KR20220077907A - 라이브러리 구축 방법 및 응용 - Google Patents

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치아오송 정
시아오 스
위천 지아오
민 천
카이화 장
스전 왕
하이 옌
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제네트론 헬쓰 (베이징) 코, 엘티디.
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Abstract

본 발명은 라이브러리 구축 방법 및 응용을 개시한다. 피검 샘플 표적 유전자 피검 영역의 변이 상황을 검출하기 위한 앰플리콘 라이브러리 구축 방법을 제공하며, 여기에는 1) 표적 영역에 따라 업스트림 외부 프라이머 F1, 업스트림 내부 프라이머 F2 및 다운스트림 프라이머 R을 설계 및 합성하는 단계; 2)상기 업스트림 외부 프라이머 F1, 상기 업스트림 내부 프라이머 F2 및 상기 다운스트림 내부 프라이머 R을 사용하여, 단일 단계법 PCR 증폭을 수행하여 증폭 산물, 즉 표적 영역의 앰플리콘 라이브러리를 획득하는 단계가 포함된다. 상기 단일 단계법 라이브러리 구축 기술은 IonTorrent, illumina 및 BGI/MGI를 포함한 모든 2세대 플랫폼에 적용할 수 있으며, 이 라이브러리 구축 방법을 기반으로 DNA에 대한 SNP, Ins/Del, CNV, 메틸화된 검출, 및 RNA 샘플에 대한 유전자 융합과 발현의 검출 제품을 개발하였다.

Description

라이브러리 구축 방법 및 응용
본 발명은 분자 생물학의 기술 분야에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 라이브러리 구축 방법 및 응용에 관한 것이다.
일반적으로 현재 단계에서 표적 영역의 서열에 대해 시퀀싱 및 분석을 수행하기 위해서는 먼저 라이브러리를 구축해야 하며 라이브러리 구축 방식은 전반적으로 포획 라이브러리 구축과 증폭 라이브러리 구축에 불과하다.
포획 라이브러리 구축은 상대적으로 설명하면 게놈의 비교적 큰 영역, 예를 들어 수십 또는 수백 개의 유전자 전체 엑솜 영역의 풍부 라이브러리 구축을 수행하는 것이다. 다중 증폭 라이브러리 구축은 특정 핫스팟 영역, 또는 개별 유전자의 전체 엑손의 표적 포획과 시퀀싱 분석을 수행하는 것이다.
증폭 라이브러리 구축 방법은 표적 영역에 따라 상응하는 특이적 프라이머를 설계한 후, 이러한 프라이머를 사용해 표적 서열에 대해 다중 증폭을 수행하는 것이다. 유의할 점은 이러한 특이적 프라이머가 시퀀싱 어댑터를 직접 갖거나 브리징 서열을 가진 후 2차 PCR 증폭을 거치며 여기에 시퀀싱 어댑터를 추가하는 것이 일반적인 증폭 라이브러리 구축 과정이라는 것이다. 종래의 증폭 라이브러리 구축 방식은 적용 시 일부 문제점이 있다. 예를 들어 라이브러리 구축 과정은 적어도 2회의 PCR 증폭 및 2회의 대응하는 라이브러리 정제가 필요해 번거로우며 수작업 시간이 비교적 길고 라이브러리 구축 작업자에 대한 요건이 높아 보급이 어렵다. 프라이머 설계, 시스템 최적화가 비교적 복잡하고 라이브러리 구축 비용이 비교적 높으며 전체 라이브러리 구축 프로세스에 소요되는 시간이 비교적 긴 폐단 등이 있다.
증폭 라이브러리 구축 방식에 존재하는 각종 문제를 고려하여 본 발명은 하기의 기술적 해결책을 제공한다.
본 발명의 목적은 표적 유전자 변이 상황을 검출하는 앰플리콘 라이브러리 구축용 프라이머 조합을 제공하는 데에 있다.
본 발명에서 제공하는 프라이머 조합은,
표적 앰플리콘에 따라 설계된 업스트림 외부 프라이머 F1, 업스트림 내부 프라이머 F2 및 다운스트림 프라이머 R를 포함한다.
상기 업스트림 외부 프라이머 F1은 시퀀싱 어댑터 서열 1, 상이한 샘플을 구분하기 위한 바코드 서열 및 범용 서열로 순차적으로 구성된다.
상기 업스트림 내부 프라이머 F2는 범용 서열과 상기 표적 앰플리콘의 업스트림 특이적 프라이머 서열로 순차적으로 구성된다(검출 조직 샘플은 분자 태그가 추가되지 않을 수 있음).
상기 다운스트림 외부 프라이머 R은 시퀀싱 어댑터 2 및 상기 표적 앰플리콘의 다운스트림 특이적 프라이머 서열로 순차적으로 구성된다.
상술한 프라이머 조합에서 선택적으로 저주파 돌연변이를 검출할 때 분자 태그를 추가해야 하며, 상기 업스트림 내부 프라이머 F2는 범용 서열, 분자 태그 서열 및 상기 표적 앰플리콘의 업스트림 특이적 프라이머 서열로 순차적으로 구성된다.
상기 분자 태그 서열은 6 내지 30개 염기로 구성되며, 무작위 염기 및 0-N(N은 ≥0인 정수)세트 특이적 염기를 포함한다. 상기 특이적 염기는 무작위 염기에 설치되며, 예를 들어 1세트, 2세트, 3세트 또는 4세트가 설치된다. 상기 각 세트의 특이적 염기는 1 내지 5개 염기로 성되며, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개이다.
상기 각 세트의 염기 서열은 무작위로 선택되며, 상기 분자 태그 서열은 상이한 시작 DNA 템플릿 분자를 구분하는 데 사용된다. 1차 라이브러리 구축 과정에서 상기 분자 태그 서열 중 특정 염기의 위치와 구성이 고정된 것을 제외하고는, 무작위 염기의 염기 클래스(A, T, G, C)는 임의로 선택된다.
예를 들어, 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 특정 염기는 1세트 또는 2세트로 설치되며, 서열은 ACT 및/또는 TGA이다. 예를 들어, 본 실시예에 있어서 상기 분자 태그 서열은 NNNNNACTNNNNTGA이고, 여기에서 ACT 및 TGA는 특정 염기이고 N은 무작위 염기이고, N은 A, T, C 또는 G이다.
상술한 프라이머 조합에 있어서, 상기 시퀀싱 어댑터 1과 상기 시퀀싱 어댑터 2는 상이한 시퀀싱 플랫폼에 따라 대응하는 시퀀싱 어댑터를 선택한다.
상술한 프라이머 조합에 있어서,
상기 시퀀싱 플랫폼은 Illumina 플랫폼이고, 상기 시퀀싱 어댑터 1은 I5이고, 상기 시퀀싱 어댑터 2는 I7이다.
또는 상기 시퀀싱 플랫폼은 Ion Torrent 플랫폼이고, 상기 시퀀싱 어댑터 1은 A이고, 상기 시퀀싱 어댑터 2는 P이다.
또는 상기 시퀀싱 플랫폼은 BGI/MGI 플랫폼이다.
또는 상기 범용 서열의 뉴클레오티드 서열은 서열 1이다.
본 발명의 다른 목적은 표적 유전자 변이 상황을 검출하는 앰플리콘 라이브러리 구축용 키트를 제공하는 데에 있다.
본 발명에서 제공하는 키트는 상술한 프라이머 조합을 포함한다.
상술한 키트에 있어서, PCR 증폭 버퍼와 DNA 중합효소 시스템이 더 포함된다.
본 발명의 또 다른 목적은 상술한 프라이머 조합 또는 키트의 어느 하나의 하기 응용을 제공하는 데에 있다.
(1) 표적 유전자 변이 상황을 검출하는 앰플리콘 라이브러리 구축에서의 응용
(2) 피검 샘플 표적 영역 돌연변이 부위 또는 변이 상황 검출에서의 응용
(3) 피검 샘플 표적 영역의 변이 빈도 검출에서의 응용
본 발명의 또 다른 목적은 표적 유전자 변이 상황을 검출하는 앰플리콘 라이브러리 구축 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명에서 제공하는 방법은 하기 단계를 포함한다.
상술한 프라이머 조합 또는 상술한 키트를 이용하여, 피검 샘플의 DNA 또는 cDNA를 템플릿으로 하여 단일 단계 PCR 증폭을 수행하여 증폭 산물, 즉 표적 유전자의 앰플리콘 라이브러리를 획득한다.
상술한 방법에 있어서, 단일 단계 PCR 증폭을 수행하는 증폭 시스템에서 업스트림 외부 프라이머 F1, 업스트림 내부 프라이머 F2 및 다운스트림 프라이머 R의 몰비는 (5-20):(1-20):(5-20)이다.
상술한 방법에 있어서, 상기 피검 샘플은 조직 샘플, 냉동 샘플, 천자 샘플, FFPE 샘플, 혈액, 소변, 뇌척수액, 흉수 또는 기타 체액이다.
상술한 방법은 피검 샘플 표적 유전자 돌연변이 부위 또는 변이 상황 검출에서의 응용이다.
상술한 방법은 피검 샘플 표적 유전자의 변이 빈도 검출에서의 응용이다.
상술한 방법으로 제조된 앰플리콘 라이브러리도 본 발명의 범위에 속한다.
본 발명의 또 다른 목적은 피검 샘플 표적 유전자의 변이 상황을 검출하는 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명에서 제공하는 방법은 하기 단계를 포함한다.
1) 상술한 방법을 이용해 표적 유전자의 앰플리콘 라이브러리를 제조한다.
2) 모든 샘플의 표적 유전자의 앰플리콘 라이브러리를 혼합한 후 희석하여 시퀀싱 DNA 라이브러리를 획득한다.
3) 상기 시퀀싱 DNA 라이브러리를 시퀀싱하여 시퀀싱 결과를 획득하고, 시퀀싱 결과에 따라 피검 샘플 표적 유전자의 변이 상황을 분석한다.
본 발명의 또 다른 목적은 피검 샘플 표적 영역의 변이 빈도를 검출하는 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명에서 제공하는 방법은 하기 단계를 포함한다.
1) 상술한 방법을 이용해 표적 유전자의 앰플리콘 라이브러리를 제조한다.
2) 모든 샘플의 표적 유전자의 앰플리콘 라이브러리를 혼합한 후 희석하여 시퀀싱 DNA 라이브러리를 획득한다.
3) 상기 시퀀싱 DNA 라이브러리를 시퀀싱하여 시퀀싱 결과를 획득하고, 시퀀싱 결과에 따라 피검 샘플 표적 유전자의 변이 빈도를 계산한다.
변이 빈도=돌연변이 클러스터의 수량/유효 클러스트의 총 수량*100%.
상술한 방법에 있어서, 상기 피검 샘플은 인비트로 조직 샘플, 냉동 샘플, 천자 샘플, FFPE 샘플, 혈액, 소변, 뇌척수액 또는 흉수이다.
상술한 방법은 선택적으로,
상기 범용 서열의 뉴클레오티드 서열은 서열 1이다.
상기 시퀀싱 어댑터 1의 뉴클레오티드 서열은 서열 2이다.
상기 시퀀싱 어댑터 2의 뉴클레오티드 서열은 서열 17이다.
예를 들어, 피검 표적 유전자가 EGFR인 경우, 선택적으로, 대응하는 업스트림 특이적 프라이머 서열과 다운스트림 특이적 프라이머 서열은 각각 서열 14 및 서열 18, 또는 서열 15 및 서열 19, 또는 서열 21 및 서열 24, 또는, 서열 22 및 서열 25이다.
피검 표적 유전자가 ERBB2인 경우, 선택적으로 대응하는 업스트림 특이적 프라이머 서열 및 다운스트림 특이적 프라이머 서열은 각각 서열 16 및 서열 20, 또는 서열 23 및 서열 26이다.
피검 표적 유전자가 EML4인 경우, 선택적으로 대응하는 업스트림 특이적 프라이머 서열 및 다운스트림 특이적 프라이머 서열은 각각 서열 27 및 서열 31, 또는 서열 28 및 서열 31이다.
피검 표적 유전자가 LMNA인 경우, 선택적으로 대응하는 업스트림 특이적 프라이머 서열 및 다운스트림 특이적 프라이머 서열은 각각 서열 29 및 서열 32이다.
피검 표적 유전자가 MYC인 경우, 선택적으로 대응하는 업스트림 특이적 프라이머 서열 및 다운스트림 특이적 프라이머 서열은 각각 서열 30 및 서열 33이다.
예를 들어, 상기 바코드 서열은 모두 길이가 6 내지 12nt이고 3개 이상의 연속 염기가 없으며 GC 함량이 40 내지 60%인 뉴클레오티드이다.
상기 범용 서열 1과 상기 범용 서열 2의 길이는 일반적으로 16 내지 25nt이고, 연속 염기가 없고, GC 함량은 35 내지 65%이며, 현저한 2차 구조가 없다.
예를 들어, 상기 분자 태그 서열는 6 내지 15개의 무작위 염기를 포함하는 서열이고, 상술한 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 실시예 중 예를 들어 상이한 샘플을 구분하기 위한 바코드 서열은 각각 서열 3 내지 서열 12이다.
변이 상황은 점 돌연변이, 결실 또는 삽입 또는 단편 융합일 수 있다.
본 발명은 상기 기술적 해결책을 채택함으로써 다음의 장점을 가진다.
1. 샘플 용량이 적고 이용률이 높다. 샘플에서 원래 템플릿 분자의 포획 효율이 높고 필요한 시작 템플릿의 양이 상대적으로 적다. 생식계열 돌연변이(germline mutation) 검출 시에는 심지어 pg 등급의 시작 템플릿량만 필요하다. cfDNA의 저주파 돌연변이 검출을 수행할 경우 제한된 시작 템플릿량으로 더 높은 템플릿 포획 효율을 달성하여 미량 ctDNA 분자의 효과적인 포획을 실행하고 더 낮은 검출 한계와 더 높은 감도를 구현할 수 있다.
2. 검출 한계가 매우 낮다. 고유한 프라이머 설계, 세트로 매칭된 PCR 반응 시스템, 반응 조건 및 후속 정보 분석 노이즈 저감 시스템은 최종적으로 3/10,000의 최저 돌연변이 검출 한도를 구현하고, 초초기 및 미량 ctDNA 샘플 돌연변이의 정확한 검출을 가능하게 하였다.
3. 라이브러리 균일성이 우수하다. 혁신적인 프라이머 구조 설계 및 세트로 매칭된 반응 시스템은 라이브러리 중 앰플리콘의 균일성을 최적의 수준으로 만든다. 다중 증폭은 각 앰플리콘 사이의 서열 구조 특징과 각 프라이머 사이의 증폭 효율이 다르기 때문에, 최종적으로 라이브러리 앰플리콘 풍부도에 큰 차이를 초래한다. 앰플리콘 풍부도 차이의 균형을 어떻게 맞추느냐는 라이브러리 품질을 평가하는 하나의 중요한 지표이다. 본 발명에서 채택하는 3부분 기능 프라이머의 성분 구성은 이전의 4성분 버전과 비교할 때 현저한 장점을 가진다. 이는 프라이머 구성 및 반응 시스템이 매칭되어 상기 방법이 앰플리콘 차등 증폭을 감소된 순환 수로 제어하도록 보장한다. 그 후 범용 프라이머 증폭과 유사한 방식을 채택하는데, 하기 도면에서 R1과 R2 사이의 경쟁이 존재하지 않으므로 후속 순환에서 안정적이고 낮은 차등 증폭의 목적이 달성된다.
4. 중복 가능성이 높다. 4기능 프라이머의 성분 구성은 반응 시스템과 반응 조건의 불확실성을 증가시킬 수 있고, 샘플 품질, 반응 시스템 및 외부 환경 영향에 보다 민감하게 반응한다. 반면 3기능 프라이머의 성분 구성은 이러한 측면에서 개선되었으며, 더욱 간단한 시스템 구성은 시스템을 보다 안정적으로 만들고 샘플 검출 반복성과 정확도는 더 높다.
5. 조작이 간편하고 시간이 절약된다. 종래의 라이브러리 구축 포획 기술은 조작이 번거롭고 프로세스가 길다. 전체 라이브러리 구축 프로세스는 거의 48시간이 걸리고 작업자에 대한 요건이 까다롭다. 일반 증폭 라이브러리 구축 방법은 적어도 2회 PCR 및 2회 정제가 필요하며, 후속적인 QPCR 정량화를 포함하여 전체 라이브러리 구축 프로세스는 적어도 1영업일이 소요된다. 본 발명은 단일 단계 PCR 반응 및 대응 산물 정제 단계만을 언급하며 실제 라이브러리 구축 프로세스는 1.5시간 이내에 완료될 수 있어 라이브러리 구축의 작업 프로세스를 단순화하고 라이브러리 구축 시간을 절약할 수 있다(라이브러리 구축은 1.5시간 이내에 완료될 수 있으며, 라이브러리 구축에서 기계 종료 및 생물정보학 분석 완료까지의 전체 프로세스를 22시간 이내에 제어 가능).
6. 여러 유형의 변이를 검출할 수 있다. DNA 샘플에서 시작하여 SNP, SNV, Ins/Del, 메틸화, 유전자 또는 엑손 수준에서 복제 수 변이를 검출할 수 있으며, 염색체 팔 수준에서 복제 수 변이를 검출할 수 있다. 그 외, 프라이머에 분자 태그를 추가한 후, 낮게는 1‰ 수준의 돌연변이를 검출할 수도 있으며, RNA 샘플에서 시작해 특정 유전자의 발현, 특정 유전자 사이의 융합 등을 검출할 수 있다.
7. 샘플 유형이 다양하다. 시작 샘플은 신선한 조직 샘플, 냉동 샘플, 천자 샘플, FFPE 샘플 등 조직 샘플 유형일 수 있으며, 동시에 혈액, 소변, 뇌척수액 및 흉수 등에서 분리된 cfDNA 또는 CTC 등도 검출할 수 있다. 정상적인 샘플은 DNA 또는 RNA 추출 후 단일 단계법 신속 증폭 라이브러리 구축 방법으로 라이브러리 구축을 수행할 수 있다.
8. 샘플 간의 교차 오염을 효과적으로 방지한다. PCR 시작에서 상이한 샘플을 구분하는 바코드 서열을 추가하며, 작업 프로세스 및 단계의 단순화는 라이브러리 구축 과정에서 초래될 수 있는 교차 오염을 방지하며, 특히 저주파 변이 검출 시 샘플 간의 교차 오염도가 매우 높아 위양성 돌연변이로 판단될 수 있다.
9. 라이브러리 구축 비용이 절감된다. 종래의 포획 기술과 비교할 때 상기 라이브러리 제조에 소요되는 비용이 크게 절감된다. 종래의 포획 라이브러리 구축 시 사용되는 포획 프로브는 비용이 높으며, 긴 실험 과정에 수반되는 시약 소모품도 포획 라이브러리 구축 비용을 증가시킨다. 상대적으로 단일 단계법 라이브러리 구축 과정은 시약 사용량이 크게 줄어들고 라이브러리 구축 비용도 종래 포획 라이브러리 구축 방법보다 훨씬 낮다. 동시에 단일 단계법 신속 증폭 라이브러리 구축 방식에 비해, 일반 증폭 라이브러리 구축 방식에서 적어도 1회의 PCR 및 1회의 정제, 및 라이브러리의 QPCR 정량적 단계 등이 라이브러리 구축 비용을 크게 증가시킬 수 있다. 3기능 프라이머 성분은 이전의 4 프라이머 기능 성분에 비해 프라이머 총량과 프라이머 각 성분 용량 측면에서 더욱 낮다. 따라서 더욱 낮은 비용 우위가 있다.
10. 공간이 절약된다. 본 방법은 1회 PCR만 필요하므로 실험실에는 3개의 방(샘플 추출, PCR 증폭실, 라이브러리 정제 및 시퀀싱)만 필요하나, 종래의 라이브러리 제작에는 4개의 방(샘플 추출, PCR1, PCR2 및 라이브러리 정제, 시퀀싱)이 필요하므로 공간 수요가 감소한다.
유연하고 간단한 라이브러리 구축 방법, 다양한 변이 유형의 검출 가능성 및 매우 높은 검출 감도가 본 발명의 가장 큰 특징이다.
도 1은 단일 단계법 신속 증폭 라이브러리 구축 기술의 프라이머 구성이다.
도 2는 신속 증폭 라이브러리 구축 기술의 템플릿 증폭 시에 대한 산물 상황이다.
도 3은 BRCA1/2 단일 단계법 프라이머풀로 구축한 라이브러리의 Agilent2200 결과이다.
도 4는 BRCA1/2 단일 단계법 프라이머 풀로 구축한 라이브러리의 시퀀싱 앰플리콘 균일성 상황이다.
도 5는 4기능 프라이머와 3기능 프라이머 각 성분 기능 구조도이다.
도 6은 3기능 성분 프라이머와 4기능 성분 프라이머 풀로 구축된 라이브러리의 균일성 결과이다.
도 7은 30ng cfDNA의 단일 단계법 프라이머 풀을 사용하여 라이브러리 구축을 수행하고, 데이터 분석 후 획득한 그 중 하나의 앰플리콘의 클러스터 수(분자 태그 종류 수)이다.
도 8은 두 가지 방법으로 라이브러리를 구축한 후 0.1‰ 내지 1‰ 수준의 배경 노이즈이다.
도 9는 실시예 2에서 구축한 라이브러리의 Agilent 2200 TapeStation 결과이다.
도 10은 실시예 3에서 구축한 라이브러리의 Agilent 2200 TapeStation 결과이다.
도 11은 실시예 4에서 구축한 라이브러리의 Agilent 2200 TapeStation 결과이다.
이하의 실시예에 사용된 실험 방법은 달리 명시되지 않는 한 모두 일반적인 방법이다.
이하의 실시예에 사용된 재료, 시약 등은 특별한 설명이 없는 한 모두 상업적 경로를 통해 획득할 수 있다.
실시예 1. 단일 단계법 앰플리콘 시퀀싱 라이브러리의 라이브러리 구축의 프라이머 설계와 합성
一. 단일 단계법 앰플리콘 시퀀싱 라이브러리의 라이브러리 구축의 프라이머 설계
본 발명은 2세대 시퀀싱 라이브러리의 증폭 라이브러리 구축 방법을 구축하는 데 사용되며, 상기 방법에서 구체적으로 언급된 프라이머 구조 상황은 하기와 같다(도 1 참조).
업스트림 외부 프라이머 F1: 5'-시퀀싱 어댑터 서열 1 + 바코드 서열 + 범용 서열-3'
업스트림 내부 프라이머 F2: 5'-범용 서열 + 분자 태그 서열 + 유전자 업스트림 특이적 프라이머 서열-3'
또는 업스트림 내부 프라이머 F2: 5'-범용 서열 + 유전자 업스트림 특이적 프라이머 서열-3'(저주파 돌연변이 검출 시 분자 태그를 추가해야 하며, 조직 샘플 검출은 분자 태크를 추가하지 않을 수 있음)
다운스트림 프라이머 R: 5'-시퀀싱 어댑터 서열 2 + 유전자 다운스트림 특이적 프라이머 서열-3'
저주파 돌연변이를 검출할 때, 상기 업스트림 내부 프라이머 F2의 구조는 5'-범용 서열 + 분자 태그 서열 + 유전자 업스트림 특이적 프라이머 서열-3'이다.
여기에서 바코드 서열은 상이한 샘플을 구분하기 위한 핵산 서열이며, 하나의 피검 샘플은 하나의 바코드 서열에 대응하고, 이 바코드 서열의 길이는 6 내지 12nt이며, 3개 이상의 연속 염기가 없을 것을 요구하고, GC 함량은 40 내지 60%이며, 바코드 서열의 프라이머는 2차 구조 등이 현저하지 않다.
업스트림 외부 프라이머 F1는 상이한 샘플을 구분하기 위한 것이며, 동일한 샘플이기만 하면 업스트림 외부 프라이머 F1이 모두 동일하고 검출 부위와 무관하다.
분자 태그 서열은 상이한 시작 DNA 템플릿 분자(상이한 앰플리콘의 템플릿)를 태그하는 데 사용되며, 하나의 시작 DNA 템플릿 분자는 하나의 분자 태그 서열에 대응한다.
상기 분자 태그 서열는 무작위 염기 및 적어도 한 세트의 특정 염기를 포함하며, 특정 염기는 무작위 염기에 설치되고, 예를 들어 1세트 또는 2세트를 설치한다. 상기 각 세트의 특정 염기의 1 내지 5개 염기로 구성되며, 예를 들어 3개 또는 4개이다. 1차 라이브러리 구축 과정에서 상기 분자 태그 서열 중 특정 염기의 위치와 성분이 고정되는 것을 제외하고는, 무작위 염기의 염기 클래스(A, T, G, C)는 임의 선택한다.
분자 태그 서열을 통해 시퀀싱 결과의 시작 템플릿에 대해 분류하며, 증폭 오류 및 시퀀싱 오류를 배제할 수 있다. 본 실시예에 채택되는 것은 특정 염기가 ACT와 TGA로 2가지이며, 이는 단독 또는 조합 사용할 수 있다.
유전자 업스트림 특이적 프라이머 서열 및 유전자 다운스트림 특이적 프라이머 서열은 특정 표적 영역을 증폭하는 프라이머 서열이다(각각 상이한 표적 영역을 증폭시키는 데 필요한 각각의 업스트림 프라이머 및 대응하는 다운스트림 프라이머를 포함함).
범용 서열 1은 각각 한 구간의 특정 핵산 서열이며, 상기 서열은 실제 필요에 따라 변경될 수 있고, 길이가 16 내지 25nt이고 연속 염기가 없으며 GC 함량이 35 내지 65%이고 현저한 2차 구조가 없다.
본 실시예에서 채택하는 것은 범용 서열 GGCACCCGAGAATTCCA이며(서열 1), 크기는 17nt이다.
시퀀싱 어댑터 서열 1과 시퀀싱 어댑터 서열 2는 시퀀싱 시 프라이머 상에 도입해야 하는 특정 서열이며, 구체적으로 Ion Torrent, Illumina 또는 BGISEQ/MGISEQ 시퀀싱 플랫폼에 대응할 수 있다.
시퀀싱 플랫폼이 Illumina 플랫폼이면, 시퀀싱 어댑터 서열 1과 2는 각각 I5와 I7이고, 어댑터 서열과 칩 상의 프라이머 서열은 상보적이며, 어댑터 추가는 핵산 단편을 벡터 상에 연결하기 위해서이다.
시퀀싱 플랫폼이 Ion Torrent 플랫폼이면, 시퀀싱 어댑터 서열 1 및 2는 각각 A 및 P이고, A 어댑터는 시퀀싱에 사용되며 시퀀싱 프라이머와 상보적이고, P 어댑터는 벡터 상 서열과 상보적이며 템플릿을 벡터와 연결하는 데 사용된다.
시퀀싱 플랫폼이 BIISEQ/MGISEQ 플랫폼이면, 시퀀싱 어댑터는 시퀀싱에 필요하며, 단일 가닥 고리화 수요, 후속 DNB 제조 및 기계 시퀀싱에 필요한 특정 서열을 충족한다.
2세대 시퀀싱 라이브러리가 기계에서 시퀀싱되면 복수개 샘플이 동시에 검출되므로, 세트의 업스트림 외부 프라이머 F1을 설계할 수 있다. M개 업스트림 외부 프라이머 F1은 M개 샘플에 대응하고, 각 업스트림 외부 프라이머 F1 중의 바코드 서열은 상이하다. 각 샘플 상의 표적 포획의 영역에 필요한 앰플리콘 수 P에 따라, P개 업스트림 내부 프라이머 F2 및 대응하는 Q(일반적인 경우 P=Q이나 두 가지가 다른 경우도 있으며, 예를 들어 RNA 융합 유전자 검출 시)개 다운스트림 프라이머 R을 설계하고, P개 업스트림 내부 프라이머 F2 중의 분자 태그 구조는 모두 동일하다.
二. 단일 단계법 앰플리콘 시퀀싱 라이브러리의 증폭 원리
단일 단계 신속 증폭 라이브러리 구축 기술 프라이머 설계는 상술한 바와 같다. 템플릿 DNA/RNA를 증폭할 때 도 2와 같은 상황을 따른다. 업스트림 외부 프라이머 F1과 업스트림 내부 프라이머 F2는 범용 서열을 공유하므로, 업스트림 외부 프라이머 F1는 업스트림 내부 프라이머 F2를 템플릿으로 사용할 수 있다. 따라서 표적 서열에 시퀀싱 어댑터와 샘플 바코드 서열을 추가한다. 증폭 시, 업스트림 내부 프라이머 MIX1(복수개 앰플리콘의 업스트림 프라이머 F2를 특정 비율로 혼합하여 형성된 MIX1) 및 다운스트림 프라이머 MIX2(복수개 앰플리콘에 대응하는 다운스트림 프라이머 R을 특정 비율로 혼합하여 형성된 MIX2)는 템플릿에 대해 제1 순환 반응을 수행하여, F2 및 R을 갖는 증폭 산물을 생성한다. 제2 순환 반응 시, 상술한 2가지 PCR 산물 외에도 양단에 각각 F2 및 R 서열을 갖는 산물을 획득할 수도 있다. 제3 순환 반응은 완전한 시퀀싱 라이브러리 완성 구조 서열을 갖는 표적 산물을 생성하기 시작할 수 있으나, 이때 상기 산물은 하나의 사슬만 있다. 그 후, 제4 순환은 완전한 양단 어댑터 서열을 갖는 이중 사슬 산물을 생성할 수 있다. 업스트림 외부 프라이머 F1은 업스트림 내부 프라이머 F2보다 TM 값이 훨씬 높고 농도도 업스트림 내부 프라이머 F2보다 훨씬 높다. 따라서 후속적으로 완전한 산물(즉, 제4 순환 PCR 산물 중 빨간색 점선으로 표시된 2가지 산물)의 지수 증폭을 구현할 수 있고, 최종적으로 십수 내지 수십개의 순환 반응 과정을 거쳐 라이브러리 구축을 완료한다.
三. 검출 방법의 구축
1. 단일 단계법 증폭
상술한 단일 합성의 프라이머는 하기와 같이 제조된다.
업스트림 외부 프라이머 F1을 100μM의 프라이머 농도가 되도록 물을 첨가하여 용해시키고, 업스트림 내부 프라이머 F2를 100μM의 농도로 물을 각각 첨가하여 용해시키고, 각각의 프라이머를 등몰비로 혼합하여 업스트림 외부 프라이머 MIX1을 형성하고, 다운스트림 프라이머 R을 각각 100μM이 되도록 물을 첨가하여 용해시키고 다운스트림 프라이머 MIX2를 등몰비로 혼합하여 형성한다.
복수의 피검 샘플의 게놈 DNA를 각각 추출한다.
0.2ml 8-스트립 튜브(8-strip tube) 또는 96웰 플레이트에 표 1에 표시된 시약을 순서대로 첨가한다(각 유형 핵산 샘플은 실시예에 제공된 특정 제조업체 키트의 지침에 따라 추출함).
표 1은 특정 샘플의 증폭 시스템이다.
Figure pct00001
상술한 PCR 증폭의 프로그램은 표 2와 같다.
표 2는 PCR 증폭 프로그램이다.
Figure pct00002
PCR 반응이 완료되며, 획득한 PCR 산물이 바로 앰플리콘 라이브러리이다.
2. 마그네틱 비드 정제 및 큐빗 정량화
PCR 반응 후 Beckman Coulter사의 Agencourt AMPure XP Kit(Cat. No. A63880/A63881/A63882)로 정제하였다. 조작 단계는 하기와 같다.
1) Agilent court AMPure XP Kit를 30분 전에 꺼내 잘 와동시킨 다음 실온에 정치한다.
2) PCR 반응이 완료된 후, 다시 마그네틱 비드를 완전히 와동시킨 후 시스템에 마그네틱 비드 24㎕를 첨가하고 5회 이상 피펫팅을 반복하거나 완전히 와동시켜 상온에서 5분간 정치하였다.
3) EP 튜브를 마그네틱 랙에 옮기고 용액이 투명해질 때까지 5분 동안 정치한 다음 마그네틱 비드에 접촉되지 않도록 주의하면서 피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거한다.
4) 신선하게 구성한 80% 에탄올 용액 100㎕를 각 튜브에 첨가하고, EP 튜브를 마그네틱 랙 상에 놓고 천천히 2원 회전하고 5m 동안 정치한 후 상층액을 버렸다.
5) 4단계를 1회 반복한다.
6) EP 튜브를 열고 상온에 정치하여 액체가 깨끗하게 휘발되도록 하며, 마그네틱 비드 표면에 무광택을 기준으로 마그네틱 비드가 과도하게 건조되지 않도록 유의한다.
7) 마그네틱 랙 상에서 EP 튜브를 취하고 PCR 등급 정제수 30μl를 넣고 와류 혼합하여 상온에서 10분 동안 정치한다.
8) 이전 단계의 EP 튜브를 마그네틱 랙 상에 2분 동안 또는 용액이 투명해질 때까지 놓고, 마그네틱 비드에 접촉되지 않도록 유의하면서 마그네틱에서 먼 일면에서 피펫으로 상층액을 조심스럽게 흡인한다.
정제된 앰플리콘 라이브러리를 획득한다.
정제된 앰플리콘 라이브러리는 Qubit 2.0을 사용하여 DNA 라이브러리 농도 측정 및 Agilent 2200 TapeStation Systems 검출을 수행한다.
3. 기계 시퀀싱 및 결과 분석
복수개 샘플 정제의 앰플리콘 라이브러리를 동일한 농도로 혼합한 다음 100PM으로 희석하여 앰플리콘 시퀀싱을 위한 DNA 라이브러리를 획득한다. 시퀀싱(사용된 시퀀서는 Ion GeneStudio™ S5 Plus System, Thermofisher, A38195)하고, 데이터 처리 분석(S5 Torrent Server)을 통해 검출 샘플의 변이 상황과 변이 빈도를 획득하였다.
분자 태그 라이브러리가 있는 변이 빈도 계산 방법은 하기와 같다.
라이브러리 증폭 과정에서 원래 템플릿에 대해 분자 표지를 수행하기 때문에, 변이 빈도의 계산 방법은 하기와 같다.
시퀀싱 결과에서 동일한 분자 태그를 가진 DNA 분자를 하나의 클러스터로 정의하고, 동일한 분자 태그를 가진 DNA 분자는 초기 DNA 템플릿의 증폭 산물, 즉 동일한 원래 템플릿이 증폭된 일련의 DNA 분자로 정의한다.
상기 클러스터 중의 돌연변이 여부를 확인한다. 상기 클러스터 중 특정 위치에서 특정 염기 유형의 비율이 ≥80%이면, 상기 클러스터는 유효 클러스터로 기록된다. 유효 클러스터 중에 분자 태그가 있는 돌연변이의 DNA 분자의 수가 ≥80%이면 돌연변이 클러스터로 기록된다.
변이 빈도=돌연변이 클러스터의 수량/유효 클러스트의 총 수량*100%.
비고: 시퀀싱 결과에서 동일한 클러스터의 DNA 분자(시퀀싱된 하나의 서열) 수 ≥ 2가 되어야 통계적으로 유의하다.
실시예 2. 단일 단계법 앰플리콘 시퀀싱 라이브러리의 구축 및 시퀀싱
一. 단일 단계법 앰플리콘 시퀀싱 라이브러리의 라이브러리 구축의 프라이머 설계
본 실험의 검출 영역은 3개의 앰플리콘(EGFR L858R, 19del 및 ERBB2 삽입 돌연변이)을 포함한다.
검출 샘플은 2개의 냉동 폐암 조직 샘플(샘플 1, 샘플 2), 4개의 폐암 FFPE(포르말린 고정 파라핀 포매 조직 샘플) 샘플(샘플 3, 샘플 4, 샘플 5, 샘플 6) 및 2개의 건강한 인간 백혈구 샘플(샘플 7, 샘플 8)을 포함하며, 상술한 8개 샘플의 변이 상황은 공지되었다.
3개의 앰플리콘(EGFR L858R, 19del 및 ERBB2의 삽입 돌연변이)에 따라 표 3에 표시된 프라이머를 설계한다(본 실시예에서는 8개의 바코드 서열이 사용됨).
표 3은 EGFR L858R, 19del 및 ERBB2의 삽입 돌연변이에 대한 프라이머 서열이다.
Figure pct00003
Figure pct00004
시퀀싱 어댑터는 Ion GeneStudio™ S5 Plus System 시퀀싱 플랫폼에 적용된다.
二. 단일 단계법 앰플리콘 시퀀싱 라이브러리
핵산 추출 정제 키트(FFPE 샘플 DNA 추출: GeneRead DNA FFPE 키트, Qiagen, 180134; 냉동 조직 샘플 DNA 추출: QIAamp DNA Mini Kit 250, QIAGEN, 51306).
1. 단일 단계법 증폭
실시예 1의 三의 1단계에 따라 수행하여 PCR 산물을 얻었다.
증폭 시스템은 표 4와 같다.
표 4는 증폭 시스템이다.
Figure pct00005
표 5는 증폭 프로그램이다.
Figure pct00006
2. 마그네틱 비드 정제 및 큐빗 정량화
실시예 1의 三의 2단계에 따라 수행한다.
마그네틱 비드 정제(Agencourt AMPure XP, Beckman Coulter, A63880)로 PCR 산물을 회수하고, Qubit 2.0을 사용하여 DNA 라이브러리 농도 측정 및 Agilent 2200 TapeStation Systems 검출을 수행한다.
Agilent 2200 TapeStation Systems 검출 결과는 도 9에 도시된 바와 같다.
3. 기계 시퀀싱 및 결과 분석
모든 샘플의 PCR 산물을 동일한 농도로 혼합한 다음 100pM으로 희석하여 기계 시퀀싱을 위한 DNA 라이브러리를 얻었다.
시퀀싱하며 결과는 표 6과 같다.
표 6은 기계 시퀀싱 결과이다.
Figure pct00007
EGFR: p.E746_A750delELREA는 EGFR 유전자 제746-750개 아미노산 ELREA(E: Glu 글루타민산; L: Leu 류신; R: Arg 아르기닌; E: Glu 글루타민산; A: Ala 알라닌) 결실을 나타내며, EGFR 19del의 한 유형이다.
EGFR:p.K745_E749delKELRE는 EGFR 유전자 제745-749개 아미노산 KELRE(K: Lys 라이신; E: Glu 글루타민산; L: Leu 류신; R: Arg 아르기닌; E: Glu 글루타민산) 결실을 나타내며, EGFR 19del의 한 유형이다.
ERBB2:p.A775_G776insYVMA는 ERBB2 유전자 제775 알라닌(영문 약자 A)와 제776 글리신(영문 약자 G) 사이에 YVMA(Y: Tyr 티로신, V: Val 발린, M: Met 메티오닌, A: Ala 알라닌) 삽입을 나타내며, 표 3에서 ERBB2에 대응한다.
63 유전자 검출 제품은 Beijing Genetron Gene Technology Co., Ltd.의 종양 액체 생검 제품으로 모든 고형 종양 환자를 대상으로 하며, 높은 처리량과 고정밀도의 2세대 시퀀싱 기술을 적용하여 종양 표적 치료, 발생 및 발달과 밀접한 관련이 있으며 63개의 유전자 부위의 변이(58개 유전자의 돌연변이 분석, 10개 유전자의 재배열 분석 및 7개 유전자의 CNV 검출 포함)를 전면적으로 검출하며, 표적 영역 시퀀싱 깊이가 20,000 x를 커버하고 검출 감도가 0.1%에 달할 수 있다. 정밀 의학, 분자 분류 및 치료 효과 및 재발 모니터링을 위한 전면적이고 가치가 높은 참조 정보를 제공한다.
상기 결과는 본 발명의 방법이 라이브러리 구축 후 기계 시퀀싱을 수행하며, 검출된 조직 샘플의 점 돌연변이, 결실 돌연변이 및 삽입 돌연변이가 공지된 63 유전자 검출에 의해 획득된 샘플 변이 정보와 일치함을 나타낸다.
실시예 3. 단일 단계법 앰플리콘 시퀀싱 라이브러리의 구축 및 시퀀싱
본 실험 샘플은 폐암 환자의 혈장 샘플이며, 4명의 상이한 환자와 2명의 건강한 사람의 혈장 샘플(샘플 변이 상황은 공지됨)을 포함한다. 키트(MagMAX™ Cell-Free DNA Isolation Kit, Applied Biosystems™, A29319)를 사용하여 cfDNA를 추출한 후, 분자 태그가 있는 EGFR L858R, 19del 및 ERBB2의 삽입 돌연변이를 포함하는 프라이머 풀을 사용하여 라이브러리 구축을 수행한다.
一. 단일 단계법 앰플리콘 시퀀싱 라이브러리의 라이브러리 구축의 프라이머 설계
3개의 앰플리콘(EGR L858R, 19del 및 ERBB2의 삽입 돌연변이)에 따라 표 7에 표시된 프라이머를 설계한다(업스트림 외부 프라이머는 동일하며 다른 것은 상이하고 이 실시예에서는 6개의 바코드 서열이 대응함).
표 7은 EGR L858R, 19del 및 ERBB2의 삽입 돌연변이에 대한 프라이머 서열이다.
Figure pct00008
二. 단일 단계법 앰플리콘 시퀀싱 라이브러리
핵산 추출 정제 키트(FFPE 샘플 DNA 추출: GeneRead DNA FFPE 키트, Qiagen, 180134; 냉동 조직 샘플 DNA 추출: QIAamp DNA Mini Kit 250, QIAGEN, 51306).
1. 단일 단계법 증폭
실시예 1의 三의 1단계에 따라 수행하여 PCR 산물을 얻었다.
표 8은 증폭 시스템이다.
Figure pct00009
표 9는 증폭 프로그램이다.
Figure pct00010
2. 마그네틱 비드 정제 및 큐빗 정량화
실시예 1의 三의 2단계에 따라 수행한다.
마그네틱 비드 정제(Agencourt AMPure XP, Beckman Coulter, A63880)로 PCR 산물을 회수하고, Qubit 2.0을 사용하여 DNA 라이브러리 농도 측정 및 Agilent 2200 TapeStation Systems 검출을 수행한다.
Agilent 2200 TapeStation Systems 검출 결과는 도 10에 도시된 바와 같다.
3. 기계 시퀀싱 및 결과 분석
모든 샘플의 PCR 산물을 동일한 농도로 혼합한 다음 100μM으로 희석하여 앰플리콘 시퀀싱을 위한 DNA 라이브러리를 얻었다.
시퀀싱하며 결과는 표 10과 같다.
표 10은 4개 조직 샘플과 2개 건강한 사람 샘플의 검출 결과이다.
Figure pct00011
EGFR: p.E746_A750delELREA는 EGFR 유전자 제746-750개 아미노산 ELREA(E: Glu 글루타민산; L: Leu 류신; R: Arg 아르기닌; E: Glu 글루타민산; A: Ala 알라닌) 결실을 나타내며, EGFR 19del의 한 유형이다.
ERBB2:p.A775_G776insYVMA는 ERBB2 유전자 제775 알라닌(영문 약자 A)와 제776 글리신(영문 약자 G) 사이에 YVMA(Y: Tyr 티로신, V: Val 발린, M: Met 메티오닌, A: Ala 알라닌) 삽입을 나타내며, 표 7에서 ERBB2에 대응한다.
본 발명의 방법이 라이브러리 구축 후 기계 시퀀싱을 수행하며, 검출된 혈장 cfDNA 샘플의 점 돌연변이, 결실 돌연변이 및 삽입 돌연변이가 공지된 63 유전자 검출에 의해 획득된 샘플 변이 정보와 일치함을 나타낸다. 환자 1 샘플 ctDNA 추출량이 비교적 많고, 환자 1 샘플을 5배 희석한 후에도 여전히 4.6‰ 빈도의 L858R의 검출을 획득하였다(데이터 Reads 중복 제거 후: 돌연변이 클러스터=2, 상기 부위 총 클러스터=4380).
실시예 4. 단일 단계법 앰플리콘 시퀀싱 라이브러리의 구축 및 시퀀싱
본 실험 샘플은 3명의 유전자 융합을 가진 갑상선암 환자의 FNA 천자 샘플(유전자 융합 정보 공지) 및 2명의 양성 갑상선 결절 환자의 FNA 천자 샘플이다. 각각 MagMAX™ FFPE DNA/RNA Ultra Kit(Applied Biosystems™, A31881)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 RNA 샘플 추출을 수행한 후, SuperScript™ VILO™ MasterMix(Invitrogen™, 11755050)를 사용하여 제조업체의 키트 지침에 따라 역전사를 수행한다.
一. 단일 단계법 앰플리콘 시퀀싱 라이브러리의 라이브러리 구축의 프라이머 설계
유전자 융합에 따라 표 11에 표시된 프라이머를 설계한다(업스트림 외부 프라이머는 표 3과 동일하며 나머지는 상이하고, 이 실시예에서는 5개 바코드 서열에 대응함). 유전자 융합의 검출 프라이머는 중단점 전후에 설계되며, 고정된 업스트림 및 다운스트림 프라이머 매칭이 없다. 융합 중단점에 대해 설계한 업스트림 및 다운스트림 프라이머는 다음 예시와 같이 ALK_20 및 ELM4_6/EML4_13을 각각 조합하여 2가지 ALK-EML4 융합 형태를 검출한다.
표 11은 유전자 융합의 프라이머이다.
Figure pct00012
二. 단일 단계법 앰플리콘 시퀀싱 라이브러리
1. 단일 단계법 증폭
실시예 1의 三의 1단계에 따라 수행하여 PCR 산물을 얻었다.
표 12는 증폭 시스템이다.
Figure pct00013
표 13은 증폭 프로그램이다.
Figure pct00014
2. 마그네틱 비드 정제 및 큐빗 정량화
실시예 1의 三의 2단계에 따라 수행한다.
마그네틱 비드 정제(Agencourt AMPure XP, Beckman Coulter, A63880)로 PCR 산물을 회수하고, Qubit 2.0을 사용하여 DNA 라이브러리 농도 측정 및 Agilent 2200 TapeStation Systems 검출을 수행한다.
Agilent 2200 TapeStation Systems 검출 결과는 도 11에 도시된 바와 같다.
3. 기계 시퀀싱 및 결과 분석
모든 샘플의 PCR 산물을 동일한 농도로 혼합한 다음 100μM으로 희석하여 앰플리콘 시퀀싱을 위한 DNA 라이브러리를 얻었다.
시퀀싱하며 결과는 표 14와 같다.
표 14는 유전자 융합 검출 결과 비교이다.
Figure pct00015
EML4-ALK-V3a(E6a A20)는 표 11의 EML4_6_ 및 ALK_20에 대응한다.
EML4-ALK-V1(E13 A20)은 표 11의 EML4_13_ 및 ALK_20에 대응한다.
63 유전자 검출 제품은 Agilent 맞춤형 프로브를 사용하여 포획 라이브러리 구축을 수행한다. 상기 제품은 이미 수천 개의 임상 혈장 샘플에 대해 검출이 수행되었으며 제품 성능이 안정적이다.
본 발명의 방법은 라이브러리 구축 후 기계 시퀀싱을 수행하며, 검출된 샘플 융합 변이 형태는 공지된 63 유전자 검출에 의해 획득된 샘플 변이 정보와 일치한다.
상술한 실시예들은 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 각 구성요소의 구조, 연결방법 및 제조공정은 어느 정도 변경될 수 있으며, 본 발명의 기술적 해결책을 기반으로 수행한 등가의 변형 및 개량은 모두 본 발명의 보호 범위에서 배제되지 않는다.
실시예 5. BRCA1/2 단일 단계법 프라이머 풀
一. 단일 단계법 앰플리콘 시퀀싱 라이브러리의 라이브러리 구축의 프라이머 설계
업스트림 외부 프라이머는 표 3과 동일하며, 나머지는 다르다. 바코드는 라이브러리 구축 샘플 수량에 따라 결정한다.
업스트림 내부 프라이머 F2: 범용 서열 + 업스트림 특이적 프라이머 서열
다운스트림 프라이머 R: 시퀀싱 어댑터 2 + 다운스트림 특이적 프라이머 서열
표 15는 BRCA1/2 프라이머 집합이다.
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
二. 단일 단계법 앰플리콘 시퀀싱 라이브러리
1. 단일 단계법 증폭
0.5 pg의 건강한 인간 혈장 백혈구 gDNA를 시작 샘플로 사용하여 실시예 1의 三의 1단계에 따라 수행하여 PCR 산물을 획득한다.
2. 마그네틱 비드 정제 및 큐빗 정량화
실시예 1의 三의 2단계에 따라 수행한다.
마그네틱 비드 정제(Agencourt AMPure XP, Beckman Coulter, A63880)로 PCR 산물을 회수하고, Qubit 2.0을 사용하여 DNA 라이브러리 농도 측정 및 Agilent 2200 TapeStation Systems 검출을 수행한다.
Agilent 2200의 검출 결과는 도 3에 도시된 바와 같이, 구축된 라이브러리는 특이도가 높고 비특이적 증폭 산물 및 프라이머 이량체가 없고, 구축된 라이브러리는 고품질이며 기계 시퀀싱을 수행할 수 있다.
3. 기계 시퀀싱 및 결과 분석
모든 샘플의 PCR 산물을 동일한 농도로 혼합한 다음 100μM으로 희석하여 앰플리콘 시퀀싱을 위한 DNA 라이브러리를 얻었다.
시퀀싱 결과는 도 4에 도시된 바와 같다. 시퀀싱 분석 결과, BRCA1/2 검출 라이브러리의 121개 앰플리콘이 우수한 균질성을 나타내었고, 본 발명의 단일 단계법 라이브러리 구축 기술이 앰플리콘 균일성 측면에서 우월성을 나타내 데이터의 유효한 산출을 보장하였다.
비교예, 본 발명의 방법의 3개 프라이머와 종래 기술의 4개 프라이머의 비교
一. 단일 단계법 앰플리콘 시퀀싱 라이브러리의 라이브러리 구축의 프라이머 설계
3개의 프라이머와 4개의 프라이머의 설계된 구조는 도 5에 도시된 바와 같다.
본 발명:
실시예 1의 설계 원리에 따라 본 발명의 3개 프라이머를 설계:
업스트림 외부 프라이머는 표 3과 동일하고, 여기에서 바코드 서열은 67가지이고, 범용 서열은 표 15와 동일하고, 업스트림 특이적 서열은 표 15 중의 P1_B2_F1 내지 P1_B2_F67이다.
시퀀싱 어댑터 2는 표 15와 동일하고, 다운스트림 특이적 프라이머 서열은 표 15에서 P1_B2_R1 내지 P1_B2_R67이다.
대조:
다음 종래 기술 원칙에 따라 4개의 프라이머를 설계:
설계 원칙:
바코드 프라이머 F1: 시퀀싱 어댑터 1 + 바코드 서열 + 범용 서열 1
업스트림 내부 프라이머 F2: 범용 서열 1 + 분자 태그 + 특이적 염기 서열 + 업스트림 특이적 프라이머 서열
다운스트림 외부 프라이머 R1: 시퀀싱 어댑터 2 + 범용 서열 2
다운스트림 내부 프라이머 R2: 범용 서열 2 + 다운스트림 특이적 프라이머 서열
상술한 시퀀싱 어댑터 1 + 바코드 서열은 표 3과 같다.
나머지는 표 16과 같다.
표 16은 대조 프라이머 서열이다.
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
二. 단일 단계법 앰플리콘 시퀀싱 라이브러리
방법은 실시예 2에서 얻은 것과 동일하다.
시퀀싱 결과 분석은 하기와 같다.
1. 3기능 성분 프라이머와 4기능 성분 프라이머 풀로 구축된 라이브러리의 균일성 결과
라이브러리 품질의 우수성 유무는 매우 중요한 지표로, 바로 라이브러리 중 앰플리콘의 균일성이다. 라이브러리의 균일성은 라이브러리 표적 영역의 커버리지가 더 높고 panel 커버리지 영역의 검출 정확도도 더욱 이상적이다. 이를 상기 목적에서 출발하여 프라이머 전체 기능 프레임워크가 완비된다는 전제하에 앰플리콘의 프라이머 설계를 개선하고 개선된 프라이머 구조를 최적화하는 것을 고려하며, 최초의 F1+F2+R1+R2(4기능 프라이머 성분)를 F1+F2+R(3기능 프라이머 성분)으로 단순화한다. 이러한 설계는 반응 시스템의 안정성을 높이고 라이브러리 앰플리콘 사이의 균일성을 보장한다.
동일한 백혈구 DNA 샘플을 템플릿으로 하며, 각각 상술한 본 발명의 프라이머 세트와 대조 프라이머 세트를 증폭한다.
결과는 도 6에 도시된 바와 같다. 특이적 프라이머 비율이 조정되지 않은 경우, 67개 앰플리콘(실시예 5에서 121쌍 프라이머 중에서 선택된 BRCA2의 67쌍 앰플리콘) 라이브러리의 3기능 프라이머 성분과 4기능 프라이머 성분으로 구축된 라이브러리의 앰플리콘 균일성을 비교하면, 3기능 성분 프라이머는 라이브러리 균일성 측면에서 현저한 이점을 갖는다.
2. 30ng cfDNA의 단일 단계법 프라이머 풀을 사용하여 라이브러리 구축을 수행하고, 데이터 분석 후 획득한 그 중 하나의 앰플리콘의 분자 태그 종류 수/클러스터 수이다.
동일한 cDNA 샘플을 템플릿으로 하며, 각각 상술한 본 발명의 프라이머 세트와 대조 프라이머 세트를 증폭한다.
결과는 도 7에 도시된 바와 같다. 4기능 성분 프라이머와 비교하여 3기능 성분 프라이머 성분은 4기능 성분 프라이머보다 더욱 우수한 원래 템플릿 포획 효율을 갖는다. 이는 초저주파 검출을 보다 민감하고 안정적으로 만든다. 하기 도면은 3기능 성분 프라이머 방식 중 무작위 선택한 하나의 앰플리콘이며, 라이브러리 구축 후 원래 템플릿에 태그를 추가한 후의 데이터 정보이다. 더 높은 템플릿 포획 효율은 3기능 성분 프라이머 방식에 더 낮은 변이 빈도 검출 한계를 부여했다.
3. 두 가지 방법으로 라이브러리를 구축한 후 0.1‰ 내지 1‰ 수준의 배경 노이즈이다(2와 동일).
동일한 cDNA 샘플을 템플릿으로 하며, 각각 상술한 본 발명의 프라이머 세트와 대조 프라이머 세트를 증폭한다.
결과는 도 8에 도시된 바와 같이, 4기능 성분 프라이머의 앰플리콘 라이브러리 구축 방식과 비교하여 3기능 성분 프라이머를 채택한 후 템플릿의 포획 효율이 효과적으로 향상되고 라이브러리의 비특이적 증폭이 감소하였으며, 라이브러리 확장의 순환 수가 감소하였다. 동시에 두 가지 앰플리콘 라이브러리 구축 방식 비교를 통해, 충실도가 모두 높은 DNA 중합효소를 사용하는 경우, 이 둘은 5/10,000 수준의 시퀀싱 데이터 배경 노이즈 측면에서 3기능 성분 프라이머 방식이 더욱 우수하였다. 더 낮은 배경 노이즈는 3기능 프라이머 성분 방식이 더 낮은 주파수 돌연변이를 검출하는 데 있어서 더욱 정확하게 만든다.
우수한 증폭 균일성, 고효율의 원래 템플릿 분자 포획 효율, 높은 충실도의 DNA 중합효소 및 초저 배경 노이즈는 동시에 분자 태그의 도입과 결합하여 최종적으로 3기능 프라이머 성분은 3/10,000 수준의 초저주파 돌연변이의 유효 검출을 구현하였다. 상기 라이브러리 구축 방식의 프라이머 구조는 충분히 최적화되었으며, 이 라이브러리 구축 방법의 성능은 종래의 저주파 돌연변이 라이브러리 구축 검출 방식보다 훨씬 우수하다.
본 발명의 단일 단계법 신속 라이브러리 구축 방법, 일반 증폭 라이브러리 구축 및 포획 라이브러리 구축 방법 비교 결과는 표 17 및 표 18과 같다.
표 17은 단일 단계법 신속 라이브러리 구축 방법, 일반 증폭 라이브러리 구축 및 포획 라이브러리 구축 방법 비교이다.
Figure pct00038
표 18은 본 방법과 비교 방법의 라이브러리 표적 단편 비중 결과 비교이다.
Figure pct00039
앰플리콘 라이브러리 구축이 완료된 시스템에는 표적 단편의 증폭 산물, 프라이머 이량체 또는 다량체 및 비특이적으로 증폭된 단편 산물이 존재할 수 있으며, 표적 단편 증폭 산물의 비중이 높아 앰플리콘 라이브러리의 품질을 평가하는 하나의 매우 중요한 지표가 되었다. 표 18은 본 발명과 비교 방법의 라이브러리 표적 단편 비중 측면에서의 상당한 강점을 나타내었다.
현재 라이브러리 구축의 어려움을 해결하기 위해 본 발명은 단일 단계 신속 증폭 라이브러리 구축 방법을 개발하였으며, 종래의 포획 방법에 비해 증폭 라이브러리 구축 방식은 다음과 같은 장점이 있다(도 1). 상기 라이브러리 구축 방식은 간단하고 신속하며 작업자에 대한 요건이 낮고, 하나의 일반 PCR 조작 및 상응하는 반응 시간만 있으면 라이브러리 구축을 완료할 수 있다. 상기 방법은 구축된 라이브러리의 품질과 순도가 모두 매우 높기 때문에, 간단한 라운드의 마그네틱 비드 정제 및 큐빗 정량화 후 정상적인 기계 시퀀싱을 수행할 수 있다. 상기 단일 단계법 라이브러리 구축 기술은 IonTorrent, illumina 및 BGI/MGI를 포함한 모든 2세대 플랫폼에 적용할 수 있으며, 이 라이브러리 구축 방법을 기반으로 DNA에 대한 SNP, Ins/Del, CNV, 메틸화된 검출, 및 RNA 샘플에 대한 유전자 융합과 발현의 검출 제품을 개발하였다.
SEQUENCE LISTING <110> GENETRON HEALTH (BEIJING) CO., LTD. <120> LIBRARY CREATION METHOD AND APPLICATION <160> 33 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 1 ggcacccgag aattcca 17 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 2 ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag 30 <210> 3 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 3 tcctcgaatc 10 <210> 4 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 4 taggtggttc 10 <210> 5 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 5 tctaacggac 10 <210> 6 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 6 ttggagtgtc 10 <210> 7 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 7 tctagaggtc 10 <210> 8 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 8 tctggatgac 10 <210> 9 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 9 tctattcgtc 10 <210> 10 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 10 aggcaattgc 10 <210> 11 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 11 ttagtcggac 10 <210> 12 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 12 cagatccatc 10 <210> 13 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(12) <223> n is a, c, g, or t <400> 13 nnnnnactnn nntga 15 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 14 caggaacgta ctggtgaaaa cac 23 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 15 cttccttctc tctctgtcat aggga 25 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 16 ctcccatacc ctctcagcgt a 21 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 17 cctctctatg ggcagtcggt gat 23 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 18 gaaaatgctg gctgacctaa agc 23 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 19 agcaaagcag aaactcacat cga 23 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 20 agccataggg cataagctgt g 21 <210> 21 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 21 ggaggaccgt cgcttg 16 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 22 gtgagaaagt taaaattccc gtc 23 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 23 cccataccct ctcagcgt 18 <210> 24 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 24 cttctgcatg gtattctttc tcttcc 26 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 25 cacacagcaa agcagaaac 19 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 26 ccagaaggcg ggagacatat g 21 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 27 actgcagaca agcataaaga tgtca 25 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 28 actactgtag agcccacacc tg 22 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 29 ctgagaacag gctgcagacc 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 30 cctggtgctc catgaggaga 20 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 31 ctcagcttgt actcagggct c 21 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 32 actcacgctg cttcccatt 19 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 33 gtgatccaga ctctgacctt ttgc 24

Claims (14)

  1. 표적 유전자 변이 상황을 검출하는 앰플리콘 라이브러리 구축용 프라이머 조합에 있어서,
    표적 앰플리콘에 따라 설계된 업스트림 외부 프라이머 F1, 업스트림 내부 프라이머 F2 및 다운스트림 프라이머 R를 포함하고,
    상기 업스트림 외부 프라이머 F1은 시퀀싱 어댑터 서열 1, 상이한 샘플을 구분하기 위한 바코드 서열 및 범용 서열로 순차적으로 구성되고,
    상기 업스트림 내부 프라이머 F2는 범용 서열 및 상기 표적 앰플리콘의 업스트림 특이적 프라이머 서열로 순차적으로 구성되고,
    상기 다운스트림 외부 프라이머 R은 시퀀싱 어댑터 2 및 상기 표적 앰플리콘의 다운스트림 특이적 프라이머 서열로 순차적으로 구성되는 프라이머 조합.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 업스트림 내부 프라이머 F2는 범용 서열, 분자 태그 서열 및 상기 표적 앰플리콘의 업스트림 특이적 프라이머 서열로 순차적으로 구성되는 것을 특징으로 하는 프라이머 조합.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 분자 태그 서열은 6 내지 30개 염기로 구성되고, 여기에는 무작위 염기와 적어도 한 세트의 특정 염기가 포함되고, 상기 특정 염기는 무작위 염기에 설치되고, 상기 각 세트의 특정 염기는 1 내지 5개의 염기로 구성되는 것을 특징으로 하는 프라이머 조합.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바코드 서열은 길이가 6 내지 12nt이고, 3개 이상 연속 염기가 없고, GC 함량이 40 내지 60%인 뉴클레오티드 서열이고,
    상기 범용 서열 1과 상기 범용 서열 2의 길이는 각각 16 내지 25nt이고, 연속 염기가 없고, GC 함량은 35 내지 65%이며, 현저한 2차 구조가 없는 것을 특징으로 하는 프라이머 조합.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시퀀싱 어댑터 1과 상기 시퀀싱 어댑터 2는 상이한 시퀀싱 플랫폼에 따라 대응하는 시퀀싱 어댑터를 선택하는 것을 특징으로 하는 프라이머 조합.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 시퀀싱 플랫폼은 Illumina 플랫폼이고, 상기 시퀀싱 어댑터 1은 I5이고, 상기 시퀀싱 어댑터 2는 I7이거나;
    상기 시퀀싱 플랫폼은 Ion Torrent 플랫폼이고, 상기 시퀀싱 어댑터 1은 A이고, 상기 시퀀싱 어댑터 2는 P이거나;
    상기 시퀀싱 플랫폼은 BGI/MGI 플랫폼이거나;
    상기 범용 서열의 뉴클레오티드 서열은 서열 1인 것을 특징으로 하는 프라이머 조합.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 유전자 변이 상황을 검출하는 앰플리콘 라이브러리 구축용 키트.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 조합 또는 제7항에 따른 키트의 어느 하나의 하기 응용에 있어서,
    (1) 표적 유전자 변이 상황을 검출하는 앰플리콘 라이브러리 구축에서의 응용,
    (2) 피검 샘플 표적 영역 돌연변이 부위 또는 변이 상황 검출에서의 응용,
    (3) 피검 샘플 표적 영역의 변이 빈도 검출에서의 응용.
  9. 표적 유전자 변이 상황을 검출하기 위한 앰플리콘 라이브러리 구축 방법에 있어서,
    제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 조합 또는 제7항에 따른 키트를 이용하여, 피검 샘플의 DNA 또는 cDNA를 템플릿으로 삼아 단일 단계 PCR 증폭을 수행하여 증폭 산물, 즉 표적 유전자의 앰플리콘 라이브러리를 획득하는 단계를 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 피검 샘플은 인비트로 조직 샘플, 냉동 샘플, 천자 샘플, FFPE 샘플, 혈액, 소변, 뇌척수액 또는 흉수인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 피검 샘플 표적 유전자의 변이 상황을 검출하는 방법에 있어서,
    1) 제9항의 방법을 이용해 표적 유전자의 앰플리콘 라이브러리를 제조하는 단계;
    2) 모든 샘플의 표적 유전자의 앰플리콘 라이브러리를 혼합한 후 희석하여 시퀀싱 DNA 라이브러리를 획득하는 단계; 및
    3) 상기 시퀀싱 DNA 라이브러리를 시퀀싱하여 시퀀싱 결과를 획득하고, 시퀀싱 결과에 따라 피검 샘플 표적 유전자의 변이 상황을 분석하는 단계를 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 피검 샘플은 인비트로 조직 샘플, 냉동 샘플, 천자 샘플, FFPE 샘플, 혈액, 소변, 뇌척수액 또는 흉수인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 피검 샘플 표적 영역의 변이 상황을 검출하는 방법에 있어서,
    1) 제9항의 방법을 이용해 표적 유전자의 앰플리콘 라이브러리를 제조하는 단계;
    2) 모든 샘플의 표적 유전자의 앰플리콘 라이브러리를 혼합한 후 희석하여 시퀀싱 DNA 라이브러리를 획득하는 단계; 및
    3) 상기 시퀀싱 DNA 라이브러리를 시퀀싱하여 시퀀싱 결과를 획득하고, 시퀀싱 결과에 따라 피검 샘플 표적 유전자의 변이 빈도를 계산하는 단계를 포함하고,
    상기 변이 빈도=돌연변이 클러스터의 수량/유효 클러스트의 총 수량*100%인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 피검 샘플은 인비트로 조직 샘플, 냉동 샘플, 천자 샘플, FFPE 샘플, 혈액, 소변, 뇌척수액 또는 흉수인 것을 특징으로 하는 방법.
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