CN111118160B - 结直肠癌诊断中的甲基化标志物 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及结直肠癌诊断中的甲基化标志物。具体而言，本公开提供了一种结直肠癌的诊断试剂，其包含选自以下的任一项或组合：锌指蛋白ZNF322B基因启动子区的甲基化检测试剂、肌钙蛋白TNNI3基因的甲基化检测试剂。与现有技术中的生物标志物相比，ZNF322B和TNNI3基因具有更高的准确性和敏感性以及更好的依从性，将成为结直肠癌诊断的新型生物标志物。

Description

结直肠癌诊断中的甲基化标志物
技术领域
本发明涉及肿瘤的诊断领域。具体而言，涉及一种甲基化标志物及其在结直肠癌早期诊断和/或预后中的用途。
背景技术
结直肠癌是威胁人类健康的重要疾病，其发病率和死亡率在所有恶性肿瘤中位居第三位[1]。早期发现、早期诊断和早期治疗对于改善结直肠癌预后和降低死亡率至关重要[2,3]。
目前，常见的结直肠癌筛查方法包括粪便潜血试验、血清生物标志物和结肠镜检查。结肠镜检查虽然比较直观，但这种侵入性的检测具有费时、昂贵、依从性差等缺点[4]。粪便潜血试验和血清生物标志物虽不具备肠镜的缺点，但其敏感性和特异性低，仅能检出40％-60％患者[5]。因此，迫切需要更敏感、更高效普遍的结直肠癌筛查指标。
DNA甲基化是重要的表观修饰方法，是基因表达的一种有效的调节机制，参与调控机体的生理和病理过程[6-8]。甲基化位点能够干扰转录因子与DNA的结合而导致基因表达的长期抑制[9]。DNA甲基化主要发生在富含CG的区域，包括CpG岛、S-Shore、shelf区域。大约60％的基因可以通过启动子区的CpG位点甲基化发生沉默[10]。DNA甲基化在肿瘤发生中的作用已逐渐得到证实[11-13]。肿瘤细胞呈现抑癌基因的高甲基化和全基因组的低甲基化，导致基因组的不稳定和原癌基因的激活。由此可见，DNA甲基化模式的改变是肿瘤发生的标志，可以用来区分肿瘤细胞和正常细胞[14，15]。
CN108315418A公开了诊断、筛查与预测男性结直肠癌发生的DNA甲基化标志物，所述标志物是基因RPS24转录起始点前后序列的如下三组CpG位点中第(1)组、或者第(1)组与第(2)组或第(3)组的组合发生甲基化：(1)+22、+27和+29；(2)-24、-18、+89和+92；(3)+136。
CN109929919A公开了检测RNF180基因或Reprimo基因甲基化的方法和试剂盒，所述方法、试剂盒可用于结直肠癌的诊断和/或预后。
CN110195107A提供了外周血中癌症检测的核酸体DNA甲基化标志物及其应用。这些标志物包括选自以下CpG位点中的至少一个：以人核糖体DNA重复片段单元参考序列U13369.1为基准，第38974、37148、37013、37028、37076、32936、21740、23407、34657、28277位置处的CpG位点或者经修饰的CpG位点。这些标志物的甲基化状态在肿瘤组织和非肿瘤组织中存在明显差异，在肿瘤组织中低甲基化，这些标志物组合在测试集中区分患者是否患结直肠癌的ROC达到了92％。
CN110438228A提供一种用于预测结直肠癌CRC风险的DNA甲基化标志物集，所述标志物集包括：ESR1、ZNF132、ZNF229、ZNF542和ZNF677。
最近，越来越多的研究者认为外周血白细胞DNA含有表观遗传信息，可以用来评估个体的疾病风险[19-22]。
然而，白细胞DNA甲基化与结直肠癌易感性之间的关系尚未确定。鉴于此，本领域仍需寻找新型高效普遍的结直肠癌生物标志物。
发明内容
根据本公开的一些实施方案，提供了一种结直肠癌的诊断试剂或诊断装置，其包含锌指蛋白ZNF322B基因启动子区的甲基化检测试剂，其能够对锌指蛋白ZNF322B基因启动子区的甲基化水平实现定性和定量检测，例如但不限于确定：ZNF322B基因启动子区的甲基化是否存在、ZNF322B基因启动子区的甲基化状态、ZNF322B基因启动子区的甲基化含量、ZNF322B基因启动子区的甲基化水平。
根据本公开的另一些实施方案，提供了一种结直肠癌的诊断试剂或诊断装置，其包含肌钙蛋白TNNI3基因的甲基化检测试剂，其能够对肌钙蛋白TNNI3基因的甲基化水平实现定性和定量检测，例如但不限于确定：肌钙蛋白TNNI3基因的甲基化是否存在、肌钙蛋白TNNI3基因的甲基化状态、肌钙蛋白TNNI3基因的甲基化含量、肌钙蛋白TNNI3基因的甲基化水平。
根据本公开的另一些实施方案，提供了一种结直肠癌的诊断试剂或诊断装置，其包含以下两者：
-锌指蛋白ZNF322B基因启动子区的甲基化检测试剂、和
-肌钙蛋白TNNI3基因的甲基化检测试剂。
在具体的实施方案中，检测试剂是引物或探针的形式。
一些实施方案中，锌指蛋白ZNF322B基因是指人的锌指蛋白ZNF322B基因或其自然界存在的天然变体，例如但不限于登录号GeneID:387328。
一些实施方案中，锌指蛋白ZNF322B基因启动子区位于转录起始位点前-1500至-1，优选-738位置处的CpG位点。
一些实施方案中，肌钙蛋白TNNI3基因是指人的肌钙蛋白TNNI3基因或其自然界存在的天然变体，更具体地是人的心肌型肌钙蛋白TNNI3基因或其自然界存在的天然变体。例如但不限于登录号Gene ID:7137、GenBank X90780.1。
一些实施方案中，肌钙蛋白TNNI3基因位于转录起始位点后1至5966，优选第489位置处的CpG位点。
在具体的实施方案中，根据本公开的结直肠癌的诊断试剂或诊断装置中，还可以根据需要，任选并入其他辅助试剂，例如可以提及亚硫酸盐转化试剂。技术人员知晓本领域目前常用的检测方案是使用亚硫酸盐将DNA中未甲基化的胞嘧啶C转化为尿嘧啶U，而甲基化的胞嘧啶则保持不变，通过设计特异性的甲基化引物进行甲基化特异性-PCR或者亚硫酸盐测序法。因此，在一些具体的实施方案中，可以包含亚硫酸盐转化试剂。
在具体的实施方案中，根据本公开的结直肠癌的诊断试剂或诊断装置中，还可以根据需要，任选并入其他辅助试剂，例如还可以提及以下的任一种或组合：DNA提取试剂、样本保存液、样本漂洗液、裂解液、提取漂洗液、洗脱液、DNA保护液、结合液、磁珠、阴性质控品、阳性质控品、聚合酶、PCR检测试剂、核苷酸混合物。
在具体的实施方案中，所述引物或所述探针选自以下的任一项或组合：SEQ IDNo.1所示的多核苷酸、SEQ ID No.2所示的多核苷酸、SEQ ID No.3所示的多核苷酸、SEQ IDNo.4所示的多核苷酸、SEQ ID No.5所示的多核苷酸、SEQ ID No.6所示的多核苷酸。
根据本公开的一些实施方案，提供了锌指蛋白ZNF322B基因和/或肌钙蛋白TNNI3基因(各自单独、或组合)作为结直肠癌诊断标记物的用途。
根据本公开的另一些实施方案，提供了锌指蛋白ZNF322B基因甲基化水平和/或肌钙蛋白TNNI3基因甲基化水平(各自单独、或组合)作为结直肠癌诊断标记物的用途；尤其是CpG区域的甲基化水平。
根据本公开的一些实施方案，提供了选自以下的任一项或组合在制备结直肠癌诊断装置中的用途：
-锌指蛋白ZNF322B基因启动子区的甲基化检测试剂、
-肌钙蛋白TNNI3基因的甲基化检测试剂。
在具体的实施方案中，诊断装置选自以下的形式：试剂盒、芯片、测序用试剂。
在具体的实施方案中，甲基化检测是指确定甲基化的状态或甲基化的定量水平。例如，在具体的实施方案中，利用检测试剂确定兴趣基因的特定区域是否存在甲基化、及其定量水平(例如但不限于浓度、分布程度、甲基化率)。
在一些具体的实施方案中，相较于对照水平(未患有结直肠癌的受试者)，受试者中锌指蛋白ZNF322B基因启动子区的甲基化水平降低，指示所述受试者患有结直肠癌或患结直肠癌的风险升高。
在另一些具体的实施方案中，相较于对照水平(未患有结直肠癌的受试者)，受试者中肌钙蛋白TNNI3基因的甲基化水平升高，指示所述受试者患有结直肠癌或患结直肠癌的风险升高。
在又一些具体的实施方案中，相较于对照水平(未患有结直肠癌的受试者)，受试者中锌指蛋白ZNF322B基因启动子区的甲基化水平降低且肌钙蛋白TNNI3基因的甲基化水平升高，指示所述受试者患有结直肠癌或患结直肠癌的风险升高。
在一些具体的实施方案中，相较于对照水平(未患有结直肠癌的受试者)，未见受试者中锌指蛋白ZNF322B基因启动子区的甲基化水平降低，同时未见受试者中肌钙蛋白TNNI3基因的甲基化水平升高，则指示所述受试者未患有结直肠癌、或患结直肠癌的风险低。
附图说明
图1：位点cg14162627及位点cg18838701在48对正常人和结直肠癌患者中的甲基化水平。
图2.ROC曲线分析位点cg14162627和位点cg18838701的诊断效能。N表示正常组；T表示肿瘤组；β-diff＝β肿瘤–β正常。
具体实施方式
以下结合实施例用于进一步描述，但这些实施例并非限制的范围。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例中尽管采用了具体的引物或探针序列，但技术人员知晓任何适当的引物或探针都可用于实施根据本公开的用途或方法，只要其能够特异性互补于兴趣基因上游富含甲基化位点的区域；当确定了感兴趣的靶向区域后，针对它设计引物或探针在技术人员的能力范围内。
1.采集受试者外周静脉血
用EDTA-K2采血管收集受试者静脉血5ml，颠倒摇匀，使其与抗凝剂充分接触，避免凝血。本实施例共纳入136例受试者，其中正常人和结直肠癌患者各68例。
表1.受试者统计
Figure BDA0002382783830000051
Figure BDA0002382783830000061
2.白细胞DNA的提取与质检
(1)取200μl的血液样本加入2ml离心管中，加入200μl缓冲液AL，涡旋15s混合均匀。
(2)加入20μl的蛋白酶K和4μl的RNA酶，再次涡旋混合均匀。
(3)放入恒温金属浴56℃孵化1-3h，直到血液完全裂解。
(4)加入200μl无水乙醇，轻柔混匀后轻微离心。
(5)将上一步所得溶液加入吸附柱(QIAamp Mini spin柱)中，8000rpm离心1min，倒掉废液，将吸附柱放入新的收集管中。
(6)加入500μl缓冲液AW1至吸附柱，8000rpm离心1min，倒掉废液将吸附柱放入新的收集管内。
(7)加入500μl缓冲液AW2至吸附柱，8000rpm离心1min，倒掉废液将吸附柱放入新的收集管内，13000rpm离心3min。
(8)将吸附柱转入一个干净的1.5ml离心管中，可开盖56℃烘干2min。
(9)加入50-100μl缓冲液AE至柱膜中央，室温放置5min，13000rpm离心3min，收集DNA。质检合格后放入-20℃保存。不合格的DNA样本需重新提取。
3.亚硫酸氢盐转化
(1)反应体系配置：
表2.反应体系
Figure BDA0002382783830000071
(2)涡旋混匀，观察DNA保护缓冲液颜色的变化(由绿变蓝)，表明转化过程中充分的混匀和正确的pH值。
(3)在9700型PCR仪上进行转化，程序如下：
表3.PCR程序设置
Figure BDA0002382783830000072
(4)转化结束后，离心，将上述产物转移至1.5mL离心管内。
(5)加入560μl已配置好的缓冲液BL，混匀，短暂离心；将混合液全部转移到EpiTect离心柱。
(6)14000rpm，离心1min；弃废液，离心柱放回收集管上。
(7)加入500μl缓冲液BW，重复上一步。
(8)加入500μl缓冲液BD，盖紧盖子，室温下放置15min。
(9)14000rpm，离心1min；弃废液，离心柱放回收集管上。
(10)加入500μl缓冲液BW，重复上一步。
(11)将柱子转移至一个新的收集管上，14000rpm离心1min，以去除残余物。
(12)将柱子置于56℃加热模块上，开盖放置15min。
(13)将柱子放置在一个新的1.5mL离心管上，加入20μl缓冲液EB，12000rpm离心1min，收集转化后DNA并保存。
4.PCR过程
(1)PCR体系配置：
表4.PCR体系
Figure BDA0002382783830000081
引物信息见下表。
表5.引物序列
引物 针对cg14162627位点
正向 tggagtgttttttttttgtaaaaagt(SEQ ID No.1)
反向 aaaaaaaaaaatacaacccttaccc(SEQ ID No.2)
探针 tgttttttattgaaattaagagtt(SEQ ID No.3)
引物 针对cg18838701位点
正向 aggggttttttaggagatagg(SEQ ID No.4)
反向 ccccacccaacccttacc(SEQ ID No.5)
探针 ccccccccaaacccctca(SEQ ID No.6)
(2)PCR程序：
表6.PCR程序
Figure BDA0002382783830000082
5.焦磷酸测序
需要准备的仪器与耗材：真空工作站，用于混匀磁珠的混匀仪，加热模块(80度)，PSQ 96 Plate Low，96孔板和封膜，96孔加热板。
需要准备的试剂：已扩增好的生物素标记的PCR产物、链霉亲和素包被的磁珠、测序引物(见表5)、纯水、乙醇(70％)、结合缓冲液、退火缓冲液、变性液、冲洗液、PyroMarkGold Q96试剂盒。
(1)单链PCR产物纯化
a.单个样本的最终体积为80μl，包含20μl PCR产物，3μl磁珠，40μl结合缓冲液和17μl纯水。
b.封膜，1400rpm振荡10min。
c.在真空工作站的4个试剂槽中加入相应的试剂：110mL 70％乙醇，90mL变性液，110mL冲洗液，180mL纯水。
d.打开真空泵，清洗探针后关闭真空开关。
e.在PSQ 96 Plate Low加入40μl退火缓冲液，1.6μl测序引物(10μM)。
f.将处理后的PCR产物板和PSQ 96 Plate Low放在相应的位置上，保证方向一致。
g.打开真空开关，将探针小心的放入PCR产物板约15s，以捕获包含模板在内的磁珠。
h.观察PCR产物板，保证所有的磁珠均被转移到探针上；若孔内有残留或者仍有白色的磁珠，探针可能需要被替换。
i.将探针转到液体槽1(含有70％乙醇)，让乙醇冲洗探针约5s，将探针转到液体槽2(含有变性液)，冲洗探针约5s，将探针工具转到液体槽3(含有冲洗液)，冲洗探针约10s，提起探针，垂直90度，数秒。
j.将探针垂直放置在PSQ 96 Plate Low板上方，关掉真空开关；放入板内，摇晃数秒以释放磁珠。
k.将探针工具转到液体槽4(含有纯水)，冲洗10s。
l.关掉真空开关，将探针放回停留位置上。
(2)引物退火步骤：
a.80℃加热PSQ 96 Plate Low板2min。
b.加热完成后取出，放置在室温下备用。
(3)在PyroMark CpG软件中输入样本信息；查阅所需要的酶、底物和核苷酸体积资料。
(4)准备焦磷酸测序用Q96卡夹，具体步骤：
a.将粉末状的酶和底物分别加入620μl纯水进行充分溶解；
b.将Q96卡夹贴有标签页的方向对准操作者，按照(3)中所确定的体积将相应试剂加入相应的孔，确保没有气泡产生。
(5)测序
a.将(2)中准备好的PSQ 96 Plate Low板和(4)中准备的Q96卡夹放入PyroMarkGold Q96测序仪的相应位置；
b.打开PyroMark CpG软件，联机，点击“开始”键进行测序，整理检测结果。
6.结果
本实施例利用Illumina 850K甲基化芯片从853307个CpG位点中筛选出差异显著且稳定的两个位点(其它位点的数据未显示)，分别是锌指蛋白ZNF322B基因启动子区(以下编号为cg14162627位点，位于-738位置)和肌钙蛋白TNNI3基因(以下编号为cg18838701，位于489位置)。
锌指蛋白家族是人类超大的基因家族，据估计人类基因组中约1％的基因编码锌指蛋白。许多锌指蛋白作为转录因子参与细胞增殖、生长和分化的调节。有报道证明，ZNF322属于一种转录激活因子。
为进一步验证，对质检合格的48对血液样本进行亚硫酸盐焦磷酸测序。结果显示：
(1)结直肠癌患者组中的cg14162627的甲基化水平(β肿瘤＝0.481)显著低于正常人对照组中的(β正常＝0.426)，差异甲基化率(β-diff＝β肿瘤-β正常)为-0.055，具有统计学意义(P<0.001)(图1)。
(2)结直肠癌患者组中的cg18838701的甲基化水平(β肿瘤＝0.268)显著高于正常人对照组中的(β正常＝0.189)，差异甲基化率(β-diff＝β肿瘤-β正常)为0.079，具有统计学意义(P<0.001)(图1)。
上述结果与芯片结果一致。cg14162627和cg18838701的甲基化水平均与结直肠癌的发病风险相关。
为了评估cg14162627和cg18838701对结直肠癌的诊断能力，在验证队列中用ROC曲线分析两个CpG位点甲基化水平的效能：
(1)cg14162627的曲线下面积(AUC)为0.67(95％CI，0.557-0.782)，敏感性和特异性均为64.6％。
(2)cg18838701的AUC为0.703(95％CI，0.595-0.811)，敏感性为62.5％，特异性为64.6％。
(3)两者联合诊断的AUC为0.792(95％CI，0.698-0.886)，敏感性和特异性分别为79.1％、70.5％，具有最佳的预测能力(图2)。
目前，在结直肠癌诊断中常用的血清肿瘤标志物是CEA和CA199，但仅能检出40％-60％患者且敏感性低[5]。Sun等人[29]报道CEA的敏感性为53.6％，CA199敏感性为48.8％。与传统的生物标志物CEA和CA199相比，ZNF322B和TNNI3基因具有更高的准确性和敏感性以及更好的依从性，将成为结直肠癌诊断的新型生物标志物。
参考文献
1.Siegel RL,Miller KD,Jemal A:Cancer statistics,2018.CA Cancer J Clin2018,68:7-30.
2.Brenner H,Kloor M,Pox CP:Colorectal cancer.The Lancet 2014,383:1490-1502.
3.Lieberman D:Screening/early detection model for colorectalcancer.Why screen？Cancer 2015,74:2023-2027.
4.Mohammed F:Screening for colorectal cancer.New England Journal ofMedicine 2002,346:1672-1674.
5.Vatandoost N,Ghanbari J,Mojaver M,Avan A,Ghayour-Mobarhan M,Nedaeinia R,Salehi R:Early detection of colorectal cancer:from conventionalmethods to novel biomarkers.Journal of Cancer Research and Clinical Oncology2015,142:341-351.
6.Razin A,Cedar H:DNA methylation and genomic imprinting.Cell 1994,77:473.
7.Rivera CM,Ren B:Mapping human epigenomes.Cell 2013,155:39-55.
8.Schubeler D:Function and information content of DNAmethylation.Nature 2015,517:321-326.
9.Bird A:Bird AP.DNA methylation patterns and epigenetic memory.GenesDev 16:6-21.Genes&Development 2002,16:6-21.
10.Yannick D,Pierre C,Cho WC,
Figure BDA0002382783830000111
T:DNA Methylation and CancerDiagnosis.International Journal of Molecular Sciences 2013,14:15029-15058.
11.Bradner JE,Hnisz D,Young RA:Transcriptional Addiction inCancer.Cell 2017,168:629-643.
12.Flavahan WA,Gaskell E,Bernstein BE:Epigenetic plasticity and thehallmarks of cancer.Science 2017,357:eaal2380.
13.Pan Y,Liu G,Zhou F,Su B,Li Y:DNA methylation profiles in cancerdiagnosis and therapeutics.Clinical and Experimental Medicine 2017,18:1-14.
14.Liang G,Weisenberger DJ:DNA methylation aberrancies as a guide forsurveillance and treatment of human cancers.Epigenetics 2017,12:416-432.
15.Taby R,Issa JP:Cancer epigenetics.CA Cancer J Clin 2010,60:376-392.
16.Poulos RC,Olivier J,Wong JWH:The interaction between cytosinemethylation and processes of DNA replication and repair shape the mutationallandscape of cancer genomes.Nucleic Acids Res 2017,45:7786-7795.
17.Chen S-P,Wu C-C,Huang S-Y,Kang J-C,Chiu S-C,Yang K-L,Pang C-Y:β-Catenin and K-Ras Mutations and RASSF1A Promoter Methylation in TaiwaneseColorectal Cancer Patients.Genetic Testing and Molecular Biomarkers 2012,16:1277-1281.
18.van Engeland M,Roemen GMJM,Brink M,Pachen MMM,Weijenberg MP,de
Figure BDA0002382783830000121
AP,Arends J-W,van den Brandt PA,Fpm de Goeij A,Herman JG:K-rasmutations and RASSF1A promoter methylation in colorectal cancer.Oncogene2002,21:3792-3795.
19.Fang X,Chen C,Cai J,Xiang E,Li J,Chen P:Genome-wide methylationstudy of whole blood cells DNA in men with congenital hypopituitarismdisease.Int J Mol Med 2019,43:155-166.
20.Heiss JA,Brenner H:Epigenome-wide discovery and evaluation ofleukocyte DNA methylation markers for the detection of colorectal cancer in ascreening setting.Clin Epigenetics 2017,9:24.
21.Ally MS,Al-Ghnaniem R,Pufulete M:The Relationship between Gene-Specific DNA Methylation in Leukocytes and Normal Colorectal Mucosa inSubjects with and without Colorectal Tumors.Cancer Epidemiology Biomarkers&Prevention 2009,18:922-928.
22.Hao J,Liu Y,Xu J,Wang W,Wen Y,He A,Fan Q,Guo X,Zhang F:Genome-wideDNA methylation profile analysis identifies differentially methylated lociassociated with ankylosis spondylitis.Arthritis Research&Therapy 2017,19.
23.Issa IA,Noureddine M:Colorectal cancer screening:An updated reviewof the available options.World J Gastroenterol 2017,23:5086-5096.
24.Schreuders EH,Ruco A,Rabeneck L,Schoen RE,Sung JJY,Young GP,Kuipers EJ:Colorectal cancer screening:a global overview of existingprogrammes.Gut 2015,64:1637.
25.Clive ML,Boks MP,Vinkers CH,Osborne LM,Payne JL,Ressler KJ,SmithAK,Wilcox HC,Kaminsky Z:Discovery and replication of a peripheral tissue DNAmethylation biosignature to augment a suicide prediction model.ClinEpigenetics 2016,8:113.
26.Baglietto L,Ponzi E,Haycock P,Hodge A,Bianca Assumma M,Jung CH,Chung J,Fasanelli F,Guida F,Campanella G,et al:DNA methylation changesmeasured in pre-diagnostic peripheral blood samples are associated withsmoking and lung cancer risk.Int J Cancer 2017,140:50-61.
27.Shi XW,Shi BH,Lyu AL,Zhang F,Zhou TT,Guo X:Exploring Genome-wideDNA Methylation Profiles Altered in Kashin-Beck Disease Using Infinium HumanMethylation 450 Bead Chips.Biomed Environ Sci 2016,29:539-543.
28.Chen Z,Li K,Yin X,Li H,Li Y,Zhang Q,Wang H,Qiu Y:Lower Expressionof Gelsolin in Colon Cancer and Its Diagnostic Value in Colon CancerPatients.Journal of Cancer 2019,10:1288-1296.
29.Sun F,Tan Y-A,Gao Q-F,Li S-Q,Zhang J,Chen Q-G,Jiang Y-H,Zhang L,Ying H-Q,Wang X-Z:Circulating fibrinogen to pre-albumin ratio is a promisingbiomarker for diagnosis of colorectal cancer.Journal of Clinical LaboratoryAnalysis 2019,33:e22635.
30.Li Y,Wang Y,Zhang C,Yuan W,Wang J,Zhu C,Chen L,Huang W,Zeng W,WuX,Liu M:ZNF322,a novel human C2H2 Kruppel-like zinc-finger protein,regulatestranscriptional activation in MAPK signaling pathways.Biochem Biophys ResCommun 2004,325:1383-1392.
31.Hu X,Zhang M,Miao J,Wang X,Huang C:miRNA-4317 suppresses humangastric cancer cell proliferation by targeting ZNF322.Cell BiologyInternational 2018,42:923-930.
32.Yu CH XF,Zhang JY,Xu JQ,Li YC:A combination of mRNA expressionprofile and miRNA expression profile identifies detection biomarkers indifferent tumor stages of laryngeal squamous cell carcinoma.European Reviewfor Medical and Pharmacological Sciences 2018,22-N.21:7296-7304。
序列表
<110> 中国医学科学院肿瘤医院
<120> 结直肠癌诊断中的甲基化标志物
<130> 300007CG
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(26)
<223> cg14162627位点正向引物
<400> 1
tggagtgttt tttttttgta aaaagt 26
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> cg14162627位点反向引物
<400> 2
aaaaaaaaaa atacaaccct taccc 25
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> 针对cg14162627位点的探针
<400> 3
tgttttttat tgaaattaag agtt 24
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> cg18838701位点正向引物
<400> 4
aggggttttt taggagatag g 21
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> cg18838701位点反向引物
<400> 5
ccccacccaa cccttacc 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> 针对cg18838701位点的探针
<400> 6
ccccccccaa acccctca 18

Claims (6)

1. 以下试剂的组合在制备结直肠癌的诊断装置中的用途：
- 锌指蛋白ZNF322B基因启动子区的甲基化检测试剂、
- 肌钙蛋白TNNI3基因的甲基化检测试剂；
其中，
所述检测试剂是引物或探针；
所述锌指蛋白ZNF322B基因启动子区的甲基化位于转录起始位点前第-738的位置；
所述肌钙蛋白TNNI3基因的甲基化位于转录起始位点后第489的位置。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述诊断装置选自以下的形式：试剂盒、芯片。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述甲基化检测试剂确定甲基化的状态或甲基化的定量水平。
4.根据权利要求1所述的用途，其中：
相较于对照水平，受试者中锌指蛋白ZNF322B基因启动子区的甲基化水平降低，指示所述受试者患有结直肠癌或患结直肠癌的风险升高；
所述对照水平是指在未患有结直肠癌的受试者中的甲基化水平。
5.根据权利要求1所述的用途，其中：
相较于对照水平，受试者中肌钙蛋白TNNI3基因的甲基化水平升高，指示所述受试者患有结直肠癌或患结直肠癌的风险升高；
所述对照水平是指在未患有结直肠癌的受试者中的甲基化水平。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的用途，其中：
针对锌指蛋白ZNF322B基因启动子区的引物对是SEQ ID No.1所示的多核苷酸和SEQID No.2所示的多核苷酸；或
针对锌指蛋白ZNF322B基因启动子区的探针是SEQ ID No.3所示的多核苷酸；或
针对肌钙蛋白TNNI3基因的甲基化的引物对是SEQ ID No.4所示的多核苷酸和SEQ IDNo.5所示的多核苷酸；或
针对肌钙蛋白TNNI3基因的甲基化的探针是SEQ ID No.6所示的多核苷酸。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012116019A1 (en) * 2011-02-22 2012-08-30 Brown University Compositions and methods for detecting bladder cancer

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2011105570A1 (ja) * 2010-02-26 2013-06-20 シスメックス株式会社 生体試料中の癌細胞の存否を判定する方法、判定用分子マーカーおよびキット
US9624549B2 (en) * 2012-01-27 2017-04-18 Cytognomix Inc. Stable gene targets in breast cancer and use thereof for optimizing therapy

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012116019A1 (en) * 2011-02-22 2012-08-30 Brown University Compositions and methods for detecting bladder cancer

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DNA methylation levels and long-term trihalomethane exposure in drinking water: an epigenome-wide association study;Lucas A Salas et al;《Epigenetics》;20150731;第10卷(第7期);表2以及第651页第1段 *
Lucas A Salas et al.DNA methylation levels and long-term trihalomethane exposure in drinking water: an epigenome-wide association study.《Epigenetics》.2015,第10卷(第7期), *

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