CN111116746A - 一种基于纳米金颗粒的蛋白标记方法 - Google Patents

一种基于纳米金颗粒的蛋白标记方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111116746A
CN111116746A CN201911114157.6A CN201911114157A CN111116746A CN 111116746 A CN111116746 A CN 111116746A CN 201911114157 A CN201911114157 A CN 201911114157A CN 111116746 A CN111116746 A CN 111116746A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
buffer solution
buffer
gold
ultrafiltration tube
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201911114157.6A
Other languages
English (en)
Inventor
林铖
王甜
童年
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Plttech Health Technology Co ltd
Original Assignee
Zhejiang Plttech Health Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Plttech Health Technology Co ltd filed Critical Zhejiang Plttech Health Technology Co ltd
Priority to CN201911114157.6A priority Critical patent/CN111116746A/zh
Publication of CN111116746A publication Critical patent/CN111116746A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2812—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD4

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本申请涉及蛋白标记技术领域，具体涉及一种基于纳米金颗粒的蛋白标记方法，所述方法包括如下步骤：(1)，还原蛋白的巯基；(2)，将巯基已被还原的蛋白和纳米金悬浮液混合，以进行纳米金和巯基的耦连反应；其中，纳米金悬浮液通过将纳米金颗粒溶解到C‑缓冲液中制备得到，所述C‑缓冲液为MAXPAR多金属标记试剂盒中的试剂。

Description

一种基于纳米金颗粒的蛋白标记方法
技术领域
本申请涉及蛋白标记技术领域，具体涉及一种基于纳米金颗粒的蛋白标记方法。
背景技术
在监测生物过程、辅助检测(例如化合物的可靠定量、蛋白质修饰的特异性检测)或者纯化标记后的蛋白及其结合对象等都需要应用到蛋白质标记技术。高效的蛋白质标记技术能够提高检测灵敏度以及简化检测工作流程。
目前有多种蛋白质标记技术，如同位素标记、荧光标记、量子点标记、生物素标记、酶联标记等来帮助我们研究感兴趣的蛋白质的丰度、位置、相互作用、翻译后修饰、功能，乃至监测活细胞中的蛋白质运输等问题。使用金属对蛋白质进行标记，能够避免样本的自发荧光背景的干扰、无生物危害、极高的灵敏度、高通零等优势，具备极大的应用情景。随着质谱仪及质谱流式细胞技术的发展越来越迅速，发展越来越迅速，国内外对应用于该技术的金属蛋白试剂需求也越来越大，以满足高维度细胞检测的需求。
发明内容
本申请提供了一种基于纳米金颗粒的蛋白标记方法，可以把蛋白质巯基与纳米金颗粒进行耦连，可以通过对金元素的检测，实现对于被标记蛋白的检测，且方法简便、经济、实用性强、效率和可靠性较高。。
本申请提供了一种基于纳米金颗粒的蛋白标记方法，所述方法包括如下步骤：
(1)，还原蛋白的巯基；
(2)，将巯基已被还原的蛋白和纳米金悬浮液混合，以进行纳米金和巯基的耦连反应；其中，纳米金悬浮液通过将纳米金颗粒溶解到C-缓冲液中制备得到，所述C-缓冲液为MAXPAR多金属标记试剂盒中的试剂。
在一些实施例中，所述还原蛋白的巯基包括：
(a)，在蛋白对应的超滤管中，使用R-缓冲液混合抗体；
(b)，在步骤(a)中的蛋白对应的超滤管中加入用R-缓冲液混合后巯基还原剂，以还原蛋白的巯基；其中，
所述R-缓冲液为MAXPAR多金属标记试剂盒中的试剂。
在一些实施例中，所述巯基还原剂为TCEP。
在一些实施例中，所述蛋白为CD4抗体；蛋白对应的超滤管为50kDa超滤管。
在一些实施例中，步骤(a)包括：将300μl的R-缓冲液加入到蛋白对应的超滤管中，加入100μg的蛋白，混匀后，离心后，去上清；
步骤(b)包括：在步骤(a)中的去了上清后的液体中，加入100μl的4mM TCEP R-缓冲液，其中，100μl的4mM TCEP R-缓冲液通过将1μl的TCEP和124μl R-缓冲液制备得到。
在一些实施例中，步骤(b)包括：在37℃孵育2小时，以还原蛋白的巯基。
在一些实施例中，所述纳米金颗粒使用N-羟基硫代琥珀酰亚胺或马来酰亚胺修饰。
在一些实施例中，在步骤(2)中，在超滤管中，将巯基已被还原的蛋白和纳米金溶液混合，以进行纳米金和巯基的耦连反应。
在一些实施例中，纳米金还可标记蛋白的氨基基团。
在一些实施例中，在步骤(2)之后，所述方法还包括：(3)，使用w-缓冲液洗脱被金属标记后的抗体，所述w-缓冲液为MAXPAR多金属标记试剂盒中的试剂。
本申请提供的抗体标记方法可以对细胞或者药物进行标记，从而加大筛选工作的通量，扩展了适用于质谱流式细胞技术的金属耦连蛋白质的金属通道。
附图说明
图1为质谱流式细胞仪检测染色结果与流式检测结果的对比图。
具体实施方式
下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
在进一步描述本申请具体实施方式之前，应理解，本申请的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本申请实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本申请的保护范围；在本申请说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本申请另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本申请中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本申请的记载，还可以使用与本申请实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本申请。
除非另外说明，本申请中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
本申请实施例提供的基于纳米金颗粒的蛋白标记方法可以对anti-CD4(RPA-T4)等七种抗体进行标记。然后可使用质谱流式平台进行检测与流式细胞技术平台检测进行比较。
接下来，在具体实施例中，对本申请实施例提供的抗体标记方法进行举例介绍。其中，实验对象包括：淋巴细胞亚群抗体的标记；实验试剂包括：Maxpar multimetallabeling Kit-40 Rnx；实验设备包括：质谱流式细胞仪Helios，流式细胞仪BD Canto II。
实施例1
本实施例提供了蛋白标记方法包括如下步骤。
步骤一、纳米金颗粒使用C-buffer溶解；
步骤二、根据蛋白质分子量使用特定的超滤管，使用R-buffer混合蛋白，离心纯化后，加入硫醇还原剂如TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine，三(2-羧乙基)膦)进行还原，加入300ul C-buffer，过特定分子量的超滤管，蛋白还原完成；步骤三、将纳米颗粒溶解物和蛋白混匀后，进行耦连反应；
步骤四、使用50ul W-buffer清洗后将超滤管倒置，使用适当体积的W-buffer反向洗出耦连完成的蛋白。
在一些实施例中，使用的金包括但不限于金纳米颗粒。
在一些实施例中，使用的纳米金颗粒使用N-羟基硫代琥珀酰亚胺或马来酰亚胺修饰。
其中，蛋白巯基和被修饰的纳米金颗粒的耦连反应可通过如下化学式表示。
Figure BDA0002273594240000051
在一些实施例中，标记蛋白质的巯基或氨基基团。
在一些实施例中，蛋白质的巯基基团使用硫醇类还原剂进行巯基还原，包括但不限于TCEP。
在一些实施例中，使用超滤管纯化标记有纳米金的蛋白。
在一些实施例中，使用Buffer C重悬金纳米颗粒。
实施例2
本实施例提供了蛋白标记方法包括如下步骤。
a.300ul R-buffer加入到50kDa超滤管(超滤管A)，加入100ug CD4抗体(规格为0.5mg/ml)，12000g RT 10min(同步配置TCEP工作液1ul TCEP和124ul R buffer混合)，弃去离心下来的液体，加入100ul 4mM TCEP R buffer混匀，37度孵育30min；
b.取出还原产物，加入300ul C-buffer，12000g RT 5min，弃去离心下来的液体，加入400ul C-buffer，12000g RT 5min，离心后弃掉离心下来的液体；
c.用200uL C-buffer溶解纳米金颗粒粉末，转移到1.5ml EP管中，在超滤管A中加入280ul C-buffer，转移到金溶液中，吹打混匀，37度孵育2h；
d.加入300ul W-buffer到超滤管A中，12000g RT 5min，弃掉离心下来的液体，重复W-buffer wash步骤三次；
e.加入50ul w-buffer到50KDa管的滤膜上，吹打冲洗管壁和滤膜，将超滤管A倒扣在一新的收集管中，1000g 2min，取出内管，用50ul W-buffer再洗涤管壁和滤膜一次，倒扣在管子中，1000g离心2min；
f.测OD280/OD420，使用W-buffer作为blank，稀释蛋白至0.5mg/ml,4度保存。
g.取10^6淋巴细胞，使用金属标记CD45进行染色；
h.用质谱流式细胞仪检测染色结果；
i.与流式检测结果进行比对。
试验结果如图1所示，可知淋巴细胞亚群分析效果与传统流式技术的比对结果相同。
结论：使用本实施例中的技术，能够实现纳米金颗粒与带巯基蛋白质的高效标记，并且能对淋巴细胞亚群进行分群。
实施例3
本实施例提供了一种基于纳米金颗粒的蛋白标记方法，所述方法包括如下步骤：
(1)，还原蛋白的巯基；
(2)，将巯基已被还原的蛋白和纳米金悬浮液混合，以进行纳米金和巯基的耦连反应；其中，纳米金悬浮液通过将纳米金颗粒溶解到C-缓冲液中制备得到，所述C-缓冲液为MAXPAR多金属标记试剂盒中的试剂。
在一些实施例中，所述还原蛋白的巯基包括：
(a)，在蛋白对应的超滤管中，使用R-缓冲液混合抗体；
(b)，在步骤(a)中的蛋白对应的超滤管中加入用R-缓冲液混合后巯基还原剂，以还原蛋白的巯基；其中，
所述R-缓冲液为MAXPAR多金属标记试剂盒中的试剂。
在一些实施例中，所述巯基还原剂为TCEP。
在一些实施例中，所述蛋白为CD4抗体；蛋白对应的超滤管为50kDa超滤管。
在一些实施例中，步骤(a)包括：将300μl的R-缓冲液加入到蛋白对应的超滤管中，加入100μg的蛋白，混匀后，离心后，去上清；
步骤(b)包括：在步骤(a)中的去了上清后的液体中，加入100μl的4mM TCEP R-缓冲液，其中，100μl的4mM TCEP R-缓冲液通过将1μl的TCEP和124μl R-缓冲液制备得到。
在一些实施例中，步骤(b)包括：在37℃孵育2小时，以还原蛋白的巯基。
在一些实施例中，所述纳米金颗粒使用N-羟基硫代琥珀酰亚胺或马来酰亚胺修饰。
在一些实施例中，在步骤(2)中，在超滤管中，将巯基已被还原的蛋白和纳米金溶液混合，以进行纳米金和巯基的耦连反应。
在一些实施例中，纳米金还可标记蛋白的氨基基团。
在一些实施例中，在步骤(2)之后，所述方法还包括：(3)，使用w-缓冲液洗脱被金属标记后的抗体，所述w-缓冲液为MAXPAR多金属标记试剂盒中的试剂。
以上所述的具体实施方式，对本申请的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本申请的具体实施方式而已，并不用于限定本申请的保护范围，凡在本申请的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于纳米金颗粒的蛋白标记方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)，还原蛋白的巯基；
(2)，将巯基已被还原的蛋白和纳米金悬浮液混合，以进行纳米金和巯基的耦连反应；其中，纳米金悬浮液通过将纳米金颗粒溶解到C-缓冲液中制备得到，所述C-缓冲液为MAXPAR多金属标记试剂盒中的试剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述还原蛋白的巯基包括：
(a)，在蛋白对应的超滤管中，使用R-缓冲液混合抗体；
(b)，在步骤(a)中的蛋白对应的超滤管中加入用R-缓冲液混合后巯基还原剂，以还原蛋白的巯基；其中，
所述R-缓冲液为MAXPAR多金属标记试剂盒中的试剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述巯基还原剂为TCEP。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，蛋白为带巯基的抗体；蛋白对应的超滤管为50kDa超滤管。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(a)包括：将300μl的R-缓冲液加入到蛋白对应的超滤管中，加入100μg的蛋白，混匀后，离心后，去上清；
步骤(b)包括：在步骤(a)中的去了上清后的液体中，加入100μl的4mM TCEP R-缓冲液，其中，100μl的4mM TCEP R-缓冲液通过将1μl的TCEP和124μl R-缓冲液制备得到。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(b)包括：在37℃孵育2小时，以还原蛋白的巯基。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳米金颗粒使用N-羟基硫代琥珀酰亚胺或马来酰亚胺修饰。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，在超滤管中，将巯基已被还原的蛋白和纳米金溶液混合，以进行纳米金和巯基的耦连反应。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，纳米金还可标记蛋白的氨基基团。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)之后，所述方法还包括：
(3)，使用w-缓冲液洗脱被金属标记后的抗体，所述w-缓冲液为MAXPAR多金属标记试剂盒中的试剂。
CN201911114157.6A 2019-11-14 2019-11-14 一种基于纳米金颗粒的蛋白标记方法 Pending CN111116746A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911114157.6A CN111116746A (zh) 2019-11-14 2019-11-14 一种基于纳米金颗粒的蛋白标记方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911114157.6A CN111116746A (zh) 2019-11-14 2019-11-14 一种基于纳米金颗粒的蛋白标记方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111116746A true CN111116746A (zh) 2020-05-08

Family

ID=70495603

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911114157.6A Pending CN111116746A (zh) 2019-11-14 2019-11-14 一种基于纳米金颗粒的蛋白标记方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111116746A (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101893634A (zh) * 2009-05-20 2010-11-24 中国科学院生物物理研究所 特异检测蛋白质或多肽半胱氨酸巯基修饰的方法及其用途
US20140235480A1 (en) * 2013-02-11 2014-08-21 Craig David Shimasaki Ultra-sensitive Detection of Analytes
CN104614518A (zh) * 2015-01-26 2015-05-13 珠海丽珠试剂股份有限公司 一种用于快速检测的胶体金共价标记方法
AU2018204709A1 (en) * 2015-07-09 2018-07-19 Atomic Oncology Pty Ltd Atomic therapeutic indicator

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101893634A (zh) * 2009-05-20 2010-11-24 中国科学院生物物理研究所 特异检测蛋白质或多肽半胱氨酸巯基修饰的方法及其用途
US20140235480A1 (en) * 2013-02-11 2014-08-21 Craig David Shimasaki Ultra-sensitive Detection of Analytes
CN104614518A (zh) * 2015-01-26 2015-05-13 珠海丽珠试剂股份有限公司 一种用于快速检测的胶体金共价标记方法
AU2018204709A1 (en) * 2015-07-09 2018-07-19 Atomic Oncology Pty Ltd Atomic therapeutic indicator

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DVS SCIENCES: "MAXPAR®-PL KIT Lanthanide Labeling of Antibodies: Pre-Load Method", 《MAXPAR®-PL KIT LANTHANIDE LABELING OF ANTIBODIES: PRE-LOAD METHOD》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mohammadi et al. Emerging technologies and commercial products in exosome-based cancer diagnosis and prognosis
EP3037171B1 (en) Multisort cell separation method
US20190331561A1 (en) Phosphoprotein Detection Using a Chip-Based Pillar Array
EP2725359B1 (en) Cell separation method using a release system for cell-antibody-substrate conjugates containing a polyethylene glycol spacer unit
US20110003285A1 (en) Separation purification method and microfluidic circuit
WO2019232797A1 (zh) 磁珠-核酸适配体-多靶分子同时检测的方法及试剂盒
CN110257383B (zh) 特异性识别邻苯二甲酸二(2-乙基）己酯的核酸适配体及其筛选方法与应用
Tang et al. Magnetic bead-based fluorescence immunoassay for aflatoxin B 1 in food using biofunctionalized rhodamine B-doped silica nanoparticles
EP2972359B1 (en) Enrichment of circulating tumor cells by depleting white blood cells
Zhang et al. Application of nanomaterials in proteomics-driven precision medicine
CN113976195A (zh) 一种用于外泌体分离富集的微流控芯片，以及一种外泌体表面蛋白的分析方法
CN112730323A (zh) 一种新型杂化金属纳米材料，其制备方法及其在基质辅助激光解吸离子化质谱中的应用
CN111116746A (zh) 一种基于纳米金颗粒的蛋白标记方法
CN108531592B (zh) 一种dna编码技术与纳米孔技术联用的癌症标志物检测方法
CN110988325A (zh) 封闭剂及包含该封闭剂的试剂盒
CN110835363A (zh) 一种基于蛋白质巯基耦连金属的抗体标记方法
CN116165123A (zh) 质谱流式检测抗体的方法及其应用
CN112485452B (zh) 金属团簇作为人工抗体定量蛋白丰度的方法
WO2022201000A1 (en) Biological sample preparation and analysis
Hsu et al. Isolating cells from blood using buoyancy activated cell sorting (BACS) with glass microbubbles
CN115902231A (zh) 用于化学发光免疫检测的抗体检测液及外泌体检测试剂盒
US20220297137A1 (en) Biological component separators
CN111116701A (zh) 一种用于蛋白金属标记的中间体及其制备方法、用途
Hochendoner et al. Diagnostic Potential of Tumor Exosomes
Sugishita et al. A centrifugation-based method for high-throughput biomaterial separation using magnetic microbeads

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200508