处理PD/MGO三周，增厚的腹膜内，胶原蛋白大量堆积(图4B及H)。PD/MGO+溶剂组的壁层腹膜与脏层腹膜不仅变厚，增厚腹膜内的胶原蛋白含量、与肌肉组织间的胶原蛋白均明显变多(图4C及I)。PD/MGO+HUMSCs(LD)组，大白鼠腹直肌内的胶原蛋白略微改善，但是脏层腹膜内的胶原蛋白并没有明显的变化(图4D及J)。PD/MGO+HUMSCs(HD)组，不论是大白鼠的壁层腹膜、或脏层腹膜厚度均有显着降低，并且，腹膜内的胶原蛋白含量也明显的降低，和正常组的相当，并没有统计差异(图4E及K)。统计结果显示，移植高剂量人类脐带间充质干细胞可以改善腹膜纤维化病鼠腹膜内的胶原蛋白的含量(图4F及L)。
实施例4、移植人类脐带间充质干细胞，可以减少腹膜纤维化病鼠腹膜内的发炎反应
取灌流固定后的各组大白鼠壁层腹膜，进行anti-αSMA(图5A-E)组织免疫染色。anti-αSMA抗体则标识出活化的纤维母细胞，活化的纤维母细胞会合成、并释出胶原蛋白。因此，活化的纤维母细胞代表发炎现象。结果显示，正常组的腹膜并没有发现活化的纤维母细胞的存在(图5A)。PD/MGO组，处理PD/MGO三周，增厚的腹膜内，出现大量的活化纤维母细胞存在(图5B)。PD/MGO+溶剂组的增厚腹膜内活化纤维母细胞的数目仍然很多(图5C)。PD/MGO+HUMSCs(LD)组，大白鼠增厚的腹膜内，活化纤维母细胞型态变得较细长(图5D)。
PD/MGO+HUMSCs(HD)组，大白鼠的壁层腹膜内，活化纤维母细胞呈现显着的减少情形(图5E)。结果显示，移植高剂量人类脐带间充质干细胞可以抑制腹膜纤维化病鼠腹膜内活化的纤维母细胞。
另外，取灌流固定后的各组大白鼠壁层腹膜，进行anti-ED1(图6A-E)组织免疫染色。anti-ED1抗体标识到巨噬细胞，巨噬细胞代表发炎反应。正常组的腹膜几乎没有发现巨噬细胞的存在(图6A)。PD/MGO组，处理PD/MGO三周，增厚的腹膜内，出现大量的巨噬细胞(图6B)。PD/MGO+溶剂组的增厚腹膜内巨噬细胞仍然不少(图6C)。PD/MGO+HUMSCs(LD)组，大白鼠增厚的腹膜内巨噬细胞较少(图6D)。PD/MGO+HUMSCs(HD)组，大白鼠的壁层腹膜增厚的腹膜内巨噬细胞呈现显着的减少情形(图6E)。结果显示，移植高剂量人类脐带间充质干细胞可以抑制腹膜纤维化病鼠腹膜内的巨噬细胞，也就是抑制发炎反应。
实施例5、移植人类脐带间充质干细胞，增进腹膜纤维化病鼠分解腹膜内胶原蛋白的能力
取各组大白鼠新鲜的腹膜，进行MMP-13蛋白质印迹法，以定量MMP-13的浓度。MMP-13又称胶原蛋白酶-3(collagenase-3)，可以分解胶原蛋白。
正常组的腹膜内存在着MMP-13。PD/MGO组、和PD/MGO+溶剂组的腹膜内MMP-13几乎标识不到。PD/MGO+HUMSCs(HD)组，大白鼠腹膜的MMP-13含量又出现了(图七)。结果显示，移植高剂量人类脐带间充质干细胞可以促进腹膜纤维化病鼠腹膜内MMP-13表现量，推测分解腹膜内胶原蛋白的能力也因此提升。
实施例6、处理人类脐带间充质干细胞的条件培养液，可以治疗腹膜纤维化病鼠的腹膜沾黏、与腹茧
取灌流固定后的各组大白鼠，将其腹壁剪开，观察外观。结果显示，正常组腹腔内的腹膜紧紧贴附在脏器上，因此，肝脏、与小肠表面呈现光滑(图9A)。PD/MGO组大白鼠，处理PD/MGO三周，内脏表面的腹膜明显可见，小肠也变得肥大(图9B)。PD/MGO+DMEM组大白鼠，处理PD/MGO三周，接着，仅给予DMEM，一个月后，发现脏层腹膜与壁层腹膜明显变厚、也彼此沾黏，形成严重腹茧(图9C)。PD/MGO+Normaxia-CM组大白鼠，处理PD/MGO三周，接着，将正常氧环境培养下的人类脐带间充质干细胞的条件培养液(Normaxia-CM)，每周两次，每次10毫升的Normaxia-CM注入大白鼠腹腔中，连续四周，则大白鼠增厚的腹膜有明显的改善(图9D)。PD/MGO+Hypoxia-CM组大白鼠，处理PD/MGO三周，接着，将低氧环境培养下的人类脐带间充质干细胞的条件培养液(Hypoxia-CM)，每周两次，每次10毫升的Hypoxia-CM注入大白鼠腹腔中，连续四周，则大白鼠腹腔没有腹茧、也没有看见增厚的腹膜，脏器表面也较平滑，小肠也恢复正常的型态(图9E)。
实施例7、处理人类脐带间充质干细胞的条件培养液，可以降低腹膜纤维化病鼠的壁层腹膜与脏层腹膜的增厚
取灌流固定后的各组大白鼠壁层腹膜(图10A-E)、与脏层腹膜(图10G-K)，进行H&E染色，观察腹膜厚度的变化情形。结果显示，正常组不论是壁层腹膜、或脏层腹膜，都仅是薄薄的一层(图10A及G)。PD/MGO组，处理PD/MGO三周，腹膜厚度均明显增厚(图10B及H)。PD/MGO+DMEM组的壁层腹膜与脏层腹膜厚度，又较PD/MGO组明显地增加(图10C及I)。PD/MGO+Normaxia-CM组，大白鼠腹膜厚度与PD/MGO组相比，则有明显的改善(图10D及J)。PD/MGO+Hypoxia-CM组，不论是大白鼠的壁层腹膜、或脏层腹膜厚度，均呈现明显的降低，和正常组的厚度相当，并没有统计差异(图10E及K)。统计结果显示，给予人类脐带间充质干细胞之条件培养液可以改善腹膜纤维化病鼠的腹膜厚度(图10F及L)。
实施例8、处理人类脐带间充质干细胞的条件培养液，可以降低腹膜纤维化病鼠壁层腹膜与脏层腹膜内的胶原蛋白
取灌流固定后的各组大白鼠壁层腹膜(图11A-E)、与脏层腹膜(图11G-K)，进行天狼星红(sirius red)染色，胶原蛋白则被标识出，以便观察腹膜内胶原蛋白的变化情形。结果显示，正常组的壁层腹膜、或脏层腹膜内存有微量的胶原蛋白(图11A及G)。PD/MGO组，处理PD/MGO三周，增厚的腹膜内，胶原蛋白大量堆积(图11B及H)。PD/MGO+DMEM组的壁层腹膜与脏层腹膜不仅变厚，增厚腹膜内的胶原蛋白含量、与肌肉组织间的胶原蛋白均明显变多(图11C及I)。PD/MGO+Normaxia-CM组，大白鼠壁层腹膜与脏层腹膜内的胶原蛋白呈现明显的减少(图11D及J)。PD/MGO+Hypoxia-CM组，大白鼠的壁层腹膜、或脏层腹膜厚度均有显着降低，并且，腹膜内的胶原蛋白含量也显着的降低(图11E及K)。统计结果显示，给予人类脐带间充质干细胞的条件培养液可以改善腹膜纤维化病鼠腹膜内的胶原蛋白的含量(图11F及L)。
为使此发明所属技术领域中具有通常知识者得以了解制作以及使用这项技艺的方法，此发明已描述并已充分详细举例说明，然而，各式各样的变体，修改或改进应被视为无异于此项发明的精神与范围。
本发明所属技术领域中具有通常知识者易于理解并实现本发明的目的，并获得先前所提到的结果及优点。本发明所使用的细胞，动物以及生产它们的过程和方法乃代表最佳实施例，乃示例性质，而不作为限制本发明的范围用途。本领域的技术人员与制作或使用此项技艺时所将产生之修改或其他用途皆涵盖于本发明的精神内，并且由权利范围所限定。

Claims (18)

1.一种组合物用于制备在有需求的个体治疗腹膜及/或腹膜覆盖器官受损后胶原蛋白异常增生的症状或病症的药物的用途，其中该组合物包含脐带间充质干细胞。
2.如权利要求1所述的用途，其中该脐带间充质干细胞来自脐带瓦顿氏凝胶。
3.如权利要求2所述的用途，其中该脐带瓦顿氏凝胶来源物种与该有需求的个体物种相同或不同。
4.如权利要求1所述的用途，其中该脐带间充质干细胞的治疗有效剂量为106个细胞。
5.如权利要求1所述的用途，其中该脐带间充质干细胞的治疗有效剂量为108个细胞。
6.如权利要求1所述的用途，其中该组合物进一步包含脐带间充质干细胞外泌体。
7.一种组合物用于制备在有需求的个体治疗腹膜及/或腹膜覆盖器官受损后胶原蛋白异常增生之症状或病症的药物的用途，其中该组合物包含脐带间充质干细胞外泌体。
8.如权利要求7所述的用途，其中该脐带间充质干细胞外泌体是源自于在含氧浓度不超过20％的环境下培养脐带间充质干细胞后的培养液。
9.如权利要求8所述的用途，其中该脐带间充质干细胞外泌体是源自于在含氧浓度不超过1％的环境下培养脐带间充质干细胞后的培养液。
10.如权利要求7所述的用途，其中该药物是以每周两次的频率施予该有需求的个体。
11.如权利要求7所述的用途，其中该药物是以腹腔内注射的方式施予该有需求的个体。
12.如权利要求7所述的用途，其中该组合物进一步包含脐带间充质干细胞。
13.如权利要求1或7所述用途，其中该组合物增加胶原酶表现量。
14.如权利要求13所述的用途，其中该胶原酶为基质金属蛋白酶。
15.如权利要求14所述的用途，其中该基质金属蛋白酶为基质金属蛋白酶-13。
16.如权利要求1或7所述的用途，其中该组合物抑制发炎反应。
17.如权利要求1或7所述的用途，其中该组合物降低纤维母细胞的活化。
18.如权利要求1或7所述的用途，其中该组合物降低巨噬细胞的数量。
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