DE69331467T2 - Oligonukleotide modulation von protein kinase c - Google Patents

Oligonukleotide modulation von protein kinase c

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Description

    Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung bezieht sich auf Therapien, Diagnosen und Forschungs- Reagentien für Erkrankungszustände, die auf die Modulation der Expression von Proteinkinase C ansprechen. Insbesondere bezieht sich diese Erfindung auf Antisense-Oligonucleotide, die spezifisch hybridisierbar sind mit Nucleinsäuren, die sich auf Proteinkinase C beziehen. Diese Oligonucleotide modulieren, wie gefunden wurde, die Expression von Proteinkinase C. Daraus resultiert ein palliativer und therapeutischer Effekt.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Die Phosphorylierung von Proteinen spielt eine Schlüsselrolle bei der Transduktion von extrazellulären Signalen in die Zelle. Die Enzyme, als Kinasen bezeichnet, die solche Phosphorylierungen bewirken, sind Targets für die Wirkung von Wachstumsfaktoren, Hormonen und anderen Agentien, die am zellulären Stoffwechsel, der Zellen-Proliferation und der Zellen-Differenzierung beteiligt sind. Einer der hauptsächlichen Signal-Transduktions-Wege umfasst das Enzym Proteinkinase C (PKC), die dafür bekannt ist, dass sie einen kritischen Einfluss auf die Zellproliferation und die Zelldifferenzierung hat. Die PKC wird durch Diacylglycerine (DAGs) aktiviert, bei denen es sich um Metabolite handelt, die bei der Signal-Transduktion freigesetzt werden.
  • Das Interesse an der PKC wurde stimuliert durch die Erkenntnis, dass die PKC der hauptsächliche und wahrscheinlich einzige zelluläre Rezeptor ist, über den eine Klasse von Tumor-fördernden Agentien, als Phorbolester bezeichnet, ihre pleiotropen Effekte auf Zellen ausüben (vgl. Gescher et al., "Anti-Cancer Drug Design" 1989, 4, 93-105). Phorbole, die einen Tumor bilden können, können den Effekt von DAG bei der Aktivierung der PKC imitieren, was vermuten lässt, dass diese Tumor- Promotoren über die PKC wirken und dass die Aktivierung dieses Enzyms mindestens teilweise verantwortlich ist für die resultierende Tumorgenese (vgl. Parker et al., "Science" 1986, 233, 853-866).
  • Der experimentelle Nachweis zeigt, dass die PKC eine Rolle bei der Wachstumskontrolle im Colon-Krebs spielt. Es wird angenommen, dass spezifische Bakterien in dem Intestinaltrakt Lipide in DAG umwandeln, wodurch die PKC aktiviert wird und die Zellproliferation verändert wird. Dies kann die Korrelation zwischen hohem Nahrungsmittelfettgehalt und Colon-Krebs erklären (vgl. Weinstein, "Cancer Res." (Suppl.) 1991, 51, 5080 s-5085 s). Es wurde außerdem gezeigt, dass ein größerer Anteil der PKC in der Colon-Schleimhaut von Patienten mit Colorectal-Krebs in einem aktivierten Zustand vorliegt, verglichen mit demjenigen von Patienten ohne Krebs (vgl. Sakanoue et al., "Int. J. Cancer" 1991, 48, 803-806).
  • Die erhöhte Neigung zur Tumorbildung steht auch in Korrelation mit der Überexpression der PKC in kultivierten Zellen, die in nackte Mäuse inokuliert wurden. Eine Mutanten-Form der PKC induziert hoch-maligne Tumorzellen mit einem erhöhten Metastase-Potential. Es wurde gezeigt, dass Sphingosin und verwandte Inhibitoren für die PKC-Aktivität das Tumorzellen-Wachstum und die durch Strahlung induzierte in vivo-Transformation hemmen (vgl. Endo et al., "Cancer Research" 1991, 51, 1613-1618; Borek et al., "Proc. Natl. Acad. Sci." 1991, 88, 1953-1957).
  • Eine Reihe von experimentell oder klinisch nützlichen Antikrebs-Arzneimitteln zeigen modulierende Effekte auf die PKC. Daher können PKC-Inhibitoren wichtige präventive oder therapeutische Krebsmittel sein. Die PKC wurde vorgeschlagen als ein plausibles Target für einen rationelleren Aufbau von konventionellen Antikrebs- Arzneimitteln (vgl. A. Gescher und I. L. Dale, "Anti-Cancer Drug Design" 1989, 4, 93- 105).
  • Experimente haben auch gezeigt, dass die PKC eine wichtige Rolle bei der Pathophysiologie von hyperproliferativen Hautstörungen wie Psoriasis und Hautkrebs spielen. Die Psoriasis ist charakterisiert durch eine Entzündung, eine Hyperproliferation der Epidermis und eine verminderte Differenzierung der Zellen. Verschiedene Untersuchungen haben gezeigt, dass die PKC eine Rolle spielt bei der Verursachung dieser Symptome. Es kann gezeigt werden, dass die PKC-Stimulierung in kultivierten Keratinozyten eine Hyperproliferation hervorruft. Eine Entzündung kann durch Phorbolester induziert werden und sie wird durch die PKC reguliert. DAG ist beteiligt an der Verwicklung der PKC in dermatologische Erkrankungen und er wird in erhöhtem Umfang bei psoriatischen Störungen gebildet.
  • Es wurde gezeigt, dass PKC-Inhibitoren in vivo sowohl einen antiproliferativen als auch einen antiinflammatorischen Effekt haben. Einige Antipsoriasis-Arzneimittel wie Cyclosporin A und Anthralin hemmen die PKC, wie gezeigt wurde. Die PKC- Hemmung (-Inhibierung) wurde vorgeschlagen als therapeutischer Weg für die Behandlung von Psoriasis (vgl. L. Hegeman und G. Mahrle, "Pharmacology of the Skin", H. Mukhtar, Ed., CRC Press, Boca Raton, FL, 1992, S. 357-368).
  • Die PKC ist nicht ein einzelnes Enzym, sondern eine Familie von Enzymen. Derzeit sind mindestens 7 Isoformen (Isozyme) der PKC identifiziert worden: die Isoformen α, β und γ wurden bis zur Homogenität gereinigt und die Isoformen δ, ε, ξ und η wurden durch molekulares Klonen identifiziert. Diese Isozyme weisen ausgeprägte Muster der Gewebe- und Organ-Lokalisierung auf (vgl. als allgemeinen Überblick Nishizuka, "Nature" 1988, 334, 661-665) und sie können unterschiedliche physiologische Funktionen haben. Beispielsweise scheint die PKC-γ nur in dem zentralen Nervensystem exprimiert zu werden. Die PKC-α und -β werden in den meisten Geweben exprimiert, sie weisen jedoch unterschiedliche Expressions-Muster in verschiedenen Zelltypen auf. Beispielsweise werden sowohl die PKC-α als auch die PKC-β in der Human-Epidermis exprimiert und sie wurden daraus gereinigt. Während die PKC-α hauptsächlich in den Keratinozyten der Basalschichten der Epidermis nachgewiesen wurde, wurde die PKC-β hauptsächlich in den mittleren Schichten der Epidermis und in den Langerhans'schen-Zellen gefunden. Die PKC-η wurde überwiegend in der Haut und in den Lungen gefunden mit Expressions-Werten, die viel höher in diesen Geweben sind als im Gehirn. Dies steht im Gegensatz zu anderen Mitgliedern der PKC-Familie, die meistens in großer Menge im Gehirn exprimiert werden (vgl. Osada et al., "J. Biol. Chem.", 1990, 265, 22434-22440). Während die hier aufgezählten PKC-Isozyme für die erfindungsgemäße Ansteuerung (Targeting) bevorzugt sind, umfasst die vorliegende Erfindung auch andere PKC-Isozyme.
  • Derzeit wird angenommen, dass unterschiedliche PKC-Isozyme an verschiedenen Erkrankungsprozessen beteiligt sein können je nach Organ oder Gewebe, in dem sie exprimiert werden. So tritt beispielsweise bei psoriatischen Störungen eine Veränderung des Verhältnisses zwischen PKC-α und PKC-β auf mit einem bevorzugten Verlust an PKC-β, verglichen mit normaler Haut (vgl. L. Hegemann und G. Mahrle, "Pharmacology of the Skin", H. Mukhtar, Ed., CRC press, Boca Raton, FL, 1992, S. 357-368).
  • Obgleich zahlreiche Verbindungen als PKC-Inhibitoren identifiziert worden sind (vgl. für einen allgemeinen Überblick Hidaka und Hagiwara, "Trends in Pharm. Sci.", 1987, 8, 162-164), wurde keine gefunden, die PKC spezifisch inhibiert (hemmt). Während Chinolinsulfonamid-Derivate wie 1-(5-Isochinolinsulfonyl)-2- methylpiperazin (H-7) die PKC in mikromolaren Konzentrationen hemmen, weisen sie ähnliche Enzym-Inhibierungs-Kinetiken für PKC und die cAMP-abhängigen und cGMP-abhängigen Proteinkinasen auf. Staurosporin, ein Alkaloidprodukt von Streptomyces sp., und seine Analoga sind die stärksten in vitro-Inhibitoren für PKC, die bisher identifiziert wurden. Sie weisen jedoch nur eine begrenzte Selektivität für unterschiedliche Proteinkinasen auf (vgl. Gescher, "Anti-Cancer Drug Design" 1989, 4, 93-105). So ist es bisher nicht gelungen, PKC unter anderen spezifisch zu inhibieren. Es besteht auch der Wunsch, spezifische PKC-Isozyme zu inhibieren, sowohl als Forschungs-Werkzeug als auch zur Behandlung von Erkrankungen, die mit speziellen Isozymen im Zusammenhang stehen können.
    • Ziele der Erfindung
  • Ein Hauptziel der Erfindung besteht darin, Therapien für neoplastische, hyperproliferative, inflammatorische und andere Krankheitszustände, die mit der Proteinkinase C im Zusammenhang stehen, zur Verfügung zu stellen.
  • Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, selektive Therapien für Erkrankungen, die mit speziellen Isozymen der Proteinkinase C in Verbindung stehen, bereitzustellen.
  • Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, Antisense-Oligonucleotide zur Verfügung zu stellen, die in der Lage sind, die Expression der Proteinkinase C zu modulieren.
  • Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, Antisense-Oligonucleotide bereitzustellen, die in der Lage sind, die Expression von speziellen Isozymen der Proteinkinase C selektiv zu modulieren.
  • Noch ein weiteres Ziel besteht darin, Mittel für die Diagnose von Erkrankungen bereitzustellen, die mit der Proteinkinase C im Zusammenhang stehen.
  • Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, Mittel für die differentielle Diagnose von Erkrankung bereitzustellen, die mit speziellen Isozymen der Proteinkinase C im Zusammenhang stehen.
  • Noch ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, Forschungswerkzeuge für die Untersuchung der Effekte der Proteinkinase C-Expression und der damit im Zusammenhang stehenden Erkrankungen bereitzustellen.
  • Ein zusätzliches Ziel der Erfindung besteht darin, Forschungswerkzeuge für die Untersuchung der Effekte der Expression von speziellen Isozymen der Proteinkinase C und der damit im Zusammenhang stehenden Erkrankungen bereitzustellen.
  • Diese und weitere Ziele der Erfindung gehen aus der Gesamtheit der nachstehenden Beschreibung hervor.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die Fig. 1(a) und 1(b) stellen graphische Darstellungen der Effekte von Antisense-Oligonucleotiden, die mit PKC-α hybridisierbar sind, auf die PKC-Expression dar. Die Oligonucleotide sind angeordnet in der 5'-3'-PKC-Target-Region.
  • Die Fig. 2 stellt ein Liniendiagramm dar, das die Dosis-abhängige Antisense- Oligonucleotid-Inhibierung der PKC-α-Protein-Synthese, ausgedrückt als Prozentsatz der Kontrolle (kein Oligonucleotid), zeigt. = ISIS 3520 (SEQ ID Nr. 1); = ISIS 3522 (SEQ ID Nr. 3); = ISIS 3527 (SEQ ID Nr. 5); = ISIS 4985 (SEQ ID Nr. 52); = ISIS 3521 (SEQ. ID Nr. 2).
  • Die Fig. 3 stellt ein Liniendiagramm dar, das die Dosis-abhängige Inhibierung der PKC-α-Proteinsynthese durch ISIS 4649, die 2'-O-Methyl-Version von ISIS 3522 (beide stellen Phosphorothioate dar) zeigt. = ISIS 4632; = ISIS 4636; = ISIS 4649; = ISIS 4648.
  • Die Fig. 4 stellt ein Balkendiagramm dar, das die Abnahme der Gehalte an PKC-α mRNA-Transkripten nach der Antisense-Oligonucleotid-Behandlung zeigt. Die schraffierten Balken repräsentieren das 8,5 kb Transkript und die weißen Balken repräsentieren das 4,0 kb Transkript.
  • Die Fig. 5 stellt ein Liniendiagramm dar, das die Antisense-Oligonucleotid- Inhibierung der A549-Zellproliferation zeigt. = ISIS 4559; ISIS = 4985; = ISIS 3521; = ISIS 3527.
  • Die Fig. 6 stellt eine Reihe von Liniendiagrammen dar, welche die Inhibierung der PKCα mRNA-Gehalte durch 2'-O-Methylphosphorothioat-Oligonucleotide zeigt, die 8-Dioxy-Lücken aufweisen, verglichen mit Voll-Deoxy-phospshorothioat- Oligonucleotiden, welche die gleiche Sequenz haben.
  • Die Fig. 6A zeigt die Daten für SEQ ID Nr. 2 (5357 ist ein Lücken-Oligonucleotid, 3521 ist ein Voll-Deoxy-Nucleotid). Die Fig. 6B zeigt die Daten für SEQ ID Nr. 3 (5352 ist ein Lücken-Oligonucleotid, 3522 ist ein Voll-Deoxy-Nucleotid). Die Fig. 6C zeigt die Daten für SEQ ID Nr. 5 (5240 ist ein Lücken-Oligonucleotid, 3527 ist ein Voll-Deoxy-Nucleotid).
  • Die Fig. 7 stellt ein Liniendiagramm dar, das die Beziehung zwischen der Länge der Deoxy-Lücke (in einem 2'-O-Methyl-oligonucleotid) und der Abnahme der PKCα mRNA-Gehalte durch Antisense-Oligonucleotide mit der SEQ ID Nr. 2, der SEQ ID Nr. 3 und der SEQ ID Nr. 5 zeigt.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Erfindungsgemäß werden Oligonucleotide bereitgestellt, die spezifisch hybridisierbar sind mit DNA oder RNA, die aus dem Gen stammt, das die PKC codiert. Das Oligonucleotid umfasst Nucleotid-Einheiten, die ausreichend sind in bezug auf die Identität und die Anzahl, um diese spezifische Hybridisierung zu bewirken. Diese Beziehung wird allgemein als "antisense" (nicht codierend) bezeichnet. Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die Oligonucleotide spezifisch hybridisierbar mit dem Translations-Initiations-Codon des Gens und vorzugsweise umfassen sie die Sequenz CAT. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die Oligonucleotide spezifisch hybridisierbar mit den 5'-nicht-translatierten oder 3'-nicht- translatierten Regionen des Gens. Bei noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden Oligonucleotide bereitgestellt, die spezifisch hybridisierbar sind mit DNA oder mRNA, die ein spezielles PKC-Isozym oder eine spezielle Gruppe von PKC- Isozymen codiert. Diese Oligonucleotide werden zweckmäßig und gewünschtenfalls in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger bereitgestellt.
  • Gemäß anderen bevorzugten Ausführungsformen sind die Oligonucleotide so formuliert, dass mindestens eine der verbindenden Gruppen zwischen den Nucleotid- Einheiten des Oligonucleotids eine Schwefel enthaltende Species, beispielsweise einen Phosphorothioat-Rest, umfasst. Bei noch anderen bevorzugten Ausführungsformen sind die Oligonucleotide so formuliert, dass mindestens eines der Nucleotide in der 2'-Position des Zuckers modifiziert ist. Einige Beispiele für diese bevorzugten Modifikationen sind 2'-O-Alkyl- und 2'-Fluor-Modifikationen.
  • Gemäß anderen Aspekten betrifft die Erfindung ex vivo-Verfahren zur Modulierung der Expression der PKC oder eines speziellen PKC-Isozyms oder einer Gruppe von Isozymen in Zellen oder Geweben. Gemäß weiteren Aspekten betrifft die Erfindung ex vivo-Verfahren zum Nachweis der DNA oder RNA, die PKC codiert, in Zellen oder Geweben und zum spezifischen Nachweis der RNA oder DNA, die insbesondere PKC-Isozyme codiert, in Zellen oder Geweben. Diese Verfahren umfassen das Inkontaktbringen von Zellen oder Geweben, von denen angenommen wird, dass sie das genannte Gen enthalten, mit erfindungsgemäßen Oligonucleotiden, um den Effekt der RNA oder DNA zu stören oder die RNA oder DNA nachzuweisen.
  • Weitere Aspekte der Erfindung betreffen die Verwendung des erfindungsgemäßen Oligonucleotids bei der Herstellung einer Zusammensetzung zum Modulieren der Expression von Proteinkinase C in Zellen oder Geweben. Diese Zusammensetzungen sind insbesondere verwendbar für die Behandlung oder Diagnose von Zuständen, die mit der Proteinkinase C im Zusammenhang stehen.
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Antisense-Oligonucleotide sind sehr vielversprechende therapeutische Agentien für die Behandlung von vielen Human-Erkrankungen. Oligonucleotide werden spezifisch gebunden (hybridisiert) an die komplementäre Sequenz der DNA, der Pre- mRNA oder der reifen mRNA, wie durch die Watson-Crick-Basenpaarbildung definiert, wobei sie den Strom der genetischen Informationen von der DNA zu dem Protein stören. Die Eigenschaften der Antisense-Oligonucleotide, die sie spezifisch für ihre Target-Sequenz machen, machen sie auch außerordentlich vielseitig. Da Antisense- Oligonucleotide lange Ketten von monomeren Einheiten sind, können sie leicht für jede Target-RNA-Sequenz synthetisiert werden. Zahlreiche jüngere Untersuchungen haben die Nützlichkeit von Antisense-Oligonucleotiden als biochemische Werkzeuge für die Untersuchung von Target-Proteinen dokumentiert (vgl. Rothenberg et al., "J. Natl. Cancer Inst.", 1989, 81, 1539-1544; G. Zon, "Pharmaceutical Res.", 1988, 5, 539-549). Aufgrund der jüngsten Fortschritte in der Oligonucleotid-Chemie und der Synthese von Nuclease-resistenten Oligonucleotiden, die eine verbesserte Zellaufnahme aufweisen, ist es nun möglich, die Verwendung von Antisense-Oligonucleotiden als eine neue Form von Therapeutika in Betracht zu ziehen.
  • Antisense-Oligonucleotide stellen eine ideale Lösung für die Probleme dar, die bei den Verfahren des Standes der Technik auftreten. Sie können so gestaltet werden, dass sie ein gegebenes Isozym oder eine spezielle Gruppe von Isozymen selektiv inhibieren oder alle Mitglieder einer gegebenen Familie von Isozymen inhibieren. Sie vermeiden nicht-spezifische Mechanismen, wie z. B. die Beseitigung von freien Radikalen. Ein vollständiges Verständnis des Enzym-Mechanismus ist nicht erforderlich, um spezifische Inhibitoren zu entwerfen.
  • Die derzeitigen Agentien, welche die Aktivität oder den Stoffwechsel von Proteinkinase C modulieren, weisen viele nicht akzeptable Nebenwirkungen auf als Folge ihres Mangels an Spezifität oder sie weisen nur eine begrenzte Wirksamkeit in bezug auf die Inhibierung (Hemmung) des Enzyms auf. Die vorliegende Erfindung umgeht die Probleme, die bei den früheren Arbeiten aufgetreten sind, durch Modulieren der Bildung des Enzyms anstatt durch direktes Inhibieren (Hemmen) des Enzyms, um den therapeutischen Effekt zu erzielen. Erfindungsgemäß ist das Oligonucleotid so konzipiert, dass es direkt an mRNA oder an ein Gen bindet, wodurch letztlich die Menge an PKC-Protein moduliert wird, die aus dem Gen gebildet wird.
  • Im Rahmen dieser Erfindung bezeichnet der Ausdruck "Oligonucleotid" ein Polynucleotid, das aus in der Natur vorkommenden Basen und Pentofuranosyl- Gruppen, die durch native Phosphodiester-Bindungen miteinander verbunden sind, gebildet wird. Dieser Ausdruck bezieht sich effektiv auf in der Natur vorkommende Species oder synthetische Species, die aus in der Natur vorkommenden Subeinheiten oder ihren nahen Homologen gebildet werden. Der Ausdruck "Oligonucleotid" kann sich auch auf Reste beziehen, die in ähnlicher Weise fungieren wie die in der Natur vorkommenden Oligonucleotide, die jedoch nicht in der Natur vorkommende Abschnitte aufweisen. So können Oligonucleotide veränderte Zuckerreste oder Interzucker-Verknüpfungen aufweisen. Beispiele dafür sind die Phosphorothioate und andere Schwefel enthaltende Species wie Phosphorodithioate, die für ihre Verwendung in dem Stand der Technik allgemein bekannt sind. Bei einigen bevorzugten Ausführungsformen ist mindestens eine der Phosphodiester-Bindungen des Oligonucleotids substituiert durch eine Struktur, die so fungiert, dass sie die Fähigkeit der Zusammensetzungen zum Eindringen in die Zellregion verbessert, in der die RNA oder DNA angeordnet ist, deren Aktivität moduliert werden soll. Es ist bevorzugt, dass diese Substitutionen Phosphorothioat-Bindungen, Methylphosphonat-Bindungen, kurzkettige Alkyl- oder Cycloalkyl-Strukturen oder durch ein Heteroatom substituierte kurzkettige Alkyl-Strukturen umfassen. Am meisten bevorzugt sind diejenigen mit CH&sub2;-NH-O-CH&sub2;-, CH&sub2;-N(CH&sub3;)-O-CH&sub2;-, CH&sub2;-O-N(CH&sub3;)-CH&sub2;-, CH&sub2;-N(CH&sub3;)- N(CH&sub3;)-CH&sub2;- und O-N(CH&sub3;)-CH&sub2;-CH&sub2;-Grundgerüsten (worin der Phosphodiester O- P-O-CH&sub2; ist). Bevorzugt sind auch Oligonucleotide mit Morpholino-Gerüststrukturen (vgl. J. E. Summerton und D. D. Weiler, US-Patent Nr. 5 034 506). Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen, beispielsweise dem Protein-Nucleinsäure (PNA)- Grundgerüst kann das Phosphodiester-Grundgerüst des Oligonucleotids durch ein Polyamid-Grundgerüst ersetzt sein, wobei die Basen direkt oder indirekt an die Aza- Stickstoffatome des Polyamid-Grundgerüsts gebunden sind (vgl. P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt, "Science" 1991, 254, 1497). Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen sind die Phosphodiester-Bindungen durch andere Strukturen substituiert, die gleichzeitig im wesentlichen nicht-ionisch und nicht-chiral sind, oder durch Strukturen, die chiral und enantiomer-spezifisch sind. Die Fachleute auf diesem Gebiet sind in der Lage, auch andere Verknüpfungen für die Verwendung bei der praktischen Durchführung der Erfindung auszuwählen.
  • Oligonucleotide können auch Species umfassen, die mindestens eine modifizierte Basenform aufweisen. Auf diese Weise können auch Purine und Pyrimidine, die von den normalerweise in der Natur vorkommenden verschieden sind, verwendet werden. In entsprechender Weise können auch Modifikationen an dem Pentofuranosyl-Abschnitt der Nucleoid-Subeinheiten durchgeführt werden, so lange an den wesentlichen Lehren der Erfindung festgehalten wird. Beispiele für solche Modifikationen sind 2'-O-Alkyl- und 2'-Halogensubstituierte Nucleotide. Einige spezifische Beispiele für Modifikationen an der 2'-Position von Zuckerresten, die erfindungsgemäß nützlich sind, sind OH, SH, SCH&sub3;, F, OCH&sub3;, OCN, O(CH&sub2;)nNH&sub2; oder O(CH&sub2;)nCH&sub3;, worin n für eine Zahl von 1 bis etwa 10 steht, sowie ander Substituenten, die ähnliche Eigenschaften aufweisen. Zuckerimitate (-ersatzstoffe), wie Cyclobutyle oder andere Carbocyclen, können ebenfalls anstelle der Pentofuranosyl-Gruppe verwendet werden. Chimäre Oligonucleotide, die zwei oder mehr chemisch unterschiedliche Regionen aufweisen, sind ebenfalls erfindungsgemäß verwendbar. Spezifische Beispiele für solche chimären Oligonucleotide sind solche, die in der 2'-Position modifiziert sind mit Ausnahme einer "Deoxy-Lücke" eines oder mehrerer Deoxynucleotide. Die "Deoxy-Lücke" kann zentral in dem Molekül vorhanden sein oder sie kann am oder in der Nähe eines Endes derselben angeordnet sein. Oligonucleotide mit Regionen mit unterschiedlichen chemischen Grundgerüsten sind ebenfalls Beispiele für chimäre Oligonucleotide.
  • Diese Oligonucleotide werden am besten beschrieben als funktionell austauschbar mit natürlichen Oligonucleotiden (oder entlang der natürlichen Reihen synthetisierten Oligonucleotiden), die jedoch einen oder mehrere Unterschiede gegenüber einer natürlichen Struktur aufweisen. Alle diese Oligonucleotide werden durch die vorliegende Erfindung umfasst, so lange sie wirksam fungieren zur Hybridisierung mit der PKC RNA. Die erfindungsgemäßen Oligonucleotide umfassen vorzugsweise etwa 5 bis etwa 50 Nucleotid-Einheiten. Besonders bevorzugt ist es, dass diese Oligonucleotide etwa 8 bis 30 Nucleotid-Einheiten umfassen, und ganz besonders bevorzugt umfassen sie etwa 12 bis 25 Nucleotid-Einheiten. Wie daraus ersichtlich, ist eine Nucleotid-Einheit eine Basen-Zucker-Kombination, die zweckmäßig über Phosphodiester- oder andere Bindungen an eine benachbarte Nucleotid-Einheit gebunden ist.
  • Die erfindungsgemäß verwendeten Oligonucleotide können zweckmäßig und routinemäßig hergestellt werden unter Anwendung der allgemein bekannten Technik der Festphasen-Synthese. Eine Vorrichtung für eine solche Synthese wird von mehreren Herstellern auf dem Markt angeboten, wie z. B. Applied Biosystems. Es kann auch jede andere Vorrichtung für diese Synthese verwendet werden; die jeweilige Synthese der Oligonucleotide liegt innerhalb des Fachwissens des Fachmannes. Es ist auch allgemein bekannt, ähnliche Techniken zur Herstellung anderer Oligonucleotide, beispielsweise der Phosphorothioate und alkylierten Derivate, anzuwenden.
  • Erfindungsgemäß ist für den Fachmann auf diesem Gebiet selbstverständlich, dass die Messenger-RNA nicht nur die Information zur Codierung eines Proteins unter Verwendung des genetischen Drei-Buchstaben-Codes, sondern auch für assoziierte Ribonucleotide, die eine Region bilden, die dem Fachmann bekannt ist als die 5'-nicht-translatierte Region, die 3'-nicht-translatierte Region, die 5'-Cap-Region, und für Intron/Exon-Verknüpfungs-Ribonucleotide umfasst. Erfindungsgemäß können somit Oligonucleotide formuliert werden, die vollständig oder teilweise auf diese assoziierten Ribonucleotide sowie die Informations-Ribonucleotide ausgerichtet (targeted) sind. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist das Oligonucleotid spezifisch hybridisierbar mit einer Transkriptions-Initiierungsstelle, einer Translations- Initiierungsstelle, einer 5'-Cap-Region, einer Intron/Exon-Verbindungsstelle, mit codierenden Sequenzen oder mit Sequenzen in der 5'- oder 3'-nicht-translatierten Region.
  • Die erfindungsgemäßen Oligonucleotide sind so konzipiert, dass sie mit der Messenger-RNA, die aus dem PKC-Gen stammt, hybridisierbar sind. Diese Hybridisierung stört, wenn sie vorgenommen wird, die normale Rolle der Messenger-RNA, sodass eine Modulation ihrer Funktion in der Zelle bewirkt wird. Die Funktionen der Messenger-RNA, die damit gestört werden sollen, umfassen alle vitalen Funktionen, beispielsweise die Transkription der RNA aus der DNA, die Translokation der RNA zu der Stelle für die Protein-Translation, die aktuelle Translation des Proteins aus der RNA, die Verspleissung der RNA unter Bildung einer oder mehrerer mRNA-Species und möglicherweise sogar eine unabhängige katalytische Aktivität, an der die RNA beteiligt sein kann. Der Gesamteffekt dieser Störung der RNA-Funktion ist der, die Expression des PKC-Gens zu modulieren.
  • Die erfindungsgemäßen Oligonucleotide können in Diagnostika, Therapeutika, für die Prophylaxe und als Forschungs-Reagentien und -Kits verwendet werden. Da die erfindungsgemäßen Oligonucleotide mit dem PKC-Gen und seiner mRNA hybridisieren, können leicht Sandwich- und andere Assays konstruiert werden, um diesen Umstand auszunutzen. Da die erfindungsgemäßen Oligonucleotide ferner spezifisch hybridisieren mit speziellen Isozymen der PKC-mRNA, können diese Assays zum Screenen von Zellen und Geweben für spezielle PKC-Isozyme konzipiert werden. Diese Assays können zur Diagnose von Erkrankungen verwendet werden, die mit verschiedenen PKC-Formen in Zusammenhang stehen. Die Bereitstellung von Einrichtungen für den Nachweis der Hybridisierung des Oligonucleotids mit dem PKC- Gen kann routinemäßig erfolgen. Diese Bereitstellung kann umfassen Enzymkonjugations-, radioaktive Markierungs- oder irgendwelche anderen geeigneten Nachweis- Systeme. Es können auch Kits zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit der PKC hergestellt werden.
  • Die Oligonucleotide werden erfindungsgemäß für die therapeutische oder prophylaktische Behandlung verabreicht. Die Oligonucleotide können zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert werden, die Träger, Verdickungsmittel, Verdünnungsmittel, Puffer, Konservierungsmittel, Tenside und dgl. zusätzlich zu dem Oligonucleotid enthalten kann. Pharmazeutische Zusammensetzungen können auch ein oder mehr aktive Bestandteile (Wirkstoffe), z. B. antimikrobielle Agentien, antiinflammatorische Agentien, Anästhetika und dgl. zusätzlich zu den Oligonucleotiden enthalten.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung kann auf verschiedenen Wegen verabreicht werden, je nachdem, ob eine lokale oder eine systemische Behandlung erwünscht ist und je nach dem zu behandelnden Bereich. Die Verabreichung kann topisch (einschließlich ophthalmisch, vaginal, rectal, intranasal), oral, durch Inhalation oder parenteral, beispielsweise durch intravenöses Eintropfen oder subcutan, intraperitoneal oder durch intramuskuläre Injektion erfolgen.
  • Die Formulierungen für die topische Verabreichung können umfassen Salben, Lotionen, Cremes, Gele, Tropfen, Suppositorien, Sprays, Flüssigkeiten und Pulver. Konventionelle pharmazeutische Träger, wässrige, pulverförmige oder ölige Basen, Verdickungsmittel und dgl. können erforderlich oder erwünscht sein. Es können auch beschichtete Kondome nützlich sein.
  • Zu Zusammensetzungen für die orale Verabreichung gehören Pulver oder Granulate, Suspensionen oder Lösungen in Wasser oder in nicht-wässrigen Medien, Kapseln, Sachets oder Tabletten. Verdickungsmittel, Geschmacksbildner, Verdünnungsmittel, Emulgatoren, Dispergierhilfsmittel oder Bindemittel können erwünscht sein.
  • Die Formulierungen für die parenterale Verabreichung können sterile wässrige Lösungen umfassen, die auch Puffer, Verdünnungsmittel und andere geeignete Additive enthalten können.
  • Die Dosierung hängt von der Schwere und dem Ansprechverhalten des zu behandelnden Zustandes ab, normalerweise werden jedoch eine oder mehrere Dosen pro Tag im Verlaufe der Behandlung verabreicht, die von mehreren Tagen bis zu mehreren Monaten dauert oder bis eine Heilung erreicht wird oder eine Linderung des Erkrankungszustandes erzielt wird. Die Fachleute auf diesem Gebiet können leicht die optimalen Dosen, die Dosierungs-Verfahren und die Wiederholungsraten bestimmen.
  • Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung, ohne sie jedoch darauf zu beschränken.
    • Beispiele Beispiel 1: Oligonucleotidsynthese
  • Nicht-modifizierte DNA-Oligonucleotide werden in einem automatisierten DNA- Synthesizer (Applied Biosystems, Modell 380B) unter Anwendung der Standard- Phosphoramidit-Chemie mit einer Oxidation durch 10d synthetisiert. Die β- Cyanoethyldiisopropyl-phosphoramidite werden von der Firma Applied Biosystems (Foster City, CA) bezogen. Zur Herstellung der Phosphorothioat-Oligonucleotide wird die Standard-Oxidationsflasche durch eine 0,2 M-Lösung von 3H-1,2-Benzodithiol-3- on-1,1-dioxid in Acetonitril ersetzt zur stufenweisen Thiatierung der Phosphit- Verknüpfungen. Die Thiatierungs-Cyclus-Wartestufe wird verlängert auf 68 Sekunden und daran schließt sich die Verkappungsstufe an.
  • Nach der Abtrennung in der kontrollierten Porenglas-Kolonne (Applied Biosystems) und der Deblockierung in konzentriertem Ammoniumhydroxid für 18 h bei 55ºC werden die Oligonucleotide durch zweimalige Ausfällung aus 0,5 M NaCl mit 2,5 Volumenteilen Ethanol gereinigt. Die analytische Gelelektrophorese wird in 20% Acrylamid, 8 M Harnstoff, 45 mM Tris-boratpuffer, pH 7,0, durchgeführt.
    • Beispiel 2: Zellkultivierung und Behandlung mit Phorbolestern und Oligonucleotiden, die auf PKC-α ausgerichtet sind
  • Es ist angegeben, dass die PKC-Protein-Halbwertszeiten (Halblebenszeiten) von 6,7 h bis mehr als 24 h variieren (vgl. Young et al., "Biochem. J.", 1987, 244, 775-779; Ballester et al., "J. Biol. Chem.", 1985, 260, 15194-15199). Diese langen Halbwertszeiten machen die Inhibierung von Gleichgewichtszustands-Gehalten von PKC-α zu einem umständlichen Verfahren beim Screening von Antisense-Oligoucleotiden aufgrund der langen Inkubationszeiten, die erforderlich wären. Bisher wurde daher die Fähigkeit der Phorbolester, reversibel die intrazellulären PKC- Gehalte zu senken, ausgenutzt. Die Behandlung der Zellen mit Phorbolestern führt zu einer anfänglichen Aktivierung der Kinase-Aktivität, woran sich eine Herunter- Regulierung der PKC anschließt. Für PKC-α wurde gezeigt, dass diese Herunter- Regulierung eine direkte Folge einer erhöhten Proteolyse-Rate der Kinase ohne eine scheinbare Veränderung der Syntheserate ist.
  • Es wurde anfänglich bestimmt, dass in Human-Lungencarcinom-Zellen (A549) die Behandlung mit dem Phorbolester-12,13-dibutyrat (PDBu) unter Anwendung eines Modifikation des Verfahrens von Krug et al. in "J. Biol. Chem." 1987, 262, 11852- 11856, tatsächlich die Zellen-Gehalte an PKC-α abnahmen, ohne die PKC-α mRNA- Gehalte zu beeinflussen, und dass dieser Effekt reversibel war. Die Basis für den Assay zum Screening in bezug auf die Stärke der Oligonucleotid-Ausrichtung auf PKC-α besteht darin, dass anfänglich die PKC-α-Protein-Gehalte durch die chronische Behandlung mit PDBu abnehmen, das PDBu durch intensives Waschen der Zellen entfernt wird (sodass die Zellen frisches PKC-α-Protein synthetisieren können) und die Zellen mit Oligonucleotiden inkubiert werden, die dazu bestimmt sind, die erneute Synthese von neuem PKC-α-Protein zu hemmen.
  • Es wurden A549-Zellen (erhalten von der American Type Culture Collection, Bethesda, MD) gezüchtet bis zur Konfluenz in Tüpfelplatten mit 6 Vertiefungen (Falcon Labware, Lincoln Park, NJ) in einem Dulbecco-modifizierten Eagle-Medium (DME), das 1 g Glucose/l und 10% fetales Kalbsserum (FCS, Irvine Scientific, Santa Ana, CA) enthielt.
  • Die Zellen wurden mit 500 nM PDBu (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO) 12 bis 16 h lang (über Nacht) behandelt. Dann wurden die Zellen 3 mal in DME bei 37ºC gewaschen und es wurde 1 ml DMA, enthaltend 20 ul DOTMA (Lipofectin-Reagens, BRL, Bethesda, MD), zugegeben. Es wurden Phosphorothioat-Oligonucleotide bis zu einer Konzentration von 1 uM zugegeben und die Zellen wurden weitere 4 h lang bei 37ºC inkubiert.
  • Die Zellen wurden einmal in 3 ml DME, enthaltend 0,1 mg/ml BSA, gewaschen und es wurden weitere 2 ml DME, enthaltend 0,1 mg/ml BSA, zugegeben. Es wurden Phosphorothioat-Oligonucleotide (1 uM) zugegeben und die Zellen wurden 24 h lang bei 37ºC inkubiert.
  • Die Zellen wurden 3 mal mit einer Phosphat-gepufferten Salzlösung (PBS) gewaschen und die Zell-Proteine wurden mit 120 ul Probenpuffer (60 mM Tris, pH 6,8, 2% SDS, 10% Glycerin, 10 mM Dithiothreit) extrahiert und 5 min lang zum Sieden erhitzt. Die intrazellulären Gehalte an PKC-α-Protein wurden durch Immunoblotting bestimmt.
  • Die in diesem Assay getestes Oligonucleotide sind in der Tabelle 1 angegeben. Die Sequenzdaten stammen aus der cDNA-Sequenz, publiziert von Finkenzeller et al. in "Nucl. Acids Res." 1990, 18, 2183; die Sequenz-Nummern, die unter den Oligonucleotiden angegeben sind, beziehen sich auf den ersten Rest, der an der cDNA sequenziert werden soll, der 28 Reste stromaufwärts von dem ATG-Start-Codon liegt. Tabelle 1 Oligonucleotide, ausgerichtet auf Human-PKC-α (alle stellen Phosphorothioate dar)
    • Beispiel 3: Immunoblot-Assay für die PKC-Expression
  • Die Zellextrakte wurden auf 10% SDS-PAGE-Minigels elektrophoretisiert. Die aufgelösten Proteine wurden auf eine Immobilon-P-Membran (Millipore, Bedford, MA) durch elektrophoretische Übertragung übertragen und die Membran wurde 60 min lang in TBS (Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl), enthaltend 5% fettfreie Milch blockiert. Die Membran wurde dann 16 h lang bei 4ºC mit monoklonalen Antikörpern, die gegenüber PKC-α entwickelt worden waren (UBI, Lake Placid, NY), verdünnt auf 0,2 ug/ml in TBS, enthaltend 0,2% fettfreie Milch, inkubiert. Danach wurde 3 mal in TBS plus 0,2% fettfreie Milch gewaschen. Die Membran wurde dann 1 h lang mit einem ¹²&sup5;I-markierten Ziegen-Anti-Maus-Sekundär-Antikörper (ICN Radiochemicals, Irvine, CA) inkubiert. Dann wurden die Membranen mit TBS plus 0,2% fettfreier Milch gründlich gewaschen. Die Banden wurden sichtbar gemacht und quantitativ bestimmt unter Verwendung eines Phosphorimagers (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Die PKC-α erscheint als einzelne Bande mit einem Molekulargewicht von 80 kD auf.
  • Jedes Oligonucleotid wurde 3 mal in dreifacher Ausfertigung getestet und die Ergebnisse der Versuche wurden in bezug auf den Prozentsatz des vorhandenen Proteins genormt im Vergleich zu Zellen, die nicht mit Oligonucleotid behandelt worden waren (Fig. 1). Die fünf wirksamsten Oligonucleotide steuerten den AUG-Start- Codon und die etwas stromaufwärts und stromabwärts davon gelegenen Regionen an (Oligos 1, 3, 17, 7, 6). Die nächst-wirksamsten Oligonucleotide steuerten die 3'- nicht-translatierte Region der RNA an (Oligos 2, 5, 14).
    • Beispiel 4: Andere PKC-Isozyme
  • Es wurde gefunden, dass die wirksamsten Sequenzen für das Antisense- Ansteuern (Targeting) von Human-PKCα diejenigen sind, die das Translations- Initiations-Codon und die 3'-nicht-translatierte Region umgeben. Es wird angenommen, dass diese Sequenzen auch wirksame Targets für Oligonucleotide wären, die auf andere PKC-Isozyme gerichtet sind. Die anderen Numan-PKC-Isozyme, für welche Sequenzdaten zur Verfügung stehen, sind PKC-β (Typen I und II), PKC-γ (partielle Sequenz) und PKC-η. Antisense-Oligonucleotide, die wahrscheinlich wirksame PKC-Inhibitoren sind, sind nachstehend angegeben. Diese Oligonucleotide werden synthetisiert wie in Beispiel 1 und können wie in den Beispielen 2 und 3 einem Screening unterworfen werden unter Verwendung geeigneter Antikörper, falls verfügbar. Alternativ kann ein Reporter-Gen-Assay-System aufgebaut werden, in dem das gewünschte PKC-Isozym intermediär coexprimiert wird mit Luciferase unter dem Einfluss eines TPA-Ansprech-Verstärkers oder eines anderen geeigneten Promotors. Die PKC-Expression wird dann bestimmt durch Messung der Luciferase- Aktivität unter Anwendung von Standard-Verfahren: Luciferase wird durch Lysis mit dem Detergens Triton X-100 aus Zellen extrahiert, wie von M. E. Greenberg in "Current Protocols in Molecular Biology", F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. A. Smith, J. G. Seidman und K. Strahl, Eds., John Wiley and Sons, NY (1987), beschrieben. Zur Messung der Peak-Lumineszenz nach der Zugabe von bis zu 625 uM Luciferin (Sigma) wird ein Dynatech ML1000-Luminometer verwendet.
    • PKC-β, Typen I und II
  • Die Sequenzdaten stammen von Kubo et al., "FEBS Lett." 1987, 223, 138- 142; die Sequenzen sind numeriert ab der ersten 5'-Base, die auf der cDNA sequenziert worden ist. Die PKC-β-Typen I und II sind das Ergebnis der alternativen mRNA- Verspleissung eines einzelnen Genprodukts. Dies führt zu Proteinen mit identischen Amino-Endgruppen (5'-Ende von mRNA); es liegt jedoch eine Sequenz-Divergens an den Carboxy-Enden vor (3'-Ende der mRNA). Die folgenden Oligonucleotide, die auf das Translations-Initiations-Codon gerichtet (targetet) sind, modulieren, wie angenommen wird, die Expression der beiden PKC-β-Typen I und II: Tabelle 2 Oligonucleotide, gerichtet auf die PKC-β-Typen I und II
  • Die folgenden Antisense-Oligonucleotide sind auf die 3'-nicht-translatierte Region nur des PKC-β Typs I gerichtet: Tabelle 3 Oligonucleotide, gerichtet auf den PKC-β Typ I
  • Die folgenden Antisense-Oligonucleotide sind auf die 3'-nicht-translatierte Region nur des PKC-β Typs II gerichtet: Tabelle 4 Oligonucleotide, gerichtet auf den PKC-β Typ II
    • PKC-γ:
  • Die Sequenzdaten stammen von Coussens et al. aus "Science" 1986, 233, 859-866; die Sequenzen sind numeriert ab der ersten 5'-Base, die in der cDNA- sequenziert worden ist. Die volle Sequenz ist nicht verfügbar: das äußere 3'-Ende des offenen Leserasters und die 3'-nicht-translatierte Region fehlen. Infolgedessen sind diese Regionen als Antisense-Targets derzeit nicht verfügbar. Tabelle 5 Oligonucleotide, gerichtet auf PKV-γ
    • PKC-η
  • Die Sequenzdaten für PKC-η stammen von Bacher und Kollegen [Bacher et al., "Mol. Cell. Biol.", 1.991, 11, 126-133]. Sie geben ihrem Isozym den Namen PKC- L; die Sequenz ist jedoch nahezu identisch mit derjenigen der Maus-PKC-η, sodass die letztgenannte Nomenklatur aus Einheitlichkeitsgründen hier angewendet wird. Die Sequenzen sind numeriert ab der ersten 5'-Base, die in der cDNA sequenziert wurde. Tabelle 6 Oliqonucleotide, gerichtet auf PKC-η
    • Beispiel 5: Die Oligonucleotid-Inhibierung der PKC ist dosenabhängig
  • Vier Oligonucleotide, die in der Fig. 1 als aktiv gegenüber PKC-α dargestellt worden sind, wurden weiter charakterisiert. Die Dosenansprech-Untersuchungen von ISIS 3520 (SEQ ID Nr. 1), 3521 (SEQ ID Nr. 2), 3522 (SEQ ID Nr. 3) und 3527 (SEQ ID Nr. 5) unter Anwendung des Immunoblotting-Assays, wie er in Beispiel 3 beschrieben ist, zeigten, dass sie alle eine dosenabhängige Aktivität gegenüber der PKC-α-Protein-Expression aufwiesen. ISIS 3521, 3522 und 3527 wiesen IC&sub5;&sub0;-Werte von 100 bis 200 nM auf und sie inhibierten alle maximal die PKC-Expression bei 500 nM. Dies ist in der Fig. 2 dargestellt. ISIS 4985 (SEQ ID Nr. 52), ein scrambled Kontroll-Oligonucleotid mit der gleichen Basen-Zusammensetzung wie ISIS 3527, war wirkungslos.
    • Beispiel 6: Synthese von 2'-O-Methylphosphorothioat-Oligonucleotiden
  • 2'-O-Methylphosphorothioat-Oligonucleotide wurden synthetisiert unter Verwendung von 2'-O-Methyl-β-cyanoethyldiisopropyl-phosphoramiditen (Chemgenes, Needham, MA) und der Standard-Cyclus für nicht-modifizierte Oligonucleotide mit Ausnahme der Wartestufe nach der Impuls-Zuführung von Tetrazol und einer Base wurde auf 360 s verlängert. Die zum Start der Synthese verwendete 3'-Base war ein 2'-Deoxyribonucleotid.
    • Beispiel 7: Effekt der 2'-O-methylierten Version von ISIS 3522 auf die PKC-α- Proteinsynthese
  • Ein einheitliches 2'-O-Methyl-modifiziertes Phosphorothioat-Oligonucleotid, ISIS 4649, das die gleiche Sequenz wie das Phosphorothioat-Oligonucleotid ISIS 3522 (SEQ ID Nr. 3) aufwies, war in der Lage, die PKC-Proteinsynthese zu hemmen (nachgewiesen durch Immunoblotting, wie in Beispiel 3 beschrieben) mit einer IC&sub5;&sub0; von weniger als 300 nM. Dies ist in der Fig. 3 dargestellt.
    • Beispiel 8: Effekt von Oligonucleotiden auf die PKC-α mRNA-Expression
  • Um die Effekte der Oligonucleotide auf die PKC-α mRNA-Gehalte zu bestimmen, wurden A549-Zellen bei der angegebenen Konzentration in Gegenwart von kationischen Liposomen 4 h lang mit Oligonucleotiden behandelt. Die gesamte zelluläre RNA wurde durch Lysis in 4M Guanidiniumisothiocyanat, gefolgt von einem Cäsiumchlorid-Gradienten, aus den Zellen isoliert. Die gesamte RNA (15 bis 30 ug) wurde auf 1,2% Agarosegelen, die 1,1% Formaldehyd enthielten, aufgelöst und auf Nylon- Membranen übertragen. Die Membranen wurden dann mit Rinder-PKC-α cDNA, die von ATCC (Bethesda, MD) erhalten worden war, hybridisiert. Die cDNA wurde mit ³²P radioaktiv markiert mit [α-³²P]dCTP durch Random-Primer-Markierung unter Verwendung eines handelsüblichen Kits (Promega) nach den Angaben des Herstellers. Die Filter wurden 60 min lang in einer Quikhyb-Lösung (Stratagene, San Diego, CA) bei 68ºC hybridisiert. Darauf folgten zwei weniger strenge Waschvorgänge (2x SSC/0,1% SDS) bei Raumtemperatur und zwei sehr strenge Waschvorgänge (0,1x SSC/0,1% SDS) bei 60ºC. Die Hybridisierungsbanden wurden sichtbar gemacht und quantitativ bestimmt unter Verwendung eines Phosphorimagers. Die Blots wurden dann radioaktiv gestrippt durch Erhitzen unter Sieden und es wurde erneut eine Sonde daraus hergestellt mit einer ³²P-markierten Glycerin-3-phosphat-dehydrogenase (G3PDH)-Sonde (Clontech), um die gleiche RNA-Beladung zu bestätigen.
  • Die Northern-Analyse der Gesamt-RNA aus A549-Zellen unter Verwendung der PKC-α-spezifischen cDNA-Sonde zeigte zwei Haupt-Hybridisierungstranskripte mit einer Größe von etwa 8,5 kb und 4,0 kb. Typischerweise werden diese in einem Verhältnis 2 : 1 exprimiert, wobei das größere Transkript überwiegt. Wenn A549-Zellen mit Antisense-Oligonucleotiden in einer Menge von 500 nM 4 h lang in Gegenwart von DOTMA behandelt und dann weitere 20 h lang inkubiert wurden, nahmen die Gehalte an beiden Transkripten ab. Dies ist in der Fig. 4 dargestellt. Die stärkste Abnahme war zu erkennen bei den Oligonucleotiden ISIS 3521 (SEQ ID Nr. 2) und 3527 (SEQ ID Nr. 5), die beide spezifisch hybridisierbar sind mit 3'-nicht-translatierten Sequenzen. Diese verringerten die Mengen an PKC-α mRNa um 90 bis 95%. ISIS 3522 (SEQ ID Nr. 3), gerichtet auf das Translations-Start-Codon, verminderte die PKC-α mRNa-Gehalte um 80% und ISIS 3520 (SEQ ID Nr. 1) verminderte die PKC mRNA-Gehalte um 40%. Alle Oligonucleotide wiesen IC&sub5;&sub0;-Werte von etwa 200 nM für die PKC mRNA-Reduktion auf. Scrambled Kontroll-Oligonucleotide zeigten bei dieser Konzentration keine Wirkung.
  • Die Kinetik der Antisense-Oligonucleotid-Verminderung der PKC mRNA- Gehalte war ähnlich bei den vier getesteten Oligonucleotiden. Innerhalb von 4 Stunden nach der Oligonucleotid-Zugabe trat eine PKC RNA-Abnahme um 60 bis 70% der maximalen Abnahme auf und innerhalb von 12 bis 24 Stunden nach der Oligonucleotid-Zugabe trat eine maximale Abnahme auf.
    • Beispiel 9: Spezifische Inhibierung der PKC-α durch Antisense-Oligonucleotide
  • Es wurde gezeigt, dass A549-Zellen normalerweise zusätzlich zu PKC-α PKC- δ, -ε und - exprimieren. Die Spezifität der Inhibierung des PKC-α-Isozyms durch Antisense-Oligonucleotide, die auf dieses Isozym gerichtet sind, wurden in diesen Zellen gezeigt durch Immunoblotting nach der Behandlung mit ISIS 3521 (SEQ ID Nr. 2), ISIS 3522 (SEQ ID Nr. 3) oder ihren scrambled Kontroll-Oligonucleotiden ISIS 4559 (SEQ ID Nr. 53) und ISIS 4608 (SEQ ID Nr. 54). A549-Zellen wurden 4 Stunden lang mit dem Oligonucleotid (entweder mit 400 nM oder 300 nM) und DOTMA behandelt, gewaschen und 48 h lang sich erholen gelassen. Die Zellen wurden dann erneut mit dem Oligonucleotid (250 nM) und DOTMA behandelt, gewaschen und sich weitere 20 Stunden lang erholen gelassen. Die Zellextrakte wurden elektrophoretisiert, auf eine Membran übertragen und blockiert wie in Beispiel 3 beschrieben. Die Membran wurde dann über Nacht mit jedem der folgenden Antikörper, verdünnt in 0,5% fettfreier Milch, in TBS behandelt: monoklonaler Anti-PKC-α, -β oder -γ (Upstate Biochemicals, Inc.), 1 ug/ml; polyclonaler Anti-PKC-δ oder - (Gibco BRL), Verdünnung 1 : 2000; Anti-PKC-ε [Huwiler et al., "Biochem. J.", 1991, 279, 441-445], Verdünnung 1 : 4000; oder Anti-PKC-η, Verdünnung 1 : 4000. Auf die Antikörper- Inkubation folgten drei Waschgänge in TBS, das 0,1% fettfreie Milch enthielt, und die Membran wurde dann 1 Stunde lang mit 5 uCi ¹²&sup5;I-Ziegen-Anti-Kaninchen- oder Anti- Maus-Antikörper (ICN Radiochemicals, Irvine, CA) inkubiert. Die Membranen wurden gründlich gewaschen und die markierten Proteine wurden sichtbar gemacht und quantitativ bestimmt unter Verwendung eines Phosphorimagers (Molecular Dynamics, CA).
  • Die Analyse der nach der Oligonucleotid-Behandlung exprimierten PKC- Isozyme zeigte, dass die Gehalte an PKC-δ, -ε und - durch die Behandlung jeweils mit den Antisense-Oligonucleotiden oder ihren scrambled Kontrollen unverändert waren. Die Antisense-Oligonucleotide verminderten die PKC-α-Expression um 70 bis 80%, während die scrambled Kontrollen keine Wirkung hatten.
    • Beispiel 10: Wirkung der Oligonucleotide auf die A549-Zellen-Proliferation
  • A549-Zellen wurden in Tüpfelplatten mit 6 Vertiefungen in einer Konzentration von 4000 Zellen pro Vertiefung ausgestrichen. Nach 24 Stunden wurden die Zellen 3 mal in DMEM gewaschen und dann wurden die Oligonucleotide bis zu der erforderlichen Konzentration in Gegenwart von 20 ug/ml DOTMA 4 Stunden lang zugegeben. Dann wurden die Zellen einmal in DMEM plus 5% FCS gewaschen und in DMEM plus 5% FCS weitere 72 Stunden lang wachsen gelassen. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Zellen zweimal in PBS gewaschen, aus den Petrischalen mit Trypsin entfernt und mit einem Hämocytometer ausgezählt.
  • Die Inhibierung der A549-Zellen-Proliferation durch ISIS 3521 und ISIS 3527 war zu erkennen nach einer einzigen Oligonucleotid-Dosis von 250 bis 500 nM. Dies ist in der Fig. 5 dargestellt.
    • Beispiel 11: Inhibierung der PKCα durch chimäre Antisense-Oligonucleotide
  • Chimäre Phosphorothioat-Oligonucleotide, die "Deoxy-Lücken" von 4 bis 8 Deoxynucleotiden in einem ansonsten 2'-O-Methyloligonucleotid aufwiesen, wurden getestet in bezug auf ihre Fähigkeit, die PKCα mRNA-Gehalte zu verringern, wie in Beispiel 8 beschrieben. Die chimären Oligonucleotide waren in bezug auf die Sequenz identisch mit ISIS 3521 (SEQ ID Nr. 2), ISIS 3522 (SEQ ID Nr. 3) und ISIS 3527 (SEQ ID Nr. 5). Die chimären Oligonucleotide sind in der Tabelle 7 dargestellt. Tabelle 7 PKC-α-Lücken-Oligonucleotide Der Fettdruck zeigt 2'-O-Methylnucleotide an Alle Oligonucleotide sind Phosphorothioate
  • Die 8-Deoxy-Lücken-Oligonucleotide waren in der Lage, die PKC-α mRNA- Gehalte um mindestens 85% zu verringern. Die Aktivität von 8-Deoxy-Lücken- Oligonucleotiden im Vergleich zu lückenfreien Oligonucleotiden mit der gleichen Sequenz ist in den Fig. 6A, 6B und 6C dargestellt. Zwei der 6-Dioxy-Lücken-Oligonucleotide (ISIS 5361, SEQ ID Nr. 2 und ISIS 5350, SEQ ID Nr. 3) waren in der Lage, die PKC-α mRNA-Gehalte um mehr als 50% zu verringern und eines der 4-Deoxy- Lücken-Oligonucleotide (ISIS 3522, SEQ ID Nr. 3) war in der Lage, die PKC-α mRNA-Gehalte um etwa 85% zu inhibieren (hemmen). Die Aktivität in Abhängigkeit von der Länge der Deoxy-Lücke für die Oligonucleotide mit der SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 5 ist in der Fig. 7 dargestellt.
    • Beispiel 12: Oligonucleotid-Behandlung von Human-Tumorzellen in nackten Mäusen
  • Es wurden Human-Lungencarcinom-Zellen A549 geerntet und 5 · 10&sup6; Zellen wurden subcutan in das Innere des Hinterlaufs von nackten Mäusen injiziert. Innerhalb von etwa einem Monat entwickelten sich tastbare Tumoren. Die Antisense- Oligonucleotide ISIS 3521 und ISIS 3527 wurden in zwei Dosen, 1 und 10 mg/kg Körpergewicht, ein über den anderen Tag sechs Wochen lang intraperitoneal den Mäusen verabreicht. Die Mäuse wurden überwacht zur Bestimmung des Tumor- Wachstums und nach 6 Wochen wurden die Tumoren entnommen und die PKC-α- Expression wurde durch Northern-Blot und Immunoblot bestimmt.
    • Sequenzliste (1) Generelle Information
  • (i) Anmelder: Nicholas Dean, C. Frank Bennett
  • (ii) Titel der Erfindung: Oligonucleotid-Modulation von Proteinkinase C
  • iii) Anzahl der Sequenzen: 51
  • (iv) Korrespondenzadresse:
  • (A) Adressat: Woodcock Washburn Kurtz Mackiewics & Norris
  • (B) Straße: One Liberty Place - 46. Stock
  • (C) Stadt: Philadelphia
  • (D) Staat: PA
  • (E) Land: USA
  • (F) Postleitzahl : 19103
  • (v) Computerlesbare Form
  • (A) Typ des Mediums: Diskette, 3,5 Inch, 1,44 MB-Speicherkapazität
  • (B) Computer: IBM PS/2
  • (C) Betriebssystem: PC-DOS
  • (D) Software: Wordperfect 5.0
  • (vi) laufende Anmeldungsdaten:
  • (A) Anmeldungs-Nr.: n/a
  • (B) Einreichungstag: hiermit
  • (C) Klassifizierung:
  • (vii) Daten der Prioritätsanmeldung:
  • (A) Anmeldung Nr.:
  • (B) Einreichungstag:
  • (viii) Informationen über den Anwalt:
  • (A) Name: Jane Massey Licata
  • (B) Registrier-Nr.: 32 257
  • (C) Referenz/Docket-Nr.: ISIS-0872
  • (ix) Telekommunikations-Informationen:
  • (A) Telefon: (215) 568-3100
  • (B) Telefax: (215) 568-3439
    • (2) Informationen für SEQ ID Nr. 1:
  • (i) Sequenz-Charakteristiken:
  • (A) Länge: 20
  • (B) Typ: Nucleinsäure
  • (C) Strängigkeit: Einzelstrang
  • (D) Topologie: linear
  • (iv) ANTI-SENSE: ja (xi) Sequenz-Beschreibung: SEQ ID Nr. 1:
    • (2) Informationen für SEQ ID Nr. 2:
  • (i) Sequenz-Charakteristiken:
  • (A) Länge: 20
  • (B) Typ: Nucleinsäure
  • (C) Strängigkeit: Einzelstrang
  • (D) Topologie: linear
  • (iv) ANTI-SENSE: ja (xi) Sequenz-Beschreibung: SEQ ID Nr. 2:
    • (2) Informationen für SEQ ID Nr. 3:
  • (i) Sequenz-Charakteristiken:
  • (A) Länge: 20
  • (B) Typ: Nucleinsäure
  • (C) Strängigkeit: Einzelstrang
  • (D) Topologie: linear
  • (iv) ANTI-SENSE: ja (xi) Sequenz-Beschreibung: SEQ ID Nr. 3:
    • (2) Informationen für SEQ ID Nr. 4:
  • (i) Sequenz-Charakteristiken:
  • (A) Länge: 20
  • (B) Typ: Nucleinsäure
  • (C) Strängigkeit: Einzelstrang
  • (D) Topologie: linear
  • (iv) ANTI-SENSE: ja (xi) Sequenz-Beschreibung: SEQ ID Nr. 4:
    • (2) Informationen für SEQ ID Nr. 5:
  • (1) Sequenz-Charakteristiken:
  • (A) Länge: 20
  • (B) Typ: Nucleinsäure
  • (C) Strängigkeit: Einzelstrang
  • (D) Topologie: linear
  • (iv) ANTI-SENSE: ja (xi) Sequenz-Beschreibung: SEQ ID Nr. 5:
    • (2) Informationen für SEQ ID Nr. 6:
  • (i) Sequenz-Charakteristiken:
  • (A) Länge: 20
  • (B) Typ: Nucleinsäure
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  • (D) Topologie: linear
  • (iv) ANTI-SENSE: ja (xi) Sequenz-Beschreibung: SEQ ID Nr. 6:
    • (2) Informationen für SEQ ID Nr. 7:
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  • (A) Länge: 20
  • (B) Typ: Nucleinsäure
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  • (D) Topologie: linear
  • (iv) ANTI-SENSE: ja (xi) Sequenz-Beschreibung: SEQ ID Nr. 7:
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  • (A) Länge: 20
  • (B) Typ: Nucleinsäure
  • (C) Strängigkeit: Einzelstrang
  • (D) Topologie: linear
  • (iv) ANTI-SENSE: ja (xi) Sequenz-Beschreibung: SEQ ID Nr. 8:
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  • (A) Länge: 20
  • (B) Typ: Nucleinsäure
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    • (2) Informationen für SEQ ID Nr. 10:
  • (i) Sequenz-Charakteristiken:
  • (A) Länge: 20
  • (B) Typ: Nucleinsäure
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  • (B) Typ: Nucleinsäure
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  • (D) Topologie: linear
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  • (B) Typ: Nucleinsäure
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  • (i) Sequenz-Charakteristiken:
  • (A) Länge: 20
  • (B) Typ: Nucleinsäure
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  • (D) Topologie: linear
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  • (i) Sequenz-Charakteristiken:
  • (A) Länge: 20
  • (B) Typ: Nucleinsäure
  • (C) Strängigkeit: Einzelstrang
  • (D) Topologie: linear
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  • (i) Sequenz-Charakteristiken:
  • (A) Länge: 20
  • (B) Typ: Nucleinsäure
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  • (B) Typ: Nucleinsäure
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  • (1) Sequenz-Charakteristiken:
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  • (A) Länge: 20
  • (B) Typ: Nucleinsäure
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  • (D) Topologie: linear
  • (iv) ANTI-SENSE: ja (xi) Sequenz-Beschreibung: SEQ ID Nr. 42:
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  • (i) Sequenz-Charakteristiken:
  • (A) Länge: 20
  • (B) Typ: Nucleinsäure
  • (C) Strängigkeit: Einzelstrang
  • (D) Topologie: linear
  • (iv) ANTI-SENSE: ja (xi) Sequenz-Beschreibung: SEQ ID Nr. 43:
    • (2) Informationen für SEQ ID Nr. 44:
  • (i) Sequenz-Charakteristiken:
  • (A) Länge: 20
  • (B) Typ: Nucleinsäure
  • (C) Strängigkeit: Einzelstrang
  • (D) Topologie: linear
  • (iv) ANTI-SENSE: ja (xi) Sequenz-Beschreibung: SEQ ID Nr. 44:
    • (2) Informationen für SEQ ID Nr. 45:
  • (i) Sequenz-Charakteristiken:
  • (A) Länge: 20
  • (B) Typ: Nucleinsäure
  • (C) Strängigkeit: Einzelstrang
  • (D) Topologie: linear
  • (iv) ANTI-SENSE: ja (xi) Sequenz-Beschreibung: SEQ ID Nr. 45:
    • (2) Informationen für SEQ ID Nr. 46:
  • (i) Sequenz-Charakteristiken:
  • (A) Länge: 20
  • (B) Typ: Nucleinsäure
  • (C) Strängigkeit: Einzelstrang
  • (D) Topologie: linear
  • (iv) ANTI-SENSE: ja (xi) Sequenz-Beschreibung: SEQ ID Nr. 46:
    • (2) Informationen für SEQ ID Nr. 47:
  • (i) Sequenz-Charakteristiken:
  • (A) Länge: 20
  • (B) Typ: Nucleinsäure
  • (C) Strängigkeit: Einzelstrang
  • (D) Topologie: linear
  • (iv) ANTI-SENSE: ja (xi) Sequenz-Beschreibung: SEQ ID Nr. 47:
    • (2) Informationen für SEQ ID Nr. 48:
  • (i) Sequenz-Charakteristiken:
  • (A) Länge: 20
  • (B) Typ: Nucleinsäure
  • (C) Strängigkeit: Einzelstrang
  • (D) Topologie: linear
  • (iv) ANTI-SENSE: ja (xi) Sequenz-Beschreibung: SEQ ID Nr. 48:
    • (2) Informationen für SEQ ID Nr. 49:
  • (i) Sequenz-Charakteristiken:
  • (A) Länge: 20
  • (B) Typ: Nucleinsäure
  • (C) Strängigkeit: Einzelstrang
  • (D) Topologie: linear
  • (iv) ANTI-SENSE: ja (xi) Sequenz-Beschreibung: SEQ ID Nr. 49:
    • (2) Informationen für SEQ ID Nr. 50:
  • (i) Sequenz-Charakteristiken:
  • (A) Länge: 20
  • (B) Typ: Nucleinsäure
  • (C) Strängigkeit: Einzelstrang
  • (D) Topologie: linear
  • (iv) ANTI-SENSE: ja (xi) Sequenz-Beschreibung: SEQ ID Nr. 50:
    • (2) Informationen für SEQ ID Nr. 51:
  • (i) Sequenz-Charakteristiken:
  • (A) Länge: 20
  • (B) Typ: Nucleinsäure
  • (C) Strängigkeit: Einzelstrang
  • (D) Topologie: linear
  • (iv) ANTI-SENSE: ja (xi) Sequenz-Beschreibung: SEQ ID Nr. 51:
    • (2) Informationen für SEQ ID Nr. 52:
  • (i) Sequenz-Charakteristiken:
  • (A) Länge: 20
  • (B) Typ: Nucleinsäure
  • (C) Strängigkeit: Einzelstrang
  • (D) Topologie: linear
  • (iv) ANTI-SENSE: nein (xi) Sequenz-Beschreibung: SEQ ID Nr. 52:
    • (2) Informationen für SEQ ID Nr. 53:
  • (i) Sequenz-Charakteristiken:
  • (A) Länge: 20
  • (B) Typ: Nucleinsäure
  • (C) Strängigkeit: Einzelstrang
  • (D) Topologie: linear
  • (iv) ANTI-SENSE: nein (xi) Sequenz-Beschreibung: SEQ ID Nr. 53:
    • (2) Informationen für SEQ ID Nr. 54:
  • (i) Sequenz-Charakteristiken:
  • (A) Länge: 20
  • (B) Typ: Nucleinsäure
  • (C) Strängigkeit: Einzelstrang
  • (D) Topologie: linear
  • (iv) ANTI-SENSE: nein (xi) Sequenz-Beschreibung: SEQ ID Nr. 54:

Claims (11)

1. Oligonucleotid mit einer Länge von bis zu 50 Nucleotid-Einheiten, das mRNA bindet, die Human-Proteinkinase C codiert, wobei das genannte Oligonucleotid umfasst eine Nucleotid-Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus SEQ ID Nr. 1, 2, 3 und 5.
2. Oligonucleotid nach Anspruch 1, worin mindestens eine der Interzucker- Verknüpfungen zwischen den Nucleotid-Einheiten des Oligonucleotids ein Phosphorothioat ist.
3. Oligonucleotid nach Anspruch 1, worin mindestens eines der Nucleotide eine Modifikation an der 2'-Position des Zuckers aufweist.
4. Oligonucleotid nach Anspruch 3, worin die Modifikation eine 2'-O-Alkyl- oder 2'-Fluor-Modifikation ist.
5. Oligonucleotid nach Anspruch 4, worin die Modifikation eine 2'-O-Methyl- oder 2'-O-Propyl-Modifikation ist.
6. Oligonucleotid nach Anspruch 1, das eine Deoxy-Lücken-Region von 4 bis 8 Deoxynucleotiden umfasst.
7. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 6 sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
8. Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 6 für die Verwendung in der Medizin.
9. Verwendung eines Oligonucleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 6 bei der Herstellung einer Zusammensetzung zum Modulieren der Expression von Proteinkinase C in Zellen oder Geweben.
10. Verwendung nach Anspruch 9 für die Behandlung oder Diagnose von Zuständen, die mit Proteinkinase C im Zusammenhang stehen.
11. Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von DNA oder RNA, die Proteinkinase C in Zellen oder Geweben codiert, das umfasst das ex vivo-Inkontaktbringen der Zellen oder Gewebe mit einem Oligonucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
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