CN105424625A - 一种定量检测糖鞘脂中糖链结构的方法 - Google Patents

一种定量检测糖鞘脂中糖链结构的方法 Download PDF

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Abstract

一种定量检测糖鞘脂中糖链结构的方法，涉及一种应用凝集素芯片检测糖鞘脂中糖链谱的方法。目的在于提供一种不但能迅速检测糖鞘脂中糖链成分并且可以得到糖链连接方式的检测糖鞘脂中糖链结构的方法。该方法包括凝集素芯片的制备，用于凝集素芯片的糖脂样品标靶制备和糖鞘脂糖链谱的鉴定。该方法基于凝集素对特定糖链识别结合特异性，通过对糖鞘脂进行亲水性处理，使得糖鞘脂中糖链与凝集素芯片结合，通过荧光标记，获得并识别不同糖链结构的凝集素的结合信号，最终得到糖鞘脂中糖链谱，对疾病的判断具有重要作用。

Description

一种定量检测糖鞘脂中糖链结构的方法
技术领域
本发明涉及一种应用凝集素芯片检测糖鞘脂中糖链谱的方法。
背景技术
糖鞘脂是脂类的一种，其广泛存在于生物体内的细胞膜表面。它由糖链部分和脂质两部分结合而成，根据其上糖链的复杂程度，糖鞘脂被分为多种类型。现有研究表明，在细胞黏附、增殖、迁移、凋亡、细胞周期等生物学过程中糖鞘脂发挥重要作用，另外，它还对肿瘤转移过程中血管生成有促进作用，这也使它成为了肿瘤研究领域中的热点。
目前，针对糖鞘脂糖链谱的研究主要采用高效液相色谱以及质谱。高效液相色谱在鉴定糖鞘脂时需要预先获得糖脂标准品的相关数据。质谱分析时，需要以酶切的方法释放糖鞘脂的糖链部分，再经除盐、全甲基化等步骤处理之后进行质谱分析。此类方法不仅实验周期长，操作繁琐，成本高昂并且只能检测糖链组成成分，缺少糖链连接方式方面的信息，而糖链连接方式对于判断人体疾病类型具有重要作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种不但能迅速检测糖鞘脂中糖链成分并且可以得到糖链连接方式的定量检测糖鞘脂中糖链结构的方法。
本发明提供一种定量检测糖鞘脂中糖链结构的方法，包括以下步骤：凝集素芯片的制备，用于凝集素芯片的糖脂样品标靶制备和糖鞘脂糖链谱的鉴定；
所述用于凝集素芯片的糖脂样品标靶制备包括（1）糖鞘脂的脂肪链酶切及纯化，（2）酶切后糖鞘脂的荧光标记及纯化；
所述糖鞘脂糖链谱的鉴定为经荧光标记的糖鞘脂加载到凝集素芯片上获得识别不同糖链结构的凝集素的结合信号，进而根据凝集素识别的糖链结构得到糖鞘脂中糖链谱。
所述（1）糖鞘脂的脂肪链酶切及纯化具体步骤是：
a）取400μMGM1溶于酶切反应缓冲液中，所述酶切缓冲液为0.8%TDC,50mMNaAc,pH5.5，加入40mUSCDase酶，混匀后加入200μL癸烷，去除酶切反应产生的脂肪酸链，37℃摇床低速震荡反应24h，期间每4-6h更换一次癸烷，24h后，吸出上方癸烷弃置，在100℃水浴锅中加热5min使SCDase酶变性，随后12000rpm，离心15min，取上清，蒸干后得到酶切后的GM1；
b）使用Sep-pakC18柱进行纯化酶切后的GM1，在使用前，先向Sep-pakC18柱中依次加入10倍于柱体积的乙腈、50%乙腈/0.1%三氟乙酸溶液、0.1%三氟乙酸进行柱体的清洗和活化，将蒸干后的糖鞘脂粗品溶解于0.2mL甲醇中，并加入1.8mL水，混匀后上样于活化后的C18柱，重复上样2次，洗脱之前，加入3mL灭菌水进行清洗，洗脱液依次选用3mL甲醇和3mL氯仿/甲醇=2:1溶液，每一种洗脱液分别进行3次洗脱和收集，再将两种洗脱液洗脱得到的样品混合，蒸干。
所述（2）酶切后糖鞘脂的荧光标记及纯化具体步骤是：
a）取10μg酶切后的GM1蒸干后加入10μLDMSO溶解沉淀；
b）向溶液中加入100μLpH9.3的0.1MNa2CO3混匀后加入5μLCy3荧光染料，涡旋，离心后置于避光处孵育2h；
c）将G-25柱用10mL超纯水清洗3次后再用10mL1×PBS缓冲液平衡，待平衡完成后将酶切后GM1与荧光的孵育液加入G-25柱中，分离Cy3标记的GM1。
所述（3）凝集素芯片的制备具体是：
a）取环氧化片基备用；
b）将凝集素配制成浓度为1mg/ml的点样液；
c）将配制的点样液加到384孔板内；再用芯片点样仪在环氧化片基上点样；
d）将点制好的凝集素芯片在湿度为55%-65%的环境中避光孵育10-12小时；
e）将孵育完毕的凝集素芯片置于真空干燥器中，37℃真空干燥3小时，使凝集素充分固定于芯片上；
f）将固定好的凝集素芯片放置在干燥器中4℃避光保存。
所述（4）荧光标记的糖鞘脂加载到凝集素芯片上获得识别不同糖链结构的凝集素的结合信号，进而根凝集素识别的糖链结构判断糖鞘脂中糖链谱具体包括如下步骤：
a）吸取3μgCy3荧光标记GM1与80μL孵育缓冲液混匀用灭菌水补足体积至120μL，混匀，覆盖点样区，加盖玻片孵育3h；
b）孵育结束后用含磷酸盐缓冲液-吐温20和磷酸盐缓冲液分别清洗各2次，每次5分钟，最后离心甩干芯片；
c）通过GenePix3.0软件对荧光图像进行中值分析，对图像中的凝集素所对应的糖链结构核对后得出GM1糖脂糖链结构。
所述（4）荧光标记的糖鞘脂加载到凝集素芯片上获得识别不同糖链结构的凝集素的结合信号，进而根凝集素识别的糖链结构判断糖鞘脂中糖链谱的处理步骤前还有凝集素封闭步骤，所述的凝集素封闭步骤具体为：
a）将凝集素芯片取出，用磷酸盐缓冲液-吐温20和磷酸盐缓冲液分别清洗各2次，每次5分钟，甩干；
b）将甩干后的凝集素芯片放入含30mL封闭缓冲液中室温孵育1小时；
c)将孵育后的凝集素芯片用磷酸盐缓冲液-吐温20和磷酸盐缓冲液分别清洗各2次，每次5分钟，甩干，备用。
上述步骤中涉及的磷酸盐缓冲液为pH7.4，1L磷酸盐缓冲液中含有：NaCl8.0g，KCl0.2g，KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g；磷酸盐缓冲液-吐温20则为：10mmol/L磷酸盐缓冲液中含质量分数0.05-0.5%吐温20；封闭缓冲液为：50mmol/L乙醇胺溶于50mmol/LpH8.0硼酸钠溶液；孵育缓冲液为：磷酸盐缓冲液-吐温20中含质量分数1%牛血清白蛋白和质量分数10-20%羟胺及质量分数1-10%TritonX-100。
本发明具有如下有益效果：
本发明技术方案基于凝集素对特定糖链识别结合特异性，通过对糖鞘脂进行亲水性处理，使得糖鞘脂中糖链与凝集素芯片结合，通过荧光标记，在凝集素芯片上获得识别不同糖链结构的凝集素的结合信号，进而根据凝集素识别的糖链结构得到糖鞘脂中糖链谱，对疾病的判断具有重要作用。
附图说明
图1为地衣酚-硫酸测定糖脂含量标准曲线；
图2为地衣酚-硫酸显色剂显色结果图；
图3为茚三酮显色剂显色结果图；
图4为GM1凝集素芯片孵育结果图；
图5为GM1标准品糖链结构图；
图6为Gal及NGalNAc识别凝集素结合信号；
图7为糖链Galβ1-4Glc识别凝集素结合信号；
图8为糖链Neu5ACa2-3Gal识别凝集素结合信号；
图9为肝癌细胞系HepG2糖脂与凝集素芯片孵育结果图；
图10为凝集素芯片荧光信号值。
具体实施方式
下面通过给出的具体实施例对本发明做进一步说明，但不作为对本发明的限定。
实施例1
为了更好的分析糖脂糖链谱，将37种识别不同糖链节结构凝集素连同阴性质控BSA、位置标记Cy3标记的BSA一起点制成4×10的矩阵。
GM1脂肪链酶切及纯化
首先，取400μMGM1溶于酶切反应缓冲液中，酶切缓冲液为0.8%TDC,50mMNaAc,pH5.5，加入40mUSCDase酶，混匀后加入200μL癸烷，去除酶切反应产生的脂肪酸链，37℃摇床低速震荡反应24h，期间每4-6h更换一次癸烷，24h后，吸出上方癸烷弃置，在100℃水浴锅中加热5min使SCDase酶变性，随后12000rpm，离心15min，取上清，蒸干后即可得到酶切后的GM1。
酶切后的GM1纯化及定量
使用Sep-pakC18柱进行纯化酶切够的GM1，在使用前，先向Sep-pakC18柱中依次加入10倍于柱体积的乙腈、50%乙腈/0.1%三氟乙酸溶液、0.1%三氟乙酸进行柱体的清洗和活化，将蒸干后的糖鞘脂粗品溶解于0.2mL甲醇中，并加入1.8mL水，混匀后上样于活化后的C18柱。重复上样2次。洗脱之前，加入3mL灭菌水进行清洗，洗脱液依次选用3mL甲醇和3mL氯仿/甲醇=2:1溶液，每一种洗脱液分别进行3次洗脱和收集，再将两种洗脱液洗脱得到的样品混合。
取100μL洗脱液进行地衣酚-硫酸定量检测，配置0.1mg/mL甘露糖标准品试剂，地衣酚-硫酸试剂（60%硫酸与1.6%地衣酚水溶液以7.5:1的比例混合），取7只离心管，编号，分别按梯度终浓度加入标准品、水和糖脂样品共0.3mL，再在各管加入0.85mL冷却到4℃的地衣酚-硫酸试剂，封口后在80℃中水浴加热15min，取出后用流水冷却至后505nm比色，根据得到的数据绘制标准曲线，再由样品在505nm吸光值带入标准曲线方程计算得到提取出的糖鞘脂质量。
得到的地衣酚硫酸测定标准曲线如图1所示，标准曲线方程y=15.944x+0.0531R2=0.9675，通过测量得到酶切后GM1在505nm处吸光值为Aa=0.068，经计算得到酶切后GM1回收量为35.4685μg。
薄层色谱(TLC)验证
分别取10μLGM1和酶切后GM1使用毛细玻璃管点样在硅胶薄层色谱板上，冷风吹干后置于展开剂中（氯仿/甲醇/0.2CaCl25:4:1v/v/v）层析，待层析界面距薄层色谱板5mm左右时将薄层色谱板取出，冷风吹干后分别喷洒地衣酚/硫酸和茚三酮试剂，冷风吹干薄层板表面液体后放入110℃烘箱中，待糖脂条带完全显示出来后取出。
如图2所示，在地衣酚-硫酸显示剂的作用下，GM1标准品和酶切后的GM1均显示出明显的条带，而条带的位置不同，这表明酶切前后GM1分子量和结构发生改变。如图3所示，在茚三酮显色剂的作用下，酶切后的GM1显示出紫色的条带，而GM1标准品未显示出任何条带，这表明酶切后的GM1产生出了有活性的氨基集团。上述实验结果证明，酶切后的GM1分子量及结构发生改变并且产生了一个有活性的氨基集团，得到预期结果。
酶切后GM1荧光标记及纯化
取10μg酶切后的GM1蒸干后加入10μLDMSO溶解沉淀。100μL0.1MNa2CO3（pH9.3）混匀后加入5μLCy3荧光染料，涡旋，离心后置于避光处孵育2h，将G-25柱使用10mL超纯水清洗3次后使用10mL1×PBS缓冲液平衡，待平衡完成后将酶切后GM1与荧光的孵育液加入G-25柱中，分离Cy3标记后的GM1。
凝集素芯片的封闭
配置封闭缓冲液，将点样后的玻片浸泡在其中，25℃温育1h，1×PBST洗玻片两次，每次5min，再用1×PBS洗清洗两次，每次5min，1000rpm离心3分钟甩干，备用。
凝集素芯片孵育
吸取3μgCy3荧光标记GM1与80μL孵育缓冲液混匀用灭菌水补足体积至120μL，混匀，覆盖点样区，加盖玻片孵育3h。孵育结束后用含1×PBST，1×PBS各清洗2次，每次5min，最后离心甩干芯片。
数据的扫描与分析
用Genepix4000B芯片扫描仪扫描芯片，光电倍增管（PMT）电压设为700，先进行预扫描，然后选定点样区域，进行精确扫描。调节明亮度和对比度，达到最佳视觉效果。用GenePix3.0软件从扫描结果图中获取荧光信号强度值和背景值等信息进行分析。
结果分析
如图4所示，酶切后GM1与凝集素芯片孵育结果显示，共计17种凝集素显示出有效的结合信号，其中识别Galβ1-3GalNAc糖链结构的凝集素ACA结合信号最高，另外在上述的17种凝集素中，共有11种凝集素为特异性识别Gal和GalNAc的凝集素，如图5所示，已证实的GM1标准品的糖链结构显示，Gal和GalNAc结构为GM1糖脂糖链的主要糖链结构，这与凝集素芯片结构一致。
另外，凝集素芯片结果表明，识别糖链结构Galβ1-4Glc的凝集素LEL以及识别Neu5Acα2-3Gal的凝集素MAL-II均显示出较强的结合信号，分别如图6-8所示，这两种糖链结构同样出现在GM1糖脂糖链中，综上所述，GM1糖脂糖链结构均在凝集素芯片中得到映证。
实施例2
采用该方法对肝癌细胞系HePG2的糖脂糖链进行验证。
1）制备凝集素芯片：
1.1）取环氧化片基备用；
1.2）将凝集素配制成浓度为1mg/ml的点样液；
1.3）将配制的点样液加到384孔板内；再用北京博奥晶芯48点样系统在环氧化片基上点样；
1.4）将点制好的芯片在湿度为60%的环境中孵育12小时；
1.5）对孵育好的芯片在37℃的环境中抽真空3小时，使芯片干燥，并使凝集素固定于芯片上；
1.6）将固定好的凝集素芯片放置在4℃干燥器中以备用。
2）用于凝集素芯片的糖脂样本靶标制备：
2.1）糖鞘脂的分离与纯化收集3×106人肝癌细胞系HepG2细胞，3mL氯仿/甲醇（2:1v:v），3mL氯仿/甲醇（1:1v:v）依次粗提糖鞘脂。使用1MNaOH降解粗提糖鞘脂中的磷脂成分，HCl调pH至中性后使用Sep-pakC18柱纯化提取的细胞糖鞘脂；
2.2）糖鞘脂酶切及纯化取100μg糖鞘脂溶于酶切反应缓冲液（0.8%TDC,50mMNaAc,pH5.5）中，加入40mUSCDase酶，混匀后加入200μL癸烷，去除酶切反应产生的脂肪酸链，37℃摇床低速震荡反应24h，期间每4-6h更换一次癸烷。24h后，小心吸出上方癸烷弃置，在100℃水浴锅中加热5min使SCDase酶变性，随后12000rpm，离心15min，取上清，使用Sep-pakC18柱纯化酶切后的糖鞘脂。
2.3）酶切后糖鞘脂荧光标记取10μg酶切后的糖鞘脂蒸干后加入10μLDMSO溶解沉淀。向溶液中加入100μL0.1MNa2CO3（pH9.3）混匀后加入5μLCy3荧光染料，涡旋，离心后置于避光处孵育2h。将G-25柱使用10mL超纯水清洗3次后使用10mL1×PBS缓冲液平衡，待平衡完成后将酶切后糖鞘脂与荧光的孵育液加入G-25柱中，分离Cy3标记的糖鞘脂。
3）糖鞘脂糖链谱鉴定：
3.1）配制30mL封闭缓冲液（50mM乙醇胺，50mM硼酸钠，pH8.0），将制备好的凝集素芯片置于封闭缓冲液中孵育1小时；
3.2）将封闭后的凝集素芯片用磷酸盐缓冲液-吐温20和磷酸盐缓冲液分别清洗各2次，每次5分钟，再经甩干后备用；
3.3）对甩干后的凝集素芯片加入4μg标记好的糖鞘脂和500μL的孵育缓冲液，并在室温孵育3小时；
3.4）将孵育后的凝集素芯片用磷酸盐缓冲液-吐温20和磷酸盐缓冲液分别清洗各2次，每次5分钟，甩干；
3.5）对甩干后的凝集素芯片用GenePix4000B芯片扫描仪扫描，得到凝集素与标记后肝癌细胞糖鞘脂结合的荧光图像，及各凝集素荧光信号强度，如图9所示；
3.6）通过GenePix3.0软件对荧光图像进行中值分析，对图像中的凝集素所对应的糖链结构核对后得到肝癌细胞系HepG2的糖脂糖链谱。
如图10所示，共有8种凝集素与肝癌细胞系HePG2糖脂结合信号较高。其中，BS-I，SBA及RCA120为半乳糖结合凝集素，UEA-I及PSA为Fucα-1,2/6结合凝集素，PWM为Glc结合凝集素，WGA为多价唾液酸结合凝集素，这与现有文献报道的细胞糖脂糖链谱类型一致，因此，本发明能够准确可靠的用于鉴定糖脂糖链谱。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所做的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种定量检测糖鞘脂中糖链结构的方法，其特征在于包括以下步骤：凝集素芯片的制备，用于凝集素芯片的糖脂样品标靶制备和糖鞘脂糖链谱的鉴定；
所述用于凝集素芯片的糖脂样品标靶制备包括（1）糖鞘脂的脂肪链酶切及纯化，（2）酶切后糖鞘脂的荧光标记及纯化；
所述糖鞘脂糖链谱的鉴定为经荧光标记的糖鞘脂加载到凝集素芯片上获得识别不同糖链结构的凝集素的结合信号，进而根据凝集素识别的糖链结构得到糖鞘脂中糖链谱。
2.根据权利要求1所述定量检测糖鞘脂中糖链结构的方法，其特征在于：所述（1）糖鞘脂的脂肪链酶切及纯化具体步骤是：
a）取400μMGM1溶于酶切反应缓冲液中，所述酶切缓冲液为0.8%TDC,50mMNaAc,pH5.5，加入40mUSCDase酶，混匀后加入200μL癸烷，去除酶切反应产生的脂肪酸链，37℃摇床低速震荡反应24h，期间每4-6h更换一次癸烷，24h后，吸出上方癸烷弃置，在100℃水浴锅中加热5min使SCDase酶变性，随后12000rpm，离心15min，取上清，蒸干后得到酶切后的GM1；
b）使用Sep-pakC18柱进行纯化酶切后的GM1，在使用前，先向Sep-pakC18柱中依次加入10倍于柱体积的乙腈、50%乙腈/0.1%三氟乙酸溶液、0.1%三氟乙酸进行柱体的清洗和活化，将蒸干后的糖鞘脂粗品溶解于0.2mL甲醇中，并加入1.8mL水，混匀后上样于活化后的C18柱，重复上样2次，洗脱之前，加入3mL灭菌水进行清洗，洗脱液依次选用3mL甲醇和3mL氯仿/甲醇=2:1溶液，每一种洗脱液分别进行3次洗脱和收集，再将两种洗脱液洗脱得到的样品混合，蒸干。
3.根据权利要求1所述定量检测糖鞘脂中糖链结构的方法，其特征在于：所述（2）酶切后糖鞘脂的荧光标记及纯化具体步骤是：
a）取10μg酶切后的GM1蒸干后加入10μLDMSO溶解沉淀；
b）向溶液中加入100μLpH9.3的0.1MNa2CO3混匀后加入5μLCy3荧光染料，涡旋，离心后置于避光处孵育2h；
c）将G-25柱用10mL超纯水清洗3次后再用10mL1×PBS缓冲液平衡，待平衡完成后将酶切后GM1与荧光的孵育液加入G-25柱中，分离Cy3标记的GM1。
4.根据权利要求1所述定量检测糖鞘脂中糖链结构的方法，其特征在于：所述（3）凝集素芯片的制备具体是：
a）取环氧化片基备用；
b）将凝集素配制成浓度为1mg/ml的点样液；
c）将配制的点样液加到384孔板内；再用芯片点样仪在环氧化片基上点样；
d）将点制好的凝集素芯片在湿度为55%-65%的环境中避光孵育10-12小时；
e）将孵育完毕的凝集素芯片置于真空干燥器中，37℃真空干燥3小时，使凝集素充分固定于芯片上；
f）将固定好的凝集素芯片放置在干燥器中4℃避光保存。
5.根据权利要求1所述定量检测糖鞘脂中糖链结构的方法，其特征在于：所述（4）荧光标记的糖鞘脂加载到凝集素芯片上获得识别不同糖链结构的凝集素的结合信号，进而根凝集素识别的糖链结构判断糖鞘脂中糖链谱具体包括如下步骤：
a）吸取3μgCy3荧光标记GM1与80μL孵育缓冲液混匀用灭菌水补足体积至120μL，混匀，覆盖点样区，加盖玻片孵育3h；
b）孵育结束后用含磷酸盐缓冲液-吐温20和磷酸盐缓冲液分别清洗各2次，每次5分钟，最后离心甩干芯片；
c）通过GenePix3.0软件对荧光图像进行中值分析，对图像中的凝集素所对应的糖链结构核对后得出GM1糖脂糖链结构。
6.根据权利要求5所述定量检测糖鞘脂中糖链结构的方法，其特征在于：所述（4）荧光标记的糖鞘脂加载到凝集素芯片上获得识别不同糖链结构的凝集素的结合信号，进而根凝集素识别的糖链结构判断糖鞘脂中糖链谱的处理步骤前还有凝集素封闭步骤，所述的凝集素封闭步骤具体为：
a）将凝集素芯片取出，用磷酸盐缓冲液-吐温20和磷酸盐缓冲液分别清洗各2次，每次5分钟，甩干；
b）将甩干后的凝集素芯片放入含30mL封闭缓冲液中室温孵育1小时；
c）将孵育后的凝集素芯片用磷酸盐缓冲液-吐温20和磷酸盐缓冲液分别清洗各2次，每次5分钟，甩干，备用。
7.根据权利要求1至6所述定量检测糖鞘脂中糖链结构的方法，其特征在于：上述步骤中涉及的磷酸盐缓冲液为pH7.4，1L磷酸盐缓冲液中含有：NaCl8.0g，KCl0.2g，KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g；磷酸盐缓冲液-吐温20则为：10mmol/L磷酸盐缓冲液中含质量分数0.05-0.5%吐温20；封闭缓冲液为：50mmol/L乙醇胺溶于50mmol/LpH8.0硼酸钠溶液；孵育缓冲液为：磷酸盐缓冲液-吐温20中含质量分数1%牛血清白蛋白和质量分数10-20%羟胺及质量分数1-10%TritonX-100。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105929162A (zh) * 2016-05-13 2016-09-07 西北大学 一种基于唾液蛋白鉴别乳腺癌的凝集素芯片和试剂盒及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090242804A1 (en) * 2008-03-31 2009-10-01 Hitachi High-Technologies Corporation Method for fluorescence analysis and fluorescence analyzer
CN103649740A (zh) * 2011-06-06 2014-03-19 耶达研究及发展有限公司 基于分子控制的半导体电阻器的蛋白质检测器
CN104977417A (zh) * 2015-05-15 2015-10-14 西北大学 一种糖肽芯片及其制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090242804A1 (en) * 2008-03-31 2009-10-01 Hitachi High-Technologies Corporation Method for fluorescence analysis and fluorescence analyzer
CN103649740A (zh) * 2011-06-06 2014-03-19 耶达研究及发展有限公司 基于分子控制的半导体电阻器的蛋白质检测器
CN104977417A (zh) * 2015-05-15 2015-10-14 西北大学 一种糖肽芯片及其制备方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EMMA ARIGI ET AL.: "Design of a covalently bonded glycosphingolipid microarray", 《GLYCOCONY J》 *
EMMA ARIGI 等: "Design of a covalently bonded glycosphingolipid microarray", 《GLYCOCONJ J》 *
王艳萍 等: "鞘糖脂研究进展", 《生命科学》 *
简强 等: "凝集素芯片技术检测糖蛋白方法的建立及初步应用", 《生物化学与生物物理进展》 *
简强: "凝集素芯片检测糖蛋白方法的建立及应用", 《中国优秀硕士学位论文 基础科学辑》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105929162A (zh) * 2016-05-13 2016-09-07 西北大学 一种基于唾液蛋白鉴别乳腺癌的凝集素芯片和试剂盒及其应用

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