JPH07503856A

JPH07503856A - プロテインキナーゼｃのオリゴヌクレオチド調節

Info

Publication number: JPH07503856A
Application number: JP5516616A
Authority: JP
Inventors: ベネット，シー・フランク; ディーン，ニコラス
Original assignee: アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド
Priority date: 1992-03-16
Filing date: 1993-02-25
Publication date: 1995-04-27
Anticipated expiration: 2012-07-30
Also published as: DE69331467T2; FI944276A; WO1993019203A1; EP1310555A2; EP1126025A2; EP0672180A1; KR0157487B1; CA2132094A1; FI20030248A; HU217179B; NO943438L; US5703054A; JP2635216B2; EP1126025A3; EP0672180A4; EP0672180B1; DE69331467D1; HU9402657D0; FI113059B; NO943438D0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】プロティンキナーゼＣのオリゴヌクレオチド調節技術分野本発明はプロティンキナーゼＣの発現調節に応答する疾病状態のための治療、診断および研究用試薬に関する。特に、本発明はプロティンキナーゼＣに関連する核酸と特異的にハイブリダイズしつるアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。これらのオリゴヌクレオチドがプロティンキナーゼＣの発現を調節することが観察された。軽減および治療効果が得られた。

背景技術タンパク質のリン酸化は細胞内への細胞外信号の導入において中心的な役割を果たしている。そのようなリン酸化を引き起こすキナーゼと称される酵素は成長因子、ホルモンおよび細胞の代謝、増殖および分化に関与するその他の因子の作用標的である。主たる信号導入経路の一つに酵素プロティンキナーゼＣ（ＰＫＣ）が含まれており、細胞増殖および分化に重大な影響を与えることが知られている。

ＰＫＣは、信号導入において放出される代謝産物であるジアシルグリセロール（ＤＡＣ）により活性化される。

ホルボールエステルと称される一部の発癌促進剤が細胞にそれらの多面的な効果を示す場合において、ＰＫＣが主たる、および多分唯一の細胞性レセプターであることが発見されたことがらＰＫＣに関しての興味がかき立てられた。Ｇｅ５ｃｈｅｒｅｔ　ａｌ、、＾ｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓｉｇｎ　１９８９．４．９３−１０５゜腫瘍生成が可能なホルボールがＰＫＣの活性化においてＤＡＣの効果を模倣しうろことは、これらの発癌促進剤がＰＫＣを通して作用し、この酵素の活性化が少なくとも部分的には腫瘍発生の原因になることを示唆している。Ｐａｒｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｓｃ江寒乙１９ｇ６，２３３．８５３−８６６゜実験的証拠は、ＰＫＣが結腸癌の増殖制御において一つの役割を果たしていることを示している。腸管中の特定の細菌が脂質をＤＡＣに変換し、ＰＫＣを活性化し細胞の増殖を変化させていると信じられている。このことは高い食物脂肪と結腸癌の間の相関を説明するものであろう。ｆｅｉｎｓｔｅｉｎ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　（Ｓｕｐ　１．　）　１９９１、　５１．５０８０ｓ−５０８５ｓ０また、結腸直腸癌の患者の結腸粘膜中のＰＫＣの大部分は、癌を持たない患者のものと比較すると活性化された状態にあることが示されている。５ａｋａｎｏｕｅ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　１９９１．４８．８０３−８０６゜高進された腫瘍発生はまたヌードマウス内に接種された培養細胞中のＰＫＣの過剰発現とも相関している。ＰＫＣの突然変異形は高進された転移能を持つ非常に悪性の腫瘍細胞を誘導する。スフィンゴシンおよび関連するＰＫＣ活性の阻害剤はインビボにおいて腫瘍細胞増殖および放射線誘発形質転換を阻害することが抗癌剤はＰＫＣに対して調節効果を示す。従って、ＰＫＣの阻害剤は癌の予防または治療剤として重要であろう。ＰＫＣは通常の抗癌剤のより合理的な設計のためのもっともらしい標的であると示唆されてきた。Ｇｅ５ｃｈｅｒ、　Ａ、および　Ｄａｌｅ、　１．　Ｌ。

、＾ｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓｉｇｎ　１９８９．４．９３−１０５゜また、実験はＰＫＣが乾癖および皮膚癌のような過増殖性皮膚疾患の病理生理学において重要な役割を果たしていることを示している。乾癖は炎症、表皮の過増殖および細胞分化の減少により特徴付けられる。種々の研究はこれらの症状の発現においてのＰＫＣの役割を示唆している。培養ケラチン細胞におけるＰＫＣ刺激が過増殖を起こすことを示すことができる。炎症はホルボールエステルにより誘発でき、ＰＫＣにより制御される。ＤＡＣは皮膚病性疾患にＰＫＣが含まれていることに関係しており、乾癖性病変に多く生成される。

ＰＫＣの阻害剤はインビトロにおいて抗増殖性および抗炎症性効果の両方を有することが示されている。シクロスポリンＡおよびアントラリンのような抗乾癖薬はＰＫＣを阻害することが示されている。ＰＫＣの阻害は乾癖の処置に対する治療法として示唆されてきた。Ｈａｇｅｍａｎｎ、　Ｌ、およびＧ、１ｌａｈｒｌｅ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｋｉｎ、　Ｈ，Ｍｕｋｈｔａｒ編、ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、　ＦＬ、　１９９２．　ｐ、　３５７−３６８゜ＰＫＣは単一の酵素ではな（一群の酵素である。現在のところ、少なくとも７つのＰＫＣのイソ型（イソ酵素）が同定されている：イソ型α 、β、およびγは均質に精製されており、イソ型δ、ε、ζ、およびηは分子クローニングにより同定されている。これらのイソ酵素は組織および器官分布の異なったパターンを有しく総説としてＮ１５ｈｉｚｕｋａ、　Ｎａｔｕｒｅ　１９ｇ８．３３４．６６１−６６５を参照されたい）、異なった生理学的機能を果たしているのであろう。例えば、ＰＫＣ−γは中枢神経系でのみ発現されるらしい。ＰＫＣ−αおよび−βはほとんどの組織で発現されるが、異なった細胞型においては異なった発現のパターンを有する。例えば、ＰＫＣ−αおよびＰＫＣ−β の両方ともヒト表皮に発現され、それから精製されている。

ＰＫＣ−αは主として表皮の基底層のケラチン細胞中に検出されたが、ＰＫＣ− βは主として表皮の中間層およびランゲルハンス細胞中に観察される。ＰＫＣ− ηは主に皮膚および肺で観察されており、これらの組織での発現のレベルは脳におけるレベルよりも高い。このことは、脳に最も豊富に発現される傾向があるＰＫＣ群の他の構成要素とは対照的である。０ｓａｄａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、　１９９０．２６５゜２２４３４−２２４４０゜ここに掲げたＰＫＣイソ酵素は本発明による標的化に好適であるが、ＰＫＣの他のイソ酵素もまた本発明に包含される。

現在のところ、異なったＰＫＣイソ酵素はそれらが発現される器官または組織に依存して種々の疾患過程に関与すると信じられている。例えば、乾癖病変においてはＰＫＣ−αおよびＰＫＣ−３間の比が変化しており、正常皮膚と比較してＰＫＣ−βが優先して失われている（Ｈａｇｅｍａｎｎル、およびＧ、　Ｍａｈｒｌｅ、Ｐｈａｒａ＋ａｃｏｌｏｇｙ　ｏｆｔｈｅ　５ｋｉｎ、　Ｈ，Ｍｕｋｈｔａｒ編、ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、ＦＬ、　１９９２．　ｐ、　３５７−R６８）。

多数の化合物がＰＫＣ阻害剤として同定されているが（総説としてｌ１ｉｄａｋａおよびＨａｇｉｖａｒａ、Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｐｈａｒｍ、Ｓｃｉ、　１９８７．８，１６２−１６４を参照されたい）、特異的にＰＫＣを阻害するものは見いだされていない。１−（５−イソキノリンスルホニル）−２−メチルピペラジン（Ｈ−７）のようなキノリン　スルホンアミド誘導体はマイクロモル濃度でＰＫＣを阻害するが、それらはＰＫＣおよびｃＡＭＰ−依存性およびｃＧＭＰ− 依存性プロチインキナーゼに対して類似の酵素阻害動力学を示している。ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種のアルカロイド生成物であるスタウロスポリンおよびその類似体は現在同定されている内で最も強力なＰＫＣのインビトロ阻害剤である。しかしながらそれらは異なったプロティンキナーゼ間では限られた選択性しか示さない、　Ｇｅ５ｃｈｃｒ、＾ｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇれていない。また、研究用の道具としておよび特定のイソ酵素に伴われるであろう疾患の処置のために、特異的なＰＫＣイソ酵素の阻害もめられている。

発明の目的本発明の主たる目的は、プロティンキナーゼＣに付随する新生物性、過増殖性、炎症性およびその他の疾患状態の治療法を提供することである。

本発明の別の目的は、プロティンキナーゼＣの特定のイソ酵素に付随する疾患のための選択的治療法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、プロティンキナーゼＣの発現を調節しうるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することである。

本発明の別の目的は、プロティンキナーゼＣの特定のイソ酵素の発現を選択的に調節しつるアンチ妄ンスオリゴヌクレオチドを提供することである。

さらに別の目的は、プロティンキナーゼＣに伴う疾患の診断手段を提供することである。

本発明のさらなる目的は、プロティンキナーゼＣの特定のイソ酵素に伴う疾患の異なった診断手段を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、プロティンキナーゼＣの発現の影響およびそれらに伴う疾患の研究のための研究道具を提供することである。

本発明のさらなる目的は、プロティンキナーゼＣの特定のイソ酵素の発現の影響およびそれらに伴う疾患の研究のための研究道具を提供することである。

本発明のこれらおよびその他の目的は本明細書の記載から明らかになるであろ図１（ａ）および（ｂ）はＰＫＣ−αとハイブリダイズ可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドのＰＫＣ発現に対する効果をグラフで表したものである。オリゴヌクレオチドはＰＫＣ標的領域により配置される（５°から３°）。

図２は対照（オリゴヌクレオチド無し）に対するパーセントとして表現されたＰＫＣ−αタンパク質合成の用量依存性アンチセンスオリゴヌクレオチド阻害を示している線グラフである。マ＝ＩＳＩＳ　３５２０＋■＝ＩＳＩＳ　３５２２：ム＝ＩｓＩｓ　３５２７：＝ＩＳＩＳ　４９８５゜図３はｌ５ＩＳ　４６４９（ＩＳＩＳ　３５２２の２′−〇−メチル体、両方ともホスホロチオエート）によるＰＫＣ−αタンパク質合成の用量依存性阻害を示している線グラフである。マ＝ＩＳＩＳ　４６３２；・＝ＩＳＩＳ　４６３６；閣＝ＩＳＩＳ　４６４９；ム＝ＩＳＩＳ　４６４８゜図４はアンチセンスオリゴヌクレオチド処理後のＰＫＣ −α　ｍＲＮＡ転写体のレベルの減少を示している棒グラフである。斜線を付けた棒は８．５ｋｂ転写体を表し、白抜きの棒は４．０ｋｂ転写体を表している。

図５はＡ３４９細胞増殖のアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害を示している線グラフである。■＝４５５９；◆＝４９８５；・＝３５２１；ム＝３５２７゜図６は同じ配列を有する完全−デオキシ　ホスホロチオエート　オリゴヌクレオチドと比較した８−デオキシギャップを有する２゛−〇−メチル　ホスホロチオエート　オリゴヌクレオチドによるＰＫＣ−α　ｍＲＮＡレベルの阻害を示している一連の線グラフである。

図６Ａは配列ＩＤ番号：２についてのデータを示している（５３５７はギャップを有するオリゴヌクレオチドであり、３５２１は完全デオキシ体である）。図６Ｂは配列ＩＤ番号：３についてのデータを示している（５３５２はギャップを有するオリゴヌクレオチドであり、３５２２は完全デオキシ体である）。図６０は配列ＩＤ番号＝５についてのデータを示している（５２４０はギャップを有するオリゴヌクレオチドであり、３５２７は完全デオキシ体である）。

図７はデオキシギャップ長（２’−０−メチルオリゴヌクレオチドにおける）と配列ＩＤ番号＝２、配列ＩＤ番号＝３および配列［Ｄ番号：５を有するアンチセンス　オリゴヌクレオチドによるＰＫＣ−α　ｍＲＮＡレベルの減少との関係を示している線グラフである。

発明の要約本発明に従うと、ＰＫＣをコードする遺伝子に由来するＤＮＡまたはＲＮＡと特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドが提供される。オリゴヌクレオチドはそのような特異的ハイブリダイゼーションを有効にするのに十分な同一性および数のヌクレオチド単位を含んでいる。この相関関係は普通、”アンチセンス′と称されている。一つの好適な実施態様においては、オリゴヌクレオチドは遺伝子の翻訳開始コドン（好適には配列ＣＡＴを含んでいる）と特異的にハイブリダイズ可能である。別の好適な実施態様においては、オリゴヌクレオチドは遺伝子の５°　−非翻訳または３′−非翻訳領域と特異的にハイブリダイズ可能である。さらに別の好適な実施態様においては、特定のＰＫＣイソ酵素またはＰＫＣイソ酵素の特定の組をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドが提供される。そのようなオリゴヌクレオチドは薬学的に受容可能な担体中に都合良くおよび望まれるように存在させることができる。

別の好適な実施態様に従うと、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位間の連結基の少なくとも一つがホスホロチオエート部分のような硫黄含有種を含むように形成される。さらに別の好適な実施態様においては、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの少なくとも一つが糖の２゛位で修飾されているように形成される。そのような好適な修飾の例は、２°−０−アルキルおよび２°−フルオロ修飾である。

本発明の別の態様は、細胞または組織中のＰＫＣまたは特定のＰＫＣイソ酵素またはイソ酵素の組の発現を調節するための方法に関する。本発明の他の態様は、ＰＫＣをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの細胞または組繊における検出法、および特定のＰＫＣイソ酵素をコードしているＤＮＡまたはＲＮＡの細胞または組織における特異的検出法に関する。そのような方法は、前記ＤＮＡまたはＲＮＡの作用を妨害するためまたは検出するために、前記遺伝子を含んでいると疑われる細胞または組織を本発明に従ったオリゴヌクレオチとを接触させることを含む。

本発明の別の態様は、ＰＫＣまたはそのイソ酵素の一つに伴う疾患を有すると疑われる動物の診断および治療法に関する。そのような方法はＰＫＣの発現を調節するため、ＰＫＣに伴う状況を処置するため、またはその診断を達成するために、動物または動物からの細胞または組織または体液と本発明に従ったオリゴヌクレオチドを接触させることを含む。

発明の詳細な説明アンチセンスオリゴヌクレオチドは多（のヒト疾患の治療のための治療剤として非常に有望である。オリゴヌクレオチドはワトソンークリック塩基対により定義されているごと（、ＤＮＡ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡまたは成熟ｍＲＮＡの相補的配列と特異的に結合（ハイブリダイズ）して、ＤＮＡからタンパク質への遺伝的情報の流れを妨害する。標的配列に対して特異的にさせられたアンチセンスオリゴヌクレオチドの性質はまた、それらを非常に有用なものにしている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは単量体単位の長い鎖であるため、それらは任意の標的ＲＮＡ配列に対して容易に合成されるであろう。多数の最近の研究は、標的タンパク質研究のための生化学的道具としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの有用性を述べている。Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、　１９８９．８１．１５３９−１５S４：Ｚｏｎ。

Ｇ、　、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｒｅｓ、１９８８．５．５３９−５４９゜オリゴヌクレオチド化学の最近の進歩、および細胞取り込みが促進されたヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドの合成により、現在では治療の新しい形としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を考えることが可能である。

アンチセンスオリゴヌクレオチドは従来の方法で直面する問題点の理想的な解決法を提供する。それらは問題とするイソ酵素またはイソ酵素の特定の組を選択的に阻害するように、または、問題とするイソ酵素の群の全てを阻害するように設計することができる。それらはフリーラジカル捕捉のような非特異的機構では働かない。特定の阻害剤の設計には酵素機構の完全な理解は必要とされない。

プロティンキナーゼＣの活性または代謝を調節する現在の薬は、それらの特異性の欠如による受容できない副作用を有するか、または酵素の阻害において限られた有効性しか示さない。本発明は従来の研究者が直面した問題を、酵素を直接的に阻害するのではなく酵素の産生を調節することにより解決し、治療効果を達成する。本発明において、オリゴヌクレオチドは直接ｍＲＮＡまたは遺伝子に結合し、最終的に遺伝子から産生されるＰＫＣタンパク質の量を調節する。

本発明の文脈において、術語”オリゴヌクレオチド”とは天然に存在する塩基および天然のホスホジエステル結合により連結されたペントフラノシル基から形成されたポリヌクレオチドを意味している。この術語は実際上、天然に存在するサブユニットまたはそれらの密接な類似体から形成された天然に存在する化学種または合成種を意味している。術語”オリゴヌクレオチド”はまた、天然に存在するオリゴヌクレオチドと同様に機能するが、天然に存在しない部分を有するものを意味してもよい。従って、オリゴヌクレオチドは修飾された糖部分または糖量結合を有していてもよい。これらの例としては、ホスホロチオエートおよびこの分野で知られているホスホロジチオエートのようなその他の硫黄含有種が挙げられる。いくつかの好適な実施態様において、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのホスホジエステル結合は、活性が調節されるべきＲＮＡまたはＤＮＡが位置している細胞の領域内に浸透する組成物の能力を促進する構造により置換されている。そのような置換はホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、短鎖アルキルまたはシクロアルキル構造、またはへテロ原子置換短鎖アルキル構造を含むものが好適である。最も好適なものは、ＣＨｚ　ＮＨＯＣＨｔ、ＣＨ２Ｎ（ＣＨｓ）　ＯＣＨｚ、ＣＨｚ−０−Ｎ　（ＣＨｓ）　ＣＨｓ、ＣＨＩ−Ｎ　（ＣＨ３）−Ｎ　（ＣＨｓ）−ＣＨｉ、および〇−Ｎ　（ＣＨｓ）　ＣＨｔ　ＣＨｔバックボーン（ここでホスホジエステルはＱ　−Ｐ　−ＯＣＨ！である）構造である。モルホリノバックボーン構造を有するオリゴヌクレオチドもまた好適である。Ｓｕｍ■ｅｒｔ。

ｎ、　Ｊ、　Ｅ、およびｔｅｌｌｅｒ、　Ｄ、　Ｄ、、米国特許出願筒５．０３４，５０６号。タンパク質−核酸（ＰＮＡ）バックボーンのような別の実施態様においては、オリゴヌクレオチドのホスホジエステルバックボーンはポリアミドバックボーンに置き換えられていてもよく、塩基がポリアミドバックボーンのアザ窒素原子に直接または間接的に結合されている。Ｐ、Ｅ、Ｎ１ｅｌｓｅｎ、Ｍ、Ｅｇｈｏｌｍ、Ｒ，Ｈ，Ｂｅｒｇ、０．　Ｂｕｃｈａｒｄｔ、５ｃｉｅｎｃｅ１９９１、２５４．１４９７゜別の好適な実施態様に従うと、ホスホジエステル結合は同時に実質的に非イオン性および非キラルである他の構造または、キラルおよび対掌体に特異的である構造に置換されている。当業者は本発明の実施に使用するための別の結合を選択することが可能であろう。

オリゴヌクレオチドは少なくとも一つの修飾塩基形を含む化学種を含んでいてもよい。すなわち、天然に見いだされるもの以外のプリンおよびピリミジンを用いてもよい。同様に、本発明の本質的教義から離れない限りはヌクレオチドサブユニットのペントフラノシル部分上の修飾もまた有効である。そのような修飾の例は２′−〇−アルキルーおよび２゛−ハロゲン−置換ヌクレオチドである。本発明において有用である糖部分の２゛位における修飾のいくつかの特定の例は、ＯＨ，ＳＨ，ＳＣＨ３、Ｆ、０ＣＨｓ、ＯＣＮ　、　Ｏ（ＣＨｔ　）　−Ｎ　Ｈｚ、またはＯ（ＣＨＩ）　。

ＣＨＩ　（式中、ｎは１から約１０である）または類似の性質を有するその他の置換基である。シクロブチルまたは他の炭素環式のような糖模倣体もまたペントフラノシル基の代わりに使用してもよい。二つまたはそれ以上の化学的に異なる領域を有するキメラオリゴヌクレオチドもまた本発明では有用である。そのようなキメラオリゴヌクレオチドの特定の例は、一つまたはそれ以上のデオキシヌクレオチドの゛デオキシギャップ°を除いて２゛位が修飾されているものである。

”デオキシギャップ”は分子の中心にあってもよいし、また、両末端にまたはその近傍に位置されていてもよい。異なったバックボーン化学の領域を有するオリゴヌクレオチドもまたキメラオリゴヌクレオチドの例である。

そのようなオリゴヌクレオチドは天然のオリゴヌクレオチド（または、天然のラインに沿って合成されたオリゴヌクレオチド）と機能的に交換可能であるが、天然の構造とは一つまたはそれ以上の相違を有するものとして記述するのが最適であろう。全てのそのようなオリゴヌクレオチドは、ＰＫＣＲＮＡとハイブリダイズするのに有効に機能する限りは本発明に包含される。本発明に従ったオリゴヌクレオチドは、好適には約５から約５０ヌクレオチド単位を含む。約８から３０のヌクレオチド単位を含むようなオリゴヌクレオチドがより好適であり、約１２から２５のヌクレオチド単位を有するものがさらにより好適である。ヌクレオチド単位とはホスホジエステルまたはその他の結合を介して隣接するヌクレオチド単位に適切に結合されている塩基−糖の組み合わせであることが理解されよう。

本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドは、固相合成のよく知られた技術により都合よくかつルーチン的に作製されるであろう。そのような合成のための装置はＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを含むいくつかの販売元から市販されている。そのような合成のために他の手段を用いてもよい；オリゴヌクレオチドの実際の合成は機械的に仕事を処理する人の能力次第である。ホスホロチオエートおよびその他のアルキル化誘導体のような他のオリゴヌクレオチドを合成するために類似の技術を使用することもよく知られている。

本発明に従うと、メツセンジャーＲＮＡには３文字遺伝コードを用いてタンパク質をコードしている情報のみならず、５°−非翻訳領域、３゛−非翻訳領域、５ °キヤツプ領域およびイントロン／エクソン結合リボヌクレオチドとして知られている領域を形成する付随するりボヌクレオチドも含まれていることが当業者には理解されよう。従って、情報部分のりボヌクレオチド並びにこれらの付随するりポヌクレオチドの全体または一部を標的とするオリゴヌクレオチドが本発明に従って形成される。好適な実施態様において、オリゴヌクレオチドは転写開始部位、翻訳開始部位、５゛キヤツプ領域、イントロン／エクソン結合部、コード配列または５゛　−または３゛−非翻訳領域中の配列と特異的にハイブリダイズ可能である。

本発明のオリゴヌクレオチドはＰＫＣ遺伝子に由来するメツセンジャーＲＮＡにハイブリダイズ可能なように設計されている。そのようなハイブリダイゼーションが達成された場合、メツセンジャーＲＮＡの正常な役割を妨害し、細胞におけるその機能の調節を起こす。妨害されるべきメツセンジャーＲＮＡの機能には、ＤＮＡからのＲＮＡの転写、タンパク質翻訳部位へのＲＮＡのトランスロケーション、ＲＮＡからタンパク質への実際の翻訳、一つまたはそれ以上のｍＲＮＡ種を得るためのＲＮＡのスプライシング、および多分ＲＮＡに携わっているであろう独立した触媒活性のような全ての生体機能が含まれる。ＲＮＡ機能へのそのような妨害の全体の効果はＰＫＣ遺伝子発現の調節である。

本発明のオリゴヌクレオチドは診断薬、治療薬、予防薬および研究用試薬およびキットとして使用することができる。本発明のオリゴヌクレオチドはＰＫＣ遺伝子およびそのｍＲＮＡにハイブリダイズするため、この事実を利用してサンドイッチおよびその他のアッセイを容易に組み立てることができる。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドはＰＫＣｍＲＮＡの特定のイソ酵素にハイブリダイズするため、特定のＰＫＣイソ酵素に対する細胞および組織のスクリーニングのためのアッセイが工夫できる。そのようなアッセイは種々のＰＫＣ形に伴う疾患の診断に利用することができる。ＰＫＣ遺伝子に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出する手段の準備はルーチン的に達成される。そのような準備には酵素のコンジュゲート、放射性標識または別の適した検出系などが含まれる。ＰＫＣの存在および不在を検出するためのキットもまた製造されるであろう。

治療または予防処置のために、オリゴヌクレオチドが本発明に従って投与される。オリゴヌクレオチドは医薬組成物中に処方され、それにはオリゴヌクレオチドに加えて担体、粘稠化剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、表面活性化剤などが含まれているであろう。医薬組成物は、オリゴヌクレオチドに加えて一つまたはそれ以上の抗菌薬、抗炎症薬、麻酔薬などのような活性成分を含んでいてもよい。

医薬組成物は局所または全身の処置が望まれているか、および処置されるべき領域に依存して多くの方法で投与されるであろう。投与は局所的に（点眼、膣内、直腸内、鼻孔内を含む）、経口で、吸入により、または非経口で（例えば、静脈内点滴または皮下、腹腔内または筋肉内注射）実施されるであろう。

局所投与のための処方には軟膏、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、座剤、スプレー剤、水剤および散剤が含まれるであろう。通常の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、粘稠化剤などが必要かまたは望ましいであろう。被覆されたコンドームもまた有用であろう。

経口投与のための処方には散剤、顆粒剤、水または非水性媒質中の懸濁化剤または液剤、カプセル剤、サツシェ剤、または錠剤が含まれる。粘稠化剤、芳香剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤または結合剤が望まれるであろう。

非経口投与のための処方には緩衝液、希釈剤およびその他の適切な添加剤を含む無菌水溶液が含まれる。

投与量は処置されるべき状態の重度および応答性に依存するが、治療が有効になるかまたは疾患状態の軽減が達成されるまで数日から数カ月の処置過程で、通常 −日当たり一回またはそれ以上の投与量であろう。当業者は容易に最適の投与量、投与法および反復率を決定することができる。

以下の実施例は本発明の例示であり、それらに制限することを意図したものではない。

実施例１　オリゴヌクレオチド合成非修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドはヨウ素により酸化する標準ホスホロアミダイトの化学を使用する自動ＤＮＡシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　モデル３８０Ｂ）にて合成された。β−シアノエチルジイソプロピルーホスホロアミダイトはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、ＣＡ）から購入した。ホスホロチオエート　オリゴヌクレオチドに対しては、ホスファイト結合の段階的チオ化のために標準酸化ボトルを３■− １，２−ベンゾジチオール−３−オン　１，１．−ジオキシドの０．２Ｍアセトニトリル溶液に置き換えた。チオ化サイクル待ち時間は６８秒に増加し、続いてキャッピング工程を実施した。

オリゴヌクレオチドは制御細孔ガラスカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から切断し、５５℃で１８時間濃水酸化アンモニウム中で脱保護した後、２．５容量のエタノールを加えた０、５Ｍ　ＮａＣ１から二回沈澱させることにより精製した。分析ゲル電気泳動は２０％アクリルアミド、８Ｍ尿素、４５５Ｍ　トリス−ホウ酸緩衝液、ｐＨ７，０で実施した。

ＰＫＣタンパク質半減期は６．７時間から２４時間まで変動することが報告さ− ション時間が必要とされ、アンチセンスオリゴヌクレオチドをスクリーニングする場合、ＰＫＣ−αの定常状態を阻害することは実際的ではない。それ故、ＰＫＣの細胞内レベルを可逆的に低（するホルボールエステルの能力が利用されてきた。細胞をホルボールエステルで処理すると最初にキナーゼ活性の活性化、続いてＰＫＣのダウンレギュレーションが起こる。ＰＫＣ−αについては、このダウンレギュレーションはキナーゼの合成速度は明らかに変化せずにタンパク質分解の速度が増加した直接の結果であることが示されている。

ヒト肺癌腫（Ａ５４９）細胞において、Ｋｒｕｇ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　Ｂｉａｓ、　Ｃｈｅｗ、　１９８７．２６２゜１１８５２−１１８５６　の方法の変法を用いたホルボールエステル　１２．１３−ジブチレート（ＰＤＢｕ）の処理は、実際にＰＫＣ−α　ｍＲＮＡレベルに影響を与えずにＰＫＣ−αの細胞レベルを低下させ、この効果は可逆的であることが最初に決定された。ＰＫＣ−α を標的とするオリゴヌクレオチドの能力をスクリーニングするアッセイの基本は、最初にＰＤＢｕで長期間処理することによりＰＫＣ−αタンパク質レベルを低下させ、細胞をよく洗浄することによりＰＤＢｕを除去しくこれにより細胞の新規のＰＫＣ−αタンパク質の合成を可能にする）、新ＰＫＣ−αタンパク質の再合成を阻害するためオリゴヌクレオチドと細胞をインキュベートすることである。

Ａ３４９細胞（＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　ＭＤから入手した）を、６−ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ　Ｌａｂｖａｒｅ、　Ｌｉｎｃｏｌｎ　Ｐａｒｋ、　ＮＪ）上、１ｇグルコース／リットルおよびｌＯ％ウシ胎児血清（Ｆ　ＣＳ、　Ｉｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、５ａｎｔａ　Ａｎａ、ＣＡ）を含むダルベツコ改良イーグル培地（ＤＭＥ）中でコンフルエントになるまで増殖させた。

細胞を５００ｎＭのＰ　Ｄ　Ｂ　ｕ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｗ、　Ｃｏ、　、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）で１２−１６時間（終夜）処理した。次に、細胞をＤＭＥ中３７℃にて３回洗浄し、２０μｌのり。

ＴＭＡ　（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ試薬、　１３Ｒ１，３６ｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を含むｌｓｌのＤＭＡを加えた。ホスホロチオエート　オリゴヌクレオチドを１ μ麗の濃度まで添加し、細胞を３７℃でさらに４時間インキュベートした。

細胞を０．１ｍｇ／ｍｌ　Ｂ　Ｓ　Ａを含む３ｍｌのＤＭＥで１回洗浄し、０．１＋ｗｇ／ａ＋ｌ　Ｂ　Ｓ　Ａを含む２１ｍ１のＤＭＥをさらに加えた。ホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド（１重Ｍ）を加えて細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。

細胞をリン酸緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）中で３回洗浄し、細胞タンパク質を１２０ μｍの試料緩衝液（６０ｍＭ　）リス　ｐＨ６，８，２％ＳＤＳ、　１０％グリセロール。

１０ｍＭジチオスレイトール）中に抽出して５分間煮沸した。ＰＫＣ−αタンパク質の細胞内レベルはイムノブロッティングにより決定した。

本アッセイで試験されたオリゴヌクレオチドは表１に示されている。配列データはＦｉｎｋｅｒｎｚｅｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｎｕｃｌ＾ａｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１９９０，１８．２１８３により発表されたｃＤＮＡ配列からのものである：オリゴヌクレオチドの下に与えられている配列番号はｃＤＮＡ上に配列されるべき第一の残基（ＡＴＧ開始コドンの上流の２８番目の残基）に対して相対的なものである。

配列ＩＤ　配列　標的Ｉ　ＣＣＣＣＡＡ　ＣＣＡ　ＣＣＴ　ＣＴｒ　ＧＣＴ　ＣＣ５’非翻訳２　ＧＴＴ　ＣＴＣＧＣＴ　ＧＧＴ　ＧＡＧ　Ｔ’ｌＴ　ＣＡ　３°非翻訳３　ＡＡＡ　ＡＣＧ　ＴＣＡ　ＧＣＣＡＴＧ　ＧＴＣＣＣ翻訳開始コドン４　ＧＧＡ　ＴＴＣＡＣＴ　ＴＣＣＡＣＴ　ＧＣＧ　ＧＧ　３’非翻訳５　ＧＡＧ　ＡＣＣＣＴＧ　ＡＡＣＡＧＴ　ＴＧＡ　ＴＣ３’非翻訳６　ＣＣＣＧＧＧ　ＡＡＡ　ＡＣＧ　ＴＣＡ　ＧＣＣＡＴ　翻訳開始コドン７　ＣＴＧ　ＣＣＴ　ＣＡＧ　ＣＧＣＣＣＣＴＴＴ　ＧＣ内部（Ｃ１）ドメイン８　ＡＣＴ　ＣＧＧ　ＴＧＣＡＧＴ　ＧＧＣＴＧＧ　ＡＧ　内部（Ｃ１）ドメイン９　ＧＣＡ　ＧＡＧ　ＧＣＴ　ＧＧＧ　ＧＡＣＡＴＴ　ＧＡ　内部（Ｃ１）ドメイン１０　ＧＧＧ　ＣＴＧ　ＧＧＧ　ＡＧＧ　ＴＧＴ　ｎＧ　ＴＴ　３’非翻訳１１　ＣＡＣＴＧＣＧＧＧ　ＧＡＧ　ＧＧＣＴＧＧ　ＧＧ　３’非翻訳１２　ＡＧＣＣＧＴ　ＧＧＣＣＴＴ　ＡＡＡ　ＡＴＴ　ＴＴ　３’非翻訳２１３７　２１．１８１３　ＡＴＴ　ｎｃ　ＡＧＧ　ＣＣＴ　ＣＣＡ　ＴＡＴ　ＧＧ　３’非翻訳１４　ＡＡＣＡＣＡＧＡＧ　ＡＣＣＣＴＧ　ＡＡＣＡＧ　３’非翻訳１５　ＧＡＴ　ＡＡＴ　ＧＴＴ　ＣＴＴ　ＧＧＴ　ＴＧＴ　ＡＡ　３’非翻訳１６　ＡＴＧ　ＧＧＧ　ＴＧＣＡＣＡ　ＡＡＣＴＧＧ　ＧＧ　内部（Ｃ３）ドメイン１７　ＧＴＣＡＧＣＣＡＴ　ＧＧＴ　ＣＣＣＣＣＣＣＣ翻訳開始コドン１８　ＣＧＣＣＧＴ　ＧＧＡ　ＧＴＣＧＴＴ　ＧＣＣＣＧ　内部（ｖｌ）ドメイン１９　ＴＣ＾＾ＡＴ　ＧＧＡ　ＧＧＣＴＧＣＣＣＧ　ＧＣ内部（Ｃ３）ドメイン２０　ＴＧＧ＾＾Ｔ　ＣＡＧ　ＡＣＡ　ＣＡＡ　ＧＣＣＧＴ　３’非翻訳実施例３　ＰＫＣ発現のイムノプロットアッセイ細胞抽出物を１０％５ＤＳ−ＰＡＧＥミニゲル上で電気泳動した。分離したタンパク質を電気泳動的移動によりＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜（Ｍｌｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ　Ｍ＾）に移し、膜を５％脱脂ミルクを含むＴＢＳ（トリス−ＭＣＩ　ｐＨ７，４，１５０ｍＭＮａＣＩ）中、６０分間ブロックした。次に、０．２％脱脂ミルクを含むＴＢＳで０、２　ｕ　ｇ／ｍｌに希釈したＰＫＣ−ａに対するモノクローナル抗体（ＵＢｌ、　Ｌａｋｅ　Ｐｌａｃｉｄ　ＮＹ）と膜を４℃で１６時間インキュベートした。続いて０．２％脱脂ミルクを加えたＴＢＳ中で３回洗浄した。次に膜を１２５１−標識ヤギ抗マウス二次抗体（ＩＣＮ　ＲａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａＬｓ、　Ｉｒｖｉｎｅ、　ＣＡ）と１時間インキュベートした。次に膜を０．２％脱脂ミルクを加えたＴＢＳ中でよく洗浄した。バンドを可視化しホスファ−イメージヤ−（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ、５ｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して定量した。ＰＫＣ−αは８０ｋＤの分子量を有する単一バンドとして現れる。

各々のオリゴヌクレオチドは３回試験され（３重に）、実験の結果はオリゴヌクレオチドで処理されていない細胞と比較して、存在するタンパク質のノく−セントに対して標準化されている（図１）。５つの最も有効なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンおよびそれかられずかに上流および下流の領域を標的としている（オリゴ１．３．１７．７．６）。次に最も有効なオリゴヌクレオチドはＲＮＡの３′非翻訳領域を標的としている（オリゴ２．５．１４）。

実施例４　ＰＫＣの他のイソ酵素ヒトＰＫＣ−αのアンチセンス標的化のために最も有効な配列は、翻訳開始コドン周辺および３′非翻訳領域であることが観察された。これらの配列はまたＰＫＣの他のイソ酵素に向かうオリゴヌクレオチドについても有用な標的であろうと信じられる。配列データが入手可能であるヒトＰＫＣの他のイソ酵素はＰＫＣ− β（タイプ■およびＩＩ）、ＰＫＣ−γ（部分配列）およびＰＫＣ−ηである。

ＰＫＣの有効な阻害剤であろうアンチセンスオリゴヌクレオチドが以下に同定されている。これらのオリゴヌクレオチドは実施例１のごとく合成し、入手可能な適当な抗体を用いて実施例２および３のごとくスクリーニングすることができる。

または、ＴＰＡ一応答性エンハンサ−または適当なプロモーターの影響下、所望のＰＫＣのイソ酵素とルシフェラーゼを一時的に同時発現するレポーター遺伝子アッセイ系を確立することができる。次に、常法を用いてルシフェラーゼ活性を測定することによりＰＫＣ発現をアッセイする。すなわち、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ、　Ｍ、　Ｅ、　、　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｆ」、　Ａｕ５ｕｂｅｌ、　Ｒ，Ｂｒｅｎｔ、　Ｒ，Ｅ、@Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、　Ｄ、　Ｄ。

Ｍｏｏｒｅ、　Ｊ、　Ａ、　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｊ、　Ｇ、　Ｓｅｉｄｍａｎおよびに、　５ｔｒａｈ１編、　Ｊｏｈｎ　ｆｉｌｅｙ　ａｎｄ　Tｏｎｓ、ＮＹ（１９８７）により記載されているごとく、界面活性剤トリトンＸ−１００による溶解により細胞からルシフェラーゼを抽出する。Ｄｙｎａｔｅｃｈ　ＭＬｌｏｏＯ発光針を用いて、６２５μ輩までのルシフェリン（Ｓｉｇｍａ）添加によるピーク発光の測定を行う。

：配列はｃＤＮＡで配列決定された最初の５゛塩基から番号付けられてＬ）る。

ＰＫＣ−βタイプＩおよびＩＩは単一の遺伝子生成物の異なったｍＲＮＡスブライソングの結果である。このため同一のアミノ末端を有するタンパク質が生じている（ｍＲＮＡの５゛末端）；シかしながら、カルボキシ末端に配列の相違が存在する（ｍＲＮＡの３′末端）。下記のオリゴヌクレオチド（翻訳開始コドンを標的とする）はＰＫＣ−βタイプ■およびＩＩ両方の発現を調節することが期待される：ＰＫＣ−βタイプ■およびＩＩを標的とするオリゴヌクレオチド配列ＴＤ　配列　標的２１　ＣＡＴ　ＣＴＴ　ＧＣＧ　ＣＧＣＧＧＧ　ＧＡＧ　ＣＣ翻訳開始コドン２２　ＴＧＣＧＣＧ　ＣＧＧ　ＧＧＡ　ＧＣＣＧＧＡ　ＧＣｉＨＲＭＩ始１　）’ 　ン２３　ＣＧＡ　ＧＡＧ　ＧＴＧ　ＣＣＧ　ＧＣＣＣＣＧ　ＧＧ　翻訳開始コドン２４　ＣＴＣＴＣＣＴＣＧ　ＣＣＣＴＣＧ　ＣＴＣＧＧ　翻訳開始コドン下記のアンチセンスオリゴヌクレオチドはＰＫＣ−βタイプＩの３°非翻訳領域のみを標的とする：配列ＩＤ　配列　艶２５　ＴＧＧ　ＡＧＴ　ＴＴＧ　ＣＡＴ　ＴＣＡ　ＣＣＴ　ＡＣ３°非翻訳２６　＾＾＾ＧＧＣＣＴＣＴＡＡ　ＧＡＣ＾＾ＧＣＴ　３’非翻訳２７　ＧＣＣＡＧＣＡＴＧ　ＴＧＣＡＣＣＧＴＧ　ＡＡ　３’非翻訳２８　ＡＣＡ　ＣＣＣＣＡＧ　ＧＣＴ　ＣＡＡ　ＣＧＡ　ＴＧ　３″非翻訳２９　ＣＣＧ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＡＣＴ　ＣＡＣＡＡＴ　ＴＴ　３°非翻訳下記のアンチセンスオリゴヌクレオチドはＰＫＣ−βタイプＩＩの３′非翻訳領域のみを標的とする：配列ＩＤ　配列　標的３０　ＡＣＴ　ＴＡＧ　ＣＴＣＴＴＧ　ＡＣＴ　ＴＣＧ　ＧＧ　３°非翻訳３１　ＡＴＧ　ＣＴＧ　ＣＧＧ　Ａ＾＾ＡＴ＾＾＾ＴＴＧ　３’非翻訳３２　ＡＴＴ　ＴＴＡ　ＴＴＴ　ＴＧＡ　ＧＣＡ　ＴＧＴ　ＴＣ３’非翻訳３３　ＴＴＴ　ＧＧＧ　ＧＡＴ　ＧＡＧ　ＧＧＴ　ＧＡＧ　ＣＡ　３’非翻訳３４　ＣＣＣＡＴＴ　ＣＣＣＡＣＡ　ＧＧＣＣＴＧ　ＡＧ　３’非翻訳ＰＫＣ−γ：配列はｃＤＮＡ中で配列決定された最初の５゛塩基から番号付けられている。完全な配列は入手不可能であった：オープンリーディングフレームの３゛最末端および３′非翻訳領域が欠如している。その結果、これらの領域は現在のところアンチセンス標的としては入手不可能である。

ＰＫＣ−γを標的とするオリゴヌクレオチド配列［Ｄ　配列　標的３５　ＣＧＧ　ＡＧＣＧＣＧ　ＣＣＡ　ＧＧＣＡＧＧ　ＧＡ　５°非翻訳３６　ＣＣＴ　ＴＴＴ　ＣＣＣＡＧＡ　ＣＣＡ　ＧＣＣＡＴ　翻訳開始コドン３７　ＧＧＣＣＣＣＡＧＡ　ＡＡＣＧＴＡ　ＧＣＡ　ＧＧ　開始コドンの５゛３８　ＧＧＡ　ＴＣＣＴＧＣＣＴＴ　ＴＣＴ　ＴＧＧ　ＧＧ　５’非翻訳３９　ＣＡＧ　ＣＣＡ　ＴＧＧ　ＣＣＣＣＡＧ＾＾＾ＣＧ　翻訳開始コドンＰＫＣ−η・ＰＫＣ−ηのための配列データはＢａｃｈｅｒおよびその協同研究者［Ｂａｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ。

、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ　胆９１．１１．１２６−１３３］からのものである。彼らはそのイソ酵素をＰＫＣ−Ｌと名付けている。しかしながら、その配列はマウスＰＫＣ−ηのものとほとんど同一であり、一貫性を保つためここでは後者の命名法が用いられた。

配列はｃＤＮＡ中で配列決定された最初の５゛塩基から番号付けられている。

表６配列ＩＤ　配列　標的４０　ＣＧＡ　ＣＡＴ　ＧＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＴ　ＧＣ翻訳開始コドン４１　ＣＡＧ　ＡＣＧ　ＡＣＡ　ＴＧＣＣＧＧ　ＣＧＣＣＧ　翻訳開始コドン４２　ＧＣＣＴＧＣＴＴＣＧＣＡ　ＧＣＧ　ＧＧＡ　ＧＡ　翻訳開始コドン４３　ＡＣＡ　ＧＧＴ　ＧＣＡ　ＧＧＡ　ＧＴＣＧＡＧ　ＧＣｇ訳開始コドン４４　ＧＴＣＣＣＧ　ＴＣＴ　ＣＡＧ　ＧＣＣＡＧＣＣＣ翻訳開始コドン４５　ＣＣＴ　ＣＡＣＣＧＡ　ＴＧＣＧＧＡ　ＣＣＣＴＣ翻訳開始コドン４６　ＡＴＴ　ＧＡＡ　ＣＴＴ　ＣＡＴ　ＧＧＴ　ＧＣＣＡＧ　翻訳開始＋　Ｆン４７　ＴＣＴ　ＣＡＣＴＣＣＣＣＡ　ＴＡＡ　ＧＧＣＴＡ　３’非翻訳４８　ＴＴＣＣＴＴ　ＴＧＧ　ＧＴＴ　ＣＴＣＧＴＧ　ＣＣ３’非翻訳４９　ＴＴＣＣＡＴ　ＣＣＴ　ＴＣＧ　ＡＣＡ　ＧＡＧ　ＴＴ　３°非翻訳５０　ＡＧＧ　ＣＴＧ　ＡＴＧ　ＣＴＧ　ＧＧＡ　ＡＧＧ　ＴＣ３’非翻訳５１　ＧＴＴ　ＣＴＡ　ＡＧＧ　ＣＴＧ　ＡＴＧ　ＣＴＧ　ＧＧ　３°非翻訳実施例５　ＰＫＣのオリゴヌクレオチド阻害の用量依存性ＰＫＣ−αに対して活性である図１の４つのオリゴヌクレオチドをさらｉこ検討した。実施例３に記載したイムノブロッティングアッセイを用し）たｌ５ＩＳ　３５２０（配列１０番号：１）、３５２１（配列ＩＤ番号：　２）　、３５２２　（配デＩＮ）番号＝３）および３５２７　（配列ＩＤ番号：５）の用量応答研究１こより、全てのものがＰＫＣ−αタンパク質発現に対して用量応答性活性を有することが示された。ｌ５ＩＳ　３５２１．３５２２および３５２７は１１００−２００ｎのＩｃｅａ値を有しており、すべてが５００ｎＭ’？’最高にＰＫＣ発現を阻害した。このこと（ま図２に示されている。ｌ５ＩＳ　３５２７と同一の塩基組成を有するスクランブル対照体であるｌ５ＩＳ　４９８５（配列■ Ｄ番号−５２）は影響を示さなかった。

２′−〇−メチル　ホスホロチオエート　オリゴヌクレオチドは、２°−Ｏ−メチＪし　β−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト（Ｃｈｅ醜ｇｅｎｅｓ、　Ｎｅｅｄｈａｍ　Ｍ＾）およびテトラゾールおよび塩基のパルス添加後の待ち工程を３６０秒Ｉこ延長したｌト修飾オリゴヌクレオチドの標準サイクルを用いて合成された。合成の出発：こ使用された３°−塩基は２′−デオキシリボヌクレオチドであった。

ホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド　ｌ５ＩＳ　３５２２　（配ｆｆ１ｌ　Ｉ　Ｄ番号＝３）と同一の配列を有し、均等に２−０−メチル修飾されたホスホロチオエート　オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ　４６４９）はＰＫＣタンノくり質合成を阻害でき（実施例３に記載したイムノブロッティングにより示された）　、３００ｎｋ１未満のＩＣ５゜を示した。このことは図３に示されている。

ＰＫＣ−α　ｍＲＮＡレベルに対するオリゴヌクレオチドの影響を決定するため、Ａ３４９細胞をカチオン性リポソーム存在下、示された濃度の第１ノゴヌクレオチドで４時間処理した。全細胞ＲＮＡは４Ｍグアニジニウム　イソチオシアネート中の溶解、続いての塩化セシウム濃度勾配により細胞から単離された。全ＲＮＡ　（１５−３０Ｐｇ）を１．１％ホルムアルデヒドを含む１．２％アガロースゲル上で分離し、ナイロン膜に移した。次にこの膜をＡ　Ｔ　ＣＣ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、輩Ｄ）から得られたウシＰＫＣ−α　ｃＤＮＡとハイブリダイズさせた。ｃＤＮＡは、市販品として入手可能なキット（Ｐｒｏ■ｅｇａ）を用いて、使用説明書に従うランダムプライマー標識により、［（Ｚ−”ＰＩ　ｄＣＴＰで３！Ｐ放射性標識した。フィルターをＱｕｉｋｈｙｂ溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）中で６８℃で６０分間ハイブリダイズさせた。

次に室温で低ストリンジエンシー（２ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ１０，１％　５ＤＳ）洗浄を２回行い、６０℃で高ストリンジエンシー（０，ｌｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ１０，１％　５ＤＳ）洗浄を２回行った。ハブリダイズしたバンドを可視化し、ホスファ− イメージヤ−を用いて定量した。次にプロットを煮沸して放射活性を除き、３２Ｐ−標識グリセロールー３−ホスフェート　デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）プローブ（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ）をプローブとして、等量のＲＮＡがのせられたことを確認した。

ＰＫＣ−α−特異的ｃＤＮＡプローブを使用するＡ３４９細胞からの全ＲＮＡのノーザン分析は、約８．５ｋｂおよび４．０ｋｂの大きさの二つの主なハイブリダイズ転写体を明らかにした。典型的には、これらは２：１の比で大きい方の転写体が優勢に発現される。Ａ３４９細胞をＤＯＴＭＡ存在下、５００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドで４時間処理し、続いてさらに２０時間インキュベートすると、両方の転写体のレベルが減少した。このことは図４に示されている。

最大の減少はオリゴヌクレオチドｌ５ＩＳ　３５２１　（配列ＩＤ番号：２）および３５２７　（配列ＩＤ番号＝５）で観察された（両方とも３゛−非翻訳配列に特異的にハイブリダイズ可能である）。これらのＰＫＣ−α　ｍＲＮＡ減少量は９０−９５％であった。ｌ５ＩＳ　３５２２　（配列ＩＤ番号：３）（翻訳開始コドンを標的にしている）はＰＫＣ−α　ｍＲＮＡレベルを８０％減少させ、ｌ５ＩＳ　３５２０（配列ＩＤ番号：１）はＰＫＣ−ａ　ｍＲＮＡを４０％減少させた。

全てのオリゴヌクレオチドはＰＫＣｍＲＮＡ減少に対し約２００ｎＭのｔＣＳ。

値を有していた。スクランブル対照体はこの濃度では何の影響も示さなかった。

ＰＫＣｍＲＮＡレベルの減少におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの反応速度論は、試験された４つのオリゴヌクレオチドについて類似していた。オリゴヌクレオチドを添加して４時間以内に６０−７０％の最大ＰＫＣＲＮＡ減少が起こり、最大減少はオリゴヌクレオチド添加後１２−２４時間で起こった。

実施例９　アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＰＫＣ−αの特異的阻害Ａ３４９細胞は通常ＰＫＣ−αに加えてＰＫＣ−δ、　ＰＫＣ−εおよびＰＫＣ−ζ を発現することが示されている。ＰＫＣ−αイソ酵素を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドによるこれらの細胞中におけるＰＫＣ−αの阻害の特異性が、ｌ５ＩＳ　３５２１　（配列ＩＤ番号＝２）、ｌ５ＩＳ　３５２２（配列ＩＤ番号＝３）またはそれらのスクランブル対照体であるオリゴヌクレオチドｌ５ＩＳ　４５５９（配列ＩＤ番号＝５３）および４６０８　（配列ＩＤ番号＝５４）処理後のイムノブロッティングにより示された。Ａ３４９細胞はオリゴヌクレオチド（４００ｎＭかまたは３００ｎＭ）およびＤＯＴＭＡで４時間処理し、洗浄後４８時間回復させた。次に細胞をオリゴヌクレオチド（２５０ｎＭ）およびＤＯＴＭＡで再び処理し、洗浄し、さらに２００時間回復せた。細胞抽出物を電気泳動し、膜に移して実施例３のごとくブロックした。続いて膜を０．５％脱脂ミルクを含むＴＢＳで希釈した下記の抗体の何れかで一夜処理した：抗−ＰＫＣ− α、−β、または−γモノクローナル抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ　ＢｉｏｃｈｅｓｉｃａＬｓ、　Ｉｎｃ、　）　、ｌμｇ／ｍｌ　；抗−ＰＫＣ−δまたは−ζポリクローナル抗体（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）　、１　：　２０００希釈；抗−ＰＫＣ −ｅ　［Ｈｕｗｉｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｔ　Ｊ、　１９９１．２７９．４４１−４４５）　、１　：　４０００希釈：または抗−ＰＫＣ−η、１　：　４０００希釈。抗体インキュベーション後、０．１％脱脂ミルクを含むＴＢＳで３回洗浄し、次に膜を５μＣｉの１！５■−ヤギ　抗−ウサギまたは抗 −マウス抗体（ＩＣＮ　Ｒａｄｉｏｃｈｅｌｌｉｃａｌｓ、　Ｉｒｖｉｎｅ　ＣＡ）とともに１時間インキュベートした。膜をよく洗浄し、標識タンパク質を可視化しホスファ−イメージヤ−（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ、ＣＡ）を使用して定量した。

オリゴヌクレオチド処理後に発現されたＰＫＣイソ酵素の分析により、ＰＫＣ− ６、−εおよび−このレベルはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそのスクランブル対照体両方の処理によっても変化しなかったことが明らかにされた。

アンチセンスオリゴヌクレオチドはＰＫＣ−α発現を７０−８０％減少させたが、一方、スクランブル対照体は影響を与えなかった。

実施例１０　Ａ３４９細胞増殖に対するオリゴヌクレオチドの影響Ａ３４９細胞をウェル当たり４０００細胞の濃度で６−ウェル　プレートに加えた。２４時間後、細胞をＤＭＥＭで３回洗浄し、２０Ｐｇ／＋ｉｌのＤＯＴＭＡ存在下、オリゴヌクレオチドを必要とされた濃度まで加え４時間インキュベートした。次に細胞を５％ＦＣ３を加えたＤＭＥＭで一度洗浄した後、５％ＦＣ３を加えたＤＭＥＭ中でさらに７２時間増殖させた。この時点で細胞をＰＢＳで２度洗浄し、トリプシンでウェルから除いて血球計数器で計数した。

ｌ５ＩＳ　３５２１および３５２７によるＡ３４９細胞増殖の阻害は２５０−５００ｎＭの一回のオリゴヌクレオチド投与後に観察された。この結果は図５に示されている。

実施例１１　キメラアンチセンスオリゴヌクレオチドによるＰＫＣ−αの阻害２ ′−〇−メチルオリゴヌクレオチド中に４から８のデオキシヌクレオチドの”デオキシギャップ”を有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを、実施例８に記載したごと＜ＰＫＣ−α　ｍＲＮＡレベル減少能力について試験した。

キメラオリゴヌクレオチドはｌ５ＩＳ　３５２１（配列ＩＤ番号：２）、ｌ５ＩＳ　３５２２（配列ＩＤ番号：３）およびｌ５ＩＳ　３５２７（配列ＩＤ番号＝５）の配列と同一の配列である。キメラオリゴヌクレオチドは表７に示されている：ボールド体は２′−０−メチルヌクレオチドを示している全てのオリゴヌクレオチドはホスホロチオエートであるオリゴ　配列　説明　配列ＩＤ番号３５２１　ＧＴＴＣＴＣＧＣＴＧＧＴＧＡＧＴＴＴＣ＾　完全Ｐ＝Ｓ　２５３５７　ＧＴｒＣＴＣＧＣＴＧＧＴＧＡ　ＧｍＣＡ　完全　Ｐ＝Ｓ　８−デオキシ　科フ１　２５３６１　ＧＴＴＣＴＣＧ　ＣＴＧＧＴＧＡ　ＧｍＣＡ　完全　Ｐ＝Ｓ　６−デオキシ　ギャフ１　２５３６０　ＧＴｒＣＴＣＧＣＴＧＧＴ　ＧＡＧｍＣ＾　完全　Ｐ＝Ｓ　４−デオキシ　ギャップ　２３５２２　＾Ａ＾＾ＣＧＴＣＡＧＣＣＡＴＧＧＴＣＣＣ完全Ｐ＝Ｓ　３５３５２　＾ＡＡＡＣＧ　ＴＣＡＧＣＣＡＴ　ＧＧＴＣＣＣ完全　Ｐ＝Ｓ　８−デオキシ　ギャフ１　３５３５０　＾ＡＡＡＣＧＴ　ＣＡＧＣＣＡ　ＴＧＧＴＣＣＣ完全　Ｐ＝Ｓ　６−デオキシ　ギャップ　３５３５１　ＡＡＡＡＣＧＴＣＡＧＣＣＡＴＧＧＴＣＣＣ完全　Ｐ＝Ｓ　４−デオキシ　ギｔ７１　３３５２７　ＧＡＧＡＣＣＣＴＧＡＡＣＡＧＴＴＧＡＴＣ完全Ｐ＝Ｓ　５５２４０　ＧＡＧＡＣＣＣＴＧＡＡＣＡＧ　ＴｒＧＡＴＣ完全　Ｐ＝Ｓ　８−デオキシ　ギャップ　５５２０８　ＧＡＧＡＣＣＣＴＧ＾＾Ｃ＾　ＧＴＴＧＡＴＣ完全　Ｐ＝Ｓ　６−デオキシ　ギャップ　５５０３８　ＧＡＧＡＣＣＣＴ　Ｇ＾＾ＣＡＧＴＴＧＡＴＣ完全　Ｐ＝Ｓ　４−デオキ／　ギャップ　５８−デオキシギャップを有するオリゴヌクレオチドはＰＫＣ−α　ｍＲＮＡレベルを少なくとも８５％低下させることができた。同じ配列のギャップを有しないオリゴヌクレオチドと比較した８−デオキシギャップのオリゴヌクレオチドの活性が図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃに示されている。６−デオキシギャップオリゴヌクレオチドの内の二つ（ＩＳＩＳ　５３６１、配列ＩＤ番号：２およびｌ５ＩＳ５３５０、配列ＩＤ番号　３）はＰＫＣ−ａ　ｍＲＮＡを５０％以上低下させることができ、４−デオキシギャップオリゴヌクレオチドの一つ（ＩＳＩＳ　３５２２、配列ＩＤ番号・３）はＰＫＣ−ａ　ｍＲＮＡを約８５％阻害することができた。配列ＩＤ番号：２、配列ＩＤ番号、３および配列Ｈ）番号：５を有するオリゴ類について、活性とデオキシギャップ長の関係が図７に示されている。

実施例１２　ヌードマウスにおけるヒト腫瘍細胞のオリゴヌクレオチド処置ヒト肺癌腫Ａ３４９細胞を採取し、５ｘｌＯ’の細胞をヌードマウスの後脚内側へ皮下で注射した。約−か列後に触診できる腫瘍が現れた。アンチセンスオリゴヌクレオチドｌ５ＩＳ　３５２１および３５２７を二つの投与量、１および１０ｍｇ／ｋｇ体重で、２日おきに６週間マウスに腹腔内投与した。マウスの腫瘍成長をモニターし、６週間後に腫瘍を切り出してＰＫＣ−αの発現をノーザンプロットおよびイムノプロットにより決定した。

配列番号ＮＯ：　１：（ｉ）配列の特性：（＾）配列の長さ＝２０（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ｉｖ）アンチセンス：　ｙｅｓ（ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　７：ＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＧＣＣＣＣＴＴＴＧＣ２０配列番号ＮＯ＋　８：（ｉ）配列の特性：（＾）配列の長さ：２０（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ｉｖ）アンチセンス：　ｙｅｓ（ｘｌ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１３：ＡＧＴＣＧＧＴＧＣＡ　ＧＴＧＧＣＴＧＧＡＧ　２０配列番号Ｎｏ：　９：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：２０（Ｂ）型；核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ｉｖ）アンチセンス：　ｙｅｓ（ｘｉ）配列：　ＳＥｏ　１０　Ｎｏ：　９：ＧＣＡＧＡＧＧＣＴＧ　ＧＧＧＡＣＡＴＴＧ＾２０配列番号Ｎｏ：　ｔｏ：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ＝２０（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数−一本鎖（Ｄ）トポロジー二直線状（ｉｖ）アンチセンス：　ｙｅｓ（ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１０：ＧＧＧＣＴＧＧＧＧＡ　ＧＧＴＧＴＴＴＧＴｒ　２０配列番号Ｎｏ：　１１：（ｉ）配列の特性。

（＾）配列の長さ：２０（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー二直線状（ｉｖ）アンチセンス：　ｙｅｓ（ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１１：ＣＡＣＴＧＣＧＧＧＧ　ＡＧＧＧＣＴＧＧＧＧ　２０配列番号Ｎｏ：　１２：（ｉ）配列の特性二（Ａ）配列の長さ：２０（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー二直線状（ｉｖ）アンチセンス：　ｙｅｓ（ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１２：ＡＧＣＣＧＴＧＧＣＣＴＴＡＡＡＡＴＴＴＴ　２０配列番号Ｎｏ：　１９：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ＝２０（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数；一本鎖（Ｄ）トポロジー−直線状（１ｖ）アンチセンス：　ｙｅｓ（ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１９：ＴＣＡＡＡＴＧＧＡＧ　ＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣ２０配列番号Ｎｏ：　２０：（ｉ）配列の特性：（＾）配列の長さ：２０（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数、一本鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（１ｖ）アンチセンス：　ｙｅｓ（ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２０：ＴＧＧＡＡＴＣＡＧＡ　ＣＡＣＡＡＧＣＣＧＴ　２０配列番号ＮＯ：　２１：（ｉ）配列の特性：（＾）配列の長さ：２０（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数、一本鎖（Ｄ）トポロジー　直線状（ｉｖ）アンチセンス　ｙｅｓ（ｘｉ）配列・　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２１ＣＡＴＣＴＴＧＣＧＣＧＣＧＧＧＧＡＧＣＣ２０配列番号Ｎｏ：　２２・（ｉ）配列の特性：（＾）配列の長さ：２０（Ｂ）型：核酸（Ｃ）　Ｍの数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー二直線状（ｉｖ）アンチセンス：　ｙｅｓ（ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２２：ＴＧＣＧＣＧＣＧＧＧ　ＧＡＧＣＣＧＧＡＧＣ２０配列番号ＮＯ＋　２３：（ｉ）配列の特性：（＾）配列の長さ：２０（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：ｉｉｉ線状（ｉｖ）アンチセンス：　ｙｅｓ（ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　２３：ＣＧＡＧＡＧＧＴＧＣＣＧＧＣＣＣＣＧＧＧ　２０配列番号ＮＯ＋　２４：（ｉ）配列の特性：（＾）配列の長さ、２０（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー二直線状（ｉｖ）アンチセンス：　ｙｅＳ（ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２４：ＣＴＣＴＣＣＴＣＧＣＣＣＴＣＣＧＴＣＧＧ　２０配列番号Ｎｏ：　３１：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：２０（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー零値（Ｄ）トポロジー：直線状（ｉｖ）アンチセンス：　ｙｅｓ（ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　３１：ＡＴＧＣＴＧＣＧＧＡ　ＡＡＡＴＡ＾＾ＴＴＧ　２０配列番号Ｎｏ：　３２：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：２０ＣＢ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー零値（Ｄ）トポロジー：直線状（ｉｖ）アンチセンス：　ｙｅｓ（ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　３２：＾ＴＴＴＴＡＴｍ　ＧＡＧＣＡＴＧＴｒＣ２０配列番号ＮＯ二３３：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：２０（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー零値（Ｄ）トポロジー・直線状（ｉｖ）アンチセンス：　ｙｅｓ（ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　３３：ＴｒＴＧＧＧＧＡＴＧ　ＡＧＧＧＴＧＡＧＣＡ　２０配列番号Ｎｏ：　３４：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：２０（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー零値（Ｄ）トポロジー：直線状（ｉｖ）アンチセンス：　ｙｅｓ（ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　３４：ＣＣＣＡＴＴＣＣＣＡ　ＣＡＧＧＣＣＴＧＡＧ　２０配列番号Ｎｏ：　３５：（ｉ）配列の特性：（＾）配列の長さ：２０（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー零値（Ｄ）トポロジー二直線状（ｉｖ）アンチセンス：　ｙｅｓ（ｘｉ）　配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　３５：ＣＧＧＡＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣＡＧＧＧＡ　２０配列番号ＮＯ＋　３６＋（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ：２０（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー零値（Ｄ）トポロジー二直線状（ｉｖ）アンチセンス：　ｙｅｓ（ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　３６：ＣＣＴＴＴＴＣＣＣＡ　ＧＡＣＣＡＧＣＣＡＴ　２０配列番号ＮＯ・４３：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ＝２０（Ｂ）型：核酸（Ｃ）　！の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ｉｖ）アンチセンス：　ｙｅｓ（ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　４３：＾ＣＡＧＧＴＧＣＡＧ　ＧＡＧＴＣＧＡＧＧＣ２０配列番号Ｎｏ：　４４：（ｉ）配列の特性：（＾）配列の長さ：２０（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ｉｖ）アンチセンス−、ｙｅｓ（ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　４４：ＧＴＣＣＣＧＴＣＴＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＣ２０配列番号Ｎｏ＋　４５＋（ｉ）配列の特性。

（＾）配列の長さ＝２０（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数、−末鎖（Ｄ）トポロジー：ｌＩＩ線状（ｉｖ）アンチセンス　ｙｅｓ（Ｘｌ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　４５：ＣＣＴＣＡＣＣＧＡＴＧＣＧＧＡＣＣＣＴＣ２１３配列番号Ｎｏ：　４６：（ｉ）配列の特性：（＾）配列の長さ＝２０（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー二直線状（ｉｖ）アンチセンス：　ｙｅｓ（ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　４６：ＡＴＴＧＡＡＣＴｒＣＡＴＧＧＴＧＣＣＡＧ　２０配列番号Ｎｏ：　４７：（ｉ）配列の特性：（＾）配列の長さ：２０（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー二重線状（ｉｖ）アンチセンス：　ｙｅｓ（ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　４７：ＴＣＴＣＡＣＴＣＣＣＣＡＴＡＡＧＧＣＴＡ　２０配列番号ＮＯ：　４８：（ｉ）配列の特性：（＾）配列の長さ：２０（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー二直線状（ｉｖ）アンチセンス：　ｙｅｓ（ｘｉ）配列＋　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　４８：ＴＴＣＣＴＴＴＧＧＧ　ｎｃＴｃＧＴＧｃｃ　２０二　０時間　ロ＝ニコ＋２４時間 −ノ’ｉｑ−ｆＡ口０時間　ロニ］　＋２４時間 −ｊ【］う７．ｆＢじ［ψ、２じ−々・Ｊ対照　３５２０　３５２＋　３５２２　３５２７オリゴヌクレオチドオリゴヌクレオチド（ｎＭ）オリゴヌクレオチド濃度　（ｎＭ）オリゴヌクレオチド濃度　（ｎＭ）オリゴヌクレオチド濃度　（ｎＭ）デオキシ　ギャップ　サイズ平成６年り２月／２日

Claims

【特許請求の範囲】

１．ＰＫＣ遺伝子由来の選択されたＤＮＡまたはＲＮＡと特異的にハイブリダイズ可能な、５から５０のヌクレオチド単位を含むオリゴヌクレオチド。
２．ＰＫＣ遺伝子の翻訳開始部位、５′非翻訳領域または３′非翻訳領域に特異的にハイブリダイズ可能な、請求項第１項に記載のオリゴヌクレオチド。
３．請求項第１項に記載のオリゴヌクレオチドおよび薬学的に受容可能な担体を含む医薬組成物。
４．前記ＤＮＡまたはＲＮＡが特定のＰＫＣイソ酵素またはイソ酸素の組をコードする請求項第１項に記載のオリゴヌクレオチド。
５．前記ＤＮＡまたはＲＮＡが、下記の酵素：ＰＫＣ−α、ＰＫＣ−β、ＰＫＣ −γ、ＰＫＣ−ηの一つまたはそれ以上をコードする請求項第４項に記載のオリゴヌクレオチド。
６．前記オリゴヌクレオチドが表１、２、３、４、５および６に同定されている配列の一つを含む請求項第５項に記載のオリゴヌクレオチド。
７．ＰＫＣの発現を調節する方法であって、前記遺伝子を含む組織または細胞をＰＫＣ遺伝子由来の選択されたＤＮＡまたはＲＮＡと特異的にハイブリダイズ可能な５から５０のヌクレオチド単位を含むオリゴヌクレオチドと接触させることからなる方法。
８．前記オリゴヌクレオチドがＰＫＣ遺伝子の翻訳開始部位、５′非翻訳領域または３′非翻訳領域に特異的にハイブリダイズ可能である請求項第７項に記載の方法。
９．前記ＤＮＡまたはＲＮＡが特定のＰＫＣイソ酵素またはイソ酵素の組をコードする請求項第７項に記載の方法。
１０．前記ＤＮＡまたはＲＮＡが、下記の酵素：ＰＫＣ−α、ＰＫＣ−β、ＰＫＣ−γ、ＰＫＣ−ηの一つまたはそれ以上をコードする請求項第９項に記載の方法。
１１．前記オリゴヌクレオチドが表１、２、３、４、５および６に同定されている配列の一つを含む請求項第１０項に記載の方法。
１２．前記オリゴヌクレオチドが配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４を含む請求項第７項に記載の方法。
１３．細胞または組織中のＰＫＣをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの存在を検出する方法であって、細胞または組織を前記ＤＮＡまたはＲＮＡと特異的にハイブリダイズ可能な５から５０のヌクレオチド単位を含むオリゴヌクレオチドと接触させ、ハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出することからなる方法。
１４．前記オリゴヌクレオチドがＰＫＣ遺伝子の翻訳開始部位、５′非翻訳領域または３′非翻訳領域に特異的にハイブリダイズ可能な請求項第１３項に記載の方法。
１５．前記ＤＮＡまたはＲＮＡが特定のＰＫＣイソ酵素またはイソ酵素の組をコードする請求項第１３項に記載の方法。
１６．前記ＤＮＡまたはＲＮＡが、下記の酵素：ＰＫＣ−α、ＰＫＣ−β、ＰＫＣ−γ、ＰＫＣ−ηの一つまたはそれ以上をコードする請求項第１５項に記載の方法。
１７．前記オリゴヌクレオチドが表１、２、３、４、５および６に同定されている配列の一つを含む請求項第１７項に記載の方法。
１８．前記オリゴヌクレオチドが配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４を含む請求項第１３項に記載の方法。
１９．ＰＫＣに伴う疾病状態を処置する方法であって、動物をＰＫＣ遺伝子由来の選択されたＤＮＡまたはＲＮＡと特異的にハイブリダイズ可能な５から２５のヌクレオチド単位を含む有効量のオリゴヌクレオチドと接触させることからなる方法。
２０．前記オリゴヌクレオチドがＰＫＣ遺伝子の翻訳開始部位、５′非翻訳領域または３′非翻訳領域に特異的にハイブリダイズ可能な請求項第１９項に記載の方法。
２１．前記オリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドおよび薬学的に受容可能な担体を含む医薬組成物として投与される請求項第１９項に記載の方法。
２２．前記ＤＮＡまたはＲＮＡが特定のＰＫＣイソ酵素またはイソ酵素の組をコードする請求項第１９項に記載の方法。
２３．前記ＤＮＡまたはＲＮＡが、下記の酵素：ＰＫＣ−α、ＰＫＣ−β、ＰＫＣ−γ、ＰＫＣ−ηの一つまたはそれ以上をコードする請求項第２２項に記載の方法。
２４．前記オリゴヌクレオチドが表１、２、３、４、５および６に同定されている配列の一つを含む請求項第２３項に記載の方法。
２５．前記オリゴヌクレオチドが配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４を含む請求項第１９項に記載の方法。
２６．ＰＫＣに伴う疾病状態を診断する方法であって、ＰＫＣに伴う疾病状態を有すると疑われる動物からの細胞または組織または体液を、ＰＫＣ遺伝子由来の選択されたＤＮＡまたはＲＮＡと特異的にハイブリダイズ可能な８から５０のヌクレオチド単位を含むオリゴヌクレオチドと接触させ、および、ハイブリダイゼーションが起こるか否かを検出することからなる方法。
２７．前記オリゴヌクレオチドがＰＫＣ遺伝子の翻訳開始部位、５′非翻訳領域または３′非翻訳領域に特異的にハイブリダイズ可能な請求項第２６項に記載の方法。
２８．前記ＤＮＡまたはＲＮＡが特定のＰＫＣイソ酵素またはイソ酵素の組をコードする請求項第２６項に記載の方法。
２９．前記ＤＮＡまたはＲＮＡが、下記の酵素：ＰＫＣ−α、ＰＫＣ−β、ＰＫＣ−γ、ＰＫＣ−ηの一つまたはそれ以上をコードする請求項第２８項に記載の方法。
３０．前記オリゴヌクレオチドが表１、２、３、４、５および６に同定されている配列の一つを含む請求項第２９項に記載の方法。
３１．前記オリゴヌクレオチドが配列ＩＤ番号：１、配列ＩＤ番号：２、配列ＩＤ番号：３または配列ＩＤ番号：４を含む請求項第２６項に記載の方法。
３２．配列ＩＤ番号：１を含むオリゴヌクレオチド。
３３．請求項第３２項に記載のオリゴヌクレオチドおよび薬学的に受容可能な担体を含む医薬組成物。
３４．配列ＩＤ番号：２を含むオリゴヌクレオチド。
３５．請求項第３４項に記載のオリゴヌクレオチドおよび薬学的に受容可能な担体を含む医薬組成物。
３６．配列ＩＤ番号：３を含むオリゴヌクレオチド。
３７．請求項第３６項に記載のオリゴヌクレオチドおよび薬学的に受容可能な担体を含む医薬組成物。
３８．配列ＩＤ番号：５を含むオリゴヌクレオチド。
３９．請求項第３８項に記載のオリゴヌクレオチドおよび薬学的に受容可能な担体を含む医薬組成物。