CN117192100A - 一种基于荧光共振能量转移构建用于gp73检测的磁性荧光适配体传感器 - Google Patents
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Abstract
一种基于荧光共振能量转移构建用于GP73检测的磁性荧光适配体传感器，采用四氧化三铁及硼氮掺杂石墨烯量子点修饰GP73适配体为荧光探针，二硫化钼为荧光共振受体。利用Fe3O4@B,N‑GQDs‑GP73Apt和MoS2间的荧光共振能量转移现象和GP73适配体的识别分子作用，构建Fe3O4@B,N‑GQDs‑GP73Apt/MoS2磁性荧光适配体传感器，根据加入GP73蛋白前后的荧光强度恢复值与GP73的关系，从而实现荧光检测未知浓度的GP73蛋白的目的。与抗体相比，GP73适配体不仅使传感器具有特异性，成本相对较低；另外由于的Fe3O4磁性使得该方法还可尝试用于荧光成像等荧光分析中。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于荧光共振能量转移的磁性荧光适配体传感器实现对GP73的检测。
背景技术
高尔基体蛋白73(GP73)是临床医学领域用来早期诊断和筛查肝细胞癌的一种血清标志物。关于检测血清中GP73的方法主要有酶联免疫吸附剂测定、Luminex多因子液相分析技术、蛋白质印记法、免疫组化染色、电化学检测法和荧光检测法等。公开号为CN111378627A的发明专利，涉及了GP73单克隆抗体、包含该抗体的试剂盒及其在检测GP73中的应用，以GP73单克隆抗体为识别分子对人体血清中的GP73进行特异性识别和检测。公开号为CN115963254A的发明专利，涉及了一种荧光共振能量转移的竞争型免疫传感器的制备方法及应用，其中通过金属银增强的N,S-GQDs为量子点发光基团，蛋白的抗体为识别分子，纳米金粒子为淬灭基团，实现了对包括GP73蛋白在内的免疫传感检测，可用于检测人体血清中GP73蛋白的含量。以上专利实现了GP73的特异性检测，但采用抗体的成本较高，且基于荧光共振能量转移的荧光检测方法中荧光基团可进一步改进，以提高灵敏度和选择性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于具有磁性荧光性能的纳米四氧化三铁及硼氮掺杂石墨烯量子点(Fe3O4@B,N-GQDs)，高尔基体蛋白73适配体(GP73Apt)和良好淬灭效应的二硫化钼(MoS2)共同构建的用于GP73检测的磁性荧光适配体传感器。此传感器最低检测限为7.37ng/mL。
为了解决该技术问题，采用Fe3O4@B,N-GQDs作为荧光基团，并将Fe3O4@B,N-GQDs活化后与氨基化GP73适配体(GP73Apt)通过酰胺键进行结合，形成Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt荧光探针，其中GP73Apt为此传感器的识别分子。在Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt溶液中加入MoS2，Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt与MoS2之间通过分子间的静电吸附和π＝π共轭作用，发生荧光共振能量转移(FRET)，Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt的能量转移至MoS2，使得整个体系的荧光强度下降，形成了Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt/MoS2磁性荧光适配体传感器。加入GP73蛋白后，由于GP73Apt和GP73的特异性结合，GP73蛋白优先与荧光探针Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt结合形成了Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt-GP73复合物，使得Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt和MoS2之间的相互作用力被极大地削弱，阻断了FRET，从而使体系中的荧光恢复。根据加入GP73蛋白前后的荧光强度恢复率与GP73的关系，建立了GP73的工作曲线，实现了GP73的快速灵敏、选择性好的定量检测。
本发明按照以下步骤进行：
步骤1：荧光共振供体Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt的制备
(1)B,N-GQDs的制备：称取柠檬酸、4-羟基苯硼酸和乙二胺，加入纯水，搅拌均匀后放入反应釜中，用水热法合成硼氮共掺杂石墨烯量子点，透析提纯并干燥，得到B,N-GQDs粉末。
(2)Fe3O4@B,N-GQDs的制备：取纳米四氧化三铁并制成溶液，与B,N-GQDs溶液混合并超声，再进行水浴搅拌，最后将其磁分离洗涤并干燥，得到Fe3O4@B,N-GQDs粉末。
(3)Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt的制备：量取Fe3O4@B,N-GQDs和GP73Apt，混合后避光孵育，得到Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt溶液。
步骤2：荧光共振受体MoS2的制备及磁性荧光适配体传感器的构建
(1)称量MoS2试剂，加入N,N-二甲基甲酰胺溶液(DMF)定容，超声破碎并静置沉淀，再洗涤沉淀物并干燥，可得低层数的MoS2粉末。
(2)称量MoS2粉末并配制成溶液，将Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt溶液、MoS2溶液和磷酸盐(PBS)缓冲溶液混合，并避光孵育一段时间，便可得到Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt/MoS2磁性荧光适配体传感器。取一部分溶液用荧光分光光度计进行扫描，记录其荧光强度F0。
步骤3：GP73工作曲线的绘制
(1)将不同浓度的标准GP73溶液加入到Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt/MoS2磁性荧光适配体传感器中，孵育后取一部分溶液，用荧光分光光度计进行扫描，记录其荧光强度F1。
(2)用(F1-F0)/F0作为纵坐标，GP73浓度作为横坐标，绘制工作曲线，计算出该磁性荧光适配体传感器在荧光检测方面的最低检测限。
步骤4：实际血清样品中GP73的检测
(1)在3份正常人的血清样本中分别加入不同浓度的标准GP73蛋白，制成待测血清样本。而后将待测血清样本加入到步骤2中的Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt/MoS2磁性荧光适配体传感器，孵育后取一部分溶液，用荧光分光光度计进行扫描，固定激发波长为343nm，测量其441nm处的荧光强度。
(2)根据步骤3所得到的GP73的工作曲线，计算待测实际血清样品中GP73的浓度。
进一步，所述步骤1中柠檬酸为无水柠檬酸，用量为0.5020g；4-羟基苯硼酸的量为0.1g；乙二胺为一水乙二胺且用量为156μL，加入纯水后定容于10mL；
进一步，所述步骤1中水热法的具体温度为200℃，时间为5h；使用的透析袋的截留分子量为12000-14000Da，透析时间为24h；
进一步，所述步骤1中，B,N-GQDs的浓度为1.0mg/mL，用量为8mL；纳米四氧化三铁的量为0.0804g，加入纯水后定容于34.7mL；
进一步，所述步骤1中，Fe3O4@B,N-GQDs的浓度为0.06mg/mL；GP73Apt的DNA序列为5′-NH2-C6-GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG-3′；GP73Apt浓度为2.5μM；
进一步，所述步骤1中Fe3O4@B,N-GQDs溶液、GP73Apt溶液的体积比为1:1；
作为优选，所述步骤1中的孵育温度为25℃，孵育时间为40min，在此条件下的相对荧光强度最好，有利于后续实验的进行；
进一步，所述步骤2中混合溶液内MoS2的浓度为0.5mg/mL；PBS缓冲溶液的pH为7.5；
进一步，所述步骤2中MoS2溶液、Fe3O4@B,N-GQDs溶液和PBS缓冲溶液配成混合溶液时的体积比1:1:4；
作为优选，所述步骤2中的孵育温度为25℃，孵育时间为40min，在此条件下体系的淬灭效果最佳；
进一步，所述步骤2，步骤3和步骤4中荧光检测的激发波长为343nm，发射波长441nm；
作为优选，所述步骤3和步骤4中GP73蛋白的孵育温度为35℃，孵育时间为40min，在此条件下加入蛋白后，体系的荧光恢复效果最好。
其中，步骤1提供了一种发出淡蓝色荧光的Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt，为步骤2提供荧光共振能量转移的荧光供体。步骤2提供了具有荧光猝灭性质的MoS2材料，作为荧光共振能量转移的受体。在Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt荧光探针中加入MoS2，由于Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt与MoS2之间的静电吸附和π＝π共轭作用，FRET发生，使得Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt的荧光被猝灭，整个体系的荧光强度下降。步骤3中，随着GP73蛋白的加入，GP73Apt与GP73蛋白特异性结合，使得GP73蛋白优先与Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt结合形成Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt-GP73复合物，阻断了FRET，荧光恢复。根据加入GP73蛋白前后的荧光强度恢复率与GP73的关系，建立了GP73的工作曲线。步骤3的GP73的工作曲线为步骤4的实际样本中GP73浓度的测定提供计算依据。步骤1到步骤4相互支撑，共同作用，才能利用Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt和MoS2间的FRET，建立起能检测GP73的Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt/MoS2磁性荧光适配体传感器。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
(1)Fe3O4@B,N-GQDs为荧光基团，其中Fe3O4具有较好的生物相容性，无毒无副作用且较稳定，能与B,N-GQDs合成荧光强度良好的磁性量子点，且由于其具有磁性，故在其他荧光方法上如荧光成像等有着强大的潜能。
(2)GP73Apt为识别分子，与抗体相比，在识别能力上不相上下，但适配体的成本较低，有利于大规模的使用；同时MoS2对GP73Apt的强大吸附能力共同提高了检测的特异性，极大的加强了传感器的检测灵敏度和检测范围。
附图说明
图1基于Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt和MoS2构建的磁性荧光适配体传感器检测GP73的原理图；
图2Fe3O4@B,N-GQDs的荧光光谱图，(A)激发光谱，(B)发射光谱；
图3Fe3O4@B,N-GQDs的电镜图，(A)扫描电子显微镜(SEM)，(B)投射电子显微镜(TEM)；
图4Fe3O4@B,N-GQDs的X射线光电子能谱(XPS)图；
图5磁性荧光适配体传感器检测不同浓度的GP73的(A)荧光光谱图和(B)线性拟合图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
一种基于荧光共振能量转移构建用于GP73检测的磁性荧光探针传感器，检测原理见图1。Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt为荧光探针，MoS2为淬灭剂，二者之间的FRET为此检测体系的关键。Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt溶液和MoS2溶液混合后，由于Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt与MoS2之间的π＝π共轭及静电吸附，发生了荧光共振能量转移，Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt的荧光被猝灭，整个体系的荧光强度下降。未加入蛋白时，荧光探针仍处于被淬灭的状态，荧光强度低；加入GP73蛋白后，由于GP73Apt对GP73蛋白的特异性，GP73优先与Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt结合形成Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt-GP73复合物，Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt和MoS2之间的相互作用力被极大地削弱，阻断了FRET，从而使体系中的荧光恢复，加入的GP73浓度越高，荧光恢复效果越好。根据加入GP73蛋白前后的荧光强度恢复率与GP73的关系，建立了GP73的工作曲线。实现了GP73的快速灵敏、选择性好的定量检测。具体实施步骤如下：1.荧光共振供体Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt的制备
(1)用精密电子天平称取0.5020g无水柠檬酸和0.1g 4-羟基苯硼酸放入25mL烧杯中，加入156μL乙二胺，再加入超纯水定容到20mL，用超声波细胞破碎机破碎30min后，倒入内衬有特氟隆的高温反应釜中，在200℃下水热5h。待反应完成后，将反应釜取出冷却至室温后，去除不能溶解的大颗粒，并用截留分子量为12000-14000Da的透析袋对其进行24h透析提纯；60℃下干燥，得到B,N-GQDs固体粉末。称取10mg的B,N-GQDs粉末，加入纯水定容于10mL，得到1.0mg/mL的B,N-GQDs溶液。
(2)用精密电子天平称取0.0804g四氧化三铁纳米颗粒于25mL烧杯中，再加入8mLB,N-GQDs溶液，用纯水定容到26.7mL，破碎30min后，在60℃下水浴搅拌3h。待反应结束后，对溶液进行磁分离，洗涤2次，将所得具有磁性的固体放入鼓风干燥箱内加热至60℃进行干燥后，得到Fe3O4@B,N-GQDs粉末。称量50mg Fe3O4@B,N-GQDs于10mL离心管中，用超纯水定容到5mL，得到10mg/mL的Fe3O4@B,N-GQDs溶液。图2的激发光谱图和发射光谱图说明Fe3O4@B,N-GQDs的激发波长和发射波长分别为343nm和441nm；图3中的电镜图说明Fe3O4@B,N-GQDs是直径约8nm的球状物；图4的XPS图中各个元素的峰的存在和含量说明了Fe3O4@B,N-GQDs的合成成功。
(3)取200μLFe3O4@B,N-GQDs和200μL 2.5μM的GP73Apt，混合均匀后放入室温为25℃的避光环境中震荡均匀，孵育40min，得到荧光标记的复合体Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt溶液。
2.荧光共振受体MoS2的制备及磁性荧光适配体传感器的构建
(1)用精密电子天平称量30mg MoS2固体放入烧杯中，加入DMF定容于50mL，将其放入超声细胞破碎仪中超声破碎1h，破碎完成后静置沉淀，待沉淀完全后用胶头滴管取出上清液，然后将剩下的沉淀物洗涤，放入电热鼓风干燥箱中干燥完后得到较低层数的MoS2。量取10mg较低层数的MoS2，加入超纯水定容到20mL，得到0.5mg/mL的MoS2溶液。
(2)量取100μL的Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt溶液、100μL的MoS2溶液和400μLpH值为7.5的PBS缓冲溶液，混合均匀后放入室温为25℃的避光环境中震荡均匀，孵育40min，形成Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt/MoS2磁性荧光适配体传感器。取部分溶液用荧光分光光度计进行扫描，固定激发波长为343nm，测量其441nm处荧光强度F0。
3.GP73工作曲线的绘制
(1)在步骤2中制备的Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt/MoS2溶液600μL中，加入200μL GP73蛋白溶液(10ng/mL，20ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，200ng/mL，500ng/mL，800ng/mL，1000ng/mL)，混合均匀后放入35℃的避光环境中震荡均匀，孵育40min。孵育后取部分溶液用荧光分光光度计进行扫描，固定激发波长为343nm，测量其441nm处荧光强度F1。从图5(A)中可以看到，随着GP73的浓度增加，传感器的荧光强度也在增加。
(2)用荧光恢复值(F1-F0)/F0作为纵坐标，GP73浓度作为横坐标，绘制荧光检测的工作曲线，当GP73蛋白浓度在10-1000ng/mL范围内，传感器的荧光恢复值(F1-F0)/F0与GP73浓度之间的关系呈线性的，如图5(B)所示，工作曲线为Y＝0.0003X+0.1594(Y表示荧光恢复值，X表示GP73蛋白的浓度)，相关系数为R2＝0.9918，最低检测限为7.37ng/mL；
4.实际血清样本中GP73的检测
(1)采用加标回收法。将正常人血清和不同浓度的GP73蛋白溶液按1:1(体积比)混合均匀，制成待测血清样本(该血清样本中GP73浓度分别为100ng/mL，200ng/mL，600ng/mL)。然后取200μL各待测血清样本加入到制备好的600μLFe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt/MoS2荧光适配体传感器中，混合均匀后放入35℃的避光环境中震荡均匀，孵育40min。按照步骤3测定GP73蛋白的方法分别测定其荧光强度。
(2)根据步骤3所得到的荧光检测的工作曲线Y＝0.0003X+0.1594，计算可得到对应实际血清样本中GP73的浓度，其荧光检测结果见表1。从表1可以得知，实验的回收率范围区间是98.80％～101.18％，相对标准偏差范围为0.29％～3.04％，该数据表明其可用于实际血清的检测。
表1实际血清中GP73的检测
Claims (6)
1.一种基于荧光共振能量转移构建用于GP73检测的磁性荧光探针传感器，按以下步骤进行：
步骤1：荧光共振供体Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt的制备
(1)硼氮共掺杂石墨烯量子点B,N-GQDs的制备：称取柠檬酸、4-羟基苯硼酸和乙二胺，加入纯水后搅拌均匀，水热后冷却至室温，将其透析提纯并干燥，得到B,N-GQDs粉末；
(2)四氧化三铁@硼氮共掺杂石墨烯量子点Fe3O4@B,N-GQDs的制备：将纳米四氧化三铁用纯水定容与B,N-GQDs溶液混合后破碎，再将破碎后的溶液水浴搅拌，最后磁分离洗涤后得到Fe3O4@B,N-GQDs粉末；
(3)Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt的制备：量取Fe3O4@B,N-GQDs和高尔基体蛋白73适配体GP73Apt，孵育后便可得到Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt溶液；
步骤2：荧光共振受体MoS2的制备及磁性荧光适配体传感器的构建
(1)称量二硫化钼MoS2粉末，加入N,N-二甲基甲酰胺溶液DMF定容，超声破碎后静置沉淀，洗涤沉淀物并干燥，得到低层数的MoS2粉末；
(2)称量MoS2粉末并配制成溶液，将MoS2溶液、磷酸盐PBS缓冲溶液和Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt溶液进行混合，避光孵育，得到Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt/MoS2磁性荧光适配体传感器；取一部分溶液用荧光分光光度计进行扫描，记录其荧光强度F0；
步骤3：GP73工作曲线的绘制
(1)将不同浓度的GP73溶液加入到Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt/MoS2磁性荧光适配体传感器，孵育；取一部分溶液用荧光分光光度计进行扫描，记录其荧光强度F1；
(2)用(F1-F0)/F0作为纵坐标，GP73浓度作为横坐标，绘制工作曲线，计算出该磁性荧光适配体传感器在荧光检测方面的最低检测限；
步骤4：实际血清样品中GP73的检测
(1)在3份正常人的实际血清样品中分别放入不同浓度的GP73蛋白，制成待测血清样本，并加入到步骤2中的Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt/MoS2磁性荧光适配体传感器，孵育；取一部分溶液用荧光分光光度计进行扫描，固定激发波长为343nm，测量其441处的荧光强度；
(2)根据步骤3所得到的的GP73的工作曲线，计算实际血清样品中GP73的浓度。
2.按照权利要求1所述的磁性荧光适配体传感器，其特征在于：步骤1中所述透析袋截留分子量为12000-14000Da，透析时间为24h。
3.按照权利要求1所述的磁性荧光适配体传感器，其特征在于：步骤1中Fe3O4@B,N-GQDs溶液的浓度为0.06mg/mL；GP73Apt溶液浓度为2.5μM；Fe3O4@B,N-GQDs溶液和GP73Apt溶液体积比为1:1；孵育温度为25℃，孵育时间为40min。
4.按照权利要求1所述的磁性荧光适配体传感器，其特征在于：步骤2中MoS2浓度为0.5mg/mL；PBS缓冲溶液pH值为7.5；Fe3O4@B,N-GQDs-GP73Apt溶液、MoS2溶液和PBS溶液体积比为1:1:4；孵育温度为25℃，孵育时间为40min。
5.按照权利要求1所述的磁性荧光适配体传感器，其特征在于：步骤3和步骤4中孵育温度为35℃，孵育时间为40min。
6.按照权利要求1所述的磁性荧光适配体传感器，其特征在于：步骤2、步骤3、步骤4中荧光分光光度计的激发波长为343nm，发射波长441nm。
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