JP2015006163A - 肝細胞癌に関する情報の取得方法、ならびに肝細胞癌に関する情報を取得するためのマーカーおよびキット - Google Patents

肝細胞癌に関する情報の取得方法、ならびに肝細胞癌に関する情報を取得するためのマーカーおよびキット Download PDF

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Abstract

【課題】肝細胞癌に特異的な新規マーカーを用いて、被験者の生体試料から抽出したDNAのメチル化状態を解析し、その解析結果に基づいて被験者の肝細胞癌に関する情報を取得する方法を提供することを課題とする。
【解決手段】被験者の生体試料から抽出したDNAに含まれるCELF6およびRNF135から選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化の状態を解析し、その解析結果に基づいて被験者の肝細胞癌に関する情報を取得することにより、上記の課題を解決する。
【選択図】なし

Description

本発明は、被験者の肝細胞癌に関する情報の取得方法に関する。また、本発明は、その方法に用いられるマーカーおよびキットに関する。
肝細胞癌は原発性肝癌の一つであり、肝細胞から発生する悪性腫瘍である。肝細胞癌は、初期の段階では症状がほとんどないが、腹部のしこり、突然の腹痛、黄疸などの自覚症状が現れる頃には重症化している場合が多い。他方で、肝細胞癌は肝炎ウィルスに起因する慢性肝炎もしくは肝硬変の患者に頻発することが知られているので、これらの患者をハイリスク群として設定し、積極的に検査を行うことによって、肝細胞癌の早期発見が試みられている。
肝細胞癌の検査では、血液中の腫瘍マーカーの測定が行われている。腫瘍マーカーとしては、現在、AFP(α-fetoprotein)、PIVKA-II(protein induced by vitamin-K absence II)などが利用されている。これらの腫瘍マーカーの検査は、肝細胞癌患者のスクリーニングに使用されているが、感度、特異度ともに十分ではない。例えば、AFPの検査では比較的小さい肝細胞癌の場合では異常値を示さないことがあり、PIVKA-IIの検査ではビタミンKの欠乏またはワーファリンの服用により偽陽性を示すことがある。それゆえ、肝細胞癌の確定診断には、腫瘍マーカーの検査に加えて、超音波検査、CTおよびMRIなどの画像検査が行われている。
他方で、近年、新たな癌の診断方法として、遺伝子情報に基づく方法が研究されている。そのような方法としては、例えば、DNAのメチル化に関する情報に基づく方法が挙げられる。この方法では、所定の遺伝子の塩基配列中のCpG部位(5'-(CG)-3')をマーカーとして用いる。そして、該マーカーのメチル化状態の解析結果に基づいて癌細胞の存否などの情報を取得し、これを指標にして癌の診断が行われる。
肝細胞癌においても、DNAのメチル化解析を利用した癌の判定方法の研究・開発が行なわれている。例えば、Lee S.らの文献には、GSTP1、p16(CDKN2Aとも呼ばれる)、E-cadherin(CDH1とも呼ばれる)などの遺伝子が非癌性肝組織ではメチル化されていないが、肝細胞癌組織では高度にメチル化されていることが開示されている(非特許文献１参照)。
Lee S.ら、Am. J. Pathol. vol. 163, no. 4, p. 1371-1378 (2003)
上述のように、肝細胞癌において異常メチル化を示す遺伝子がいくつか報告されているが、それらの中には、肝細胞癌とは異なる種類の癌においてもある程度メチル化されている遺伝子が含まれている。しかし、肝細胞癌を含む複数の種類の癌においてメチル化されている遺伝子をマーカーとして用いてメチル化解析を行った場合、解析結果から得られた情報には、肝細胞癌に関する情報のみならず、他の種類の癌に関する情報も含まれる可能性がある。例えば、解析結果に基づいて試料中に癌細胞が存在するという情報を得たとしても、その癌細胞が肝細胞癌に由来するのか、または、他の種類の癌に由来するのかを判別することは困難である。
このように、マーカーのメチル化解析により肝細胞癌に関する情報を取得するためには、該マーカーの肝細胞癌への特異性が非常に重要な要素となる。それゆえ、肝細胞癌に由来する癌細胞を特異的に検出することを可能にするような、肝細胞癌に特異的な新規マーカーの開発が望まれている。
そこで、本発明は、そのような新規マーカーを同定し、そのマーカーについてメチル化の状態を解析することにより、肝細胞癌由来の癌細胞に関する情報の取得方法を提供することを目的とする。また、本発明は、その方法に好適に用いられるキットを提供することを目的とする。
本発明者らは、肝細胞癌の癌部組織から得たDNAに特異的にメチル化が認められる遺伝子領域を、新規マーカーとして同定した。そして、本発明者らは、これらのマーカーについてメチル化状態を解析して得られた結果に基づいて、肝細胞癌に由来する癌細胞と、その他の細胞(正常組織の細胞、非癌部組織の細胞、および、肝細胞癌とは異なる種類の癌に由来する癌細胞)とを明確に区別できることを見出して、本発明を完成した。
すなわち、本発明によれば、
被験者から採取した生体試料からDNA試料を調製する工程と、
調製工程で得られたDNA試料に含まれるCELF6(CUGBP, Elav-like family member 6)およびRNF135(Ring finger protein 135)から選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化の状態を解析する工程と、
解析工程で得られた解析結果に基づいて、上記の被験者の肝細胞癌に関する情報を取得する工程と
を含む、肝細胞癌に関する情報の取得方法が提供される。
本発明によれば、CELF6およびRNF135の各遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位から選択される少なくとも１つである、メチル化解析により肝細胞癌に関する情報を取得するためのマーカーが提供される。
また、本発明によれば、CELF6およびRNF135の各遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位から選択される少なくとも１つのメチル化の状態を解析するためのプライマーセットを含む、肝細胞癌に関する情報を取得するためのキットが提供される。
さらに、本発明によれば、CELF6またはRNF135遺伝子のプロモータ領域の全部またはその一部の連続する塩基配列からなり且つ該プロモータ領域中の少なくとも１つのCpG部位およびCpG部位を構成しない少なくとも１つのシトシンを含む単離DNAをバイサルファイト処理して得られるポリヌクレオチドである、肝細胞癌に関する情報を取得するためのマーカーが提供される。
本発明は、肝細胞癌に関する情報の取得を可能にする新規マーカーを提供することができる。また、本発明は、そのようなマーカーについてメチル化の状態を解析することにより、被験者の肝細胞癌に関する情報を取得するための方法およびキットを提供することができる。
正常肝臓組織、ならびに肝細胞癌の癌部組織および非癌部組織から抽出したDNAにおけるCELF6遺伝子のプロモータ領域のメチル化陽性率を示すグラフである。 正常肝臓組織、ならびに肝細胞癌の癌部組織および非癌部組織から抽出したDNAにおけるRNF135遺伝子のプロモータ領域のメチル化陽性率を示すグラフである。 種々の臨床検体のメチル化データから算出した、CELF6遺伝子のプロモータ領域のメチル化陽性率を示すグラフである。 種々の臨床検体のメチル化データから算出した、RNF135遺伝子のプロモータ領域のメチル化陽性率を示すグラフである。 種々の臨床検体のメチル化データから算出した、既知のマーカー遺伝子CDH1のプロモータ領域のメチル化陽性率を示すグラフである。 種々の臨床検体のメチル化データから算出した、既知のマーカー遺伝子CDKN2Aのプロモータ領域のメチル化陽性率を示すグラフである。 種々の臨床検体のメチル化データから算出した、既知のマーカー遺伝子GSTP1のプロモータ領域のメチル化陽性率を示すグラフである。 正常肝臓組織、ならびに肝細胞癌の癌部組織および非癌部組織から抽出したDNAを、CELF6およびRNF135の各プライマーセットを用いてメチル化特異的PCR(MSP)法により増幅した結果を示す写真である。 健常人血漿および肝細胞癌患者の血漿から抽出したDNAを、CELF6およびRNF135の各プライマーセットを用いてMSP法により増幅した結果を示す写真である。 肝細胞癌以外の癌組織および正常組織から抽出したDNAを、CELF6、RNF135および精度管理のための各プライマーセットを用いてMSP法により増幅した結果を示す写真である。 肝細胞癌以外の癌組織および正常組織から抽出したDNAを、CELF6のプライマーセットを用いてMSP法により増幅して得られた増幅産物のバンド強度を示すグラフである。 肝細胞癌以外の癌組織および正常組織から抽出したDNAを、RNF135のプライマーセットを用いてMSP法により増幅して得られた増幅産物のバンド強度を示すグラフである。 肝細胞癌以外の癌組織および正常組織から抽出したDNAを、精度管理用プライマーセットを用いてMSP法により増幅して得られた増幅産物のバンド強度を示すグラフである。 被験者の肝細胞癌に関する情報を提供するための判定装置の一例を示した概略図である。 図８の判定装置の機能構成を示すブロック図である。 図８に示された判定装置のハードウェア構成を示すブロック図である。 図８に示された判定装置を用いた、被験者の肝細胞癌に関する情報を提供するための判定のフローチャートである。
本発明の肝細胞癌に関する情報の取得方法(以下、単に「方法」ともいう)では、まず、被験者から採取した生体試料からDNA試料を調製する。
本実施形態において、生体試料は、被験者のDNAを含む生体由来の試料であれば特に制限されないが、好ましくはゲノムDNAを含む試料、例えば臨床検体である。臨床検体としては、例えば、体液、尿、手術または生検により採取した組織などが挙げられる。体液としては、血液、血清、血漿、リンパ液、腹水、骨髄液、乳頭分泌液などが挙げられる。また、被検者から採取した細胞または組織を培養して得られた培養物を生体試料として用いることもできる。
DNA試料の調製は、生体試料からDNAを抽出することにより行うことができる。生体試料からのDNAの抽出方法は当該技術において公知である。例えば、生体試料と、細胞または組織を可溶化する界面活性剤(例えばコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウムなど)を含む処理液とを混合し、得られた混合液に物理的処理(撹拌、ホモジナイズ、超音波破砕など)を施して、生体試料に含まれるDNAを該混合液中に遊離させることによって、DNAを抽出することができる。この場合、混合液を遠心分離して細胞破片を沈殿させ、遊離したDNAを含む上清を後述の解析工程に用いることが好ましい。また、得られた上清を当該技術において公知の方法により精製してもよい。なお、生体試料からのDNAの抽出および精製は、市販のキットを用いて行うこともできる。
上記の調製工程は、抽出したDNAを断片化する工程をさらに含むことが好ましい。DNAを適当な長さに断片化することにより、後述するメチル化DNA免疫沈降(MeDIP)法および非メチル化シトシン変換処理を効率よく行うことができる。
DNAの断片化は、超音波処理、アルカリ処理、制限酵素処理などにより行うことができる。例えば、アルカリ処理によりDNAの断片化を行なう場合は、DNA溶液に水酸化ナトリウム溶液を終濃度0.1〜1.0 Ｎとなるよう添加し、10〜40℃で５〜15分間インキュベーションすることによりDNAが断片化される。また、制限酵素処理によりDNAの断片化を行なう場合、用いる制限酵素はDNAの塩基配列に基づいて適宜選択され、例えばMseIやBamHIなどが用いられる。
本発明の方法では、上記の調製工程で得られたDNAに含まれるCELF6およびRNF135から選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化の状態を解析する。
なお、本明細書において、「CpG部位」とは、塩基配列中のシトシン(C)とグアニン(G)とが5'から3'への方向にこの順序で隣り合った配列の部位を意味する。なお、CpGの「p」の文字は、シトシンとグアニンとの間のホスホジエステル結合を表わす。
また、本明細書において、「メチル化の状態を解析する」とは、CELF6およびRNF135から選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化の有無を解析すること、または該プロモータ領域のメチル化の頻度を解析することを意味する。
当該技術において、CELF6およびRNF135の各遺伝子のプロモータ領域の塩基配列自体は公知である。これらの塩基配列は、例えば米国国立医学図書館の国立生物情報センター(National Center for Biotechnology Information：NCBI)により提供されるデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)などの公知のデータベースから知ることができる。上記の遺伝子の各種ID番号を、表１に示す。また、各遺伝子のプロモータ領域の塩基配列を、それぞれ配列番号１および２として示す。
本発明の実施形態において、解析工程は、CELF6およびRNF135から選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のうち、少なくとも１つのCpG部位のメチル化の有無を解析する工程であってもよい。ここで、「メチル化の有無」とは、上記のプロモータ領域に存在するCpG部位のシトシンがメチル化されているか否かを意味する。この実施形態では、解析するCpG部位は１つであってもよいが、複数のCpG部位のメチル化の有無を解析することが好ましい。なお、複数のCpG部位は、１つの遺伝子のプロモータ領域から選択してもよいし、複数の遺伝子のプロモータ領域のそれぞれの中から選択してもよい。
本発明の別の実施形態において、解析工程は、CELF6およびRNF135から選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモータ領域におけるメチル化の頻度を解析する工程であってもよい。ここで、「メチル化の頻度」とは、上記のプロモータ領域に存在するCpG部位の数に対する、メチル化されたCpG部位の数の割合を意味する。この実施形態では、解析対象は、上記のプロモータ領域の全部であってもよいし、少なくとも１つのCpG部位を含む一部分であってもよい。なお、解析対象は、CpG部位を１つしか含んでいなくてもよいが、複数のCpG部位を含んでいることが好ましい。また、解析対象は、上記の遺伝子のうちのいずれか１つのプロモータ領域から決定してもよいし、複数の遺伝子のプロモータ領域から決定してもよい。
なお、CELF6およびRNF135の各遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位の位置および数は既知であるので、本発明の実施形態においては、該プロモータ領域におけるメチル化されたCpG部位の数自体をメチル化の頻度として利用できる。
上記のメチル化の頻度は、DNA中のCpG部位のメチル化状態を、後述するMassARRAY(登録商標)などの質量分析法で解析することにより得られる「メチル化スコア」であってもよい。MassARRAY(登録商標)では、DNA断片を測定して、メチル化DNA断片に由来するピークと非メチル化DNA断片に由来するピークとの面積比からメチル化スコアが算出される。
本発明の実施形態では、CELF6およびRNF135の各遺伝子のプロモータ領域中のいずれのCpG部位、あるいは該CpG部位を含むいずれの領域を解析対象とするかについては、特に限定されない。なお、これらの遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位の位置および数は既知であるので、解析対象とするCpG部位または範囲は、後述の公知の解析方法を用いたルーチンの実験の結果に基づいて当業者が適宜決定することができる。
メチル化の状態を解析する方法は、当該技術において種々の方法が公知である。本発明の方法では、いずれの解析方法を用いるかは特に限定されないが、好ましくは、メチル化DNAと非メチル化DNAとを区別する工程と、DNAを増幅する工程と、メチル化DNAおよび／または非メチル化DNAを検出する工程とを含む方法である。
メチル化DNAと非メチル化DNAとを区別する工程としては、メチル化感受性制限酵素処理、MeDIP法、非メチル化シトシン変換処理などを行う工程が挙げられる。
DNAを増幅する工程としては、PCR法、定量的PCR法、IVT(in vitro transcription)増幅法、SPIA(商標)増幅法などを行う工程が挙げられる。
メチル化DNAおよび／または非メチル化DNAを検出する工程としては、電気泳動法、シークエンス解析法、マイクロアレイ解析法、質量分析法、サザンハイブリダイゼーションなどを行う工程が挙げられる。
MeDIP法とは、抗メチル化シトシン抗体もしくは抗メチル化シチジン抗体、またはメチル化DNA結合タンパク質を特異的に認識する抗体を用いる免疫沈降により、生体試料に含まれるメチル化DNAを濃縮する方法である。本発明の実施形態において、解析工程は、抽出工程で得られたDNAに含まれるメチル化DNAをMeDIP法により濃縮し、得られたメチル化DNAのメチル化状態を解析する工程であってもよい。また、MeDIP法により濃縮したメチル化DNAを、IVT増幅法などにより増幅し、得られた増幅産物について、マイクロアレイを用いてメチル化状態を解析することもできる。このような解析方法は、MeDIP on chip法と呼ばれる。
非メチル化シトシン変換処理とは、生体試料から抽出したDNAと非メチル化シトシン変換剤とを反応させることにより、該DNA中の非メチル化シトシンを他の塩基(ウラシル、チミン、アデニンまたはグアニン)に変換する処理である。ここで、非メチル化シトシン変換剤とは、DNAと反応して該DNA中の非メチル化シトシンを他の塩基(ウラシル、チミン、アデニンまたはグアニン)に変換できる物質である。このような非メチル化シトシン変換剤としては、例えば亜硫酸水素のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの亜硫酸水素塩(バイサルファイト)が好適に用いられる。
バイサルファイトを用いる処理では、DNA中の非メチル化シトシンは、脱アミノ化反応によりウラシルに変換されるが、メチル化シトシンには、このような塩基の変換が起こらない。
したがって、DNA中のCpG部位のメチル化状態の違いは、バイサルファイトを用いる非メチル化シトシン変換処理によって、塩基配列の違い(CおよびU)に変換される。なお、バイサルファイトによる非メチル化シトシン変換処理は、バイサルファイト処理と呼ばれる。
バイサルファイト処理を行なう場合、バイサルファイトの添加量(濃度)は、DNA中の非メチル化シトシンを十分に変換できる程度であれば特に限定されないが、例えば、DNAを含む溶液中の終濃度として１M以上、好ましくは１〜15 M、より好ましくは３〜10 Mである。また、バイサルファイトを添加した後のインキュベーションの条件(温度および時間)は、バイサルファイトの添加量に応じて適宜設定できるが、例えば、バイサルファイトを終濃度６Mで添加した場合、50〜80℃で10〜90分間インキュベーションする。
DNAに含まれるCpG部位のメチル化状態は、バイサルファイト処理したDNAをシークエンス解析して、本来の塩基配列との違いを検出することにより解析できる。この方法は、バイサルファイトシークエンス法と呼ばれている。
また、CpG部位のメチル化状態は、質量分析法によって解析することができる。具体的には、バイサルファイト処理したDNAを鋳型として、解析対象とする塩基配列に特異的なプライマーセットを用いてPCR増幅した後、得られたPCR産物をさらにIVT増幅することにより、メチル化シトシンおよびウラシルはそれぞれグアニン(G)およびアデニン(A)となる。得られたIVT増幅産物をRNase Aで切断し、得られた核酸断片間におけるGとAとの質量差(16 Da)をMALDI-TOF(マトリックス支援レーザ脱離イオン化−飛行時間)型質量分析装置を用いて検出することにより、DNAのメチル化状態を解析できる。この方法はMassARRAY(登録商標)解析と呼ばれる。
IVT産物においてRNase Aによって切断される部位は、任意の塩基と該塩基に隣接するウラシル(U)またはチミン(T)との間であることが知られている。したがって、RNase Aによって切断されたIVT産物の塩基配列および質量は、鋳型として用いたDNAの塩基配列から予測することが可能である。したがって、MassARRAY(登録商標)で得られた各ピークについて、鋳型としたDNAの塩基配列のどの部分に由来するかを同定できる。例えば、DNA断片中の１か所のCpG部位がメチル化していた場合、MassARRAY(登録商標)で得られるピークは、高質量側へ16 Daシフトする。複数のCpG部位を有するDNA断片の解析では、例えば、該DNA断片中のCpG部位が２か所メチル化していた場合は32 Daシフトし、３か所メチル化していた場合は48 Daシフトする。
MassARRAY(登録商標)などの質量分析法では、測定したDNA断片のメチル化スコアを算出することができる。例えば、所定の配列のDNA断片について、分析で得られたチャートにおける非メチル化DNA断片のピークとメチル化DNA断片のピークとの面積比が１：３であった場合、このDNA断片のメチル化スコアは、３／(１+３)＝0.75より、0.75となる。なお、メチル化スコアは、理論上、DNA断片が有する全てのCpG部位がメチル化している場合は１であり、全てのCpG部位がメチル化していない場合は０である。
CpG部位のメチル化状態は、メチル化特異的PCR(MSP)法によって解析することができる。MSP法とは、バイサルファイト処理したDNAを、後述するプライマーセットを用いてPCR増幅を行い、PCR産物の有無を確認することによって、CpG部位のメチル化状態(メチル化の有無)を解析する方法である。
MSP法では、解析対象のCpG部位がメチル化されている(すなわち、シトシンがウラシルに変換されていない)塩基配列は増幅できるが、CpG部位がメチル化されていない(すなわち、該シトシンがウラシルに変換されている)塩基配列は増幅できないプライマーセットを用いる。このようなプライマーセットを用いるMSP法では、PCR産物が存在する場合に、解析対象のCpG部位がメチル化されていることがわかる。
また、MSP法は、解析対象のCpG部位のシトシンがウラシルに変換されていない塩基配列は増幅できないが、CpG部位のシトシンがウラシルに変換されている塩基配列は増幅できるプライマーセットを用いて行なうこともできる。この場合、PCR産物が存在しない場合に、解析対象のCpG部位がメチル化されていることがわかる。
MSP法で用いられるプライマーセットに含まれる各プライマーは、解析対象のCpG部位を含む塩基配列に応じて当業者が適宜設計できるが、プライマーの3'末端またはその付近に、解析対象のCpG部位のシトシンを含むように設計することが好ましい。
CpG部位のメチル化状態は、マイクロアレイを用いて解析することもできる。この場合、解析用マイクロアレイは、CELF6およびRNF135の各遺伝子のプロモータ領域の塩基配列に相補的な核酸プローブを、基板上に固定して作製できる。なお、このようなマイクロアレイは、当該技術において公知の方法により作製できる。
マイクロアレイによる解析では、生体試料から抽出したDNAは、当該技術において公知の標識物質により標識されていることが好ましい。よって、本発明の判定方法は、抽出したDNAを標識する工程をさらに含むことが好ましい。この標識工程は、生体試料中の全てのDNAを標識できるので、上記のDNA増幅工程の後に行われるのが有利である。なお、標識物質としては、蛍光物質、ビオチンなどのハプテン、放射性物質などが挙げられる。また、蛍光物質としては、Cy3、Cy5、FITC、Alexa Fluor(商標)などが挙げられる。このようにDNAを標識することにより、マイクロアレイ上のプローブからのシグナルの測定が容易になる。なお、DNAをこれらの標識物質で標識する方法は、当該技術において公知である。
上記のシグナルは、マイクロアレイの種類に応じて適切なシグナルであり得る。例えば、シグナルは、マイクロアレイの各プローブとハイブリダイズしたDNA断片が存在する場合に発生する電気的シグナルであってもよいし、上記のように解析対象のDNAが標識されている場合は、標識物質から生じる蛍光、発光などのシグナルであってもよい。シグナルの検出は、通常のマイクロアレイ測定装置に備えられたスキャナーにより行うことができる。スキャナーとしては、例えば、GeneChip(登録商標)Scanner3000 7G(Affymetrix社)、Illumina(登録商標) BeadArray Reader (Illumina社)などが挙げられる。
本発明の方法では、上記の解析工程で得られた解析結果に基づいて、被験者の肝細胞癌に関する情報を取得する。ここで、肝細胞癌に関する情報とは、肝細胞癌の診断の指標となり得る情報であれば特に限定されないが、好ましくは、被験者における肝細胞癌の発生もしくは状態またはその両方を示す情報である。そのような情報としては、例えば、被験者から採取した生体試料における肝細胞癌由来の癌細胞の存否、肝細胞癌が被験者に発生している可能性、肝細胞癌がこれから被験者に発生する危険性などが挙げられる。また、被験者に肝細胞癌が発生している場合は、肝細胞癌に関する情報として、被験者の予後、癌の進行度(ステージ)などが挙げられる。なお、上記の解析工程で得られた解析結果に基づいて取得した肝細胞癌に関する情報は、肝細胞癌とは異なる種類の癌に関する情報を実質的に含まない。これは、本発明の方法でマーカーとして用いる上記の遺伝子のプロモータ領域が、肝細胞癌に由来する癌細胞に特異的にメチル化していることによる。
本発明の実施形態では、解析工程において、メチル化されたCpG部位が有るという解析結果が得られた場合、肝細胞癌が発生していることを示唆する情報、または肝細胞癌の状態が不良である(もしくは、悪い)という情報を取得することができる。
また、本発明の別の実施形態では、解析工程で得られたメチル化の頻度が所定の閾値より高いという結果が得られた場合、そのような情報を取得することができる。
より具体的には、生体試料中に肝細胞癌由来の癌細胞が存在するという情報を取得することができる。あるいは、被験者が肝細胞癌になる危険性が高いという情報、または肝細胞癌がすでに発生しているという情報を取得することができる。また、被験者に肝細胞癌が発生しているならば、被験者の予後が不良である(もしくは、悪い)という情報、または癌の状態がより進行したステージであるという情報を取得することができる。
反対に、解析工程において、メチル化されたCpG部位が無いという結果が得られた場合、肝細胞癌が発生していないことを示唆する情報または肝細胞癌の状態が良好であるという情報を取得することができる。あるいは、解析工程で得られたメチル化の頻度が所定の閾値より低いという結果が得られた場合に、そのような情報を取得することができる。より具体的には、生体試料中に肝細胞癌に由来する癌細胞が存在しないという情報を取得することができる。あるいは、被験者が肝細胞癌になる危険性が低いという情報、または肝細胞癌はまだ発生していないという情報を取得することができる。また、被験者に肝細胞癌が発生しているならば、被験者の予後が良好であるという情報、または癌の状態がそれほど進行したステージではないという情報を取得することができる。
なお、所定の閾値は特に限定されず、種々の生体試料についてのデータの蓄積により経験的に設定することができる。あるいは、次のようにして所定の閾値を設定してもよい。まず、肝細胞癌に由来する癌細胞を含まないことが予め確認されている生体試料(正常肝組織または正常肝細胞)、および、肝細胞癌に由来する癌細胞を含む生体試料のそれぞれから抽出したDNAについて、メチル化の頻度を解析する。次いで、得られた解析結果に基づいて、癌細胞を含まない生体試料のメチル化の頻度よりも高く、且つ、癌細胞を含む生体試料のメチル化の頻度よりも低い範囲から閾値を設定する。好ましくは、癌細胞を含まない生体試料と癌細胞を含む生体試料とを高精度に区別し得る値を、閾値として設定する。
本発明の範囲には、メチル化解析により肝細胞癌に関する情報を取得するためのマーカー(以下、単に「マーカー」ともいう)も含まれる。本発明のマーカーは、CELF6およびRNF135の各遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位から選択される少なくとも１つである。
本発明の実施形態では、被験者から採取した生体試料から調製したDNA試料におけるマーカーのメチル化状態を解析し、得られた解析結果に基づいて該被験者の肝細胞癌に関する情報を取得することができる。なお、メチル化状態の解析および肝細胞癌の情報の取得については、これまでに述べたことと同様である。
また、本発明の範囲には、肝細胞癌に関する情報を取得するためのキット(以下、単に「キット」ともいう)も含まれる。本発明のキットは、CELF6およびRNF135の各遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位から選択される少なくとも１つのメチル化の状態を解析するためのプライマーセットを含む。
本発明の実施形態において、キットに含まれるプライマーセットは、MassARRAY(登録商標)などの質量分析法、MSP法、バイサルファイトシーケンス法などのPCR増幅を伴う解析方法によりCpG部位のメチル化の状態を解析するためのプライマーセットであればよいが、好ましくはMassARRAY(登録商標)などの質量分析法またはMSP法で用いられるプライマーセットである。なお、プライマーセットに含まれる各プライマーの塩基配列は、上記のプロモータ領域の塩基配列に応じて当業者が適宜設定できる。MSP法で用いられるプライマーセットとしては、例えば、配列番号３および配列番号４の塩基配列であるプライマーセット、ならびに配列番号５および配列番号６の塩基配列であるプライマーセットが挙げられる。
また、本発明の範囲には、肝細胞癌に関する情報を取得するためのマーカーとして、CELF6またはRNF135遺伝子のプロモータ領域の全部またはその一部の連続する塩基配列からなり且つ該プロモータ領域中の少なくとも１つのCpG部位およびCpG部位を構成しない少なくとも１つのシトシンを含む単離DNAをバイサルファイト処理して得られるポリヌクレオチドを用いることも含まれる(以下、単に「ポリヌクレオチド」ともいう)。ここで、CpG部位を構成しないシトシンとは、CpG部位に含まれるシトシン以外であればよく、例えば、シトシン(C)と、アデニン(A)、チミン(T)またはシトシン(C)とが5'から3'への方向にこの順序で隣り合った塩基配列(すなわち、CA、CTまたはCC)中のシトシンが挙げられる。
本発明のポリヌクレオチドにおいては、上記の単離DNAのバイサルファイト処理により、該単離DNA中の非メチル化シトシンはウラシルに変換されているが、メチル化シトシンはそのままとなっている。本発明の実施形態では、このようなポリヌクレオチド中のCpG部位のメチル化状態を解析することによって、肝細胞癌に関する情報を取得することができる。なお、上記の単離DNAは、これまでに述べたDNA試料の調製と同様にして得ることができる。また、バイサルファイト処理、メチル化状態の解析および肝細胞癌の情報の取得についても、これまでに述べたことと同様である。
本発明のポリヌクレオチドのサイズは、MSP法、シーケンス法または質量分析法によるメチル化状態の解析が可能なサイズであれば特に限定されないが、好ましくは50〜200塩基、より好ましくは80〜130塩基である。そのような本発明のポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号９および１０の各塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。この配列番号９および１０の各塩基配列からなるポリヌクレオチドは、MSP法によるメチル化状態の解析に適している。
本発明には、被験者における肝細胞癌に関する情報の提供に適するシステムも含まれる。そのようなシステムは、例えば、次のとおりである。
プロセッサおよび該プロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを備え、
該メモリには、下記のステップ：
被験者由来のDNA試料に含まれるCELF6およびRNF135から選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化の状態の解析結果を取得するステップと、
得られた解析結果に基づいて、上記の被験者の肝細胞癌に関する情報を提供するステップと
を該コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている、
被験者における肝細胞癌に関する情報の提供に適するシステム。
また、本発明には、被験者における肝細胞癌に関する情報の提供をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラム製品も含まれる。そのようなコンピュータプログラム製品は、例えば、次のとおりである。
コンピュータに読み取り可能な媒体を備え、
該媒体には、下記のステップ：
被験者由来のDNA試料に含まれるCELF6およびRNF135から選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化の状態の解析結果を取得するステップと、
得られた解析結果に基づいて、上記の被験者の肝細胞癌に関する情報を提供するステップと
を該コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている、
被験者における肝細胞癌に関する情報の提供をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラム製品。
なお、上記の媒体は、上記のコンピュータプログラムが非一時的に記録され、且つコンピュータに読み取り可能な媒体であってもよい。
以下に、本発明の方法を実施するのに好適な装置の一形態を、図面を参照して説明する。しかし、本発明はこの実施形態のみに限定されるものではない。図８は、被験者の肝細胞癌に関する情報を提供するための判定装置の一例を示した概略図である。図８に示された判定装置１は、測定装置２と、該測定装置２と接続されたコンピュータシステム３とを含んでいる。
本実施形態においては、測定装置２は、MALDI-TOF型質量分析装置である。この測定装置２は、被験物質の飛行時間や質量電荷比(m/z値)などの質量分析情報を取得する。被験者由来のDNA試料から調製した測定用試料を測定装置２にセットすると、測定装置２は、該測定用試料に含まれる核酸の質量分析情報を取得し、得られた質量分析情報をコンピュータシステム３に送信する。
なお、メチル化の状態をMSP法により解析する場合、測定装置２は、蛍光イメージスキャナなどのゲルイメージング装置であってもよい。この場合、MSP法による核酸増幅を行った反応液をゲル電気泳動し、泳動後のゲルを測定装置２にセットすると、測定装置２は増幅産物を検出する。そして、測定装置２は、増幅産物のバンド強度データを取得し、得られたデータをコンピュータシステム３に送信する。
コンピュータシステム３は、コンピュータ本体３ａと、入力デバイス３ｂと、検体情報、判定結果などを表示する表示部３ｃとを含む。コンピュータシステム３は、測定装置２から質量分析情報を受信する。そして、コンピュータシステム３のプロセッサは、質量分析情報に基づいて、被験者における肝細胞癌に関する情報を提供するプログラムを実行する。
図９は、図８に示された判定装置の機能構成を示すブロック図である。図９に示されるように、コンピュータシステム３は、取得部３０１と、記憶部３０２と、算出部３０３と、判定部３０４と、出力部３０５とを備える。取得部３０１は、測定装置２と、ネットワークを介して通信可能に接続されている。なお、算出部３０３と判定部３０４とは、制御部３０６を構成している。
取得部３０１は、測定装置２から送信された情報を取得する。記憶部３０２は、判定に必要な閾値およびメチル化スコアを算出するための式を記憶する。算出部３０３は、取得部３０１で取得された情報を用い、記憶部３０２に記憶された式にしたがって、メチル化スコアを算出する。判定部３０４は、算出部３０３によって算出されたメチル化スコアが、記憶部３０２に記憶された閾値よりも低いか否かを判定する。出力部３０５は、判定部３０４による判定結果を、被験者の肝細胞癌に関する情報(例えば、該被験者から採取した生体試料中の肝細胞癌由来の癌細胞の有無)として出力する。
図１０は、図８に示された判定装置のハードウェア構成を示すブロック図である。図１０に示されるように、コンピュータ本体３ａは、ＣＰＵ(Central Processing Unit)３０と、ＲＯＭ(Read Only Memory)１２１と、ＲＯＭ３２と、ハードディスク３３と、入出力インターフェイス３４と、読出装置３５と、通信インターフェイス３６と、画像出力インターフェイス３７とを備えている。ＣＰＵ３０、ＲＯＭ３１、ＲＡＭ(Random Access Memory)３２、ハードディスク３３、入出力インターフェイス３４、読出装置３５、通信インターフェイス３６および画像出力インターフェイス３７は、バス３８によってデータ通信可能に接続されている。
ＣＰＵ３０は、ＲＯＭ３１に記憶されているコンピュータプログラムおよびＲＯＭ３２にロードされたコンピュータプログラムを実行することが可能である。ＣＰＵ３０がアプリケーションプログラムを実行することにより、上述した各機能ブロックが実現される。これにより、コンピュータシステムが、被験者の肝細胞癌に関する情報を提供するための判定装置としての端末として機能する。
ＲＯＭ３１は、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成されている。ＲＯＭ３１には、ＣＰＵ３０によって実行されるコンピュータプログラムおよびこれに用いるデータが記録されている。
ＲＯＭ３２は、ＳＲＡＭ、ＤＲＡＭなどによって構成されている。ＲＯＭ３２は、ＲＯＭ３１およびハードディスク３３に記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。ＲＯＭ３２はまた、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、ＣＰＵ３０の作業領域として利用される。
ハードディスク３３は、ＣＰＵ３０に実行させるためのオペレーティングシステム、アプリケーションプログラム(被験者の肝細胞癌に関する情報を提供するためのコンピュータプログラム)などのコンピュータプログラムおよび当該コンピュータプログラムの実行に用いるデータがインストールされている。
読出装置３５は、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、ＤＶＤ−ＲＯＭドライブなどによって構成されている。読出装置３５は、可搬型記録媒体４０に記録されたコンピュータプログラムまたはデータを読み出すことができる。
入出力インターフェイス３４は、例えば、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインターフェイスと、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインターフェイスと、Ｄ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインターフェイスとから構成されている。入出力インターフェイス３４には、キーボード、マウスなどの入力デバイス３ｂが接続されている。操作者は、当該入力デバイス３ｂを使用することにより、コンピュータ本体３ａにデータを入力することが可能である。
通信インターフェイス３６は、例えば、Ethernet(登録商標)インターフェイスなどである。コンピュータシステム３は、通信インターフェイス３６により、プリンタへの印刷データの送信が可能である。
画像出力インターフェイス３７は、ＬＣＤ、ＣＲＴなどで構成される表示部３ｃに接続されている。これにより、表示部３ｃは、ＣＰＵ３０から与えられた画像データに応じた映像信号を出力することができる。表示部３ｃは、入力された映像信号にしたがって画像(画面)を表示する。
次に、判定装置１による、被験者の肝細胞癌に関する情報の提供の処理手順を説明する。図１１は、図８に示された判定装置を用いた肝細胞癌に関する情報の提供のフローチャートである。ここでは、被験者由来のDNA試料から調製した測定用試料に含まれる核酸の質量分析情報からピーク面積を算出し、得られたピーク面積からメチル化スコアを算出し、得られたメチル化スコアが閾値よりも低いか否かの判定を行なう場合を例として挙げて説明する。しかし、本発明は、この実施形態のみに限定されるものではない。
まず、ステップＳ１−１において、判定装置１の取得部３０１は、測定装置２から質量分析情報を取得する。次に、ステップＳ１−２において、算出部３０３は、取得部３０１が取得した質量分析情報からピーク面積を算出し、記憶部３０２に送信する。そして、ステップＳ１−３において、算出部３０３は、記憶部３０２に記憶された該ピーク面積に基づき、記憶部３０２に記憶された式にしたがって、メチル化スコアを算出する。
その後、ステップＳ１−４において、判定部３０４は、算出部３０３で算出されたメチル化スコアが、記憶部３０２に記憶された閾値よりも低いか否かの判定を行う。ここで、メチル化スコアが閾値よりも低いとき、処理は、ステップＳ１−５に進行し、判定部３０４は、被験者から採取した生体試料には肝細胞癌由来の癌細胞がないことを示す判定結果を出力部３０５に送信する。また、メチル化スコアが閾値よりも低くないとき(すなわち、メチル化スコアが閾値以上であるとき)、被験者から採取した生体試料には肝細胞癌由来の癌細胞があることを示す判定結果を出力部３０５に送信する。
そして、ステップＳ１−７において、出力部３０５は、判定結果を、被験者の肝細胞癌に関する情報として出力し、表示部３ｃに表示させたり、プリンタに印刷させたりする。これにより、被験者において肝細胞癌があるのか、またはないのかについて判定することを補助する情報を医師などに提供することができる。
以下に、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
参考例１： 肝細胞癌の組織のゲノムDNAからの新規マーカーの同定
(1)生体試料
本参考例では、生体試料として、肝切除術により患者から採取した臨床検体を用いた。該臨床検体は、肝細胞癌の癌部組織(99検体)、肝細胞癌の非癌部組織(19検体)および正常肝組織(２検体)であった。これらの組織を採取した後、ただちに液体窒素で凍結し、使用するまで−80℃で保存した。
(2)DNA抽出およびバイサルファイト処理
上記の各組織からゲノムDNAを、QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN社)を用いて抽出した。得られたゲノムDNA(500 ng)を、EZ DNA Methylation Kit(Zymo Research社)を用いてバイサルファイト処理を行い、処理後のゲノムDNAを滅菌蒸留水(10μl)に溶出した。得られたDNA溶液(４μl)に含まれるゲノムDNAを、Bioruptor(COSMO BIO社製)によって断片化した。
(3)新規マーカーの同定
断片化したゲノムDNAについて、Infinium HumanMethylation450 BeadChip(Illumina社)を用いたInfinium Methylation Assayを行って、肝細胞癌の癌部組織に特異的にメチル化が認められる新規マーカーを探索した。なお、具体的な操作は、用いたチップに添付されたマニュアルに従って行った。
Infinium HumanMethylation450 BeadChipには、ヒトゲノム上にある482,421ケ所のCpG部位のメチル化状態を定量できるようプローブが配置されている。各CpG部位ごとでメチル化DNA断片と非メチル化DNA断片のシグナル強度をプローブに対するハイブリダイゼーションおよび一塩基伸長反応でそれぞれ定量できるよう設計されている。約55%に相当する265,824プローブは、遺伝子の転写開始点より5kb以内の領域を標的としている(1遺伝子あたり平均10.1プローブ)。本参考例では、CpG部位のメチル化用プローブのシグナル強度(シグナルM)と非メチル化用プローブのシグナル強度(シグナルU)とをBeadArray Readerで検出し、以下の計算式により各遺伝子のCpG部位のメチル化率(mCpG)を算出した。
(mCpG)＝(シグナルM)／(シグナルM)＋(シグナルU)
得られた各遺伝子のメチル化率(mCpG)の値について、閾値を「0.4」に設定し、メチル化率の値がこの閾値と同じか、またはこの閾値よりも高い検体を「メチル化陽性検体」とした。そして、メチル化陽性検体の数に基づいて、各種の組織における遺伝子のメチル化陽性率(％)を下記の式により算出した。
メチル化陽性率(％)＝(メチル化陽性検体数／総検体数)×100
例えば、癌部組織検体の場合、遺伝子のメチル化陽性率は「(癌部組織検体のうちメチル化陽性検体数／癌部組織の総検体数)×100」によって算出される。そして、癌部組織検体と、非癌部組織検体および正常組織検体との間で統計学的に有意な差を認められる場合に、その遺伝子を癌部組織でメチル化が認められるマーカーとした。
その結果、CELF6およびRNF135の各遺伝子のプロモータ領域が、肝細胞癌の癌部組織に高度にメチル化が認められるマーカーとして同定された(図１ＡおよびＢ参照)。以降、これらのマーカーを本発明のマーカーとも呼ぶ。
参考例２： 複数種類の癌／腫瘍由来の癌／腫瘍組織検体、非癌部組織検体および正常組織検体におけるメチル化データの比較
(1)メチル化データの取得
本参考例では、７種類の癌／腫瘍組織検体、７種類の非癌部組織検体および19種類の正常組織検体のメチル化データを比較した。なお、各組織の検体数を以下の表に示す。
表４において、「RCAST」の欄の検体については、上記参考例１と同様にして、Infinium HumanMethylation450 BeadChip(Illumina社)を用いたInfinium Methylation Assayにより本発明者らがメチル化データを取得した。「論文１」および「論文２」の欄の検体については、下記の文献に公開されているInfinium HumanMethylation450 BeadChip(Illumina社)のメチル化データを取得した。なお、ここでいうメチル化データとは、上記参考例１の(3)の記載のようにして得られた、CELF6およびRNF135のCpG部位のメチル化率(mCpG)である。また、正常血球成分を除く18種類の正常組織については、症例の陽性率の平均値をプロットした。正常血球成分については、上記の健常人の各種血球成分60検体(６人×10)の平均値をプロットした。
・論文１：Nazor KLら、Recurrent variations in DNA methylation in human pluripotent stem cells and their differentiated derivatives. Cell Stem Cell 2012;10(5):620-634
・論文２：Reinius LEら、Differential DNA Methylation in Purified Human Blood Cells: Implications for Cell Lineage and Studies on Disease Susceptibility, PLoS One, 7(7) e41361
(2)複数種類の癌／腫瘍由来の癌／腫瘍組織検体、非癌部組織検体および正常組織検体におけるメチル化陽性率の比較
各遺伝子のメチル化率(mCpG)の値について、閾値を「0.4」に設定し、メチル化率の値がこの閾値と同じか、またはこの閾値よりも高い検体を「メチル化陽性検体」とした。メチル化陽性検体の数に基づいて、各種の組織における本発明のマーカーのメチル化陽性率(％)を上記の式により算出した。結果を図２ＡおよびＢに示す。なお、図２において、「正常組織」とは、表４に示される組織のうち、各種の正常血球成分60検体を除く正常組織を表し、「正常血球」とは各種の正常血球成分60検体を表す。
図２ＡおよびＢより、本発明のマーカーはいずれも、他の種類の癌、ならびにヒト正常組織およびヒト正常血球ではメチル化はほとんど認められず、肝細胞癌において特異的に、且つ高度にメチル化していることがわかった。
比較例１： 複数種類の癌／腫瘍由来の癌／腫瘍組織検体、非癌部組織検体および正常組織検体におけるメチル化陽性率の比較
肝細胞癌由来の癌細胞においてメチル化されていることが既に知られているCDH1、CDKN2AおよびGSTP1の各遺伝子(以下、「既知マーカー」という)について、参考例２と同様にして各組織におけるメチル化陽性率を算出した。結果を図３Ａ〜Ｃに示す。
図３ＡおよびＣより、CDH1およびGSTP1は、肝細胞癌で症例の陽性率が高いが、他の種類の癌および他の非癌部組織でもメチル化を検出しているので、肝細胞癌への特異性は低い。図３Ｂより、CDKN2Aは、他の種類の癌でもメチル化を検出しているので、感度および特異性は低い。したがって、既知マーカーは肝細胞癌の診断マーカーとしての性能において課題が多い。すなわち、肝細胞癌への感度、ならびに他の種類の癌および他の非癌部組織における特異性を考慮したマーカー探索を実施する必要あることが示された。
実施例１： 正常肝臓組織、肝硬変組織および肝細胞癌組織におけるメチル化データの比較
(1)生体試料
本実施例では、生体試料として、肝細胞癌患者から採取した癌部組織(６検体)を用いた。また、対照として、正常肝組織(２検体)および肝細胞癌患者から採取した肝細胞癌の非癌部組織(５検体)を用いた。
(2)測定用試料および対照試料の作製
(i)ゲノムDNAの抽出
上記の各組織からゲノムDNAを、QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN社)を用いて抽出した。得られたDNA溶液に含まれるゲノムDNAを、Bioruptor(COSMO BIO社製)によって断片化した。また、対照用ゲノムDNAとして、ヒト末梢血リンパ球のゲノムDNAを用いた。このヒト末梢血リンパ球のゲノムDNAを、GenomiPhi v2DNA amplificationキット(GEヘルスケアライフサイエンス社)を用いて増幅した。得られた増幅産物は非メチル化DNAからなる。次いで、該増幅産物をBioruptor(COSMO BIO社製)により断片化して、非メチル化DNA断片(０％メチル化DNA)の溶液を得た。この非メチル化DNA断片の溶液の一部を取り、これにSssIメチラーゼ(New England Biolab社)を反応させることによりＣＧ配列にある全てのシトシンをメチル化させて、メチル化DNA断片(100％メチル化DNA)の溶液を得た。
(ii)バイサルファイト処理
上記で得られた各DNA断片(500 ng)を、EZ DNA Methylation Kit(Zymo Research社)を用いてバイサルファイト処理を行い、処理後のゲノムDNAを滅菌蒸留水(80μl)に溶出した。
(3)メチル化特異的PCR(MSP)
上記(2)で得られた測定用試料および対照試料(バイサルファイト処理後のDNA)を用いて、MSPを行った。MSPで用いたPCR試薬の組成、プライマーセットおよびPCRの反応条件を以下に示す。
＜PCR試薬＞
DDW(滅菌水) 16.8μL
10×PCR buffer with MgCl2(Roche社) 2.5μL
2mM dNTP mix 2.5μL
10μMセンスプライマー 1.0μL
10μMアンチセンスプライマー 1.0μL
Faststart Taq polymerase(Roche社) 0.2μL
測定用試料または対照試料 1.0μL
トータル 25μL
＜プライマーセット＞
上記のMSPで用いたプライマーセットを表５に示す。これらのプライマーセットは、増幅対象の領域のDNAがメチル化している場合に増幅産物を得ることができるプライマーセット(以下、「メチル化検出用プライマーセット」とも呼ぶ)である。また、精度管理用プライマーセットとして、バイサルファイト処理が適切に行なわれたか否かを判定するためのプライマーセットも用いた(表６参照)。なお、CELF6およびRNF135のメチル化検出用プライマーセットで増幅される領域のバイサルファイト変換後の塩基配列を、それぞれ配列番号９および１０で示した。ここで、配列番号９および１０の塩基配列は、各メチル化検出用プライマーセットで増幅される領域に存在する全てのCpG部位がメチル化している場合の塩基配列を表す。
＜PCR反応条件＞
95℃で6分、
95℃で30秒、Ｘ℃で30秒、72℃で30秒をＹサイクル、
72℃で7分、
16℃で放置。
なお、上記の反応条件において「Ｘ」および「Ｙ」はそれぞれ、表５および６に示されるアニーリング温度およびサイクル数を表す。
(4)メチル化特異的PCR(MSP)の結果解析
上述のMSPで得られた増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動で確認した。結果を図４に示す。なお、図中で「control」として示されている「０」および「100」はそれぞれ０％メチル化対照試料および100％メチル化対照試料を表す。
精度管理用プライマーセットを用いたPCRでは、全ての試料についてバンドを検出した(データ示さず)。このことから、試料のバイサルファイト処理が適切に行なわれたことがわかる。メチル化検出用プライマーセットを用いたPCRでは、正常肝組織および非癌部組織の全ての試料についてメチル化CpGに由来するバンドを検出しなかった。これに対して、肝細胞癌組織の試料についてのPCRでは、CELF6およびRNF135のいずれマーカーについても６症例中５症例でバンドを検出した。このように、MSP法による本発明のマーカーのメチル化解析では、参考例１のInfinium法の結果と同様に、本発明のマーカーのメチル化と肝細胞癌とが相関することが示された。すなわち、CELF6およびRNF135は高率に肝細胞癌でメチル化傾向を示すが、正常組織および非癌部組織では検出されない特異性の高いマーカーであることが示唆された。
実施例２： 健常人血漿および肝細胞癌患者血漿におけるメチル化データの比較
(1)生体試料
本実施例では、生体試料として、肝細胞癌患者から採取した末梢血(６検体)を用いた。また、対照として、健常人から採取した末梢血(３検体)を用いた。
(2)測定用試料および対照試料の作製
(i)ゲノムDNAの抽出
上記の各末梢血(２ml)から常法により血漿を得た。得られた各血漿からゲノムDNAを、QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(QIAGEN社)を用いて抽出した。また、対照用ゲノムDNAとして、ヒト末梢血リンパ球のゲノムDNAを用いた。実施例１と同様にして、このヒト末梢血リンパ球のゲノムDNAから、非メチル化DNA断片(０％メチル化DNA)の溶液およびメチル化DNA断片(100％メチル化DNA)の溶液を得た。
(ii)バイサルファイト処理
上記で得られた各DNA断片(500 ng)を、EZ DNA Methylation Kit(Zymo Research社)を用いてバイサルファイト処理を行い、処理後のゲノムDNAを滅菌蒸留水(80μl)に溶出した。
(3)MSP
上記(2)で得られた測定用試料および対照試料(バイサルファイト処理後のDNA)を用いて、MSPを行った。なお、MSPで用いたPCR試薬およびプライマーセットは上記の実施例１と同じである。PCRの反応条件を以下に示す。
＜PCR反応条件＞
95℃で6分、
95℃で30秒、60℃で30秒、72℃で30秒を50イクル、
72℃で7分、
16℃で放置。
(4)MSPの結果解析
上述のMSPで得られた増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動で確認した。結果を図５に示す。なお、図中で「control」として示されている「０」および「100」はそれぞれ０％メチル化対照試料および１００％メチル化対照試料を表す。
精度管理用プライマーセットを用いたPCRでは、全ての試料についてバンドを検出した(データ示さず)。このことから、試料のバイサルファイト処理が適切に行なわれたことがわかる。メチル化検出用プライマーセットを用いたPCRでは、健常人血漿の試料についてメチル化CpGに由来するバンドを検出しなかった。これに対して、肝細胞癌患者血漿の試料についてのPCRでは、CELF6については６症例中４症例でバンドを検出し、RNF135については６症例中５症例でバンドを検出した。このように、試料として血漿を用いたMSP法による本発明のマーカーのメチル化解析では、参考例１のInfinium法の結果と同様に、本発明のマーカーのメチル化と肝細胞癌とが相関することが示された。すなわち、CELF6およびRNF135は高率に肝細胞癌患者の血漿でメチル化傾向を示すが、健常人血漿では検出されない特異性の高いマーカーであることが示唆された。
実施例３： 肝細胞癌以外の癌組織および正常組織におけるメチル化データの比較
(1)生体試料
本実施例では、生体試料として、肝細胞癌以外の癌の患者から採取した組織試料、および種々の臓器の正常組織を用いた。各試料の詳細については、表７に示す。なお、表７中、「Ｔ」は腫瘍組織、「Ｎ」は正常組織、「PBLN」は気管支周囲リンパ節(peribronchial lymph node)を表す。
(2)測定用試料および対照試料の作製
(i)ゲノムDNAの抽出
実施例１と同様にして、各組織試料からゲノムDNAを抽出した。また、対照用ゲノムDNAとして、ヒト末梢血リンパ球のゲノムDNAを用いた。実施例１と同様にして、このヒト末梢血リンパ球のゲノムDNAから、非メチル化DNA断片(０％メチル化DNA)の溶液およびメチル化DNA断片(100％メチル化DNA)の溶液を得た。
(ii)バイサルファイト処理
上記で得られた各DNA断片(500 ng)を、EZ DNA Methylation Kit(Zymo Research社)を用いてバイサルファイト処理を行い、処理後のゲノムDNAを滅菌蒸留水(80μl)に溶出した。
(3)MSP
上記(2)で得られた測定用試料および対照試料(バイサルファイト処理後のDNA)を用いて、MSPを行った。なお、本実施例のMSPで用いたプライマーセットは実施例１と同じである。PCR試薬の組成およびPCRの反応条件を以下に示す。
＜PCR試薬＞
DW(滅菌水) 18.8μL
10×PCR buffer with MgCl2(Roche社) 2.5μL
10 mM dNTP mix 0.5μL
10μMセンスプライマー 1.0μL
10μMアンチセンスプライマー 1.0μL
Faststart Taq polymerase(Roche社) 0.2μL
測定用試料または対照試料 1.0μL
トータル 25μL
＜PCR反応条件＞
95℃で6分、
95℃で30秒、58℃で15秒、72℃で30秒を38サイクル、
72℃で7分、
16℃で放置。
(4)MSPの結果解析
上述のMSPで得られた増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動で確認した。結果を図６に示す。なお、図中の「NC」および「PC」はそれぞれ０％メチル化対照試料および100％メチル化対照試料を表す。また、「rCpG」は精度管理用プライマーの増幅産物を示す。また、図６の各増幅産物のバンド強度を測定した。結果を図７Ａ〜Ｃに示す。
図６より、精度管理用プライマーセットを用いたPCRでは、全ての試料についてバンドを検出したので、試料のバイサルファイト処理が適切に行なわれたことがわかる。そして、CELF6およびRNF135の各メチル化検出用プライマーセットを用いたPCRでは、100％メチル化対照試料についてメチル化CpGに由来するバンドを検出したが、それ以外の試料ではバンドを検出しなかった。また、図７Ａ〜Ｃより、精度管理用プライマーセットを用いたPCRのバンド強度と比較すると、CELF6およびRNF135の各メチル化検出用プライマーセットを用いたPCRのバンド強度はバックグラウンドに相当することがわかる。これらの結果より、本発明のマーカーは、肝細胞癌以外の癌組織および正常組織ではメチル化が検出されないマーカーであることが示唆された。

Claims (11)

  1. 被験者から採取した生体試料からDNA試料を調製する工程と、
    調製工程で得られたDNA試料に含まれるCELF6およびRNF135から選択される少なくとも１つの遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位のメチル化の状態を解析する工程と、
    解析工程で得られた解析結果に基づいて、前記被験者の肝細胞癌に関する情報を取得する工程と
    を含む、肝細胞癌に関する情報の取得方法。
  2. 解析工程が、少なくとも１つのCpG部位のメチル化の有無を解析する工程である請求項１に記載の方法。
  3. 被験者の肝細胞癌に関する情報が、被験者から採取した生体試料における肝細胞癌に由来する癌細胞の存否であり、
    情報取得工程が、メチル化されたCpG部位が有るという解析結果が得られた場合に、生体試料中に肝細胞癌由来の癌細胞が存在するという情報を取得する工程である請求項２に記載の方法。
  4. 解析工程が、メチル化の頻度を解析する工程である請求項１に記載の方法。
  5. 被験者の肝細胞癌に関する情報が、被験者から採取した生体試料における肝細胞癌に由来する癌細胞の存否であり、
    情報取得工程が、解析工程で得られたメチル化の頻度が所定の閾値より高い場合に、生体試料中に肝細胞癌由来の癌細胞が存在するという情報を取得する工程である、
    請求項４に記載の方法。
  6. CELF6およびRNF135の各遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位から選択される少なくとも１つである、メチル化解析により肝細胞癌に関する情報を取得するためのマーカー。
  7. CELF6およびRNF135の各遺伝子のプロモータ領域に存在するCpG部位から選択される少なくとも１つのメチル化の状態を解析するためのプライマーセットを含む、肝細胞癌に関する情報を取得するためのキット。
  8. プライマーセットが、質量分析法およびメチル化特異的PCR法から選択される少なくとも１つの方法によりCpG部位のメチル化の状態を解析するためのプライマーセットである請求項７に記載のキット。
  9. プライマーセットが、配列番号３および配列番号４の塩基配列であるプライマーセット、ならびに配列番号５および配列番号６の塩基配列であるプライマーセットから選択される少なくとも１つである請求項８に記載のキット。
  10. CELF6またはRNF135遺伝子のプロモータ領域の全部またはその一部の連続する塩基配列からなり且つ前記プロモータ領域中の少なくとも１つのCpG部位およびCpG部位を構成しない少なくとも１つのシトシンを含む単離DNAをバイサルファイト処理して得られるポリヌクレオチドである、肝細胞癌に関する情報を取得するためのマーカー。
  11. 配列番号９または１０の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項１０に記載のマーカー。
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