CN109295215B - 一种用于检测少精子症的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测少精子症的试剂盒,其含有能够检测与少精症相关的分子标记的检测试剂，具体的涉及检测的位点为CRKL基因片段，其序列存在t/c突变时诊断为少精症患者。本发明试剂盒的优点和有益效果为利用设计的特定性引物，采用PCR技术，因此它的检测灵敏度很高。具有很高的准确性，特异性好、假阳性低。操作简单、安全、自动化程度高、防污染。速度快、高通量，可在2‑3小时完成。经济、便捷，便于临床广泛开展，节省患者开支，能够批量化检测。

Description

一种用于检测少精子症的试剂盒
发明领域
本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种用于检测少精子症的试剂盒。
背景技术
少精弱精症是指精子运动力差甚至无活动能力。在男性中，少精弱精症是造成男性不育或生育力下降的主要原因之一。弱精症的原因比较多，是否造成不育，要看弱精症的程度。如果是轻度的弱精症一般对生育没有大的影响，如果是严重的弱精症要做进一步的检查，看看引起弱精症的原因，有没有前列腺炎导致的弱精症，有没有免疫因素导致的弱精症，查明弱精症的原因后针对病因治疗弱精症。
少、弱精子症主要有下列病因引起：①附睾、精囊、前列腺等器官的炎症引起精浆变异，影响精子活动和存活。②精索静脉曲张，睾丸局部因静脉血液回流障碍而缺氧，引起精子活动力降低。③微量元素缺乏影响精子活动力。④睾丸发育受阻，睾丸生精上皮不完全成熟或受损变薄，致使精子质量差，活力减弱。⑤精液量不足影响精子活动。⑥体内产生抗精子抗体，使精子凝集或制动。特发性精子减少，促性腺激素缺乏，膏酮分泌不足，性腺功能低下，影响曲细精管上皮生精，支持细胞提供各级精细胞营养。长期大量注射雄激素，使得下丘脑促性腺激素释放激素的减少，促性腺激素分泌降低，导致暂时性精子减少或消失。染色体异常，染色体畸变特别是性染色体畸变，对精子密度、活动率、前向运动率及形态均有严重影响，故对精子密度低于l000万/ml者都应作染色体分析。自身免疫，自身免疫可以通过二种途径造成少精子症：①自身免疫影响精子的发生使生殖细胞脱落；②睾丸网及附睾的自身免疫过程可造成精子输出的阻断。
治疗少、弱精子症，重点应查明病因，在查清病因的基础上，对症治疗。是精索静脉曲张引起的则要及时手术治疗，如果是生殖器官炎症则要积极消除炎症，如果是缺乏某种营养物质，则要及时补充，如果是内分泌因素所引起则要行内分泌治疗，总之，只有查清了病因，对症治疗才有可能治愈少、弱精子症。
对于少、弱精子症，中医认为主要是肾肝脾功能失调造成的。肾藏精，主生殖，肾虚则生精功能障碍，可能出现阳萎、不射精、少精、弱精、死精。肾藏精，肝藏血，肝肾同源，精血互生，肝经络阴器，肝阴亏损则精少，肝经湿热则伤精而无子。所以治疗上应辨证施治，随症加减，标本兼治，攻补兼施。
目前检测少精症的方法也有。比如CN101633925A公开了一种与精子生成障碍相关的精浆微小核糖核酸标志物及其应用。该标志物选自SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4中一种或多种。该标志物对精子生成障碍具有特异性和敏感性，可用于制备精子生成障碍诊断或监测的试剂，可避免侵入性诊断，可反复检测，且易于动态监测精子生成障碍的程度。CN106148524A提供了一种研究人体无精症和严重少精症快速测试的方法，包括：样品收集，样品处理及利用real-time PCR平台诊断和利用样品处理的结果进行ELISA检测。
但是基于该疾病的检测准确度以及检测方法更优化的需要，本领域急需进一步开发检测少精症的方法、试剂盒。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种能快速、简便、敏感、特异的检测CRKL所在的突变位点多态性的试剂盒，用以检测样本是否为少精症患者。
本发明的试剂盒利用普通PCR技术，包含：人外周血基因组提取试剂、阴性对照和阳性对照、PCR反应液，还包含基因突变扩增引物。
本发明提供含有所述突变位点的CRKL基因片段，其序列如下：(R为t/c突变)
Figure BDA0001854612040000021
本发明提供上游扩增引物序列为：5'-ctctggaaattcgttaatgt-3'；
下游扩增引物序列为：5’-gtccacaagggagagcagac-3’
内部参照基因上游扩增引物：
5，-TTATCGCATACGGCTAGGC-3，
内部参照基因下游扩增引物：
5，-CACAATTCCCACCACGAGA-3。
其中的人外周血基因组提取试剂为：去离子水，6M NaI，氯仿/异戊醇(24：1v/V)混合液，异丙醇和无水乙醇。
其中阴性对照和阳性对照：以去离子水为阴性对照，以已知患者的外周血基因组DNA为阳性对照。
其中的PCR反应液包括：10XPCR混合液、O.25pmol/μL的引物、
Figure BDA0001854612040000031
Figure BDA0001854612040000032
的MgCl2,2U的Taq酶、的dNTPs、
Figure BDA0001854612040000034
dUTP、通常取
Figure BDA0001854612040000035
的模板。
本发明提供的一个技术方案是：一种用于检测少精子症的试剂盒,其含有能够检测与少精症相关的分子标记的检测试剂。
优选地，所述与少精症相关的分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其与正常的基因相比，区别在于：在SEQ ID NO：1第81位存在一个单核苷酸多态性：t>c。
优选地，所述检测试剂为如下引物，序列如序列表中SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
本发明提供的一个技术方案是：SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的引物对在用于检测少精症中的应用。
优选地，所述试剂盒中，除引物外，还包括有PCR反应液，PCR反应液由dNTP、Mg2+、Taq酶和Buffer组成。
本发明提供的一个技术方案是：一种体外检测样品是否存在少精症基因的单核苷酸多态性的方法，步骤如下：
(1)用特异性引物扩增样品，得到扩增产物；所述引物为一对，具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的序列；
(2)对扩增产物进行序列测定，检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性：在SEQ ID NO：1第81位存在一个单核苷酸多态性：t>c。
本发明提供的一个技术方案是：一种分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其与正常的基因相比，区别在于：在SEQ ID NO：1第81位存在一个单核苷酸多态性：t>c。
用本发明的试剂盒检测临床待检者外周血CRKL基因片段基因多态性，预测少精症患者情况：首先使用外周血基因组DNA提取试剂得到患者外周血基因组DNA，利用合成的PCR引物进行PCR扩增。扩增产物直接采用DNA凝胶电泳，通过测序，即可判断基因突变与否，从而判断检测源是否为少精症患者。克服了现有技术的少精症检测还要取精子的麻烦，以及其他检测方法的冗余复杂状况。
该试剂盒操作简便、检测过程短、经济有效，便于临床医生有针对性的制定治疗方案，有很高的临床应用价值，特别适合临床推广。
本发明试剂盒的优点和有益效果为利用设计的特定性引物，采用PCR技术，因此它的检测灵敏度很高。具有很高的准确性，特异性好、假阳性低。操作简单、安全、自动化程度高、防污染。速度快、高通量，可在2-3小时完成。经济、便捷，便于临床广泛开展，节省患者开支，能够批量化检测。
具体实施方式
下面通过具体实例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1 CRKL基因突变的检测及与少精症的关联分析
1.1研究对象
选取少精症患者100例，2012年7月～2017年12月于苏州大学附属第一医院确诊治疗，临床资料从病历获得。年龄相似的对照50例，为体检中心体检健康人群。取受试人员外周血1.5ml，于-80℃冷藏保存。所有受试人员均按照苏州大学附属第一医院伦理委员会要求征得同意。
1.2 DNA提取
用常规酚氯仿法提取受试者外周血DNA，具体如下：
1)取1ml外周血，3-6℃ 1600g离心8-12min，将上清液于:4℃ 16000g离心8-12min后再取上清液；
2)取步骤1)中经16000g离心得到的上清液于离心管中，加等体积消化液和蛋白酶复合物，55-62℃孵育30min；
3)把步骤2)得到的样品在冰上冷却，然后加入NH4AC沉淀蛋白，并充分混匀，5000g离心4-6min；
4)转移步骤3)上清液与0.8倍体积磁珠混悬液混合，室温孵育1min；
5)将步骤4)得到样品置于磁力架上静置吸附后，吸取上清；
6)将步骤5)得到的上清液与1.5倍体积磁珠混悬液室温孵育lOmin，置于磁力架上静置吸附后，弃掉上清液，用75％酒精洗涤2次，即得磁珠-目的DNA复合体。
7)采用DNA洗脱液，将步骤6)获得的磁珠-目的DNA复合体在DNA洗脱液中旋涡振荡，置于磁力架上静置，吸取上清液，得到目的DNA。
1.3测序匹配
将弱精子症患者和健康对照的血样DNA，经ilumina全测序获得相关结果。利用Illumina测序技术进行线粒体全基因组扫描。
数据分析与处理:在少精子症病例组和健康男性对照组中发现的基因型分布频率有显著差异的遗传变异，可用的结果见表1。
表1:病例组与对照组全基因组关联分析结果
位点 OR 回归系数 P
CRKL81 2.96 0.99 8.43E-03
从表1可以看出，CRKL位点与该病具有显著关联。
实施例2分型结果验证
由于CRKL81的突变与少精症高度相关，因此可基于这个突变设计基因特异性引物再以病人的DNA为模板进行扩展检测。
制备一试剂盒(100人次)，试剂盒的组成为：上下游引物，dNTP，Mg2+，Taq酶，PCRbuffer，反应体系为20微升，上游引物：5'-ctctggaaattcgttaatgt-3'；下游引物：5’-gtccacaagggagagcagac-3’。
以实施例1中的样本作为检测对象，重新进行PCR以及结果测序，通过基因型分布频率的比较，选择阳性关联的SNP，以全基因组扫描样本中单个SNP回归系数为权重，进一步求得危险分值，绘制ROC来评估预测的灵敏性和特异性，进而评估这些SNP对少精子症发病的判断能力。对该SNP标志物的分析发现，这个SNP以85.69％的AUC将健康男性对照组和少精子症病例组分开，最佳临界点的灵敏度为89.97％，特异度:91.31％。
通过结果发现，CRKL81t>c突变可以作为少精症检测的靶标，并且当改为点由t突变为c时，受试者均为少精症患者。
实施例3少精症检测准确度验证
抽取受试者外周血2ml(其中受试者为20例新鉴定的少精症患者，10例对照健康人群)，常规方法提取DNA。利用少精症易感性检测试剂盒进行PCR反应，PCR扩增条件：94℃5分钟，(94℃35秒，65℃30秒，72℃45秒)×30，72℃10分钟，10℃保温。将反应产物进行测序，将测序结果利用Meglign 7.0和Chromas 2.33软件进行检验和分析。检测结果含有CRKL81t>c突变的受试者95％均为少精症患者，10例对照没有检测到所述突变，准确度较高。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域的技术人员可以对本发明做各种修改或改动，但这些改动或修改的等价形式同样落在本发明所限定的范围内。
序列表
<110> 苏州立豪生物科技有限公司
<120> 一种用于检测少精子症的试剂盒
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 240
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
ctctggaaat tcgttaatgt atttgatgtc ttagtgtttt agtgactagg gagaccatta 60
actagtttat cattaaccac ctatcagtgt attgatgtta aagcatttcc ctgttagcta 120
aaagaggcct gttcatacaa gccaactggt atatacgtgt ggttcatcca tcatctgctg 180
cacatagcag actagaattc tgggaaccct gtgcaattca gtctgctctc ccttgtggac 240
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 2
ctctggaaat tcgttaatgt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 3
gtccacaagg gagagcagac 20

Claims (1)

1.检测血液样本中少精症相关分子标记的引物对在制备用于检测少精症的试剂盒中的应用，其特征在于：所述分子标记为SEQ ID NO：1第81位存在一个单核苷酸多态性：t>c，所述引物对序列为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3。
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