FI112379B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten oligonukleotidien valmistamiseksi - Google Patents

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten oligonukleotidien valmistamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI112379B
FI112379B FI944276A FI944276A FI112379B FI 112379 B FI112379 B FI 112379B FI 944276 A FI944276 A FI 944276A FI 944276 A FI944276 A FI 944276A FI 112379 B FI112379 B FI 112379B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
pkc
seq
oligonucleotides
oligonucleotide
sequence
Prior art date
Application number
FI944276A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI944276A0 (fi
FI944276A (fi
Inventor
Frank C Bennett
Nicholas M Dean
Original Assignee
Isis Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Isis Pharmaceuticals Inc filed Critical Isis Pharmaceuticals Inc
Publication of FI944276A0 publication Critical patent/FI944276A0/fi
Publication of FI944276A publication Critical patent/FI944276A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI112379B publication Critical patent/FI112379B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/11—Protein-serine/threonine kinases (2.7.11)
    • C12Y207/11013—Protein kinase C (2.7.11.13)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3527—Other alkyl chain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533—Halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

112379
Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten oligonukleotidi-en valmistamiseksi
Keksinnön alue 5 Tämä keksintö koskee menetelmää oligonukleotidien valmistamiseksi, jotka ovat käyttökelpoisia sellaisten tautitilojen hoidossa, jotka ovat herkkiä proteiinikinaasi C -proteiinin ekspression modulaatiolle. Tämä keksintö koskee erikoisesti menetelmää sellaisten vastinjuosteoligonukle-10 otidien valmistamiseksi, jotka hybridisoituvat spesifisesti ihmisen proteiinikinaasi C -proteiinia koodaavien mRNA-nukleiinihappojen kanssa. Näiden oligonukleotidien on havaittu moduloivan proteiinikinaasi C -proteiinin ekspressiota. Tuloksena on taudin lieventyminen ja terapeuttinen 15 vaikutus.
Keksinnön tausta
Proteiinien fosforylaatiolla on keskeinen rooli so- lunulkoisten signaalien siirtämisessä soluun. Entsyymit, joita kutsutaan kinaaseiksi, jotka aiheuttavat sellaiset 20 fosforylaatiot, ovat kasvutekijöiden, hormonien ja muiden . solun metabolia-, lisääntymis- ja erilaistumisaineiden toi- * minnan kohteita. Eräs pääasiallinen signaalin siirtoreitti : ’* sisältää proteiinikinaasi C -entsyymin (PKC), jolla tiede- » ” tään olevan kriittinen vaikutus solun lisääntymiseen ja 25 erilaistumiseen. PKC-proteiini aktivoituu diasyyliglysero- » lien (DAG) vaikutuksesta, jotka ovat signaalin siirrossa ;^; : vapautuvia metaboliitteja.
Kiinnostusta PKC-proteiiniin stimuloi havainto, et-tä PKC-proteiini on pääasiallinen, ja ehkä ainoa, solu-30 reseptori, jonka kautta kasvainta edistävät aineet, joita ** kutsutaan forboliestereiksi, saavat aikaan pleiotrooppiset
I t I
vaikutuksensa soluissa. Gescher et ai., Anti-Cancer Drug Design 1989, 4, 93 - 105. Kasvaimen tuottoon kykenevät for-bolit voivat matkia DAG-molekyylien vaikutusta PKC-.·, : 35 proteiinin aktivoimisessa, joka antaa ehdottaa, että nämä I I · kasvaimen edistäjät toimivat PKC-proteiinin kautta ja että 2 112379 tämän entsyymin aktivaatio on ainakin osaksi vastuussa tuloksena syntyneestä kasvaimen kasvusta. Parker et ai., Science 1986, 233, 853 - 866.
Kokeellinen todiste osoittaa, että PKC-proteiinilla 5 on rooli paksusuolen syövän kasvun säätelyssä. Uskotaan, että spesifiset bakteerit suolessa muuttavat lipidit DAG-molekyyleiksi näin aktivoiden PKC-proteiinin ja muuttaen solun lisääntymistä. Tämä voisi selittää korrelaation ruokavalion korkean rasvapitoisuuden ja paksusuolen syövän vä-10 Iillä. Weinstein, Cancer Res. (Suppl.) 1991, 51, 5080s-5085s. On myös osoitettu, että suurempi määrä PKC-proteiinia paksu-peräsuolisyöpäpotilaiden paksusuolen limakalvossa on aktivoituneessa tilassa verrattuna sellaisten potilaiden vastaavaan, joilla ei ole syöpää. Sakanoue et 15 ai., Int. J. Cancer 1991, 48, 803 - 806.
Lisääntynyt kasvaimen kasvu korreloituu myös PKC-proteiinin yliekspressioon viljellyissä soluissa, jotka on ympätty paljaisiin hiiriin. PKC-proteiinin mutanttimuoto indusoi erittäin pahanlaatuiset kasvainsolut, joilla on ko-20 honnut metastasoiva aktiivisuus. Sfingosiinin ja sille su-. kua olevien PKC-proteiinin aktiivisuuden inhibiittorien on
> 1 I
osoitettu inhiboivan kasvainsolun kasvua ja säteilyllä in- : “ dusoitua transformaatiota in vivo. Endo et ai., Cancer Re- * · - -- *. 1: search 1991, 51, 1613 - 1618; Borek et ai., Proc. Natl.
25 Acad. Sei. USA 1991, 88, 1953 - 1957. Useat kokeellisesti ,,1·1 tai kliinisesti käyttökelpoiset syövän vastaiset aineet si- ::: sältävät PKC-proteiinia moduloivia vaikutuksia. Näin ollen PKC-proteiinin inhibiittorit voivat olla tärkeitä syöpää jV. ehkäiseviä tai terapeuttisia aineita. PKC-proteiinin on eh- f · .1·. 30 dotettu olevan mahdollinen kohde tavanomaisten syövän vas- • a täisten lääkkeiden rationaaliselle suunnittelulle. Gescher > · A. ja Dale, I.L., Anti-Cancer Drug Design 1989, 4, 93 - 105.
Kokeet osoittavat myös, että PKC-proteiinilla on ; 35 tärkeä rooli hyperproliferatiivisten ihotautien, kuten pso riasiksen ja ihosyövän, patofysiologiassa. Psoriasikselle 3 112379 on tunnusomaista tulehdus, orvaskeden hyperproliferäätio ja alentunut solujen erilaistuminen. Eri tutkimukset osoittavat PKC-proteiinin roolin näiden oireiden aiheuttamisessa. PKC-proteiinin stimulaation viljellyissä keratinosyyteissä 5 voidaan osoittaa aiheuttavan hyperproliferaatiota. Tulehdus voidaan indusoida forboliestereillä ja sitä säätelee PKC. DAG-molekyyli on mukana PKC-proteiinin osallisuudessa ihotaudeissa ja sitä muodostuu kohonneessa määrin psoriasis-vaurioissa .
10 PKC-inhibiittorien on osoitettu sisältävän sekä li sääntymisen vastaisia että tulehduksen vastaisia vaikutuksia in vitro. Joidenkin psoriasiksen vastaisten lääkkeiden, kuten syklosporiini A:n ja antraliinin, on osoitettu inhiboivan PKC-proteiinia. PKC-proteiinin inhibitiota on ehdo-15 tettu terapeuttiseksi lähestymistavaksi psoriasiksen hoitoon. Hegemann, L. ja G. Mahrle, Pharmacology of the Skin, H. Mukhtar, toim., CRC Press, Boca Raton, FL, 1992, sivut 357 - 368.
PKC ei ole yksi ainoa entsyymi vaan entsyymiperhe. 20 Tällä hetkellä on tunnistettu ainakin seitsemän PKC- . isomuotoa (isotsyymiä): a, β ja γ on puhdistettu homogeeni siksi ja isomuodot δ, e, ζ ja η_ on tunnistettu molekyyli-* ’* kloonauksella. Näillä isotsyymeillä on erilaiset kudos- ja ’· ’· elin-sijaintikuviot (katso yhteenvetoa varten Nishizuka, 25 Nature 1988, 334, 661 - 665) ja ne voivat toimia erilaisis- sa fysiologisissa toiminnoissa. Esimerkiksi PKC-γ-proteiini : tuntuu olevan ekspressoitu ainoastaan keskushermostossa.
PKC-ce- ja PKC-B-proteiineja ekspressoidaan useimmissa ku-·*·’: doksissa, mutta niillä on erilaiset ekspressiokuviot eri 30 solutyypeissä. Esimerkiksi sekä PKC-α- että PKC-β- proteiineja ekspressoidaan ihmisen orvaskedessä ja ne on t i » puhdistettu siitä. Samalla kun PKC-a-proteiini on tunnista ' tettu ainoastaan pääosin orvaskeden tyvikerrosten kerätino- syyteissä, PKC-S-proteiinia löydeään pääosin orvaskeden : 35 keskikerroksista ja Langerhansin soluita. PKC-η-proteiinia on löydetty pääosin ihosta ja keuhkoista niin, että eks- 4 112379 pressiotaso on paljon korkeampi näissä kudoksissa kuin aivoissa. Tämä on päinvastaista verrattuna muihin PKC-perheen jäseniin, jotka tuntuvat olevan runsaimmin ekspressoituja aivoissa. Osada et ai., J. Biol. Chem 1990, 265, 22434 - 5 22440. Samalla kun tässä luetellut PKC-isotsyymit ovat suo siteltavia esillä olevan keksinnön kohdennusta varten, muut PKC-isotsyymit kuuluvat myös esillä olevaan keksintöön.
Tällä hetkellä uskotaan, että erilaiset PKC-isotsyymit voivat ottaa osaa erilaisiin tautiprosesseihin 10 riippuen elimestä tai kudoksesta, joissa niitä ekspressoi-daan. Esimerkiksi psoriasisvaurioissa on muutos PKC-o;- ja PKC-6-proteiinien suhteessa niin, että erityisesti PKC-β-proteiinia on hävinnyt verrattuna normaaliin ihoon (Hege-mann, L. ja G. Mahrle, Pharmacology oq the Skin, H. Mukh- 15 tar, toim. , CRC Press, Boca Raton, FL, 1992, sivut 357 - 368 .
Vaikka useiden yhdisteiden on tunnistettu olevan PKC-inhibiittoreita (katso yhteenvetoa varten Hidaka ja Ha- giwara, Trends in Pharm. Sei. 1987, 8, 162 - 164), ei ole 20 löydetty yhtäkään, joka inhiboi PKC-proteiinia spesifises- ti. Samalla kun kinoliinisulfonamidijohdannaiset, kuten 1- (5-isokinoliinisulfonyyli)-2-metyylipiperatsiini (H-7) in- ' " hiboi PKC-proteiinia mikromolaarisina konsentraatioina, # niillä on samanlaiset entsyymi-inhibitiokinetiikat PKC- . ! 25 proteiinille ja cAMP-molekyylistä riippuvaisille ja cGMP- » molekyylistä riippuvaisille proteiinikinaaseille. Stauro-V : sporiini, Streptomyces sp. -ljin alkaloidituote, ja sen analogit ovat vahvimpia PKC-proteiinin inhibiittoreita in ;!*1; vitro, jotka on tunnistettu tähän mennessä. Niillä on kui- 30 tenkin ainoastaan rajoitettu selektiivisyys eri prote- iinikinaasien joukossa. Gescher, Anti-Cancer Drug Design t t » 1989, 4, 93 - 105. Näin ollen muut ovat epäonnistuneet PKC-’···’ proteiinin inhiboimisessa spesifisesti. On myös olemassa toive spesifisten PKC-isotsyymien inhiboimiseksi sekä tut-.‘.J 35 kimusvälineenä käytettäväksi että sellaisten tautien hoita miseksi, jotka voivat liittyä tiettyyn isotsyymiin.
5 112379
Keksinnön aiheet
Keksinnön pääaihe on saada aikaan reagensseja, jotka ovat käyttökelpoisia neoplastisten, hyperproliferatii-visten, tulehduksellisten ja muiden tautien hoitoon, jotka 5 liittyvät proteiinikinaasi C -proteiiniin.
Toinen keksinnön aihe on saada aikaan reagensseja, jotka ovat selektiivisiä hoidettaessa tauteja, jotka liittyvät proteiinikinaasi C -proteiinin tiettyihin isotsyymei-hin.
10 Keksinnön lisäaihe on saada aikaan vastinjuosteoli- gonukleotidit, jotka kykenevät moduloimaan proteiinikinaasi C -proteiinin ekspressiota.
Eräs keksinnön aihe on saada aikaan vastinjuosteo-ligonukleotidit, jotka kykenevät selektiivisesti moduloi-15 maan proteiinkinaasi C -proteiinin tiettyjen isotsyymien ekspressiota.
Vielä eräs aihe on esittää keinot proteiinikinaasi C -proteiiniin liittyvien tautien diagnosoimiseksi, esittää keinot proteiinikinaasi C -proteiinin tiettyihin isotsyy-20 meihin liittyvien tautien diagnosoimiseksi, esittää tutkimusvälineet proteiinikinaasi C -proteiinin ekspression vai-' kutusten ja siihen liittyvien tautien tutkimiseksi sekä ’ ( esittää tutkimusvälineet proteiinikinaasi C -proteiinin * tiettyjen isotsyymien ekspression vaikutusten ja niihin .. ; 25 liittyvien tautien tutkimiseksi. Nämä keksinnön puolet on esitetty tästä hakemuksesta jakamalla erotetussa hakemuk-- sessa FI 20030284.
Nämä ja muut tämän keksinnön aiheet selviävät vä-littömästä patenttihakemuksen yhteenvedosta.
''. 3 0 Kuvioiden lyhyt kuvaus
Kuviot 1(a) ja 1(b) ovat graafiset esitykset PKC-o;- * * » sekvenssin kanssa hybridisoituvien vastinjuosteoligonukle- ‘ otidien vaikutuksista PKC-proteiinin ekspressioon. Oligo- nukleotidit on järjestetty PKC-kohdealueen mukaisesti 5' -: 35 3 '-suuntaisesti .
6 112379
Kuvio 2 on käyrästö, joka esittää PKC-a-proteiini-synteesin annoksesta riippuvaisen vastinjuosteoligonukle- otidi-inhibition, joka on ilmaistu prosenttina verrokista (ei oligonukleotidia). Y = ISIS 3520; = ISIS 3522; A = 5 ISIS 3527; V = ISIS 4985.
Kuvio 3 on käyrästö, joka esittää PKC-a-proteiini-synteesin annoksesta riippuvaisen inhibition oligonukleoti-dilla ISIS 4649, oligonukleotidin ISIS 3522 2'-0- metyylimuodolla (molemmat ovat fosforotioaatteja). Y = 10 ISIS 4632; · = ISIS 4636; = ISIS 4649; A = ISIS 4648.
Kuvio 4 on pylväsdiagrammi, joka esittää alenemiset PKC - o;-mRNA-transkripti tasoissa vas tin juos teoligonukleot idi-käsittelyn jälkeen. Viivoitetut pylväät edustavat 8,5 kb transkriptia ja valkoiset pylväät edustavat 4,0 kb tran-15 skriptia.
Kuvio 5 on käyrästö, joka esittää A549-solujen lisääntymisen inhibition vastinjuosteoligonukleotideilla. = 4559; ♦ = 4985; · = 3521; A = 3527.
Kuvio 6 on sarja käyrästöjä, jotka esittävät ΡΚΟα-20 mRNA-tasojen inhibition 2'-O-metyylifosforotioaattioligo- . nukleotideilla, joissa on 8-deoksi-aukkoja verrattuna täy- ,;** dellisesti deoksinukleotideista koostuviin fosforotioaat-
" tioligonukleotideihin, joissa on sama sekvenssi. Kuvio 6A
’* esittää tulokset sekvenssille SEQ ID nro 2 (5357 on aukkoja 25 sisältävä oligonukleotidi, 3521 koostuu täysin deoksinukle- otideista) . Kuvio 6B esittää tulokset sekvenssille SEQ ID : nro 3 (5352 on aukkoja sisältävä oligonukleotidi, 3522 koostuu täysin deoksinukleotideista). Kuvio 6C esittää tu- • V. lokset sekvenssille SEQ ID nro 5 (5240 on aukkoja sisältävä 30 oligonukleotidi, 3527 koostuu täysin deoksinukleotideista) .
Kuvio 7 on käyrästö, joka esittää suhteet deoksi-aukkojen pituuden (2' -O-metyylioligonukleotidissa) ja vas-*...· tinjuosteoligonukleotidien SEQ ID nro 2, SEQ ID nro 3 ja jV. SEQ ID nro 5 aiheuttaman PKC-a-mRNA-tasojen alenemisen vä- : 35 Iillä.
* t 7 112379
Keksinnön yhteenveto
Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistetaan oligonukleotidejä, jotka hybridisoituvat spesifisesti PKC-proteiinia koodittavasta geenistä peräisin oleviin DNA ja 5 RNA-molekyyleihin. Oligonukleotidi sisältää nukleotidiyksiköitä identiteetiltään ja määrältään riittävästi niin, että ne saavat aikaan sellaisen spesifisen hybridisäätiön. Tätä suhdetta kutsutaan yleisesti nimellä "antisense". Eräässä suositeltavassa suoritustavassa oligonukleotidit hybridi-10 soituvat spesifisesti geenin translaation aloituskodonin kanssa ja ne sisältävät suositeltavasti sekvenssin CAT. Toisessa suositeltavassa suoritustavassa oligonukleotidit hybridisoituvat spesifisesti geenin transloimattomien 5'-tai 3'-alueiden kanssa. Vielä eräässä suositeltavassa suo-15 ritustavassa esitetään oligonukleotidit, jotka hybridisoituvat spesifisesti sellaisen DNA- tai mRNA-molekyylin kanssa, joka koodittaa tiettyä PKC-isotsyymiä tai tiettyä PKC-isotsyymien ryhmää.
Erityisesti keksintö koskee menetelmää terapeutti -20 sesti käyttökelpoisen oligonukleotidin valmistamiseksi, . joka käsittää 5-50 nukleotidiyksikköä, jotka hybridisoi- • ♦ ' tuvat spesifisesti ihmisen proteiinikinaasi C:tä koodaa- • " vaan mRNA-molekyyliin, jolloin mainittu oligonukleotidi *· '* käsittää nukleotidisekvenssin, joka on valittu ryhmästä, 25 joka koostuu sekvensseistä tunnusnumerot nro 1, 2, 3 ja 5, jolloin menetelmälle on tunnusomaista, että olionukleotidi •t! : syntetisoidaan käyttämällä kiinteäfaasimenetelmää.
Keksinnön mukaisesti valmistettavat oligonukleoti-·*·'; dit annetaan helposti ja suositeltavasti farmaseuttisesti 30 hyväksyttävässä kantajassa.
Edullisesti valmistettavat oligonukleotidit formu- i · · *·'·’ loidaan niin, että ainakin yksi oligonukleotidin nukleoti- diyksiköiden välisistä liitosryhmistä sisältää rikkiä si-; V: sältävän lajin, fosforotioaattiosan. Muissa edullisissa
* I
35 suoritustavoissa oligonukleotidit formuloidaan niin, että i a ainakin yksi nukleotideista on modifioitu sokerin 2'- 8 112379 kohtaan. Esimerkkejä sellaisista edullisista modifikaatioista ovat 2'-O-alkyyli- ja 2'-fluori-modifikaatiot.
Keksinnön mukaisesti valmistettuja oligonukleotide-jä voidaan käyttää menetelmissä PKC-ekspression tai tietyn 5 PKC-isotsyymin tai isotsyymiryhmän ekspression modulointi -seksi soluissa tai kudoksissa. Lisäksi keksinnön mukaisesti valmistettuja oligonukleotidejä voidaan käyttää menetelmissä sellaisen DNA- tai RNA-molekyylin tunnistamiseksi soluissa tai kudoksissa, joka koodittaa PKC-proteiinia, ja 10 sellaisen DNA- tai RNA-molekyylin spesifiseksi tunnistamiseksi soluissa tai kudoksissa, joka koodittaa tiettyä PKC-isotsyymiä. Sellaiset menetelmät sisältävät vaiheen, jossa saatetaan sellaiset solut tai kudokset, joiden epäillään sisältävän mainitun geenin, kosketukseen keksinnön mukai-15 sesti valmistettavien oligonukleotidien kanssa niin, että häiritään mainitun RNA- tai DNA-molekyylin toimintaa tai tunnistetaan se.
Keksinnön mukaisesti valmistettavia oligonukleotidej ä voidaan käyttää sellaisten eläinten diagnosoimiseksi 20 ja terapeuttiseksi hoitamiseksi, joilla epäillään olevan tauti, joka liittyy PKC-proteiiniin tai johonkin sen isot- , ’ syymiin. Sellaiset menetelmät sisältävät vaiheen, jossa ’ saatetaan eläin tai eläimen solut tai kudokset tai kehon- * *· '· neste kosketukseen keksinnön mukaisten oligonukleotidien * · ·. : 2 5 kanssa PKC-proteiinin ekspression moduloimiseksi, PKC- ,proteiiniin liittyvien tautitilojen hoitamiseksi tai niiden V ' diagnoosin tekemiseksi.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus
Vastinjuosteoligonukleotidit ovat lupaavia tera-30 peuttisina aineina monien ihmisen tautien hoidossa. Oligo- I i * ,*, nukleotidit sitoutuvat (hybridisoituvat) spesifisesti DNA-, f * t pre-mRNA- tai kypsän mRNA-molekyylin komplementaarisen
» I
juosteen kanssa Watson-Crick-emäspariutumisen mukaisesti niin, että ne häiritsevät geneettisen informaation kulkua : 35 DNA:sta proteiiniksi. Vastinjuosteoligonukleotidien ominai suudet, jotka tekevät ne spesifiseksi niiden kohdesekvens- 9 112379 sille, tekevät niistä myös erityisen monipuolisia. Koska vastinjuosteoligonukleotidit ovat pitkiä monomeeriyksiköi-den ketjuja, ne on helppo syntetisoida mille tahansa kohde-RNA-sekvenssille. Useat viime aikaiset tutkimukset ovat 5 osoittanneet vastinjuosteoligonukleotidien käyttökelpoisuuden biokemiallisina työvälineinä kohdeproteiinien tutkimisessa. Rothenberg et ai., J. Natl. Cancer Inst. 1989, 81, 1539 - 1544; Zon, G., Pharmaceutical Res. 1988, 5, 539 -549. Johtuen viime aikaisista edistymisistä sellaisten nuk-10 leaasiresistenttien oligonukleotidien oligonukleotidikemi-assa ja synteesissä, joita solu ottaa sisäänsä tehostuneesta, on nyt mahdollista harkita vastinjuosteoligonukleoiti-dien käyttöä uutena terapeuttisena hoitomuotona.
Vastinjuosteoligonukleotidit tarjoavat ideaalisen 15 ratkaisun ongelmiin, joita alan aikaisemmissa lähestymistavoissa on ollut. Ne voidaan suunnitella niin, että ne selektiivisesti inhiboivat tiettyä isotsyymiä tai tiettyä isotsyymiryhmää, tai inhiboivat kaikkia tietyn isotsyymi-ryhmän jäseniä. Niillä vältetään epäspesifiset mekanismit, 20 kuten vapaan radikaalin sieppaus. Täydellistä entsyymimeka-nismin ymmärrystä ei tarvita spesifisten inhibiittorien ,1* suunnittelemiseksi.
* ‘j Tämänhetkisillä aineilla, jotka moduloivat prote- ’· '' iinikinaasi C -proteiinin aktiivisuutta tai metaboliaa, on 2 5 monia ei-hyväksyttäviä sivuvaikutuksia johtuen siitä, että ne eivät ole spesifisiä tai niillä on ainoastaan rajoittuisi i nut tehokkuus entsyymin inhiboimisessa. Esillä oleva kek sintö kiertää ongelmat, joita aiemmat tutkijat ovat kohdan-neet, moduloimalla entsyymin tuottoa mieluummin kuin inhi- • * .···, 3 0 boimalla entsyymiä suoraan terapeuttisen vaikutuksen ai kaansaamiseksi. Esillä olevassa keksinnössä oligonukleotidi > t ) suunnitellaan niin, että se sitoutuu suoraan geenin mRNA-molekyyliin lopulta moduloiden geenistä tuotetun PKC-proteiinin määrää.
: 35 Tämän keksinnön yhteydessä termi "oligonukleotidi" viittaa polynukleotidiin, joka on muodostettu luonnollises- 10 112379 ti esiintyvistä emäksistä ja pentofuranosyyliryhmistä, jotka on liitetty yhteen luonnollisilla fosfodiesterisidoksil-la. Tämä termi viittaa tehokkaasti luonnollisesti esiintyviin lajeihin tai synteettisiin lajeihin, jotka on muodos-5 tettu luonnollisesti esiintyvistä alayksiköistä tai niiden läheisistä homologeista. Termi "oligonukleotidi" voi myös viitata osiin, jotka toimivat luonnollisesti esiintyvien oligonukleotidien tavoin, mutta joissa on ei-luonnollisesti esiintyviä osia. Näin ollen oligonukleotideissa voi olla 10 muutettuja sokeriosia tai sokerien välisiä sidoksia. Esimerkit näistä sisältävät fosforotioaatit ja muut rikkiä sisältävät lajit, kuten fosforoditioaatit, joiden käyttö tunnetaan alalla. Joidenkin suositeltavien suoritustapojen mukaisesti ainakin yksi oligonukleotidin fosfodiesterisidok-15 sista on substituoitu rakenteella, joka toimii tehostaen koostumusten kykyä tunkeutua sellaisille solun alueille, joissa RNA tai DNA, jonka aktiivisuutta on tarkoitus moduloida, sijaitsee. On suositeltavaa, että sellaiset substituutiot sisältävät fosforotioaattisidokset, metyylifosfo-20 naattisidokset, lyhytketjuiset alkyyli- tai sykloalkyylira-kenteet tai heteroatomilla substituoidut lyhytketjuiset al-kyylirakenteet. Suositeltavimpia ovat ne, joissa on CH2-NH-Ί 0-CH2-, CH2-N(CH3) -0-CH2-, ch2-o-n(ch3) -ch2-, CH2-N(CH3)- '· N(CH3)-CH2- ja 0-N (CH3) - CH2 - CH2 - runko (joissa f osfodiesteri ·· ! 25 on 0-P-0-CH2) . Myöskin suositeltavia ovat oligonukleotidit, .joissa on morfoliinirunkorakenne. Summerton, J. E. ja · Weller, D. D., US-patentti nro 5 034 506. Muissa suositel tavissa suoritustavoissa, kuten proteiini-nukleiini-;l,‘; happorungon (PNA) tapauksessa, oligonukleotidin fosfodies- 30 terirunko voidaan korvata polyamidirungolla niin, että emäkset ovat suoraan tai epäsuorasti sidottuja polyamidi- • ( > rungon aza-typpi-atomeihin. P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, 0. Buchardt, Science 1991, 254, 1497. Muiden suosi- ; ; ; teltavien suoritustapojen mukaisesti fosfodiesterisidokset 35 on substituoitu muilla rakenteilla, jotka ovat samanaikai sesti oleellisesti ionittomia ja kiraalittomia tai raken- 11 112379 teillä, jotka ovat kiraalisia ja enantiomeerisesti spesifisiä. Alan asiantuntijat kykenevät valitsemaan käyttöön muita sidoksia keksinnön suoritusta varten.
Oligonukleotidit voivat myös sisältää lajit, jotka 5 sisältävät ainakin yhden modifioidun emäsmuodon. Näin ollen voidaan käyttää muitakin puriineja ja pyrimidiinejä kuin niitä, joita luonnosta normaalisti löydetään. Samalla tavalla voidaan tehdä modifikaatioita nukleotidialayksiköiden pentofuranosyyliosaan niin kauan, kun tämän keksinnön kes-10 keisistä periaatteista pidetään kiinni. Esimerkit sellaisista modifikaatioista ovat 2'-O-alkyyli- ja 2'-halogeenisubstituoidut nukleotidit. Jotkin spesifiset esimerkit modifikaatioista sokerioisien 2'-kohtaan, jotka ovat käyttökelpoisia esillä olevassa keksinnössä, ovat OH, SH, 15 SCH3/ F, 0CH3, OCN, 0(CH2)nNH2 tai 0(CH2)nCH3, jossa n on 1 -noin 10, ja muut substituentit, joilla on samanlaiset ominaisuudet. Sokerijäljittelijöitä, kuten syklobutyyleja tai muita hiilirenkaita, voidaan myös käyttää pentofuranosyyli-ryhmän tilalla. Kimeeriset oligonukleotidit, joissa on kak-20 si kemiallisesti erilaista aluetta tai useampi, ovat myös . käyttökelpoisia esillä olevassa keksinnössä. Spesifiset * · esimerkit sellaisista kimeerisistä oligonukleotideista ovat \ ‘ ne, jotka on modifioitu 2'-kohtaan lukuunottamatta yhden ’· '! tai useamman deoksinukleotidin "deoksi-aukko" kohtaa.
25 "Deoksi-aukko" kohta voi olla molekyylin keskellä tai si- jäitä jommassa kummassa päässä tai lähellä jompaa kumpaa :/· : päätä. Oligonukleotidit, joissa on alueita, joiden runkoke- mia on erilainen, ovat myös esimerkkejä kimeerisistä oligo-V, nukleotideista.
30 Sellaisten oligonukleotidien on parasta kuvata ole van toiminnallisesti samanlaisia luonnollisten oligonukle-*·'' otidien kanssa (tai luonnollisten linjojen mukaisesti syn- tetisoitujen oligonukleotidien) , mutta joissa on yksi tai useampi ero luonnolliseen rakenteeseen verrattuna. Kaikki .·. : 35 sellaiset oligonukleotidit kuuluvat tähän keksintöön niin * · kauan kuin ne toimivat tehokkaasti hybridisoituen PKC-RNA- 12 112379 molekyyliin. Tämän keksinnön mukaisesti valmistettavat oli-gonukleotidit sisältävät suositeltavasti noin 5 - noin 50 nukleotidiyksikköä. On suositeltavampaa, että oligonukle-otidit sisältävät noin 8 - 30 nukleotidiyksikköä ja vielä 5 suositeltavampaa, että niissä on noin 12 - 25 nukleotidiyksikköä. Kuten ymmärretään, nukleotidiyksikkö on emäs-sokeriyhdistelmä, joka on sopivasti sidottu viereiseen nuk-leotidiyksikköön fosfodiesteri- tai muulla sidoksella.
Tämän keksinnön mukaisesti oligonukleotidit voidaan 10 helposti ja rutiinisti valmistaa hyvin tunnetulla kiin-teäfaasisynteesimenetelmällä. Tarvikkeita sellaista synteesiä varten myyvät useat myyjät, kuten Applied Biosystems. Mitä tahansa muuta menetelmää sellaista synteesiä varten voidaan myös käyttää; oligonukleotidien todellinen synteesi 15 kuuluu alan rutiinit omaavan henkilön kykyihin. On myös hyvin tunnettua käyttää samanlaisia menetelmiä muiden oligonukleotidien, kuten fosforotioaattien ja alkyloitujen johdannaisten, valmistamiseksi.
Tämän keksinnön mukaisesti alan asiantuntijat ym- 20 märtävät, että lähetti-RNA ei sisällä ainoastaan proteiinia koodittavaa informaatiota käyttämällä kolmikirjaimista ge- ,/* neettistä koodia, vaan myös siihen liittyneet ribonukleoti- \ t dit, jotka muodostavat alueen, jonka sellaiset henkilöt • * '' '* tuntevat nimellä transloimaton 5'-alue, transloimaton 3'- ··! 25 alue, 5'-cap-alue ja introni/eksoni-rajakohdan ribonukle- .,!·* otidit. Näin ollen tämän keksinnön mukaisesti voidaan for- V ’ muloida oligonukleotidit, jotka on kohdennettu täydellisesti tai osittain näihin liittyneisiin ribonukleotideihin kuin myös informatiivisiin ribonukleotideihin. Suositelta- • ) 30 vissa suoritustavoissa oligonukleotidi hybridisoituu spesi-fisesti transkription aloituskohtaan, translaation aloitus- t * i kohtaan, 5 '-cap-alueelle, introni/eksoni-rajakohtaan, koo- i * dittaviin sekvensseihin tai sekvensseihin transloimattomil-la 5'- tai 3'-alueilla.
3 5 Tämän keksinnön mukaisesti valmistettavat oligonuk leotidit suunnitellaan niin, että ne hybridisoituvat PKC- 13 112379 geenistä peräisin olevaan lähetti-RNA-molekyyliin. Muodos-tuttuaan sellainen hybridisaatio häiritsee lähetti-RNA-molekyylin normaalia roolia aiheuttaen sen toiminnan modulaation solussa. Häirittävät lähetti-RNA-molekyylin toimin-5 nat sisältävät kaikki elintärkeät toiminnot, kuten RNA-molekyylin transkription DNA:sta, RNA-molekyylin kulkeutumisen proteiinin translaatiokohtaan, proteiinin todellisen translaation RNA-molekyylistä, RNA-molekyylin silmukoinnin yhden tai useamman mRNA-lajin tuottamiseksi ja ehkä jopa 10 riippumattoman katalyyttisen aktiivisuuden, johon RNA-molekyyli voi ottaa osaa. Sellaisen RNA-toiminnan häirinnän lopullinen vaikutus aiheuttaa PKC-geenin ekspression modu-loimisen.
Tämän keksinnön mukaisesti valmistettavia oligonuk-15 leotideja voidaan käyttää diagnostiikassa, terapeuttisina aineina, ennaltaehkäisysssä ja tutkimusreagensseina ja käyttöpakkauksina. Koska oligonukleotidit hybridisoituvat PKC-geeniin ja sen mRNA-molekyyliin, kerros- ja muita testejä voidaan helposti muodostaa tämän tosiasian hyväksi 20 käyttämiseksi. Lisäksi, koska oligonukleotidit hybridisoi- . tuvat spesifisesti tiettyjen PKC-isotsyymien mRNA-molekyy- • · '* lien kanssa, sellaisia testejä voidaan suunnitella solujen ja kudosten seulomiseksi tiettyjen PKC-isotsyymien suhteen.
'! Sellaisia testejä voidaan käyttää sellaisten tautien diag- . ,: 25 nosoimiseksi, jotka liittyvät eri PKC-muotoihin. Keinot, joilla tunnistetaan oligonukleotidin hybridisoituminen PKC- : geenin kanssa, voidaan toteuttaa rutiinisti. Sellaiset kei not voivat sisältää entsyymikonjugaation, radiaktiivisen leimauksen tai mitkä tahansa muut sopivat tunnistussystee- > » 30 mit. Käyttöpakkaukset PKC-proteiinin läsnäolon tai poissaolon tunnistamiseksi voidaan myös valmistaa.
Terapeuttista tai ennaltaehkäisevää hoitoa varten oligonukleotidit voidaan formuloida farmaseuttiseksi koos-tumukseksi, joka voi sisältää kantajia, paksunnosaineita, : 35 laimentimia, puskureita, säilöntäaineita, pinta-aktiivisia 1 1 » aineita ja niiden kaltaisia oligonukleitidin lisäksi. Far- 14 112379 maseuttiset koostumukset voivat myös sisältää yhden tai useamman aktiivisen ainesosan, kuten mikrobien vastaisia aineita, tulehduksen vastaisia aineita, puudutusaineita ja niiden kaltaisia oligonukleotidien lisäksi.
5 Farmaseuttinen koostumus voidaan antaa useilla eri tavoilla riippuen halutaanko saada aikaan paikallinen vai systeeminen hoito ja hoidettavasta alueesta. Anto voidaan suorittaa ulkoisesti (sisältäen silmään annon, emättimeen annon, peräsuoleen annon, nenään annon), suun kautta, si-10 säänhengityksen mukana tai parenteraalisesti esimerkiksi suonen sisäisellä tiputuksella tai injektiolla ihon läpi, vatsaonteloon tai lihakseen.
Formulaatiot ulkoiseen antoon voivat sisältää voiteet, nestemäiset ihovoiteet, ihovoiteet, geelit, tipat, 15 lääkepuikot, suihkeet, nesteet ja jauheet. Tavanomaiset farmaseuttiset kantajat, vesipohjaiset, jauhemaiset tai öl-jymäiset pohja-aineet, paksunnosaineet ja niiden kaltaiset voivat olla tarpeellisia tai toivottavia. Päällystetyt kondomit voivat myös olla käyttökelpoisia.
20 Koostumukset suun kautta antoa varten sisältävät . jauheet tai rakeet, suspensiot tai liuokset vedessä tai ei- ' vesipohjaisissa alustoissa, kapselit, pussit tai tabletit.
Paksunnosaineet, makuaineet, laimentimet, emulsioaineet, 4 ‘‘ dispersioapuaineet tai sitojat voivat olla toivottavia.
, ;* 25 Formulaatiot parenteraalista antoa varten voivat * sisältää steriilit vesipohjaiset liuokset, jotka voivat si- ; : sältää myös puskureita, laimentimia ja muita sopivia lisä aineita .
j*.'. Annostelu riippuu hoidettavan tautitilan vakavuu- 30 desta ja herkkyydestä, mutta se on normaalisti yksi tai useampi annos vuorokaudessa niin, että hoitojakso kestää '* useista vuorokausista useisiin kuukausiin tai kunnes tauti on parantunut tai on saatu aikaan tautitilan väheneminen. Alan asiantuntijat voivat helposti määrittää annosmäärät, , , ; 35 antotavat ja toistonopeudet.
* t 15 112379
Seuraavat esimerkit kuvaavat esillä olevaa keksintöä eikä niiden ole tarkoitettu rajoittavan sitä.
Esimerkit
Esimerkki 1 5 Oligonukleotidisynteesi
Modifioimattomat DNA-oligonukleotidit syntetisoidaan automaattisella DNA-syntetisaattorilla (Applied Bio-systems malli 380B) käyttäen standardia fosforoamidiittike-miaa hapettaen jodilla, β-syanoetyylidi-isopropyylifosforo-10 amidiitit hankitaan Applied Biosystems -tuottajalta (Foster City, CA). Fosforotioaattioligonukleotideja varten standardi hapetuspullo korvataan asetonitriilissä olevalla 0,2 M 3H-1,2-bentsoditiol-3-oni-1,1-dioksidiliuoksella fosfiitti-sidosten vaiheittaiseksi tioloimiseksi. Tiolaatiosyklin 15 odotusvaihe pidennetään 68 sekuntiin ja sitä seuraa pään suoj ausvaihe.
Sen jälkeen kun on katkaistu säädellystä huokos-lasipylväästä (Applied Biosystems) ja deblokeerattu konsentroidussa ammoniumhydroksidissa 55 °C:ssa 18 tunnin 20 ajan, oligonukleotidit puhdistetaan saostamalla kahdesti . 0,5 M NaCl:sta 2,5 tilavuudella etanolia. Suoritetaan ana- ‘ lyyttinen geelielektroforeesi 20 % akryyliamidi, 8 M urea, 45 mM Tris-boraatti -puskurissa, pH 7,0.
Esimerkki 2 25 Soluviljely ja käsittely forboliesterillä ja ΡΚΟα- . proteiinia vastaan kohdennetuilla oligonukleotideil- '-· la PKC-proteiinin eliniän on julkaistu vaihtelevan 6,7 tunnista yli 24 tuntiin. Young et ai., Biochem. J. 1987, .··*. 30 244, 775 - 779; Ballester et ai., J. Biol. Chem. 1985, 260, 15194 - 15199. Nämä pitkät eliniät tekevät PKC-a-proteiinin tasapainotilatasojen inhiboimisen hankalaksi lähestymista-vaksi vastinjuosteoligonukleotidej a seulottaessa johtuen pitkistä inkubaatioajoista, joita tarvittaisiin. Sen vuoksi .·. : 35 on käytetty hyväksi forboliesteriden kykyä reversiibelisti alentaa PKC-proteiinin solunsisäisiä tasoja. Solujen käsit- 16 112379 tely forboliestereillä aiheuttaa ensin kinaasiaktiivisuuden aktivoitumisen, jota seuraa PKC-proteiinin säätö alas. PKC-α-proteiinilla tämän alassäädön on osoitettu olevan suora seuraus kinaasin kohonneesta proteolyysinopeudesta ilman, 5 että synteesinopeudessa tapahtuu mitään ilmeistä muutosta.
Aluksi määritettiin, että ihmisen keuhkokarsinoo-masoluissa (A549) käsittely forboliesteri-12,13-dibutyraa-tilla (PDBu) käyttäen sen menetelmän modifikaatiota, jonka ovat kuvanneet Krug et ai., J. Biol. Chem. 1987, 262, 10 11852 - 11856, todella alensi solun PKC-a-proteiinin tasoja ilman, että se vaikutti PKC-a-mRNA-tasoihin, ja että tämä vaikutus oli reversiibeli. Perusta testille, jolla seulotaan oligonukleotidien PKC-a-kohdennuksen vahvuutta on se, että ensin alennetaan PKC-a-proteiinin tasoja käsitellen 15 kroonisesti PDBu-yhdisteellä, poistetaan PDBu-yhdiste pesemällä solut huolella (näin sallien solujen syntetisoida tuoretta PKC-a-proteiinia) ja inkuboimalla soluja sen oli-gonukleotidin kanssa, jonka on tarkoitettu inhiboivan uuden PKC-a-proteiinin uutta synteesiä.
20 A549-solut (hankittu kokoelmasta American Type Cul- . ture Collection, Bethesda, MD) kasvatettiin konfluenteiksi « * ··’ 6-kuoppaisilla maljoilla (Falcon Labware, Lincoln Park, NJ)
Dulbecco's modified Eagle's -alustassa (DME), joka sisälsi ’i 1 g glukoosia/litra ja 10 % naudan sikiön seerumia (FCS, 25 Irvine Scientific, Santa Ana, CA) .
»
Soluja käsiteltiin 500 nM konsentraatiolla PDBu-: yhdistettä (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO) 12 - 16 tuntia (yli yön) . Sitten solut pestiin kolme kertaa DME-alustassa jV. 37 °C:ssa ja lisättiin 1 ml DMA-yhdistettä, joka sisälsi .*··, 30 20 μΐ DOTMA-yhdistettä (Lipofectin-reagenssi, BRL, Bethes- da, MD). Fosforotioaattioligonukleotidit lisättiin konsent- l i i ‘•V raatioksi 1 μΜ ja soluja inkuboitiin neljä tuntia lisää 37 °C:SSa.
Solut pestiin kerran 3 ml:ssa DME-alustaa, joka si-.·. : 35 sälsi 0,1 mg BSA:ta/ml ja lisäksi lisättiin 2 ml DME- alustaa, joka sisälsi 0,1 mg BSA:ta/ml. Fosforotioaatti- 17 112379 oligonukleotidit (1 μΜ) lisättiin ja soluja inkuboitiin 37 °C:ssa 24 tuntia.
Solut pestiin kolme kertaa fosfaatilla puskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) ja solun proteiinit uutettiin 5 120 pl:ssa näytepuskuria (60 mM Tris, pH 6,8, 2 % SDS, 10 % glyseroli, 10 mM ditiotreitoli) ja keitettiin 5 minuuttia. PKC-a-proteiinin solunsisäiset tasot määritettiin immuno-blottauksella.
Tässä testissä testatut oligonukleotidit on esitetty 10 taulukossa 1. Sekvenssitiedot ovat cDNA-sekvenssistä, jonka ovat julkaisseet Finkenzeller et ai., Nucl. Acids Res. 1990, 18, 2183; oligonukleotidien alla annetut sekvenssi-numerot on ilmoitettu cDNA:n ensimmäisen sekvensoitavan jäännöksen suhteen, joka on 28 jäännöstä ylävirtaan ATG-15 aloituskodonista.
Taulukko 1
Ihmisen PKC-α-sekvenssiin kohdennetut oligonukleotidit (kaikki ovat fosforotioaatteja) 20 SEO ID Sekvenssi Kohde 1 CCC CAA CCA CCT CTT GCT CC Transloimaton 5'-alue : 19 1 . 2 GTT CTC GCT GGT GAG TTT CA Transloimaton 3'-alue 2063 2044 25 3 AAA ACG TCA GCC ATG GTC CC Transl. aloituskodoni \ 41 22 t ; t 4 GGA TTC ACT TCC ACT GCG GG Transloimaton 3'-alue 2109 2090 5 GAG ACC CTG AAC AGT TGA TC Transloimaton 3'-alue : 30 2211 2192 ‘ 6 CCC GGG AAA ACG TCA GCC AT Transl. aloituskodoni i 47 28 . 7 CTG CCT CAG CGC CCC TTT GC Sisäinen (Cl) domeeni 110 91 18 112379 8 AGT CGG TGC AGT GGC TGG AG Sisäinen (Cl) domeeni 193 174 9 GCA GAG GCT GGG GAC ATT GA Sisäinen (Cl) domeeni 480 461 5 10 GGG CTG GGG AGG TGT TTG TT Transloimaton 3'-alue 2080 2061 11 CAC TGC GGG GAG GGC TGG GG Transloimaton 3 *-alue 2098 2079 12 AGC CGT GGC CTT AAA ATT TT Transloimaton 3'-alue 10 2137 2118 13 ATT TTC AGG CCT CCA TAT GG Transloimaton 3'-alue 2168 2149 14 AAG AGA GAG ACC CTG AAC AG Transloimaton 3'-alue 2217 2198 15 15 GAT AAT GTT CTT GGT TGT AA Transloimaton 3'-alue 2235 2216 16 ATG GGG TGC ACA AAC TGG GG Sisäinen (C3) domeeni 2027 2008 17 GTC AGC CAT GGT CCC CCC CC Transl. aloituskodoni 20 36 17 18 CGC CGT GGA GTC GTT GCC CG Sisäinen (VI) domeeni ; 63 44 ·.. 19 TCA AAT GGA GGC TGC CCG GC Sisäinen (C3) domeeni ;· : 1643 1624 25 20 TGG AAT CAG ACA CAA GCC GT Transloimaton 3'-alue :, 2151 2132
Esimerkki 3 PKC-ekspression immunoblottaustesti : ‘ 30 Solu-uutokset ajettiin elektroforeesissa 10 % SDS- ' * PAGE-minigeeleissä. Erotetut proteiinit siirrettiin Immo- ‘bilon-P-membraanille (Millipore, Bedford, MA) elektrofo-reettisesti ja membraani blokeerattiin 60 minuutin ajan TBSrssä (Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl), joka sisälsi 5 % 35 rasvatonta maitoa. Sitten membraania inkuboitiin 16 tuntia 19 112379 4 °C:ssa PKC-a-proteiinia vastaan olevien monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa (UBI, Lake Placid, NY), jotka oli laimennettu konsentraatioksi 0,2 pg/ml TBSzää, joka sisälsi 0,2 % rasvatonta maitoa. Tämän jälkeen tehtiin kolme pesua 5 TBSzssä, jossa oli 0,2 % rasvatonta maitoa. Sitten membraa-nia inkuboitiin yksi tunti sekundaarisen 125I-leimatun vuohen anti-hiiri-vasta-aineen kanssa (ICN Radiochemicals, Irvine, CA). Sitten membraanit pestiin voimakkaasti TBSrssä, jossa oli 0,2 % rasvatonta maitoa. Rintamat teh-10 tiin silmin näkyviksi ja kvantitoitiin käyttäen Phosphori-mager-laitetta (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). PKC-a-proteiini näkyy yhtenä rintamana, jonka molekyylipaino on 80 kD.
Kukin oligonukleotidi testattiin kolme kertaa kolme-15 na rinnakkaisena ja kokeiden tulokset normalisoitiin sitä proteiiniprosenttia vastaan, joka oli läsnä soluissa, joita ei oltu käsitelty oligonukleotidilla (kuvio 1). Viisi tehokkainta oligonukleotidia kohdentuu AUG-aloituskodonin alueelle ja alueille, jotka sijaitsevat siitä hiukan ylä-20 ja alavirtaan (oligot 1, 3, 17, 7, 6). Seuraavaksi tehokkaimmat oligonukleotidit kohdentuvat RNA-molekyylin trans-loimattomaan 3'-alueeseen (oligot 2, 5, 14).
Esimerkki 4 \· PKC-proteiinin muut isotsyymit 25 Havaittiin, että tehokkaimmat sekvenssit ihmisen PKC-a-proteiinin vastinjuostekohdennusta varten ovat ne, jotka ympäröivät translaation aloituskodonia ja transloi-matonta 3'-aluetta. Uskotaan, että nämä sekvenssit olisivat myös tehokkaita kohteita oligonukleotideille, jotka on 30 suunnattu PKC-proteiinin muita isotsyymejä vastaan. Muut ihmisen PKC-proteiinin isotsyymit, joiden sekvenssitiedot ; ; ; on saatavissa, ovat PKC-β (tyypit I ja II), PKC-γ (osittai- . nen sekvenssi) jaPKC-fl. Vastinjuosteoligonukleotidit, jot ka todennäköisesti ovat tehokkaita PKC-inhibiittoreita, on 35 tunnistettu alla. Nämä oligonukleotidit syntetisoidaan ku- 20 112379 ten esimerkissä 1 ja ne voidaan seuloa kuten esimerkeissä 2 ja 3 käyttäen sopivia vasta-aineita, milloin niitä on saatavissa. Vaihtoehtoisesti voidaan muodostaa reportteri-geeni testi yhteisekspressoimalla lyhytaikaisesti PKC-prote-5 iinin haluttua isotsyymiä lusiferaasin kanssa TPA-herkän tehostajan tai muun sopivan promoottorin säätelyn alaisuudessa. Sitten PKC-ekspressio testataan mittaamalla lusife-raasiaktiivisuus käyttäen standardeja menetelmiä: lusife-raasi uutetaan soluista lyysaamalla Triton X-100 -deter-10 gentillä, kuten on kuvannut Greenberg, M. E., teoksessa Current Protocols in Molecular Biology. F.M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. A. Smith, J. G. Seidman ja K. Strahl, toim., John Wiley and Sons, NY (1987). Dynatech ML1000 -luminometriä käytetään mitattaessa 15 luminesenssihuippua sen jälkeen, kun lusiferiiniä (Sigma) lisätään konsentraatioksi 625 μΜ.
PKC-β, tyypit I ja II
Sekvenssitiedot ovat julkaisusta Kubo et ai., FEBS Lett. 1987, 223, 138 - 142; sekvenssit on numeroitu ensim-20 mäisestä cDNA:ssa sekvensoidusta 5'-puoleisesta emäksestä. PKC-B-proteiinin tyypit I ja II ovat tulosta yksittäisen : geenituotteen vaihtoehtoisesta mRNA-silmukoinnista. Tämä johtaa proteiineihin, joilla on identtiset aminopäät (mRNA- molekyylin 5'-pää); kuitenkin karboksipäissä sekvensseissä 25 on eroa (mRNA-molekyylin 3'-pää). Seuraavien oligonukleoti-dien, jotka on kohdennettu translaation aloituskodoniin, odotetaan moduloivan molempien PKC-B-proteiinin tyyppien I ja II ekspressiota: 21 112379
Taulukko 2 PKC-B-proteiinin tyyppeihin I ja II kohdennetut oligonuk-leotidit SEQ ID Sekvenssi Kohde 5 21 CAT CTT GCG CGC GGG GAG CC Transl. aloituskodoni 139 120 22 TGC GCG CGG GGA GCC GGA GC Transl. aloituskodoni 134 115 23 CGA GAG GTG CCG GCC CCG GG Transl. aloituskodoni 10 113 94 24 CTC TCC TCG CCC TCG CTC GG Transl. aloituskodoni 183 164
Seuraavat vastinjuosteoligonukleotidit on kohdennet-15 tu ainoastaan PKC-B-proteiinin tyypin I transloimattomalle 3'-alueelle:
Taulukko 3 PKC-B-proteiinin tyyppiin I kohdennetut oligonukleotidit 20 SEQ ID Sekvenssi Kohde 25 TGG AGT TTG CAT TCA CCT AC Transloimaton 3'-alue 2168 2149 26 AAA GGC CTC TAA GAC AAG CT Transloimaton 3'-alue ,1 2285 2266 * ·· 25 27 GCC AGC ATG TGC ACC GTG AA Transloimaton 3'-alue 2250 2231 28 ACA CCC CAG GCT CAA CGA TG Transloimaton 3' -alue 2186 2167 ,, , 29 CCG AAG CTT ACT CAC AAT TT Transloimaton 3'-alue 30 2569 2550 * i * li : Seuraavat vastinjuosteoligonukleotidit on kohdennet- tu ainoastaan PKC-B-proteiinin tyypin II transloimattomalle / 3'-alueelle: !·:·: 35 * 1 · % 22 1 12 3 7 9
Taulukko 4 PKC-B-proteiinin tyyppiin II kohdennetut oligonukleotidit SEQ ID Sekvenssi Kohde 30 ACT TAG CTC TTG ACT TCG GG Transloimaton 3'-alue 5 2160 2141 31 ATG CTG CGG AAA ΑΤΑ AAT TG Transloimaton 3’-alue 2420 2401 32 ATT TTA TTT TGA GCA TGT TC Transloimaton 31 -alue 2663 2644 10 33 TTT GGG GAT GAG GGT GAG CA Transloimaton 3' -alue 2843 2824 34 CCC ATT CCC ACA GGC CTG AG Transloimaton 3'-alue 3137 3118 15 PKC-γ:
Sekvenssitiedot ovat julkaisusta Coussens et ai., Science 1986, 233, 859 - 866; sekvenssit on numeroitu ensimmäisestä cDNA:ssa sekvensoidusta 5'-puoleisesta emäksestä. Täyspitkä sekvenssi ei ole saatavissa: avoimen lukuraa-20 min uloin 3'-pää ja transloimaton 3 *-alue puuttuvat. Näin ollen nämä alueet eivät tällä hetkellä ole saatavissa vastin juostekohteiksi.
Taulukko 5 25 PKC-γ-proteiiniin kohdennetut oligonukleotidit SEQ ID Sekvenssi Kohde 35 CGG AGC GCG CCA GGC AGG GA Transloimaton 5' -alue 51 32 36 CCT TTT CCC AGA CCA GCC AT Transl. aloituskodoni : V 30 215 196 37 GGC CCC AGA AAC GTA GCA GG Aloituskodonin 5'- 195 176 puolinen alue 38 GGA TCC TGC CTT TCT TGG GG Transloimaton 5'-alue 170 151 *·'·’ 35 39 CAG CCA TGG CCC CAG AAA CG Transl. aloituskodoni : 202 183 23 112379 PKC-fl:
Sekvenssitiedot PKC-fl-proteiinille ovat julkaisusta, jonka on julkaissut Bacher työtovereineen (Bacher et ai., Mol. Cell. Biol. 1991, 11, 126 - 133). He kutsuvat isotsyy-5 miään nimellä PKC-L; sekvenssi on kuitenkin lähes identtinen hiiren PKC-fl-proteiinin sekvenssin kanssa, näin ollen jälkimmäistä nimeä käytetään tässä johdonmukaisuuden vuoksi. Sekvenssit on numeroitu ensimmäisestä cDNArssa sekven-soidusta 5'-puoleisesta emäksestä.
10
Taulukko 6 PKC-fl-proteiiniin kohdennetut oligonukleotidit SEQ ID Sekvenssi Kohde 40 CGA CAT GCC GGC GCC GCT GC Transl. aloituskodoni 15 172 153 41 CAG ACG ACA TGC CGG CGC CG Transl. aloituskodoni 176 157 42 GCC TGC TTC GCA GCG GGA GA Transl. aloituskodoni 138 119 20 43 ACA GGT GCA GGA GTC GAG GC Transl. aloituskodoni 86 67 44 GTC CCG TCT CAG GCC AGC CC Transl. aloituskodoni 111 92 ; 45 CCT CAC CGA TGC GGA CCC TC Transl. aloituskodoni 25 221 202 46 ATT GAA CTT CAT GGT GCC AG Transl. aloituskodoni 193 174 47 TCT CAC TCC CCA TAA GGC TA Transloimaton 3’-alue ,, , 2046 2027 30 48 TTC CTT TGG GTT CTC GTG CC Transloimaton 3'-alue 2067 2048 ... 49 TTC CAT CCT TCG ACA GAG TT Transloimaton 3'-alue 2353 2336 , ’, 50 AGG CTG ATG CTG GGA AGG TC Transloimaton 3'-alue 35 2300 2281 51 GTT CTA AGG CTG ATG CTG GG Transloimaton 3'-alue 2306 2287 24 112379
Esimerkki 5 PKC-proteiinin inhibitio oligonukleotideilla on annoksesta riippuvainen
Neljä kuviossa 1 kuvattua oligonukleotidia, jotka 5 olivat aktiivisia PKC-a-proteiinia vastaan, karakterisoitiin edelleen. Annosresponssitutkimukset oligonukleotideilla ISIS 3520 (SEQ ID nro 1), 3521 (SEQ ID nro 2), 3522 (SEQ ID nro 3) ja 3527 (SEQ ID nro 5) käyttäen esimerkissä 3 kuvattua immunoblottaustestiä osoittivat, että kaikilla oli 10 annoksesta riippuvainen aktiivisuus PKC-a-proteiinin eks-pressioon. Oligonukleotidien ISIS 3521, 3522 ja 3527 IC50-arvot olivat 100 - 200 nM ja kaikki inhiboivat maksimaali-sesti PKC-ekspressiota konsentraationa 500 nM. Tämä on kuvattu kuviossa 2. Oligonukleotidilla ISIS 4985 (SEQ ID nro 15 52), joka on sekoitetun sekvenssin sisältävä verrokkioli- gonukleotidi, jolla on sama emäskoostumus kuin oligonukleotidilla ISIS 3527, ei ollut vaikutusta.
Esimerkki 6 2·-O-metyylifosforotioaattioligonukleotidien syn-20 teesi 2'-O-metyylifosforotioaattioligonukleotidit synte-: tisoitiin käyttäen 2'-O-metyyli-B-syanoetyylidi-isopropyy- lifosforoamidiitteja (Chemgenes, Needham, MA) ja standar- disykliä modifioimattomille oligonukleotideille paitsi, . 25 että odotusvaihe tetratsolin ja emäksen pulssilisäyksen jälkeen pidennettiin 360 sekuntiin. Synteesin aloituksen _ ; _ 3'-emäs oli 2'-deoksiribonukleotidi.
Esimerkki 7 ,,, Oligonukleotidin ISIS 3522 2'-O-metyloidun muodon 30 vaikutus PKC-a-proteiinin synteesiin
Tasaisesti 2 '-O-metyylillä modifioitu fosforotioaat-:Y; tioligonukleotidi ISIS 4649, jolla on sama sekvenssi kuin fosforotioaattioligonukleotidilla ISIS 3522 (SEQ ID nro 3), kykeni inhiboimaan PKC-proteiinin synteesiä (joka osoitet-35 tiin esimerkissä 3 kuvatulla immunoblottauksella) niin, 25 112379 että sen IC50-arvo oli pienempi kuin 300 nM. Tämä on osoitettu kuviossa 3.
Esimerkki 8
Oligonukleotidien vaikutus PKC-a-mRNA-ekspressioon 5 Oligonukleotidien vaikutusten määrittämiseksi PKC-a- mRNA-tasoihin, A549-soluja käsiteltiin oligonukleotideilla osoitetuissa konsentraatioissa neljä tuntia niin, että läsnä oli kationisia liposomeja. Solun kokonais-RNA eristettiin soluista lyysaamalla ne 4 M guanidiniumisotiosyanaa-10 tissa, jota seurasi kesiumkloridigradientti. Kokonais-RNA (15 - 30 pg) erotettiin 1,2 % agaroosigeeleissä, jotka sisälsivät 1,1 % formaldehydiä, ja ne siirrettiin nailonmemb-raaneille. Sitten mebraanit hybridisoitiin naudan PKC-a-cDNArlla, joka saatiin ATCC-kokoelmasta (Bethesda, MD). 15 cDNA leimattiin radioaktiiviseksi 32P:lla käyttäen [a-32P]dCTP:tä satunnaisoligoleimauksella käyttäen kaupallisesti saatavaa käyttöpakkausta (Promega) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Suodattimet hybridisoitiin 60 minuutin ajan Quikhyb-liuoksessa (Stratagene, San Diego, CA) 68 °C:ssa. 20 Tämän jälkeen seurasi kaksi pesua alhaisen tiukkuuden sisältävissä olosuhteissa (2 x SSC/0,1 % SDS) huoneenlämpö-: : tilassa ja kaksi pesua korkean tiukkuuden sisältävissä olo- suhteissa (0,1 x SSC/0,1 % SDS) 60 °C:ssa. Hybridisoituneet \\ rintamat tehtiin silmin näkyviksi ja ne kvantitoitiin käyt- 25 täen Phosphorimager-laitetta. Sitten blotatuista suodatti-mistä poistettiin radioaktiivisuus keittämällä ja ne hybri-disoitiin uudelleen 32P-leimatulla glyseroli-3-fosfaattide-’ hydrogenaasikoettimella (G3PDH)(Clontech) sen varmistami seksi, että RNA:ta oli ladattu samat määrät.
» · · ' • · » ·’ 30 A549-solujen kokonais-RNA:n Northern-analyysi, jossa ·...’ käytettiin spesifistä PKC-a-cDNA-koetinta, paljasti kaksi pääasiallista hybridisoituvaa transkriptia, jotka olivat .···. kooltaan noin 8,5 kb ja 4,0 kb. Näitä ekspressoidaan tyy pillisesti suhteessa 2:1 niin, että suurempi transkripti on *··' 35 vallitseva. Kun A549-soluja käsiteltiin vastinjuosteoligo- 26 112379 nukleotidien konsentraatiolla 500 nM neljä tuntia DOTMA-yhdisteen läsnä ollessa ja sitten inkuboitiin 20 tuntia lisää, molempien transkriptien tasot alenivat. Tämä on osoitettu kuviossa 4. Suurin aleneminen havaittiin oligo-5 nukleotideilla ISIS 3521 (SEQ ID nro 2) ja 3527 (SEQ ID nro 5), jotka molemmat voivat hybridisoitua spesifisesti trans-loimattomiin 3'-sekvensseihin. Nämä alensivat PKC-a-mRNA-määriä 90 - 95 %. Oligonukleotidi ISIS 3522 (SEQ ID nro 3), joka on kohdennettu translaation aloituskodoniin, alensi 10 PKC-a-mRNA-tasoja 80 %, ja oligonukleotidi ISIS 3520 (SEQ ID nro 1) alensi PKC-mRNA-tasoja 40 %. Kaikkien oligonuk-leotidien IC50-arvot olivat noin 200 nM PKC-mRNA:n alentamiselle. Sekoitetun sekvenssin sisältävällä verrokkioligonuk-leotidilla ei ollut mitään vaikutusta tässä konsentraatios-15 sa.
Vastinjuosteoligonukleotidien aiheuttaman PKC-mRNA-tasojen alenemisen kinetiikat olivat samanlaiset kullakin testatulla neljällä oligonukleotidilla. Neljän tunnin sisällä oligonukleotidin lisäyksestä tapahtui 60 -70 % maksi-20 maalisesta PKC-mRNA:n alentumisesta ja maksimaalinen alentuminen tapahtui 12 - 24 tuntia oligonukleotidin lisäykses-: : : tä.
Esimerkki 9 ;'· PKC-a-proteiinin spesifinen inhibitio vastinjuoste- , . 25 oligonukleotideilla A549-solujen osoitettiin ekspressoivan normaalisti PKC-6-, -6- ja -C-proteiineja PKC-a-proteiinin lisäksi.
' PKC-a-isotsyymin spesifinen inhibitio tätä isotsyymiä vas taan kohdennetuilla vastinjuosteoligonukleotideilla osoi-: ·“ 30 tettiin näissä soluissa immunoblottauksella sen jälkeen,
* kun niitä oli käsitelty oligonukleotideilla ISIS 3521 (SEQ
ID nro 2), ISIS 3522 (SEQ ID nro 3) tai niiden sekoitetun ···. sekvenssin sisältävillä verrokkioligonukleotideilla ISIS
4559 (SEQ ID nro 53) ja 4608 (SEQ ID nro 54). A549-soluja 35 käsiteltiin neljä tuntia oligonukleotidilla (joko konsent- 27 112379 raatiolla 400 nM tai 300 nM) ja DOTMA-yhdisteellä, ne pestiin ja niiden annettiin palautua 48 tuntia. Sitten soluja käsiteltiin jälleen oligonukleotidilla (250 nM) ja DOTMA-yhdisteellä, ne pestiin ja niiden annettiin palautua 20 5 tuntia lisää. Solu-uutokset ajettiin elektroforeesissa, siirrettiin membraanille ja ne blokeerattiin, kuten on kuvattu esimerkissä 3. Sitten membraania käsiteltiin yli yön jonkin seuraavan vasta-aineen läsnä ollessa, jotka oli laimennettu TBS:ssä olevaan 0,5 % rasvattomaan maitoon: mono-10 klonaalinen anti-PKC-α-, -S tai -γ-vasta-aine (Upstate
Biochemicals, Inc.), 1 pg/ml; polyklonaalinen anti-PKC-6-tai -C-vasta-aine (Gibco BRL), laimennus 1:2 000; anti-PKC- 6-vasta-aine (Huwiler et ai., Biochem. J. 1991, 279, 441 -445), laimennus 1:4 000 tai anti-PKC-fl-vasta-aine, laimen-15 nus 1:4 000. Vasta-aineinkubaation jälkeen seurasi kolme pesua TBS:ssä, joka sisälsi 0,1 % rasvatonta maitoa, ja sitten membraania inkuboitiin yksi tunti niin, että läsnä oli 5 pCi 125I-vuohen anti-kani tai anti-hiiri -vasta-ainetta (ICN Radiochemicals, Irvine, CA). Membraanit pestiin 20 voimakkaasti ja leimatut proteiinit tehtiin silmin näkyviksi ja ne kvantitoitiin Phosphorimager-laitteella (Molecular : Dynamics, CA).
Oligonukleotidikäsittelyn jälkeen ekspressoituneiden ·,· PKC-isotsyymien analyysi paljasti, että PKC-δ-, -6- ja ,25 -C-proteiinien tasot eivät muuttuneet käsiteltäessä vastin- juosteoligonukleotideilla tai niiden sekoitetun sekvenssin ♦ ’.’il sisältävillä verrokeilla. Vastinjuosteoligonukleotidit alensivat PKC-a-proteiinin ekspressiota 70 - 80 %, kun taas sekoitetun sekvenssin sisältävillä verrokeilla ei ollut * ·* 30 mitään vaikutusta.
* t
Esimerkki 10 :Y: Oligonukleotidien vaikutus A549-solujen 1 isään tyrni- . seen » » A549-solut maljattiin 6-kuoppaisille maljoille kon- ' 35 sentraationa 4 000 solua/kuoppa. 24 tunnin kuluttua solut
> I
112379 28 pestiin kolme kertaa DMEM-alustalla ja sitten lisättiin oligonukleotidit tarvittavaksi konsentraatioksi neljäksi tunniksi niin, että läsnä oli 20 pg DOTMA-yhdistettä/ml. Sitten solut pestiin kerran DMEM-alustalla, jossa oli 5 % 5 FCS:ia, ja niiden annettiin kasvaa DMEM-alustassa, jossa oli 5 % FCS:ia, 72 tuntia lisää. Tässä vaiheessa solut pestiin kahdesti PBS:llä, ne poistettiin maljoilta trypsiinil-lä ja laskettiin hemosytometrissä.
A549-solujen lisääntymisen inhibitio oligonukleoti-10 deilla ISIS 3521 ja 3527 havaittiin, kun yksittäinen oligo-nukleotidiannos oli 250 - 500 nM. Tämä on esitetty kuviossa 5.
Esimerkki 11 PKC-a-proteiinin inhibitio kimeerisillä vastinjuos-15 teoligonukleotideilla
Kimeeriset fosforotioaattioligonukleotidit, joissa oli 4-8 deoksinukleotidin "deoksi-aukko" muutoin 2'-0-metyylioligonukleotidissa, testattiin niiden kyvyn suhteen alentaa PKC-a-mRNA-tasoja, kuten on kuvattu esimerkissä 8. 20 Kimeeriset oligonukleotidit olivat idennttisiä sekvenssiltään oligonukleotideille ISIS 3521 (SEQ ID nro 2), ISIS 3522 (SEQ ID nro 3) ja ISIS 3527 (SEQ ID nro 5). Kimeeriset oligonukleotidit on esitetty taulukossa 7: t » * * • « » « • » 29 112379
Taulukko 7 PKCA-aukko-oligonukleotidit Paksunnos osoittaa 2'-O-metyylinukleotidit Kaikki oligonukleotidit ovat fosforotioaatteja 5
Oligo Sekvenssi Kuvaus SEQ ID nro 3521 GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA Täysin P=S 2 5357 GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA Täysin P=S 8-deoksi-aukko 2 5361 GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA Täysin P=S 6-deoksi-aukko 2 10 5360 GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA Täysin P=S 4-deoksi-aukko 2 3522 AAAACGTCAGCCATGGTCCC Täysin P=S 3 5352 AAAACGTCAGCCATGGTCCC Täysin P=S 8-deoksi-aukko 3 5350 AAAACGTCAGCCATGGTCCC Täysin P=S 6-deoksi-aukko 3 5351 AAAACGTCAGCCATGGTCCC Täysin P=S 4-deoksi-aukko 3 15 3527 GAGACCCTGAACAGTTGATC Täysin P=S 5 5240 GAGACCCTGAACAGTTGATC Täysin P=S 8-deoksi-aukko 5 5208 GAGACCCTGAACAGTTGATC Täysin P=S 6-deoksi-aukko 5 5038 GAGACCCTGAACAGTTGATC Täysin P=S 4-deoksi-aukko 5 20 8-deoksi-aukon sisältävät oligonukleotidit kykenivät alentamaan PKC-a-mRNA-tasoja ainakin 85 %. 8-deoksi-aukon sisältävien oligonukleotidien aktiivisuus verrattuna aukottomiin oligonukleotideihin, joilla on sama sekvenssi, on esitetty kuvioissa 6A, 6B ja 6C. Kaksi 6-deoksi-aukon si- 25 sältävistä oligonukleotideista (ISIS 5361, SEQ ID nro 2 ja ISIS 5350, SEQ ID nro 3) kykeni alentamaan PKC-a-mRNA-taso-• ja enemmän kuin 50 %, ja yksi 4-deoksi-aukon sisältävistä oligonukleotideista (ISIS 3522, SEQ ID nro 3) kykeni inhiboimaan PKC-a-mRNA-tasoja noin 85 %. Aktiivisuus verrattuna
* ·' 30 deoksi-aukon pituuteen oligoilla, joiden nimet ovat SEQ ID
* > *...' nro 2, SEQ ID nro 3 ja SEQ ID nro 5, on esitetty kuviossa :Y: 7.
4 * » 1 1 t 30 112 3 7 9
Esimerkki 12
Ihmisen kasvainsolujen oligonukleotidikäsittely paljaissa hiirissä
Ihmisen A549-keuhkokarsinoomasolut kerättiin ja 5 x 5 106 solua injektoitiin ihon alaisesti paljaan hiiren taka- raajan sisäpuolelle. Tunnustelemalla havaittavat kasvaimet kehittyivät noin yhden kuukauden sisällä. Hiirille annetaan vastinjuosteoligonukleotideja ISIS 3521 ja 3527 vatsaonteloon kahtena annoksena, 1 ja 10 mg/kg kehon painoa, joka 10 toinen päivä kuuden viikon ajan. Hiiriä tarkkaillaan kasvaimen kasvun suhteen ja kuuden viikon kuluttua kasvaimet poistetaan ja PKC-a-proteiinin ekspressio määritetään Northern-blot- ja immunoblottausanalyyseillä.
t » * * « * · • s t 31 (1) GENERAL INFORMATION: 11237°
Sekvenssilista (i) APPLICANT: Nicholas Dean, C. Frank Bennett (ii) TITLE OF INVENTION: Oligonucleotide Modulation of
Protein Kinase C
(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 54 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS: (A) ADDRESSEE: Woodcock Washburn Kurtz
Mackiewicz & Norris (B) STREET: One Liberty Place - 46th Floor (C) CITY: Philadelphia
(D) STATE: PA
(E) COUNTRY: USA
(F) ZIP: 19103 (V) COMPUTER READABLE FORM:
(A) MEDIUM TYPE: DISKETTE, 3.5 INCH, 1.44 Mb STORAGE
(B) COMPUTER: IBM PS/2
(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS
• * (D) SOFTWARE: WORDPERFECT 5.0 .' · (vi) CURRENT APPLICATION DATA: I (A) APPLICATION NUMBER: n/a 3 ( > (B) FILING DATE: herewith (C) CLASSIFICATION: :*·]: (vii) PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: 852,852 :,V (B) FILING DATE: March 16, 1992 ‘;· (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION: (A) NAME: Jane Massey Licata » * ·
* * I
(B) REGISTRATION NUMBER: 32,257 32 112379 (C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: ISIS-0872 (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION: (A) TELEPHONE: (215) 568-3100 (B) TELEFAX: (215) 568-3439 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: yes (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1: CCCCAACCAC CTCTTGCTCC 2 0 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid ..: (C) STRANDEDNESS: single :· (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: yes V ’* (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2: GTTCTCGCTG GTGAGTTTCA 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid \ (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 33 112379 (iv) ANTI-SENSE: yes (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 3: AAAACGTCAG CCATGGTCCC 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 4: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: yes (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4: GGATTCACTT CCACTGCGGG 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 5: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single t · V·: (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: yes > > · ·;;; (xi) . SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 5: GAGACCCTGA ACAGTTGATC 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 6: .···. (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ,V, (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single : (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: yes 34 112379 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 6: CCCGGGAAAA CGTCAGCCAT 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 7: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: yes (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 7: CTGCCTCAGC GCCCCTTTGC 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 8: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single I I » (D) TOPOLOGY: linear .·, : (iv) ANTI-SENSE: yes • I » ··· (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 8: AGTCGGTGCA GTGGCTGGAG 20 « * # V : (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 9: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: :,,’ (A) LENGTH: 2 0 « » (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single V (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: yes (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 9: 35 1 12379 GCAGAGGCTG GGGACATTGA 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 10: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: yes (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 10: GGGCTGGGGA GGTGTTTGTT 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 11: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear v, 5 (iv) ANTI-SENSE: yes (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 11: I » CACTGCGGGG AGGGCTGGGG 2 0 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 12: *** ' (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ,, , (A) LENGTH: 2 0 (B) TYPE: nucleic acid I * (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear i » (iv) ANTI-SENSE: yes (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 12: AGCCGTGGCC TTAAAATTTT 20 36 112 3 7 9 .
(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 13: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: yes (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 13: ATTTTCAGGC 'CTCCATATGG 2 0 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 14: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear ., (iv) ANTI-SENSE: yes ; _ (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 14: ; ! AAGAGAGAGA CCCTGAACAG 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 15: .. (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: V ' (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: yes • s (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 15: ; GATAATGTTC TTGGTTGTAA 20 37 112379 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 16: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: yes (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 16: ATGGGGTGCA CAAACTGGGG 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 17: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear : (iv) ANTI-SENSE: yes (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 17: t t ; GTCAGCCATG GTCCCCCCCC 2 0 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 18: ;;; (i) sequence characteristics: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single .v, (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: yes (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 18: CGCCGTGGAG TCGTTGCCCG 2 0 38 112 3 7 9 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 19: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: yes (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 19: TCAAATGGAG GCTGCCCGGC 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 20: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: yes :·. t (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 20: ! TGGAATCAGA CACAAGCCGT 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 21: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: '·' (A) LENGTH: 20 ,, , (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear ·.·_ (iv) ANTI-SENSE: yes (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 21: \ CATCTTGCGC GCGGGGAGCC 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 22: 39 112379 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: yes (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 22: TGCGCGCGGG GAGCCGGAGC 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 23: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear , (iv) ANTI-SENSE: yes :· t (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 23: ;’· CGAGAGGTGC CGGCCCCGGG 2 0 * (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 24: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: **' (A) LENGTH: 2 0 ,. , (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: yes (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 24: CTCTCCTCGC CCTCCGTCGG 20 40 112 3 7 9 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 25: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: yes (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 25: TGGAGTTTGC ATTCACCTAC 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 26: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: yes ’ (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 26: . AAAGGCCTCT AAGACAAGCT 2 0 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 27: · (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) length: 20 (B) TYPE: nucleic acid : (C) STRANDEDNESS: single ( t (D) TOPOLOGY: linear v>‘ (iv) ANTI-SENSE: yes (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 27: '·’·* GCCAGCATGT GCACCGTGAA 2 0 4i 112379 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 28: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: yes (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 28: ACACCCCAGG CTCAACGATG 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 29: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic' acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear : (iv) ANTI-SENSE: yes (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 29: \'*! CCGAAGCTTA CTCACAATTT 2 0 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 30: ;;; (i) sequence characteristics: » * · (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single ,V. (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: yes (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 30: ACTTAGCTCT TGACTTCGGG 2 0 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 31: 42 1Ί2379 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: yes (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 31: ATGCTGCGGA AAATAAATTG 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 32: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear ,·, (iv) ANTI-SENSE: yes (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 32: ATTTTATTTT GAGCATGTTC 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 33: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 ,, , (B) TYPE: nucleic acid • * (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: yes t 1 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 33: ' TTTGGGGATG AGGGTGAGCA 20 43 112 3 7 9 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 34: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: yes (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 34: CCCATTCCCA CAGGCCTGAG 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 35: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: yes : (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 35: ’· : CGGAGCGCGC CAGGCAGGGA 2 0 ; (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 36: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: t (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single •V: (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: yes (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 36: , CCTTTTCCCA GACCAGCCAT 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 37: 44 112379 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: yes (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 37: GGCCCCAGAA ACGTAGCAGG 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 38: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear .·. (iv) ANTI-SENSE: yes (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 38: ’ : GGATCCTGCC TTTCTTGGGG 2 0 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 39: • * # . .: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 ,. . (B) TYPE: nucleic acid ,··, (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: yes (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 39: ; CAGCCATGGC CCCAGAAACG 20 45 1 12379 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 40: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: yes (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 40: CGACATGCCG GCGCCGCTGC 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 41: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear Y,: (iv) ANTI-SENSE: yes • ’* (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 41: CAGACGACAT GCCGGCGCCG 2 0 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 42: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: i (A) LENGTH: 20 j · : (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single Y; (D) TOPOLOGY: linear :,Y (iv) ANTI-SENSE: yes (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 42: , GCCTGCTTCG CAGCGGGAGA 20 46 112 3 7 9 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 43: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: yes (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 43: ACAGGTGCAG GAGTCGAGGC 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 44: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear , ·. (iv) ANTI-SENSE: yes (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 44: ! GTCCCGTCTC AGGCCAGCCC 20 .,(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 45: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 ,, . (B) TYPE: nucleic acid » * » !··-, (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear
( I I
.··, (iv) ANTI-SENSE: yes (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 45: » * * ; CCTCACCGAT GCGGACCCTC 2 0 t t (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 46: 47 1 12 3 7 9 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: yes (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 46: ATTGAACTTC ATGGTGCCAG 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 47: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear :.v (iv) ANTI-SENSE: yes : (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 47: TCTCACTCCC CATAAGGCTA 2 0 '"I (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 48: ’Y, (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 I’’ , (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single :Y; (D) TOPOLOGY: linear ί,,,ί (iv) ANTI-SENSE: yes :Y; (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 48: TTCCTTTGGG TTCTCGTGCC 2 0 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 49: 48 112379 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: yes (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 49: TTCCATCCTT CGACAGAGTT 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 50: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: yes (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 50: ,: AGGCTGATGC TGGGAAGGTC 20 ;· (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 51: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: V * (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single '·' (D) TOPOLOGY: linear I,! (iv) ANTI-SENSE: yes '·' (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 51: ; GTTCTAAGGC TGATGCTGGG 20 49 1 12379 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 52: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: no (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 52 TAACATACAT CATGGGGCCG 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 53 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: no (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 53: GGTTTTACCA TCGGTTCTGG 20 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 54: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 (B) TYPE: nucleic acid -(C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (iv) ANTI-SENSE: no , V. (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 54: GTTACACAGG GACTCAACCC 20 i t

Claims (7)

112379
1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen oligo-nukleotidin valmistamiseksi, joka käsittää 5-50 nukleo-tidiyksikköä, jotka hybridisoituvat spesifisesti ihmisen 5 proteiinikinaasi C:tä koodaavaan mRNA-molekyyliin, jolloin mainittu oligonukleotidi käsittää nukleotidisekvenssin, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu sekvensseistä tunnusnumerot nro 1, 2, 3 ja 5, tunnettu siitä, että se syntetisoidaan käyttämällä kiinteäfaasimenetelmää.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että vähintään yksi oligonukleotidin nuk-leotidiyksiköiden välillä olevista sokerien välisistä sidoksista on fosforotioaatti.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun- 15 nettu siitä, että vähintään yksi nukleotideistä käsit tää modifikaation sokerin 2'-asemassa.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että modifikaatio on 2'-O-alkyyli- tai 2'-fluorimodifikaatio.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tun- ^ nettu siitä, että modifikaatio on 2'-O-metyyli- tai 2'- O-propyylimodif ikaatio.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun- '· nettu siitä, että mainittu oligonukleotidi käsittää 4 - 25 8:n deoksinukleotidin deoksi-aukko-alueen.
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun- >/· · nettu siitä, että mainittu oligonukleotidi käsittää nukleotidisekvenssin, joka on sekvenssi tunnusnumero 2. i « · • » 1 t I 51 112379
FI944276A 1992-03-16 1994-09-15 Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten oligonukleotidien valmistamiseksi FI112379B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US85285292A 1992-03-16 1992-03-16
US85285292 1992-03-16
PCT/US1993/002213 WO1993019203A1 (en) 1992-03-16 1993-02-25 Oligonucleotide modulation of protein kinase c
US9302213 1993-02-25

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI944276A0 FI944276A0 (fi) 1994-09-15
FI944276A FI944276A (fi) 1994-09-15
FI112379B true FI112379B (fi) 2003-11-28

Family

ID=25314390

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI944276A FI112379B (fi) 1992-03-16 1994-09-15 Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten oligonukleotidien valmistamiseksi
FI20030248A FI113059B (fi) 1992-03-16 2003-02-18 Proteiinikinaasi C:tä koodaavaan mRNA:han hybridisoituvia oligonukleotideja

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20030248A FI113059B (fi) 1992-03-16 2003-02-18 Proteiinikinaasi C:tä koodaavaan mRNA:han hybridisoituvia oligonukleotideja

Country Status (14)

Country Link
US (1) US5703054A (fi)
EP (3) EP0672180B1 (fi)
JP (1) JP2635216B2 (fi)
KR (1) KR0157487B1 (fi)
AT (1) ATE212063T1 (fi)
AU (1) AU675638B2 (fi)
CA (1) CA2132094A1 (fi)
DE (1) DE69331467T2 (fi)
DK (1) DK0672180T3 (fi)
ES (1) ES2170065T3 (fi)
FI (2) FI112379B (fi)
HU (1) HU217179B (fi)
NO (1) NO943438L (fi)
WO (1) WO1993019203A1 (fi)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5789573A (en) * 1990-08-14 1998-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of ICAM-1, E-selectin, and CMV IE1/IE2
US7015315B1 (en) * 1991-12-24 2006-03-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligonucleotides
US6117847A (en) * 1992-03-16 2000-09-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides for enhanced modulation of protein kinase C expression
US6153599A (en) * 1992-03-16 2000-11-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methoxyethoxy oligonucleotides for modulation of protein kinase C expression
US5922686A (en) * 1992-03-16 1999-07-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide modulation of protein kinase C
US6537973B1 (en) * 1992-03-16 2003-03-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide inhibition of protein kinase C
AU713740B2 (en) * 1992-03-16 1999-12-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide modulation of protein kinase C
US5681747A (en) * 1992-03-16 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid sequences encoding protein kinase C and antisense inhibition of expression thereof
NO180167C (no) * 1994-09-08 1997-02-26 Photocure As Fotokjemisk fremgangsmåte til å innföre molekyler i cellers cytosol
US6645943B1 (en) 1994-10-25 2003-11-11 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US5744460A (en) * 1996-03-07 1998-04-28 Novartis Corporation Combination for treatment of proliferative diseases
WO1998007415A2 (en) * 1996-08-20 1998-02-26 Novartis Ag Methods for prevention of cellular proliferation and restenosis
GB9618376D0 (en) * 1996-09-04 1996-10-16 Ciba Geigy Ag Pharmaceutical compositions
US5989912A (en) 1996-11-21 1999-11-23 Oligos Etc. Inc. Three component chimeric antisense oligonucleotides
US5849902A (en) * 1996-09-26 1998-12-15 Oligos Etc. Inc. Three component chimeric antisense oligonucleotides
WO1999060010A1 (en) * 1998-05-21 1999-11-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the pulmonary delivery of nucleic acids
EP1080225A4 (en) * 1998-05-21 2004-02-04 Isis Pharmaceuticals Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE PULMONAL ADMINISTRATION OF NUCLEIC ACIDS
US6077709A (en) 1998-09-29 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of Survivin expression
US6492111B1 (en) 1998-11-25 2002-12-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. In situ binary synthesis of biologically effective molecules
DE19956568A1 (de) * 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
EP1198592A4 (en) * 1999-07-06 2002-09-18 Isis Pharmaceuticals Inc OLIGONUCLEOTIDES COMPRISING BOTH 2-AMINOADENINE AND 5-SUBSTITUTED PYRIMIDINES
US6190869B1 (en) * 1999-10-26 2001-02-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of protein kinase C-theta expression
US6852529B1 (en) * 1999-11-08 2005-02-08 University Of South Florida Gloucose-regulated mRNA instability element
US8008071B2 (en) * 1999-11-08 2011-08-30 University Of South Florida Compositions and methods for detecting intracellular glucose and analogs thereof
US7105962B2 (en) * 2000-08-03 2006-09-12 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Brushless motor for partable electronic equipment with wire treatment technique of coils
US20050182006A1 (en) * 2001-05-18 2005-08-18 Sirna Therapeutics, Inc RNA interference mediated inhibition of protein kinase C alpha (PKC-alpha) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20030054381A1 (en) * 2001-05-25 2003-03-20 Pfizer Inc. Genetic polymorphisms in the human neurokinin 1 receptor gene and their uses in diagnosis and treatment of diseases
US20040014049A1 (en) * 2002-07-19 2004-01-22 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of protein kinase C-iota expression
FR2864539B1 (fr) * 2003-12-30 2012-10-26 Lvmh Rech Oligonucleotide et son utilisation pour moduler l'expression de la proteine-kinase c isoforme beta-1 comme agent de depigmentation cutanee
WO2024028476A1 (en) * 2022-08-05 2024-02-08 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the treatment of th2-mediated diseases

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4511713A (en) * 1980-11-12 1985-04-16 The Johns Hopkins University Process for selectively controlling unwanted expression or function of foreign nucleic acids in animal or mammalian cells
US5034506A (en) * 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
AU7851387A (en) * 1986-08-13 1988-03-08 Genetics Institute Inc. Protein kinase c enzymes
US5098890A (en) * 1988-11-07 1992-03-24 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Antisence oligonucleotides to c-myb proto-oncogene and uses thereof
US5138045A (en) * 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
WO1994015621A1 (en) * 1993-01-13 1994-07-21 Arsinur Burcoglu Method for using polynucleotides, oligonucleotides and derivatives thereof to treat various disease states
AU673897B2 (en) * 1993-02-06 1996-11-28 Garvan Institute Of Medical Research Protein kinase C (iota)

Also Published As

Publication number Publication date
NO943438D0 (no) 1994-09-15
DE69331467T2 (de) 2002-11-07
ES2170065T3 (es) 2002-08-01
KR950700999A (ko) 1995-02-20
EP0672180A1 (en) 1995-09-20
FI113059B (fi) 2004-02-27
EP1126025A3 (en) 2002-02-13
JPH07503856A (ja) 1995-04-27
FI20030248A (fi) 2003-02-18
EP1310555A3 (en) 2003-08-27
HUT69939A (en) 1995-09-28
DK0672180T3 (da) 2002-03-04
KR0157487B1 (ko) 1998-10-15
EP1126025A2 (en) 2001-08-22
DE69331467D1 (de) 2002-02-21
EP0672180B1 (en) 2002-01-16
WO1993019203A1 (en) 1993-09-30
ATE212063T1 (de) 2002-02-15
FI944276A0 (fi) 1994-09-15
NO943438L (no) 1994-11-11
CA2132094A1 (en) 1993-09-30
AU3802593A (en) 1993-10-21
US5703054A (en) 1997-12-30
FI944276A (fi) 1994-09-15
HU9402657D0 (en) 1994-12-28
EP0672180A4 (en) 1997-05-02
AU675638B2 (en) 1997-02-13
JP2635216B2 (ja) 1997-07-30
EP1310555A2 (en) 2003-05-14
HU217179B (hu) 1999-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI112379B (fi) Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten oligonukleotidien valmistamiseksi
US6015892A (en) Oligonucleotide modulation of protein kinase C
AU685074B2 (en) Administration of oligonucleotides antisense to dopamine receptor MRNA for diagnosis and treatment of neurological pathologies
US5885970A (en) Antisense oligonucleotides against human protein kinase C
US6537973B1 (en) Oligonucleotide inhibition of protein kinase C
AU2119297A (en) Methoxyethoxy oligonucleotides for modulation of protein kinase c expression
US5882927A (en) Oligonucleotide inhibition of protein kinase C
US5959096A (en) Antisense oligonucleotides against human protein kinase C
AU680449B2 (en) Antisense oligonucleotide inhibition of the ras gene
US5916807A (en) Antisense oligonucleotides against human protein kinase C
US5922686A (en) Oligonucleotide modulation of protein kinase C
AU713740B2 (en) Oligonucleotide modulation of protein kinase C
AU710972B2 (en) Oligonucleotide modulation of protein kinase C

Legal Events

Date Code Title Description
MA Patent expired