KR20210010564A - 종양 마커, 메틸화 검출 시약, 키트 및 이의 용도 - Google Patents

종양 마커, 메틸화 검출 시약, 키트 및 이의 용도 Download PDF

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롱송 자오
홍지 주
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Abstract

본 발명은 생명공학 분야에 속하며, 종양 마커, 메틸화 검출 시약, 키트 및 이의 용도가 개시된다. 결장직장암 시료가 COL4A2 유전자 프로모터 영역의 메틸화 수준을 검출함으로써 정상인의 대변 시료와 구별될 수 있음이 본 발명에서 개시된다. 본 발명은 결장직장암을 검출하기 위해 상기 유전자의 메틸화 검출 시약을 사용한다.

Description

종양 마커, 메틸화 검출 시약, 키트 및 이의 용도
본 발명은 생물학 기술 분야, 특히 종양 마커, 메틸화 검출 시약, 키트 및 이의 용도에 관한 것이다.
결장암으로도 알려져 있는 결장직장암은 소화관의 일반적인 악성 종양이다. 결장직장암의 발생률은 중국에서 매년 증가하고 있다. 상하이 및 광저우와 같은 중국의 일부 해안 지역에서, 결장암의 발생률은 두 번째로 높아져서 폐암 다음이다. 현재, 내장암의 형성은 유전학적 및 후생유전학적 결함의 축적 결과인 것으로 여겨지고 있다. 초기 단계의 결장직장암은 보통 임의의 징후 또는 증상을 갖지 않으며, 대변 중 혈액, 복통, 및 설사와 같은 증상은 후기 단계에서 나타날 수 있다. 증상이 나타나면, 이는 종종 후기 단계이며, 환자에게 큰 통증과 고가의 치료를 불러온다. 따라서, 조기 검출, 조기 진단 및 조기 치료가 결장직장암의 발생률 및 사망율을 감소시키기 위한 중요한 조치이다.
스크리닝 테스트가 내장암 및 전암성 병소의 조기 검출 및 병소의 제거를 위해 사용될 수 있고, 이에 따라 내장암의 발생을 방지할 수 있다. 현재, 결장직장암에 대한 스크리닝 테스트에는 주로 잠혈 테스트가 포함되며, 이는 식품에 의해 쉽게 영향받음 또는 샘종의 낮은 검출률, 그리고 내장암 진단을 위한 황금 기준이지만 스크리닝 테스트로서 낮은 순응도를 갖는, 내시경이라는 문제를 갖는다. 따라서, 높은 정확성 및 순응도로 내장암을 스크리닝하는 방법에 대한 긴급한 필요성이 존재한다.
내장암에 대한 새로운 스크리닝 테스트로서, 대변 DNA 테스트에 점점 더 관심이 기울여지고 있다. 상기 방법(Cologuard®)은 2016년에 미국 결장직장암 스크리닝 가이드라인에 포함되었다. 이 방법은 편의성, 비침습성, 내장암 및 전암성 샘종의 높은 검출률 등의 특징을 갖는다. 내장암을 검출하기 위한 고성능 대변 DNA 테스트 키트를 제조하기 위해, 대변 DNA의 추출 및 마커의 선택을 포함하는 2개의 큰 장애를 극복해야 한다. 한 편, 대변의 조성이 복잡하고, 하류 반응에 대한 여러 억제제가 존재하며, 여러 박테리아 DNA가 존재한다. 이러한 혼합물로부터 인간 표적 유전자를 추출하기 위해, 고도로 민감한 유전자 추출 및 정제 방법 세트가 요구된다; 다른 한 편, 연구들에서 DNA 메틸화가 종양 형성의 초기 이벤트임이 나타났으므로, 결장직장암에 관련된 여러 마커, 특히 DNA 메틸화 마커가 존재한다. 그러나, 여러 메틸화 마커는 세포 및 조직 수준에서 작 작용하며, 대변, 혈액 및 다른 스크리닝 매질에서 사용되는 경우, 내장암에 대한 이의 민감성 및 특이성이 크게 감소되고, 예를 들어, 비멘틴 유전자는 조직에서 83% 민감성을 갖지만 대변 시료에서는 46%로 감소되었다. 유사하게, SFRP1 및 SFRP2와 같은 유전자가 존재한다. 이러한 마커는 결장직장암의 임상적 검출의 필요성에 부합할 수 없다. 따라서, 대변에서 내장암에 대해 높은 검출 민감성 및 특이성을 갖는 마커의 선택이 대변에서 내장암의 유전자 검출의 핵심 포인트이며, 이러한 마커는 내장암의 임상 검출에서 실제로 사용될 것으로 예상된다.
이러한 관점에서, 본 발명은 종양 마커, 포착 서열, 프라이머 쌍, 탐침, 메틸화 검출 시약, 키트 및 이의 용도를 제공한다. 대변에서 내장암에 대한 종양 마커의 민감성은 조직에서와 비슷하며, 심지어 조직에서보다 더 높다.
본 발명의 또 다른 목적은 종양을 비침습적으로 검출하기 위한 마커, 포착 서열, 프라이머 쌍, 탐침, 메틸화 검출 시약, 키트 및 방법을 제공하는 것이다.
목적을 달성하기 위해, 본 발명은 하기 기술적 프로토콜을 제공한다:
본 발명은 종양 마커의 제조에서 COL4A2 유전자의 용도를 제공한다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, COL4A2 유전자의 서열은 진뱅크(Genebank) 접근 번호 NC_000013.11에 나타낸 서열과 적어도 97.8% 동일성을 갖는다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, COL4A2 유전자의 서열은 진뱅크 접근 번호 NC_000013.11에 나타낸 서열과 적어도 98.9% 동일성을 갖는다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, COL4A2 유전자의 서열은 진뱅크 접근 번호 NC_000013.11에 나타낸 서열과 적어도 99.9% 동일성을 갖는다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, COL4A2 유전자의 서열은 진뱅크 접근 번호 NC_000013.11에 나타낸 서열과 100% 동일성을 갖는다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 종양은 결장직장 종양이다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 종양은 결장직장 암 또는 샘종이다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 테스트될 시료는 조직, 체액 또는 배설물이다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 조직은 내장 조직이다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 체액에는 비제한적으로 혈액, 혈청, 혈장, 세포외액, 사이질(interstitial)액, 림프액, 뇌척수액, 또는 방수(aqueous humor)가 포함된다. 본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 배설물은 가래, 소변, 타액, 또는 대변이다.
본 발명은 또한 종양 검출 시약 또는 키트의 제조에서 COL4A2 유전자의 메틸화 검출 시약의 용도를 제공한다.
COL4A2 유전자의 메틸화 검출 시약은 선행 기술의 메틸화 검출 시약일 수 있다; 선행 기술에서, 표적 유전자의 메틸화를 검출하기 위한 다양한 방법, 예컨대 메틸화-특이적 PCR(MSP), 메틸화-특이적 정량적 PCR(qMSP), 메틸화된 DNA-특이적 결합 단백질 PCR, 정량적 PCR 및 DNA 칩, 메틸화-민감성 제한 엔도뉴클레아제, 바이설파이트 서열분석 또는 피로서열분석(pyrosequencing) 등이 존재한다. 각각의 검출 방법은 그 대응하는 시약을 가지며, 모든 이러한 시약이 COL4A2 유전자의 메틸화를 검출하기 위해 본 발명에서 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 아래에 나타낸 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 포착 서열을 제공한다:
I. 서열번호 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열;
II. 서열번호 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 하나 이상의 염기를 변형하거나, 치환하거나, 결실시키거나, 부가하여 수득되는 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 CpG 섬(island)으로부터 수득되는 기능적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열;
III. 서열번호 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열 또는 서열번호 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 CpG 섬으로부터 수득되는 기능적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열; 및
IV. I, II 또는 III으로 나타내는 서열의 상보적 서열.
본 발명은 또한 프라이머 쌍을 제공하며, 여기서 상류 프라이머는 아래에 나타내는 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열을 갖고:
V. 서열번호 2에 나타낸 뉴클레오타이드 서열;
VI. 서열번호 2에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 하나 이상의 염기를 변형하거나, 치환하거나, 결실시키거나, 부가하여 수득되는 뉴클레오타이드 서열;
VII. 서열번호 2에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 2에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 CpG 섬으로부터 수득되는 기능적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열; 및
VIII. V, VI 또는 VII로 나타내는 서열의 상보적 서열;
하류 프라이머는 아래에 나타내는 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다:
IX. 서열번호 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열;
X. 서열번호 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 하나 이상의 염기를 변형하거나, 치환하거나, 결실시키거나, 부가하여 수득되는 뉴클레오타이드 서열;
XI. 서열번호 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 CpG 섬으로부터 수득되는 기능적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열; 및
XII. IX, X 또는 XI로 나타내는 서열의 상보적 서열.
본 발명은 또한 아래에 나타낸 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 탐침을 제공한다:
XIII. 서열번호 4에 나타낸 뉴클레오타이드 서열;
XIV. 서열번호 4에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 하나 이상의 염기를 변형하거나, 치환하거나, 결실시키거나, 부가하여 수득되는 뉴클레오타이드 서열;
XV. 서열번호 4에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열번호 4에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 CpG 섬으로부터 수득되는 기능적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열; 및
XVI. XIII, XIV 또는 XV로 나타내는 상보적 서열.
본 발명은 또한 COL4A2 유전자의 메틸화 검출 시약을 제공하며, 이는 COL4A2 유전자의 포착 서열, 프라이머 및/또는 탐침을 포함한다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, COL4A2 유전자의 CpG 섬으로부터 수득되는 포착 서열, 프라이머 및/또는 탐침이 포함된다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 프라이머 및/또는 탐침은 정량적 메틸화-특이적 PCR(qMSP)에 의해 COL4A2 유전자의 메틸화를 검출한다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 메틸화 검출 시약은 COL4A2 유전자의 게노솜(genosome), 유전자간 영역 또는 프로모터 영역 및 프로모터 영역 근처의 영역에서 메틸화 수준을 검출한다.
종양 조직에 존재하는 메틸화는 DNA의 뚜렷한 변형인 것으로 여겨지며, 잠재적인 임상적 가치를 갖는다. 게노솜, 유전자간 영역, 프로모터 영역 또는 프로모터 영역 근처의 영역이 모두 메틸화되며, 이는 종양에 관련될 수 있다. 현재, 다양한 종양에서 종양 억제인자 유전자 프로모터에서 또는 근처에서 CpG 섬의 비정상적 메틸화가 전사 불활성화를 야기함이 실증되었다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 메틸화 검출 시약에는 COL4A2 유전자의 프로모터 영역에서 또는 근처에서 CpG 섬으로부터 수득되는 포착 서열, 프라이머 및/또는 탐침이 포함된다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 메틸화 검출 시약에서의 포착 서열은 아래에 나타내는 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다:
I. 서열번호 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열;
II. 서열번호 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 하나 이상의 염기를 변형하거나, 치환하거나, 결실시키거나, 부가하여 수득되는 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 CpG 섬으로부터 수득되는 기능적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열;
III. 서열번호 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열 또는 서열번호 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 CpG 섬으로부터 수득되는 기능적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열; 및
IV. I, II 또는 III으로 나타내는 서열의 상보적 서열.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공되는 메틸화 검출 시약에서 프라이머의 상류 프라이머는 아래에 나타내는 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다:
V. 서열번호 2에 나타낸 뉴클레오타이드 서열;
VI. 서열번호 2에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 하나 이상의 염기를 변형하거나, 치환하거나, 결실시키거나, 부가하여 수득되는 뉴클레오타이드 서열;
VII. 서열번호 2에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 2에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 CpG 섬으로부터 수득되는 기능적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열; 및
VIII. V, VI 또는 VII에 나타낸 서열의 상보적 서열.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공되는 메틸화 검출 시약에서 프라이머의 하류 프라이머는 아래에 나타내는 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다:
IX. 서열번호 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열;
X. 서열번호 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 하나 이상의 염기를 변형하거나, 치환하거나, 결실시키거나, 부가하여 수득되는 뉴클레오타이드 서열;
XI. 서열번호 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 CpG 섬으로부터 수득되는 기능적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열; 및
XII. IX, X 또는 XI에 나타낸 서열의 상보적 서열.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공되는 메틸화 검출 시약에서 탐침은 아래에 나타내는 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다:
XIII. 서열번호 4에 나타낸 뉴클레오타이드 서열;
XIV. 서열번호 4에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 하나 이상의 염기를 변형하거나, 치환하거나, 결실시키거나, 부가하여 수득되는 뉴클레오타이드 서열;
XV. 서열번호 4에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열번호 4에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 CpG 섬으로부터 수득되는 기능적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열; 및
XVI. XIII, XIV 또는 XV에 나타낸 상보적 서열.
본 발명은 또한 종양을 검출하기 위한 키트를 제공하며, 이는 포착 서열, 프라이머 쌍, 탐침 또는 메틸화 검출 시약을 포함한다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공되는 키트에는 시약을 수신하기 위해 구분된 하나 이상의 용기가 포함된다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공되는 키트에는 포착 서열을 포함하는 제1 용기; 증폭용 프라이머 쌍을 포함하는 제2 용기; 및 탐침을 포함하는 제3 용기가 포함된다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 본원에서 제공되는 키트는 키트에서 일반적으로 사용되는 시약, 예를 들어 메틸화되지 않은 시토신 염기를 우라실로 전환하지만, 메틸화된 시토신 염기는 변화하지 않고 남아있기 위해 qMSP에서 일반적으로 사용되는 전환 시약을 추가로 포함한다; 여기서 이러한 전환 제제에는 비제한적으로 하이드로설파이트, 바이설파이트 또는 하이드라진 염 등; 및 예를 들어, COL4A2 유전자의 증폭에서 일반적으로 사용되는 DNA 폴리머라제, dNTP, Mg2+ 이온 및 완충액이 포함된다.
본 발명은 또한 종양 검출에서의 포착 서열, 프라이머 쌍, 탐침, 메틸화 검출 시약 및 키트의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 종양 검출 방법을 제공하며, 이는 COL4A2 유전자의 메틸화 수준을 검출하여 정상 시료를 종양 시료와 구별하기 위해 사용된다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 방법은 하기 단계:
(1) 대상체의 COL4A2 유전자의 메틸화 수준을 검출하는 단계;
(2) 대상체의 COL4A2 유전자의 메틸화 수준을 정상 대조군 시료의 메틸화 수준과 비교하는 단계;
(3) 정상 대조군 시료의 메틸화 수준 대비 대상체의 COL4A2 유전자의 메틸화 수준에서의 증가에 따라, 정상 시료를 종양 시료와 구별하기 위해, 대상체가 종양을 갖거나 그 발생 위험이 있음을 표시하는 단계,
를 포함한다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 본 발명은 COL4A2 유전자의 게노솜, 유전자간 영역 또는 프로모터 영역 및 프로모터 영역 근처의 영역에서 메틸화 수준을 검출한다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 본 발명은 COL4A2 유전자의 프로모터 영역 및 프로모터 영역 근처의 영역에서 메틸화 수준을 검출하여 정상 시료를 종양 시료와 구별한다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 메틸화 수준은 상기 포착 서열, 프라이머 쌍, 탐침, 메틸화 검출 시약, 또는 상기 키트를 사용하여 검출된다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 메틸화 수준은 메틸화-특이적 PCR, 또는 메틸화-특이적 정량적 PCR(qMSP), 또는 메틸화된 DNA-특이적 결합 단백질 PCR, 정량적 PCR, 및 DNA 칩, 또는 메틸화-민감성 제한 엔도뉴클레아제, 또는 바이설파이트 서열분석, 또는 피로서열분석에 의해 검출된다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 메틸화 수준은 메틸화-특이적 정량적 PCR에 의해 검출된다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 단계 (1)에서, 대상체의 COL4A2 유전자의 메틸화 수준 검출은 하기 단계:
a) 자기 비드 포착 방법을 적용하여 검출될 시료의 DNA를 추출하는 단계;
b) 하이드로설파이트, 바이설파이트 또는 하이드라진 염에 의해 검출될 시료의 DNA를 전환하는 단계;
c) 메틸화-특이적 정량적 PCR(qMSP)에 의해 검출을 수행하는 단계,
를 포함한다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 단계 a)에서, 자기 비드 포착 방법을 적용하는 검출될 시료의 DNA 추출은 하기 단계:
보호액 중 검출될 시료를 혼합하고 연마한 후, 원심분리하고, 상청액을 취하는 단계;
상청액을 원심분리하고, 상청액을 취하여, 인큐베이션을 위한 상청액 내로 용해 용액 및 특이적인 상보적 올리고뉴클레오타이드 포착 서열을 갖는 자기 비드를 첨가하는 단계;
상청액의 일부를 폐기하고, 자기 비드를 세척하고, 깨끗한 원심분리 튜브로 옮기고, 세척액을 첨가하고, 0.5∼5분 동안 실온에서 100∼2000 rpm 하에 인큐베이션을 수행하고, 자기 프레임 상에 배치하여 상청액을 피펫팅하고, 3회 반복하는 단계;
및 표적 유전자 DNA를 완충액으로 용출하는 단계,
를 포함한다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 검출 기준은 종양 시료 및 정상 시료가 역치 값에 따라 해석되는 것이며, 여기서 대변 시료에서의 Ct 값의 역치 값은 32∼42이고, 바람직하게는, 대변 시료에서의 Ct 값의 역치 값은 34.9이고, 대변 시료의 Ct 값이 Ct 값의 역치 값 이하인 경우, 이는 종양 시료로 해석되며, 대변 시료의 Ct 값이 Ct 값의 역치 값 초과인 경우, 이는 정상 시료로 해석된다; 조직 시료에서 메틸화 수준 값의 역치 값은 1∼10이고, 바람직하게는, 대변 시료에서의 Ct 값의 역치 값은 4.9이고, 조직 시료의 메틸화 수준 값이 메틸화 수준 값의 역치 값 이상인 경우, 이는 종양 시료로 해석되며; 메틸화 수준 값이 메틸화 수준 값의 역치 값 미만인 경우, 이는 정상 시료로 해석된다. 역치는 실제 상황에 따라 조정될 수 있다.
본 발명은 또한 종양 검출 시스템을 제공하며, 이는 하기 구성요소(component):
(1) COL4A2유전자의 메틸화 검출 구성요소;
(2) 데이터 처리 구성요소;
(3) 결과 출력 부재;
를 포함한다;
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 메틸화 검출 구성요소는 하나 이상의 형광 정량적 PCR 기기, PCR 기기, 및 서열분석기를 포함한다;
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 메틸화 검출 구성요소는 포착 서열, 프라이머 쌍, 탐침, 메틸화 검출 시약 또는 키트를 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 데이터 처리 구성요소는 a. 테스트될 시료 및 정상 대조군 시료의 테스트 데이터를 수신하고; b. 테스트될 시료 및 정상 대조군 시료의 테스트 데이터를 저장하고; c. 동일한 유형의 테스트될 시료 및 정상 대조군 시료의 테스트 데이터를 비교하고; 및 d. 비교 결과에 따라 대상체가 종양을 겪을 확률 또는 가능성에 반응하도록 구성된다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 결과 출력 구성요소는 대상체가 종양을 겪을 확률 또는 가능성을 출력하기 위해 사용된다;
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 데이터 처리 구성요소의 판단 기준은 하기와 같다:
역치 값에 따라 종양 시료 및 정상 시료를 해석하고; 여기서 대변 시료에서의 Ct 값의 역치 값은 32∼42이고, 바람직하게는, 대변 시료에서의 Ct 값의 역치 값은 34.9이고, 대변 시료의 Ct 값이 Ct 값의 역치 값 이하인 경우, 이는 종양 시료로 해석되며, 대변 시료의 Ct 값이 Ct 값의 역치 값 초과인 경우, 정상 시료로 해석되고; 조직 시료에서 메틸화 수준 값의 역치 값은 1∼10이고, 바람직하게는, 대변 시료에서의 Ct 값의 역치 값은 4.9이고, 조직 시료의 메틸화 수준 값이 메틸화 수준 값의 역치 값 이상인 경우, 이는 종양 시료로 해석되며; 메틸화 수준 값이 메틸화 수준 값의 역치 값 미만인 경우, 이는 정상 시료로 해석된다. 역치는 실제 상황에 따라 조정될 수 있다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 본 발명의 종양은 결장직장 종양이다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 본 발명의 종양은 결장직장 암 또는 샘종이다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 테스트될 시료 또는 시료 유형은 조직, 체액, 또는 배설물이다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 조직은 내장 조직이다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 체액은 혈액, 혈청, 혈장, 세포외액, 조직액, 림프액, 뇌척수액, 또는 방수를 포함한다.
본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 배설물은 가래, 소변, 타액, 또는 대변이다.
본 발명의 연구를 통해, COL4A2 유전자의 프로모터 영역의 메틸화 수준을 검출함으로써, 결장직장암 시료가 정상 인간 대변 시료와 구별될 수 있음이 확인된다. 본 발명에 따르면, 유전자의 메틸화를 함유하는 검출 시약은 내장암에 대해 높은 검출 민감성 및 특이성으로, 결장직장암을 검출하기 위해 사용된다.
내장암을 검출하기 위한 기존 마커에 비해, 본 발명에 의해 제공되는 마커 및 기술적 프로토콜은 높은 민감성 및 특이성으로 결장직장암을 검출할 수 있고, 대변에서 결장직장암의 검출률은 조직 시료에서의 검출률보다 높다.
1. 상기 기술적 프로토콜에 따르면, COL4A2 유전자의 메틸화 검출 시약은 95.2%의 특이성으로 대변 시료에서 85%의 결장직장암을 검출할 수 있고, 대변 시료에서 결장직장암의 검출률이 조직 시료에서의 검출률보다 높고, 대변이 간단히 검출 시료로 사용될 수 있고, 결장직장암이 재현성 있게 진단될 수 있다. 대변 시료를 수득하는 것이 매우 쉽고, 샘플채집이 비침습적이고 간단하며, 환자에게 어떠한 통증 및 불편을 유도하지 않을 것이다.
2. 상기 기술적 프로토콜에 따르면, COL4A2 유전자의 메틸화 검출 시약은 95.2%의 특이성으로 조직 시료에서 80%의 결장직장암을 검출할 수 있다.
3. 이 기술적 프로토콜에 따르면, COL4A2 유전자를 위한 메틸화 검출 시약 및 추출 검출 방법은 결장직장암 및 정상 개인을 편리하고 정확하게 판단할 수 있고, 유전자의 메틸화 검출 시약은 대변 유전자 검출 키트에서 사용되고 내장암의 임상적 검출을 위해 기능할 것으로 예상된다.
4. 기술적 프로토콜에서의 시약/키트에 따르면, 암은 메틸화 수준을 통해 검출되고 진단되며, 메틸화 변화가 종양형성 공정에서의 초기 이벤트임을 점점 더 많은 연구가 증명하고, 메틸화 비정상성의 검출에 의해 초기 병소를 확인하기 쉽다.
본 발명 또는 선행 기술의 구현예를 보다 명확히 예시하기 위해, 본 발명 또는 본 명세서에 포함되고 그 일부를 구성하는 선행 기술의 구현예의 설명에서 필요한 첨부되는 도면이 이제 간략하게 설명될 것이다.
도 1은 실시예 1의 대변 테스트에서 결장직장암 검출을 위한 COL4A2 유전자의 ROC 곡선을 나타낸다;
도 2는 실시예 1의 대변 테스트에서 COL4A2 유전자의 표준 곡선 증폭 맵을 나타낸다;
도 3은 실시예 2의 조직 테스트에서 결장직장암 검출을 위한 COL4A2 유전자의 ROC 곡선을 나타낸다;
도 4는 비교예 2의 19쌍의 조직 테스트에서 결장직장암 검출을 위한 SFRP1 유전자의 ROC 곡선을 나타낸다;
도 5는 비교예 2의 36 케이스의 대변 테스트에서 결장직장암 검출을 위한 SFRP1 유전자의 ROC 곡선을 나타낸다.
본 발명은 종양 마커, 메틸화 검출 시약, 키트 및 이의 용도를 개시하며, 본 기술분야의 기술자는 본 문헌의 내용으로부터 배우고 공정 파라미터를 적절히 개선할 수 있다. 본 기술분야의 기술자에게 자명한 모든 유사한 치환 및 변형은 본 발명에 포함되는 것으로 간주됨이 구체적으로 주지된다. 본 발명의 방법 및 적용이 바람직한 구현예의 측면에서 기재되었으나, 본 기술분야의 기술자에게는 본 발명의 기법이 본 발명의 정신 및 범위에서 벗어나지 않고 본원에서 기재되는 방법 및 용도의 변형 또는 적절한 변경 및 조합과 함께 실시되고 적용될 수 있음이 명확할 것이다.
본 발명에 의해 제공되는 종양 마커, 메틸화 시약, 키트 및 이의 용도에서 사용되는 원료, 보조 물질 및 시약은 시장에서 구입되거나 합성될 수 있다. 차별적 메틸화를 검출할 수 있는 CpG 부위가 존재하는 한, COL4A2 유전자의 임의의 핵산 단편이 본 발명에서 사용될 수 있다. CpG 섬은 핵산 서열에서의 CpG-풍부 영역이다. CpG 섬은 프로모터의 상류에서 시작되어 하류로 전사 영역까지 연장된다. 프로모터 상의 CpG 섬의 메틸화는 일반적으로 유전자 발현을 억제한다. 프로모터에서 CpG 섬은 메틸화 부분이며, 게노솜에서의 CpG 공해(open sea)는 보존적 DNA 메틸화 표적을 갖는다. 최근 연구에서는 유전자 발현에 대한 비-프로모터 영역(예컨대, 게노솜 및 UTR)의 메틸화의 상승적 효과를 드러내었고, 게노솜의 메틸화는 암에서 잠재적인 치료 표적일 수 있다.
일반적으로, CpG 섬은 보통 프로모터에 또는 근처에 위치하는, CpG 디뉴클레오타이드가 풍부한 영역을 나타낸다. 본 발명에서, CpG 섬은 프로모터에 또는 근처에 CpG 디뉴클레오타이드가 풍부한 영역뿐만 아니라, 하이브리드 메틸화 CpG 부위, 또는 단리된 CpG 부위도 나타낸다.
전형적으로, CpG-함유 핵산은 DNA이다. 그러나, 본 발명은, 예를 들어, DNA, 또는 DNA 및 mRNA를 포함하는 RNA를 포함하는 시료에 적용 가능하며, 여기서 DNA 또는 RNA는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있거나, DNA-RNA 하이브리드 가닥이 또한 시료에 포함될 수 있다.
본 발명에서 "프라이머" 또는 "탐침"은 표적 핵산 분자(예컨대, 표적 유전자)의 적어도 6개 연속 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 영역을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 나타낸다. 일부 구현예에서, 프라이머 또는 탐침은 표적 분자의 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 또는 적어도 20개 연속 또는 불연속 블록 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 영역을 포함한다. 프라이머 또는 탐침이 표적 분자의 적어도 x개 연속 뉴클레오타이드에 상보적인 영역을 포함하는 경우, 프라이머 또는 탐침은 표적 분자의 적어도 x개 연속 뉴클레오타이드에 적어도 95% 상보적이다. 일부 구현예에서, 프라이머 또는 탐침은 표적 분자에 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 상보적이다.
본 발명에서 "검출"은 진단과 동일하며, 또한 결장직장 종양의 중기 및 후기 단계의 진단이 포함되고, 또한 결장직장 종양의 조기 진단에 부가하여, 결장직장 종양 스크리닝, 위험 평가, 예후, 질환 확인, 질환 단계의 진단 및 치료 표적의 선택이 포함된다.
결장직장 종양 마커 COL4A2의 사용은 결장직장 종양의 조기 진단을 가능하게 만든다. 암 세포에서 메틸화된 유전자가 임상적으로 또는 형태적으로 정상-외관 세포에서 메틸화된 것으로 확인되는 경우, 이는 정상-외관 세포가 암으로 진행 중임을 시사한다. 따라서, 결장직장암은 정상-외관 세포에서 결장직장 종양-특이적 유전자 COL4A2의 메틸화에 의해 조기 진단될 수 있다.
여기서, 조기 진단은 전이 전, 바람직하게는 조직 또는 세포에서의 형태적 변화가 확인될 수 있기 전, 암의 검출 가능성을 나타낸다.
결장직장 종양의 조기 진단에 부가하여, 본 발명의 시약/키트는 결장직장 종양 스크리닝, 위험 평가, 예후 진단, 질환 확인, 질환 단계의 진단, 및 치료 표적의 선택을 위해서도 바람직하다.
질환 단계를 위한 대안적 구현예로서, 상이한 단계 또는 기간에서의 결장직장 종양의 진행에 있어서, 진단은 시료로부터 수득되는 COL4A2의 메틸화 정도를 측정함으로써 수행될 수 있다. 결장직장암의 초기 단계 시료로부터 단리된 핵산의 COL4A2 유전자의 메틸화 정도를 세포 증식성 장애가 없는 내장 조직의 시료로부터 단리된 하나 이상의 핵산의 COL4A2 유전자의 메틸화 정도와 비교함으로써, 시료에서 특정 단계의 결장직장 종양이 검출될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다:
실시예 1
163 케이스의 대변 시료(결장직장암 80 케이스, 정상 83 케이스, 모두 내시경 또는 병리에 의해 확인됨)를 선택하여 연마 원심분리를 거치고, 100 ㎕의 포착 자기 비드(COL4A2 유전자의 포착 서열 함유)를 첨가하고, 혼합물로 하기 기술적 프로토콜에 따른 작동을 거치고, 15 ㎕의 바이설파이트-변환 DNA를 수득하였다. 이어서 qMSP를 수행하여 COL4A2의 메틸화 수준을 검출하였다.
기술적 프로토콜은 하기와 같았다:
1) 내시경 결과와 함께 정상인 및 결장직장 종양 환자의 대변 시료를 수집하고, 1 g의 대변 및 4 ㎖의 보호 용액을 혼합하고 연마한 후, 10분 동안 5000 rpm에서 원심분리하고, 이어서 상청액을 취하고 침전을 폐기하였다;
2) 10 ㎖의 상청액을 원심분리를 위해 다시 취하고, 3.2 ㎖의 상청액을 취하여, 2 ㎖의 용해 용액 및 100 ㎕의 포착 자기 비드 M1을 첨가한 후, 10분 동안 92℃에서 인큐베이션하고, 이어서 실온에서 1 h 동안 방치하였다;
3) 혼합물을 자기 프레임 상에 배치하고, 상청액의 일부를 폐기하고, 자기 비드를 세척한 후, 혼합물을 2 ㎖ 원심분리 튜브로 옮기고, 800 ㎕의 세척 용액 W1을 첨가한 후, 실온에서 1분 동안 1300 rpm에서 인큐베이션하고, 자기 프레임 상에 배치하고, 상청액을 피펫팅하고, 3회 반복하였다;
4) 55 ㎕의 용출액을 첨가한 후, 10분 동안 1300 rpm에서 92℃에서 인큐베이션하고, 자기 프레임 상에 배치하고, 3분 이내에 50 ㎕의 용출액을 새로운 EP 튜브 내로 옮겼다;
5) 이전 단계로부터의 DNA 단편을 EZ DNA 메틸화 키트(Zymo Research)를 사용하여 메틸화하고 15 ㎕의 최종 용출액을 qMSP 검출을 위해 사용하였다.
qMSP 반응 시스템: 25 ㎕(뉴클레아제-비함유수 8.2 ㎕, 5×Colorless GoTaq Flexi 완충액 5 ㎕, MgCl2(25 mM) 5 ㎕, dNTP(10 mM) 1 ㎕, GoTaq Hot Start 폴리머라제 0.5 ㎕, 전방 프라이머(100 μM) 0.125 ㎕, 후방 프라이머(100 μM) 0.125 ㎕, 탐침(100 μM) 0.05 ㎕, DNA 5 ㎕). 반응 절차: 95℃ 4분, (95℃ 20 s, 56℃ 30 s, 72℃ 30 s) × 45 사이클, 37℃ 30 s.
그리고 마지막으로 시료에서의 유전자 카피수를 표준 곡선에 따라 계산하였다.
COL4A2 유전자의 메틸화 부위는 비교적 일정하며, 주로 프로모터 영역에서 또는 근처에서 CpG 섬 상에 위치한다. 1세트의 포착 서열, 프라이머 및 탐침을 이들 영역에 대해 설계하고 COL4A2 유전자의 메틸화 검출 시약에서 사용하였다.
시약에 함유된 포착 서열, 프라이머 및 탐침은 하기와 같다:
COL4A2의 포착 서열(서열번호 1):
5'-GCTGCTGCCCGAACGCATTGGCCCTTCCAGAAGCA-3'
COL4A2의 qMSP 프라이머 및 탐침:
전방 프라이머(서열번호 2): 5'-AGAGAGTTTAGTAAGGTCGGTC-3'
후방 프라이머(서열번호 3): 5'-GACTTCAAAAACTACTACCCG-3'
탐침(서열번호 4): 5'-TGTCGGTGTGTCGTCGGC-3'
대변 테스트에서, 결장직장암 검출을 위한 COL4A2 유전자의 ROC 곡선을 도 1에 나타낸다:
결장직장암에 있어서, COL4A2 유전자의 검출 민감성은 85%(68/80)이고, 특이성은 95.2%(79/83)이고, ROC 곡선 하 면적은 0.966이다(95% CI: 0.941∼0.991, p <0.0001).
대변 테스트에서, COL4A2 유전자의 표준 곡선의 증폭 곡선을 도 2에 나타낸다:
표준 곡선의 증폭 효율은 99%, 선형도 R2 = 0.994이다.
163 케이스의 대변 시료
시료의 분류 CT 값 검출 및 해석 시료의 분류 CT 값 검출 및 해석
결장직장암 38 정상 정상 비-증폭 정상
결장직장암 37 정상 정상 비-증폭 정상
결장직장암 37 정상 정상 비-증폭 정상
결장직장암 36 정상 정상 비-증폭 정상
결장직장암 36 정상 정상 비-증폭 정상
결장직장암 36 정상 정상 비-증폭 정상
결장직장암 36 정상 정상 비-증폭 정상
결장직장암 36 정상 정상 비-증폭 정상
결장직장암 35 정상 정상 비-증폭 정상
결장직장암 35 정상 정상 비-증폭 정상
결장직장암 35 정상 정상 비-증폭 정상
결장직장암 35 정상 정상 비-증폭 정상
결장직장암 35 내장암 정상 비-증폭 정상
결장직장암 35 내장암 정상 비-증폭 정상
결장직장암 35 내장암 정상 비-증폭 정상
결장직장암 35 내장암 정상 비-증폭 정상
결장직장암 34 내장암 정상 44 정상
결장직장암 34 내장암 정상 43 정상
결장직장암 34 내장암 정상 42 정상
결장직장암 34 내장암 정상 42 정상
결장직장암 34 내장암 정상 42 정상
결장직장암 33 내장암 정상 41 정상
결장직장암 33 내장암 정상 40 정상
결장직장암 32 내장암 정상 40 정상
결장직장암 32 내장암 정상 39 정상
결장직장암 32 내장암 정상 39 정상
결장직장암 32 내장암 정상 39 정상
결장직장암 32 내장암 정상 38 정상
결장직장암 32 내장암 정상 39 정상
결장직장암 31 내장암 정상 38 정상
결장직장암 31 내장암 정상 38 정상
결장직장암 31 내장암 정상 38 정상
결장직장암 31 내장암 정상 38 정상
결장직장암 30 내장암 정상 38 정상
결장직장암 30 내장암 정상 38 정상
결장직장암 30 내장암 정상 38 정상
결장직장암 30 내장암 정상 38 정상
결장직장암 30 내장암 정상 38 정상
결장직장암 30 내장암 정상 38 정상
결장직장암 30 내장암 정상 38 정상
결장직장암 30 내장암 정상 38 정상
결장직장암 30 내장암 정상 38 정상
결장직장암 30 내장암 정상 38 정상
결장직장암 29 내장암 정상 38 정상
결장직장암 29 내장암 정상 38 정상
결장직장암 29 내장암 정상 37 정상
결장직장암 29 내장암 정상 37 정상
결장직장암 29 내장암 정상 37 정상
결장직장암 29 내장암 정상 37 정상
결장직장암 29 내장암 정상 37 정상
결장직장암 29 내장암 정상 37 정상
결장직장암 29 내장암 정상 37 정상
결장직장암 29 내장암 정상 37 정상
결장직장암 28 내장암 정상 37 정상
결장직장암 28 내장암 정상 37 정상
결장직장암 28 내장암 정상 37 정상
결장직장암 28 내장암 정상 37 정상
결장직장암 28 내장암 정상 37 정상
결장직장암 28 내장암 정상 37 정상
결장직장암 27 내장암 정상 36 정상
결장직장암 28 내장암 정상 37 정상
결장직장암 28 내장암 정상 37 정상
결장직장암 27 내장암 정상 36 정상
결장직장암 27 내장암 정상 36 정상
결장직장암 27 내장암 정상 36 정상
결장직장암 27 내장암 정상 36 정상
결장직장암 27 내장암 정상 36 정상
결장직장암 27 내장암 정상 36 정상
결장직장암 27 내장암 정상 36 정상
결장직장암 27 내장암 정상 36 정상
결장직장암 27 내장암 정상 36 정상
결장직장암 27 내장암 정상 36 정상
결장직장암 26 내장암 정상 36 정상
결장직장암 26 내장암 정상 36 정상
결장직장암 26 내장암 정상 36 정상
결장직장암 26 내장암 정상 36 정상
결장직장암 25 내장암 정상 35 정상
결장직장암 25 내장암 정상 35 정상
결장직장암 23 내장암 정상 35 정상
결장직장암 23 내장암 정상 35 내장암
정상 35 내장암
정상 34 내장암
정상 34 내장암
주: "비-증폭"은 증폭 곡선 없음, Ct 데이터 없음, 역치보다 큰 범위 내에 속함을 의미한다.
실시예 2
105쌍의 결장직장암 및 정상 암종-주변 조직 시료(내시경 또는 병리에 의해 확인됨)를 선택하였다. 프로토콜에 따라, 조직 DNA를 QIAamp DNA 키트(QIAGEN)에 의해 추출한 후, DNA를 EZ DNA 메틸화 키트(Zymo Research)로 변환시켰다.
이어서 qMSP를 수행하여 COL4A2의 메틸화 수준을 검출하였다.
qMSP 반응 시스템 및 반응 절차는 실시예 1에서의 대변 테스트에서와 동일하였다. 그리고 최종적으로 시료에서 유전자의 메틸화 값을 표준 곡선에 따라 계산하였다: (표적/ACTB) * 100. 사용된 qMSP 프라이머 및 탐침은 실시예 1에서와 동일하였다.
조직 테스트에서, 결장직장암 검출을 위한 COL4A2 유전자의 ROC 곡선을 도 3에 나타낸다:
결장직장암에 있어서, COL4A2 유전자의 검출 민감성은 80%(84/105)이며, 특이성은 95.2%(100/105)이고, ROC 곡선 하 면적은 0.857이다(95% CI: 0.795∼0.919, p <0.0001).
105쌍의 암 및 정상 암종-주변 조직
시료의 분류 메틸화 값 검출 및 해석 시료의 분류 메틸화 값 검출 및 해석
정상 6.6 내장암 결장직장암 0.0 정상
정상 6.5 내장암 결장직장암 0.0 정상
정상 5.3 내장암 결장직장암 0.0 정상
정상 5.0 내장암 결장직장암 0.0 정상
정상 4.9 내장암 결장직장암 0.0 정상
정상 4.8 정상 결장직장암 0.1 정상
정상 4.6 정상 결장직장암 0.1 정상
정상 4.5 정상 결장직장암 0.2 정상
정상 4.4 정상 결장직장암 0.5 정상
정상 4.3 정상 결장직장암 0.6 정상
정상 4.3 정상 결장직장암 0.8 정상
정상 4.3 정상 결장직장암 0.9 정상
정상 4.2 정상 결장직장암 1.1 정상
정상 4.2 정상 결장직장암 1.5 정상
정상 3.7 정상 결장직장암 1.8 정상
정상 3.6 정상 결장직장암 1.9 정상
정상 3.6 정상 결장직장암 2.5 정상
정상 3.4 정상 결장직장암 3.3 정상
정상 3.3 정상 결장직장암 3.7 정상
정상 2.8 정상 결장직장암 3.8 정상
정상 2.8 정상 결장직장암 4.0 정상
정상 2.7 정상 결장직장암 5.3 내장암
정상 2.7 정상 결장직장암 5.3 내장암
정상 2.7 정상 결장직장암 5.7 내장암
정상 2.7 정상 결장직장암 5.9 내장암
정상 2.7 정상 결장직장암 6.1 내장암
정상 2.6 정상 결장직장암 7.3 내장암
정상 2.6 정상 결장직장암 7.3 내장암
정상 2.5 정상 결장직장암 7.5 내장암
정상 2.5 정상 결장직장암 8.7 내장암
정상 2.5 정상 결장직장암 9.5 내장암
정상 2.5 정상 결장직장암 9.7 내장암
정상 2.5 정상 결장직장암 11.3 내장암
정상 2.4 정상 결장직장암 11.8 내장암
정상 2.4 정상 결장직장암 12.4 내장암
정상 2.3 정상 결장직장암 12.4 내장암
정상 2.2 정상 결장직장암 13.7 내장암
정상 2.2 정상 결장직장암 13.7 내장암
정상 2.2 정상 결장직장암 15.0 내장암
정상 2.1 정상 결장직장암 15.1 내장암
정상 2.1 정상 결장직장암 15.3 내장암
정상 2.1 정상 결장직장암 15.4 내장암
정상 2.1 정상 결장직장암 17.3 내장암
정상 2.1 정상 결장직장암 17.6 내장암
정상 2.0 정상 결장직장암 18.2 내장암
정상 2.0 정상 결장직장암 18.9 내장암
정상 2.0 정상 결장직장암 19.1 내장암
정상 2.0 정상 결장직장암 19.1 내장암
정상 2.0 정상 결장직장암 19.2 내장암
정상 2.0 정상 결장직장암 19.3 내장암
정상 1.9 정상 결장직장암 20.7 내장암
정상 1.9 정상 결장직장암 21.7 내장암
정상 1.9 정상 결장직장암 22.4 내장암
정상 1.8 정상 결장직장암 22.6 내장암
정상 1.8 정상 결장직장암 23.3 내장암
정상 1.8 정상 결장직장암 23.8 내장암
정상 1.8 정상 결장직장암 24.2 내장암
정상 1.7 정상 결장직장암 24.3 내장암
정상 1.7 정상 결장직장암 24.6 내장암
정상 1.7 정상 결장직장암 24.9 내장암
정상 1.6 정상 결장직장암 25.6 내장암
정상 1.6 정상 결장직장암 25.6 내장암
정상 1.6 정상 결장직장암 25.9 내장암
정상 1.6 정상 결장직장암 26.4 내장암
정상 1.6 정상 결장직장암 26.8 내장암
정상 1.5 정상 결장직장암 27.3 내장암
정상 1.5 정상 결장직장암 27.4 내장암
정상 1.4 정상 결장직장암 27.7 내장암
정상 1.4 정상 결장직장암 28.3 내장암
정상 1.4 정상 결장직장암 28.4 내장암
정상 1.4 정상 결장직장암 28.5 내장암
정상 1.3 정상 결장직장암 28.6 내장암
정상 1.3 정상 결장직장암 28.6 내장암
정상 1.3 정상 결장직장암 28.8 내장암
정상 1.3 정상 결장직장암 28.8 내장암
정상 1.3 정상 결장직장암 30.8 내장암
정상 1.3 정상 결장직장암 31.2 내장암
정상 1.3 정상 결장직장암 32.0 내장암
정상 1.2 정상 결장직장암 32.0 내장암
정상 1.2 정상 결장직장암 32.5 내장암
정상 1.1 정상 결장직장암 32.7 내장암
정상 1.1 정상 결장직장암 33.2 내장암
정상 1.1 정상 결장직장암 35.1 내장암
정상 1.1 정상 결장직장암 37.5 내장암
정상 1.0 정상 결장직장암 37.5 내장암
정상 1.0 정상 결장직장암 37.7 내장암
정상 1.0 정상 결장직장암 38.1 내장암
정상 1.0 정상 결장직장암 40.9 내장암
정상 0.9 정상 결장직장암 41.2 내장암
정상 0.9 정상 결장직장암 41.3 내장암
정상 0.9 정상 결장직장암 45.7 내장암
정상 0.8 정상 결장직장암 46.6 내장암
정상 0.8 정상 결장직장암 46.9 내장암
정상 0.8 정상 결장직장암 48.9 내장암
정상 0.8 정상 결장직장암 49.5 내장암
정상 0.7 정상 결장직장암 52.6 내장암
정상 0.7 정상 결장직장암 55.2 내장암
정상 0.6 정상 결장직장암 60.3 내장암
정상 0.6 정상 결장직장암 61.9 내장암
정상 0.6 정상 결장직장암 62.6 내장암
정상 0.5 정상 결장직장암 62.9 내장암
정상 0.4 정상 결장직장암 65.5 내장암
정상 0.4 정상 결장직장암 70.5 내장암
정상 0.4 정상 결장직장암 74.1 내장암
정상 0.1 정상 결장직장암 100.0 내장암
비교예 1
현재, 일부 연구에서, 대변 시료로부터의 DNA를 QIAamp DNA 스툴(stool) Mini 키트(QIAGEN)를 사용하여 추출한 후, 시료에서 마커 수준의 정성적 또는 정량적 검출을 메틸화-특이적 PCR(MSP) 또는 정량적 메틸화-특이적 PCR(qMSP)을 사용하여 수행하였다. 여기서, MSP에 의한 결장직장암의 검출을 위해 전기영동이 요구되므로, 작동시키기 더 불편하고 산물 오염의 위험이 존재한다; QIAamp DNA 스툴 Mini 키트에 의해 추출된 대변에서의 DNA는 실제 인간 종양의 소량의 DNA를 포함하는 인간 및 박테리아의 전체 DNA이며, 후속 PCR 검출에 적합하지 않다.
비교예 2
연구에서는 SFRP1 유전자 메틸화가 내장암과 연관되며, 대변에서 상기 유전자의 메틸화 수준을 검출함으로써 결장직장암을 검출할 수 있음을 나타내었다. 53 케이스의 대변 시료(29 케이스의 내장암, 7 케이스의 샘종, 17 케이스의 정상)의 테스트에서, 89% 결장직장 종양이 86%의 특이성으로 검출되었다(Zhang W, Bauer M, Croner RS, Pelz JO, Lodygin D, Hermeking H, Sturzl M, Hohenberger W, Matzel KE. DNA feces test for colorectal cancer: Hypermethylation of the secreted frizzled-related protein-1 gene. DISEASES OF THE COLON & RECTUM 2007; 50(10): 1618-26; discussion 1626-7).
SFRP1 유전자의 메틸화 수준을 또한 19쌍의 조직 및 36 케이스의 대변 시료에서 검출하였고, 표적 유전자에 대한 추출 방법은 실시예 1 및 2에서와 동일하였다. 19쌍의 조직 테스트에서, 결장직장암 검출을 위한 SFRP1 유전자의 ROC 곡선을 도 4에 나타낸다:
결장직장암 조직에 있어서, SFRP1 유전자의 검출 민감성은 89%이며, 특이성은 95%이고, ROC 곡선 하 면적은 0.972이다(95% CI: 0.929∼1, p <0.001).
36 케이스의 대변 시료의 테스트에서, 결장직장암 검출을 위한 SFRP1 유전자의 ROC 곡선을 도 5에 나타낸다:
결장직장암에 있어서, SFRP1 유전자의 검출 민감성은 67%이며, 특이성은 94%이고, ROC 곡선 하 면적은 0.892이다(95% CI: 0.790∼0.994, p <0.0001).
따라서, SFRP1 유전자는 결장직장암 조직 상에서 높은 검출 민감성 및 특이성을 갖지만, 대변 시료에서 SFRP1 유전자의 민감성은 크게 감소된다.
상기는 단지 본 발명의 바람직한 구현예이고, 본 기술분야의 기술자에 있어서, 다양한 변형 및 개질이 본 발명의 원리에서 벗어나지 않고 수행될 수 있으며, 이들 변형 및 개질이 또한 본 발명의 보호 범위로서 간주되어야 함이 주지되어야 한다.
<110> CREATIVE BIOSCIENCES (GUANGZHOU) CO., LTD. <120> TUMOR MARKER, METHYLATION DETECTION REAGENT, KIT AND USE THEREOF <130> 2020-FPA-0425 <150> 201810494989.4 <151> 2018-05-22 <160> 4 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COL4A2 capture sequence <400> 1 gctgctgccc gaacgcattg gcccttccag aagca 35 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 2 agagagttta gtaaggtcgg tc 22 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer <400> 3 gacttcaaaa actactaccc g 21 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 4 tgtcggtgtg tcgtcggc 18

Claims (14)

  1. 종양 마커의 제조에서의 COL4A2 유전자의 용도로서,
    바람직하게는 상기 COL4A2 유전자의 서열은 진뱅크 접근 번호 NC_000013.11에 나타낸 서열과 적어도 97.8%, 적어도 98.9%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일성을 갖고;
    바람직하게는 상기 종양은 결장직장 종양이고;
    바람직하게는 상기 종양은 결장직장 암 또는 샘종이고;
    바람직하게는 상기 마커에 의해 표적화되어 검출될 시료는 조직, 체액 또는 배설물이고;
    바람직하게는 상기 조직은 내장 조직이고;
    바람직하게는 상기 체액은 혈액, 혈청, 혈장, 세포외액, 조직액, 림프액, 뇌척수액 또는 방수이고;
    바람직하게는 상기 배설물은 가래, 타액, 소변 또는 대변인 용도.
  2. 종양 검출 시약 또는 키트의 제조에서의 COL4A2 유전자의 메틸화 검출 시약의 용도로서,
    바람직하게는 상기 COL4A2 유전자의 서열은 진뱅크 접근 번호 NC_000013.11에 나타낸 서열과 적어도 97.8%, 적어도 98.9%, 적어도 99.9% 또는 100% 동일성을 갖고;
    바람직하게는 상기 종양은 결장직장 종양이고;
    바람직하게는 상기 종양은 결장직장 암 또는 샘종이고;
    바람직하게는 상기 검출 시약에 의해 표적화되어 검출될 시료는 조직, 체액 또는 배설물이고;
    바람직하게는 상기 조직은 내장 조직이고;
    바람직하게는 상기 체액은 혈액, 혈청, 혈장, 세포외액, 조직액, 림프액, 뇌척수액 또는 방수이고;
    바람직하게는 상기 배설물은 가래, 타액, 소변 또는 대변인 용도.
  3. 아래에 나타낸 바와 같은 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 포착 서열:
    I. 서열번호 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열;
    II. 서열번호 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 하나 이상의 염기를 변형하거나, 치환하거나, 결실시키거나, 부가하여 수득되는 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 CpG 섬으로부터 수득되는 기능적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열;
    III. 서열번호 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열 또는 서열번호 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 CpG 섬으로부터 수득되는 기능적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열;
    IV. I, II 또는 III으로 나타내는 서열의 상보적 서열.
  4. 프라이머 쌍으로서,
    상류 프라이머가 아래에 나타낸 바와 같은 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열을 갖고;
    V. 서열번호 2에 나타낸 뉴클레오타이드 서열;
    VI. 서열번호 2에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 하나 이상의 염기를 변형하거나, 치환하거나, 결실시키거나, 부가하여 수득되는 뉴클레오타이드 서열;
    VII. 서열번호 2에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 2에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 CpG 섬으로부터 수득되는 기능적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열;
    VIII. V, VI 또는 VII에 나타낸 서열의 상보적 서열;
    하류 프라이머가 아래에 나타내는 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 프라이머 쌍:
    IX. 서열번호 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열;
    X. 서열번호 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 하나 이상의 염기를 변형하거나, 치환하거나, 결실시키거나, 부가하여 수득되는 뉴클레오타이드 서열;
    XI. 서열번호 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 CpG 섬으로부터 수득되는 기능적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열;
    XII. IX, X 또는 XI에 나타낸 서열의 상보적 서열.
  5. 임의의 하나의 하기 뉴클레오타이드 서열을 갖는 탐침:
    XIII. 서열번호 4에 나타낸 뉴클레오타이드 서열;
    XIV. 서열번호 4에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 하나 이상의 염기를 변형하거나, 치환하거나, 결실시키거나, 부가하여 수득되는 뉴클레오타이드 서열;
    XV. 서열번호 4에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열번호 4에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 CpG 섬으로부터 수득되는 기능적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열;
    XVI. XIII, XIV 또는 XV에 나타낸 상보적 서열.
  6. COL4A2 유전자의 메틸화 검출을 위한 포착 서열, 프라이머 및/또는 탐침을 포함하는 COL4A2 유전자의 메틸화 검출 시약으로서,
    바람직하게는 COL4A2 유전자의 CpG 섬으로부터 수득되는 포착 서열, 프라이머 및/또는 탐침을 포함하고;
    바람직하게는 COL4A2 유전자의 게노솜, 유전자간 영역, 프로모터 영역 또는 프로모터 영역 근처의 영역의 CpG 섬으로부터 수득되는 포착 서열, 프라이머 및/또는 탐침을 포함하고;
    바람직하게는 상기 포착 서열은 아래에 나타낸 임의의 뉴클레오타이드 서열을 갖고:
    I. 서열번호 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열;
    II. 서열번호 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 하나 이상의 염기를 변형하거나, 치환하거나, 결실시키거나, 부가하여 수득되는 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 CpG 섬으로부터 수득되는 기능적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열;
    III. 서열번호 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열 또는 서열번호 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 CpG 섬으로부터 수득되는 기능적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열;
    IV. I, II 또는 III에 나타내는 서열의 상보적 서열;
    상기 프라이머 쌍에서의 상류 프라이머는 아래에 나타낸 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열을 갖고:
    V. 서열번호 2에 나타낸 뉴클레오타이드 서열;
    VI. 서열번호 2에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 하나 이상의 염기를 변형하거나, 치환하거나, 결실시키거나, 부가하여 수득되는 뉴클레오타이드 서열;
    VII. 서열번호 2에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 2에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 CpG 섬으로부터 수득되는 기능적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열;
    VIII. V, VI 또는 VII에 나타낸 서열의 상보적 서열;
    상기 프라이머 쌍에서의 하류 프라이머는 아래에 나타내는 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열을 갖고:
    IX. 서열번호 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열;
    X. 서열번호 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 하나 이상의 염기를 변형하거나, 치환하거나, 결실시키거나, 부가하여 수득되는 뉴클레오타이드 서열;
    XI. 서열번호 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열번호 3에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 CpG 섬으로부터 수득되는 기능적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열;
    XII. IX, X 또는 XI에 나타낸 서열의 상보적 서열;
    바람직하게는 상기 탐침은 아래에 나타낸 임의의 하나의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 메틸화 검출 시약:
    XIII. 서열번호 4에 나타낸 뉴클레오타이드 서열;
    XIV. 서열번호 4에 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 하나 이상의 염기를 변형하거나, 치환하거나, 결실시키거나, 부가하여 수득되는 뉴클레오타이드 서열;
    XV. 서열번호 4에 나타낸 뉴클레오타이드 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 서열, 또는 서열번호 4에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 CpG 섬으로부터 수득되는 기능적으로 유사한 뉴클레오타이드 서열; 및
    XVI. XIII, XIV 또는 XV에 나타낸 상보적 서열.
  7. 청구항 3의 포착 서열, 또는 청구항 4의 프라이머 쌍, 또는 청구항 5의 탐침, 또는 청구항 6의 메틸화 검출 시약을 포함하는 키트로서,
    바람직하게는 상기 키트는 포착 서열을 포함하는 제1 용기; 증폭용 프라이머 쌍을 포함하는 제2 용기; 및 탐침을 포함하는 제3 용기를 포함하는 키트.
  8. 종양 검출에서 키트의 제조에서의 청구항 3의 포착 서열, 또는 청구항 4의 프라이머 쌍, 또는 청구항 5의 탐침, 또는 청구항 6의 메틸화 검출 시약의 용도로서,
    바람직하게는 상기 종양은 결장직장 종양이고;
    바람직하게는 상기 종양은 결장직장 암 또는 샘종이고;
    바람직하게는 검출을 위해 검출될 시료는 조직, 체액 또는 배설물이고;
    바람직하게는 상기 조직은 내장 조직이고;
    바람직하게는 상기 체액은 혈액, 혈청, 혈장, 세포외액, 조직액, 림프액, 뇌척수액 또는 방수이고;
    바람직하게는 상기 배설물은 가래, 타액, 소변 또는 대변인 용도.
  9. 종양 검출에서의 청구항 3의 포착 서열, 또는 청구항 4의 프라이머 쌍, 또는 청구항 5의 탐침, 또는 청구항 6의 메틸화 검출 시약, 또는 청구항 7의 키트의 용도로서,
    바람직하게는 상기 종양은 결장직장 종양이고;
    바람직하게는 상기 종양이 결장직장 암 또는 샘종이고;
    바람직하게는 상기 검출될 시료는 조직, 체액 또는 배설물이고;
    바람직하게는 상기 조직은 내장 조직이고;
    바람직하게는 상기 체액은 혈액, 혈청, 혈장, 세포외액, 조직액, 림프액, 뇌척수액 또는 방수이고;
    바람직하게는 상기 배설물은 가래, 소변, 타액 또는 대변인 용도.
  10. (1) 대상체의 COL4A2 유전자의 메틸화 수준을 검출하는 단계;
    (2) 대상체의 COL4A2 유전자의 메틸화 수준을 정상 대조군 시료의 메틸화 수준과 비교하는 단계;
    (3) 정상 대조군 시료의 메틸화 수준 대비 대상체의 COL4A2 유전자의 메틸화 수준에서의 증가에 따라, 정상 시료를 종양 시료와 구별하기 위해, 대상체가 종양을 갖거나 그 발생 위험이 있음을 표시하는 단계;를 포함하는 종양의 검출 방법으로서,
    바람직하게는 정상 시료는 COL4A2 유전자의 게노솜, 유전자간 영역 또는 프로모터 영역 및 프로모터 영역 근처의 영역에서 메틸화 수준을 검출함으로써 종양 시료와 구별되고;
    바람직하게는 정상 시료는 COL4A2 유전자의 프로모터 영역 및 프로모터 영역 근처의 영역의 메틸화 수준을 검출함으로써 종양 시료와 구별되고;
    바람직하게는 상기 메틸화 수준은 메틸화-특이적 PCR, 또는 메틸화-특이적 정량적 PCR, 또는 메틸화된 DNA-특이적 결합 단백질 PCR의 PCR, 정량적 PCR, 및 DNA 칩, 또는 메틸화-민감성 제한 엔도뉴클레아제, 또는 바이설파이트 서열분석, 또는 피로서열분석에 의해 검출되고;
    바람직하게는 상기 메틸화 수준은 메틸화-특이적 정량적 PCR에 의해 검출되고;
    바람직하게는 상기 메틸화 수준은 청구항 3의 포착 서열, 또는 청구항 4의 프라이머 쌍, 또는 청구항 5의 탐침, 또는 청구항 6의 메틸화 검출 시약, 또는 청구항 7의 키트를 사용하여 검출되고;
    바람직하게는 단계 (1)에서 상기 대상체의 COL4A2 유전자의 메틸화 수준을 검출하는 것은
    a) 자기 비드 포착 방법을 적용하여 검출될 시료의 DNA를 추출하는 단계;
    b) 하이드로설파이트, 바이설파이트 또는 하이드라진 염에 의해 검출될 시료의 DNA를 전환하는 단계;
    c) 메틸화-특이적 정량적 PCR 검출을 수행하는 단계;를 포함하고;
    바람직하게는 단계 a)에서 자기 비드 포착 방법을 적용하여 검출될 시료의 DNA를 추출하는 것은
    보호액 중 검출될 시료를 혼합하고 연마한 후, 원심분리하고, 상청액을 취하는 단계;
    상기 상청액을 원심분리하고, 상기 상청액을 취하여, 용해 용액 및 특이적인 상보적 올리고뉴클레오타이드 포착 서열을 갖는 자기 비드를 인큐베이션을 위해 상기 상청액 내로 첨가하는 단계;
    상기 상청액의 일부를 폐기하고, 상기 자기 비드를 세척하고, 깨끗한 원심분리 튜브로 옮기고, 세척액을 첨가하고, 0.5∼5분 동안 실온에서 100∼2000 rpm 하에 인큐베이션을 수행하고, 자기 프레임 상에 배치하여 상기 상청액을 피펫팅하고, 3회 반복하는 단계; 및
    상기 표적 유전자 DNA를 완충액으로 용출하는 단계;를 포함하는 방법.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 검출 기준은 하기와 같이:
    역치 값에 따라 종양 시료 및 정상 시료를 해석하고, 여기서 대변 시료에서의 Ct 값의 역치 값은 32∼42이고, 대변 시료의 Ct 값이 Ct 값의 역치 값 이하인 경우 종양 시료로 해석되고, 대변 시료의 Ct 값이 Ct 값의 역치 값 초과인 경우 정상 시료로 해석되고;
    조직 시료에서의 메틸화 수준 값의 역치 값은 1∼10이고, 조직 시료의 메틸화 수준 값이 메틸화 수준 값의 역치 값 이상인 경우 종양 시료로 해석되고; 조직 시료의 메틸화 수준 값이 메틸화 수준 값의 역치 값 미만인 경우 정상 시료로 해석되는 방법.
  12. (1) COL4A2 유전자의 메틸화 검출 구성요소;
    (2) 데이터 처리 구성요소;
    (3) 결과 출력 부재;를 포함하는 종양 검출 시스템으로서,
    바람직하게는 상기 메틸화 검출 구성요소는 형광 정량적 PCR 기기, PCR 기기 및 서열분석기 중 하나 이상을 포함하고;
    바람직하게는 상기 메틸화 검출 구성요소는 제3항의 포착 서열, 또는 청구항 4의 프라이머 쌍, 또는 청구항 5의 탐침, 또는 청구항 6의 메틸화 검출 시약, 또는 청구항 7의 키트를 추가로 포함하고;
    바람직하게는 상기 데이터 처리 구성요소는 a. 테스트될 시료 및 정상 대조군 시료의 테스트 데이터를 수신하고; b. 테스트될 시료 및 정상 대조군 시료의 테스트 데이터를 저장하고; c. 동일한 유형의 테스트될 시료 및 정상 대조군 시료의 테스트 데이터를 비교하고; 및 d. 비교 결과에 따라 대상체가 종양을 겪을 확률 또는 가능성에 반응하도록 구성되고;
    바람직하게는 상기 결과 출력 구성요소는 대상체가 종양을 겪을 확률 또는 가능성을 출력하기 위해 사용되고;
    바람직하게는 상기 데이터 처리 구성요소의 판단 기준은 하기와 같이:
    역치 값에 따라 종양 시료 및 정상 시료를 해석하며;
    여기서 대변 시료에서의 Ct 값의 역치 값은 32∼42이고, 대변 시료의 Ct 값이 Ct 값의 역치 값 미만인 경우 대변 시료는 종양 시료로 해석되고, 대변 시료의 Ct 값이 Ct 값의 역치 값 이상인 경우 대변 시료는 정상 시료로 해석되고;
    조직 시료에서의 메틸화 수준 값의 역치 값은 1∼10이고, 조직 시료의 메틸화 수준 값이 메틸화 수준 값의 역치 값 초과인 경우 종양 시료로 해석되고; 메틸화 수준 값이 메틸화 수준 값의 역치 값 이하인 경우 정상 시료로 해석되는 종양 검출 시스템.
  13. 청구항 10 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 종양은 결장직장 종양이고;
    바람직하게는, 상기 종양은 결장직장 암 또는 샘종인 방법, 또는 시스템.
  14. 청구항 10 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시스템 또는 방법은 시료 유형을 조직, 체액 또는 배설물로서 검출하고;
    바람직하게는 상기 조직은 내장 조직이고;
    바람직하게는 상기 체액은 혈액, 혈청, 혈장, 세포외액, 조직액, 림프액, 뇌척수액 또는 방수이고;
    바람직하게는 상기 배설물은 가래, 소변, 타액 또는 대변인 방법 또는 시스템.
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