CN113234163B - 分离胎儿滋养层细胞的方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种分离胎儿滋养层细胞的方法及试剂盒。具体地，本发明涉及用于分离纯化胎儿滋养层细胞的抗体组合，包括用于负筛选的抗体和/或用于正筛选的抗体。本发明还涉及分离胎儿滋养层细胞的方法和试剂盒。其中所述方法包括以下步骤：（1）获得包含滋养层细胞的母体组织样本；（2）制备组织样本单细胞悬液；（3）免疫磁珠法富集胎儿滋养层细胞；（4）细胞分选仪分选胎儿滋养层细胞。其中所述试剂盒包含以下试剂：（a）用于免疫磁珠法富集胎儿滋养层细胞的试剂；和/或（b）用于样本清洗的试剂。

Description

分离胎儿滋养层细胞的方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及一种利用免疫磁珠法富集与细胞分选仪分选相结合的细胞分离技术。具体地，本发明涉及一组用于分离纯化胎儿滋养层细胞的抗体组合，包括用于负筛选的抗体和用于正筛选的抗体。本发明还涉及一种分离母体组织样本中胎儿滋养层细胞的方法以及适用于该方法的试剂盒。
背景技术
在胚胎发育成桑椹胚并进一步发育过程中，开始出现分化沿透明带内壁扩展和排列的一种个体较小的细胞，即为滋养层细胞。在内细胞团发育过程中，由滋养层细胞和胚外中胚层的壁层构成绒毛膜。随着胚胎发育，丛密绒毛膜与基蜕膜共同构成了胎盘，而平滑绒毛膜则和包蜕膜一起逐渐与壁蜕膜融合。在此过程中，脱落的滋养层细胞即绒毛外滋养层细胞（Extravillous trophoblast, EVT）进入宫颈。
胎儿滋养层细胞可以作为一种胎儿遗传物质的来源，用于进行无创产前诊断1。因此纯化出高纯度的滋养层细胞，具有非常重要的临床应用意义。
目前也有报道，从母体血液中可富集获得滋养层细胞2；但母体血液中胎儿滋养层细胞的数量非常稀少，大约108个母体细胞中含有1个胎儿滋养层细胞，从母体血液中分离胎儿滋养层细胞非常困难。
利用滋养层细胞的特异性表面抗体anti-HLAG染色的实验表明，宫颈刮片样本中滋养层细胞的比例大约是1/20003。目前已报道的纯化宫颈样本滋养层细胞主要有显微切割和微流控两种技术4, 5, 6。但两种方法操作周期都非常长、成本昂贵并且对设备和实验人员的操作技术要求都很高，而且技术和临床应用可行性并没有得到充分验证。
利用细胞分选仪分选是一种常规且成熟的细胞分选技术，但由于大量背景细胞对特异性细胞染色的干扰，对于纯度小于0.1%甚至1%的细胞分离仍然存在很大难度。即使在抗体非常特异的情况下，流式细胞仪分离纯度也只能达到20%左右甚至更低7。由于宫颈刮片样本中存在许多细胞碎片和宫颈本身存在细菌感染等因素，实际流式分选时滋养层细胞的纯度可能远小于1/2000。而宫颈刮片样本中宫颈粘液的干扰，又给滋养层细胞的纯化带来更多难度。因此，在利用细胞分选仪分选前，对宫颈样本等母体组织样本中的滋养层细胞进行有效富集至关重要。
免疫磁珠法利用细胞表面特异性抗原和抗体结合，并利用磁力直接富集目标细胞（正筛选）或去除非目标细胞（负筛选）。正筛选一般可以达到几倍到几十倍的富集效果8，而负筛选一般可以达到几倍到几百倍的富集效果9。HLAG特异性在滋养层细胞上表达，可利用anti-HLAG进行滋养层细胞正筛选。而利用多种抗体进行正筛选会增加滋养层细胞的得率。目前尚无利用免疫磁珠负筛选法进行滋养层细胞富集的报道。
发明内容
本发明目的在于解决现有技术中，分离胎儿滋养层细胞操作复杂、周期长、成本昂贵、对实验人员的技术要求高的问题。
首先，本发明涉及一种抗体组合，其包括：
A）第一抗体；或
B）第二抗体；或
C）第一抗体和第二抗体；其中，
所述第一抗体包含anti-CD44、anti-CD45、anti-CD66c、anti-CD82、anti-CD114、anti-CD227和anti-E-cadherin中的一种或多种；优选地，所述第一抗体包含anti-CD44、anti-CD45、anti-CD66c、anti-CD82、anti-CD114、anti-CD227和anti-E-cadherin中的两种或以上。
所述第二抗体包含anti-HLAG、anti-EpCAM和anti-Trop2中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述第一抗体包含anti-CD44、anti-CD45、anti-CD227、anti-CD66c中的一种或多种。在优选的实施方案中，所述第一抗体包含anti-CD44、anti-CD45和anti-CD227的组合；或包含anti-CD45和anti-CD66c的组合。
在一些实施方案中，所述第二抗体包含anti-HLAG、anti-EpCAM或其组合。在优选的实施方案中，所述第二抗体包含anti-HLAG。
本发明的另一方面，涉及一种用于分离胎儿滋养层细胞的试剂盒，其包括：（a）用于免疫磁珠法富集胎儿滋养层细胞的试剂；其中，所述富集胎儿滋养层细胞的试剂包含根据本发明所述的任一种抗体组合。优选地，其中所述的试剂（a）还包括免疫磁珠。
在一些实施方案中，所述试剂盒还包括（b）用于样本清洗的试剂。优选地，所述试剂（b）选自PBS、HBS或其组合；任选地，进一步包括EDTA、BSA或其组合。
本发明的另一方面，涉及一种分离胎儿滋养层细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提供包含胎儿滋养层细胞的母体组织样本；
（2）制备该样本的单细胞悬液；
（3）免疫磁珠法富集胎儿滋养层细胞；和
（4）细胞分选胎儿滋养层细胞；其中，
所述的步骤（3）中免疫磁珠法包括：
3.1）负筛选步骤；或
3.2）正筛选步骤；或
3.3）负筛选步骤和正筛选步骤；其中，
所述负筛选步骤包括：孵育负筛选抗体和磁珠，去除非滋养层细胞；所述正筛选步骤包括：孵育正筛选抗体和磁珠，富集胎儿滋养层细胞。
在一些实施方案中，所述负筛选抗体选自根据本发明上文所述的任一种第一抗体；所述正筛选抗体选自根据本发明上文所述的第二抗体。
在具体的实施方案中，上文所述的免疫磁珠法中，所述孵育包括以下步骤：加入抗体孵育，然后孵育磁珠；或直接加入抗体-磁珠复合物孵育。
根据本文所述的分离胎儿滋养层细胞的方法，其中所述母体组织样本选自宫颈样本。
根据本文所述的方法，所述细胞分选采用细胞分选仪或细胞分选柱，优选流式细胞分选仪或基于微流控方法的细胞分选仪。
本发明的另一方面，根据本发明上文所述的方法得到的产品。
本发明的另一方面，涉及根据本文所述的任一种抗体组合在用于分离胎儿滋养层细胞中的用途。
本发明提供了一种用于分离纯化母体组织样本中胎儿滋养层细胞的抗体组合，包括用于负筛选的抗体和用于正筛选的抗体。如图1所示，首先获取（5-20孕周）母体组织样本（优选例如宫颈样本），并制备单细胞悬液；后利用免疫磁珠法进行负筛选步骤，去除样本中的非滋养层细胞，如宫颈上皮细胞或炎性细胞等；和/或正筛选步骤，进一步富集其中的胎儿滋养层细胞；最后通过细胞分选仪达到分选获得胎儿滋养层细胞的目的。
虽然本文描述的组合和方法特别提及人类母体和人类胎儿，但并不限于人类，且可类似地分离和分析其他物种的胎儿细胞。
根据本发明各方面的方法或产品，包括从受试者获得含有胎儿绒毛外滋养层细胞母体宫颈样本，从中分离胎儿滋养层细胞、裂解分离的胎儿滋养层细胞。
现有技术中，免疫磁珠纯化法分离胎儿滋养层细胞，通常取母体宫颈样本用PE-HLAG抗体孵育，PE-beads特异性结合抗体，再使孵育了抗体和磁珠的样本经过细胞分选柱，在外加磁场的作用下，目标细胞会吸附到分选柱上，达到富集胎儿滋养层细胞的目的，但该方法耗时久，存在磁珠表面的二抗与样本里面的细胞非特异性结合，降低检测的准确性，富集效率较低；且样本固定的方法对于胎儿滋养层细胞的富集也有很大的影响。
本发明的发明人意外地发现，可通过“负筛选”方法，利用可与宫颈样本中大量阴性细胞（如宫颈上皮细胞或炎性细胞）的表面抗原特异性结合的“负筛选”抗体，和经初步处理的宫颈样本进行孵育，以分选获得所述的大量阴性细胞（即非滋养层细胞），并将该分选得到的细胞从样本中去除，可以显著提高剩余样本中“胎儿滋养层”细胞的占比：仅通过单独负筛选即可将其在样本中浓度富集至40倍以上；而结合正筛选，可将正筛选富集效率提高（正筛选可将浓度富集至8倍以上），两步筛选结合，可将浓度富集至370倍以上，远超过现有技术的免疫磁珠法（仅能富集至约5.8倍）。
由此，根据第一方面，本发明涉及一种抗体组合，可用于分离纯化胎儿滋养层细胞（如从母体宫颈样本中分离）；其特征在于，所述抗体组合包含：
A）第一抗体；或
B）第二抗体；或者
C）第一抗体和第二抗体。
其中，所述第一抗体可用于负筛选步骤；第二抗体可用于正筛选步骤。
如本文所用，术语“抗体”是指血清中的功能性组分，且通常被认为一种分子集合（抗体或免疫球蛋白，或一种分子（抗体分子或免疫球蛋白分子）。抗体分子能够与特定抗原决定簇（抗原或抗原性表位）结合或反应，引发免疫效应。各抗体分子通常具有特异性，且抗体分子的组合物可为单克隆抗体（即由相同抗体分子组成）或多克隆抗体（即由两种或两种以上，与相同抗原甚至不同的抗原上相同或不同的表位结合或反应的不同抗体分子组成）。各抗体分子均具有使其能够与相应的抗原特异性结合的特定结构；抗体亦被统称为免疫球蛋白。本文所用的“抗体”不仅涵盖完整的抗体分子，还包括抗体片段及其变体（如衍生结构）。如本文所用的“抗体”也包括：嵌合及单链抗体；抗体的结合片段，如Fab、Fv片段或scFv片段；以及多聚体的抗体，如二聚体（如二聚IgA）或五聚体（如五聚IgM）。抗体可为人类、鼠类、嵌合、人源化或重构抗体。
如本文所用，本发明中抗体，如anti-CD44、anti-CD45、anti-CD66c、anti-CD82、anti-CD114、anti-CD227、anti-E-cadherin、anti-HLAG、anti-EpCAM和anti-Trop2，为任意的可识别和结合上述相应的抗原（即CD44、CD45、CD66c、CD82、CD114、CD227、E-cadherin、HLAG、EpCAM和Trop2）的抗体分子或其活性片段；在本文中，上述抗体并不限定或意图限制为相应抗原的某个或某种特定抗体或其片段。
如本文所述，术语“包含”、“包括”或“含有”、“具有”或其类似表达，属于非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合、步骤、方法、制品或装置，无需仅限于相应要素，可包括未明确列出的其它要素或该组合、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。术语“由……组成”，排除任何未列出的要素、步骤或组分。用于权利要求中时将使权利要求为封闭式，即不包含除所述材料以外的其他材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而非紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。除非另有说明或定义，否则本发明中涉及“包含”、“包括”或“含有”、“具有”的方案、组合、方法、产品等，均包含由其所列出要素组成的方案、组合、方法、产品。
如本文所述，术语“组合”是指一个剂量单位形式的固定联合，例如其中本发明的抗体及其组合的“伴侣”（例如本发明的另一种抗体）可或在一定时间间隔内分别使用。其中单个组分（抗体）可以共同包装在试剂盒中或分别单独包装，或混合包装。在使用前，可以将一种或多种组分（抗体）配制或稀释至所需剂量。本文所述的“共同使用”或“组合使用”等术语包括将选择的抗体及其组合的抗体同时、分别或依次使用。
如本文所用，术语“抗体组合”是指由大于一种抗体的联合而产生的产品；其包括抗体的固定或非固定组合。
“固定组合”是指抗体（例如第一抗体中某组分）及其组合的抗体（例如第一抗体中另一组分），均以单独的实体或剂量同时或混合使用（例如用于负筛选步骤）。
“非固定组合”是指抗体（例如第一抗体（单一组分或多种组分））及其组合的抗体（例如第二抗体（单一组分或多种组分）），均作为单独的实体或剂量，依次地或顺序地使用（例如分别用于负筛选步骤和正筛选步骤）。
进一步地，上述的“使用”也适用于多种抗体的组合，例如使用三种或更多种抗体，包括在一个步骤中同时使用多种抗体（如同时使用两种或多种的负筛选抗体用于负筛选步骤），以及在不同步骤中顺序使用多种抗体（例如使用三种负筛选抗体用于负筛选步骤，且使用两种正筛选抗体用于正筛选步骤）。
如本文所用，除非另有说明，否则“一种”、“一个”以及“所述”不特指某个或某种，其包含“复数形式”。例如，“抗体”或“一种抗体”可以包含多个抗体，所述多种抗体包括其混合物。
术语“一种或多种”，指在其修饰的目标群体中，可为一个、一种或更多；具体在本文中，“一种或多种”是指，所述的抗体中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种。
在本发明的上下文中，“负筛选”是指，通过孵育样本中阴性细胞表面marker，并与其对应的磁珠结合，使样本经例如细胞分选柱，只收集未被分选柱结合的组分，而达到去除掉大量阴性细胞（即非滋养层细胞）的目的，提高样本中滋养层细胞的比例。
在本发明的上下文中，“正筛选”是指，通过孵育样本中阳性细胞表面marker，并与其对应的磁珠结合，使样本经例如细胞分选柱，收集被特异性分选柱结合的阳性细胞，即胎儿滋养层细胞，达到富集的目的。
在具体的实施方案中，所述负筛选步骤包括：孵育负筛选抗体和磁珠，去除非滋养层细胞；所述正筛选步骤包括：孵育正筛选抗体和磁珠，富集胎儿滋养层细胞。其中，所述负筛选抗体为本发明上文所述的第一抗体，所述正筛选抗体为本发明上文所述的第二抗体。
在一些实施方案中，所述第一抗体选自anti-CD44、anti-CD45、anti-CD66c、anti-CD82、anti-CD114、anti-CD227和anti-E-cadherin中的一种或多种；优选地，所述第一抗体选自anti-CD44、anti-CD45、anti-CD66c、anti-CD82、anti-CD114、anti-CD227和anti-E-cadherin中的两种、三种或以上。
所述第二抗体选自anti-HLAG、anti-EpCAM和anti-Trop2中的一种或多种。
在优选的实施方案中，所述用于负筛选的第一抗体选自anti-CD44、anti-CD45、anti-CD227、anti-CD66c中的一种、二种、三种或多种；进一步地，所述第一抗体选自anti-CD44、anti-CD45和anti-CD227的组合；或所述第一抗体选自anti-CD45和anti-CD66c的组合。
在优选的实施方案中，其中所述用于正筛选的第二抗体包含anti-HLAG、anti-EpCAM或其组合；进一步地，所述第二抗体包含anti-HLAG。
根据本发明的另一方面，本发明还涉及一种分离胎儿滋养层细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
（1）获得包含胎儿滋养层细胞的母体组织样本；
（2）制备组织样本的单细胞悬液；
（3）免疫磁珠法富集胎儿滋养层细胞；
（4）细胞分选胎儿滋养层细胞。
在一些实施方案中，所述方法中，母体组织样本来自5-20孕周的母体；优选地，来自5-12孕周的母体。
在一些实施方案中，所述母体组织样本选自宫颈样本。
在一些实施方案中，所述步骤（2）中，制备样本的单细胞悬液是，首先将获得的样本重悬于新柏氏TCT样本细胞保存液中；将样本用100μm的细胞筛过滤，离心，弃上清并用样本清洗试剂清洗数次，再重悬于该清洗试剂中。所述离心过程优选400g下离心5~10min；所述样本清洗试剂优选PBS或HBS，更优选PBS；任选地，所述试剂还可加入EDTA和/或BSA。
在一些实施方案中，所述的免疫磁珠法包括：
a）负筛选步骤；或
b）正筛选步骤；或
c）负筛选步骤和正筛选步骤；其中，在优选的实施方案中，免疫磁珠法包括负筛选步骤和正筛选步骤。
如本文所述，所述的富集胎儿滋养层细胞的步骤中，“负筛选”步骤或“正筛选”步骤可以单独进行，即只进行“负筛选”步骤，或只进行“正筛选”步骤；或者依次进行，所述依次进行是指先进行“负筛选”再进行“正筛选”，或者先进行“正筛选”再进行“负筛选”。
在具体的实施方案中，上文的免疫磁珠法中，所述负筛选步骤包括：孵育负筛选抗体和磁珠，去除非滋养层细胞；所述正筛选步骤包括：孵育正筛选抗体和磁珠，富集滋养层细胞。
在优选的实施方案中，其中所述的免疫磁珠法中，孵育步骤包括加入抗体孵育，然后再孵育磁珠；或直接加入抗体-磁珠复合物孵育。
在优选的实施方案中，本发明的孵育过程为避光孵育；抗体孵育的温度范围是4℃~25℃；孵育的时间范围为30min~120min。
在本文中，术语“免疫磁珠（Immunomagnetic bead，IMB）”，又称生物磁珠或磁珠。“免疫磁珠分选法(Immunomagnetic separation，IMS)”是指用于细胞分选的方法，例如通过偶联反应将抗体结合到磁性微球或磁球的表面上，形成免疫磁性微球（例如即本文所述的抗体-磁珠偶联复合物）；在磁珠表面包被的抗体进行抗原-抗体反应，在细胞表面形成“抗原-抗体-磁珠”免疫复合物。结合了磁珠的细胞置于强大的磁场下时，会定向移动，使免疫复合物与其他未被结合的细胞分群。当磁珠脱离磁场后，磁性立即消失，从而达到阳性或阴性选择特定细胞的目的。利用免疫磁珠分选法从生物样本的复杂环境中分选出目标细胞，需要其具有特异性的生物标志物，而且稳定性、分散性好，不能团聚。同时免疫磁珠的粒径不能过大，否则会压迫目标细胞。在本文中，免疫磁珠例如以纳米磁性材料为固相载体，在其表面加上高分子包裹层以引入活性功能基团（如羧基、氨基、巯基、醛基、羟基等）。免疫磁珠粒径小，为纳米级别，比表面积大，可捕获较多的待测物，在本发明中，更利于后续细胞的分选。
本文上文所述的“抗体-磁珠的偶联复合物”可通过向免疫磁珠中加偶联剂和能够特异性捕获相应细胞的抗体进行孵育获得；洗涤孵育完成的偶联抗体的免疫磁珠，将偶联抗体的免疫磁珠（即抗体-磁珠复合物）保存在保存液中备用。具体地，在本发明中，“能够特异性捕获相应细胞的抗体”包括在负筛选步骤中，可特异性捕获“非滋养层细胞”的负筛选抗体，以及在正筛选步骤中，可特异性捕获“胎儿滋养层细胞”的正筛选抗体。
在本文中，也可首先在样本中加入抗体孵育，然后再加入免疫磁珠以及相应的偶联剂孵育，实现抗体与磁珠的偶联。所述免疫磁珠可根据实际情况进行具体尺寸和型号的选择。优选地，本文所述免疫磁珠可选自氨基磁珠、羧基磁珠、环氧基磁珠、硅基磁珠、甲苯磺酰基磁珠、由多聚糖和氧化铁组成的超顺磁性微珠；其中优选由多聚糖和氧化铁组成的超顺磁性微珠，例如德国美天旎Miltenyi细胞分选磁珠（例如，Anti-APC MicroBeads或Anti-PE Microbeads）。所述磁珠的粒径范围优选：50nm~2000nm，更优选50~800nm，进一步优选50~200nm，最优选50nm。所述偶联剂为与免疫磁珠类型相对应的偶联剂，偶联方法与所购免疫磁珠类型相一致。
在优选的实施方案中，所述负筛选抗体选自本发明所述的第一抗体。具体地，所述第一抗体选自anti-CD44、anti-CD45、anti-CD66c、anti-CD82、anti-CD114、anti-CD227和anti-E-cadherin中的一种或多种；优选地，所述第一抗体选自anti-CD44、anti-CD45、anti-CD66c、anti-CD82、anti-CD114、anti-CD227和anti-E-cadherin中的两种、三种或以上；更优选地，选自anti-CD44、anti-CD45、anti-CD227、anti-CD66c中的一种、两种、三种或多种；进一步优选地，所述第一抗体选自anti-CD44、anti-CD45和anti-CD227的组合；或选自anti-CD45和anti-CD66c的组合。
如本文所用，上文所述的用于负筛选的抗体仅为列举，其通过与母体宫颈样本中，阴性细胞（即非滋养层细胞）的表面抗原特异性结合，实现分选分离。因此，应当理解，对于母体样本中含有的任意其他阴性细胞的表面抗原，或除上文所述（即CD44、CD45、CD66c、CD82、CD114、CD227或E-cadherin）以外的、阴性细胞其他表面抗原，同样可作为细胞标记物（marker），能够特异性结合上述marker的抗体同样可用作负筛选的第一抗体。
在优选的实施方案中，所述正筛选抗体选自本发明所述的第二抗体；具体地，所述第二抗体选自anti-HLAG、anti-EpCAM和anti-Trop2中的一种或多种。优选地，选自anti-HLAG、anti-EpCAM或其组合。进一步优选地，选自anti-HLAG。
如本文所用，术语“细胞分选”是指用于根据细胞的类型和/或特征分离细胞的方法。通常地，根据细胞大小、形态和/或表面蛋白或标记物表达的差异，以筛选和分离细胞。细胞分选可依赖于本领域技术人员已知的不同策略，例如单细胞分选、荧光细胞分选、磁性细胞分选或浮力活化细胞分选。具体地，在本文所述的细胞分选方法中，从未结合的细胞中分选与抗体结合的细胞。
在具体的实施方案中，所述细胞分选步骤采用细胞分选柱进行；进一步地，所述细胞分选柱分选过程中，将分选柱置于磁力架中，用缓冲液润洗细胞分选柱，样本加到润洗好的细胞分选柱内，受重力作用样本流过分选柱，结合磁珠的目标细胞受磁场力作用吸附到分选柱，收集流出的未结合的样本或结合到分选柱的样本。
或者，本发明所述的细胞分选步骤，可使用细胞分选仪进行，其中优选地，细胞分选仪选自流式细胞分选仪和基于微流控方法的细胞分选仪。更优选地，使用流式细胞分选仪。
根据本发明的另一方面，本发明还涉及一种用于分离胎儿滋养层细胞的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：
（a）用于免疫磁珠法富集胎儿滋养层细胞的试剂。
其中，所述试剂（a）用于免疫磁珠法富集胎儿滋养层细胞的试剂包含：用于负筛选的抗体；或用于正筛选的抗体；或用于负筛选的抗体和用于正筛选的抗体的组合。
在具体的实施方案中，所述负筛选抗体选自本发明所述的第一抗体。具体地，所述第一抗体选自anti-CD44、anti-CD45、anti-CD66c、anti-CD82、anti-CD114、anti-CD227和anti-E-cadherin中的一种或多种；优选地，所述第一抗体选自anti-CD44、anti-CD45、anti-CD66c、anti-CD82、anti-CD114、anti-CD227和anti-E-cadherin中的两种、三种或以上；更优选地，选自anti-CD44、anti-CD45、anti-CD227、anti-CD66c中的一种、两种、三种或多种；进一步优选地，所述第一抗体选自anti-CD44、anti-CD45和anti-CD227的组合；或选自anti-CD45和anti-CD66c的组合。
在优选的实施方案中，所述正筛选抗体选自本发明所述的第二抗体。具体地，所述第二抗体选自anti-HLAG、anti-EpCAM和anti-Trop2中的一种或多种；优选地，选自anti-HLAG、anti-EpCAM或其组合；进一步优选地，选自anti-HLAG。
在一些实施方案中，所述的试剂（a）还包括免疫磁珠。在一些优选的实施方案中，所述试剂（a）中的抗体和免疫磁珠分别保存，未偶联在一起；在另一些优选的实验方案中，抗体和磁珠偶联在一起，形成抗体-磁珠复合物。
进一步地，本文所述的试剂盒还包括（b）用于样本清洗的试剂。在一些实施方案中，其中所述试剂（b）用于样本清洗的试剂选自PBS、HBS或其组合，优选地，选自PBS。任选地，所述试剂（b）进一步还包括EDTA、BSA或其组合。
根据本发明的另一方面，还涉及本发明上文所述的方法得到的产品。
根据本发明的另一方面，本发明还涉及上文所述的抗体组合在用于分离胎儿滋养层细胞中的用途。
在一些实施方案中，所述分离是，从含有胎儿滋养层细胞的母体组织样本中分离；进一步地，从母体宫颈样本中分离；更优选地，从母体宫颈样本中分离。
在一些实施方案中，所述分离是，从5-20孕周母体的宫颈样本中分离；优选地，从5-12孕周的母体宫颈样本中分离。
本发明所述方法和试剂盒的优异技术效果主要在于以下几个方面：
（1）纯化过程严谨。通过负筛选法去除宫颈样本中大量阴性细胞，包括宫颈上皮细胞和炎症细胞；后续可以利用正筛选法进一步富集目标滋养层细胞比例，利于细胞分选仪纯化得到滋养层细胞；
（2）可应用于真实宫颈刮片样本。在真实宫颈刮片样本中，利用本发明方法得到的滋养层细胞纯度可达48%；
（3）操作过程简单，且可实现多样本自动化操作；
（4）用途广泛。细胞分选仪可实现多细胞分选，也可实现单细胞分选，操作人员可以根据后续需求灵活选择。
附图说明
图1是根据本发明方法从宫颈样本中纯化滋养层细胞的流程图。
图2是根据实施例1中的方法利用负筛选抗体对滋养层细胞系JEG3和宫颈样本进行染色并流式分析的结果。
图3是根据实施例1中的方法利用正筛选抗体对滋养层细胞系JEG3和宫颈样本进行染色并流式分析的结果。
图4是根据实施例2中的方法验证磁珠正筛选（4A）及负筛选结合正筛选（4B和4C）富集宫颈样本中掺入的滋养层细胞JEG3效率。
图5是根据本发明方法从真实宫颈样本中纯化单个滋养层细胞并进行高通量测序验证的结果图。
具体实施方式
结合以下本发明的优选实施例可更容易地理解本发明内容。除非另有规定，本文中使用的所有技术和术语与本发明所属技术领域的技术人员通常理解的含义相同。除非特别说明，本文应用和涵盖的技术是本发明所属技术领域的技术人员熟知的标准方法。所述材料、方法和实施例仅用作说明目的，而不以任何方式限制本发明的保护范围。
实施例1：利用本发明的抗体染色人宫颈上皮细胞系HcerEpic、人绒毛膜滋养层细胞系JEG3和宫颈刮片样本
步骤1：制备单细胞悬液
用0.25%的胰蛋白酶消化培养的HcerEpic和JEG3细胞系，按照5x105 细胞/ml制备单细胞悬液，并置于PBS溶液中，每个染色反应取100μl细胞。
用细胞刷取5-20孕周的母体宫颈刮片样本，重悬于20ml的新柏氏TCT样本细胞保存液中。将样本用100μm的细胞筛过滤，400g离心5min，弃上清并用PBS清洗两次，再重悬于5ml的PBS中，每个染色反应取100μl细胞。
步骤2：流式抗体染色分析
在100μl细胞中加入5μl抗体，置于冰箱避光孵育30min。400g 离心5min，弃上清并用PBS清洗两次。用300μl PBS重悬细胞并用流式细胞仪检测抗体效率。
步骤3：流式抗体染色结果分析
流式染色负筛选抗体和正筛选抗体的结果分别如图2和图3所示。与空白对照相比，不同抗体在不同细胞中的染色效率总结如表1所示。可用于负筛选抗体标准是在宫颈刮片样本染色为阳性，在JEG3细胞中染色为阴性，或在宫颈刮片样本中染色效率远高于JEG3细胞。可用于正筛选抗体的标准是在JEG3细胞中的染色阳性超过80%，在宫颈刮片样本中染色基本为阴性。
表1：本发明方法的负筛选和正筛选抗体清单及其在滋养层细胞JEG3和宫颈样本中的染色效率统计。
Figure 668676DEST_PATH_IMAGE001
实施例2：利用本发明的免疫磁珠法富集宫颈样本中掺入的JEG3滋养层细胞
步骤1：制备宫颈样本和JEG3细胞悬液
按照实施例1的方法分别制备宫颈样本和JEG3单细胞悬液并在显微镜下计数。取JEG3单细胞悬液，按照1:1000的比例掺入到宫颈样本单细胞悬液中并混合均匀。
步骤2：免疫磁珠法正筛选富集JEG3细胞
（1）取1ml混合后的细胞，加入20µl anti-HLAG抗体，在4℃条件下避光孵育1h。
（2）样本用1ml的PBS溶液清洗两次，4℃条件下400g离心5min，用250μl PBS溶液重悬样本。
（3）向样本中加入20µl 磁珠（美天旎细胞分选磁珠 Anti-PE MicroBeads），4℃条件下避光孵育30min。
（4）将样本加入到PBS润洗后美天旎MS细胞分选柱，收取分选柱上结合的细胞。
（5）流式细胞仪分析富集的JEG3细胞纯度。
步骤3：免疫磁珠法负筛选结合正筛选富集JEG3细胞
（1）取1ml混合后的细胞，加入负筛选抗体组合一anti-CD44 + anti-CD45 +anti-CD227，或负筛选抗体组合二anti-CD45 + anti-CD66c，4℃条件下分别避光孵育1h。
（2）样本用1ml的PBS溶液清洗两次，4℃条件下400g离心5min，用1ml PBS溶液重悬样本。
（3）向样本中加入100µl 磁珠（美天旎细胞分选磁珠 Anti-APC MicroBeads），4℃条件下避光孵育30min。
（4）将样本加入到PBS润洗后美天旎LD细胞分选柱，收取过分选柱后的流穿液。
（5）4℃条件下400g离心5min，用250µl PBS溶液重悬样本。加入5μl anti-HLAG抗体，4℃条件下避光孵育1h。
（6）样本用1ml的PBS溶液清洗两次，4℃条件下400g离心5min，用250μl PBS溶液重悬样本。
（7）向样本中加入20µl 磁珠（美天旎细胞分选磁珠 Anti-PE MicroBeads），4℃条件下避光孵育30min。
（8）将样本加入到PBS润洗后美天旎MS细胞分选柱，收取分选柱上结合的细胞。
（9）流式细胞仪分析富集的JEG3细胞纯度。
步骤4：流式细胞仪分析JEG3滋养层细胞的富集效果
利用流式细胞仪分析免疫磁珠法富集JEG3滋养层细胞的效率，结果如图4所示。JEG3的起始比例为0.11%，经过anti-HLAG正筛选后，浓度提高到0.64%，富集了5.8倍（图4中A）。经过anti-CD44 + anti-CD45 + anti-CD227负筛选后，浓度为4.4%，富集了40倍，结合anti-HLAG正筛选，浓度提高到41.3%，总共富集375.5倍（图4中B）。经过anti-CD45 + anti-CD66c负筛选后，浓度为6.3%，富集了57.3倍，结合anti-HLAG正筛选，浓度提高到51.6%，总共富集469.1倍（图4中C）。这些结果表明，利用抗体组合anti-CD44 + anti-CD45 + anti-CD227或anti-CD45 + anti-CD66c进行负筛选可以得到良好的富集滋养层细胞效果；而结合anti-HLAG进行进一步正筛选可以显著提高富集效率。
实施例3：利用本发明的方法纯化宫颈样本中的滋养层细胞
步骤1：获得包含滋养层细胞的宫颈样本
用细胞刷取5-20孕周的母体宫颈刮片样本，重悬于20ml的新柏氏TCT样本细胞保存液中。
步骤2：制备宫颈样本单细胞悬液
将样本用100µm的细胞筛过滤，400g离心5min，弃上清并用PBS清洗两次，再重悬于1ml的PBS中。
步骤3：免疫磁珠法富集胎儿滋养层细胞
（1）在1ml PBS重悬的宫颈细胞中加入负筛选抗体组合anti-CD44 + anti-CD45 +anti-CD227，4℃条件下避光孵育1h。
（2）样本用1ml的PBS溶液清洗两次，4℃条件下400g离心5min，用1ml PBS溶液重悬样本。
（3）向样本中加入100µl 磁珠（美天旎细胞分选磁珠 Anti-APC MicroBeads），4℃条件下避光孵育30min。
（4）将样本加入到PBS润洗后美天旎LD细胞分选柱，收取过分选柱后的流穿液。
（5）4℃条件下400g离心5min，用250μl PBS溶液重悬样本。加入5µl anti-HLAG抗体，4℃条件下避光孵育1h。
（6）样本用1ml的PBS溶液清洗两次，4℃条件下400g离心5min，用250μl PBS溶液重悬样本。
（7）向样本中加入20µl 磁珠（美天旎细胞分选磁珠 Anti-PE MicroBeads），4℃条件下避光孵育30min。
（8）将样本加入到PBS润洗后美天旎MS细胞分选柱，收取分选柱上结合的细胞。
步骤4：细胞分选仪分选胎儿滋养层细胞
利用流式细胞仪圈门磁珠法富集后的HLAG阳性细胞，并将单个细胞收集到PCR管中，用于后续Y染色体鉴定。
实施例4：滋养层细胞的检测和纯度鉴定
从北京协和医院收集3例经NIPT验证怀有男胎的12孕周的母体宫颈刮片样本。参照实施例3的磁珠富集结合流式细胞仪分选的步骤，得到单个滋养层细胞。利用科孕安PGT-A胚胎植入前染色体非整倍体检测试剂盒（北京贝瑞和康生物技术有限公司）构建单细胞高通量测序文库，并利用Illumina Nextseq测序平台测序，最后通过综合分析X染色体的reads比例与Y染色体的reads比例来确定纯化的单细胞是否还有Y染色体。如果含有Y染色体，表明该细胞为胎儿滋养层细胞，而不是来自于母体背景细胞。代表性的测序结果如图5曼哈顿图所示，男性对照细胞同时含有1个拷贝的X染色体和1个拷贝的Y染色体，女性对照细胞含有2个拷贝的X染色体。
滋养层细胞纯度鉴定如表2所示，样本#1纯化得到81个单细胞，其中39个为滋养层细胞，纯度为48.2%；样本#2纯化得到124个单细胞，其中60个为滋养层细胞，纯度为48.4%；样本#3纯化得到60个单细胞，其中30个为滋养层细胞，纯度为50%；三个样本得到的滋养层细胞平均纯度为48.9%。这些结果表明利用该发明所述的方法，可以从宫颈刮片样本中富集得到滋养层细胞。
表2：利用本发明方法纯化三例宫颈刮片样本，得到的细胞数及滋养层细胞纯度统计。
Figure 627667DEST_PATH_IMAGE002
需要说明的是，虽然已通过以上实施例阐明了本发明的一些特征，但不能用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。免疫磁珠法富集胎儿滋养层细胞中所涉及的抗体组合、反应试剂、反应条件等等可以根据具体的需要进行相应的调整和改变。因此对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的构思和原则之内，还可做出若干简单替换，这些均应包含在本发明的保护范围之内。
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Claims (13)

1.抗体组合在用于分离胎儿滋养层细胞中的用途；其中，所述抗体组合包括：
A）第一抗体；或
B）第一抗体和第二抗体；其中，
所述第一抗体为负筛选抗体，其包含anti-CD44、anti-CD45和anti-CD227的组合，或包含anti-CD45和anti-CD66c的组合；
所述第二抗体为正筛选抗体，其包含anti-HLAG、anti-EpCAM和anti-Trop2中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述第二抗体为anti-HLAG、anti-EpCAM或其组合。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述第二抗体为anti-HLAG。
4.试剂盒在用于分离胎儿滋养层细胞中的用途，其特征在于，所述试剂盒包括：
（a）用于免疫磁珠法富集胎儿滋养层细胞的试剂；其中，
所述富集胎儿滋养层细胞的试剂包含抗体组合；所述抗体组合包括：
A）第一抗体；或
B）第一抗体和第二抗体；其中，
所述第一抗体为负筛选抗体，其包含anti-CD44、anti-CD45和anti-CD227的组合，或包含anti-CD45和anti-CD66c的组合；
所述第二抗体为正筛选抗体，其包含anti-HLAG、anti-EpCAM和anti-Trop2中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述第二抗体为anti-HLAG、anti-EpCAM或其组合。
6.根据权利要求4所述的用途，其中所述的试剂（a）还包括免疫磁珠。
7.根据权利要求4-6任一项所述的用途，其中所述试剂盒还包括（b）用于样本清洗的试剂。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述试剂（b）选自PBS、HBS或其组合。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述试剂（b）进一步包括EDTA、BSA或其组合。
10.分离胎儿滋养层细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提供包含胎儿滋养层细胞的母体组织样本；
（2）制备该样本的单细胞悬液；
（3）免疫磁珠法富集胎儿滋养层细胞；和
（4）细胞分选胎儿滋养层细胞；其中，
所述的步骤（3）免疫磁珠法包括：
3.1）负筛选步骤；或
3.2）负筛选步骤和正筛选步骤；
其中所述负筛选步骤包括：孵育负筛选抗体和磁珠，去除非滋养层细胞；所述正筛选步骤包括：孵育正筛选抗体和磁珠，富集胎儿滋养层细胞；
其中所述负筛选抗体为权利要求1-3任一项中所述的第一抗体；所述正筛选抗体为权利要求1-3任一项中所述的第二抗体；
其中步骤（1）所述母体组织样本选自宫颈样本。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，免疫磁珠法中，所述孵育包括以下步骤：
加入抗体孵育，然后孵育磁珠；或，
直接加入抗体-磁珠复合物孵育。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述步骤（4）细胞分选采用细胞分选仪或细胞分选柱。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述步骤（4）细胞分选采用流式细胞分选仪或基于微流控方法的细胞分选仪。
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