CN107267597A - Hic1在肿瘤诊断、治疗、预后和预测复发中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了HIC1在肿瘤诊断、治疗、预后和预测复发中的应用。本发明发现在许多肿瘤中HIC1基因的拷贝数、表达水平与肿瘤的侵袭转移、复发和预后密切相关。通过研究发现HIC1基因高甲基化导致HIC1表达降低能够促进肿瘤的侵袭转移，HIC1表达降低程度与患者与预后呈负相关。通过恢复基因HIC1表达，可以有效减弱乳腺癌、前列腺癌、肺癌的侵袭转移能力，提高患者生存率，说明HIC1基因可以作为肿瘤诊断、治疗、预后和预测复发的标记物，可做成试剂盒。促进HIC1表达的药物在制备治疗肿瘤的药物组合物上极具有临床应用价值，为肿瘤的有效治疗提供了新的药物和方法。
Description
技术领域
本发明涉及医学领域，尤其涉及HIC1在肿瘤诊断、治疗、预后和预测复发中的应用。
背景技术
癌高甲基化基因1(HIC1)是一个新的肿瘤抑制基因，位于人类第17号染色体13区短臂，处于p53位点远端。在人类多种肿瘤组织中，HIC1往往发生缺失或启动子高甲基化修饰而沉默的现象，这其中就包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结肠癌等。这种启动子甲基化修饰并不是固定不变的，但却与肿瘤的恶性程度以及低生存率存在一定的相关性。当使用去甲基化试剂5-AZA处理肿瘤细胞可恢复HIC1的表达，并且能够抑制肿瘤细胞的侵袭性。进一步的研究发现，HIC1杂合缺失导致自发肿瘤与其野生等位基因启动子的高甲基化存在关联。但是现有技术中，并没有将HIC1应用于肿瘤诊断或治疗之中，上述领域现今仍是空白。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明一方面提供了一种肿瘤检测试剂盒，所述的试剂盒中含有能够定量检测基因HIC1拷贝数的试剂。
本发明另一方面提供了一种肿瘤诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有能够定量检测基因HIC1表达水平的试剂。
较佳地，该试剂盒中含有实时荧光定量检测基因HIC1转录水平的引物序列。
较佳地：该试剂盒中含有实时荧光定量检测基因HIC1转录水平的引物序列：上游引物：5'-GTCGTGCGACAAGAGCTACAA-3'(SEQ ID NO:1)；
下游引物：5'-CGTTGCTGTGCGAACTTGC-3'(SEQ ID NO:2)。
本发明第三方面提供了一种肿瘤的预后试剂盒，所述的试剂盒中含有能够定量检测基因HIC1拷贝数的试剂。
本发明第四方面提供了一种肿瘤的预后试剂盒，所述的试剂盒中含有能够定 量检测基因HIC1表达水平的试剂。
本发明第五方面提供了一种肿瘤的复发试剂盒，所述的试剂盒中含有能够定量检测基因HIC1拷贝数的试剂。
本发明第六方面提供了一种肿瘤的复发试剂盒，所述的试剂盒中含有能够定量检测基因HIC1表达水平的试剂。
本发明第七方面提供了一种肿瘤治疗药剂，所述的药剂中含有恢复基因HIC1表达的试剂。
较佳地，所述恢复基因HIC1表达的试剂选自可恢复基因HIC1的试剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明发现了HIC1在多种肿瘤如前列腺癌、肺癌、乳腺癌等中表达明显降低。目前拥有肿瘤与临床辅助诊断技术尚不完善，而HIC11在肿瘤中与正常组织爱相比是明显降低的。这提示HIC1具有成为肿瘤辅助诊断标记物的潜能。
本发明通过一系列分析方法发现：在多种肿瘤中HIC1的降低与肿瘤的侵袭、转移患者预后密切相关。通过一系列体内功能试验发现：敲低HIC1促进体内三阴性乳腺癌的成瘤能力，降低小鼠的生存率。提示HIC1可作为乳腺癌癌治疗的靶点。而通过恢复HIC1在癌细胞和组织中的表达水平，可以有效抑制HIC1的侵袭转移、提高小鼠的生存率。以上实验数据均足以证明促进内源性HIC1的表达显著降低乳腺癌、前列腺癌、肺癌的侵袭转移提高患者的生存率，提示HIC1具有成为诊断、治疗、预后和预测复发的标记物的潜能。可以用来制作试剂盒，促进HIC1表达的药物在制备治疗肿瘤的药物组合极具有临床应用价值，为肿瘤的有效治疗提供了新的药物和方法。
附图说明：
图1为本发明实施例1中H1C1在乳腺癌细胞系中的表达状态图。
图2为本发明实施例1中H1C1在乳腺癌组织中染色结果图。
图3为本发明实施例1中的PCR检测图。
图4A为本发明实施例1在NSCLC细胞系95-D,A549,NCI-H1975和LTEP-a-2以及胚肺成纤维细胞MRC-5和WI-38中对HIC1基因启动子-624～-495bp之间存在的11个CpG位点的甲基化测序图。
图4B为本发明实施例1中对图4A所做的统计图。
图4C为本发明实施例1中采用q-RTPCR分析不同细胞系中HIC1 mRNA表达的高低的统计图。
图5A为本发明实施例1中对10例NSCLC的癌和癌旁组织中HIC1基因启动子-624～-495bp之间存在的11个CpG位点的甲基化测序图。
图5B为本发明实施例1中对图5A做的统计图。
图5C为本发明实施例1中采用q-RTPCR分析这10例癌和癌旁组织中HIC1 mRNA表达的高低的统计图。
图6A为本发明实施例1中采用5-Aza-CdR对细胞系A549和H292的DNA进行去甲基化处理后的结果图。
图6B为本发明实施例1中采用q-RTPCR和Western bolt方法检测5-Aza-CdR对A549和H292细胞系中HIC1表达的影响图。
图7为本发明实施例1中H1C1在肺腺癌和癌旁组织中的染色图
图8A为本发明实施例1中TCGA数据库中，HIC1基因启动子在前列腺癌组织和癌旁组织中甲基化程度比较图。
图8B为本发明实施例1TCGA数据库中，前列腺癌组织及癌旁组织HIC1基因启动子甲基化程度与HIC1表达的相关性分析线形图。
图9为本发明实施例1中前列腺癌标本库中(GSE21034)，癌旁组织(n＝29)、原位癌组织(n＝131)和转移癌组织(n＝19)中HIC1基因表达差异图。
图10A为本发明实施例1中在WT,PTENPC-/-HIC1PC+/+和PTENPC-/-HIC1PC-/-小鼠中，免疫组化检测其前列腺上皮中HIC1表达变化的染色图。
图10B为本发明实施例1中TENPC-/-HIC1PC+/+和PTENPC-/-HIC1PC-/-小鼠中，H&E染色和免疫组化染色(ɑ-SMA)观察小鼠前列腺前叶组织变化图。
图11A为本发明实施例2中在整个乳腺癌数据库中(Whole data set)，HIC1的表达与病人总生存率之间不具有相关性的线形图。
图11B为本发明实施例2中在Basal型乳腺癌中，HIC1的低表达与病人的不良预后具有统计学意义的线形图。
图12为本发明实施例2中前列腺癌标本库中(GSE21034)，HIC1基因表达量与病人生存关系的线形图。
图13为本发明实施例3中的载体图谱。
图14A为本发明实施例4中Western blot和Real-time PCR验证HIC1过 表达效果图。
图14B为本发明实施例4中的与图14A相关的划痕实验结果图。
图14C为本发明实施例4中与图14A相关的细胞侵蚀实验结果图。
图15A为本发明实施例4中Western blot和Real-time PCR验证MDA-468细胞中HIC1过表达效果图
图15B为本发明实施例4的与图15A相关的划痕实验结果图。
图15C为本发明实施例4中与图15A相关的细胞侵蚀实验结果图.
图16A为本发明实施例4Western blot验证HIC1在蛋白水平的敲除效果图。
图16B为本发明实施例4中Real-time PCR验证HIC1在RNA水平的敲除效果图。
图16C为本发明实施例4中敲除HIC1后细胞侵蚀实验结果图。
图16D为本发明实施例4中细胞计数统计分析图。
图17A为本发明实施例4中Western blot验证HIC1蛋白水平敲除效果图。
图17B为本发明实施例4中与图17A相关的细胞侵蚀实验结果图。
图17C为本发明实施例4中用chamber小室进行细胞迁移实验的结果图。
图18A为本发明实施例4中HIC1组小鼠活体成像图。
图18B为本发明实施例4中荧光值统计分析图。
图19A为本发明实施例4中肺转移灶和肺负重统计图。
图19B为本发明实施例4中肺转移灶切片，H&E染色结果图
图20A为本发明实施例4通过细胞侵袭实验和划痕实验结果图。
图20B为本发明实施例4中用staurosporine处理细胞12h来诱导细胞凋亡后，TUNEL实验结果。
图20C为本发明实施例4中把A549细胞中的HIC1敲除后的侵袭实验图。
图20D为本发明实施例4中把A549细胞中的HIC1敲除后的tunel实验图。
图21A为本发明实施例4中Trans-well实验检测结果图。
图21B为本发明实施例4中裸鼠左心室注射luciferase基因标记的小鼠活体成像图。
图21C为本发明实施例4中X-光检测luciferase标记的C4-2Bshctrl,C4-2BshHIC1和DU145shctrl,DU145shHIC1细胞对裸鼠胫骨的X光透视图。
图21D为本发明实施例4中对融骨发生部位的H&E染色切片图。
图22A为本发明实施例4中在DU145和C4-2B细胞中，沉默HIC1表达细胞形态学变化图。
图22B为本发明实施例4C4-2Bshctrl,C4-2BshHIC1和DU145shctrl,DU145shHIC1细胞表达谱芯片检测后EMT相关marker的热图分析。
图22C为本发明实施例4在LNCaP，DU145和C4-2B细胞中，沉默HIC1表达后，westernblot实验检测EMT相关marker(E-cadherin，Slug，N-cadherin和Vimentin)表达变化图。
图22D为本发明实施例4C4-2Bshctrl,C4-2BshHIC1细胞EMT相关marker(E-cadherin，N-cadherin和Vimentin)表达变化的免疫荧光检测图。
图22E为本发明实施例4PTENPC-/-HIC1PC+/+和PTENPC-/-HIC1PC-/-小鼠中，免疫组化染色观察小鼠前列腺前叶组织EMT相关marker(E-cadherin，CK-8，N-cadherin和Slug)表达变化图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明作进一步地说明，以更好地理解本发明。
实施例1：HIC1在肿瘤细胞和组织中表达降低
一、HIC1在三阴性乳腺癌细胞(TNBC)和组织中表达丢失
如图1所示，为HIC1在几种常用的乳腺癌细胞系中的表达状态。结果显示HIC1在TNBC类型的细胞系MDA-231中的表达量明显低于Luminal型的细胞系MCF-7和BT474、HER2+阳性的细胞系SK-BR-3，以及良性的细胞系MCF-10A。但与良性MCF-10A相比，HIC1在乳腺癌细胞系的表达并未呈现下调趋势。
接下来，又运用高密度组织芯片，通过免疫组化染色的方法，检测了HIC1在乳腺癌病人标本中的表达情况。如图2所示，染色结果显示与良性组织、Luminal型、HER-2+相比，HIC1在TNBC中的表达几乎丢失。如表1所示，随后进行的统计分析也得到了相似的结论。虽然HIC1在良恶性之间表达并无差别(p＝0.230)，但有意思的是，HIC1的表达却与组织染色级别T status以及ER、PR、HER-2受体的状态呈显著相关。具体到乳腺癌的分子分型上则是：与良性乳腺组织相比，HIC1在三阴性乳腺癌组织中表达丢失(p＝0.020)。
表1
IDC＝invasion ductal carcinoma，ILC＝invasion lobular carcinoma
二、HIC1在非小细胞肺癌组织(NSCLC)和细胞中因启动子甲基化而表达下降
为了研究在NSCLC中是否发生了HIC1基因启动子甲基化并表达下降的现象，抽提出NSCLC细胞系95D，A549，NCI-H1975和LTEP-a-2的DNA，并以胚肺成纤维细胞MRC-5和WI-38的DNA作为正常对照进行启动子特异性甲基化PCR检测，如图3所示，结果显示在NSCLC细胞中HIC1均处于甲基化状态，而正常细胞系中HIC1处于非甲基化状态。
通过MSP方法发现在NSCLC细胞系95-D，A549，NCI-H1975，LTEP-a-2中HIC1基因启动子处于甲基化状态，而胚肺成纤维细胞MRC-5，WI-38中HIC1基因启动子处于非甲基化状态。M代表甲基化，U代表非甲基化。
为了更准确的反应在NSCLC中HIC1基因启动子的甲基化程度，对HIC1启动子上-624～-495bp区域的11个CpG位点进行甲基化测序分析，结果如图4A显 示，HIC1基因在癌细胞中的甲基化程度要普遍高于正常细胞。图4B是对图4A的统计图。同时通过q-RTPCR实验检测了HIC1基因在细胞系中的转录情况。如图4C所示，发现HIC1的mRNA转录水平在癌细胞中要明显低于正常细胞。
如图4A所示，在NSCLC细胞系95-D,A549,NCI-H1975和LTEP-a-2以及胚肺成纤维细胞MRC-5和WI-38中对HIC1基因启动子-624～-495bp之间存在的11个CpG位点进行甲基化测序。一个黑色实心圆代表一个CpG位点发生甲基化修饰，一个空心圆代表一个CpG位点没有发生甲基化。
如图4B所示，不同细胞系中HIC1基因启动子甲基化程度的统计图。95-D,A549，NCI-H1975，LTEP-a-2,MRC-5和WI-38细胞系中HIC1的甲基化程度分别为42％，50％，35％，58％,20％和17％。
如图4C所示q-RTPCR分析不同细胞系中HIC1 mRNA表达的高低，95-D,A549，NCI-H1975，LTEP-a-2细胞系中HIC1表达远远低于MRC-5and WI-38细胞系。
那么HIC1基因在NSCLC组织中的甲基化情况又是如何？选取10例NSCLC病人的癌组织和相对应的癌旁组织。对其DNA进行同样的甲基化测序分析，图5A所示，发现HIC1在癌组织中的甲基化程度要普遍高于癌旁组织。图5B是对图5A的统计。如图5C所示，而HIC1在癌组织中的mRNA转录则普遍低于癌旁组织。
如图5A、5B、5C所示采用BSP方法检测10例NSCLC患者癌和癌旁组织中HIC1基因启动子的甲基化程度，q-RTPCR方法检测HIC1在这10例组织中的表达情况。
对10例NSCLC的癌和癌旁组织中HIC1基因启动子-624～-495bp之间存在的11个CpG位点进行甲基化测序。黑色实心圆代表CpG位点发生甲基化修饰，空心圆则代表CpG位点没有发生甲基化。
10例组织中HIC1基因启动子甲基化程度的统计图。癌组织中HIC1的甲基化程度要高于癌旁组织，p-Value＝0.011。
q-RTPCR分析这10例癌和癌旁组织中HIC1 mRNA表达的高低，癌组织中HIC1表达普遍低于癌旁组织。
上述实验结果在NSCLC细胞和组织中HIC1基因的甲基化程度越高，则其mRNA转录水平越低。那么推测HIC1基因发生甲基化会降低HIC1的mRNA转录和蛋白表达。为了得到更直接的证据，用5-Aza-CdR对细胞系A549和H292的DNA进行去甲基化处理后，如图6A所示，发现HIC1基因的mRNA转录和蛋白表达均有一 定程度的升高，结果可以在6B中看到。说明HIC1基因启动子发生甲基化后能够在一定程度上导致HIC1表达下降。
图6A所示，用10μM 5-Aza-CdR处理A549和H292细胞48h，没有处理(即0μM)的细胞作为对照，通过MSP的方法检测细胞中HIC1基因启动子甲基化的变化，如图所示，A549和H292细胞中HIC1基因启动子的甲基化程度都有所降低。
图6B所示，q-RTPCR和Western bolt方法检测5-Aza-CdR对A549和H292细胞系中HIC1表达的影响，如图所示，经处理后HIC1的mRNA和蛋白表达都有所上调。
为了检测HIC1在NSCLC组织中的蛋白表达情况，图7和表2所示，对肺腺癌的组织芯片进行HIC1的免疫组织化学染色，发现在癌旁组织的细胞核中HIC1的阳性率要高于癌组织，并且癌组织的恶性程度越高，HIC1的阳性率越低。
表2
如图7所示，HIC1在癌旁组织细胞核中的阳性率高于癌组织，Scale bar＝50μM,p-Value<0.001。HIC1在癌组织中的表达与癌组织的恶性度相关，恶性度越高HIC1的阳性率越低，p-Value＝0.011。
三、HIC1基因表达缺失与前列腺癌转移正相关
为评估HIC1基因在前列腺癌组织中高度甲基化状态，及其与基因表达的关系，进一步在TCGA数据库(The Cancer Genome Atlas)中387例前列腺癌临床 标本进行大样本分析。图8A结果显示，癌组织中HIC1基因启动子甲基化程度明显高于癌旁组织(P<0.005)；相关性分析发现，图8B所示HIC1基因启动子甲基化程度与其表达呈明显负相关(R＝-0.243；P<0.001)(。提示，在前列腺癌组织中HIC1基因高度甲基化可以促使基因表达下降。
如图8A所示，TCGA数据库中，HIC1基因启动子在前列腺癌组织和癌旁组织中甲基化程度比较。**P<0.005。
图8B所示，TCGA数据库中，前列腺癌组织及癌旁组织HIC1基因启动子甲基化程度与HIC1表达的相关性分析。
为了进一步探索HIC1基因与前列腺癌转移的关系，对GEO数据库中带有转移性前列腺癌标本进行数据分析(Taylor’s dataset，GSE21034)。进一步在此数据库中比较了癌旁组织、原位癌组织和转移癌组织中HIC1基因表达差异，如图9所示，发现在转移性前列腺癌标本中的表达量比癌旁组织和原位前列腺癌组织明显降低。临床数据分析结果提示：1.HIC1表达丢失可能参与了前列腺癌的转移和侵袭。
图9为前列腺癌标本库中(GSE21034)，癌旁组织(n＝29)、原位癌组织(n＝131)和转移癌组织(n＝19)中HIC1基因表达差异。*P<0.05。
尽管临床数据提示HIC1基因表达量降低与前列腺癌转移呈正相关，但不能说明两者之间的因果关系。因此，使用了自发性前列腺癌小鼠模型(PTENpc-/-小鼠)来验证，HIC1基因表达下降是否导致前列腺癌转移。在PTENloxP/loxP小鼠的前列腺上皮细胞中特异性表达Cre重组酶(Pb-Cre)，导致前列腺上皮中PTEN基因组织特异性缺失(PTENpc-/-)以及Akt的高度磷酸化。这些PTENpc-/-小鼠先发生前列腺上皮增生，进而在6周内进展成前列腺上皮内瘤变，9至12周时发展成浸润性的腺癌，这与人PCa的发展过程相似，因此它是目前研究PCa的很好模型。已有研究表明，HIC1基因纯合缺失会导致小鼠在围产期死亡。通过在HIC1基因编码区两侧插入loxP位点，构建条件性HIC1无效等位基因模型(HIC1loxP/loxP小鼠)。与Pb-Cre/PTENloxP/loxP小鼠杂交，经过鼠尾组织DNA样本PCR鉴定(见材料和方法)和19周龄小鼠前列腺组织前叶的免疫组化分析，如图10A所示，得到WT，PTENPC-/-HIC1PC+/+和PTENPC-/-HIC1PC-/-三种基因型小鼠。H&E染色和免疫组化(ɑ-SMA特异性染色)检测发现，PTENPC-/-HIC1PC+/+小鼠前列腺腺腔薄膜完整，腺腔之间界限清晰；如图10B所示，而PTENPC-/-HIC1PC-/-小鼠前列腺包膜出现破损， 腺腔之间界限较为模糊，呈现出较高的侵袭性表型。基因敲除小鼠模型结果提示，HIC1基因缺失可以促进前列腺癌侵袭性增加。
图10A为在WT,PTENPC-/-HIC1PC+/+和PTENPC-/-HIC1PC-/-小鼠中，免疫组化检测其前列腺上皮中HIC1表达变化。标尺：50μm。
图10B为PTENPC-/-HIC1PC+/+和PTENPC-/-HIC1PC-/-小鼠中，H&E染色和免疫组化染色(ɑ-SMA)观察小鼠前列腺前叶组织变化。标尺：200μm(H&E)and 100μm(免疫组化)。蓝色箭头指示被破坏的腺腔组织。
实施例2：HIC1缺失与患者生存预后正相关
一、HIC1基因表达缺失与三阴性乳腺癌病人生存预后正相关
为进一步探索HIC1与临床病人预后及生存率之间的相关性，又分析了已公开发表的乳腺癌临床基因芯片数据库。截止2013年11月，该数据库共收录1027例乳腺癌病人芯片结果，其中有效的Basal型的乳腺癌占185例(通常意义上，将TNBC等同于Basal-like型)。分析结果如图11B提示，HIC1的低表达与basal-like型病人的不良预后呈明显相关p＝0.028)，但在整个乳腺癌数据库和其他分子亚型的乳腺癌中，如图11B所示，HIC1的表达与病人的总生存率之间不具有统计学意义。HIC1基因在三阴性乳腺癌中表达丢失，提示HIC1可能成为一个特异的分子亚型预后指标。
图11A显示.，在整个乳腺癌数据库中(Whole data set)，HIC1的表达与病人总生存率之间不具有相关性。数据来源于Kaplan–Meier plotter database。p值根据log-ranktest自动计算得出。
图11B显示，在Basal型乳腺癌中，HIC1的低表达与病人的不良预后具有统计学意义(p＝0.028)。
二、HIC1表达缺失与前列腺癌病人生存预后正相关
通过对GEO该数据库中179例标本的HIC1基因表达二代测序结果分析，如图12所示，发现表达高的病人无复发生存期(Recurrence free survival，RFS)明显高于表达低的病人(HR＝0.7；95％CI:0.5～1.0；P<0.05)，提示癌组织中HIC1基因表达量高的病人预后较好。
如图12所示，前列腺癌标本库中(GSE21034)，HIC1基因表达量与病人生存关系。
实施例3：构建稳定的高表达HIC1的细胞株和构建sh HIC1的细胞株。
一、构建稳定的HIC1高表达的细胞株
1.构建HIC1过表达质粒包装慢病毒
(1)克隆CDS：从含有HIC1的非病毒表达质粒(PC3.1骨架)中克隆出CDS序列；
(2)酶切CDS序列和载体(pHR-SIN-CSIGW)，胶回收酶切产物；
(3)将酶切过的CDS序列与慢病毒载体按比例连接、转化连接产物、挑取克隆、质粒小抽、测序鉴定阳性克隆；
(4)质粒大抽：构建好的目的质粒进行超纯去内毒素抽提，以达到细胞转染级别(浓度1μg以上，纯度OD值大于1.8)；
(5)慢病毒包装：将慢病毒包装质粒(PMD2.G、PSPAX2)和表达质粒HIC1共转染293T细胞，转染试剂为Lipofectamine 2000，操作步骤参照Invitrogene公司说明书。48h后收集病毒上清，3000rpm离心15min，并进行滴度测定，病毒分装冻存-80℃保存。
(6)病毒感染：病毒上清感染靶细胞MDA-MB-231(连续两次)，FACS筛选鉴定出带GFP的阳性细胞，并扩增培养、保种。
(7)Western blot及Real-time PCR检测HIC1的表达水平、以及细胞的表型变化等。
2.转染乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞
在本实验中所有的siRNA转染、质粒转染、病毒包装均采用Invitrogene公司生产的转染试剂Lipofectamine 2000。质粒DNA和Lipofectamine 2000的稀释液可用公司推荐的Opti-MEM或者无血清的DMEM都可，原理一样，效果相差不大。整个转染过程中均不添加抗生素。操作步骤如下：
(1)转染前24小时在12孔板中培养MDA-MB-231细胞,细胞密度50％；
(2)第二天取病毒上清液,每孔加500μl病毒上清液,500μl完全培养基,并加入终浓度8μg/ml polybrene混匀,37℃CO2培养箱过夜培养；
(3)12小时后换新鲜完全培养基；
(4)12小时后加入终浓度1μg/ml嘌呤霉素(shHIC1)筛选阳性克隆细胞 株；
(5)DMEM加10％胎牛血清的培养基培养，37℃CO2培养箱培养。
二、构建稳定的HIC1敲低的细胞株
针对每个基因，都设计3个敲除片段和一个空载对照。质粒骨架为GV248，属于慢病毒载体，带GFP和puro抗性。载体图谱如图13所示：
慢病毒的包装质粒是pMD2.G和PSPAX2，病毒的包装、细胞感染过程和之前基因过表达步骤一致。采用puro(1μg/ml)筛选4天，之后换成0.5μg/ml继续维持。针对HIC1基因敲除片段的序列如下：
上述方法转染永生化的乳腺上皮细胞HBL-100中shRNA敲除HIC1。
实施例4：HIC1在肿瘤细胞及裸鼠体内的功能研究
一、HIC1在三阴性乳腺癌(TNBC)细胞及裸鼠体内中的功能研究
首先通过慢病毒系统在三阴性细胞系MDA-231和MDA-468中恢复了HIC1的表达，并通过Western blot和Real-time PCR验证过表达效果，结果如图14A，15A所示。在构建好细胞系后，又通过划痕损伤实验检测细胞的迁移能力，以及Chamber实验检测细胞的侵袭能力。如图14B结果显示，在MDA-231细胞中恢复HIC1的表达能够抑制细胞的迁移能力，如图15B显示，但对MDA-468细胞，影响并不明显。如图14C，图15C显示，细胞侵袭实验结果显示，对MDA-231和MDA-468细胞，恢复HIC1的表达都能够明显抑制细胞的侵袭能力。
图14A、14B、14C显示Western blot和Real-time PCR验证HIC1过表达效果。划痕实验,恢复HIC1表达后，细胞的迁移能力受到抑制。细胞侵袭实验，恢复HIC1表达后，细胞的侵袭能力受到明显抑制(p＝0.0006)。Mean±SD；Scare bar,200μm。
图15A、15B、15C显示Western blot和Real-time PCR验证MDA-468细胞中HIC1过表达效果。划痕实验。恢复HIC1表达后，对MDA-468细胞的迁移能力影响不明显。细胞侵袭实验。恢复HIC1表达后，细胞的侵袭能力受到明显抑 制(p＝0.0061)。Mean±SD；Scare bar,200μm。
如图16A、16B、16C、16D所示，相反，在永生化的乳腺上皮细胞HBL-100中通过shRNA敲除HIC1后，细胞的侵袭能力大大增加。与sh-control相比，片段shHIC1-2和shHIC1-3的敲除效果较为明显，敲除后细胞侵袭能力也明显增加。而片段shHIC1-1的敲除效果和对细胞侵袭的影响并不明显。另外，如图17A、17B、17C所示，在良性乳腺上皮细胞MCF-10A细胞中联合使用shHIC1-2和shHIC1-3两个片段，敲除HIC1表达后，也得到了类似的结论，即：敲除HIC1的表达能够促进细胞的侵袭转移能力。
如图16A、16B、16C、16D所示.Western blot验证HIC1在蛋白水平的敲除效果。.Real-time PCR验证HIC1在RNA水平的敲除效果。细胞侵袭实验，敲除HIC1后，细胞的侵袭能力大大增加。Scare bar,200μm。细胞计数，统计分析。相比sh-control和shHIC1-1,片段shHIC1-2和shHIC1-3对细胞侵袭的影响更为明显。Mean±SD。
如图17A、17B、17C所示敲除HIC1促进MCF-10A细胞的迁移、侵袭
Western blot验证HIC1蛋白水平敲除效果。细胞侵袭实验，联合使用shHIC1-2和3片段敲除HIC1后，细胞的侵袭能力大大增加(p＝0.0145)。用chamber小室进行细胞迁移实验。敲除HIC1后，细胞的迁移能力同样明显增加(p＝0.0008)。Mean±SD；Scare bar,200μm。
在细胞水平获得初步结果后，为进一步在小鼠体内探索HIC1对肿瘤侵袭转移能力的影响，在带有Luciferase标记的MDA-231细胞中，继续使用慢病毒系统稳定转染HIC1表达质粒。在经过Western blot和Real-time PCR对稳定转染的细胞系鉴定合格后，将对照组MDA-231GFP和实验组MDA-231HIC1细胞通过尾静脉注射到Nude Balb/c品系小鼠。每只小鼠注射1×106细胞，总体积不超过100μl，同时注意气泡和细胞团块，要避免小鼠发生栓塞而急速死亡。尾静脉注射第4周开始，如图18A所示，通过活体成像的方法检测肿瘤的转移情况。之后，每周检测一次，共3次。结果显示，与对照组细胞MDA-231GFP相比，注射MDA-231HIC1细胞的小鼠发生肺转移的比例明显降低。在如图18B所示，尾静脉注射第五周，荧光活体成像系统进一步证实，携带MDA-231HIC1细胞的小鼠发生肺转移的病情明显低于携带MDA-231GFP细胞的小鼠。
图18A和18B所示，HIC1抑制小鼠肺转移，活体成像显示HIC1组小鼠肺 转移明显减轻。荧光值统计分析。Mean±SEM。
在注射后的第七周，处死全部小鼠，取肺组织观察。肺转移灶的计数统计和整体的肺负重结果显示，如图19A所示，HIC1组小鼠肺转移情况明显好于GFP对照组小鼠。肺组织切片的苏木素-伊红(H&E)染色结果，使更直观的看到：如图19B所示，和GFP组相比，HIC1组小鼠肺转移受到明显的抑制。此部分结果表明，恢复HIC1表达能够显著降低三阴乳腺癌细胞的侵袭、转移能力。
图19A、19B所示.小鼠肺转移灶、肺负重及H&E染色
肺转移灶和肺负重统计。n＝8；Mean±SEM.肺转移灶切片，H&E染色结果。Scarebar,500μm。
二、HIC1可抑制非小细胞肺癌细胞的侵袭迁移并促进细胞凋亡
已有研究表明HIC1参与调控癌症进展中的基因损伤[28,78]，细胞迁移和侵袭[18,31]等，为了进一步研究HIC1在NSCLC中由于启动子甲基化表达下降后对癌细胞产生的影响，在A549和H292细胞中使用慢病毒载体恢复表达HIC1。如图20A所示，Transwell细胞侵袭实验和划痕实验结果显示HIC1恢复表达的细胞其侵袭迁移能力下降。而用staurosporine处理细胞12h来诱导细胞凋亡后，如图20B所示TUNEL实验结果显示HIC1可以促进细胞的凋亡；并且当把A549细胞中的HIC1敲除后，如图20C所示细胞迁移能力增强，如图20D所示同时细胞的凋亡数目减少。
如图20A、20B、20C、20D所示，HIC1抑制A549和H292细胞的侵袭迁移并促进细胞的凋亡。
通过细胞侵袭实验和划痕实验发现在A549和H292中恢复表达HIC1后可抑制细胞的侵袭迁移。通过tunel实验发现在A549和H292中恢复表达HIC1后可促进细胞的凋亡。通过细胞侵袭实验发现在A549中敲除HIC1后促进了细胞的迁移。通过tunel实验发现在A549中敲除HIC1后抑制了细胞的凋亡。
侵袭实验图片放大倍数：10×10(物镜×目镜)，划痕实验图片放大倍数：5×10(物镜×目镜)，Tunel实验图片放大倍数：10×10(物镜×目镜)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
三、HIC1表达缺失促进前列腺癌细胞侵袭转移和上皮间质转换(EMT)
利用前列腺癌细胞模型来进一步验证HIC1表达缺失与前列腺癌侵袭转移的 关系，并初步探索其分子机制。使用转移性前列腺癌细胞株C4-2B和DU145做为研究对象，利用慢病毒感染细胞，建立HIC1表达沉默的细胞模型，即C4-2Bshctrl,C4-2BshHIC1-2,C4-2BshHIC1-3和DU145shctrl,DU145shHIC1-2,DU145shHIC1-3。Western blot和免疫荧光实验证实，HIC1沉默稳转细胞模型成功建立(图5A和5B)。
体外实验中，使用Trans-well方法来检测HIC1沉默后对细胞侵袭和迁移能力的影响。如图21A所示，在C4-2B和DU145细胞中，沉默HIC1的表达可以明显促进细胞的侵袭和迁移能力(P<0.05)。体内实验中，使用左心室注射luciferase标记的C4-2Bshctrl,C4-2BshHIC1和DU145shctrl,DU145shHIC1细胞的方法，在注射6周后检测HIC1沉默对细胞在体内转移能力的变化影响。结果显示，HIC1的表达沉默后，如图21B所示，可以显著促进C4-2B和DU145细胞在小鼠体内的转移(P<0.05)。值得注意的是，HIC1的表达沉默促进了细胞骨转移灶的数量增多。如图21C所示使用X-ray方法检测进一步验证了细胞在小鼠体内的骨转移(图3C)。经过对转移部位的骨组织切片H&E染色，如图21D所示可以看到转移的HIC1表达沉默的肿瘤细胞使骨组织出现了明显的破坏。此外，同时发现，注射C4-2BshHIC1细胞的小鼠生存期明显短于注射C4-2Bshctrl细胞的小鼠(P<0.01)。由此证实，HIC1表达缺失与前列腺癌细胞的侵袭、骨转移能力升高以及小鼠生存期缩短相关。
图21A、21B、21C、21D：HIC1表达缺失促进前列腺癌细胞侵袭转移。
Trans-well实验检测，在DU145和C4-2B细胞中，沉默HIC1表达细胞侵袭和迁移能力的变化。*P<0.05。
裸鼠左心室注射luciferase基因标记的DU145shctrl(n＝10),DU145shHIC1(n＝16)细胞，注射6周后，检测细胞远端转移，并进行定量分析转移灶大小。*P<0.05，n代表每组小鼠数量。
X-光检测luciferase标记的C4-2Bshctrl,C4-2BshHIC1和DU145shctrl,DU145shHIC1细胞对裸鼠胫骨的融骨影响。红色箭头指示融骨发生部位。
对融骨发生部位的H&E染色。蓝色箭头指示转移到骨髓腔中的肿瘤细胞。
EMT的发生是促进肿瘤细胞侵袭转移的重要分子机制。EMT的发生，往往伴随着细胞形态学变化，即细胞极性消失、细胞之间粘附性降低。发现HIC1在C4-2B和DU145细胞表达沉默后，与对照组细胞相比，细胞形态学发生了变化：细胞之间的连接变得松散，如图22A所示，形态由立方形变为梭形。提示HIC1沉默可 能引起前列腺癌细胞EMT发生。EMT发生会使上皮型细胞marker表达降低，而间质型细胞marker表达升高，这是EMT发生的重要分子生物学事件。进一步使用转录组学基因表达谱芯片检测发现，如图22B、22C、22D、22E所示，HIC1在C4-2B和DU145细胞表达沉默后可以促进间质型细胞的marker表达，抑制上皮细胞型marker表达。
图22A、22B、22C、22D、22E：HIC1表达缺失促进前列腺癌细胞EMT发生。
在DU145和C4-2B细胞中，沉默HIC1表达细胞形态学变化。标尺：50μm。
C4-2Bshctrl,C4-2BshHIC1和DU145shctrl,DU145shHIC1细胞表达谱芯片检测后EMT相关marker的热图分析。
在LNCaP，DU145和C4-2B细胞中，沉默HIC1表达后，western blot实验检测EMT相关marker(E-cadherin，Slug，N-cadherin和Vimentin)表达变化。
使用激光共聚焦显微镜，免疫荧光实验检测C4-2Bshctrl,C4-2BshHIC1细胞EMT相关marker(E-cadherin，N-cadherin和Vimentin)表达变化。标尺：50μm。
PTENPC-/-HIC1PC+/+和PTENPC-/-HIC1PC-/-小鼠中，免疫组化染色观察小鼠前列腺前叶组织EMT相关marker(E-cadherin，CK-8，N-cadherin和Slug)表达变化。标尺：50μm。
本发明通过一系列分析方法发现：在多种肿瘤中HIC1的缺失与肿瘤的侵袭、转移患者预后密切相关。通过一系列体内功能试验发现：敲低HIC1促进体内三阴性乳腺癌的成瘤能力，降低小鼠的生存率。提示HIC1可作为乳腺癌癌治疗的靶点。而通过促进HIC1在癌细胞和组织中的表达水平，可以有效抑制HIC1的侵袭转移、提高小鼠的生存率。以上实验数据均足以证明促进内源性HIC1的表达显著降低乳腺癌、前列腺癌、肺癌的侵袭转移提高患者的生存率，提示HIC1具有成为诊断、治疗、预后和预测复发的标记物的潜能。可以用来制作试剂盒，恢复HIC1表达的药物在制备治疗肿瘤的药物组合极具有临床应用价值，为肿瘤的有效治疗提供了新的药物和方法。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110>王建华
<120> HIC1在肿瘤诊断、治疗、预后和预测复发中的应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
GTCGTGCGACAAGAGCTACAA
21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
CGTTGCTGTGCGAACTTGC
19
Claims (10)
1.一种肿瘤检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有能够定量检测基因HIC1拷贝数的试剂。
2.一种肿瘤诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有能够定量检测基因HIC1表达水平的试剂。
3.根据权利要求2中所述的一种肿瘤检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒中含有实时荧光定量检测基因HIC1转录水平的引物序列。
4.根据权利要求3所述的一种肿瘤检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒中含有实时荧光定量检测基因HIC1转录水平的引物序列：上游引物：5'-GTCGTGCGACAAGAGCTACAA-3'(SEQID NO:1)；下游引物：5'-CGTTGCTGTGCGAACTTGC-3'(SEQ ID NO:2)。
5.一种肿瘤的预后试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有能够定量检测基因HIC1拷贝数的试剂。
6.一种肿瘤的预后试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有能够定量检测基因HIC1表达水平的试剂。
7.一种肿瘤的复发试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有能够定量检测基因HIC1拷贝数的试剂。
8.一种肿瘤的复发试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有能够定量检测基因HIC1表达水平的试剂。
9.一种肿瘤治疗药剂，其特征在于，所述的药剂中含有促进基因HIC1表达的试剂。
10.根据权利要求9所述的一种肿瘤治疗药剂，其特征在于，所述促进基因HIC1表达的试剂选自可恢复基因HIC1的试剂。
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