CN105861693A - 基于高通量dna甲基化组学信息的分子诊断检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于高通量DNA甲基化组学信息的分子诊断检测方法，产生高通量组学原始数据的平台主要有DNA甲基化450K高通量芯片及表观亚硫酸氢盐测序技术RRBS。所采用的方法涉及到多染色体链和多片段的拼接和重组定位等一系列先前步骤；其次是根据全局染色体片段定位信息并结合高通量组学的信息在全部细胞系中进行全染色体组型筛查，对照多模态的参考组，最终实现染色体双链中的高危及致癌关联片段的检测与诊断。该发明填补了国内外分子检测诊断领域中的单源性和可靠度低等多种缺点，在基础研究和临床医学诊断领域具有较好的市场开发前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于高通量DNA甲基化组学信息的分子诊断检测方法，属于高通量组学技术在生物医学无创检测技术应用领域。
背景技术
DNA 甲基化是一类重要的表观遗传学过程。其在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用。随着对甲基化研究水平的提升，其检测与分析技术越来越受到学术和工程应用领域的重视。根据不同的研究和应用目的，目前已有基于限制性内切酶、甲基化敏感性单核苷酸药物延伸、甲基化敏感扩增多态性和免疫化学法等多种甲基化检测分析方法，但大部分在技术上还存在一定缺陷或是实现需要精密且成本更为昂贵的检测仪器，由此在相当大的程度上限制了该类技术在学术研究和工程领域的应用范围。我们前期的工作已经围绕全基因组 DNA 甲基化的检测和分析开展了一定程度研究，并鉴于目前 DNA 甲基化检测与分析技术所存在问题，提出了新的思路和途径。
发明内容
目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种基于高通量DNA甲基化组学信息的分子诊断检测方法，提供一类基于多路互验的检测技术与分析途径。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种基于高通量DNA甲基化组学信息的分子诊断检测方法，包括以下步骤：
步骤（1）：基于基因微阵列 SAGE 的全基因组 DNA 甲基化水平检测与分析；
步骤（2）：基于染色质免疫共沉淀 ChIP 的全基因组 DNA 甲基化水平检测与分析；
步骤（3）：基于重亚硫酸盐加克隆测序 RRBS 的 DNA 甲基化水平检测与分析。
所述步骤（1）具体是指：
1A）利用基因微阵列 SAGE
技术构建样本文库，并进行测序和定位分析，从而获得相关蛋白在全基因组内的分布特征及状态水平信息；
1B）基于细胞系或组织样本进行基因微阵列 SAGE
技术的全基因组 DNA 甲基化水平图谱的构建；
1C）基于多样本数据进行批次效益预处理后，进行相关位点的全基因组定位和差异化位点鉴定。
所述步骤（2）具体是指：
2A）利用染色质免疫共沉淀 ChIP 技术，结合基因芯片技术，完善相关细胞系或组织样本中目标蛋白与基因组中 DNA关键研究对象的全基因组定位；
2B）利用基因组位点以及前期测序丰度关键信息，确定目标蛋白与基因组中 DNA相互作用位点；并在 RT-PCR 扩增实验的基础上进一步验证本步骤结论的可重复性和可信度；
2C）结合二代测序技术，确定转录因子绑定位点信息，并以此考查和验证本步骤结论的可靠性。
所述步骤（3）具体是指：
3A）利用重亚硫酸氢钠在碱性条件和氢醌的催化下处理 DNA，使非甲基化的胞嘧啶发生脱氧基反应，从而转变成尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶不发生反应；
3B）并在此基础上，通过 DNA 直接测序、限制性内切酶分析以及设计不同引物的PCTR 扩增方法测出相应序列的甲基化水平；
3C）在此结合 RT-PCR 扩增实验，进一步验证本步骤所得结论的可重复性和可信度。
步骤（4）：基于上述实验步骤和相关结论，结合多源信息融合的途径，对 DNA 甲基化水平进行定性和定量化的评价与鉴定。
该部分计算分析需要结合适当实验验证环节来开展，从而使得实验与计算部分的结论具有较高的可信度和可重复性，同时能够在试验和计算可控范围内，大大提高 DNA甲基化的检测和分析精度，缩小检测和鉴定的时间。
本发明基于现有 DNA 分子表达水平检测与实验设备，提出了多源组学信息融合互验的检测和分析途径。相关的检测和分析对象可以采用实验室常用的细胞系和组织样本，因此具有较大的适用范围和市场前景。
有益效果：本发明提供的基于高通量DNA甲基化组学信息的分子诊断检测方法，利用基因微阵列 SAGE 技术、染色质免疫共沉淀 ChIP 技术、重亚硫酸盐加克隆测序 RRBS 技术，开创性提出了多源基因组学资源融合的 DNA 甲基化检测与分析技术，填补了国内外在此项研究上的空白；能够实现多源实验平台组学信息的快速整合、DNA 甲基化水平的高精度检测与分析等用途，并且具有软硬件实现成本较低，适用范围较广的优点。另外该技术方法相对工艺简单，不需要使用专用设备，不需要特殊环境资源，对环境无污染等特点。
附图说明
图1是本发明的流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明。
如图1所示， 一种基于高通量DNA甲基化组学信息的分子诊断检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤（1）：基于基因微阵列 SAGE 的全基因组 DNA 甲基化水平检测与分析；具体是指：
1A）利用基因微阵列 SAGE
技术构建样本文库，并进行测序和定位分析，从而获得相关蛋白在全基因组内的分布特征及状态水平信息；
1B）基于细胞系或组织样本进行基因微阵列 SAGE
技术的全基因组 DNA 甲基化水平图谱的构建；
1C）基于多样本数据进行批次效益等预处理后，进行相关位点的全基因组定位和差异化位点鉴定。
步骤（2）：基于染色质免疫共沉淀 ChIP 的全基因组 DNA 甲基化水平检测与分析；具体是指：
2A）利用染色质免疫共沉淀 ChIP 技术，结合基因芯片技术，完善相关细胞系或组织样本中目标蛋白与基因组中 DNA等关键研究对象的全基因组定位等步骤；
2B）利用基因组位点以及前期测序丰度等关键信息，确定目标蛋白与基因组中 DNA相互作用位点；并在 RT-PCR 扩增实验的基础上进一步验证结论的可重复性和可信度；
2C）结合二代测序技术，确定转录因子绑定位点等信息，并以此考查和验证上述结论的可靠性。
步骤（3）：基于重亚硫酸盐加克隆测序 RRBS 的 DNA 甲基化水平检测与分析，具体是指：
3A）利用重亚硫酸氢钠在碱性条件和氢醌的催化下处理 DNA，可使非甲基化的胞嘧啶发生脱氧基反应，从而转变成尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶不发生反应；
3B）并在此基础上，通过 DNA 直接测序、限制性内切酶分析以及设计不同引物的PCTR 扩增等方法测出相应序列的甲基化水平；
3C）在此结合 RT-PCR 扩增实验，进一步验证本步骤所得结论的可重复性和可信度。
步骤（4）：基于上述实验步骤和相关结论，结合多源信息融合的途径，对 DNA 甲基化水平进行定性和定量化的评价与鉴定。
该部分计算分析需要结合适当实验验证环节来开展，从而使得实验与计算部分的结论具有较高的可信度和可重复性，同时能够在试验和计算可控范围内，大大提高 DNA甲基化的检测和分析精度，缩小检测和鉴定的时间。
本发明基于现有 DNA 分子表达水平检测与实验设备，提出了多源组学信息融合互验的检测和分析途径。相关的检测和分析对象可以采用实验室常用的细胞系和组织样本，因此具有较大的适用范围和市场前景。
本发明提供的基于高通量DNA甲基化组学信息的分子诊断检测方法，产生高通 量 组 学 原 始 数 据 的 平 台 主 要 有 DNA 甲 基 化 450K 高 通 量 芯 片 （ Illumina Human
Methylation450 DNA BeadChip）及表观亚硫酸氢盐测序技术 RRBS（Reduced Representation Bisulfite
Sequencing）。所采用的方法涉及到多染色体链和多片段的拼接和重组定位等一系列先前步骤；其次是根据全局染色体片段定位信息并结合高通量组学的信息在全部细胞系中进行全染色体组型筛查，对照多模态的参考组，最终实现染色体双链中的高危及致癌关联片段的检测与诊断。该发明填补了国内外分子检测诊断领域中的单源性和可靠度低等多种缺点，在基础研究和临床医学诊断领域具有较好的市场开发前景。
利用基因微阵列 SAGE 技术、染色质免疫共沉淀 ChIP
技术、重亚硫酸盐加克隆测序 RRBS 技术，开创性提出了多源基因组学资源融合的 DNA 甲基化检测与分析技术，填补了国内外在此项研究上的空白；能够实现多源实验平台组学信息的快速整合、DNA 甲基化水平的高精度检测与分析等用途，并且具有软硬件实现成本较低，适用范围较广的优点。另外该技术方法相对工艺简单，不需要使用专用设备，不需要特殊环境资源，对环境无污染等特点。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种基于高通量DNA甲基化组学信息的分子诊断检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤（1）：基于基因微阵列 SAGE 的全基因组 DNA 甲基化水平放的检测与分析过程；
步骤（2）：基于染色质免疫共沉淀 ChIP 的全基因组 DNA 甲基化水平的检测与分析过程；
步骤（3）：基于重亚硫酸盐加克隆测序 RRBS 的 DNA 甲基化水平的检测与分析过程。
2.根据权利要求1所述的基于高通量DNA甲基化组学信息的分子诊断检测方法，其特征在于：所述步骤（1）具体是指：
1A）利用基因微阵列 SAGE 技术构建样本文库，并进行测序和定位分析，从而获得相关蛋白在全基因组内的分布特征及状态水平信息；
1B）基于细胞系或组织样本进行基因微阵列 SAGE 技术的全基因组 DNA 甲基化水平图谱的构建；
1C）基于多样本数据进行批次效益预处理后，进行相关位点的全基因组定位和差异化位点鉴定。
3.根据权利要求1所述的基于高通量DNA甲基化组学信息的分子诊断检测方法，其特征在于：所述步骤（2）具体是指：
2A）利用染色质免疫共沉淀 ChIP 技术，结合基因芯片技术，完善相关细胞系或组织样本中目标蛋白与基因组中 DNA关键研究对象的全基因组定位；
2B）利用基因组位点以及前期测序丰度关键信息，确定目标蛋白与基因组中 DNA相互作用位点；并在 RT-PCR 扩增实验的基础上进一步验证本步骤结论的可重复性和可信度；
2C）结合二代测序技术，确定转录因子绑定位点信息，并以此考查和验证本步骤结论的可靠性。
4.根据权利要求1所述的基于高通量DNA甲基化组学信息的分子诊断检测方法，其特征在于：所述步骤（3）具体是指：
3A）利用重亚硫酸氢钠在碱性条件和氢醌的催化下处理 DNA，使非甲基化的胞嘧啶发生脱氧基反应，从而转变成尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶不发生反应；
3B）并在此基础上，通过 DNA 直接测序、限制性内切酶分析以及设计不同引物的PCTR 扩增方法测出相应序列的甲基化水平；
3C）在此结合 RT-PCR 扩增实验，进一步验证本步骤所得结论的可重复性和可信度。
5.根据权利要求1所述的基于高通量DNA甲基化组学信息的分子诊断检测方法，其特征在于：还包括步骤（4）：基于上述实验步骤和相关结论，结合多源信息融合的途径，对 DNA 甲基化水平进行定性和定量化的评价与鉴定。
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