RO132002A0 - Metodă de stabilire a chemogramei personalizate, utilizată în managementul pacientului cu cancer pancreatic - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la o metodă de obţinere a chemogramei personalizate a pacientului oncologic. Metoda conform invenţiei constă în izolarea celulelor pancreatice din tumora pacientului (ADPK) şi a celulelor stromale din pancreas normal, şi co-cultivarea lor în matriţa 3D, în sisteme polimerice, sub formă de sferoizi, constituind un model organotipic tumoral pentru sceeningul şi analiza simultană a unor citostatice, şi realizarea unei chemograme personalizate.

Description

invenția se refera la metoda de stabilire a strategiei de obținere a unei chemograme personalizate utilizabilă 1a investigarea unor noi medicamente anti-tumorale specifice pentru celulele tumorale, pentru cele stromale sau pentru ambele, pe baza unor sisteme organotipice de pancreas.

Cultura celulara convenționala in sistem 2D (monostrat sau suspensie) a permis identificarea de noi tinte si medicamente, dar, deși aceste sisteme furnizează cu siguranța mult mai multe informații decât testele de biochimie ce nu folosesc celule ca substrat, totuși ele nu sunt capabile sa reproducă cu acuratele micromediul tumoral, in special in experimentele in care tinta este identificarea de noi medicamente in adenocarcinomul ductal pancreatic (ADKP), cazuri in care stroma are un rol deosebit de important in răspunsul la tratament. Obținerea de modele celulare, relevante din punct de vedere fiziologic, pentru evaluarea susceptibilității la anumite medicamente, testarea rezistentei sau screening-u] de medicamente si analiza funcționala care ar putea fi in măsură sa ofere o valoare predictiva ridicata pentru eficacitatea clinica a compușilor, este o necesitate absolută.

ADKP este caracterizat printr-un prognostic foarte prost, cu o mortalitate la 5 ani de 97-98%, metastazarea ia distanta ramanand responsabila mortalitatea si morbiditatea mare cauzata de acest tip de cancer. Totuși „micromediul tumoral, caracterizat printr-un continui stromal foarte mare, pare a fi unul dintre cei mai importanți determinant! ai rezistentei la chimioterapie si ai supraviețuirii pacientilor cu ADKP. De aceea, este necesara evaluarea cantitativa si calitativa a efectelor antitumorale ale medicametelor in contextul stromei existențe in tumori si a interacțiunii dintre proteinele stromale si celulele tumorale. Limitările cunoștințelor actuale, asociate cu probabilitatea ca stroma sa joace un roi fundamental in răspunsul terapeutic, impun eforturi focalizate si integrate pentru a analiza evoluția efectul antitumoralelor in prezenta stromei de ADKP.

Sistemele de cultura 3D reprezintă un model mult mai realist decât sistemele 2D pentru investigarea interacțiunilor celulare la nivelul formațiunii tumorale si mai ales pentru investigarea unor noi strategii anti-tumorale care sa tinteasca celulele tumorale, cele stromale sau pe ambele. Celulele crescute si multiplicate in vitro, sunt expuse unor presiuni de mediu diferite de cele la care sunt supuse atunci când sunt intr-un tesut, si in consecința, structura si abilitățile lor de funcționare si proliferare sunt diferite. Cultura 3D modelează in mod controlat configurația naturala, iar functiiile celulelor constituente ale țesutului tumoral sunt diferite de cele ale celulelor cultivate in sistem 2D, utilizate convențional in prezent pentru evaluarea unor compuși cu activitate anti-tumorala.

Au fost descrise mai multe procedee de obținere a sistemului de cultura 3D in alte tipuri de tumori. Jaganathan si colaboratorii (Jaganathan H, Gage J, Leonard F, Srinivasan S, Souza GR, Dave B, Godin

B. Three-dimensional in vitro co-culture model of breast tumor using magnetic levitation. Sci Rep. 20i4;4:6468. doi: 10.1038/srep06468) au testat un sistem de cultura 3D, fara scaffold, menit sa mimeze cat mai bine tumorile mamare heterogene. Celulele tumorale au fost co-cultivate cu fihrobiastele si apoi au fost supuse levitatiei magnetice care conduce ia formarea unor structuri tridimensionale (3D) asemanatoare cu țesuturile in vivo. Deși modelul tridimensional propus pentru cancerul mamar are avantajele ca se pot forma modele tumorale de mari dimensiuni in 24 de ore (milimetri in diametru), cu compoziție si densitate controlata, imitând micromediul tumoral si permițând testare eficientei unor medicamente, totuși, s-a aratat ca levitatia magnetica induce o serie de modificări ia nivelule celulelor expuse (altereaza metabolismul energetic, promovează diferențierea, etc).

ί isftl iUtl '« V i JSOiQg'fc rtiteb-rȘ Sifolau ¹ Di snsîliutu! de Biologie si P CeluIara ^lrNicoI ae__S i m i Acad. Maya Simio ,ΑΛ

jjîui Oncologic '*Pjof,.Dr·..· ,·

-¼ 1^{Γι Λ>ι} Z $ ^J11 · - 4

a 2016 00927

28/11/2016 lntr-un alt studiu Ekert si colaboratorii (Jason E. Ekert, Kjell Johnson, Brandy Strake, Jose Pardinas, Stephen Jarantow, Roberî Perkinson, David C. Coiter Three-Dimensional Lung Tumor Microenvironment Moduiates Therapeutic Compound Responsiveness In Vitro - impiication for Drug Development, PLoS One. 2014 Mar 17;9(3):e92248. doi: 10.1371/journal.pone.0092248) au propus un modei de cultura 3D pentru cancerul pulmonar, utilizând mai multe linii de celule tumorale pulmonare. Acest model presupune cultivarea celulelor tumorale pulmonare in placi de cultura cu aderenta scăzută (Ultra Low Adherence), cu baza in forma de “U”. Formarea sferelor a fost observata, in funcție de linia celulara utilizata, la 24 - 72 de ore de la incubare. Acest studiu a avut ca scop studierea diferentelor fenotipice si funcționale dintre celulele tumorale pulmonare crescute in monostrat 2D comparativ cu celulele crescute sub forma de sfere 3D, precum si evaluarea răspunsului la tratamentul cu inhibitori de EGFR si cMET (Erlotinib, Crizotinib, Cetuximab [Erbitux] si Onartuzumab [MetMab]). Deși, acest studiu a aratat ca celulele cultivate in sistem 3D prezina diferente morfologice, funcționale si un răspuns alterat la tratament si factori de creștere fata de celulele cultivate in sistem 2D, acest sistem nu reușește sa mimeze suficient micromediul tumora! Întrucât la generarea sferelor au fost utilizate numai celule tumorale provenite din linii celulare fara sa se utilizeze celule stromale care, asa cum a fost demonstrat in numeroase studii au un rol esențial in micromediul tumoral.

Recent, intr-un studiu publicat de Yu Takahashi si colaboratorii (Yu Takahashi, Yuji Hori, Tomohisa Yamamoto, Toshiki Urashima, Yasunori Ohara and Hideo Tanaka. 3D spheroid cultures improve the metabolic gene expression profiles of HepaRG cells Biosci Rep. 2015 May 7:35(3). pii: e00208. doi: 10.1042/BSR20150034) a fost descrisa pentru prima data cultivarea celulelor hepatice: intr-un sistem 3D. Acest studiu a avut ca scop obținerea unui sistem simplu de cultura 3D, care sa nu implice utilizarea de biomateriale si in care funcțiile hepatice specifice sa fie cat mai reproduse, astfel incat sa poata fi utilizat in screening-ul de noi compuși terapeutici sau in teste funcționale si farmacologice. Pentru realizarea acestui sistem au fost utilizate doua Linii celulare tumporale hepatice (HepaRG si HepG2) care au fost cultivate intr-un sistem de cultivare in picătură GravityPLUS Systems (Insphero). Cultivarea celulelor sub forma de sfere a dus la creșterea secreției de apoiipoprotein B si albumina (considerata un marker al funcției hepatic), comparativ cu sistemul de cultura 2D. De asemenea, s-a observat ca expresia genelor implicate in metabolismul glucidelor, medicamentelor si lipidelor a crescut semnificativ in sferele HepaRG.Cu toate ca acest model a demonstrat o imbuntatire a funcțiilor caracteristice celulelor hepatice atunci când au fost cultivate in sistem 3D, in vivo ficatul este format din mai multe tipuri de celule, iar co-cultivarea in sistem 3D a celulelor tumorale împreuna cu alte tipuri de celule hepatice ar permite o mai buna reprezentare in vitro a funcțiilor hepatic.

In brevet US9334473 B2, autorii propun pentru crearea unor sisteme de cultura 3D utilizarea unei matrici formata dintr-un component absorbent rigid (de regula din fibra de sticla), iar in unele cazuri includ si un gel. Utilizarea unui astfel de sistem pentru crearea unor matrici extracelulare poate induce anumite modificări in celulele tumorale afectând proliferarea si diferențierea celulara, si nu substituie prezența celulelor stromale si a micromediului tumora!.

In brevetul nr.US 2013/0295578 Al, Sempere si colaboratorii au propus o metoda de screening pentru rezistenta la medicamente in tesut tumoral ex vivo care implica utilizarea un sistem de culturi celulare 3D ce mimeaza micromediul tumoral. In acest scop, autorii propun cultivarea celulelor obținute din biopsie in Matrigei 3% utilizat cu scopul de a mima matricea extracelulara, cu sau fara alte componente de tip colagen I, colagen IV, laminina si fibronectina. Totuși, modificarea micromediului celulelor din tumora prin plasarea lor directa in Matrigei 3%, cu sau fara alte componente, fara o perioada de

AsaTîyhstifUtu! oneo ogtc ’Prol In t

InstitutulCI jfriTfîjiîtSeii t

Institutul de Virusologie “Ștefan S.friicolaft” / f

Conf

institutul de Biologie si - _____________.

Celulara Nicolae Simtoisiesfeu”:i f ro^tioroafixC jAcad, Maya Simkinesyy, VWja$ \\ sss . x·· ^Si •X \ _s ^s \ ^s a 2016 00927

28/11/2016 acomodare, poate determina modificări morfologice si funcționale la nivelul celulelor din sistemul 3D care pot influenta rezultatul testelor de rezistenta 1a citostatice.

Problema pe care invenția actuala o rezolva este stabilirea unei metode de realizare a chemogramei personalizate utilizata la investigarea unor noi medicamente anti-tumorale specifice pentru celulele tumorale, pentru celulele stromale sau pentru ambele, pe baza unor sisteme organotipice de pancreas. In final invenția aduce beneficii in managementul clinic pacientului cu cancer pancreatic. Sistemul organotipic PCI-35/PSC, pe care invenția actuala il propune, este potrivit pentru investigarea sensibilității terapeutice la medicamente, surmontand dificultățile create de modelele tipice convenționale 2D, care nu reproduc micromediul existent in vivo, avand astfel o putere limitata de predicile in eficacitatea clinica, precum si reducerea costurilor si a timpului necesare in testările pe modele animale si in studiile clinice.

Soluția pe care o propune prezenta invenție este stabilrea unei strategii de obținere a unui model de sistem organotipic de pancreas prin co-cultivarea in matrita 3D, sub forma de sferoizi a celulelor pancreatice din tumora pacientului Împreuna cu celule stromale (denumite PSC), separate in cadrul protocolului de izolare al insulelor pancreatice pentru transpalant, pentru imbunatatirea investigării eficientei strategiilor antitumorale si realizarea chemogramei personalizate.

Metoda conform invenției permite obținerea unei culturi 3D de pancreas folosind celule ADPK cocultivate cu PSC in sisteme polimerice recreând caracteristici reprezentative ale nișelor tumorale ale tumorilor in vivo, acest sistem fiind util pentru realizarea chemogramei personalizate a pacientului oncologic.

Avantajul metodei de stabilire a strategiei de obținere a unei chemograme personalizate pe baza unui sistem organotipic de pancreas consta iu faptul ca sistemului de co-cultura pancreatica 3D este superior in mimarea creșterii tumorii si a biologiei ei. Reproducând interacțiunea fizica si de activare intr-un tesut tumora!, modelul organotipic tumora! 3D oferă informații precise pentru selecția compusului si a tintei, reducând astfel răspunsul slab sau eșecul chimioterapiei in vivo in stadiile târzii. Sistem organotipic de pancreas permite screening-u\ si analiza simultana a unui număr mare de noi compuși cu scopul de a-i identifica pe cei eficienți sau pentru explorarea interacțiunilor inîra-tumorale si descoperirea țintelor si validarea lor. Nu in ultimul rând, modelul celular 3D oferă posibilitatea de a dezvolta o chemograma personalizata care creaza profilul eficacității medicamentelor asupra tumorii proprii fiecărui pacient cu cancer pancreatic.

Se prezintă in continuare 4 exemple ale invenției in legătură cu figurile:

Fig. 1. Morfologia PSC obținute din pancreas, celule fibroblastice, aplatizate, cu forma poligonala cu picaturi lipidice in citoplasmă, pasajul 2, 48 de ore in cultura (obiectiv 20x)

Fig. 2. Analiza celulelor PSC prin citometrie in flux; celulele prezintă CD90 (Thy-1) si CD 105 (endoglin) - dot-plot stanga sus si CD44 - dot-plot dreapta sus,

Fig, 3, Dinamica formarii sferoizilor timp de 1-7 zile in cultura (contrast de faza, obiectiv !0x).

Fig. 4. Analiza celulelor din co-cultura PCI-35/PSC in sistem 2D (A, 400X) si 3D (Β, 400X; C, 100X, după separarea din sferoid) prin imunofluorescenta pentru alfa-SMA (1) si beta-catenina (2).

Fig.5. Nivelurile de expresie a genelor GFAP, Nestin, BMP4, Notchl, SHH, WNT1 si vimentin in celule stelate pancreatice cultivate in sistem 2D (Roșu - PSC 2D), 3D (Verde - PSC 3D) si co-cultura PC1-35/PSC (albastru). Analiza s-a realizat comparativ cu linia de celule tumorale PCI-35 (cultura 2D).

Institutul ele Virusologie

N icolat’’/ 'Pf -Mika: S&uan j ' — - - —

Institut uîb-A n i

Institutul de Biolofii^’Fajgțogie, pl^siituiulOncaogu 'Po* L»r Celulara Nicoiae8ftnione«^.'^K' 1 AitXandnfTșîjuoreano;' _ , Acad. Ma>a Sifij ViK)

a 2016 00927

28/11/2016

Fig. 6. Nivelurile de expresie a genelor GFAP, Nestin comparativ cu linia de celule stern neurale STON,

Neurosfere celule stern neurale NECU - cărămiziu; co-cultura PCI-35/PSC - albastru; PSC 2D - roșu,

PSC 3D - verde.

Fig. 7. Analiza viabilității co-culturi de PCI-35/PSC in sistem 3D si 2D. A) Control co-cultura 3D tratata cu tampon fosfat salin; B) co-cultura 3D tratata cu 10 μΜ 5-FU; C) Control co-cultura 2D tratata cu tampon fosfat salin; D) co-cultura 2D tratata cu 10 μΜ 5-FU. Imaginile au fost colectate folosind un obiectiv de lOx.

Fig. 8. Cuantificarea toxicității induse de citostaticeie analizate - stabilirea chemogramei.

Exemplul 1: Obținerea culturii organotipice de pancreas ln experimentele noastre au fost utilizate celulele PCI-35, obținute dintr-un adenocarcinom de pancreas de către grupul profesorului A Horii, Japonia (Hitoshi Sekine; et al., Biochemical and biophysical research Communications 2012;429(3-4):214-9) si celule stromale izolate din pancreas normai denumite PSC.

Obținerea celulelor stromale/stem mezenchimale/stelate din pancreas s-a realizat in cadrul operației de izolare a insulelor pancreatice de Sa donor in moarte clinica de către o echipa formata din specialiști din Institutului Clinic Fundeni si Institutul de Virusologie. Izolarea insulelor pancreatice a fost efectuata in cadrul laboratorului GMP al Institutului Clinic Fundeni, in conformitate cu legislația romaneasca privind terapia cu celule, insulele au fost izolate din tesutul exocrin si conjunctiv înconjurător utilizând metoda Ricordi modificata, prin digestie cu colagenaza. Insulele pancreatice, împreuna cu resturile de tesut acinar si celule mezenchimale, au fost menținute in cultura in mediu CMRL si 10% BSA. La 24 de ore, celulele in suspensie (respectiv insulele) au fost recultivate in recipiente noi, iar celulele aderate (celulele stern mezenchimale/stelate) au fost menținute in alfaMEM suplimentat cu 10% ser fetal bovin, cu schimbarea mediului ia fiecare 2 zile pana la obținerea monostratului celular. Analiza fenotipica a PSC s-a realizat prin citometrie in flux (Beckman-Coulter Epics XL). Celulele au fost tripsinizate, spalate cu o soluție de TFS rece/ BSA 0,1% si incubate o ora cu anticorpi specifici (AbCam, Millipore) diluați in TFS conform recomandărilor producătorului. Rezultatele au fost evaluate in doua experimente individuale folosind programul FlowJo (Tree star, Inc.). Spre deosebire de celulele stern mezenchimale, monostratul de celule aderente pancreatice au prezentat o forma fibroblastica, plata, poligonala cu picaturi mici lipidice in citoplasmă (Fig. 1). Pe de alta parte, celulele PSC au prezentat markeri de celule stern cum sunt CD90 (Thy-1) si CD105 (endoglin). De asemeni, 99,8% din populația PSC au prezentat CD44, o glicoproteina de suprafața implicata in interactiile intercelulare, adeziune celulara si migrare, si doar, o mica fracție din populație a prezentat CD24, o molecula de adeziune celulara (Fig. 2).

Cultura 3D a fost obtinuta in micro-placi speciale. Matrițele pentru turnarea micro-placilor 30¹¹¹¹ au fost spalate cu apa distilata si sterilizate prin autoclavare timp de 30 de minute in ciclu uscat. Ig de agaroza pura, sterilizată prin autoclavare timp de 30 de minute in ciclu uscat, a fost fiarta in 50 mL de soluție salina sterila [0,9% (w/v) NaCI], in condiții aseptice, in cuptorul cu microunde jpana la dizolvare totala, după care a fost lasata sa se raceasca pana la 60 - 70 °C. Micro-placile 3D® au fost preparate prin pipetarea a 330 pL de agaroza topita in micro-maîrita, evitandu-se formarea bulelor de aer in timpul agitării sau pipetarii agarozei. Micro-placile 3D® au fost transferate in placi cu 24 de godeuri pentru culturi celulare. Micro-placile 30^' astfel obținute au fost echilibrate prin 3 spălări cu 1 mL/godeu de mediu de cultura, timp de 15 minute, la temperatura camerei. Celulele au fost tripsinizate, numărate si preparate suspensii celulare cu diferite concentrații de celule, in scopul obținerii unor sferoizi cu diametrul de 100 pm. Mediul de cultura din jurul si din interiorul micro-placilor 3D® a fost înlăturat si s1asi ttyț’-i I ae fo/fofen S sologie Rieoiatiy insti tu iu fefesîeAÎ .··.· \ . .

Cort,î^v Cțiiru Qr'an

Institutul cie Biologje^0^lîpîaj/țe:C\irist(!uii:l On·.-'logic “Pio>, Dr Celulara Nicolae-^Hnioi^^jg^· ‘'-Alexandre Țr^tiuteanu¹' . ''

Acad. Maya Siy'iio/jÎSCLi css ^Li-i _, 7% ... 2⁵ '2 - ț ^T''

TU' ' ir i « $/>' fo i a 2016 00927

28/11/2016 au pipetat cate 75 pL de suspensie celulara in interiorul micro-placilor 3D% Plăcile 30'^ au fost lasate in repaos timp de 10 minute pentru repartizarea celulelor in micro-godeuri, după care s-a adaugat cate 1 mL de mediu de cultura DMEM suplimentat cu 10% ser fetal bovin in fiecare godeu al placi cu 24 godeuri conținând sistemul de cultura 3D. Plăcile de 24 de godeuri au fost incubate ia 37 °C, in atmosfera umeda cu 5% CO₂. Formarea sferelor a fost urmărită zilnic ia microscopul inversat Cari Zeiss Microscop GmbH si fotografiate utilizând camera Axio CamMR (Zeiss). Cuntificarea mărimii sferelor s-a realizat utilizând softul Zen 2011 SPlx64.

Exemplul 2: Analiza morfologiei, proliferării si viabilității celulelor de ADKP in sistem 3D.

Pattern-ul de creștere si viabilitatea celulelor in micromediul de cultura 3D au fost urmărite in dinamica pe parcursul a 7 zile (Fig. 3). S-a observat ca PCI-35 nu a format sferoizi perfect rotunzi, celulele fiind Împrăștiate, iar dimensiunea conglomeratului celular fiind mai mare (de exmplu, dimensiunea medie a sferoidului la. 24 de ore era de aproximativ 250 um/12000 celule insamantate in micro-placa). In schimb, sferoizii formați de PSC au fost mai mici, mai uniformi si mai rotunzi, de aproximativ 180 pm/12000 celule insamantate inițial in micro-placa. Prin co-cultivarea PCI-35 cu PSC s-au obtinut sferoizi, rotunzi, de dimensiuni medii (aproximativ 220 pm). Morfologia sferoizilor in sistemul 3D pare a fi dependenta de tipul de celula: in timp ce PCI-35 nu formează sferoizi, iar celulele agrega in clustere din prima zi de cultura, celulele PSC formează sferoizi.

Analiza de rutina a viabilității celulelor in sistemele de cultura 3D este dificila datorita limitărilor legate de difuzia si trasportul in structurile celulare complexe 3D. Pentru a cuantifica viabilitatea celulara s-au utilizat comparativ 2 metode: testul de excludere a albăstruiul de tripan, evaluat folosind microscopie convenționala, si colorația cu fluorescein diacetat (FDA)/iodura de propidium (PI) in microscopie de fluorescenta. Determinarea viabilității celulare in sistemele 3D utilizând albastru de tripan a inclus un tratament prealabil de digestie enzimatică a sferelor cu soluție de tripsina-EDTA (0,25%, Gibco), iar suspensia monocelulara obtinuta a fost examinata prin procedura ciasica folosind camera de numărare Burker-Turk. In cazul utilizării colorației cu FDA/PI in microscopie de fluorescenta, sistemele 3D au fost evaluate ca atare. Prin colorare cu fluorescein diacetat (celulele apar colorate in verde) au fost puse in evidenta celulele vii si cu iodură de propidium (celulele apar colorate in roșu) au fost puse in evidenta celulele moarte.

Rata de dublare a celulelor in sferoizi, observata in microscopie de fluorescenta si prin colorație cu albastru de tripan, a fost asemanatoare. Diferența intre rezultatele obținute prin cele 2 metode a fost de mai puțin de 10%, aspect cauzat probabil de principiile diferite de estimare a viabilității celulare in fiecare din aceste metode. Rezultatele noastre arata ca, deși estimarea precisa a viabilității celulelor in culturile 3D este o operație dificila, colorația FDA/PI poate fi o soluție rezonabila pentru analiza de rutina a viabilității celulare in acest caz. Astfel, putem spune ca PCI-35 si PSC sunt capabile sa prolifereze in interiorul sferoidului co-cultura si după 7 zile.

Aceste rezultate arata ca celulele PCI-35, celulele PSC si co-cultura lor sunt capabile sa supraviețuiască si sa prolifereze in sferoizii care mimeaza îesuîul pancreatic. Spre deosebire de culturile de celule 2D, care au o rata de dublare de 24 de ore, in sferoizi celulele au proliferat cu o rata relativ scăzută, caJculandu-se un timp de dublare de aproximativ 8 zile, Sferoizii multicelulari reprezintă analogi tridimensionali ai țesutului ceea ce oferă oportunitatea testării de medicamente in vitro, deoarece mențin parametrii fiziologici critici prezent! in vivo, incluzând arhitectura multicelulara complexa, matricea extracelulara, si barierele de penetrare a nutrientilor si medicamentelor. Funcțiile si răspunsul celulelor la nivel tisular sunt adesea pierdute in culturile convenționale 2D limitând capacitatea predictiva a .,---Institutul de Virusologie 4i c oj a uf Γfir MslUi iroijn/

hisiîțs^fUfȘȘC'Eundeni ^obt 'Li 5zu meu fon

Institutul de Biologie si p£$îîp|fo^A ί ÎMXîjfuiui C itolo^e Prof fi Celulara Nicolae 5ΐΜφ^υ“^,;._:|^ΐ6Χ«ήόι·υΤΓ64>.)?χ^)Η ' Acad. Maya Sinirpnes^FJ 6r Lî^jîi-AsA o

-, ' I \

' “ î s r β»^-'' a 2016 00927

28/11/2016 metodei. De aceea este necesara dezvoltarea tehnicilor / sistemelor de cultura 3D, bine caracterizate, simple, reproductibile si care sa fie similare fiziologiei țesuturilor.

ExempIu I 3: Analiza fenotipica comparativa a sitemelor de co-cultura 2D si 3D

Pentru analiza comparativa a expresiei alfa-SMA si beta-catenina in culturile 2D si 3D, sferele si celulele individuale din sistemele 3D de co-cultura ADKP/PSC, respectiv 2D, au fost recoltate si fixate in etanol 70%. Sferele si celulele au fost spalate cu soluție rece de TFS si BSA 0,1% si incubate o ora cu anticorpi monoclonali anti-SMA alfa (Santa Cruz, SC-53Î42) sau anticorpi monoclonali anii betacatenina (Santa Cruz, SC-59737). Ulterior, probele au fost incubate cu un anticorp secundar anti-mouse cuplat cu FITC (Light DIAGNOSTIC Chemicon), iar analiza comparativa a cele doua sisteme a fost realizata pe imaginile capturate folosind Leica DM IL Fluo cu aplicația Leica Suite.

Analizând prin imuno fluorescenta expresia alfa-SMA in co-culturile 3D comparativ cu culturile 2D s-a putut observa expresia mult mai redusa a acestei proteine in culturile 2D comparativ cu nivelul de expresie in sferoizii obținuți in culturile 3D (Fig. 4). Acest lucru indica activarea celulelor PSC in cocultura 3D, fapt explicabil prin hipoxia descrisa in astfel de sferoizi. Sistemele noastre de co-cultura 3D par a fi capabile sa imite starea hipoxica din centrul sferelor si activarea PSC prin creșterea nivelului expresiei α-SMA evidenta, aceasta fiind o caracteristica tipica in creșterea tumorala si invazivitate. Hipoxia este un proces important ee poate afecta funcționalitatea PSC in sferoizii cultivat! 3D, dar si in tumorile pancreatice cunoscute ca fiind hipovasculare si cu celule tumorale care proliferează eficient in condiții hipoxice. Sistemul nostru organotipic de pancreas (co-cultura 3D) imita mult mai bine decât o co-cultura 2D interacțiunile intra-tumorale si ar putea fi mai potrivit pentru investigarea mecanismelor care favorizează creșterea tumorala si, de asemenea, pentru testarea de medicamente anti-tumorale mai eficiente.

Caracterizarea PSC inițiate din pancreas uman si a co-culturii cu celule tumorale (PCI-35) a constat in evaluarea expresiei genelor GFAP (glia! fibrillary acidic protein) si nestina, precum si a altor gene, cum ar fi: BMP4 (bone morphogenetic protein 4), Notchl, SHH (Sonic HedgeHog), WNT1 (Wingless-Type MMTV Integration SiteFamily Member i) si vimentin, prin RT-PCR semicantitativ. Pentru aceasta, celulele cultivate in sistem 2D si 3D au fost colectate si s-a extras ARN total cu Trizol (Invitrogen, USA) conform indicațiilor producătorului. ARN-ul total (2 pg) a fost revers-transcris folosind kit-ul High Capaciiy cDNA Reverse Transcription cu inhibitori pentru RN-aze (Applied Biosystems). O cantitate de 50 ng cDNA a fost supus reacției de real time PCR (qPCR) pentru expresia genelor GFAP, nestina, BMP4, Notchl, SHH, WNT1 si vimentin folosind Taqman Gene Expression Assay conform indicațiilor producătorului (Applied Biosystems). Ca si control endogen s-a folosit beta-actina umana. Fiecare experiment a fost lucrat in triplicat. Pentru a compara nivelul relativ de expresie s-a utilizat metoda AACț. Compartiv cu linia de celule tumorale PCI-35, celulele PSC crescute in sistem 2D au prezentat o expresie crescută a ARNm GFAP si nestin. Expresia acestor markeri a fost mai scăzută in PSC menținute in sistemul 3D si mult scăzută in co-cultura 3D PCI-35/PSC (Fig. 5). De remarcat a fost faptul ca atat expresia GFAP cat si a nestinei a fost mult mai mica comparativ cu celulele stern neurale tumorale NECU si STON (care cresc normal sub forma de neurosfere) (Fig. 6). Expresia scăzută a acestor markeri in sistemul co-cultura 3D PCI-35/PSC ar putea fi explicata prin modificările progresive ale expresiei nestinei si GFAP care au loc in timpul etapelor-cheie in diferențierea tipurilor celulare. De aceea, presupunem ca diferențierea ar putea fi indusa sub influenta semnalelor si factorilor de creștere produși in micromediu de celulele APKD.

a 2016 00927

28/11/2016

Exemplul 4: Analiza calitativa (IF) si cantitativa (CellTiter-Glo®) a toxicității induse de citostatice Pentru analiza calitativa a toxicității induse de citostatice, celulele cultivate in sistem 2D si in sistem 3D au fost menținute in cultura 7 zile si apoi, tratate cu 10 μΜ 5-Fluorouracil (5-FU; Teva Parenteral Medicines) diluat in TFS (Invitrogen) exact Înainte de folosire, sau cu un amestec 1:1 de doua extracte hidro-alcooiice obținute din cătină roșie (Tamarix gallicd) si armurariu (Sylibum marianum). După 24 de ore, s-a evaluat răspunsul la tratament in culturile 3D versus culturile 2D folosind 10 pL din soluția stoc cu concentrația de 1 mg/mL FDA/PI (Fig. 7). S-a observat ca in condițiile culturii 3D celulele PCÎ-35 au fost mai rezistente la 10 μΜ 5-FU. Rezultatele sunt datorate integrității sferoizilor 3D, fund mult mai dificil pentru acești compuși sa difuzeze si sa penetreze in centrul masei celulare. Mai mult, 5-FU un blocant al proliferării celulare, tinteste celulele aflate in proliferare, si nu afecteaza celulele dormande din sferoid.

Pentru analiza cantitativa a toxicității induse de citostatice, culturile de celule in sistem 3D au fost obținute in placi HDP1096 Perfecta.3D in picătură suspendata cu 96 de godeuri (3D Biomatrix, SUA). In acest scop au fost create sisteme de cultura 3D formate din celule tumorale PCi-35 si sisteme 3D de co-cultura PC135/HpaSteC in raport de 1:1 in mediu de cultura DMEM suplimentat cu 10% ser fetal bovin. Plăcile HDP1096 Perfectau D® in picătură suspendata cu 96 de godeuri (3D Biomatrix, SUA) reprezintă un ansamblu format dintr-o tava inferioara, o placa intermediara cu orificii pentru formarea picaturilor suspendate si capac. Placa intermediara si tava inferioara sunt prevăzute pe marginea periferica cu rezervoare, separate de ecrane deflectoare in secțiuni, acestea putând fi umplute cu apa distilata sau agaroza 0,5 - 1% pentru a evita evaporarea mediului de cultura din picaturile suspendate in cazul unor incubari Îndelungate. Pentru obținerea sistemelor de cultura 3D, celulele au fost tripsinizate, numărate si preparate suspensii celulare cu o densitate de 5000 de celule / 40 pL. “Picaturile suspendate” au fost obținute prin pipetarea a cate 40 pL din suspensia celulara per godeu/orificiu in placa intermediara. In rezervoarele situate pe marginea periferica a plăcii si a tăvii a fost adaugata apa distilata pentru a evita evaporarea mediului de cultura pe perioada incubarii. Plăcile au fost incubate la 37 °C, in atmosfera umeda cu 5% CO?. pentru a permite formarea sferelor. După 72 de ore, sferele formate au fost transferate prin fixarea placiilor intermediare pe placi albe de 96 de godeuri (NUNC, SUA) si centrifugare timp de 5 minute la 300 x g. Analiza toxicității citostaticelor in sistem 3D s-a realizat comparativ cu sistemele de cultura 2D. Pentru sistemul 2D, celulele au fost tripsinizate, numărate si insamantate in placi albe de 96 de godeuri (NUNC, SUA) la o densitate de 5000 de celule per godeu. Plăcile au fost incubate Sa 37 °C, in atmosfera umeda cu 5% CO2 timp de 24 de ore.

Pentru a evalua eficienta utilizării sistemelui de co-cultura 3D elaborat in determinarea citotoxicitatii/rezistentei unor medicamente utilizate in tratamentul ADKP, sistemele de cultura 3D, cit si cele 2D, au fost tratate cu 5-fluorouracil, gemcitabina, oxaliplatin, cisplatin si sorafenib. în acest scop, medicamentele au fost supuse unor dilutii seriale binare, concentrația finala testata variind intre 2,44 μΜ si 5 mM pentru 5-fluorouracil, gemcitabina si oxaliplatin, si intre 0,05 - 100 μΜ pentru cisplatin si sorafenib. Sistemele de cultura 2D si 3D au fost supuse tratamentului timp de 72 de ore ia 37 °C, in atmosfera umeda cu 5% CO₂. Viabilitatea celulara a fost determinata folosind kitul CelITiter-Glo® (Promega, G7572). Tamponul CelITiter-Glo® a fost decongelat si echilibrat, împreuna cu substratul CelITiter-GIo® liofilizat, ia temperatura camerei înainte de utilizare. Substratul liofilizat a fost reluat in tamponul CelITiter-Glo® si omogenizat prin agitare. Pentru determinarea viabilității celulelor cultivate in sisteme de cultura 2D sau 3D si supuse tratamentului cu medicamente antitumorale, in fiecare godeu a fost adaugat un volum egal de reactiv CellTiîer-GSo®. Plăcile au fost incubate la temperatura camerei timp de 10 minute pentru a permite stabilizarea semnalului luminescent. Luminiscenta a fost citita la un

Institutul de Virusologie “Ștefan iNicota

Inspttrțiîi CiiTnc'Pnrdeni

ConA Ut Cat tîienvi Hșn

Institutul de Biologie.djFatqiogje ₄ Ceiuiara Nicoiae Sjnaones^S*^*^ Acad. Mava Siiniorfeți hiftițutul Oncologic P.rqf, Dr.

AI^XndruTțesforeasnP . :

ia-A/tca

a 2016 00927

28/11/2016 aparat FilterMax F5 Multi-Mode Microplate Reader (Molecular Devices, SUA), iar rezultatele au fost interpretate utilizând soft-ul GraphPad Prism (GraphPad Software inc., SUA). Cuantificarea toxicității induse de citostaticele analizate (prezentata in tabelul 1) arata o reducere a sensibilității la medicament in sistemul 3D comparativ cu sistemul 2D demonstrând ca integritatea sferelor din sistemele 3D potenteaza dificultatea de pătrundere a tratamentului (medicamentelor) spre centrul masei de ceiuie intrun tesut tumoral si susține importanta micromediului înconjurător tumoral asupra eficientei chimioterapiei.

Tabel 1. Cuantificarea toxicității induse de citostaticele analizate (1C50).

TIP CULTURA	1C5O (μΜ)
5- Fluorouracil	Oxaliplatin	Cisplatin	Sorafenib
PCI-35 2D	100,3	62,1	29,87	5,91
PCI-35 3D	373,5	84,75	45,82	9,07
Cocultura 2D	85,83	38,9	22,27	6,15
Cocultura 3D	445,1	100,8	59,97	7,021

*Cocultura - co-cultura PCI-35 cu HPaSteC in raport 1:1 j Institutul de Virusologie

I 2 xîlSțfeȘ lĂliSSÎSiI Dr WiSi

-----C^if :6rț-Cattîj«iții Oțbaș

----------------------------------->A_- · Λ J- .**· - . Λ- + ,......................_rț .................

Institutul de si P^obgîe<>?{ Institutul Prof.-Dr

Celulara Nicolăe S&miondȘte.: fi Alexandru/rre^f4rețfetp'^v

-—-fs—--’ — ----^A ... a. r............

Acad. Mavh\S?mij5tteg&Xv ‘ • · Ή · · \v\ a 2016 00927

28/11/2016

Claims (1)

1. Invenția se refera Ia o metodă de stabilire a chemogramei personalizate utilizata in managementul pacientului eu cancer pancreatic. Metoda conform invenției are următoarele etape:

   obținerea celulelor pancreatice si/sau stromale din tumora pacientului co-cultivarea in matrita 3D, sub forma de sferoizi a celulelor pancreatice din tumora pacientului împreuna cu celule stromale (denumite PSC), separate in cadrul protocolului de izolare ai insulelor pancreatice peniru transpalant.

   investigarea eficientei strategiilor antitumorale si realizarea chemogramei personalizate.

   Metoda conform invenției permite obținerea unei culturi 3D de pancreas folosind celule ADPK cocuitivate cu PSC in sisteme polimerice recreând caracteristici reprezentative ale nișelor tumorale ale tumorilor in vivo, acest sistem fiind util peniru realizarea chemogramei personalizate a pacientului oncologic.