CN110029192A - Emt动态监测系统、包括其的emt动态监测体系及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种EMT动态监测系统、包括其的EMT动态监测体系及应用。该EMT动态监测系统基于Cre/LoxP重组酶系统构建而成，包括：Cre基因，置于EMT相关基因的启动子控制之下；转换式报告载体，包括两个相反的LoxP位点，在两个相反的LoxP位点之间插入有第一报告分子与第二报告分子；或转换式报告载体包括一对同向LoxP位点，在一对同向LoxP位点之间插入第一报告分子与终止信号，在LoxP位点之后插入第二报告分子。应用本发明的技术方案，建立基于Cre/loxP重组酶和生物发光技术的EMT动态监测体系，实现对肿瘤EMT动物模型的实时定量监测，突破了肿瘤EMT研究的瓶颈。

Description

EMT动态监测系统、包括其的EMT动态监测体系及应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种EMT动态监测系统、包括其的EMT动态监测体系及应用。
背景技术
在肿瘤恶性进展过程中,上皮细胞会发生间充质样的形态和功能改变，即为EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition，上皮细胞的间充质型转化)。具体表现为上皮细胞丧失细胞间的紧密连接和极性，而获得侵袭迁移的能力。近年来，EMT相关研究倍受关注，因为EMT与肿瘤耐药、复发、转移和肿瘤干细胞理论密切相关。因此，以阻止EMT为目标的治疗策略成为近年来生物学和药学领域密切关注的研究热点。然而，目前针对肿瘤EMT治疗的探索，收效甚微，重要原因之一就是忽视了EMT的动态转化规律，缺少能在临床前研究中动态监测模型动物体内肿瘤EMT发生发展的装置。
目前研究肿瘤EMT的动物模型有两大类(参见表1)：
(一)移植模型：通过基因转入、敲除技术，或药物、生长因子处理的方法，体外诱导肿瘤细胞发生EMT，再将已发生EMT的肿瘤细胞注射入动物体内，观察成瘤性和转移率。该方法操作简单、成本低。其最大的局限在于：(1)EMT是经体外诱导发生的，从病因角度分析，不符合肿瘤EMT发生规律；(2)通常用萤火虫荧光素酶对肿瘤细胞进行简单标记，利用这种报告系统只能判断成瘤性强弱、转移发生与否，不能直接观察肿瘤EMT的动态进展。
(二)自发模型：针对EMT相关基因，直接制备基因转入或基因敲除动物模型，观察肿瘤自发形成率和转移率。从病因角度分析，该方法制备的EMT模型与人类肿瘤EMT的发生更为相似。但是，涉及转基因动物的操作，较复杂；涉及转基因动物的筛选繁育，通常超过6个月；自发的鼠源性肿瘤与人源性肿瘤存在一定的种属差异，而且疾病进展较为缓慢，常常需要6～12个月才能观察到EMT的发生。这类模型大多没有肿瘤EMT动态监测体系，个别模型采用GFP和RFP分别示踪不同类型的组织细胞，但无肿瘤特异性，只能用于离体分析，并需借助其他染色来鉴别肿瘤细胞。
此类模型中，设计最为巧妙的当属Dingcheng Gao和Vivek Mittal实验室建立的MMTV-PyMT/Rosa26-RFP-GFP/Fsp1-Cre转基因小鼠模型，其上皮型组织表达RFP产生红色荧光，而间质型组织表达GFP产生绿色荧光。但是，其最大的缺陷是只能用于离体研究：(1)小鼠的全部上皮型组织均呈现红色荧光，而全部的间质型组织均呈现绿色荧光，所以只能用于离体分析，并且需要借助其他染色来鉴别发出荧光的组织是正常细胞，还是肿瘤细胞；(2)GFP与RFP荧光的波长短，穿透性差，且易与小鼠自发荧光混淆，很难用于准确识别活体动物中(尤其是深层组织中)的肿瘤细胞。
此外，以上两类模型还存在一个共同的缺陷：均为终点研究法。凭经验决定实验终点，处死小鼠，分离肿瘤组织和转移器官，分析EMT相关基因的表达。这种终点研究法不能实时动态的监测动物体内EMT发生发展过程，无法揭示其动态转化规律，这正是EMT相关研究的瓶颈所在。
表1.目前常用于研究EMT的两类动物模型
发明内容
本发明旨在提供一种EMT动态监测系统、包括其的EMT动态监测体系及应用，以解决现有技术中EMT不能进行动态监测的技术问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种EMT动态监测系统。该EMT动态监测系统基于Cre/LoxP重组酶系统构建而成，包括：Cre基因，置于EMT相关基因的启动子控制之下；转换式报告载体，包括两个相反的LoxP位点，在两个相反的LoxP位点之间插入有第一报告分子与第二报告分子；或转换式报告载体包括一对同向LoxP位点，在一对同向LoxP位点之间插入第一报告分子与终止信号，在LoxP位点之后插入第二报告分子。
进一步地，第一报告分子与第二报告分子为不同的荧光素酶或远红外荧光蛋白；优选的，第一报告分子与第二报告分子分别为荧光素酶Fluc2和Rluc8.6，或Rluc8.6和Fluc2。
进一步地，Cre基因置于间质型标志物或EMT相关转录因子的启动子控制之下。
进一步地，间质型标志物包括Vimentin(波形蛋白)、N-cadherin(神经-钙粘蛋白)或Fibronectin(纤维粘连蛋白)，EMT相关转录因子包括Snail、Twist和ZEB1。
根据本发明的另一方面，提供了一种EMT动态监测体系。该EMT动态监测体系包括EMT基因诱导表达系统和上述EMT动态监测系统。
进一步地，EMT基因诱导表达系统为基于四环素正向调节系统构建而成，包括调节载体和反应载体，调节载体表达rtTA，反应载体包括基因表达型和基因敲除型，基因表达型的反应载体中目的基因为EMT相关基因，基因敲除型的反应载体中目的基因为针对EMT相关基因的shRNA。
进一步地，当含有基因表达型的反应载体时，当Dox存在时，rtTA能够与反应载体中的TRE结合，激活启动子，启动EMT相关基因的表达；当撤掉Dox时，rtTA不能与TRE结合，启动子处于失活状态，EMT相关基因不能表达；当含有基因敲除型的反应载体时，当Dox存在时，rtTA能够与反应载体中的TRE结合，激活启动子，启动针对EMT相关基因的shRNA的表达；当撤掉Dox时，rtTA不能与TRE结合，启动子处于失活状态，针对EMT相关基因的shRNA基因不能表达。
进一步地，基因表达型的反应载体中的启动子为PminCMV启动子，基因敲除型的反应载体中的启动子为PminH1启动子。
进一步地，基因表达型的反应载体中的EMT相关基因为EMT诱导分子TGF-β1的cDNA，基因敲除型的反应载体中的针对EMT相关基因的shRNA基因为针对上皮型基因CDH1的shRNA。
进一步地，EMT基因诱导表达系统和EMT动态监测系统共转染进入上皮型肿瘤细胞。
根据本发明的再一方面，提供了一种EMT动态监测系统在EMT动态监测中的应用。
根据本发明的又一方面，提供了一种EMT动态监测的方法。该方法采用EMT动态监测体系进行EMT动态监测。
应用本发明的技术方案，建立基于Cre/loxP重组酶和生物发光技术的EMT动态监测体系，实现对肿瘤EMT动物模型的实时定量监测，突破了肿瘤EMT研究的瓶颈。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了根据本发明一实施方式的基于Tet-On系统的体内EMT诱导系统示意图；
图2示出了根据本发明一实施方式的Tet-On系统的调节载体示意图；
图3示出了根据本发明一实施方式的过表达TGF-β1的EMT诱导系统的载体示意图；
图4示出了根据本发明一实施方式的敲除CDH1的EMT诱导系统的载体示意图；
图5示出了根据本发明一实施方式的基于Cre/loxP重组酶和生物发光技术的EMT体内动态转化报告载体示意图；
图6示出了根据本发明一实施方式的Cre/loxP重组酶的调节载体示意图；
图7示出了根据本发明一实施方式的转换式报告载体示意图；
图8示出了根据本发明另一实施方式的转换式报告载体示意图；以及
图9示出了根据本发明实施例1的实验结果图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
针对背景技术中记载的技术问题，本发明提出了下列技术方案。
总的发明构思如下：设计构建一系列EMT基因的诱导表达载体与EMT动态转化的报告载体，共转染进入特征明确的人源性上皮型肿瘤细胞，筛选稳定表达的克隆，进行EMT表型验证，移植到裸鼠体内的相应的肿瘤原发部位，之后，通过给小鼠服用诱导剂强力霉素(Dox)来调控EMT基因表达载体，从而实现EMT的体内诱导，并因此激活EMT报告载体，得以实时观察EMT的动态转化。这种“体内诱导+实时监测”的EMT实验模型不仅能够能直观的展示EMT的动态发展，还可以准确的衡量诱导载体控制的EMT相关基因对EMT进展的调控力度，从而客观的评价其作为药物靶标的价值。因此，这种“体内诱导+实时监测”模型在均一性、稳定性和可控性方面也具有显著的优势，能够作为药理学研究的工具，探索EMT体内动态变化规律，筛选有效的EMT抑制剂。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种EMT动态监测系统。该EMT动态监测系统基于Cre/LoxP重组酶系统构建而成，包括：Cre基因，置于EMT相关基因的启动子控制之下；转换式报告载体，包括两个相反的LoxP位点，在两个相反的LoxP位点之间插入有第一报告分子与第二报告分子；或转换式报告载体包括一对同向LoxP位点，在一对同向LoxP位点之间插入第一报告分子与终止信号，在LoxP位点之后插入第二报告分子。其中，第一报告分子与第二报告分子可以为不同的荧光素酶或远红外荧光蛋白；优选的，第一报告分子与第二报告分子分别为荧光素酶Fluc2和Rluc8.6，或Rluc8.6和Fluc2。
应用本发明的技术方案，建立基于Cre/loxP重组酶和生物发光技术的EMT动态监测体系，实现对肿瘤EMT动物模型的实时定量监测，突破了肿瘤EMT研究的瓶颈。
根据本发明一种典型的实施方式，Cre基因置于间质型标志物或EMT相关转录因子的启动子控制之下。优选的，间质型标志物包括Vimentin(波形蛋白)、N-cadherin(神经-钙粘蛋白)或Fibronectin(纤维粘连蛋白)，EMT相关转录因子包括Snail、Twist和ZEB1。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种EMT动态监测体系。该EMT动态监测体系包括EMT基因诱导表达系统和上述EMT动态监测系统。例如，EMT基因诱导表达系统可基于Tet-On系统构建，建立基于Tet-On系统的EMT体内诱导方法，可实现对EMT发生发展的可控性诱导，增强肿瘤EMT动物模型的稳定性和均一性。
根据本发明一种典型的实施方式，EMT基因诱导表达系统为基于四环素正向调节系统构建而成，包括调节载体和反应载体，调节载体表达rtTA，反应载体包括基因表达型和基因敲除型，基因表达型的反应载体中目的基因为EMT相关基因，基因敲除型的反应载体中目的基因为针对EMT相关基因的shRNA。具体的，当含有基因表达型的反应载体时，当Dox存在时，rtTA能够与反应载体中的TRE结合，激活启动子，启动EMT相关基因的表达；当撤掉Dox时，rtTA不能与TRE结合，启动子处于失活状态，EMT相关基因不能表达；当含有基因敲除型的反应载体时，当Dox存在时，rtTA能够与反应载体中的TRE结合，激活启动子，启动针对EMT相关基因的shRNA的表达；当撤掉Dox时，rtTA不能与TRE结合，启动子处于失活状态，针对EMT相关基因的shRNA基因不能表达。优选的，基因表达型的反应载体中的启动子为PminCMV启动子，基因敲除型的反应载体中的启动子为PminH1启动子。
根据本发明一种典型的实施方式，基因表达型的反应载体中的EMT相关基因为EMT诱导分子TGF-β1的cDNA，基因敲除型的反应载体中的针对EMT相关基因的shRNA基因为针对上皮型基因CDH1的shRNA。优选的，EMT基因诱导表达系统和EMT动态监测系统共转染进入上皮型肿瘤细胞。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种EMT动态监测系统在EMT动态监测中的应用。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种EMT动态监测的方法。该方法采用上述EMT动态监测体系进行EMT动态监测。
在本发明一种典型的实施方式中，构建基于四环素正向调节系统(Tet-OnSystem)的EMT诱导系统包括：Tet-On系统是一个基因表达调控系统，当受到强力霉素(Dox)作用时，可诱导目的基因的高效表达；而撤走Dox时，目的基因则不被转录。该系统具有高效无毒、开/关严密、调控迅速等特点，适用于体内诱导肿瘤EMT。通过启动子和目的基因的替换，可以将Tet-On系统改造为两种类型：基因表达型和基因敲除型。这样就可以针对任意EMT相关基因，设计表达型载体和敲除型载体，从而实现用Dox来诱导EMT相关基因表达的改变，并最终达到体内诱导肿瘤EMT的目的(参见如图1)。根据需要，可将反应载体中的目的基因替换成任意转录因子、膜受体、激酶、细胞因子，一方面，可以检验已知EMT相关基因对动物模型EMT的调控效果；另一方面，还可以探索未知目的基因对EMT的调节功能。
其中，除了野生型LoxP位点，还可以使用其他突变型的Lox位点
具体的，图1示出了一种基于Tet-On系统的体内EMT诱导系统。其中，A示出了Tet-On系统由调节载体和反应载体两部分构成。调节载体表达rtTA。当Dox存在时，rtTA能够与反应载体中的TRE结合，激活启动子PminCMV，启动EMT相关基因的表达；当撤掉Dox时，rtTA不能与TRE结合，PminCMV处于失活状态，目的基因不能表达，这就构成了Dox诱导的EMT基因表达体系。若将反应载体当中的目的基因替换为针对EMT基因的shRNA，就能构建出Dox诱导的EMT基因敲除体系。通过以上两种体系实现Dox诱导的EMT相关基因表达的改变，从而实现体内诱导EMT。B示出了基于TGF-β1过表达的EMT诱导系统：在反应载体中插入EMT诱导分子TGF-β1的cDNA，将该系统转入上皮型肿瘤细胞后，就能在Dox的诱导下表达TGF-β1，促进EMT发生发展。C示出了基于敲除CDH1的EMT诱导系统：将反应载体中的目的基因替换成针对上皮型基因CDH1的shRNA,该系统转入上皮型肿瘤细胞后，就能在Dox的诱导表达shCDH1，下调CDH1表达，进而促进EMT的发生。
动态监测EMT的载体：Cre基因的启动子设计为间质型标志物Vimentin(波形蛋白)、N-cadherin(神经-钙粘蛋白)或Fibronectin(纤维粘连蛋白)等的启动子，或EMT相关转录因子Snail、Twist、ZEB1等的启动子。上皮型肿瘤细胞中，以上标志物和转录因子不表达，Cre重组酶的转录也不能被激活，细胞表达荧光素酶Rluc8.6,通过氧化底物colenterazine而发光；当细胞发生EMT,开始转录以上标志物或转录因子时，Cre重组酶同时表达，切除loxP位点之间的Rluc8.6与终止信号，发生间质化的肿瘤细胞开始转录表达荧光素酶Fluc2，通过氧化底物D-luciferin而发光。
在本发明一种典型的实施方式中，Tet-On系统的调节载体如图2所示。在载体主要元件见表2。
表2
在本发明一种典型的实施方式中，基于过表达TGF-β1的EMT诱导系统的载体见图3所示，载体主要元件见表3。
表3
在本发明一种典型的实施方式中，基于敲除CDH1的EMT诱导系统的载体见图4所示，载体主要元件见表4。
表4
在本发明一种典型的实施方式中，构建基于Cre/loxP重组酶系统和生物发光技术的EMT动态监测体系包括：Cre/LoxP重组酶系统是经典的基因编辑工具。在Cre/LoxP系统中，Cre重组酶起着“剪刀”的作用，LoxP位点则是DNA分子上的“剪裁标记”，该系统的最基础的作用就是“剪掉”DNA分子上成对LoxP位点之间的基因片段。利用Cre/LoxP重组酶系统设计EMT体内动态转化的报告载体(参见图5)，要点如下：(1)Cre基因启动子的设计：将Cre基因置于EMT相关基因的启动子控制之下,实现伴随EMT发生的Cre蛋白的可控型表达。(2)转换式报告载体的设计：构建两个相反的LoxP位点(LoxP与antiLoxP)，在这对反向的LoxP位点之间插入报告分子A(正向，也可称为第一报告分子)与报告分子B(反向，也可称为第二报告分子)。无Cre重组酶作用时，载体表达报告分子A；在Cre重组酶的作用下，LoxP位点之间的靶基因反方向倒转，报告分子A为反向序列，而报告分子B为正向序列，此时载体表达报告分子B(3)报告分子的设计：使用发光效率高和穿透力强的荧光素酶Fluc2、Rluc8.6作为报告分子，满足体内动态监测需求。将此EMT动态监测系统与基于Tet-On的EMT诱导系统结合起来，我们就可以更为准确的判断Tet-On诱导系统控制的目的基因对EMT进展的调控力度，更为客观的评价该目的基因作为药物靶标的价值。
具体的，图5示出了基于Cre/loxP重组酶和生物发光技术的EMT体内动态转化报告载体。A示出了Cre/loxP重组酶的调节载体：Cre基因的启动子设计为间质型标志物Vimentin、N-cadherin、Fibronectin等的启动子，或EMT相关转录因子Snail、Twist、ZEB1等的启动子。B示出了反应载体：构建两个相反的LoxP位点(LoxP与antiLoxP)，在这对反向的LoxP位点之间插入荧光素酶Rluc8.6(正向)与荧光素酶Fluc2(反向)。上皮型肿瘤细胞中，以上标志物和转录因子不表达，Cre重组酶的转录也不能被激活，细胞表达荧光素酶Rluc8.6,通过氧化底物colenterazine而发光；当细胞发生EMT,开始转录以上标志物或转录因子时，Cre重组酶同时表达，LoxP位点之间的报告分子反方向倒转，发生间质化的肿瘤细胞开始转录表达荧光素酶Fluc2，通过氧化底物D-luciferin而发光。
Cre/loxP重组酶的调节载体见图6所示，载体主要元件见表5。
表5
转换式报告载体见图7所示，载体主要元件见表6。
表6
根据本发明一种典型的实施方式，“EMT动态监测系统”中转换式报告载体的另一种设计(如图8所示)：保留一对同向LoxP位点，在LoxP位点之间插入第一报告分子(也可以成为报告分子A)与终止信号，在LoxP位点之后插入第二报告分子(也可以成为报告分子B)。
下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。
实施例1
本实施例中，没有详细描述的部分具体实施方式部分有描述的以具体实施方式部分描述为准，例如“EMT诱导系统”的载体及构成等，具体实施方法可采用本领域的常规技术手段。
本实施例中的方案如下：
1.过表达TGF-β1的“EMT诱导系统”
在Tet-On系统的反应载体中插入EMT诱导分子TGF-β1的cDNA。
2.构建基于Cre/loxP和生物发光技术的“EMT报告系统”
1)将Cre基因的启动子设计为间质型标志物Vimentin的启动子；
2)构建两个相反的LoxP位点(LoxP与antiLoxP)，在这对反向的LoxP位点之间插入报告分子A(正向)与报告分子B(反向)。无Cre重组酶作用时，载体表达报告分子A；在Cre重组酶的作用下，LoxP位点之间的靶基因反方向倒转，报告分子A为反向序列，而报告分子B为正向序列，此时载体表达报告分子B。其中，报告分子A为海肾荧光素酶Rluc8.6，报告分子B为增强型萤火虫荧光素酶Fluc2。
3.将上述载体都共转染进入人源性上皮型结肠癌肿瘤细胞HT29。为了更直观的考察该报告载体的成像功能，首先选择皮下移植瘤进行试验。在裸鼠皮下接种转染了“EMT诱导系统”与“EMT报告系统”的肿瘤细胞HT29。3周后，Dox饮水饲喂裸鼠7天，Dox浓度为1mg/ml。诱导结束后，裸鼠腹腔分别注射萤光素酶底物D-Luciferin与colenterazine进行发光成像，进一步定量计算得知约16％的上皮细胞发生了EMT转化，转变为间质型肿瘤细胞。证明这个基于Cre/loxP和生物发光技术的EMT体内动态转化报告载体能够准确的定位和定量EMT的动态进展。
图9示出了本实施例中，在Dox作用下，“诱导系统”表达TGF-β1，HT29细胞发生EMT，开始转录Vimentin；“报告系统”中Vimentin的启动子同时被激活，并表达Cre重组酶，loxP位点之间报告分子发生反向倒转，部分发生间质化的HT29细胞开始表达荧光素酶Fluc2，通过氧化底物D-luciferin而发光，这部分细胞主要分布于肿瘤边缘，进一步定量计算得知约16％的上皮细胞发生了EMT转化，转变为间质型肿瘤细胞。未发生EMT转化的细胞仍旧表达Rluc，通过氧化colenterazine发光，这部分细胞占84％大多集中在肿瘤中部。
从以上的描述中，可以看出，本发明实现了如下技术效果：
1.通过体内诱导实现人源性肿瘤在小鼠体内的EMT动态转化
本方案利用四环素正向调节系统(Tet-On System)，通过启动子和目的基因的替换，可以将Tet-On系统改造为两种类型：基因表达型和基因敲除型。这样就可以针对任意EMT相关基因，设计表达型载体和敲除型载体。将载体转染进入人源性的肿瘤细胞，并接种在小鼠的原发脏器上，通过给小鼠服用强力霉素Dox，来诱导EMT相关基因表达的改变，最终诱导小鼠体内的人源性肿瘤细胞发生EMT。该方案的优点在于：
1)符合人源性肿瘤细胞在体内发生EMT的规律。
2)调控性强，可将反应载体中的目的基因替换成任意转录因子、膜受体、激酶、细胞因子，一方面，可以检验已知EMT相关基因对EMT的调控效果；另一方面，还可以探索未知目的基因对EMT的调节作用。
3)EMT发生率高、EMT发生进程短(0.5-2个月)。
4)EMT发病时间与疾病进展程度上的个体差异小，均一性和稳定性好
5)设计操作简单，实验整体成本较低。
2.能够实时定量监测活体动物的肿瘤EMT进展
本方案利用Cre/LoxP重组酶系统设计EMT体内动态转化的报告载体，一方面，将Cre基因置于EMT相关基因的启动子控制之下,实现伴随EMT发生的Cre重组酶的可控型表达；另一方面，利用两个相反的LoxP位点构建转换式报告载体，当无Cre重组酶作用时，载体表达报告分子荧光素酶Rluc8.6；在Cre重组酶的作用下，LoxP位点之间的基因反方向倒转，表达报告分子荧光素酶Fluc2。将该“报告系统”与上述“诱导系统”一起转染进入人源性的肿瘤细胞，并接种在小鼠的原发脏器上，通过给小鼠服用强力霉素Dox，来促进“诱导系统”表达EMT相关基因，引发EMT，EMT的发生随即改变“报告系统”中Cre重组酶的转录活性，使报告分子的表达从Rluc8.6转变为Fluc2。这样就实现了对动物体内肿瘤EMT的实时定量监测。该方案的优点在于：
不仅能实时观察动物体内肿瘤的生长和转移，更重要的是，还可以实现对动物体内肿瘤EMT的实时定量监测，摆脱传统模型的终点研究法的局限，实时动态的监测动物体内肿瘤EMT发生发展过程，揭示其动态转化规律。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种EMT动态监测系统，其特征在于，所述EMT动态监测系统基于Cre/LoxP重组酶系统构建而成，包括：
Cre基因，置于EMT相关基因的启动子控制之下；
转换式报告载体，包括两个相反的LoxP位点，在两个相反的所述LoxP位点之间插入有第一报告分子与第二报告分子；或
所述转换式报告载体包括一对同向LoxP位点，在一对同向所述LoxP位点之间插入第一报告分子与终止信号，在所述LoxP位点之后插入第二报告分子。
2.根据权利要求1所述的EMT动态监测系统，其特征在于，所述第一报告分子与所述第二报告分子为不同的荧光素酶或远红外荧光蛋白；
优选的，所述第一报告分子与所述第二报告分子分别为荧光素酶Fluc2和Rluc8.6，或Rluc8.6和Fluc2。
3.根据权利要求1所述的EMT动态监测系统，其特征在于，所述Cre基因置于间质型标志物或EMT相关转录因子的启动子控制之下。
4.根据权利要求3所述的EMT动态监测系统，其特征在于，所述间质型标志物包括波形蛋白、神经-钙粘蛋白或纤维粘连蛋白，所述EMT相关转录因子包括Snail、Twist和ZEB1。
5.一种EMT动态监测体系，其特征在于，包括EMT基因诱导表达系统和如权利要求1至4中任一项所述的EMT动态监测系统。
6.根据权利要求5所述的EMT动态监测体系，其特征在于，所述EMT基因诱导表达系统为基于四环素正向调节系统构建而成，包括调节载体和反应载体，所述调节载体表达rtTA，所述反应载体包括基因表达型和基因敲除型，基因表达型的所述反应载体中目的基因为EMT相关基因，基因敲除型的所述反应载体中目的基因为针对EMT相关基因的shRNA。
7.根据权利要求6所述的EMT动态监测体系，其特征在于，当含有基因表达型的所述反应载体时，当Dox存在时，rtTA能够与所述反应载体中的TRE结合，激活启动子，启动EMT相关基因的表达；当撤掉Dox时，rtTA不能与TRE结合，启动子处于失活状态，EMT相关基因不能表达；
当含有基因敲除型的所述反应载体时，当Dox存在时，rtTA能够与所述反应载体中的TRE结合，激活启动子，启动针对EMT相关基因的shRNA的表达；当撤掉Dox时，rtTA不能与TRE结合，启动子处于失活状态，针对EMT相关基因的shRNA基因不能表达。
8.根据权利要求7所述的EMT动态监测体系，其特征在于，基因表达型的所述反应载体中的启动子为PminCMV启动子，基因敲除型的所述反应载体中的启动子为PminH1启动子。
9.根据权利要求7所述的EMT动态监测体系，其特征在于，基因表达型的所述反应载体中的EMT相关基因为EMT诱导分子TGF-β1的cDNA，基因敲除型的所述反应载体中的针对EMT相关基因的shRNA基因为针对上皮型基因CDH1的shRNA。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的EMT动态监测体系，其特征在于，所述EMT基因诱导表达系统和所述EMT动态监测系统共转染进入上皮型肿瘤细胞。
11.如权利要求1至4中任一项所述的EMT动态监测系统在EMT动态监测中的应用。
12.一种EMT动态监测的方法，其特征在于，采用如权利要求5至10中任一项所述的EMT动态监测体系进行EMT动态监测。
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