JP2006115791A - 神経幹細胞及び神経前駆細胞のスクリーニング及び分離方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 生体に存在しない別の遺伝子導入等を行なうことなく、生細胞状態で神経幹細胞又は神経幹細胞富化集団を同定、分離する方法、当該方法により得られる神経幹細胞富化集団、当該方法で使用する神経幹細胞スクリーニング用試薬を提供する。
【解決手段】 神経幹細胞において、ＭＤＲ１の発現がＮｅｓｔｉｎの発現と相関性があることを利用し、細胞集団に抗ＭＤＲ１抗体と反応させ、抗ＭＤＲ１抗体との反応に陽性なＭＤＲ１発現細胞をスクリーニング、分取することにより、Ｎｅｓｔｉｎ高発現細胞、ひいては神経幹細胞及び神経前駆細胞を検出、分取する。
【選択図】 図４

Description

本発明は、生体外での培養により得られるヒトニューロスフェアや、生体から採取した神経幹細胞及び神経前駆細胞を含む不均一な細胞集団から、神経幹細胞及び神経前駆細胞をスクリーニングし、選択的に分取する方法、神経幹細胞及び神経前駆細胞の含有率を評価する方法、当該方法により得られる神経幹細胞及び神経前駆細胞富化集団、当該方法を実施するのに用いられる神経幹細胞及び神経前駆細胞スクリーニング用試薬に関する。

神経幹細胞は、自己複製能と多分化能を特徴とする未分化な細胞で、胎児脳のみならず、成体脳成体脳にも存在することが判明しており、従来は再生が不可能と考えられてきた中枢神経内で、新生ニューロンおよび新生グリア細胞を作成させるための有用な移植用細胞として、再生医療領域での臨床応用が期待されている。

臨床応用するためには、細胞ソースからの分離、選択的培養方法の確立が重要である。
神経幹細胞の選択的培養方法としては、ニューロスフェア法が、現在、最も汎用されている方法の一つである。ニューロスフェア法は、神経幹細胞を含む細胞群をインスリン、トランスフェリン、セレン、プロゲステロン、上皮成長因子（ＥＧＦ）と塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ２）を含む無血清培地を用いて、その中で細胞を浮遊培養することで、球状の細胞塊（ニューロスフェア）として神経幹細胞を増殖させる方法である（非特許文献１、特許文献１）。

しかし、ニューロスフェア法で増幅された細胞集団も、不均一な細胞集団であり、すべてが神経幹細胞であるわけでない。

非特許文献２では、ＬｅｎｄａｈｌとＭｃＫａｙらにより同定されたＮｅｓｔｉｎという中間径フィラメントタンパク質であるＮｅｓｔｉｎマーカーが、神経幹細胞及び神経前駆細胞の同定に有用であることが開示されている。しかし、Ｎｅｓｔｉｎは細胞内に存在するため、生細胞のままで神経幹細胞を同定、単離することができない。

神経幹細胞を生細胞のまま培養増殖させたい場合には、培養後、しばらくして、ニューロスフェアが形成されることで、初めて、もとの細胞集団内に神経幹細胞が存在していることが判明するというのが現状である。

Ｎｅｓｔｉｎの他、神経幹細胞に対する選択性の高い表現マーカーとしては、ＮａｋａｍｕｒａとＯｋａｎｏらにより同定された分子量約３８ｋＤａのＲＮＡ結合蛋白質であるＭｕｓａｓｈｉ１が知られている。

Ｍｕｓａｓｈｉ１も、Ｎｅｓｔｉｎと同様に、細胞内に存在する蛋白質であるため、生細胞の場合、細胞が生きた状態で外部からこれらの蛋白質の発現状況を把握し、それを可視化することは通常の方法では不可能である。

生細胞でＮｅｓｔｉｎやＭｕｓａｓｈｉ１の発現程度を可視化し、その発現量に基づいて、神経幹細胞を効率的に分離する方法として、ｍｕｓａｓｈｉ１プロモータ、あるいはｎｅｓｔｉｎエンハンサーの下流に、ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）を組み込んだレポータ遺伝子を、予め各種方法で人為的に神経幹細胞に遺伝子導入し、ＧＦＰ発現細胞を発現強度（蛍光強度）にしたがって、ＦＡＣＳを用いて分離することが報告されている（非特許文献３、特許文献２、特許文献３）。

しかし、この方法は、人体には存在しないＧＦＰ発現遺伝子の導入を伴っているため、効率的に分離、増殖させたとしても、増殖により得られた神経幹細胞を、実際に人体へ移植するといった臨床的応用には危険を伴う。

このようなことから、遺伝子導入を伴わない方法で生細胞の評価が可能な細胞表面マーカーを用いた神経幹細胞の分離技術が望まれている。

近年、選択的細胞表面マーカーを用いたＦＡＣＳによる分離法を行なったものとして、非特許文献４に、ＣＤ１３３抗体を用いたヒト由来神経幹細胞の分離法が報告されている。そして、ＣＤ１３３^＋／ＣＤ３４⁻／ＣＤ４５⁻細胞が高率にニューロスフェアを形成することが報告されている。また特許文献４に、中枢神経の幹細胞（ＣＮＳ−ＳＣ）について高度に富化された集団を産生する方法として、モノクローナル抗体ＡＣ１３３、またはモノクローナル抗体５Ｅ１２によって、細胞表面マーカーを認識させることを利用する方法が開示されている。ＣＤ１３３抗体（ＡＣ１３３抗体）は、プロミニンホモログを認識する抗体であると予想されている。

さらに、特許文献５に、神経幹細胞の細胞表面マーカーとして、抗ＨＦＢ１１５モノクローナル抗体をはじめ、４種類の人工抗体（１６番抗体（ＦＥＲＭ Ｐ−１８７７８）、２７番抗体（ＦＥＲＭ Ｐ−１８７７９）、１１５番抗体（ＦＥＲＭ Ｐ−１８７８０）、２１１番抗体（ＦＥＲＭ Ｐ−１８７８１））を用いて、分離する方法が提案されている。

またさらに、特許文献６に、哺乳動物末梢神経系から神経幹細胞の同定、単離方法として、ポジティブマーカーとして抗ｐ７５抗体を使用し、ネガティブマーカーとして抗Ｐ_０を用いることが提案されている。

さらにまた、特許文献７及び非特許文献５に、ＧＤ２ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ、ＭＨＣ クラスＩ、β２マイクログロブリン、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１５、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ８１、ＣＤ９５、ＣＤ１５２の発現を神経幹細胞の陽性マーカーとし、ＭＨＣ クラスＩＩ、ＨＬＡ−ＤＲ、Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ−Ａ、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ４１、ＣＤ４５、ＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１５４を神経幹細胞の陰性マーカーとして神経幹細胞を分離する技術が提案されている。

また、ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子：ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）のレセプター（ＶＥＧＦＲ）をマーカーとして用いて神経系の幹細胞を精製する技術が提案されている（特許文献８）。

特表平８−５０２６６２ 特開２００１−２９２７６８ 特開２００２−３４５８０ 特開２００４−２３５０ 特表２００２−５３６０２３ 特表２００２−５３７８０２ ＰＣＴ／ＵＳ０２／１２６８９、ＷＯ０２／０８６０８２） 特表２００２−５００８７９ Ｂ．Ａ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｗ．Ｔｅｔｚｌａｆｆ，ａｎｄ Ｓ．Ａ．Ｗｅｉｓｓ．「Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ＥＧＦ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｓｔｒｉａｔａｌ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ」、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１２，４５６５−４５７４（１９９２年） Ｌｅｈｎｄａｈｌら、Ｃｅｌｌ ６０：５８５−５９５（１９９０年） Ｈ．Ｍ．Ｋｅｙｏｕｎｇら、「Ｈｉｇｈ−ｙｉｅｌｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｐｒｏｍｏｔｏｒ−ｄｅｆｉｎｅｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｆｅｔａｌ ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ」、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９，８４３−８５０（２００１年） Ｕｃｈｉｄａ Ｎら、「Ｄｉｒｅｃｔ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０００；９７；１４７２０−２５） Ｋｌａｓｓｅｎ Ｈ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＭＲ，Ｂａｉｌｅｙ ＡＨ，Ｙｏｕｎｇ ＭＪら、「Ｓｕｒｆａｃｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｎｅｕｒａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎｃｌｕｄｅ ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎｓ ａｎｄ ｎｏｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｐｉｔｏｐｅｓ」Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００１ Ｏｃｔ．２６；３１２（３）：１８０−２（２００１年）

本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、生体に存在しない別の遺伝子導入等を行なうことなく、生細胞状態で神経幹細胞又は神経幹細胞富化集団を同定、分離する方法、当該方法により得られる神経幹細胞富化集団、当該方法で使用する神経幹細胞スクリーニング用試薬を提供することにある。

本発明者らは、種々のモノクローナル抗体をスクリーニングした結果、神経幹細胞において、ＭＤＲ１の発現がＮｅｓｔｉｎの発現と相関性があることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明の神経幹細胞及び神経前駆細胞を取り出す方法は、神経幹細胞及び神経前駆細胞を含む細胞集団から神経幹細胞及び神経前駆細胞を取り出す方法であって、前記細胞集団に抗ＭＤＲ１抗体と反応させ、抗ＭＤＲ１抗体との反応が陽性であるＭＤＲ１発現細胞を分取する工程を含む。また、本発明の神経幹細胞及び神経前駆細胞の含有率の高い集団を選択的に取り出す方法は、神経幹細胞及び神経前駆細胞を含む細胞集団から神経幹細胞及び神経前駆細胞の含有率の高い集団を選択的に取り出す方法であって、前記細胞集団に抗ＭＤＲ１抗体と反応させ、抗ＭＤＲ１抗体との反応が陽性であるＭＤＲ１発現細胞を分取する工程を含む。これらの方法は、前記ＭＤＲ１発現細胞を分取することにより、Ｎｅｓｔｉｎ高発現細胞を分取することによって達成される。

本発明のＮｅｓｔｉｎ高発現細胞をスクリーニングする方法は、神経幹細胞及び神経前駆細胞を含む細胞集団からＮｅｓｔｉｎ高発現細胞をスクリーニングする方法であって、前記細胞集団を抗ＭＤＲ１抗体と反応させ、抗ＭＤＲ１抗体との反応が陽性であるＭＤＲ１発現細胞を検出する工程を含む。

本発明の神経幹細胞及び神経前駆細胞の含有率評価方法は、神経幹細胞及び神経前駆細胞を含む細胞集団の神経幹細胞及び神経前駆細胞の含有率を評価する評価方法であって、前記細胞集団を抗ＭＤＲ１抗体と反応させ、抗ＭＤＲ１抗体との反応が陽性であるＭＤＲ１発現細胞の含有率に基づいて評価する方法である。

上記方法において、前記細胞集団は、ヒトニューロスフェアであることが好ましく、また生体から採取した細胞群であることが好ましい。

上記方法において、抗ＭＤＲ１抗体との反応が陽性であるＭＤＲ１発現細胞の分取は、抗ＭＤＲ１抗体を蛍光標識し、フローサイトメトリーにより行なってもよいし；前記細胞集団を抗体カラムに通過させることにより行なってもよいし；抗ＭＤＲ１抗体を磁気標識し、着脱磁可能なカラムに通過させることにより行なってもよい。

上記方法における前記抗ＭＤＲ１抗体は、ＭＤＲ１分子の細胞表面部分に存在する抗原と特異的に結合する抗体、免疫グロブリン、及び抗体断片から選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、より好ましくはモノクローナル抗体ＭＲＫ１６である。

本発明の神経幹細胞及び神経前駆細胞富化集団は、神経幹細胞及び神経前駆細胞含有細胞集団から、前記抗ＭＤＲ１抗体との反応が陽性であるＭＤＲ１発現細胞の集団を分離採取して得られる。

本発明の神経幹細胞及び神経前駆細胞スクリーニング用試薬は、神経幹細胞及び神経前駆細胞含有細胞集団から神経幹細胞及び神経前駆細胞富化集団をスクリーニングするための試薬であって、抗ＭＤＲ１抗体及び溶媒を含有することを特徴とする。

本発明は、神経幹細胞及び神経前駆細胞に特徴あるとされるＮｅｓｔｉｎ発現と相関性がある細胞表面マーカーを用いて、ニューロスフェア等の不均一な細胞集団から神経幹細胞及び神経前駆細胞をスクリーニング、分離、分取しているので、生細胞のまま神経幹細胞及び神経前駆細胞を選択的に検出、分取することができる。
また、本発明の評価方法では、抗ＭＤＲ１抗体との反応性の有無でＮｅｓｔｉｎ発現含有率を評価することができるので、採取した生細胞集団試料やニューロスフェアを生細胞状態のままで、神経幹細胞及び神経前駆細胞含有率を評価することができる。

本発明は、不均一な細胞集団から神経幹細胞又は神経幹細胞富化集団を選択的にスクリーニングし、必要に応じて分離採取する方法であって、スクリーニングに際して、Ｎｅｓｔｉｎ高発現細胞を分取、富化する目的のために、抗ＭＤＲ１抗体を使用することを特徴とする方法である。

本発明の方法でスクリーニングの対象とする細胞集団は、神経幹細胞を含有すると考えられる細胞集団で、培養しているニューロスフェア、生体から採取した細胞含有試料、例えば、妊娠中絶胎児の脳や脊椎から採取した試料、成体、特に成体の脳、脊椎から採取した細胞含有試料である。これらの細胞集団は、一般に、目的とする神経幹細胞及び神経前駆細胞だけでなく、他の神経系細胞も含んだ不均一な細胞集団である。本発明のスクリーニング方法は、神経系以外で神経幹細胞及び神経前駆細胞を含む細胞集団、組織についても適用でき、さらにはＥＳ細胞から分化誘導された細胞集団も適用対象となり得る。

これらの細胞集団に抗ＭＤＲ１抗体を反応させ、抗ＭＤＲ１抗体との反応が陽性であると認識出来る程度にＭＤＲ１を細胞表面に発現している細胞（以下、「抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞」という」）をスクリーニングすることで、Ｎｅｓｔｉｎ高発現細胞を分離する。

ＭＤＲ１とは、ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ−ｐｒｏｔｅｉｎのことで、多剤排出トランスポータとして知られている。
１９８６年にＡＤＰ駆動型トランスポータ（ＡＴＰｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ：ＡＢＣトランスポータ）ファミリーのＰ糖蛋白質（Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）に属するｍｄｒ１のクローニングが成功している。
ＡＢＣトランスポータは、ＡＴＰ結合カセットが１分子中に２カ所存在し、ＡＴＰの水開エネルギーを利用して、薬物の細胞膜での細胞内から細胞外への逆向きの輸送を担う。

ＭＤＲ１は、ヒトの正常組織では、小腸、腎近位尿細管、肝臓の毛細胆管の肝腔側、脳と精巣の毛細血管内皮、副腎皮質、妊娠時の子宮及び胎盤などで発現していること、造血幹細胞などで発現されていることは知られているが（植田和光「多剤排出トランスポーターＭＤＲ１の分子機構」、タンパク質・核酸・酵素、２００１年ｖｏｌ．４６，Ｎｏ．５）、神経幹細胞との関係は、未だ報告されていない。

今回、本発明者らは、ニューロスフェア構成細胞のうち、抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞がＮｅｓｔｉｎ抗体陽性反応と相関性が高いことを見出した。従って、細胞集団に、抗ＭＤＲ１抗体を反応させ、抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞を検出することにより、Ｎｅｓｔｉｎ発現細胞を検出することができる。Ｎｅｓｔｉｎを発現している細胞は神経幹細胞であることが、この分野において認められていることから、抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞は、神経幹細胞、少なくとも神経幹細胞を高濃度で含む集団であると考えられる。換言すると、スクリーニングの対象となる細胞集団における抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞の含有割合を測定することにより、Ｎｅｓｔｉｎ発現細胞の含有割合を知ることが可能となり、ひいては神経幹細胞の含有割合を知ることが可能となる。

ここで、本発明の方法で使用する抗ＭＤＲ１抗体は、ＭＤＲ１の細胞表面抗原を認識するモノクローナル抗体、ＭＤＲ１の細胞表面抗原を認識する抗原結合部位を有する抗体断片（例えばＦ（ａｂ）_２、Ｆａｂなど）、免疫グロブリンを含む概念である。市販品としては、ＫＹＯＷＡ社製のＭＲＫ１６（マウス産生モノクローナル抗体）、マウスモノクローナル抗体４Ｅ３（ＵＳ５３６９００９）、マウスモノクローナル抗体ＵＩＣ２（ＥＰ０ ６４４ ９００ Ｂ１）などを使用することができる。

このように、細胞表面抗原を認識する抗ＭＤＲ１抗体を使用することにより、細胞集団から、抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞のスクリーニング、ひいては神経幹細胞富化集団、Ｎｅｓｔｉｎ高発現細胞、又は神経幹細胞を、生細胞のままで検出し、分取することが可能となる。

細胞集団から抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞の検出は、抗ＭＤＲ１抗体の標識を検出することにより行なわれる。抗ＭＤＲ１抗体の標識は、抗ＭＤＲ１抗体を直接標識してもよいし、抗ＭＤＲ１抗体を一次抗体として標識二次抗体と結合させることにより間接的に標識してもよい。標識としては、従来より標識に用いられているものを使用できる。具体的には、蛍光色素、放射性物質、金コロイド、酵素、化学発光などが挙げられる。

抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞の分離採取方法としては、ソート機能を備えたフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）や、表面抗原特異的抗体と磁気ビーズを併用したＭＡＣＳ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ）システムや、抗ＭＤＲ１抗体又はＭＤＲ１と特異的に結合できる抗体を結合させた抗体カラムを通過させて二次抗体結合細胞と結合しない細胞を分離する方法などが挙げられる。

ＦＡＣＳでは、標識として使用した蛍光強度に応じて陽性細胞と陰性細胞を分離採取することができる。ＭＡＣＳシステムによる分離は、細胞を磁性をもつビーズで標識し、強力な永久磁石上に設置された分離カラムを通し、磁気標識細胞のみをカラムに保持することにより分離する方法である。また、抗体カラムを用いる方法では、抗ＭＤＲ１抗体のエフェクター部位と特異的に結合できる二次抗体やＭＤＲ１自体と特異的に結合できる抗ＭＤＲ１抗体を結合させたカラムを通すことで、抗ＭＤＲ１抗体が結合した細胞（抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞）と結合していない細胞（抗ＭＤＲ１抗体陰性細胞）とを分離することができる。

本発明の方法で分離採取された抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞は、Ｎｅｓｔｉｎを高発現しており、神経幹細胞としての機能を有しているので、ニューロスフェアの成長、増殖培地で増殖培養することができる。また、条件設定により適宜分化誘導することも可能である。従って、分離採取した抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞を再生医療用細胞として用いることもできる。

本発明の神経幹細胞スクリーニング用試薬は、抗ＭＤＲ１抗体を必須成分として含有するもので、溶媒としては、神経幹細胞培養に用いる培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）やＰＢＳを用いることができる。一方、スクリーニング用試薬には、血清、界面活性剤は含まれないことが好ましい。血清は神経幹細胞を分化誘導させる作用があり、界面活性剤は、細胞表面分子の抗体での認識を妨げる可能性があるからである。

神経幹細胞及び神経前駆細胞を含む細胞集団における神経幹細胞及び神経前駆細胞の含有率を評価する本発明の評価方法は、細胞集団を抗ＭＤＲ１抗体と反応させ、抗ＭＤＲ１抗体との反応が陽性であるＭＤＲ１発現細胞（抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞）の含有率に基づいて評価する方法である。抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞がＮｅｓｔｉｎ高発現細胞と相関性があることに基づく方法で、本発明のスクリーニング方法で対象となる細胞集団に適用できる。

上記評価方法は、抗ＭＤＲ１抗体を蛍光標識し、フローサイトメトリーなどを用いて得られるヒストグラム、サイトグラム（ドットプロット）等のプロファイルなどから、抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞の含有割合を求めることによって行なってもよいし、試料となる細胞集団や組織をスライドグラスに貼付けて、免疫細胞・組織化学的手法によって行なってもよいし、ＥＬＩＳＡやＲＩＡなどで行なってもよい。

〔神経幹細胞〕
神経幹細胞は、国立病院機構大阪医療センター倫理委員会及び産業技術総合研究所倫理委員会承認の下、妊娠９週齢のヒト胎児前脳部より取り出した神経幹細胞及び神経前駆細胞（以下、これらをまとめて「ｈＮＳＰＣ」という）を、継代培養後、前述の神経幹細胞増殖培地で継代培養して得られたニューロスフェアを測定に用いた。

ニューロスフェア法の培養に使用した培地組成は、以下の通りである。
ＤＭＥＭ ／Ｆ１２（１：１混合物、シグマ社）
ヒト組換え（以下「ｈｒ−」と略記する）ＥＧＦ（インビトロジェン社）２０ｎｇ／ｍｌ
ｈｒ−ＦＧＦ２（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ社）２０ｎｇ／ｍｌ
ｈｒ−ＬＩＦ（ケミコン・インターナショナル社）１０ｎｇ／ｍｌ
ヘパリン（シグマ社）５ｍｇ／ｍｌ
Ｂ２７（インビトロジェン社）
ＨＥＰＥＳ１５ｍＭ
Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（インビトロゲン社）

〔実施例１：抗ＭＤＲ１抗体を用いたフローサイトメトリー解析〕
培養日数１００〜３００日のニューロスフェアをトリプシン処理により単一細胞にしたものを用いた。一次抗体として、マウス産生抗ヒトＭＤＲ１モノクローナル抗体（終濃度５０μｇ／ｍｌ、ＫＹＯＷＡ社のＭＲＫ１６）を４℃、３０分間反応させ、続いて二次抗体としてＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ４８８ヤギ産生抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｈｉｇｈｌｙ ｃｒｏｓｓ−ａｄｓｏｒｂｅｄ（終濃度４μｇ／ｍｌ、モレキュラープローブス社）を４℃で３０分間反応させた。この二次抗体は、ヤギ産生でマウスのＨ鎖及びＬ鎖を認識し、ヒト、ウシ、ヤギ、ウサギ、ラットの抗体は認識しないもので、蛍光色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ４８８（緑）で標識されたものである。

ヨウ化プロピジウム（終濃度１μｇ／ｍｌ、シグマ社）を加え、ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ−ＳＥフローサイトメータ（ベクトン−ディクソン社）を用いて、抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞と陰性細胞を分離した。

尚、コントロールは、一次抗体と反応させず、二次抗体だけと反応させた場合に同様の操作を行なったときの蛍光強度を示している。

分離により得られた陽性細胞をフローサイトメトリーにかけた解析及びコントロールの解析結果を図１に示す。図１中、Ｘ軸は蛍光強度、Ｙ軸は細胞数を示している。
図１の解析結果に基づき、ＭＤＲ１の細胞表面の発現により抗ＭＤＲ１抗体との反応が陽性を示した細胞、すなわち抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞（抗ＭＤＲ１抗体結合細胞）及び抗ＭＤＲ抗体陰性陰性細胞（抗ＭＤＲ１抗体と結合しなかった細胞）についての全細胞中の各存在割合を求めた結果を表１に示す。表１には、３回の解析の平均値±標準誤差を示す。

図１からわかるように、コントロールに対して、抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞群は、より蛍光強度の強い分布にシフトしていた。従ってヒトニューロスフェア構成細胞には抗ＭＤＲ１による識別で陽性と評価できるような、ＭＤＲ１分子を細胞表面に発現している細胞（抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞）が存在することがわかる。

表１から、コントロール実験において抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞と判断されたバックグラウンドの値は０．０２５±０．０２５％であった。このことから、今回の解析では、抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞の評価におけるバックグラウンドの誤差はほぼ無視できるレベルのものであると考えられる。従って、表１が示すように、全ヒトニューロスフェア構成細胞における抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞の割合は、ほぼ６０％であることがわかった。

〔実施例２：神経幹細胞の選択的マーカーである抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体による免疫細胞染色〕
フローサイトメーターにて分離された抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞及び陰性細胞のそれぞれを、４％パラホルムアルデヒドで固定した後、ｃｙｔｏｓｐｉｎ３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｈａｎｄｏｎ社）を用いてスライドガラスに貼付けた。１０％ヤギの正常血清で室温で１時間反応させてブロッキングした後、一次抗体としてウサギ産生抗ヒトＮｅｓｔｉｎポリクローナル抗体（１：５００、ウサギポリクローナル抗体、Ｎａｋａｍｕｒａら２００３年）を４℃で一晩反応させ、続いて二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ５６８ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｈｉｇｈｌｙ ｃｒｏｓｓ−ａｄｓｏｒｂｅｄ（終濃度４μｇ／ｍｌ、モレキュラープローブス社）及び核染色用のＴＯ−ＰＲＯ−３ｉｏｄｉｄｅ（終濃度１μＭ、モレキュラープローブス社）と室温で１時間反応させ、免疫細胞染色標本を作製した。上記二次抗体は、ヤギ産生でマウスのＨ鎖及びＬ鎖を認識し、ヒト、ウシ、ヤギ、ウサギ、ラットの抗体は認識しないもので、蛍光色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ５６８（赤）で標識されたものである。

免疫染色標本は、共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ５１０、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で観察した。抗ＭＤＲ１抗体陰性細胞群の写真を図２、抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞群の写真を図３に示す。図２及び図３中、（ａ）は抗ＭＤＲ１抗体のみ、（ｂ）は抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体のみ、（ｃ）は核染色を含め、抗ＭＤＲ１抗体と抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体の３つの染色を重ねた画像である。尚、図２及び図３に示すスケールバーの長さは、２０μｍである。

図２（ａ）及び図３（ａ）の比較から、抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞と陰性細胞とがフローサイトメータによる分離操作にて正しく分離・分取されていることがわかる。また、図２（ｂ）と図３（ｂ）を比較することで、抗ＭＤＲ１陽性細胞群は、抗ＭＤＲ１陰性細胞群と比較してＮｅｓｔｉｎ陽性率が高いことがわかる。

抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞と陰性細胞のそれぞれの細胞群におけるＮｅｓｔｉｎタンパク質の発現程度を、定量的に検討する目的のために、抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体を用いた免疫細胞染色標本をレーザースキャニングサイトメータ（ＬＳＣ２、オリンパス社）を用いてすることで評価した結果（ヒストグラム）を、図４に示す。図４中、Ｘ軸は抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体蛍光標識強度、Ｙ軸は細胞数である。抗ＭＤＲ１抗体陰性細胞群に対して、抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞群の方が強い蛍光強度分布を示し、ヒトニューロスフェア構成細胞中、ＭＤＲ１を強く発現している細胞は、Ｎｅｓｔｉｎの発現量も多いことがわかった。

さらに、図４の結果に基づき、抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞と抗ＭＤＲ１抗体陰性細胞について、レーザースキャニングサイトメータの結果に基づき、Ｎｅｓｔｉｎ発現量に基づいて、抗ＭＤＲ１陰性細胞におけるＮｅｓｔｉｎ発現量の最大値以上のＮｅｓｔｉｎ発現量を呈する細胞をＮｅｓｔｉｎ強陽性（＋＋）、コントロール細胞における最高蛍光強度以下の発現をＮｅｓｔｉｎ陰性（−）とし、その間の発現量の細胞をＮｅｓｔｉｎ弱陽性（＋）と分類したときの結果を表２に示す。

表２から、ヒトニューロスフェア構成細胞中の抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞のほぼすべての細胞にＮｅｓｔｉｎの発現が認められ、そのうちの２０％の細胞が強くＮｅｓｔｉｎを発現する細胞（Ｎｅｓｔｉｎ強発現細胞）であることが判明した。一方、抗ＭＤＲ１抗体陰性細胞では、約７５％程度の細胞にＮｅｓｔｉｎの発現が観察されるが、抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞群のときに観察されたＮｅｓｔｉｎ強発現細胞はほとんど存在せず、殆どがＮｅｓｔｉｎ弱発現細胞であった。そのＮｅｓｔｉｎ弱発現細胞におけるＮｅｓｔｉｎの発現量も、図４の結果から、抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞群に見られるＮｅｓｔｉｎ弱発現細胞と比較して、発現量は全体的に低いものであった。従って、ヒトニューロスフェア構成細胞において、ＭＤＲ１の発現は、Ｎｅｓｔｉｎの発現と相関関係にあり、ＭＤＲ１を指標としてスフェア形成能の高いＮｅｓｔｉｎ強発現細胞を分取できることがわかる。

〔実施例３：抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞と陰性細胞の細胞周期〕
実施例１で分離したヒトニューロスフェア構成細胞中の抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞、抗ＭＤＲ１抗体陰性細胞それぞれにおける、レーザースキャニングサイトメータを用いた細胞核内のＤＮＡ量の分析に基づく、それぞれの細胞周期の解析した結果を、表３に示す。

表３から、ヒトニューロスフェア構成細胞において、抗ＭＤＲ１抗体陰性細胞群と比べて、抗ＭＤＲ１抗体細胞陽性細胞の方が、Ｓ期、Ｇ２−Ｍ期の細胞割合が高く、増殖期に入っている細胞が多いことがわかる。従って、細胞増殖の点から、ヒトニューロスフェア構成細胞において、ＭＤＲ１が発現している細胞群は、陰性細胞群より増殖能が高いと考えられる。

〔実施例４：発生段階のヒト神経組織標本を用いた免疫組織染色〕
パラフィン包埋ヒト神経組織永久標本（胎生９週齢前脳、１８週齢海馬、２８週齢海馬、３２週齢海馬）を、Ｈｉｓｔｏ−Ｃｌｅａｒ（Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）と１００％エタノール、９５％エタノール、９０％エタノール、８０％エタノール、７０％エタノールで脱パラフィン、親水処理し、１０％ヤギの正常血清で室温で１時間反応させてブロッキングした後、一次抗体としての抗ヒトＭＤＲ１抗体（終濃度４μｇ／ｍｌ）及び核染色用のＴＯ−ＰＲＯ−３ｉｏｄｉｄｅ（終濃度１μＭ）と室温で１時間反応させ、免疫組織染色標本を作製した。次いで抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体を用いて免疫染色した。免疫染色標本は共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ５１０、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で観察した。

ヒト胎生９週齢前脳の顕微鏡写真を図５、１８週齢海馬の顕微鏡写真を図６、２８週齢海馬の顕微鏡写真を図７、３２週齢海馬の顕微鏡写真を図８に示す。各図、抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体で標識されるＮｅｓｔｉｎ発現細胞が局在する脳室壁周辺の画像を示し、（ａ）抗ＭＤＲ１抗体による染色結果、（ｂ）抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体による染色結果、（ｃ）核染色（ＴＯ−ＰＲＯ−３ｉｏｄｉｄｅ）＋抗ＭＤＲ１抗体＋抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体の３つの染色を重ねたものを示している。それぞれ上段の四角で囲んだ領域を拡大したものを下段に示した。尚、図５〜８に示すスケールバーの長さは２５μｍである。

図５〜図８から明らかなように、発生段階のヒト脳組織において、ＭＤＲ１の発現はＮｅｓｔｉｎの発現と同様、脳室壁周辺に存在する細胞に強い発現が見られ、ｉｎ ｖｉｔｒｏのヒトニューロスフェアを用いて実施した解析結果が生体脳内（ｉｎ ｖｉｖｏ）でも反映されることが確認できた。

本発明の方法は、不均一な細胞集団から神経幹細胞及び神経前駆細胞（以下、これらをまとめて「神経幹／前駆細胞」という）又は神経幹／前駆細胞の富化集団を生細胞のままでスクリーニングできるので、再生医療用に生体から採取した神経幹／前駆細胞が含まれる細胞集団から神経幹／前駆細胞富化集団、ひいては神経幹／前駆細胞の検出、さらには分離する方法として利用できる。そして、本発明の方法により得られた神経幹／前駆細胞は、生細胞の状態で、しかも生体由来でない遺伝子導入等の操作は行なわれていないので、人体への移植細胞用、または移植細胞のための培養細胞として利用することができる。

本発明のスクリーニング試薬は、人体移植用の神経幹／前駆細胞をスクリーニングする試薬として用いることができる。

抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞及びコントロールのフローサイトメトリー解析で得られたヒストグラムである。 抗ＭＤＲ１抗体陰性細胞群のＮｅｓｔｉｎ染色の顕微鏡写真である。 抗ＭＤＲ１抗体陽性細胞群のＮｅｓｔｉｎ染色の顕微鏡写真である。 抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体陽性細胞群及び抗Ｎｅｓｔｉｎ抗体陰性細胞群におけるＮｅｓｔｉｎ蛍光標識強度と細胞群の関係を示すフリーサイトメトリー解析結果のヒスとグラムである。 ヒト胎児９週齢前脳の免疫組織染色を示す顕微鏡写真である。 ヒト胎児１８週齢海馬の免疫組織染色を示す顕微鏡写真である。 ヒト胎児２８週齢海馬の免疫組織染色を示す顕微鏡写真である。 ヒト胎児３２週齢海馬の免疫組織染色を示す顕微鏡写真である。

Claims (14)

1. 神経幹細胞及び神経前駆細胞を含む細胞集団から神経幹細胞及び神経前駆細胞を取り出す方法であって、
   前記細胞集団に抗ＭＤＲ１抗体と反応させ、抗ＭＤＲ１抗体との反応が陽性であるＭＤＲ１発現細胞を分取する工程を含む方法。
2. 神経幹細胞及び神経前駆細胞を含む細胞集団から神経幹細胞及び神経前駆細胞の含有率の高い集団を選択的に取り出す方法であって、
   前記細胞集団に抗ＭＤＲ１抗体と反応させ、抗ＭＤＲ１抗体との反応が陽性であるＭＤＲ１発現細胞を分取する工程を含む方法。
3. 前記ＭＤＲ１発現細胞を分取することにより、Ｎｅｓｔｉｎ高発現細胞を分取する請求項１又は２に記載の方法。
4. 神経幹細胞及び神経前駆細胞を含む細胞集団からＮｅｓｔｉｎ高発現細胞をスクリーニングする方法であって、
   前記細胞集団を抗ＭＤＲ１抗体と反応させ、抗ＭＤＲ１抗体との反応が陽性であるＭＤＲ１発現細胞を検出する工程を含む方法。
5. 神経幹細胞及び神経前駆細胞を含む細胞集団における神経幹細胞及び神経前駆細胞の含有率を評価する評価方法であって、
   前記細胞集団を抗ＭＤＲ１抗体と反応させ、抗ＭＤＲ１抗体との反応が陽性であるＭＤＲ１発現細胞の含有率に基づいて評価する方法。
6. 前記細胞集団は、ヒトニューロスフェアである請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. 前記細胞集団は、生体から採取した細胞群である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
8. 前記抗ＭＤＲ１抗体との反応が陽性であるＭＤＲ１発現細胞の分取は、抗ＭＤＲ１抗体を蛍光標識し、フローサイトメトリーにより行なう請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
9. 前記抗ＭＤＲ１抗体との反応が陽性であるＭＤＲ１発現細胞の分取は、前記細胞集団を抗体カラムに通過させることにより行なう請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
10. 前記抗ＭＤＲ１抗体との反応が陽性であるＭＤＲ１発現細胞の分取は、抗ＭＤＲ１抗体を磁気標識し、着脱磁可能なカラムに通過させることにより行なう請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
11. 前記抗ＭＤＲ１抗体は、ＭＤＲ１分子の細胞表面部分に存在する抗原と特異的に結合する抗体、免疫グロブリン、及び抗体断片から選ばれる少なくとも１種である請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
12. 前記抗ＭＤＲ１抗体は、モノクロナール抗体ＭＲＫ１６である請求項１１に記載の方法。
13. 神経幹細胞及び神経前駆細胞含有細胞集団から、前記抗ＭＤＲ１抗体との反応が陽性であるＭＤＲ１発現細胞の集団を分離採取して得られる神経幹細胞及び神経前駆細胞富化集団。
14. 神経幹細胞及び神経前駆細胞含有細胞集団から神経幹細胞及び神経前駆細胞富化集団をスクリーニングするための試薬であって、
    抗ＭＤＲ１抗体及び溶媒を含有することを特徴とする神経幹細胞及び神経前駆細胞スクリーニング用試薬。