CN113025705B - miRNA-214作为帕金森病前驱期生物标志物的应用 - Google Patents

miRNA-214作为帕金森病前驱期生物标志物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供miRNA‑214作为帕金森病前驱期的生物标志物的应用。通过快速测定中老年人群静脉血中的miRNA‑214的含量，用以筛查并预测PD前驱期的风险，督促患者及时就医，延缓疾病进展，保障患者生命安全。研究发现，本发明提供的miRNA‑214在PD前驱期患者静脉血中的表达量明显高于正常人，通过对miRNA‑214进行特异性的监测能够达到辅助诊断PD前驱期的目的。

Description

miRNA-214作为帕金森病前驱期生物标志物的应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种miRNA-214作为帕金森病前驱期生物标志物的应用。
背景技术
帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种常见的神经系统退行性疾病，临床表现为运动迟缓、静止性震颤、肌强直、步态姿势异常、嗅觉减退、抑郁等症状，其发病原因及机制迄今不明。大约1％的65岁以上的人患有PD。其主要病理特征是中脑黑质致密部多巴胺(DA)神经元的选择性和进行性变性，纹状体DA含量显著降低，残余神经元中的嗜酸性包涵体——路易小体，主要由α-突触核蛋白(α-syn)组成。经过几十年的研究，PD的诊断和治疗仍然不理想；目前，PD的临床诊断主要是通过病史评估、体格检查、影像学检查以及左旋多巴等药物的疗效评估，但只有当症状完全发展时，才能观察到特定的影像学异常。而此时，大多数患者确诊已处于中晚期，使得多数PD患者错失了最佳治疗时期。
PD前驱期指患者出现非运动症状，乃至轻微运动症状，但尚未达到PD临床诊断标准，这些患者未来可能发生PD的风险高于平均值。从患者出现第一个PD非运动症状到符合PD临床诊断标准之间的前驱期阶段可长达20年。那么这个时期就是一个非常关键的诊断时期；患者常见的非运动症状例如有抑郁、便秘、嗅觉障碍等，但是仅仅通过这些非运动症状无法准确判断其是否会发展为PD患者，而前驱期的生物标志物则是一个非常有效的手段，在现有技术中，并未有相关的PD前驱期诊断的生物标志物。因此，亟需探索出一种PD前驱期诊断的生物标志物，这对于中老年人群中筛查发现前驱期患者，以及PD的早期诊断、疾病干预具有重要的意义。
发明内容
为了解决现有问题，本发明提供一种用于PD前驱期诊断的生物标志物miRNA-214(SEQ ID NO.1：ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU)。
本发明的有益效果在于，通过快速测定中老年人群静脉血中的miRNA-214的含量，用以筛查并预测PD前驱期的风险，督促患者及时就医，延缓疾病进展，保障患者生命安全。研究发现，本发明提供的miRNA-214在PD前驱期患者静脉血中的表达量明显高于正常人，通过对miRNA-214进行特异性的监测能够达到辅助诊断PD前驱期的目的。
附图说明
图1A为miRNA-31在四组中的表达情况图；
图1B为miRNA-214在四组中的表达情况图；
图2A为miRNA-31预测晚期PD的受试者工作特征曲线图；
图2B为miRNA-214预测前驱期PD的受试者工作特征曲线图。
具体实施方式
为了更清楚地表述本发明，下面结合附图对本发明作进一步地描述。
在下文描述中，给出了普选实例细节以便提供对本发明更为深入的理解。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例。应当理解所述具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在所述特征、整体、步骤、操作、元件或组件，但不排除存在或附加一个或多个其他特征、整体、步骤、操作、元件、组件或它们的组合。
随着微小RNA(microRNA，miRNA)研究的热潮，这种内源性非编码小RNAs已经作为一个基因表达调节的中心因子显露，参加许多重要的生理过程。miRNA是一类长度在22nt左右的内源非编码小RNA，广泛存在于动物、植物、病毒等多种有机体中。它主要通过与靶基因的3'UTR的完全或不完全配对，降解靶标基因mRNA或抑制其翻译，从而参与调控机体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动，预测超过1/3的人类基因都是保守的miRNA靶基因。在现有研究中，qPCR检测PD患者和健康对照组miRNA的表达。224个miRNAs中有8个在中脑高度表达，其中，PD组miRNA-133b表达下调最明显。然而，这些在人脑组织中发现的miRNAs不能直接作为临床应用的生物标志物，利用PD患者的脑组织样本来诊断PD是不可能的。早期诊断不仅需要确定疾病的特异性，还需要微创的生物标志物。
本发明中涉及的作为PD前驱期生物标志物的miRNA-214的序列为：SEQ ID NO.1：ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU。
本发明中涉及的PD前驱期表示典型的疾病发展过程阶段中的一个，PD早期阶段包括临床前期、前驱期、临床期。
以下各实施例中使用的实验材料和试剂以及情况说明如下：伦理委员会批准了南京医科大学附属脑科医院的研究，该研究是根据1964年《赫尔辛基宣言》及其后修正案确立的伦理标准完成的。所有参与者均给予书面知情同意。所有测试对象均取等量静脉血进行测试。
一、总RNA提取步骤
试剂盒为：miRcute血清/血浆miRNA提取分离试剂盒DP503(采购自天根生化科技(北京)有限公司)。
1.样品处理：每200μL血清中加入900μL裂解液MZA(Buffer MZA)，振荡器振荡混匀30sec至完全匀浆，加入1pmol外参，颠倒混匀；
2.室温放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；
3.加入200μL氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置5min；
4.12,000rpm(～13,400×g)，4℃，离心15min，样品会分成三层：黄色的有机相，白色的中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新管中，进行下一步操作；
5.量取转移液的体积，缓慢加入转移液2倍体积的无水乙醇(如：500μL的转移液加1mL无水乙醇)，混匀(此时可能会出现沉淀)。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRelute，室温放置2min，室温12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，离心后弃掉流出液，保留吸附柱miRelute；
6.向吸附柱miRelute中加入700μL去蛋白液MRD(Buffer MRD)，室温静置2min，室温12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃废液；
7.向吸附柱miRelute中加入500μL漂洗液RW(Buffer RW)，室温静置2min，室温12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃废液；
8.重复步骤7一次；
9.室温12,000rpm(～13,400×g)离心2min，弃收集管；
10.将吸附柱miRelute转入一个新的RNase-Free 1.5mL离心管中，向吸附膜中心位置加15-30μL RNase-Free ddH2O，室温放置2min，室温12,000rpm(～13,400×g)离心2min。
二、miRNA第一链cDNA制备
1.miRNA-214的c-DNA制备
试剂盒为：miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒KR211(采购自天根生化科技(北京)有限公司)。
1)先通过E.coli Poly(A)Polymerase在miRNA 3’末端加多聚A尾Poly(A)，再使用Oligo(dT)-Universal Tag通用逆转录引物进行逆转录反应，最终生成miRNA对应的cDNA第一链。
2)反转录体系(见表1)的配制
解冻2×miRNA反转录缓冲液并混匀，miRNA反转录混合酶放于冰中备用，在冰上预冷无RNA酶的反应管内加入以下试剂至总体积20μL(最后加入miRNA反转录混合酶)。
表1
试剂组分 体积 终浓度
Total RNA - 1μg
2×miRNA反转录缓冲液 10μL 1×
miRNA反转录混合酶 2μL -
无RNA酶双蒸水 补至20μL -
3)反转录程序
移液器轻轻混匀上述配制的反应液，按下表(表2)程序进行miRNA的逆转录反应：
表2
反应温度 反应时间 说明
42℃ 60<sub>min</sub> miRNA加A尾反应和逆转录反应
95℃ 3<sub>min</sub> 酶失活反应
三、SYBR Green法检测miRNA-214的表达量
试剂盒为：miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒FP411(采购自天根生化科技(北京)有限公司)。
1.室温融化2×miRcute增强型miRNA定量预混试剂和下游引物；
2.使用时请将2×miRcute增强型miRNA定量预混试剂上下颠倒轻轻均匀混合，避免起泡，并经轻微离心后使用；
3.将试剂置于冰上，并按表3配制反应体系：
表3
组成成分 20μL体系 终浓度
2×miRcute增强型miRNA定量预混试剂(含SYBR&ROX) 10μL 1×
上游引物(10μM，SEQ ID NO.2) 0.4μL 200nM
下游引物(10μM，SEQ ID NO.3) 0.4μL 200nM
miRNA第一链cDNA 1μL -
双蒸水 至20μL -
注：上游引物的序列号为SEQ ID NO.2(ACACTCCAGCTGGG)
下游引物的序列号为SEQ ID NO.3(CTCAACTGGTGTCGTGGA)。
4.Real Time PCR反应条件如表4
表4
Figure BDA0003018748050000051
注：采用7300Real-Time PCR System扩增仪进行定量检测。
四、miRNA表达水平对比例
一共纳入90例，包括对照组21例，前驱期PD组25例，早期PD组20例，晚期PD组24例。早期PD和晚期PD患者来自南京医科大学附属脑科医院PD专病门诊，早期PD组为初诊未服药且H-Y≤2的患者，晚期PD组为服用抗PD药物且H-Y>2的患者，PD诊断符合英国脑库原发性PD的诊断标准。前驱期PD来自南京医科大学附属脑科医院进行的一项基于社区的前驱期PD前瞻性研究，诊断符合2015年国际运动障碍协会的PD前驱期诊断研究标准。
按照上述的方式采集所有测试人员的静脉血进行miRNA-214和miRNA-31的表达水平分析，由于在现有技术中，miRNA-214能预测早期PD，miRNA-31能预测PD，但是对于前驱期的预测还未有更加有利的发现；所以将miRNA-214和miRNA-31在各种不同时期的表达水平进行对比。
1.血清miRNA-31和和miRNA-214在四组中表达情况的比较
一共纳入90例，包括对照组21例，前驱期PD组25例，早期PD组20例，晚期PD组24例(见表5)。各组间年龄、性别比较无统计学差异(P>0.05)。与对照组相比，晚期PD组的血清miRNA-31相对表达量高(P＝0.005，图1A)。而对照组与前驱期PD组和早期PD组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。另外，晚期PD组的血清miRNA-31表达高于早期PD组(P＝0.001，图1A)。结果表明，miRNA-31可作为晚期PD的生物标记物。与对照组相比，前驱期PD组的血清miRNA-214相对表达量高(P＝0.003，图1B)。而对照组与早期PD组和晚期PD组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。另外，晚期PD组的血清miR-214表达低于早期PD组和前驱期PD组(P＝0.046vs0.001，图1B)。因此，miRNA-214可作为前驱期PD的生物标记物。
表5基本资料
Figure BDA0003018748050000061
注：性别以外的计量资料用中位数(四分位数)表示；UP：统一帕金森病评定量表；H-Y：Hoehn and Yahr分期；NMSQ：30项非运动症状问卷；MMSE：简易精神状态检查量表；MoCA：蒙特利尔认知评估量表；HAMD：汉密尔顿抑郁量表；HAMA：汉密尔顿焦虑量表；RBDQ-HK:香港中文大学快速眼动睡眠期行为障碍量表；PDSS：帕金森病睡眠量表。
2.血清miRNA-31和和miRNA-214评价晚期PD和前驱期PD的诊断价值分析
对照组21例，晚期PD组24例，以晚期PD为金标准，建立ROC曲线，约登指数最大为最佳界值，结果显示，血清miR-31预测晚期PD的最佳界值为0.0148，敏感度87.5％，特异度71.4％，AUC为0.744(95％CI＝0.572-0.916，P＝0.005，图2A)。对照组21例，前驱期PD组25例，以前驱期PD为金标准，建立ROC曲线，结果表明，血清miR-214预测前驱期PD的最佳界值为0.1962，敏感度72.0％，特异度76.2％，AUC为0.756(95％CI＝0.614-0.898,P＝0.003，图2B)。
3.血清miR-31和和miR-214与临床特征的相关性分析
早期PD组和晚期PD组合并为一组进行相关性分析。Spearman相关分析显示，早期PD组和晚期PD患者的发病年龄与miRNA-214呈正相关关系，而与miRNA-31呈负相关关系(见表6)。另外，miRNA-31与病程、UPⅡ、UPⅢ、H-Y、HAMD呈正相关关系，与PDSS呈负相关关系(见表6)。结果表明，miRNA-31和miRNA-214与前驱期PD患者的临床特征无相关性(见表7)。
表6血清miRNA与早期PD和晚期PD患者临床特征的相关性分析
Figure BDA0003018748050000071
注：UP：统一帕金森病评定量表；H-Y：Hoehn and Yahr分期；NMSQ：30项非运动症状问卷；MMSE：简易精神状态检查量表；MoCA：蒙特利尔认知评估量表；HAMD：汉密尔顿抑郁量表；HAMA：汉密尔顿焦虑量表；PDSS：帕金森病睡眠量表；*在0.05级别(双尾)，相关性显著；**在0.01级别(双尾)，相关性显著。
表7血清miRNA与前驱期PD患者临床特征的相关性分析
Figure BDA0003018748050000081
注：UP：统一帕金森病评定量表；NMSQ：30项非运动症状问卷；MMSE：简易精神状态检查量表；MoCA：蒙特利尔认知评估量表；HAMD：汉密尔顿抑郁量表；HAMA：汉密尔顿焦虑量表；RBDQ-HK:香港中文大学快速眼动睡眠期行为障碍量表。
本发明的技术效果有：
本发明提供的miRNA-214在PD前驱期患者静脉血中的表达量明显高于正常人，通过对miRNA-214进行特异性的监测能够达到辅助诊断PD前驱期的目的。
以上公开的仅为本发明的几个具体实施例，但是本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

Claims (1)

1. 检测静脉血中miRNA-214的试剂在制备诊断帕金森前驱期产品中的应用，其特征在于，所述miRNA-214的序列如SEQ ID NO.1所示。
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血清神经来源外泌体miR-221、miR-214与帕金森病认知障碍的相关性;于慧娟等;《国际神经病学神经外科学杂志》;20210228;第48卷(第2期);第110-114页 *

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