KR20190008541A - 생체공학적 조직용 조성물 및 방법 - Google Patents

생체공학적 조직용 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20190008541A
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epithelial
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mesenchymal
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아리엘 던 핸슨
미츠오 야마우치
엘리안느 루시에 와우티에르
티모시 안-히에우 딘
프라빈 세투패시
로라 엠. 레이드
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더 유니버시티 오브 노스캐롤라이나 앳 채플 힐
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Abstract

본 발명은 장치를 따라 생체공학적 조직을 생산하는 방법 및 이의 생성에 사용되는 다른 관련 조성물을 제공한다.

Description

생체공학적 조직용 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 5월 11일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 제 62/335,013호 및 2017년 5월 3일자로 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 제 15/586,061호에 대해 35 U.S.C. 119(e) 하에 우선권을 주장하며, 두 출원은 모두 본원에 참고로 포함된다.
배경
본 발명의 배경에 관한 이하의 논의는 독자가 본 발명을 이해하는 것을 돕기 위해 제공되는 것일 뿐이며, 본 발명에 대한 선행 기술을 기술하거나 이를 구성하는 것으로 인정되지 않는다.
스페로이드(spheroid) 및 오가노이드(organoid) 배양 시스템 및 기타 기관 모델링 방법은 천연 조직에서 발견되는 것에 더 가까운 세포 구성 및 극성의 형성을 용이하게 한다. 클로닝된 세포 집단으로부터 전적으로 유래된 배양물은 특정한 이점을 가지지만, 재생 의학에서 3차원 조직화, 세포 극성, 상피-중간엽 상호 작용 및 세포와 이의 기능을 안정화시키는 역할을 하는 상피-중간엽 관계로부터의 측분비 신호의 중요성에 대한 인식이 증가하고 있다.
기관 및 오가노이드 조직을 성장시키는 종래의 방법은 미니 스케일 모델로 제약되는데, 이는 모델 기관의 혈관 및 조직학적 구역화(zonation)를 모방하지 않는 혈관 지지 및 조직의 부재하에 많은 수의 세포가 지속될 수 없기 때문이다. 따라서, 생체공학적 조직을 생성하는 규모 조정이 가능하고 안정한 방법에 대한 필요성이 남아 있다.
발명의 요약
본 발명의 양태는 생체공학적 조직 또는 미세 기관(micro-organ)을 생산하고 사용하기 위한 조성물, 키트, 및 방법, 및 이의 생성을 위해 구성된 컨테이너에 관한 것이다.
본 발명의 양태는 생체공학적 조직을 생성하기 위한 컨테이너에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 생성은 상피 세포 및/또는 중간엽 세포를 바이오매트릭스 스캐폴드(biomatrix scaffold) 내로 또는 바이오매트릭스 스캐폴드 상으로 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 생성은 실질 및/또는 비-실질 세포를 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 서로에 대한 계통 단계 파트너이다. 본 발명의 양태는 세포외 매트릭스를 포함하는 3차원 스캐폴드에 관한 것이며, 이 3차원 스캐폴드는 결과적으로 (i) 기관에서 발견되는 천연 콜라겐 및/또는 (ii) 기관에서 발견되는 혈관계(vascular tree)의 매트릭스 잔재를 포함한다.
일부 구현예에서, 바이오매트릭스 스캐폴드는 콜라겐을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이오매트릭스 스캐폴드는 (1) (i) 신생 콜라겐, (ii) 응집된 그러나 가교되지 않은 콜라겐 분자, (iii) 가교된 콜라겐 및 (iv) 이러한 다양한 형태의 콜라겐에 결합된 인자 (매트릭스 성분, 신호전달 분자, 다른 인자)를 포함하고 그리고/또는 (2) 조직에서 발견되는 대다수의 가교된 및 가교되지 않은 천연 콜라겐 둘 모두를 이들 콜라겐에 결합된 매트릭스 분자 및 신호전달 분자와 함께 포함한다. 일부 구현예에서, 바이오매트릭스 스캐폴드는 3차원이다. 일부 구현예에서, 바이오매트릭스 스캐폴드는 하나 이상의 콜라겐 관련 매트릭스 성분, 예를 들어 그 매트릭스 성분과 관련된 라미닌, 니도겐, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 하이알루로난, 비-황산화 글리코사미노글리칸, 및 황산화 글리코사미노글리칸 및 성장 인자 및 사이토카인을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이오매트릭스 스캐폴드는 생체 내에서 발견되는 매트릭스 결합 신호전달 분자의 50% 초과를 포함한다. 일부 구현예에서, 매트릭스 결합 신호전달 분자는 표피 성장 인자 (EGF), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 인슐린 유사 성장 인자 (IGF), 형질전환 성장 인자 (TGF), 신경 성장 인자 (NGF), 신경 영양 인자, 인터류킨, 백혈병 억제 인자 (LIF), 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 줄기 세포 인자 (SCF), 콜로니 자극 인자 (CSF), GM-CSF, 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, 헤파린 결합 성장 인자, IGF 결합 단백질, 태반 성장 인자, 및 wnt 신호일 수 있다. 일부 구현예에서, 바이오매트릭스 스캐폴드는 조직의 혈관계의 매트릭스 잔재를 포함한다. 추가의 구현예에서, 매트릭스 잔재는 생체공학적 조직에서 세포의 혈관 지지를 제공할 수 있다
일부 구현예에서, 세포가 시딩(seeding) 배지 중에 있는 경우, 생성은 초기 인큐베이션 기간 후에 시딩 배지를 분화 배지로 교체하는 것을 추가로 선택적으로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포가 시딩 배지 중에 있는 경우, 세포는 다수의 간격으로 도입되고, 각각의 간격에는 휴지 기간이 뒤따른다. 일부 구현예에서, 간격은 약 10 분이고, 휴지 기간은 약 10 분이다. 일부 구현예에서, 시딩 밀도는 바이오매트릭스 스캐폴드의 습윤 중량 그램당 1200 만개 미만 또는 약 1200 만개 이하의 세포이며, 1회 이상의 간격으로 도입된다. 일부 구현예에서, 시딩 배지 중의 세포는 1회 이상의 간격 동안 약 15 ml/분의 속도로 도입된다. 일부 구현예에서, 시딩 배지 중의 세포는 10 분 간격으로 도입되고, 각각 10 분의 휴지 기간이 뒤따른다. 일부 구현예에서, 시딩 배지 중의 세포는 3회의 간격 후에 1.3 ml/분의 속도로 도입된다.
일부 구현예에서, 시딩 배지는 무혈청 시딩 배지를 포함한다. 일부 구현예에서, 시딩 배지는 혈청, 선택적으로 약 2% 내지 10%의 소 태아 혈청 (FBS)과 같은 태아 혈청으로 보충된다. 일부 구현예에서, (예를 들어, 세포 현탁액을 제조하는데 사용되는 효소를 비활성화시키기 위해) 배지의 혈청 보충이 필요할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 보충은 수 시간에 걸쳐 수행된다.
일부 구현예에서, 시딩 배지는 기초 배지, 지질, 인슐린, 트랜스페린, 및/또는 항산화제를 포함한다. 일부 구현예에서, 시딩 배지는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 기초 배지, 저 칼슘 (0.3 내지 0.5 mM), 구리 비함유, 아연 및 셀레늄, 인슐린, 트랜스페린/fe, 및 정제된 알부민과 선택적으로 복합체화된 하나 이상의 정제된 유리 지방산 (예를 들어, 팔미틴산, 팔미톨레인산, 스테아린산, 올레인산, 리놀레인산, 리놀렌산), 및 고밀도 지질단백질 (HDL)과 같은 하나 이상의 지질 결합 단백질. 일부 구현예에서, 시딩 배지는 낮은 산소 농도 수준 (1% 내지 2%)으로 사용될 수 있거나, 이를 포함 또는 유지한다.
일부 구현예에서, 세포는 도입 단계 전에 4 내지 6 시간 동안 시딩 배지에서 4℃에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 세포는 태아 또는 신생아 기관으로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 중간엽 세포는 간질, 내피세포, 또는 조혈 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 성인 또는 아동(child) 기증자로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 상피 또는 실질 세포는 담도계 줄기 세포, 담낭 유래 줄기 세포, 간 줄기 세포, 간모세포, 수임 간세포 및 담즙 전구세포, axin2+ 전구세포 (예를 들어, axin2+ 간 전구세포), 성숙 실질 또는 상피 세포, 성숙 간세포, 성숙 담관세포, 췌장 줄기 세포, 췌장 수임 전구세포, 섬 세포, 및/또는 선방 세포 중 어느 하나 이상일 수 있고 그리고/또는 중간엽 또는 비-실질 세포는 혈관모세포, 성상 세포 전구체, 성상 세포, 중간엽 줄기 세포, 혈관 주위 세포, 평활근 세포, 간질 세포, 신경 세포 전구체, 신경 세포, 내피 세포 전구체, 내피 세포, 조혈 세포 전구체, 및/또는 조혈 세포 중 어느 하나일 수 있다. 일부 구현예에서, 상피 또는 실질 세포는 담도계, 간, 담낭, 간-췌장 공통관으로부터의 줄기 세포 및/또는 그 후손일 수 있고/있거나, 중간엽 또는 비-실질 세포는 혈관모세포, 내피 및/또는 성상 세포 전구체, 중간엽 줄기 세포, 성상 세포, 간질 세포, 평활근 세포, 내피세포, 골수 유래 줄기 세포, 조혈 세포 전구체, 및/또는 조혈 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 상피 또는 실질 세포는 axin2+ 전구세포 (예를 들어, axin2+ 간세포 또는 간 전구세포), 성숙 세포 (예를 들어, 성숙 간세포, 성숙 담관세포), 다배체 세포 (예를 들어, 다배체 간세포) 및 아폽토시스 세포와 같은 그러나 이에 제한되지 않는 분화된 실질 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 성숙 세포는 굴모양의(sinusoidal) 내피세포와 관련될 수 있으며, 그 중 일부는 유창 중간엽 세포 (예를 들어, 내피 세포)일 수 있다. 일부 구현예에서, axin2+ 전구 세포 (예를 들어, axin2+ 간 전구세포)는 내피 세포에 테더링(tethering)될 수 있다. 일부 구현예에서, 상피 또는 실질 세포는, 선택적으로 성숙 내피세포, 및/또는 성숙 선방 세포와 관련되고/되거나 선택적으로 성숙 간질과 관련된, 성숙 섬이다. 일부 구현예에서, 세포의 비는 내피 대 중간엽 또는 실질 대 비-실질이 80% 대 20%이다. 일부 구현예에서, 세포는 적어도 50%가 줄기 세포 및/또는 전구체 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 임의의 최종 분화된 간세포 및/또는 췌장 세포를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 상피 또는 실질 세포는 줄기 세포, 수임 전구세포, 이배체 성체 세포, 다배체 성체 세포, 및/또는 최종 분화된 세포 중 하나 이상일 수 있고/있거나 중간엽 또는 비-실질 세포는 혈관모세포, 내피세포의 전구체, 성숙 내피세포, 간질의 전구체, 성숙 간질, 신경 전구체 및 성숙 신경 세포, 조혈 세포의 전구체, 및/또는 성숙 조혈 세포 중 하나 이상일 수 있다.
일부 구현예에서, 세포의 조성은 요망되는 조직에 대해 조정될 수 있는데, 예를 들어 간 세포가 생체공학적 간 조직에 대해 특정 비율로 사용될 수 있거나 췌장 세포가 생체공학적 췌장 조직에 대해 특정 비율로 사용될 수 있다. 예를 들어, 간의 경우, 상피 세포는 담도계, 간, 간-췌장 공통관, 및/또는 담낭으로부터의 줄기 세포 (예를 들어, 담도계 줄기 세포) 및 그 후손, 담도계 줄기 세포, 담낭 유래 줄기 세포, 간 줄기 세포, 간모세포, 수임 간세포 및 담즙 전구세포, axin2+ 전구세포 (예를 들어, axin2+ 간 전구세포), 성숙한 간세포, 및/또는 성숙 담관세포 중 하나 이상일 수 있고/있거나; 중간엽 또는 비-실질 세포는 혈관모세포, 성상 세포 전구체, 성상 세포, 중간엽 줄기 세포, 평활근 세포, 간질 세포, 내피 세포 전구체, 내피 세포, 조혈 세포 전구체, 및/또는 조혈 세포 중 하나 이상일 수 있다. 유사하게, 이러한 동일한 중간엽 또는 비-실질 세포가 췌장에 사용될 수 있고/있거나; 췌장에 대한 상피 세포는 담도계 줄기 세포 (예를 들어, 간-췌장 공통관으로부터의 줄기 세포), 췌장 줄기 세포, 췌장 수임 전구세포, 섬 세포, 담도계, 간-췌장 공통관, 또는 췌장으로부터의 줄기 세포 및 그 후손 및/또는 선방 세포를 포함할 수 있다. 추가의 구현예에서, 간의 경우, 최종 분화된 간세포가 배제될 수 있고, 췌장의 경우, 최종 분화된 췌장 세포가 배제될 수 있다.
일부 구현예에서, 분화 배지가 사용되는 경우, 분화 배지는 기초 배지, 지질, 인슐린, 트랜스페린, 항산화제, 구리, 칼슘, 및/또는 상피 세포, 중간엽 세포, 실질 세포, 및/또는 비-실질 세포 중 하나 이상의 증식 및/또는 유지를 위한 하나 이상의 신호를 포함하며, 이는 사용되는 세포에 좌우된다. 본 발명의 양태는 분화 배지 자체에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 분화 배지는 쿠보타 배지(Kubota's Medium); 하나 이상의 지질 결합 단백질 (예를 들어 HDL), 하나 이상의 정제된 지방산 (예를 들어, 팔미틴산, 팔미톨레인산, 스테아린산, 올레인산, 리놀레인산, 리놀렌산), 하나 이상의 당 (갈락토스, 글루코스, 프룩토스), 하나 이상의 글루코코르티코이드 (예를 들어, 덱사메타손 또는 하이드로코르티손), 구리 (예를 들어, 약 10-10 내지 대략 또는 약 10-12 M의 농도); 칼슘 (예를 들어, 0.6 mM의 농도); 프롤락틴, 성장 호르몬, 글루코코르티코이드, 글루카곤, 갑상선 호르몬 (예를 들어, 트리-요오도티로닌 또는 T3), 표피 성장 인자 (EGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 인슐린 유사 성장 인자 (IGF), 백혈병 억제 인자 (LIF), IL6 및 IL11과 같은 인터류킨 (IL), wnt 리간드, 골 형성 단백질 (BMP), 및/또는 고리형 아데노신 일인산염으로부터 선택되는 상피 또는 실질 세포의 증식 및/또는 유지를 위한 하나 이상의 호르몬 및/또는 성장 인자, 및/또는 안지오포이에틴, 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF), 인터류킨 (IL), 줄기 세포 인자 (SCF), 백혈병 억제 인자 (LIF), 콜로니 자극 인자 (CSF), 트롬보포이에틴, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 에리트로포이에틴, 인슐린 유사 성장 인자 (IGF), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 표피 성장 인자 (EGF)로부터 선택되는 중간엽 또는 비-실질 세포의 증식 및/또는 유지를 위한 하나 이상의 호르몬 및/또는 성장 인자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 분화 배지는 대략 5%의 산소 수준으로 사용될 수 있거나, 이를 포함 또는 유지한다.
일부 구현예에서, 컨테이너는 세포의 혈관 지지를 모방하도록 고안된 유체용 유로를 위해 고안된다.
본 발명의 양태는 천연 간의 특징을 이루는 구역화 의존성 표현형 형질을 포함하는 생체공학적 조직에 관한 것이며, 상기 표현형 형질은 (a) 줄기/전구 세포, 이배체 성체 세포, 및/또는 관련 중간엽 또는 비-실질 전구체 세포의 형질을 갖는 문맥 주위 영역, (b) 성숙 담즙 상피세포 (예를 들어 담관세포) 및/또는 관련 성숙 성상 및 간질 세포, 굴모양의 내피세포 및/또는 혈관 주위 세포 (즉, 평활근 세포)와 같은 그러나 이에 제한되지 않는 성숙 실질 세포 (예를 들어, 간세포) 및/또는 관련 중간엽 세포의 굴모양의 판의 형질을 지닌 세포를 갖는 중간-선방(mid-acinar) 영역, (c) 다배체 간세포 및 아폽토시스 간세포를 포함하는 간세포와 같은 그러나 이에 제한되지 않는 최종 분화된 실질 세포, 및/또는 유창 내피세포(fenestrated endothelia) 및/또는 내피세포에 테더링된 이배체 axin2+ 간 전구세포와 같은 그러나 이에 제한되지 않는 관련 중간엽 세포의 형질을 갖는 중심 주위 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 조직의 표현형 형질은 문맥 주위 구역의 이배체 실질 및/또는 중간엽 세포와 관련된 형질을 포함한다. 일부 구현예에서, 조직의 표현형 형질은 천연 간의 중간-선방 영역에서 발견되는 성숙 실질 세포 (예를 들어, 성숙 간 실질 세포) 및/또는 중간엽 세포 (예를 들어, 굴모양의 내피세포)의 형질을 포함한다. 일부 구현예에서, 조직의 표현형 형질은 중심 주위 구역의 실질 세포 (예를 들어, 간 실질 세포) 및/또는 중간엽 세포의 형질을 포함한다. 일부 구현예에서, 조직은 (i) 유창 내피 세포와 관련된 다배체 간세포, 및/또는 (ii) 문맥 주위의 이배체 간 전구세포 및/또는 중심 정맥의 내피세포에 연결되는 axin2+ 간 전구세포 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 조직의 문맥 주위 영역은 간 줄기 세포, 간모세포 및/또는 수임 전구세포 및/또는 이배체 성체 간세포를 포함하는 줄기/전구 세포 니치(niche)의 형질이 풍부하다. 일부 구현예에서, 조직의 실질 세포는 간세포 및/또는 담관세포의 전구체 및/또는 성숙 형태를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조직의 중간엽 세포는 성상 세포, 혈관 주위 세포, 평활근 세포 및/또는 내피세포의 전구체 및/또는 성숙 형태를 추가로 포함한다. 유사하게, 본 발명의 양태는 천연 췌장의 특징을 이루는 구역화 의존성 표현형 형질을 포함하고 그리고/또는 췌장의 머리에 있는 췌장 세포와 관련된 구역화 및 췌장의 꼬리에 있는 췌장 세포와 관련된 구역화를 포함하는 생체공학적 조직에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 중간엽 세포는 간질, 평활근 세포, 내피세포 및 조혈 세포를 포함하고; 추가의 구현예에서, 이러한 중간엽 세포는 구역화 의존성 형질을 나타낼 수 있다.
또 다른 양태는 3차원 미세 기관에 관한 것이다. 비제한적인 예는 개시된 컨테이너에서 생성되거나 개시된 생체공학적 조직으로 이루어진 3차원 미세 기관을 포함한다. 이러한 미세 기관의 생성 및 배양을 위한 키트도 본원에서 고려된다.
또한, 본원에는 생체공학적 조직 또는 3차원 미세 기관에 치료제를 투여하는 것을 포함하는, 기관에 대한 치료제를 평가하는 방법이 제공한다.
도 1은 탈세포화(decellularization) 후의 바이오매트릭스 스캐폴드의 특성 규명을 나타낸다. A) 새로운 조직과 비교한 바이오매트릭스 스캐폴드에서의 다양한 성장 인자의 유지 비율. B 내지 E) 주사 전자 현미경 (SEM)에 의해 영상화된 바이오매트릭스 스캐폴드의 초구조(ultrastructure). B) 간문맥 (PV), 간동맥 (HA) 및 담관 (화살표)을 함유한 간세동이(portal triad). C) 세포가 없음을 나타내는 바이오매트릭스 스캐폴드 내의 선방의 굴모양의 영역. D 내지 E) 콜라겐 번들 (*) 및 콜라겐에 결합된 부착 분자 (화살표). F 내지 O) 간 선방 내의 적당한 구역 위치에 있는 매트릭스 분자를 확인하는 면역조직화학. P) 새로운 조직과 비교한 스캐폴드 내의 콜라겐 함량의 정량 분석.
도 2는 3 개의 태아 간 조직으로부터 수득되고 바이오리액터에서 사용된 세포들 사이의 상대적인 유전자 발현의 RNA 시퀀싱 데이터를 도시한다
도 3은 배양 14일 후의 인간 태아 간 줄기/전구 세포의 조직학을 나타낸다. A 내지 D) 문맥 주위 영역에 위치한 세포의 마커. G) 글리코겐 저장을 입증하는 간 세포의 과요오드산 쉬프 (periodic acid schiff, PAS) 염색. H) P450 대사 효소인 Cyp3A4에 양성인 간세포. I) 혈관을 라이닝(lining)하는 내피 세포의 SEM 영상. 삽입된 영상은 혈소판 내피 세포 부착 분자 (PECAM)로도 일컬어지는 CD31에 대해 양성인 내피 세포의 영상이다.
도 4는 태아 간, 바이오리액터 조직 (Bio_T14), 및 성인 간 샘플의 상대적 발현의 RNA-시퀀싱을 도시한다. A) MMP-2 및 MMP-9와 같은 매트릭스 메탈로펩티다아제 (MMP)는 매트릭스 리모델링에 관여하는 효소이다. B 내지 E) 세포외 매트릭스 분자의 발현. 바이오리액터에서 성장한 세포는 다른 샘플과 비교하여 유의하게 높은 수준의 ECM 분자를 발현한다 (p<0.05). [Bio_T14 = 바이오리액터 번호 T14]
도 5는 문맥 주위 영역에서 발견되는 세포를 프로파일링하는 마커들의 상대적인 유전자 발현의 RNA-시퀀싱을 도시한다. 바이오리액터에서 배양된 세포는 줄기 세포 및 간모세포 마커의 유전자 발현이 유의하게 감소하였고, 담관세포 마커는 증가하였다 p<0.05. 이는 더 성숙한 표현형으로의 변화를 암시한다. p<0.05
도 6은 중심 주위 영역에서 발견되는 세포를 프로파일링하는 마커들의 상대적인 유전자 발현의 RNA-시퀀싱을 도시한다. 줄기 세포 및 전구 세포 마커의 감소와 병행하여, 바이오리액터에서 배양된 세포는 성숙 간 표현형쪽으로 계속 분화되었는데, 이는 성숙 대사 형질과 관련된 유전자의 증가된 발현에 의해 명백하다. p<0.05
도 7은 발현 검정의 결과를 나타낸다 A) 기관 크기를 조절하고 Hippo ("하마(hippopotamus) 유사") 키나아제 및 YAP (Yes 관련 단백질)을 포함하는 Saivador/Warts/Hippo (SWH) 경로라고 일컬어지는 피드백 루프 및 신호 전달 경로에 관한 유전자의 발현의 RNA 시퀀싱. 바이오리액터에서 배양된 세포는 태아 및 성인 간과 비교하여 Hippo 키나아제의 감소와 YAP 및 관련 표적 유전자의 상승을 나타내며, 이는 재생 과정이 진행중임을 암시한다. B) 배양 14일 후의 바이오매트릭스 스캐폴드에서의 혈관형성 마커의 유전자 발현 및 혈관을 라이닝하는 태아 간 내피 세포의 SEM 영상. C) 내피 전사 인자, GATA-2, 줄기 세포 인자 수용체 (SCR) 및 인터류킨 7R (IL7R)과 같은 조혈 및 내피 줄기 세포 마커 및 재조합 활성화 유전자 1 (Ragl), CD3 (T 세포 공동수용체) 및 콜로니 자극 인자 (CSF)와 같은 성숙 조혈 유전자의 상대적인 유전자 발현. 바이오리액터 샘플은 성인 간에서 발견되는 것과 유사한 CD3의 유전자 발현 수준과 상승하는 Rag1 발현을 가지며, 둘 모두는 T 세포와 관련된다. 골수 세포에 의해 발현되는 유전자인 CSF는 태아 및 성인 간 둘 모두에 비해 유의하게 높다. p<0.05
도 8은 다양한 검정의 결과를 나타낸다: A) 락테이트 탈수소효소 (LDH), 괴사의 지표인 전장 케라틴 18 (FL-K18), 및 아폽토시스의 지표인 절단된 사이토케라틴 18 (ccK18)로 표시되는 세포 생존력; 및 B) 배양 14일에 걸친 알파-태아단백질 (AFP) 및 알부민의 세포 생산과 요소의 분비. 알부민 수준의 상승과 하강은 아폽토시스 데이터를 보완하는 것으로 보였는데, 이는 세포 주기 현상과 재생 반응을 암시한다.
도 9는 바이오리액터에서 배양되어 글루코스신합성 또는 해당 과정을 겪고 있는 세포를 나타낸다. 글루코스의 생산 또는 소비의 변화는 또한 조직 공학적(tissu-engineered) 간의 발달의 변화에 상응할 수 있다. 글루코스신합성은 전구체 및 문맥 주위 세포에서 발생하는 반면, 해당 과정은 중심 주위 영역에 있는 세포와 관련된다. B) 바이오리액터의 대사 거동이 유사한 경향이긴 하지만 여전히 대사 기능의 다른 단계에 있음을 나타내는 다변수 분석. C) 투영시 변수 중요도 (VIP) 플롯은 분리에 기여하는 대사산물을 나타낸다. VIP>1.0이 중요한 것으로 간주된다.
도 10A 내지 도 10F는 배양 14일 후의 조직 공학적 간에서의 세포의 투과 전자 현미경 (TEM) 영상이다. A 내지 C) 담세관 (BC)을 형성하는 수 개의 간세포 유사 세포 및 이들 세포 사이의 굴모양의 공간 (화살표). B) 가능한 분비 소낭이 담세관 주위에 보인다 (화살표). D) 바이오매트릭스 스캐폴드에 부착성인 세포. E, F) 데스모솜(desmosome), 어드헤린(adherin) 및 갭 정션(gap junction) (화살표)을 포함하는 세포들 사이의 연접 복합체.
도 11은 바이오리액터 실험에 사용되는 바이오매트릭스 스캐폴드를 생성하는 래트 간에서의 탈세포화 과정의 영상이다.
도 12는 바이오리액터를 위해 고안된 무혈청 호르몬 한정 배양 배지 (BIO-LIV-HDM) 또는 상업적으로 이용 가능한 간세포 유지 배지 (HMM)에서 배양된 경우 간세포에 의한 알부민 및 요소 분비를 도시한다.
상세한 설명
이하에서, 본 발명에 따른 구현예를 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 양태들은 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 본원에 설명된 구현예들로 제한되는 것으로 해석되지 않아야 한다. 오히려, 이들 구현예는 본 개시가 철저하고 완전하며, 당업자에게 본 발명의 범위를 충분히 전달하도록 제공된다. 본원의 설명에 사용된 용어는 특정 구현예만을 설명하기 위한 것이며 제한하도록 의도되지 않는다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 용어 (기술 용어 및 학술 용어를 포함함)는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 통상적으로 사용되는 사전에 정의된 것과 같은 용어는 본 출원 및 관련 분야의 맥락에서의 그 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하고, 본원에 명백히 그렇게 정의되지 않는 한 이상화되거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않아야 하는 것으로 추가로 이해될 것이다. 예를 들어, 간(liver) 유래 조직 또는 간 유사 오가노이드를 설명하기 위해 "간(hepatic)"을 사용하는 것과 같이, 특정 기관의 특성을 나타내는 생물학적 물질 (예를 들어, 조직, 오가노이드, 샘플)을 지칭하기 위해 기술어가 사용될 수 있다. 아래에 명시적으로 정의되지 않았지만, 이러한 용어는 그 통상의 의미에 따라 해석되어야 한다.
본원의 설명에 사용된 용어는 특정 구현예만을 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 제한하도록 의도되지 않는다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 그 전체가 참고로 포함된다.
본 기술의 실시는 달리 지시되지 않는 한 당업계의 기술 범위 내에 있는 조직 배양, 면역학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 및 재조합 DNA의 종래의 기법을 사용할 것이다. 예를 들어, 문헌[Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition]; 문헌[the series Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology]; 문헌[the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)]; 문헌[MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press)]; 문헌[MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach]; 문헌[Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual]; 문헌[Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition]; 문헌[Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis]; 미국 특허 제 4,683,195호; 문헌[Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization]; 문헌[Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization]; 문헌[Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986))]; 문헌[Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning]; 문헌[Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory)]; 문헌[Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells]; 문헌[Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London)]; 및 문헌[Herzenberg et al. eds (1996) Weir 's Handbook of Experimental Immunology]이 참조된다.
문맥이 달리 나타내지 않는 한, 본원에 기술된 본 발명의 다양한 특징은 임의의 조합으로 사용될 수 있는 것으로 구체적으로 의도된다. 더욱이, 본 발명은 일부 구현예에서 본원에 설명된 임의의 특징 또는 특징들의 조합이 배제되거나 생략될 수 있다는 것을 또한 고려한다. 예시하자면, 본 명세서에 복합체가 성분 A, B 및 C를 포함하는 것으로 언급된 경우, A, B 또는 C 중 어느 하나, 또는 이들의 조합이 단독으로 또는 임의의 조합으로 생략되고 포기될 수 있는 것으로 구체적으로 의도된다.
범위를 포함하여 pH, 온도, 시간, 농도, 및 분자량과 같은 모든 수치 표기는 적절한 경우 1.0 또는 0.1의 증분 만큼 (+) 또는 (-) 변화되거나, 대안적으로 +/- 15%, 10%, 5%, 또는 2%의 변동 만큼 변화되는 근사값이다. 항상 명시적으로 언급된 것은 아니지만, 모든 수치 표기에는 "약"이라는 용어가 선행되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 항상 명시적으로 언급된 것은 아니지만, 본원에 기재된 시약은 단지 예시적인 것이며, 그 균등물이 당업계에 공지되어 있는 것으로 이해되어야 한다.
I. 정의
본 발명의 설명 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥에 달리 분명히 표시하지 않는 한 복수 형태를 또한 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "약"은, 양 또는 농도 (예를 들어, 바이오매트릭스 스캐폴드의 총 단백질 중 콜라겐의 백분율) 등과 같은 측정 가능한 값을 지칭하는 경우, 지정된 양의 20%, 10%, 5%, 1%, 0.5%, 또는 심지어 0.1%의 변동을 포함하고자 한다.
"허용되는", "효과적인", 또는 "충분한"이란 용어는, 본원에 개시된 임의의 성분, 범위, 투여 형태 등의 선택을 기술하는데 사용되는 경우, 상기 성분, 범위, 투여 형태 등이 개시된 목적에 적합함을 의미한다.
또한, 본원에서 사용된 바와 같이, "및/또는", "고/거나" 또는 "그리고/또는"은 하나 이상의 관련하여 열거된 항목 중 임의의 것 및 이들의 모든 가능한 조합뿐만 아니라 택일적 ("또는")으로 해석되는 경우 조합의 결여를 지칭하고 포함한다.
생체공학적이라는 용어는 자연 발생 기관 또는 조직과 유사하거나 동일한 생물학적 특성을 갖도록 조작된 인공 기관 또는 조직을 기술하기 위해 본원에서 사용된다. 어떤 측면에서, 이는 특정 장치의 조작의 사용을 필요로 할 수 있으며; 다른 측면에서, 이는 다양한 생물학적 인자의 사용을 필요로 할 수 있다.
용어 "바이오매트릭스 스캐폴드"는 세포외 매트릭스가 풍부한 분리된 조직 추출물을 지칭하며, 본원에 기술된 바와 같이 생물학적 조직에서 자연적으로 발견되는 콜라겐 및/또는 콜라겐 결합 인자의 일부, 선택적으로 다수 또는 대부분을 보유한다. 일부 구현예에서, 바이오매트릭스 스캐폴드는 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 니도겐/엔탁틴, 인테그린, 엘라스틴, 프로테오글리칸, (하이알루로난을 포함하는 황산화 또는 비-황산화) 글리코사미노글리칸 및 이들의 임의의 조합을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 이들로 본질적으로 구성되며, 이들 모두는 바이오매트릭스 스캐폴드의 일부이다 (예를 들어, 바이오매트릭스 스캐폴드라는 용어에 포함됨).
일부 구현예에서, 바이오매트릭스 스캐폴드는 검출 가능한 양의 특정 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 니도겐/엔탁틴, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 글리코사미노글리칸 및/또는 이들의 임의의 조합을 결여한다. 일부 구현예에서 본질적으로 모든 콜라겐 및 콜라겐 결합 인자가 보유되고, 다른 구현예에서 바이오매트릭스 스캐폴드는 조직에 존재하는 것으로 알려진 모든 콜라겐을 포함한다.
바이오매트릭스 스캐폴드는 천연 생물학적 조직에서 발견되는 임의의 조합의 콜라겐, 콜라겐 관련 매트릭스 성분, 및/또는 매트릭스 결합 성장 인자, 호르몬 및/또는 사이토카인의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99.5% 또는 100%를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이오매트릭스 스캐폴드는 생물학적 조직의 콜라겐의 적어도 95% 그리고 콜라겐 관련 매트릭스 성분 및 매트릭스 결합 성장 인자, 호르몬 및/또는 사이토카인의 대부분을 포함한다. 본원에 기술된 콜라겐은 신생의 (새로 형성된) 가교되지 않은 콜라겐일 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 콜라겐은 모발과 같이 3중 나선으로 엮어진 3 개의 아미노산 사슬로 구성되어 (3 개의 아미노산에 의해 지배되는 영역: [글리신-프롤린-X] (여기서 X는 다수의 다른 아미노산 중 임의의 것일 수 있음), 콜라겐의 섬유 유사 도메인을 형성하며, 분자의 단부는 다양한 콜라겐 유형에 특유한 아미노산 화학을 가지며 구형 도메인을 생성한다. 콜라겐 분자는 분비될 수 있고; 자체 조립되어 콜라겐 원섬유 (응집된 콜라겐 분자)를 형성하고; 비-콜라겐성 매트릭스 성분 및 신호전달 분자 (사이토카인, 성장 인자)와 함께 자체 조립된 후; 가교되어 세포외 매트릭스를 형성한다. 예시적인 콜라겐 및 이의 추출 방법은 이하 본원에서 간략히 설명된다.
특정 콜라겐 분자는 29종의 공지된 콜라겐 유형 각각에 특유한 아미노산 화학을 갖는다. 콜라겐은 세포로부터 분비되고, 이어서 분자의 한쪽 또는 양쪽 단부가 특정 펩티다제에 의해 제거된 후, 여러 콜라겐 분자가 응집되어 콜라겐 섬유 또는 원섬유를 형성한다. 예외는 구형 도메인을 보유하고 이어서 단부 대 단부로 응집되어 콜라겐 분자의 네트워크 (즉, 치킨-와이어(chicken-wire) 유사 구조를 가짐)를 형성하는 "네트워크 콜라겐"이다. 섬유 또는 네트워크로 응집된 후, 콜라겐은 콜라겐 분자 사이 (그리고 또한 엘라스틴 분자 사이)에 공유 결합을 일으키는 세포외 구리 의존성 효소인 라이실 옥시다제의 효과를 통해 가교되어 콜라겐의 매우 안정한 응집체 및 콜라겐에 결합된 어떤 것을 구성하는 가교된 형태를 생산한다. 원섬유성 콜라겐 중의 원섬유 당 콜라겐 분자 수와 네트워크 콜라겐에서의 연결 패턴은 특정 콜라겐 유형의 정확한 아미노산 화학에 의해 결정된다.
가교되지 않은 콜라겐뿐만 아니라 가교된 콜라겐을 불용성 상태로 분리하기 위한 조직의 추출은 중성 pH이고 1 M 이상의 염 농도를 갖는 완충액을 사용하여 달성될 수 있고; 가교되지 않은 콜라겐을 불용성으로 보존하기 위해 필요한 염의 정확한 농도는 콜라겐 유형에 좌우된다. 예를 들어, 피부에서 풍부하게 발견되는 I형 및 III형 콜라겐은 대략 1 M의 염을 필요로 하고; 대조적으로 양막에 있는 콜라겐 (예를 들어, V형 콜라겐)은 3.5 내지 4.5 M의 염을 필요로 하고; 간에 있는 가교되지 않은 콜라겐뿐만 아니라 가교된 콜라겐은 적어도 3.4 M의 염을 필요로 한다. 결과적으로, 세포외 매트릭스가 풍부한 추출물을 제조하는 대부분의 방법은 모든 콜라겐을 보존하지 못하며, 특히 가교되지 않은 콜라겐을 보존하지 못한다. 또한, 일부 방법은 a) 매트릭스 성분을 분해하는 효소 및/또는 b) 가교되지 않은 콜라겐 및 이에 결합된 임의의 인자의 용해를 가져오는 저염 또는 무염 완충액 (예를 들어, 증류수)를 사용한다. 따라서, 가교된 콜라겐 및 이 가교된 콜라겐에 결합된 임의의 인자를 함유하지만 가교되지 않은 콜라겐 및 이의 관련 인자가 없거나 최소량인 매트릭스 스캐폴드용 추출물은 다수의 형태가 있다. 가교된 콜라겐을 주로 또는 단독으로 분리하는 추출물은 부착 분자 및 신호전달 분자를 또한 가지지만, 이들은 가교된 매트릭스 내에서의 배향 및 위치로 인해 세포와 상호 작용하도록 쉽게 이용 가능하지 않다. 대조적으로, 가교되지 않은 콜라겐은 다른 매트릭스 성분 및 신호전달 분자와 함께 자체 조립되며, 이들 모두는 세포와의 상호 작용에 이용 가능하다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바이오매트릭스 스캐폴드는 가교된 콜라겐 및 가교되지 않은 콜라겐 둘 모두를 보존하기 위해 저 이온 강도 완충액을 회피하도록 제조된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 바이오매트릭스 스캐폴드는 신생 (새로 형성된) 콜라겐, 가교 전의 응집된 콜라겐 분자에 더하여 가교된 콜라겐을 포함하는 본질적으로 모든 콜라겐을 함유한다. 또한, 바이오매트릭스 스캐폴드는 다른 매트릭스 성분에 더하여 이들 콜라겐 또는 결합된 매트릭스 성분에 결합된 신호전달 분자를 선택적으로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이오매트릭스 스캐폴드에서의 콜라겐들의 비는 바이오매트릭스 스캐폴드가 유래되는 조직에서의 비와 유사하거나 동일하다. 원래의 조직을 모방하기 위한 신생 콜라겐들의 적합한 백분율의 비제한적인 예로는 적어도 약 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%, 5%, 10%, 15% 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50%를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 기술된 바와 같이, "생물학적 조직의 콜라겐 관련 매트릭스 성분 및 매트릭스 결합 성장 인자, 호르몬 및/또는 사이토카인의 대부분"은 천연 (예를 들어, 처리되지 않은) 생물학적 조직에서 발견되는 콜라겐 관련 매트릭스 성분 및 매트릭스 결합 성장 인자, 호르몬 및/또는 사이토카인의 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%를 보유하는 바이오매트릭스 스캐폴드를 지칭한다. 용어 "분말화된" 또는 "미분된"은 분말로 분쇄된 바이오매트릭스 스캐폴드를 기술하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. "3차원 바이오매트릭스 스캐폴드"라는 용어는 천연 3차원 구조를 보유하는 탈세포화된 스캐폴드를 지칭한다. 이러한 3차원 스캐폴드는 전체 스캐폴드 또는 이의 동결된 절편일 수 있다.
용어 "완충액" 및/또는 "린스 배지"는 본원에서 바이오매트릭스 스캐폴드의 제조에 사용되는 시약을 지칭하기 위해 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "세포"는 진핵 세포를 지칭한다. 일부 구현예에서, 이 세포는 동물 기원이며 줄기 세포 또는 체세포일 수이었다. 용어 "세포 집단"은 동일하거나 상이한 기원을 갖는 동일하거나 상이한 세포 유형의 하나 이상의 세포의 군을 지칭한다. 일부 구현예에서, 이 세포 집단은 세포주로부터 유래될 수 있고; 일부 구현예에서, 이 세포 집단은 기관 또는 조직의 샘플로부터 유래될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "전구 세포" 또는 "전구체"는 줄기 세포 및 이의 자손 둘 모두를 포함하도록 광범위하게 정의되며; 본 발명의 일부 양태에서, 용어 "줄기/전구세포"는 본원에서의 "전구세포", "전구 세포", 또는 "전구체"와 상호 교환적으로 본원에서 사용될 것이다. "자손"은 특정 계통으로 분화하여 하나 이상의 성숙 세포 유형을 생성할 수 있는 다능성 줄기 세포 또는 단능성(unipotent) 수임 세포를 포함할 수 있다. 전구 세포의 비제한적인 예는 임의의 조직 유형의 배아 줄기 (ES) 세포, 유도 만능성 줄기 (iPS) 세포, 배엽층 줄기 세포, 결정된 줄기 세포, 주산기 줄기 세포, 양수 유래 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포 세포, 전이 증폭 세포, 또는 수임 전구 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. "단능성", "다능성", 및/또는 "수임"과 같은 기술어와 함께 사용되는 경우, 하나 이상의 성체 운명으로 분화되는 세포의 능력이 표시되는데, 예를 들어 배아 줄기 세포는 만능성이며 3배엽층 (외배엽, 중배엽, 내배엽)의 모든 성체 운명을 발생시킬 수 있고; 결정된 줄기 세포는 다능성이며 2개 이상의 성체 운명을 발생시킬 수 있는 반면; 성상 세포 전구체 또는 내피 전구 세포는 단능성 전구세포의 예이며 그렇게 특정 세포 계통으로 수임된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "실질 세포"는 상피 세포, 전형적으로 기관의 상피 세포이다. 간에서, 실질 세포는 간세포와 담관세포를 포함할 수 있고; 췌장에서, 실질 세포는 선방 세포 및 섬을 포함할 수 있고; 간, 췌장 및 다른 내배엽 기관 (예를 들어, 갑상선, 장, 폐)에서, 실질 세포는 내배엽 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 이들의 표현형 형질은 계통 의존성이며, 가장 초기의 형질 세트는 간 선방의 구역 1에 있는 세포에서 발견되고, 중간 선방(mid-acinar) 구역 (간의 2 구역)에 있는 것들로 이행하고, 중심 주위 구역 (간의 3 구역)에 있는 최종 분화된 세포에서 끝난다. 또한, 중심 정맥을 형성하는 내피세포에 연결된 2배체 실질 세포의 집단은 단능성 전구세포 특성을 갖는 것으로 새롭게 발견되었다. 비제한적인 예시적 실질 세포는 담도계 줄기 세포, 간 줄기 세포, 간세포, 수임 간세포 및 담즙 전구세포, axin2+ 전구세포 (예를 들어, axin2+ 간 전구세포), 성숙 실질 세포 (간세포, 담관세포, 및 이들의 줄기 세포 하위집단의 다능성 또는 단능성 유도체)이다. 추가의 비제한적인 예는 담도계 줄기 세포, 특히 간-췌장 공통관으로부터의 줄기 세포, 췌장 줄기 세포, 간-췌장 공통관 그리고 췌관샘으로부터의 췌장 수임 전구세포, 섬 및 선방 세포를 포함한다. 이러한 예시적인 구현예는, 예를 들어, 간과 췌장에서 각각 유용할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "비-실질 세포"는 중배엽 및 외배엽 줄기 세포 및 성숙 중배엽 및 외배엽 세포 유형을 포함하는 그 계통 후손으로부터 유래된 것이다. 중배엽 줄기 세포 유래 자손은 혈관모세포, 내피세포 및 성상 세포의 전구체의 집단, 성숙 내피세포, 성숙 성상 세포, 간질 세포, 평활근 세포, 혈관 주위 세포, 조혈 줄기 세포 및 전구세포 그리고 쿠퍼 세포, 자연 살상 세포 (피트(Pit) 세포), 골수 세포, 림프구, 및 다양한 다른 조혈 세포를 포함하는 그 후손을 포함한다. 외배엽 줄기 세포 자손은 신경 전구체 및 성숙 신경 세포를 포함한다.
"상피 세포"는 당업계에 상피로부터 유래된 것으로 알려져 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "중간엽 세포"는 중배엽 기원의 비-실질 세포를 지칭한다. 조직의 관계 중심부을 구성하는 상피-중간엽 파트너십이 존재하고, 이는 계통 의존성일 수 있는데; 즉, 상피 줄기 세포는 중간엽 줄기 세포 및 그 성숙 후손과 통합적 방식으로 파트너를 이룬다. 이 관계는 상피세포 및 중간엽 세포의 생물학적 반응을 조절하기 위해 동적으로 그리고 상승적으로 작용하는 가용성 신호 및 세포외 매트릭스 성분으로 이루어진 신호 (측분비 신호)의 "크로스-톡(cross-talk)"에 의해 지속된다. 예를 들어, 혈관모세포 (중간엽 줄기 세포 집단의 유형)은 간 줄기 세포와 파트너를 이룬다. 이들은 간세포 계통과 파트너를 이루는 내피 세포 전구체와 그 후손을 발생시키며, 병행하여 담관세포 계통과 파트너를 이루는 성상 세포 전구체 및 그 후손을 발생시킨다. 성상 및 내피 세포 집단은 이들이 결합되어 있는 상피 세포와 유사하고 이와 통합적인 성숙 과정을 겪는다. 따라서, 이러한 세포의 표현형 특성은 계통 의존성이며, 세포가 계통의 초기, 중기 또는 후기 단계에 있는지에 따라 구별된다. 이것은 세포가 간 선방의 구역 1 (초기), 구역 2 (중기), 또는 구역 3 (후기)으로부터의 것인지의 여부로 개략적으로 번역된다. 비제한적인 예시적 비-실질 세포는 혈관모세포, 중간엽 줄기 세포, 성상 세포 전구체, 성상 세포, 혈관 주위 세포, 간질 세포, 평활근 세포, 신경 세포 전구체, 신경 세포, 내피 세포 전구체, 내피 세포, 조혈 세포 전구체, 및 조혈 세포이다.
용어 "담도계 줄기 세포" (BTSC)는 담낭을 포함하여 담도계 전체에서 발견되는 줄기 세포를 지칭하며, 간 및/또는 췌장 줄기 세포 및 그 후손 전구 세포로 이행하는 능력을 지닌다. 이는 담관의 표면에 테더링된 벽외 담관 주위 샘 (PBG) 및 담관 벽 내에 있는 벽내 PBG 둘 모두에서 발견된다. PBG 관련 BTSC의 후손은 담낭에서 발견되며, 담낭 융모 또는 이의 바닥에서 창자움(intestinal crypt)과 유사한 니치에 위치한다. 다수의 BTSC 하위집단이 있으며, 큰 간내 담관의 PBG에서 발견되는 간 줄기 세포 (HpSC)로 이행하는 계통을 형성하는 것, 관판 (태아 및 신생아 조직) 내로 연결되는 것 및 헤링(Hering)의 관으로 전환되는 것 (소아 및 성인 조직)이 있다. HpSC는 간모세포를 발생시키고, 헤링의 관에 인접하여 또는 이 근처에 위치하며, 간세포 및 담관세포로 성숙되는 수임 간세포 및 담관세포 전구세포로 이행된다. 또한, 담도계 전체에서 발견되지만 주로 간-췌장 공통관의 PBG 내에서 발견되는 췌장 줄기 세포를 발생시키는 BTSC의 후손이 존재하며; 이는 결과적으로 췌장 내의 췌관샘에서 발견되는 수임 췌장 전구세포로 이행된다. 모든 BTSC 하위집단에 대한 바이오마커는 내배엽 전사 인자 (SOX9, SOX17, FOXL1, HNF4-알파, ONECUT2, PDX1), 만능 유전자 (예를 들어, OCT4, SOX2, NANOG, SALL4, KLF4, KLF5, BMI-1); 하이알루로난 수용체 아이소형인 CD44의 하나 이상의 아이소형 (CD44s 및 CD44v 둘 모두); CXCR4; ITGB1 (CD29), ITGA6 (CD49f), ITGB4, 및 사이토케라틴 8 및 18을 포함한다. CD44S와 같은 CD44의 아이소형은 줄기 세포와 성숙 세포 둘 모두에 의해 더 많이 발현되는 것으로 발견되는 반면, CD44변이체 아이소형 (CD44v)은 줄기 세포 하위집단에서 우세하게 발견된다. 또한, 지금까지 확인된 3가지 단계의 BTSC 하위집단이 있다: 단계 1 BTSC는 소듐 요오다이드 심포터 (NIS), 줄기 세포에서도 발견되는 특정 CD44v 아이소형, 및 CXCR4를 발현하며, LGR5 또는 EpCAM을 발현하지 않고; 단계 2 BTSC는 줄기 세포에서 발견되는 CD44변이체의 특정 아이소형을 발현하고 NIS를 더 적게 발현하며 LGR5를 발현하지만 EpCAM은 발현하지 않고; 단계 3 BTSC (담낭에서 발견되는 유일한 BTSC로서 담도계 전체에서 또한 발견됨)는 LGR5와 EpCAM 그리고 더 성숙한 세포에서 발견되는 CD44v와 CD44s의 혼합체를 발현한다. 단계 3 BTSC는 간 줄기 세포 전구세포 및 췌장 줄기 세포의 전구체이다.
용어 "간 줄기 세포"(HpSC)는 담도계의 큰 간내 담관의 PBG의 단부를 간세포의 판에 연결하는 헤링의 관에서 발견되는 줄기 세포를 지칭한다. HpSC는 자기 복제하는 능력을 보유하며 다능성이다. 이들 세포에 대한 바이오마커는 상피 세포 부착 분자 (EpCAM; 세포질 및 원형질막에서 발견됨), 신경 세포 부착 분자 (NCAM), 및 매우 낮은 수준 (존재하는 경우)의 알부민을 포함한다. 이들 세포는 SOX9, SOX17, CD29 (ITBG1), HNF4-알파, ONECUT2, 낮은 수준 내지 보통 수준의 하나 이상의 만능 유전자 (OCT4, SOX2, NANOG, KLF5, SALL4)를 발현하고, 사이토케라틴 8, 18 및 19를 발현한다. 이들 세포는 PDX1 또는 알파-태아단백질 (AFP) 또는 P450-A7 또는 세크레틴 수용체 (SR)를 발현하지 않는다.
용어 "간모세포"는 간세포 및 담관세포를 발생시킬 수 있는 이능성(bipotent) 간 줄기 세포를 지칭한다. 간모세포는 BTSC 및 HpSC의 자기 복제를 허용하는 조건하에서 자기 복제하는 최소한의 능력을 가진다. 여전히 간모세포는 추가적인 사이토카인 및 성장 인자로의 처리에 따라 광범위하게 분열할 것이지만, 분열은 어느 정도의 분화를 포함할 수 있다. 이들 세포는 HpSC 및 BTSC와 중복되지만 HpSC와 구별되고 또한 BTSC와 구별되는 바이오마커 프로파일을 특징으로 한다. 이는 HNF4-알파, CPS1, APOB, EpCAM (주로 원형질막에 있음), P450-A7, 사이토케라틴 7, 19, 8 및 18, 세크레틴 수용체, 알부민, 높은 수준의 AFP, 세포간 부착 분자 (ICAM-1)의 발현을 포함하지만, NCAM, DLK1, 및 최소의 (존재하는 경우) 만능 유전자의 발현은 포함하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "수임 전구세포"라는 용어는 단세포 유형, 예를 들어 수임 간세포 전구 세포 (보통 알부민, AFP, 글리코겐, ICAM-1, 글리코겐 합성에 관여하는 다양한 효소의 발현에 의해 인식됨)을 발생시키고 간세포를 발생시키는 단능성 전구 세포를 지칭한다. 수임 담즙 (또는 담관세포) 전구세포 (보통 EpCAM, 사이토케라틴 7 및 19, 아쿠아포린, CFTR, 담즙 수송체 (담즙산염은 간세포에 의해 합성됨)의 생산과 관련된 막 펌프의 발현에 의해 인식됨)는 담관세포를 발생시킨다.
세포를 기술하는데 사용되는 경우 기술어 "성숙"은 분화된 세포를 지칭한다. 예를 들어, "성숙 간세포는"는 문맥 주위 영역에서는 이배체가 되고, 중간 선방 영역에서는 이배체와 다배체의 혼합체가 되고, 중심 주위 구역에서는 주로 다배체가 되는 간에 있는 우세한 실질 세포를 지칭한다. 유전자 발현 프로파일은 구역에 따라 계통 의존성일 수 있으며, 구역 1 유전자 (대표적인 것은 트랜스페린 mRNA (단백질로의 번역을 수행할 능력이 없음), 코넥신 28, 및 글리코겐 합성에 관여하는 효소임), 구역 2 유전자 (대표적인 것은 티로신 아미노트랜스퍼라제, 단백질로의 번역을 수행할 수 있는 트랜스페린 mRNA, 및 가장 높은 발현 수준의 알부민임), 및 구역 3 유전자 (대표적인 것은 P450-3A4와 같은 후기 P450s 및 아폽토시스와 관련된 유전자임)를 포함한다. 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 문헌[Turner et al Human Hepatic Stem Cell and Liver Lineage Biology. Hepatology , 2011; 53: 1035-1045 (간 선방 구역과 관련된 패턴으로 발현되는 유전자의 더욱 상세한 목록)이 참조된다. 구역 3의 최종 실질 세포 층은 이배체, axin2+, 중심 정맥의 내피세포에 연결된 단능성 간 전구 세포로 구성된다.
"혈관모세포"라는 용어는 내피세포, 성상 세포 그리고 관련 중간엽 줄기 세포와 함께 혈관 주위 세포를 발생시키는 다능성 전구체를 기술하는데 사용된다. 이들 세포는 CD117, VEGF-수용체, 폰 빌레브란트 인자, CD133과 같은 하나 이상의 바이오마커를 발현할 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 문헌[Geevarghese A. and Herman I., Transl Res. 2014; 163(4):296-306] (중간엽 계통 간의 바이오마커의 중첩에 관해 논의함)이 참조된다. 혈관모세포는 또한 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 발생시키고 이로부터 내피세포 주위를 감싸는 평활근 세포의 형태인 혈관 주위 세포를 발생시킬 수 있으며, 그 수축성으로 혈액을 구역 1로부터 구역 3으로 이동시킨 다음 중심 정맥 내로 이동시키는 것을 도울 수 있다. 혈관모세포는 간세포 성장 인자 (HGF), 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF), 엔도텔린, IGF II, 표피 성장 인자 (EGF), 산성 섬유모세포 성장 인자 (a-FGF), 및 뉴로트로핀을 포함하는 혈관생성에 관여하는 인자를 생산한다. 문헌[Geevarghese (2014)]의 도 13이 참조된다.
"성상 세포 전구체"라는 용어는 성상 세포의 단능성 전구체를 지칭하며; 간모세포에 대한 중간엽 파트너의 하나 및 수임 담관세포 전구세포에 대한 중간엽 파트너이다. 이 세포의 바이오마커는 CD146 (Mel-CAM으로도 일컬어짐), 알파-평활근 액틴 및 데스민을 포함한다. 성상 세포 전구체는, 간세포 성장 인자 (HGF) 및 간질 유래 성장 인자 (SDGF)와 같은 성장 인자, 및 라미닌 및 IV형 콜라겐과 같은 초기 계통 단계 매트릭스 성분을 포함하는, 간모세포 및 수임 전구세포에 필요한 풍부한 측분비 신호를 생산하는 것으로 알려져 있다.
용어 "내피 세포 전구체"는 내피세포의 단능성 전구체를 지칭하며; 간모세포에 대한 나머지 중간엽 파트너이고, 또한 수임 간세포 전구세포에 대한 중간엽 파트너이다. 이 세포의 바이오마커는 VEGF-수용체, 폰 빌레브란트 인자, CD133, 및 CD31 (PECAM으로도 일컬어짐)을 포함한다. 이 세포는 성장 인자 (예를 들어, VEGF, 안지오포이에틴) 및 매트릭스 성분 (예를 들어, IV형 콜라겐, 라미닌, 및 헤파란 설페이트 프로테오글리칸의 형태)을 또한 포함하는 측분비 신호를 생산하는 것으로 알려져 있다.
용어 "성숙 성상 세포"는 담관세포에 대한 중간엽 세포 파트너를 지칭하기 위해 사용된다. 이 세포의 바이오마커는 알파 평활근 액틴 및 데스민을 포함한다. 전구체가 아닌 성숙 성상 세포는 유의 수준의 레티노이드 (비타민 A 유도체), 신경교 원섬유 산성 단백질 (GFAP), I형 및 II 형 콜라겐 및 다른 성숙 매트릭스 성분을 발현하며, 성숙 성상 세포의 다른 마커는 상기 도면에 나타난 바와 같다.
용어 "내피 세포"는 간세포에 대한 중간엽 세포 파트너를 기술하기 위해 사용된다. 이들의 표현형 형질은 간세동이 근처에 간세포를 지닌 완전한 기저막을 형성하는 것으로부터 세포 사이의 갭을 지닌 유창 ("윈도우") 내피세포를 생성시키고 중심 정맥에 근접한 매트릭스를 생성시키는 것으로 이행한다. 바이오마커는 높은 수준의 CD31 및 VEGF-수용체를 포함한다.
용어 "조혈(hematopoietic) 세포" (이는 영국식 용어이고, 미국식 용어는 조혈(hemopoietic)임)는 태아 및 주산기 단계에서는 간에서 생산되고 이후에는 골수에서 생산되는 세포를 포함하는 당업계의 용어이며, 조혈 줄기 세포, 림프구, 과립구, 단핵구, 대식세포, 혈소판, 자연 살상 세포 (간에서는 피트 세포라고 일컬어짐), 및 적혈구를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "포함하는"이라는 용어는 조성물 및 방법이 언급된 요소를 포함하지만 다른 것들을 배제하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "본질적으로 구성된 (및 문법상 변형들)"이라는 전이 문구는 언급된 재료 또는 단계 "그리고 언급된 구현예의 기본 및 신규 특성(들)에 실질적으로 영향을 주지 않는 재료 또는 단계"를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 문헌[In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 U.S.P.Q. 461, 463 (CCPA 1976)] (원문에서의 강조)이 참조되고; 또한 MPEP § 2111.03이 참조된다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같은 "본질적으로 구성된"이라는 용어는 "포함하는"과 균등한 것으로 해석되지 않아야 한다. "구성된"은 다른 성분의 미량 원소를 더 배제한 본원에 개시된 조성물을 투여하기 위한 실질적인 방법 단계를 의미한다. 이들 전이 용어 각각에 의해 규정되는 양태들은 본 발명의 범위 내에 속한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "컨테이너"는 세포 및/또는 조직을 수용하도록 특별히 구성된 장치를 지칭한다. 일부 구현예에서, 이러한 컨테이너는 바이오매트릭스 스캐폴드를 수용하도록 고안된 바이오리액터일 수 있다. 추가의 구현예에서, 컨테이너는 상기 스캐폴드를 탈세포화 및/또는 재세포화하는 처리를 위해 구성될 수 있다.
용어 "배양" 또는 "세포 배양"은 세포를, 인위적인 시험관내 환경에서, 일부 구현예에서는 부착성 세포로서 (예를 들어, 단층 배양물) 또는 스페로이드 또는 오가노이드의 부유 응집체 배양물로서 유지하는 것을 의미한다. "스페로이드"라는 용어는 모두 동일한 세포 유형 (예를 들어, 세포주로부터의 응집체)인 세포의 부유 응집체를 나타나며; "오가노이드"는 다수의 세포 유형으로 이루어진 세포의 부유 응집체이다. 일부 구현예에서, 이는 상피 세포 및 이의 중간엽 파트너 세포, 전형적으로는 내피 세포 및/또는 간질 세포일 것이다. 세포는 이러한 범주의 세포의 줄기/전구세포일 수 있거나 성숙 세포일 수 있다. "세포 배양 시스템"은 세포 집단이 성장할 수 있는 배양 조건을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.
"배양 배지"는 세포의 배양, 성장, 또는 증식을 위한 영양분 용액을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 배양 배지는 세포를 특정 상태 (예를 들어, 만능성 상태, 정지 상태 등)로 유지하는 능력, 세포를 성숙시키는 능력, 일부 경우에는, 구체적으로 전구 세포의 특정 계통의 세포로의 분화를 촉진하는 능력과 같은 그러나 이에 제한되지 않는 기능적 특성을 특징으로 할 수 있다. 배양 배지의 비제한적인 예로는 쿠보타 배지 및 간에 대한 호르몬 한정 배지가 있으며, 이들 배지는 본원에서 이하에 추가로 규정된다. 일부 구현예에서, 배지는 주어진 환경으로 세포를 제시하거나 도입시키는데 사용되는 "시딩 배지"일 수 있다. 다른 구현예에서, 배지는 세포의 분화를 용이하게 하는데 사용되는 "분화 배지"일 수 있다. 이러한 배지는 "기초 배지" 또는 영양분, 무기질, 아미노산, 당 및 미량 원소의 혼합물로 이루어질 수 있으며, 생체 외에서의 세포의 유지를 위해 사용될 수 있다.
더욱 상세하게는, "기초 배지"는 세포 주위의 간질 유체의 화학적 구성성분을 모방하는 조성으로 아미노산, 당, 지질, 비타민, 무기질, 염, 및 다양한 영양분으로 이루어진 완충액이다. 이러한 배지에는 생물학적 과정 (예를 들어, 증식, 분화)을 유도하는데 필요한 필수 신호전달 분자 (호르몬, 성장 인자)를 제공하기 위해 혈청이 선택적으로 보충될 수 있다. 혈청은 배양에 사용되는 세포 유형에 대해 자가 유래일 수 있지만, 소, 양, 염소, 말 등으로부터의 혈청과 같은 농업용 또는 식용으로 일상적으로 도살된 동물로부터의 혈청이 가장 일반적이다. 혈청으로 보충된 배지는 선택적으로 혈청 보충된 배지 (SSM)로서 지칭될 수 있다.
상업적으로 이용 가능한 기초 배지의 많은 형태는 상피 줄기/전구 세포에 사용될 수 있지만, 세포에서 스턴니스(sternness) 형질을 유지하도록 변형되어야 한다. 연구 (Kubota et al, PNAS, 2000; 97(22): 12132-12137)는 내배엽 상피 세포를 미분화 상태로, 즉, 줄기 세포로서 유지하기 위해 무혈청이고; 산소 수준이 낮고 (1% 내지 2%); 구리가 없고; 사이토카인 및 성장 인자가 부재하고; 칼슘 수준이 0.5 mM 미만이고; 인슐린 및 트랜스페린/fe로 보충되고, 알부민과 같은 관련 운반체 분자와 복합체화된 정제된 유리 지방산의 혼합물을 지니며, 최적으로 (그러나 엄격히 요구되는 것은 아님) 고밀도 지질단백질과 같은 지질단백질을 지닌 배지가 사용될 수 있다는 것을 밝혀내었다. 줄기 세포에 대한 이러한 최적화된 배지는 내배엽 줄기 세포를 위해 개발되었으며, 이하에서 정의되는 "쿠보타 배지"로서 지칭된다. 이는 내배엽 줄기 세포가 수개월 동안 자기 복제 방식으로 증식할 수 있게한다. (Kubota and Reid PNAS 2000; 97 (22): 12132-12137) 줄기 세포로서의 상피 세포의 안정성은 세포가 쿠보타 배지에서 그리고 하이알루로난의 하층 상에서 또는 하이알루로난의 하이드로겔 또는 하이알루로난으로 보충된 배지에서 배양된 경우 선택적으로 향상될 수 있다. 본원에 참고로 포함된 문헌[Y. Wang, HL Yao, CB Cui et al. Hepatology. 2010; 52 (4): 1443-54], 미국 특허 제 8,802,081호.
간모세포 및 수임 전구세포와 같은 전구체의 후기 성숙 계통 단계는 제한된 자기 복제능을 갖지만 상당한 증식 능력을 가지며; 이러한 증식을 위한 조건은 쿠보타 배지를 HGF, EGF, FGF의 형태, IL-6, IL-11 및 그 밖의 것들과 같은 다양한 성장 인자 및 사이토카인으로 보충하는 것 그리고 III형 및/또는 IV형 콜라겐 및 라미닌을 포함하는 매트릭스 하층을 사용하는 것으로 구성된다. (예를 들어, 본원에 참고로 포함된 문헌[Kubota and Reid PNAS 2000; 97(22): 12132-12137; 문헌[Turner et al; Journal of Biomedical Biomaterials. 2000; 82(1): pp. 156-168]; 문헌[Y. Wang, H.L. Yao, C.B. Cui et al. Hepatology. 2010 Oct 52(4): 1443-54]이 참조된다)
본원에서 사용된 바와 같이, "분화"는 특정 조건이 세포가 성체 특이적 유전자 산물을 생산하는 성체 세포 유형으로 성숙하게 함을 의미한다.
용어 "균등한" 또는 "생물학적 균등물"은 특정 분자, 생물학적 물질, 또는 세포 물질을 지칭하는 경우 상호 교환적으로 사용되고, 요망되는 구조 또는 기능성을 여전히 유지하면서 최소한의 상동성을 갖는 것을 의도한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "발현"은 폴리누클레오티드가 mRNA로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 후속하여 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래된 경우, 발현은 진핵 세포에서의 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다. 유전자의 발현 수준은 세포 또는 조직 샘플에서 mRNA 또는 단백질의 양을 측정함으로써 결정될 수 있으며; 추가로, 특정 샘플에 대한 발현 프로파일을 확립하기 위해 다수의 유전자의 발현 수준이 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "세포외 매트릭스" 또는 "ECM"은 세포에 의해 분비되고, 하나 이상의 세포 표면에 인접하며, 세포 및 이로 이루어진 조직 또는 기관의 구조적 및/또는 기능적 지지에 관여하는 다양한 생물학적 활성 분자로 이루어진 복합 스캐폴드를 지칭한다. 특정 매트릭스 성분 및 그 농도는 특정 조직 유형, 조직학적 구조, 기관, 및 기타 초세포(super-cellular) 구조와 관련될 수 있다. 본 발명과 관련된 세포외 매트릭스의 성분은 콜라겐, 콜라겐 관련 매트릭스 성분, 및 성장 인자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
예시적인 콜라겐은 I형 내지 XXIX형 콜라겐과 같은 그러나 이에 제한되지않는 콜라겐의 임의의 및 모든 유형을 포함한다. 바이오매트릭스 스캐폴드는 천연 생물학적 조직에서 발견되는 하나 이상의콜라겐의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 그 초과를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 콜라겐은 가교되고/되거나 가교되지 않는다. 바이오매트릭스 스캐폴드 내의 콜라겐 양은 히드록시프롤린 함량을 결정하는 것과 같은 그러나 이에 제한되지 않는 당업계에 공지되고 본원에 기술된 바와 같은 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다. 콜라겐의 가교된 특성 또는 가교되지 않은 특성이 또한 존재하는지의 여부를 결정하는 예시적인 방법은, 예를 들어 그의 용해 특성을 관찰하는 것에 의존하는 방법이다. 예를 들어, 문헌 [D. R. Eyre,* M. Weis, and J. Wu. Advances in collagen cross-link analysis Methods, 2009; 45 (1): 65-74] (콜라겐 화학 분야의 표준 방법에 의해 가교의 분석을 설명함)이 참조된다. 예를 들어, 콜라겐은 1 M의 염 농도 또는 그 미만의 완충액에 용해되는지의 여부에 기초하여 가교된 것으로 결정될 수 있다.
예시적인 콜라겐 관련 매트릭스 성분은 부착 분자; 부착 단백질; L- 및 P-셀렉틴; 헤파린 결합 성장 관련 분자 (HB-GAM); 트롬보스폰딘 I형 반복체 (TSR); 아밀로이드 P (AP); 라미닌; 니도겐/엔탁틴; 피브로넥틴; 엘라스틴; 비멘틴; 프로테오글리칸 (PG); 콘드로이틴 설페이트 PG (CS-PG); 더마탄 설페이트-PG (DS-PG); 비글리칸(biglycan) 및 데코린(decorin)과 같은 소형 류신 풍부 프로테오글리칸 (SLRP) 계열의 구성원; 헤파린-PG (HP-PG); 글리피칸(glypican), 신데칸(syndecan), 및 펄레칸(perlecan)과 같은 헤파란 설페이트-PG (HP-PG); 및 하이알루로난, 헤파란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 케라틴 설페이트, 및 헤파린과 같은 글리코사미노글리칸 (GAG)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다..
일부 구현예에서, 바이오매트릭스 스캐폴드는 다양한 매트릭스 성분에 결합된 (임의의 조합의) 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 니도겐/엔탁틴, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 글리코사미노글리칸 (GAG), 성장 인자, 호르몬, 및 사이토카인을 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성된다. 바이오매트릭스 스캐폴드는 천연 생물학적 조직에서 발견되는 하나 이상의 콜라겐 관련 매트릭스 성분, 호르몬 및/또는 사이토카인의 적어도 약 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과를 포함할 수 있고/있거나 천연 생물학적 조직에서 발견되는 것의 적어도 약 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 그 초과인 농도로 존재하는 이들 성분의 하나 이상을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 바이오매트릭스 스캐폴드는 조직에 존재하는 것으로 알려진 콜라겐 관련 매트릭스 성분, 호르몬 및/또는 사이토킨의 전부 또는 대부분을 포함한다. 다른 구현예에서, 바이오매트릭스 스캐폴드는 천연 생물학적 조직에서 발견되는 것들에 가까운 농도 (예를 들어, 천연 조직에서 발견되는 농도의 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100%)의 하나 이상의 콜라겐 관련 매트릭스 성분, 호르몬 및/또는 사이토카인을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다.
예시적인 매트릭스 결합 신호전달 분자는 표피 성장 인자 (EGF), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 인슐린 유사 성장 인자 (IGF), 형질전환 성장 인자 (TGF), 신경 성장 인자 (NGF), 신경영양 인자, 인터류킨, 백혈병 억제 인자 (LIF), 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 골 형성 인자, 줄기 세포 인자 (SCF), 콜로니 자극 인자 (CSF), GM-CSF, 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, 헤파린 결합 성장 인자, IGF 결합 단백질, 태반 성장 인자, 및 Wnt 신호를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
예시적인 사이토킨은 인터류킨, 림포카인, 모노카인, 콜로니 자극 인자, 케모카인, 인터페론 및 종양 괴사 인자 (TNF)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바이오매트릭스 스캐폴드는 천연 생물학적 조직에서 발견되는 하나 이상의 매트릭스 결합 성장 인자 및/또는 사이토카인의 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 100% 또는 그 초과를 (임의의 조합으로) 포함할 수 있고/있거나 천연 생물학적 조직에서 발견되는 것의 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 100% 또는 그 초과인 농도로 존재하는 하나 이상의 이러한 성장 인자 및/또는 사이토카인을 (임의의 조합으로) 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 바이오매트릭스 스캐폴드는, 천연 조직에 존재하는 것으로 알려져 있고/있거나 그 조직에서 검출되는, 생리학적 수준 또는 거의 생리학적 수준의 다수의 또는 대부분의 매트릭스 결합 성장 인자, 호르몬 및/또는 사이토카인을 포함하며, 다른 구현예에서, 바이오매트릭스 스캐폴드는 천연 생물학적 조직에서 발견되는 그러한 생리학적 농도와 유사하거나 이에 가까운 농도 (예를 들어, 비교해 볼 때 약 50% 이하, 40%, 30%, 25%, 20%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 만큼 달라짐)의 하나 이상의 매트릭스 결합 성장 인자, 호르몬 및/또는 사이토카인을 포함한다. 바이오매트릭스 스캐폴드에 존재하는 성장 인자 또는 사이토카인의 양 또는 농도는 다양한 항체 검정 및 성장 인자 검정과 같은 그러나 이에 제한되지 않는 당업계에 공지되고 본원에 기재된 바와 같은 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "기능적"은 특정의 지정된 효과를 달성하고자 하는 임의의 분자, 생물학적 물질, 또는 세포 물질을 수식하기 위해 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "유전자"는 RNA가 코딩 (예를 들어, mRNA) 또는 비-코딩 (예를 들어, ncRNA)인지 여부와 관계없이 RNA 분자로 전사되는 임의의 핵산 서열을 광범위하게 포함하는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "생성한다" 및 그 균등물 (예를 들어, 생성하는, 생성되는 등)은 본 발명의 미세 기관 또는 공학적 조직을 가져오는 방법 단계를 지칭하는 경우 "생산한다" 및 그 균등물과 상호 교환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같은 "간에 대한 호르몬 한정 배지" 또는 "HDM-L"은 줄기 세포를 성숙 세포로 분화시키는 고전적 인자를 포함하며; 이러한 배지는 일반적으로 호르몬, 성장 인자, 및 다양한 영양분의 혼합물로 보충된 기초 배지로 이루어지며, 특정 세포 유형, 예를 들어 실질 세포의 증식 또는 분화를 위해 무혈청으로 이용된다. 일부 구현예에서, 이는 줄기 세포에 대해 한정된 쿠보타 배지에 세포의 분화에 필요한 추가의 호르몬 및 인자를 보충함으로써 제조될 수 있다. 이러한 분화 배지에서 사용하기 위한 예시적인 성장 인자는 본원에 그 전체가 참고로 포함된 문헌 [Y. Wang, H.L. Yao, C.B. Cui et al. Hepatology. 2010 Oct 52(4): 1443-54] 및 미국 특허 제 8,404,483호에 개시되어 있다. 본 발명의 양태는 성숙한 간 조직을 생성하기 위해 실질 및 비-실질 계통 둘 모두 및/또는 상피 및 중간엽 계통 둘 모두의 줄기 세포 및 전구세포를 분화시키도록 고안된 실험 전체에서 "BIO-LIV-HDM"으로 명명되는 특정 HDM-L에 관한 것이다. 또한, BIO-LIV-HDM-L에는 전구체와 성숙 형태 둘 모두의 중간엽 세포 (성상 세포, 혈관 주위 세포, 내피 세포), 전구체와 성숙 형태 둘 모두의 신경 세포, 및 전구체와 성숙 형태 둘 모두의 조혈 세포를 포함하는 다양한 비-실질 세포 유형에 필요한 성장 인자 및 호르몬이 추가로 보충되었다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "하이알루로난" 또는 "하이알루론산"은 α1-4, α1-3 결합에 의해 연결된 글루코사민과 글루론산의 이당류 단위로 구성된 우론산과 아미노당 [1-3]의 중합체 및 이의 염을 지칭한다. 따라서, 용어 하이알루로난은 천연 및 합성 하이알루로난 둘 모두를 지칭한다.
본원에서 사용된 "하이드로겔"은 중합체 사슬에 의해 형성된 3차원 네트워크로서, 수성 매질의 상당한 분획을 상기 수성 매질에 용해됨이 없이 상기 3차원 네트워크 내에 보유하는 3차원 네트워크를 의미하도록 의도된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "분리된"은 다른 물질이 실질적으로 없는 분자 또는 생물학적 물질 또는 세포 물질을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "쿠보타 배지"는 내배엽 줄기 세포를 위해 고안된 무혈청의 호르몬 한정 배지를 지칭하며, 내배엽 줄기 세포가 자기 복제 모드의 분열로 클론원성으로(clonogenically) (예를 들어, 하이알루로난 하층 상에서 또는 하이알루로난을 함유하는 완충액에서) 증식할 수 있게 한다. 쿠보타는 구리를 함유하지 않고, 저 칼슘 (0.5mM 미만), 인슐린, 트랜스페린/Fe, 정제된 알부민에 결합된 정제된 유리 지방산의 혼합체, 및 선택적으로 또한 고밀도 지질단백질을 함유하는 임의의 기초 배지를 지칭할 수 있다. 쿠보타 배지 또는 그 균등물은 무혈청이며 호르몬, 성장 인자, 및 영양분의 정제되고 한정된 혼합체만을 함유한다. 특정 구현예에서, 배지는 구리를 함유하지 않고 저 칼슘 (<0.5 mM)을 함유하는 무혈청의 기초 배지 (예를 들어, RPMI 1640 또는 DME/F12)로 이루어지며, 인슐린 (5 ㎍/mL), 트랜스페린/Fe (5 ㎍/Ml), 고밀도 지질단백질 (10 μg/mL), 셀레늄 (10-10 M), 아연 (1012 M), 니코틴아미드 (5 μg/mL), 및 정제된 알부민의 형태에 결합된 정제된 유리 지방산의 혼합물로 보충된다. 이 배지의 제조를 위한 비제한적인 예시적 방법은 다른 곳에, 예를 들어, 개시 내용이 본원에 참고로 포함된 문헌 [Kubota H, Reid LM, Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 2000; 97: 12132-12137]; 문헌 [Y. Wang, H.L. Yao, C.B. Cui et al. Hepatology. 2010; 52(4): 1443-54]; 문헌 [Turner et al; Journal of Biomedical Biomaterials. 2000; 82(1): pp. 156-168]; 및 문헌 [Y. Wang, H.L. Yao, C.B. Cui et al. Hepatology. 2010 Oct 52(4): 1443-54]에 공개되었다. 쿠보타 배지는 무혈청 조건하에서 특이적 증식이 가능하도록 특정 인자와 보충제를 제공함으로써 특정 세포 유형을 위해 고안될 수 있다. 예를 들어, 간모세포와 함께 사용하기 위해 변형된 쿠보타 배지는 간모세포 및 그 자손인 수임 전구세포를 위해 고안된 것이며 무혈청 조건하에서 증식을 촉진한다. 증식은 자기 복제와 함께 발생할 수 있지만, 보통 최소의 (존재하는 경우) 자기 복제와 함께 발생한다. 배지는 세포가 IV형 콜라겐 및 라미닌의 하층 상에 존재하는 경우 특히 효과적이다.
용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드", 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호 교환적으로 사용되며, 데옥시리보누클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 이들의 유사체인 임의의 길이의 중합체 형태의 뉴클레오티드를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고 공지되거나 공지되지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편 (예를 들어, 프로브, 프라이머, EST 또는 SAGE 태그), 엑손, 인트론, 전령 RNA (mRNA), 운반 RNA, 리보솜 RNA, RNAi, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 분리된 DNA, 임의의 서열의 분리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머.
폴리뉴클레오티드는 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체와 같은 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 폴리뉴클레오티드의 조립 전 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후에, 예를 들어 표지화 성분과의 접합에 의해 추가로 변형될 수 있다. 이 용어는 또한 이중 가닥 및 단일 가닥 분자 둘 모두를 지칭한다. 달리 명시되거나 요구되지 않는 한, 폴리누클레오티드인 이 기술의 임의의 양태는 이중 가닥 형태 및 이중 가닥 형태를 구성하는 것으로 알려져 있거나 예측되는 2 개의 상보적 단일 가닥 형태 각각 둘 모두를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "기관"은 개별 유기체의 특정 부분인 구조체로서, 개별 유기체의 특정 기능 또는 기능들이 국소적으로 수행되고 형태학적으로 분리된 구조체이다. 기관의 비제한적인 예는 피부, 혈관, 각막, 흉선, 신장, 심장, 간, 탯줄, 장, 신경, 폐, 태반, 췌장, 갑상선 및 뇌를 포함한다. 기관은 조직 공급원으로 사용될 수 있으며, 예를 들어 태아, 신생아, 소아, 아동, 또는 성인 기관은 본원에 개시된 용도를 위해 관심 있는 세포 집단을 유도하는데 사용될 수 있다.
"단백질", "펩티드" 및 "폴리펩티드"라는 용어는 상호 교환적으로 사용되며, 아미노산, 아미노산 유사체 또는 펩티도미메틱의 2개 이상의 서브유닛의 화합물을 지칭하기 위해 가장 넓은 의미로 사용된다. 서브유닛은 펩티드 결합에 의해 연결될 수 있다. 또 다른 양태에서, 서브유닛은 다른 결합, 예를 들어, 에스테르, 에테르 등에 의해 연결될 수 있다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2 개의 아미노산을 함유해야 하며, 단백질 또는 펩티드 서열을 구성할 수 있는 최대 아미노산 수에 제한은 없다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산"은 글리신 및 D와 L 둘 모두의 광학 이성질체, 아미노산 유사체 및 펩티도미메틱을 포함하는 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "대상체"라는 용어는 임의의 동물을 의미하는 것으로 의도된다. 일부 구현예에서, 대상체는 포유 동물일 수 있으며; 추가의 구현예에서, 대상체는 인간, 마우스, 또는 래트일 수 있다.
"조직"이라는 용어는 살아 있거나 사망한 유기체의 조직 또는 살아 있거나 사망한 유기체로부터 유래되거나 그러한 유기체를 모방하도록 고안된 임의의 조직을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 조직은 건강하고/하거나 질병에 걸려 있고/있거나 유전적 돌연변이를 가질 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "천연 조직" 또는 "생물학적 조직" 및 이의 변화형은 천연 상태로 존재하거나 유기체로부터 유래되었을 때로부터 변형되지 않은 상태로 존재하는 생물학적 조직을 지칭한다. "미세 기관"은 "천연 조직"을 모방한 "생체공학적 조직"의 조각을 지칭한다.
생물학적 조직은 임의의 단일 조직 (예를 들어, 상호 연결될 수 있는 세포의 집합체) 또는 유기체의 신체의 기관 또는 부분 또는 영역을 구성하는 조직의 군을 포함할 수 있다. 조직은 균일한 세포 물질을 포함할 수 있거나, 예를 들어 폐 조직, 골격 조직 및/또는 근육 조직을 포함할 수 있는 흉부를 포함하는 신체의 영역에서 발견되는 것과 같은 복합 구조체일 수 있다. 예시적인 조직은 간, 폐, 갑상선, 피부, 췌장, 혈관, 방광, 신장, 뇌, 담도계, 십이지장, 복부 대동맥, 장골 정맥, 심장 및 장으로부터 유래된 것들과 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 대상체에서 질병을 "치료하는" 또는 질병의 "치료"는 (1) 질병에 걸리기 쉽거나 아직 질병의 증상을 나타내지 않은 대상체에서 증상 또는 질병이 발생하지 않게 하거나; (2) 질병을 억제하거나 질병의 발달을 저지하거나; (3) 질병 또는 질병의 증상을 개선시키거나 그 퇴행을 야기하는 것을 지칭한다. 당업계에서 이해되는 바와 같이, "치료"는 임상 결과를 포함하여 유익하거나 요망되는 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적을 위해, 유익하거나 요망되는 결과는 검출 가능 또는 검출 불가능의 여부와 관계 없이 하나 이상의 증상의 완화 또는 개선, 질환 (질병을 포함함)의 범위의 감소, 질환 (질병을 포함함)의 안정화된 (즉, 악화되지 않은) 상태, 질환 (질병을 포함함) 진행의 지연 또는 늦춤, 질환 (질병을 포함함)의 개선 또는 경감, 상태 및 관해 (부분적이든지 완전하든지의 여부와 관계 없음) 중 하나 이상을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
II. 약어
본 발명의 일부는 두문자어를 이용하여 특정 용어를 지칭한다. 세포 집단에 대한 두문자어는 종을 나타내기 위해 소문자로 본원에서 지칭될 수 있다: r = 래트; m = 뮤린; h = 인간. 분자에 대한 두문자어가 이탤릭체로 인쇄되어 있는 경우, 유전자를 지칭하며; 보통의 글꼴로 인쇄되어 있는 경우, 유전자에 의해 코드화된 단백질을 지칭한다.
다음은 본원에서 사용되는 약어의 비제한적인 목록이다: ACOX, 아실-코엔자임 A 옥시다제; APOL6, 아포지질단백질 L6; AFP, α태아단백질로서, 간모세포에 의해 발현되는 시그니처(signature) 유전자임; ASMA, α-평활근 액틴; ALB, 알부민; ALT, 알라닌 아미노트랜스퍼라제; AST, 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제; ccK18, 절단된 카스파제 K18로서, 분비된 경우 세포 괴사의 지표임; C/EBP, CCAAT/인핸서 결합 단백질 알파; CD, 공통 결정기(common determinant); CD31, 혈소판 내피 세포 항원 (또는 PECAM)으로서, 내피 세포의 표면 마커임; CD34, 조혈 줄기/전구 세포 항원; CD45, 대부분의 조혈 세포 하위집단에서 발견되는 공통 백혈구 항원; CD133, 프로미닌으로서, 내피 및 실질 세포 전구체에서 발견되는 표면 마커임; CSF, 콜로니 자극 인자; CYP, 약물 대사 및/또는 콜레스테롤, 스테로이드 및 지질의 합성과 관련된 많은 반응을 촉매하는 시토크롬 P450 모노-옥시게나제로서, 실질 세포의 초기 계통 단계에서 발현되는 형태 (CYP3A7 그리고 가능하게는 CYP1B1) 및 후기 계통 단계에서 발현되는 그 밖의 형태 (예를 들어, CYP1A1, CYP2C8, CYP3A4)가 있음; CK, 사이토케라틴; CK7, 담즙 세포와 관련된 사이토케라틴; CK8 및 18, 모든 상피세포와 관련된 사이토케라틴; EGF, 표피 성장 인자; EpCAM, 상피 세포 부착 분자; FBS, 소 태아 혈청; FGF, 섬유 모세포 성장 인자; bFGF, 염기성 섬유모세포 성장 인자; GAG, 글리코사미노글리칸으로서, 이량체 (우론산 및 아미노당)의 중합체인 탄수화물 사슬이며, 이들 대부분은 특정 황화 패턴을 지니며 신호 전달 과정에서 단백질과 협동하여 다양한 역할을 함; GATA, DNA 서열 GATA에 대한 징크 결합 DNA 결합 도메인을 지닌 전사 인자; GATA-2, GATA 결합 단백질 2로서, 조혈 유전자 발현의 조절인자임; HB, 간모세포; HDL, 고밀도 지질단백질; hGH, 인간 성장 호르몬; HGF, 간세포 성장 인자; HpSC, 간 줄기 세포; HDM, 호르몬 한정 배지; H&E, 헤마톡실린 및 에오신; HNF, 간세포 핵 인자; HNFlα, 모든 간 실질 전구체에서 발현되는 간세포 핵 인자 호메오박스 A; HNF1b, 간-췌장 사양(specification)에서 발달상 관여하는 것으로 발견되는 간세포 핵 인자 호메오박스 B; HPLC, 고성능 액체 크로마토그래피; IGF, 인슐린과 상동성을 공유하며 관련된 특정 GAG에 따라 분열 촉진 물질 또는 분화 신호로서 작용하는 인슐린 유사 성장 인자; IGF-I, 성체 간 세포에서 핵심 조절인자로 잘 알려진 인슐린 유사 성장 인자 I; IGF-II, 인슐린 유사 성장 인자 II로서, 태아 간 세포에서의 주요 조절인자임; IL, 인터류킨; IL7-R, 인터류킨 7에 대한 수용체로서, 림프구의 발달에 결정적임; JAG1, Jagged1으로서, CD339로도 일컬어지며, 운명 결정에 관여하는 노치(notch) 신호전달 경로의 핵심 유전자임; K18, 토털(total) 사이토케라틴 18로서, 세포에 의해 방출되는 경우 세포 사멸 또는 괴사를 나타냄; KM, 쿠보타 배지; LGR5, 류신 풍부 반복체 함유 G-단백질 연결 수용체 5로서, 장, 간 및 췌장에서 중요한 줄기 세포 마커임; LDH, 락테이트 데하이드로게나제; LDLR, 저밀도 지질단백질 (LDL) 수용체; LYVE-1, 림프 내피 하이알루로난 세포 수용체; MST1, 대식세포 자극(macrophage stimulating) 1; MMP, 매트릭스 메탈로프로테이나제 (또는 펩티다제); MMP2, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2로서, 72 kDa의 IV형 콜라게나제 또는 젤라티나제 A (GELA)임; MMP9, 매트릭스 메탈로펩티다제 9로서, 92 kDa의 IV형 콜라게나제 또는 젤라티나제 B (GELB)로도 알려져 있음, 매트릭신으로서, 세포외 매트릭스의 분해에 관여하는 징크-메탈로프로테이나제 계열의 효소의 부류임; MRP2, 다약제 내성 관련 단백질 2; NMR, 핵 자기 공명; PAR, 프로테아제 활성화 수용체, PAS, 과요오드산-쉬프; PDGF, 혈소판 유래 성장 인자; RAG1, 재조합 활성화 유전자 1; SEM, 주사 전자 현미경; SCF, 줄기 세포 인자; SCTR, 세크레틴 수용체; SLC4A2, 용질 운반체 계열 4 (음이온 교환물질)로서, 멤버(member) 2임; TGF, 형질전환 성장 인자; TEM, 투과 전자 현미경; VEGF, 혈관 내피 세포 성장 인자.
III. 본 발명을 실시하기 위한 형태
본 발명의 양태는 생체공학적 조직을 생산하기 위한 조성물 및 방법 및 이의 생성을 위해 구성된 컨테이너에 관한 것이다.
특정 구현예는 (a) 시딩 배지 중의 세포 현탁액을 바이오매트릭스 스캐폴드 내로 또는 바이오매트릭스 스캐폴드 상으로 도입하고 (b) 초기 인큐베이션 기간 후에 시딩 배지를 분화 배지로 교체하는 것을 포함하는 생체공학적 조직의 생성 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 이 방법은 이러한 과정의 실행을 위해 특별히 고안된 컨테이너에서 수행된다. 본 발명의 양태는 컨테이너에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 이 컨테이너는 세포의 혈관 지지를 모방하도록 특별히 고안된 유로로 구성된다. 추가의 구현예에서, 이는 혈관계의 매트릭스 잔재를 포함하는 3차원 바이오매트릭스 스캐폴드의 사용을 통해 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 시딩은 다수의 간격으로 수행된 후 휴지 기간이 뒤따르며; 이러한 간격 및 휴지 기간은 약 1 분 내지 약 15 분, 예를 들어 약 1 분, 2 분, 3 분, 4 분, 5 분, 6 분, 7 분, 8 분, 9 분, 10 분, 11 분, 12 분, 13 분, 14 분, 및/또는 15 분의 지속 기간으로 달라질 수 있다. 도입되는 세포의 수 및 그 농도는 마찬가지로 변화될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 습윤 중량 스캐폴드 그램당 약 1,000만 개 내지 1,200만 개의 세포가 주어진 간격에 걸쳐 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 도입 속도는 1회, 2회, 3회, 4회, 또는 그 초과의 간격인 주어진 간격 횟수 동안 15 mL/분일 수 있고, 이어서 주어진 간격 횟수 후에는 예를 들어 1.3 mL/분의 속도로 감소될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 및 시딩 배지는 도입 전에, 예를 들어 4℃에서 4 내지 6 시간 동안, 예비 인큐베이션될 수 있다.
일부 구현예에서, 바이오매트릭스 스캐폴드는 전구 세포가 유래되는 유기체와 동일하거나 상이할 수 있는 특정 유기체로부터 유래될 수 있다.
일부 구현예에서, 바이오매트릭스 스캐폴드는 조직으로부터 매트릭스의 스캐폴드를 생성하고 조직의 조직학의 내부구조(intrastructure)를 유지하는 세포외 매트릭스 성분만을 또는 세포외 매트릭스 성분을 주로 보유하도록 생물학적 조직 샘플을 다수의 완충액 및 린스 배지로 관류시켜 조직을 탈세포화시킴으로써 생물학적 조직으로부터 제조될 수 있다. 대안적인 구현예에서, 온전한 바이오매트릭스 스캐폴드는 상업적으로 이용 가능한 공급원으로부터 입수할 수 있다.
생체공학적 조직의 생성을 위해 허용되는 배양 배지는 조직의 요망되는 특성에 기초하여 선택될 수 있으며, 예를 들어 배양은 문헌 [Y. Wang, H.L. Yao, C.B. Cui et al. Hepatology. 2010 Oct 52(4): 1443-54]에 기재된 것들과 같은 특정 기관 또는 조직 유형의 세포로의 전구 세포 집단의 분화 및/또는 성장을 자극하는 특정 인자의 존재하에서 선택될 수 있다. 또한, 생체공학적 조직을 생성시키는 과정의 생성에서의 다양한 단계에서, 다양한 배지, 예를 들어 시딩 배지 또는 분화 배지가 관련될 수 있다.
특정 결과를 달성하기 위한 인자 및 다른 배지 성분의 사용에 관한 추가의 개시는 그 전체가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 제 12/213,100호 및 미국 특허 제 8,404,483호에 개시되어 있다. 특정 구현예에서, 배양 배지는 세포 분화를 촉진시키는 배지이다.
일부 구현예에서, 배지는 앞서 본원에 기재된 것들과 같은 하나 이상의 세포 성장 또는 분화 인자를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 시딩 배지는 약 0.3 mM 내지 0.5 mM 농도의 칼슘, 미량 원소 (예를 들어, 셀레늄 및 아연이지만 구리는 아님), 정제된 유리 지방산의 혼합물 (예를 들어, 팔미틴산, 팔미톨레인산, 스테아린산, 올레인산, 리놀레인산, 리놀렌산), 하나 이상의 지질 결합 단백질 (예를 들어, HDL), 인슐린, 및 트랜스페린/fe 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 시딩 배지는 세포 현탁액을 제조하는데 사용되는 효소를 비활성화시키기 위해 선택적으로 사용되는 혈청을 포함한다. 그러한 혈청의 비제한적인 예는 소 태아 혈청 (FBS) 이다. 혈청이 첨가되는 일부 구현예에서, 혈청은 전형적으로 약 6 시간 내지 24 시간 내에 그리고/또는 가능한한 빨리, 무혈청 배지 (예를 들어, 무혈청 HDM)로 교체된다.
일부 구현예에서, 분화 배지는 적어도 약 0.5 mM 농도의 칼슘, 미량 원소, 에탄올아민, 글루타티온, 아스코르빈산, 무기질, 아미노산, 및 피루브산나트륨, 정제된 유리 지방산의 혼합물, 하나 이상의 지질 결합 단백질 (예를 들어, HDL), 하나 이상의 당, 하나 이상의 글루코코르티코이드, 인슐린, 트랜스페린 f/e, 실질 세포의 증식 및/또는 유지를 위한 것들 (프롤락틴, 성장 호르몬, 글루카곤, 및 갑상선 호르몬 (예를 들어, 트리요오도티로닌 또는 T3), 표피 성장 인자 (EGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), 인슐린 유사 성장 인자 (IGF), 골 형성 단백질, Wnt 리간드, 및 고리형 아데노신 일인산염) 및/또는 비-실질 세포의 증식 및/또는 유지를 위한 것들 (안지오포이에틴, 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF), 신경 성장 인자, 줄기 세포 인자, 백혈병 억제 인자 (LIF), 콜로니 자극 인자 (CSF), 트롬보포이에틴, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), 에리트로포이에틴, 인슐린 유사 성장 인자 (IGF), 섬유 모세포 성장 인자 (FGF), 및 표피 성장 인자 (EGF))와 같은 그러나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 호르몬 및/또는 성장 인자 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 현탁액은 바이오매트릭스 스캐폴드가 유래되는 유기체와 동일하거나 상이할 수 있는 특정 유기체로부터 유래될 수 있다. 줄기 또는 전구 세포는 직판 소매업체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 상업적으로 이용 가능한 공급원 또는 아메리칸 타입 컬처 콜렉션(American Type Culture Collection, ATCC, http://www.atcc.org/)과 같은 수탁기관으로부터 얻을 수 있다. 대안적으로, 샘플로부터 줄기 또는 전구 세포를 생성 및/또는 분리하는 방법이 당업계에 개시되어 있다. 예시적인 방법은 그 전체가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 제 12/926161호에 개시된 방법을 포함한다. 비제한적인 예시적 세포 공급원은 간, 담도계, 담낭, 간-췌장 공통관, 췌장, 십이지장, 골수, 및 내피세포 (예를 들어, 담도계 또는 담낭으로부터의 간 또는 담도계 줄기 세포, 골수 줄기 세포, 및 내피 줄기 세포)를 포함한다. 추가의 예는 임의의 공급원으로부터의 배아 줄기 (ES) 세포 또는 유도 만능 줄기 (iPS) 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 현탁 세포 집단은 동일한 유형의 세포만을 포함하는 균일한 세포 집단 또는 다양한 유형의 세포를 포함하는 불균일한 세포 집단일 수 있다. 배양된 현탁 세포 집단 내의 세포의 수 및 농도는 현탁 세포, 배양 배지, 배양 크기, 요망되는 기관/조직 특성, 및 기타 관련 인자에 기초하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 전구 세포 집단 내의 세포 수는 줄기/전구 세포의 성장 속도 및 분화 조건에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 줄기/전구 세포 집단 내의 세포 수는 배양 배지에 존재하는 성장 인자 및 다른 성분에 의해 결정된다.
일부 구현예에서, 세포 현탁액은 실질 세포 (예를 들어, BTSC, HpSC, 간모세포, 췌장 줄기 세포, 간 또는 췌장 수임 전구세포, 간세포, 담관세포, 섬, 선방 세포) 및 비-실질 세포를 포함하며, 여기서 비-실질 세포는 중간엽 세포 (예를 들어, 혈관모세포 또는 성상 세포 또는 내피세포의 전구체, 성숙 성상 세포 또는 성숙 내피 세포), 신경 전구체 및 성숙 신경 세포, 및 조혈 전구체 및 성숙 조혈 세포 (예를 들어, 림프구, 골수 세포, 자연 살상 세포, 혈소판, 적혈구의 전구체 또는 이들의 성숙 대응물)의 하위집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 이들 세포는 약 10%/90%, 20%/80%, 30%/70%, 40%/60%, 50%/50%, 60%/40%, 70%/30%, 80%/20%, 및 10%/90%의 비로 존재한다. 일부 구현예에서, 세포 현탁액은 적어도 약 50%의 전구체 및/또는 줄기 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 현탁액은 최종 분화된 간세포를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 배양물의 유전자 또는 단백질 발현은 생체공학적 조직을 생성시키기에 충분한 시간에 걸쳐 모니터링될 수 있다. 특정 구현예에서, 특정 시점에서의 전구 세포의 배양된 집단의 유전자 또는 단백질 발현 프로파일은 (i) 더 이른 또는 더 늦은 시점에서의 배양된 전구 세포 집단, (ii) 대조 샘플 전구 세포 집단, (iii) 기관 또는 조직으로부터 유래된 분화된 세포 집단으로부터 선택된 세포 집단의 유전자 또는 단백질 발현 프로파일과 비교될 수 있다. 유사하게, 조직의 조직학은 요망되는 표적 조직의 발달의 더 초기인 또는 더 후기인 단계와 비교될 수 있다.
이론에 구속됨이 없이, 생체공학적 조직을 생성시키기에 충분한 시간에 걸쳐, 배양된 세포의 유전자 또는 단백질 발현 프로파일 및/또는 조직학은 기관 또는 조직으로부터 유래된 분화된 세포 집단 또는 이의 덜 분화된 전구체와 유사하도록 변경될 것으로 예상된다.
본 발명의 양태는 스캐폴드가 유래되는 기관의 혈관계의 매트릭스 잔재를 포함하는 3차원 바이오매트릭스 스캐폴드에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 스캐폴드는 스캐폴드가 유래되는 기관에서 발견되는 천연 콜라겐을 또한 포함한다.
본 발명의 추가의 양태는 본원에 개시된 조성물 및 방법을 사용하여 생산된 생체공학적 조직 및/또는 미세 기관에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 생성된 조직은 (a) 문맥 주위 영역, (b) 실질 세포 및 중간엽 세포의 굴모양의 판을 갖는 영역과 같은 그러나 이에 제한되지 않는 천연 간의 성숙시의 계통 의존성 또는 구역화 의존성 표현형 특성을 나타낸다. 표현형 형질은 이배체 세포와 관련된 문맥 주위 형질, 천연 간의 중간 선방 영역에서 발견되는 성숙 실질 세포 및 중간엽 세포의 형질, 중심 주위 구역의 실질 및 중간엽 세포의 형질을 추가로 포함할 수 있다. 생체공학적 조직 및/또는 미세 기관은 (i) 유창 내피 세포와 관련된 다배체 간세포 및/또는 (ii) 중심 정맥의 내피세포에 연결된 이배체 간세포 및/또는 성상 세포와 관련된 담관세포를 추가로 포함할 수 있다. 생체공학적 조직 및/또는 미세 기관이 췌장을 위해 고안된 경우, 선방 및 섬 세포를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 생체공학적 조직 및/또는 미세 기관의 문맥 주위 영역은 간 줄기 세포, 간모세포 및 수임 전구세포를 포함하는 줄기/전구 세포 니치의 형질이 풍부하다. 일부 구현예에서, 생체공학적 조직 및/또는 미세 기관의 실질 세포는 덜 성숙한 (이배체) 간세포 및 담관세포를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 문맥 주위 구역의 생체공학적 조직 및/또는 미세 기관의 중간엽 세포는 성상 세포, 혈관 주위 세포, 평활근 세포 및 내피세포의 전구체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 생체공학적 조직 및/또는 미세 기관의 중간 선방 영역은 성숙 간세포 및 담관세포를 포함하는 성숙 실질 세포의 형질이 풍부하다. 일부 구현예에서, 생체공학적 조직 및/또는 미세 기관의 실질 세포는 간세포 및 담관세포를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 문맥 주위 구역의 생체공학적 조직 및/또는 미세 기관의 중간엽 세포는 성상 세포, 혈관 주위 세포, 평활근 세포, 신경 세포 및 내피세포를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 생체공학적 조직 및/또는 미세 기관의 중심 주위 영역은, 일부는 다배체며 일부는 아폽토시스를 겪는 후기 P450s (예를 들어, P450-3A)와 같은 후기 유전자를 발현하는 성숙 실질 세포, 간세포의 형질이 풍부하다. 일부 구현예에서, 생체공학적 조직 및/또는 미세 기관의 중심 주위 구역의 중간엽 세포는 유창 내피세포를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 생체공학적 조직 및/또는 3차원 미세 기관은 생체 내 또는 생체 외에서의 사용에 유용할 수 있다. 잠재적인 용도의 비제한적인 예는 조직 형태형성, 세포 이동, 클론 계통, 세포 운명 가능성, 종간 발생 시기, 및 세포 유형 특이적 게놈 발현을 연구하기 위한 연구 용도; 특정 기관, 세포 대체 요법, 또는 다른 유형의 기관 특이적 치료를 위한 고효율 약물 스크리닝을 위한 모델로서의 오가노이드의 용도; 및 이식을 포함한다.
본 발명의 양태는 또한 생체공학적 조직 또는 미세 기관의 생산을 위한 적절한 컨테이너 및/또는 배지를 포함하는 키트를 제공한다. 추가의 구현예에서, 키트는 생체공학적 조직 또는 미세 기관을 생성시키는 방법에 관한 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
IV. 실시예
하기 실시예는 본 발명을 실시함에 있어서 다양한 경우에 사용될 수 있는 절차에 관한 비제한적이고 예시적인 것이다. 또한, 이하 본원에 개시된 모든 참고 문헌은 그 전체가 참고로 포함된다.
이하 본원에 개시된 조사를 위한 시약 및 공급품은 다음의 회사로부터 입수하였다: 압캠(Abcam, Cambridge, MA); ACD 랩스(ACD Labs, Toronto, CA); 아크리스 안티바디즈, 인크.(Acris Antibodies, Inc., San Diego, CA); 어드밴스드 바이오사이언스 리소시즈 인크.(Advanced Bioscience Resources Inc. (ABR), Rockville, MD); 애질런트 테크놀로지즈(Agilent Technologies, Santa Clara, CA); 알프코 다이아그노틱스(Alpco Diagnostics, Salem, NH); BD 파밍젠(BD Pharmingen, San Jose, CA); 벡톤 디켄손(Becton Dickenson, Franklin Lakes, NJ); 베틸 래보러토리즈(Bethyl Laboratories, Montgomery, TX); 바이오어세이 시스템즈(BioAssay Systems, Hayward, CA; Cambridge); 아이소토프 래버러토리즈(Isotope Laboratories, Tewksbury, MA); 칼 짜이스 마이크로스코피(Carl Zeiss Microscopy, Thornwood, NY); 캐롤라이나 리퀴드 케미스트리즈, 코프.(Carolina Liquid Chemistries, Corp., Winston-Salem, NC); 찰스 리버 래보러토리즈 인터내셔널, 인크.(Charles River Laboratories International, Inc., Wilmington, MA); 케놈엑스(Chenomx, Alberta, Canada); 콜-파머(Cole-Parmer, Court; Vernon Hills, IL); 다이아파마(DiaPharma, West Chester Township, OH); 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA); 가탄, 인크.(Gatan, Inc., Pleasanton, CA); 일루미나(Illumina, San Diego, CA); 인제뉴이티(Ingenuity, Redwood City, CA); 라이프 테크놀로지즈 코프.(Life Technologies Corp., Grand Island, NY); 라이프스팬 바이오사이언시즈 인크.(LifeSpan Biosciences, Inc., Seattle, WA); 몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices, Sunnyvale, CA); 올림푸스 사이언티픽 솔루션즈 아메리카스 코프.(Olympus Scientific Solutions Americas Corp., Waltham, MA); 폴리사이언시즈, 인크.(Polysciences, Inc., Warrington, PA); 리서치 트라이앵글 랩스( Research Triangle Labs (TRL), Research Triangle Park, NC); R&D 시스템즈(R&D Systems, Minneapolis, MN); 레이바이오테크(RayBiotech, Norcross, GA); 산타 크루즈 바이오테크놀로지, 인크.(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX); 시그마 알드리치(Sigma Aldrich, St. Louis, MO); 투시미스 리서치 코프.(Tousimis Research Corp., Rockville, MD); 키아겐(Qiagen, Germantown, MD); 우메트릭스(Umetrics, Umea, Sweden)
실시예 1 - 인간 간 세포 공급처 및 처리
인간 태아 간은 선택적 임신 중절에 의해 얻어졌고, 인가 기관인 ABR에 의해 제공되었다. 실험에 사용된 조직은 17주 내지 19주 사이의 태아로부터의 것이다. 연구 프로토콜은 유니버시티 오브 노스캐롤라이나 앳 채플 힐(University of North Carolina at Chapel Hill)의 인스티튜셔널 리뷰 보드 포 휴먼 리서치 스터디즈(Institutional Review Board (IRB) for Human Research Studies)에 의해 검토되고 승인되었다. 인간 태아 간 세포 현탁액의 제조 방법은 선행 간행물에 기재되어 있다. 간략하게 설명하면, 간을 먼저 기계적으로 균질화하고, 이어서 0.1% 소 혈청 알부민 (BSA), 1 nM 셀레늄, 300 U/ml의 IV형 콜라게나제, 0.3mg/ml의 데옥시리보누클레아제 및 항생제로 보충된 RPMI-1640의 세포 현탁액에 효소적으로 분산시켰다. 30분 내지 60분 동안 빈번히 교반하면서 32℃에서 분해시켰다. 대부분의 조직은 2회의 분해를 필요로 하며, 그 후 4℃에서 1100 rpm으로 원심 분리하였다. 세포 펠릿을 합치고 세포 세척액 (0.1% BSA, 1 nM 셀레늄 및 항생제를 지닌 RPMI-1640)에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 4℃에서 5분간 300 rpm으로 원심 분리하여 적혈구를 제거하였다. 세포 펠릿을 다시 세포 세척액에 재현탁시키고, 70 ㎛ 나일론 세포 여과기 (Becton Dickenson)를 통해 여과하였다. 1 X 106 세포의 분취량을 분리하고 RNA에 대해 처리하여, qRT-PCR (t=0)을 사용하는 검정을 위한 대조군으로 사용하였다.
성인 인간 조직 (n=3)을 급속 동결 조직으로서 트라이앵글 리서치 래보러토리스(Triangle Research Laboratories, TRL)로부터 입수하고, RNA-시퀀싱을 통한 mRNA 발현을 위한 대조군으로 사용하였다. 세포는 제조사의 지시에 따라 Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 RNA에 대해 처리하였다. 태아 간 줄기/전구 세포 (t=0)와 바이오리액터 (t=14일) 사이의 비교를 위해 3명의 공여자로부터의 결과의 평균을 구하였다. 호르몬 한정 무혈청 배지 (HDM)로서 바이오리액터 실험에서 간세포 분화를 위해 고안된 호르몬 한정 무혈청 배지 (BIO-LIV-HDM)와 전통적으로 사용되는 간세포 배양 배지를 비교하기 위해 TRL로부터 성인 인간 간세포의 새로 분리된 현탁액을 입수하였다. 3 개의 6-웰 샌드위치 배양 플레이트를 인간 공여자당 1 개의 플레이트로 두 가지의 상이한 배지 조건하에서 7일 동안 배양했다. 각 조건에서의 배양물의 3벌(triplicate)을 각 공여자로부터 준비하였다.
실시예 2 - 바이오매트릭스 스캐폴드의 제조 및 분석
래트 간의 탈세포화. 위스타(Wistar) 랫트 (체중 250 내지 300 g)를 찰스 리버 래버러토리스(Charles River Laboratories)로부터 입수하고, UNC 디비전 오브 래버러토리 애니멀 매니지먼트(UNC Division of Laboratory Animal Management )에 의해 통제되는 동물 시설에 수용했다. 랫트는 실험에 사용될 때까지 자유로이 먹게 하였다. 모든 실험 작업은 UNC 인스티튜셔널 애니멀 유즈 앤 케어 커미티(UNC Institutional Animal Use and Care Committee) 지침에 따라 승인되고 수행되었다.
바이오매트릭스 스캐폴드를 생산하기 위해 간을 탈세포화하기 위한 프로토콜은 이전에 기술된 바 있다. 문헌[Wang Y., et al. (2011) Hepatology 53:293-305]; 문헌[Gessner, R.C. et al. (2013) Biomaterials 34:9341-9351]. 수컷 래트를 케타민-자일라진으로 마취시키고 복강을 열었다. 간문맥에 20 게이지 카테터를 삽입하여 간의 맥관에 관류 입구를 제공하고, 대정맥과 간 동맥을 절개하여 관류용 출구를 제공하였다. 간을 복강으로부터 분리하여 관류 바이오리액터에 넣었다. 간을 300ml의 무혈청 DMEM/F12 (Gibco)로 플러싱(flushing)하여 혈액을 제거하였다. 이어서 고염 완충액 (NaCl)으로 90분간 관류하였고; 간에서의 알려진 콜라겐 유형에 대한 용해도 상수는 콜라겐 또는 콜라겐 결합 매트릭스 성분에 결합된 임의의 매트릭스 성분 및 사이토카인/성장 인자와 함께 이러한 콜라겐 유형 모두를 불용성 상태로 유지하는데 3.4 M NaCl이 적절한 정도이다. 간을 무혈청 DMEM/F12로 15분간 린싱하여 탈지 완충액을 제거하고, 이어서 100 ml의 DNase (100 mL당 1 mg, Fisher) 및 RNase (100 mL당 5 mg, Sigma)로 관류하여 임의의 잔류 핵산 오염물을 제거하였다. 마지막 단계는 1 시간 동안 스캐폴드를 무혈청 DMEM/F12로 린싱하여 잔류 염 또는 누클레아제를 제거하는 것이었다. 영상은 도 11에 제공되어 있다. 바이오매트릭스 스캐폴드를 10% 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충된 쿠보타 배지와 함께 마스터플렉스(Masterflex) 연동 펌프 (Cole-Parmer)를 통해 1.3 ml/분으로 2 시간 동안 관류하였다. 프라이밍 후에 태아 간 세포를 즉시 시딩하였다. 세포 현탁액이 세포 현탁액의 제조에 사용된 효소를 제거하기 위해 적절히 처리된 경우, 스캐폴드를 프라이밍하기 위한 SSM을 사용하는 이 단계는 제거될 수 있다.
콜라겐 분석. 바이오매트릭스 스캐폴드 중의 콜라겐의 양은 히드록시프롤린 (hyp) 함량을 기초로 평가되었다. 새로운 간 (n=5)과 바이오매트릭스 스캐폴드 (n=6)의 샘플을 급속 동결시키고 분말로 미분하였다. 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)를 사용하여 총 단백질당 콜라겐 함량을 정량하고, 300 잔기/콜라겐의 히드록시프롤린 값을 기초로 총 콜라겐을 추정 하였다. 검정은 Cytofluor Spectramax 250 멀티-웰 플레이트 리더(multi-well plate reader) (Molecular Devices)로 개별적으로 측정하였다. 하이드록시-프롤린 함량을 사용하여 탈세포화 후 콜라겐 보유의 정도를 평가하였다. 이러한 분석은 HPLC를 사용하여 수행되어, 새로운 조직으로부터의 콜라겐의 양 대 바이오매트릭스 스캐폴드 (탈세포화된 조직)으로부터의 콜라겐의 양을 비교하였다. 결과는 히드록시-프롤린 (콜라겐 단백질에 특이적인 아미노산)의 질량으로 제시된다. 모든 콜라겐 중 약 99%가 래트 간의 탈세포화 후에 존재하는 것으로 결정되었다 (도 1p).
바이오매트릭스의 면역조직화학. 바이오매트릭스 스캐폴드를 OCT에 끼워 넣고, 동결 절편화를 위해 급속 동결시켰다. 동결 절편을 실온에서 1 시간 동안 해동시키고, 이어서 10% 완충 포름알데히드에서 고정시켰다. 고정 후, 절편을 1x 인산염 완충 식염수 (PBS)로 3회 세척한 후, 내인성 퍼옥시다아제를 3% H2O2로 실온에서 15분간 블로킹하였다. 1x PBS로 세척한 후, 절편을 실온에서 1 시간 동안 PBS 중의 2.5% 말 혈청으로 다시 블로킹하였다. PBS 중의 2.5% 말 혈청 중에 희석된 1차 항체를 첨가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날 아침, 절편을 PBS로 3회 린싱하고, 실온에서 30분간 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 노바 레드(Nova Red) 기질 (Vector)을 현상제로서 사용하였고, 제조사의 지시에 따라 제조하였다. 올림푸스(Olympus) IX70 현미경 (Olympus)을 사용하여 영상을 촬영하였다. 바이오매트릭스 스캐폴드의 헤마톡실린 및 에오신 염색은 탈세포화 후 남아 있는 세포가 없음을 보여주었다 (데이터는 제시되지 않음). 탈세포화 후 바이오매트릭스 스캐폴드의 DNA/RNA 함량의 추가 분석이 수행되었고, DNA/RNA 수준은 무시할 정도인 것으로 결정되었다.
조직학은 선방에 걸친 전통적인 위치에 존재하는 콜라겐 I, III, IV, V 및 VI의 존재를 나타내었다 (도 1f 내지 도 1j). 탈세포화 과정 동안 유지되는 높은 삼투압은 콜라겐을 불용성으로 유지하며, 따라서 콜라겐은 바이오매트릭스 스캐폴드에 존재한다. 알시안 블루(Alcian blue) 염색은 세포외 매트릭스의 주성분인 프로테오글리칸도 존재한다는 것을 또한 질적으로 나타내었고 (도 1k, 도 1l); 프로테오글리칸은 성장 인자 및 사이토카인에 대한 화학적 스캐폴드로 알려져 있으며 이러한 인자의 이용 가능성 및 활성에 영향을 미친다. 기저막 세포 부착 분자 (엘라스틴, 피브로넥틴 및 라미닌)는 탈세포화 후에 적절한 구역 위치에서 확인되었다 (도 1m 내지 도 1o). 엘라스틴과 라미닌 둘 모두는 hHpSC와 다른 간 전구체가 존재하는 문맥 주위 영역에서 발견되었다. 피브로넥틴은 모든 구역에 걸쳐 매트릭스 전체에서 확인되었다.
성장 인자. 래트 간 (새로운 조직) 및 래트 간 바이오매트릭스 스캐폴드 (탈세포화된 조직)의 샘플을 매트릭스 결합 성장 인자 및 사이토카인의 존재 및 농도에 대해 분석하였다. 샘플을 액체 질소에서 급속 동결시키고, 액체 질소 온도에서 분말로 미분하고, 분석을 위해 레이바이오테크(RayBiotech)로 보냈다. 반정량적 성장 인자 검정은 RayBiotech® 휴먼 그로쓰 팩터 어레이즈 G1 시리즈(Human Growth Factor Arrays Gl Series) (Raybiotech)를 사용하여 수행하였고, 결과는 형광 강도 단위 (FIU)로 보고하였다. FIU 수준은 비특이적 결합에 대한 음성 대조군으로부터의 결과에 의해 감소하였고, 이를 단백질 농도로 정규화시켰다. 새로운 비탈세포화된 래트 간 조직 (n=3)에서 40 개의 성장 인자를 검정하였고, 바이오매트릭스 간 스캐폴드 (n=3)와 비교하였다. 복제물로부터의 데이터의 평균을 구하였다. 이 검정은 인간 성장 인자를 위해 개발되었지만, 래트 조직에 대한 사용이 허용될 정도로 래트 성장 인자에 대한 교차 반응에 충분한 중첩이 존재한다. 새로운 조직 및 바이오매트릭스 스캐폴드 둘 모두의 세 가지 샘플을 40 개의 성장 인자에 대해 분석하였다 (도 1a). 분석 결과, 생체 내 조직에서 발견되는 모든 성장 인자가 바이오매트릭스 스캐폴드 추출물과 함께 남아 있는 것으로 나타났고; 성장 인자의 대부분이 생체 내보다 낮은 수준이었지만 여전히 생리학적으로 관련있는 수준이었다. 특히 중요한 것은 다수 형태의 FGF, PDGF 및 VEGF과 같은 혈관형성과 관련된 성장 인자; 및 EGF, 헤파린 결합 EGF, HGF, IGF I 및 II 및 이들의 결합 단백질, 및 TGF와 같은 세포 증식 및 분화에 중요한 성장 인자의 존재였다. 이러한 성장 인자의 이용 가능성은 많은 다른 생물학적 기능 (유사 분열뿐만 아니라 조직 특이적 유전자 발현)에 중요하다.
주사 전자 현미경 (SEM). 탈세포화된 간 바이오매트릭스의 영상화는 온전한 간세동이를 포함하는 천연 간의 맥관 구조를 보유함을 보여주었다 (도 1b). 도 1b에 나타낸 바와 같이, 담관, 간동맥 및 간문맥은 모두 명백하다. 또한, 정상적으로 간 실질을 수용하는 벌집 구조는 온전한 상태로 남아 있었지만 세포는 없었다 (도 1c). 엘라스틴, 콜라겐 I 및 III과 같은 매트릭스 분자는 또한 SEM에 의해 확인가능하였다 (도 1d, 도 1e).
실시예 3 - 배지
모든 배지를 멸균 여과 (0.22 ㎛ 필터)하고, 사용하기 전에 4℃에서 어두운 곳에 보관하였다. 기초 배지 및 소 태아 혈청 (FBS)은 깁코/인비트로겐(GIBCO/Invitrogen)으로부터 구입하였다. 모든 성장 인자는 R&D 시스템즈(R&D Systems)로부터 구입하였다. 언급된 것 이외의 다른 모든 시약은 시그마(Sigma)로부터 입수하였다. 배지 비교 연구에 사용되는 전통적인 간세포 유지 배지 (HMM)는 트라이앵글 리서치 래보러토리스 (TRL)로부터 구입하였고, 이는 HEPES, 글루타맥스(GlutaMax), ITS+ (인슐린, 트랜스페린 및 셀레늄), 덱사메타손, 및 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 윌리엄 E 배지(William 's E Medium)를 함유하였다.
시딩 배지. 쿠보타 배지는 내배엽 줄기/전구세포의 클론원성 자기 복제 증식을 위해 고안된 완전 한정 무혈청 배지이다. 이는 태아 간 세포의 단층 배양 또는 오가노이드 배양을 위해 무혈청으로 사용되었다. 쿠보타 배지는 뮤린, 설치류 및 인간 간/전구세포의 배양 선택에서 효과적인 것으로 밝혀졌다. 이 배지는 구리가 없고, 저 칼슘 (0.3 mM), 1 nM 셀레늄, 0.1% 소 혈청 알부민 (정제되고 지방산이 없음; 분획 V), 4.5 mM 니코틴아미드, 0.1 nM 황산 아연 7수화물, 5 μg/ml 트랜스페린/Fe, 5 ㎍/ml 인슐린, 10㎍/ml 고밀도 지질단백질, 및 정제된 유리 지방산의 혼합물이 함유된 RPMI-1640으로 구성된다. 이의 제조는 방법에 대한 재검토에서 상세히 제공된다. 문헌 [Wauthier, E. et al. Hepatic stem cells and hepatoblasts: identification, isolation and ex vivo maintenance Methods for Cell Biology (Methods for Stem Cells) 86, 137-225 (2008)]. 생체공학적 간을 확립하기 위해 사용되는 경우, 쿠보타 배지는 간 세포 현탁액을 제조하는데 사용된 효소를 극복하기 위해 일시적으로 10% FBS로 보충되고, 이어서 실질 및 비-실질 세포 둘 모두의 최적 분화를 위해 조정되고 BIO-LIV-HDM으로 일컬어지는 무혈청 호르몬 한정 배지로 바뀌었다.
인간 간 조직을 생성시키는 분화 배지 (BIO-LIV-HDM). 세포를 시딩 배지에서 최초 36 시간 배양한 후 바이오리액터에서 14 일 동안 덱사메타손 (0.04 mg/L), 프롤락틴 (10 IU/L), 글루카곤 (1 mg/L), 니코틴아미드 (10 Mm), 트리요오도티로닌 (T3, 67 ng/L), 표피 성장 인자 (EGF, 20 ng/ml), 고밀도 지질단백질 (HDL, 10 mg/L), 간세포 성장 인자 (HGF, 20 ng/ml), 인간 성장 호르몬 (hGH, 3.33 ng/ml), 혈관 내피 성장 인자 (VEG-F, 20 ng/ml), 인슐린 유사 성장 인자 (IGF, 20 ng/ml), 고리형 아데노신 일인산염 (2.45 mg/L), 염기성 섬유모세포 성장 인자 (bFGF, 20 ng/ml), 갈락토스 (0.16 g), 안지오포이에틴 (0.2 mg/ml), 유리 지방산의 혼합물, L-글루타민 및 항생제로 보충된 쿠보타 배지를 함유하는 HDM에서 배양하였다. 이 HDM은 시딩 후 3 일째에 시작하였고, 이어서 이후 2 일마다 교체하였다. 모든 시약은 R&D 시스템즈로부터 입수하였다. BIO-LIV-HDM은 2 mM 암모니아의 첨가에 반응하는 알부민 생산과 요소 분비 둘 모두에서 전통적인 간세포 유지 배지 (HMM)보다 더 성공적인 것으로 판명되었다 (도 12). 그러나, 알부민 결과는 다른 2명의 공여자와 비교하여 극히 높은 수준의 알부민을 발현하는 1명의 공여자 샘플로 인해 유의할 만한 차이가 없었고, 이는 큰 표준 편차를 가져왔다. 통계 유의성은 장래에 성인 간 공여자의 추가적인 준비로 명확해질 것이며, 이는 본원에 보고된 표준 편차를 최소화할 것이다. 모든 3명의 공여자는 요소 분비에서 동등한 성능을 발휘하였다. BIO-LIV-HDM 중의 샘플은 1 일, 4 일, 6 일 및 7 일째에 유의하게 높았다 (p<0.05).
실시예 4 - 생체공학적 간 조직의 생성
인간 간 줄기/전구 세포를 분리하고, 시딩할 때까지 4℃에서 4 시간 동안 쿠보타 배지에서 저장하였다. 이 세포를 연동 펌프를 통해 간문맥의 매트릭스 잔재를 통한 관류에 의해 도입시키고, 10% FBS (시딩 배지)로 보충된 쿠보타 배지에 시딩하였다. 대략 90 X 106의 총 세포를 20분 간격으로 스캐폴드 내로 관류시켰다. 각 간격 동안, 30 x 106 세포를 15 ml/분으로 10 분간 관류시킨 후, 10 분간 휴지 (0 ml/분)시켰다. 이를 3회 반복했다. 일단 모든 세포가 매트릭스 스캐폴드에 도입되면, 유량을 1.3 ml/분으로 낮추고, 스캐폴드를 시딩 배지와 함께 36 시간 동안 관류시켰다. 시딩 후, 시딩 배지를 수집하고, 배지에 남아 있는 임의의 세포를 혈구 계수기로 계수하였다. 이어서 배지를 분화 배지 (BIO-LIV-HDM)로 변경하고, 그 후 이를 2 일마다 교체하였다. 리시딩(reseeding)된 매트릭스 스캐폴드를 바이오리액터에서 14 일 이하 동안 배양하였다. 14 일 후, 리시딩된 매트릭스 스캐폴드의 로브(lobe)를 조직학 및 면역조직화학을 위해 동결시키고, 주사 전자 현미경 (SEM) 및 투과 전자 현미경 (TEM)을 위해 고정시키거나 RNA 시퀀싱을 위해 급속 동결시켰다 (t=14 일). 이러한 바이오리액터의 분석은 Bio_FL724, Bio_FL728, 또는 Bio_FL732로 제시되며, 이는 각각의 세포로 시딩된 바이오리액터를 나타낸다. 36 시간의 시딩 후, 약 99%의 세포가 매트릭스에 부착되었으며, 이는 수집되어 혈구 계수기에 의해 계수된 시딩 배지에서 발견된 세포의 결여에 의해 입증되었다 (데이터는 제시되지 않음). 헤마톡실린과 에오신 (H&E)에 의한 염색시에, 혈관 주위 및 실질 전체에서 많은 수의 세포가 발견되었다 (데이터는 제시되지 않음). 배양 14 일 후에 촬영한 SEM 영상화는 맥관을 라이닝하는 내피 세포를 보여주었다 (도 3i 및 도 7b).
조직학. (도 3)은 면역세포화학과 면역형광법에 의해 확인된 단백질의 위치와 발현을 나타낸다. 성숙 마커의 발현은 배양 14 일 후 태아 간 세포의 분화 및 재조직화를 나타낸다. 문맥 주위 영역인 구역 1에서, 세포는 간 줄기 세포 및 간모세포에서 공동 발현되는 바이오마커인 EpCAM 및 CK19를 발현하며, 담관를 둘러싸는 것으로 발견된다. 이 구역은 간모세포의 바이오마커인 AFP를 발현하는 세포를 또한 함유한다. 이 도면에는 발달하기 시작한 간세포삭(hepatic cord)뿐만 아니라 간세포가 세포-세포 연결부를 형성하는 부위에 국소화되는 간세포 극성의 마커인 E-카드헤린의 발현이 나타나 있다. 담즙 수송의 마커인 MRP2는 간 세포의 내강측에서 확인되며, 이는 세포 극성을 확인하는데 도움이 된다. 이 세포는 담관을 둘러싸고, 이는 담즙의 분비와 같은 잠재적 담즙 기능을 나타내는 것으로 여겨진다. 과요오드산-쉬프 (PAS) 염색에 의해 확인되는 글리코겐 저장은 또한 실질 내의 세포에서 또한 명백하였다. 글리코겐은 선방 전체에서 간세포에서 발견될 수 있지만, 문맥 주위 영역에 있는 것들은 최고 수준의 글리코겐 저장을 함유하였다. 구역 구배를 따라, 세포는 Cyp3A4 및 알부민 (모든 구역에서 발견됨)과 같은 중심 주위 구역 (구역 3)을 나타내는 마커를 발현하는 실질에서 발견되었다. 일반적으로, 대다수의 세포는 문맥 주위 영역에서 정상적으로 발견되는 세포 및 중간 선방 및 중심 주위 영역에서 발견되는 성숙 세포와 일치하는 분화 상태를 획득했다.
간 실질 세포 계통의 세포외에도, 데스민의 발현에 의해 확인되는 성상 세포, 및 굴모양의 내피 세포인 lyve-1+ 세포가 생체 내의 위치에 상응하는 스캐폴드 내의 위치에 국소화된 것으로 발견되었다. 성상 세포는 전형적으로 이의 상피 파트너와 공동 국소화되며, 유사 분열 및 특수화된 세포 기능에 관여하는 측분비 신호전달에 필수적이다. 조직학 사진에서 이 세포의 모양은 세포가 세포 주위를 감싸는 과정에서 찌부러지기 때문에 가늘었다 (양성 대조군 사진이 참고로 나타남). 알파-평활근 액틴 (αSMA)을 발현하는 세포는 혈관 구조 주위에서 발견되었다. αSMA 양성 세포는 가능하게는 혈관 주위 세포였고, 이는 혈관을 라이닝하는 것으로 발견된 내피 세포인 CD31+ 세포와 함께 증식하도록 활성화될 수 있다. 이들은 면역조직화학과 SEM 둘 모두에 의해 명백하였다 (도 3i). 증식은 Ki67 염색 (데이터는 제시되지 않음)에 의해 명백하였고, 혈관 주위에 위치한 세포에서 주로 발견되었다. 큰 세포는 Ki67에 대해 양성으로 염색되지 않았고, 이에 따라 비증식성인 완전 성숙 상태인 것으로 추정된다.
RNA 시퀀싱. 본 발명자들은 3 개의 상이한 바이오리액터로부터의 샘플에 대해 페어드-엔드(paired-end) 고처리량 RNA 시퀀싱을 수행하여, 샘플당 평균 약 200만 개의 페어드-엔드 판독값을 얻었고, 이 중 평균 약 87%가 인간 게놈에 특유하게 맵핑되었다. RNA 시퀀싱 데이터를 분석함으로써 수 많은 기능성의 양상 및 분화 단계가 확인되었다. 우선, 바이오리액터 내의 세포가 MMP-2 및 MMP-9 (매트릭스 분해 효소, 도 4a)의 증가된 발현 및 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴,및 펄레칸(perlecan)의 증가된 발현에 의해 확인 가능한 매트릭스를 리모델링했다는 것이 분명하다 (도 4b 내지 도 4e). 이들 유전자의 mRNA 발현 수준은 펄레칸을 제외하고 태아 및 성인 간 샘플 둘 모두와 비교하여 바이오리액터에서 모두 유의하게 높았고 (p<0.05), 펄레칸의 경우 바이오리액터가 성인 간 세포보다 단지 유의하게 높았으며, 라미닌 10 및 11의 경우 샘플간에 유의한 차이는 없었다. 바이오리액터 내의 태아 간 유래 줄기/전구 세포가 모든 성숙 실질 세포 계통 단계를 나타내도록 분화되었다는 표시가 또한 있었고, 이는 태아 유전자의 감소된 발현과 더 성숙한 유전자의 상향 조절에 의해 명백하였다 (도 5 및 도 6). 간세포 줄기 세포에 대한 공지된 마커인 LGR5 및 EpCAM과 같은 태아 유전자는 태아 세포와 비교하여 바이오리액터 샘플에서 발현 수준이 유의하게 낮았으며, 각각 3.4배와 1.2배의 변화가 있었다 (도 5). 유사하게, 간모세포를 확인하는 것으로 가장 잘 알려진 유전자인 AFP는 바이오리액터 샘플 및 성인 간 조직과 비교하여 태아 조직에서 11배가 넘게 높았고; 바이오리액터와 성인 간 조직의 수준간에 유의한 차이는 없었다.
대조적으로, 성숙 간 마커에 대한 유전자 발현 수준은 태아 조직과 비교하여 바이오리액터 샘플에서 1 주일 미만 이내에 꾸준히 상승하였고, 이는 간 실질 세포 계통의 성숙 발달을 나타낸다. 구역 1에서, 성숙 담즙 마커인 CK7, SLC4A2, JAG1, HNF1B 및 SCTR (도 6)은 태아 및 성인 간 샘플과 비교하여 모두 상향 조절되었다. 태아 간 세포와 비교하여 가장 유의하게 증가된 것은 CK7, JAG1 및 SCTR이었고, 이들은 각각 98배, 1.75배 및 1.85배가 넘게 높았다. 바이오리액터 샘플에서 상향 조절된 대사 기능의 구역 3 마커의 발현 수준은 성숙 형태의 P450 유전자 (CYP1 A1, CYP-1B1 및 CYP-2C8)을 포함하였고; 모든 유전자는 태아 세포에 비해 적어도 3배 넘게 증가하였고; UDP-글루쿠로닐 트랜스퍼라제 UTG1A1은 태아 세포와 비교하여 약 10배 증가하였고; 지질 및 콜레스테롤 대사에 관여하는 유전자 (ACOX3, APOL6, LDLR)에서는 LDLR에서 단지 유의하게 높았다. 이 성숙도는 태아 간 샘플과 비교하여 바이오리액터 조직에서 P450의 태아 형태인 P450의 발현이 4배 넘게 감소한 것에 의해 추가로 암시되었다 (데이터는 제시되지 않음). 성숙 간세포에 대한 또 다른 마커인 C/EBP는 바이오리액터에서 또한 증가하였지만 유의한 것은 아니었고, 태아 간과 비교하여 HNF4a 발현에는 변화가 나타나지 않았다.
바이오리액터에서 측정된 유전자 발현 수준은 태아 간의 수준을 넘는 주로 성숙을 암시하는 수준이지만, 대부분의 경우 성인 조직의 수준과는 여전히 구별된다. 이는 추가의 성숙을 위해 배양 또는 변형된 배양 조건 (예를 들어, 혈청 사용의 추가 감소, 산소 공급의 더 큰 조절)에서 추가 시간이 필요함을 암시한다. 이를 염두에 두고, Yap, 관련 표적 유전자, 및 Hippo의 유전자 발현 수준은 모두 재생 과정이 활발함을 나타낸다. Hippo 키나아제인 MST1의 유전자 발현 수준은 태아 및 성인 간과 비교하여 바이오리액터에서 유의하게 낮았고; 병행하여, Yap 신호전달 유전자는 태아 및 성인 간과 비교하여 바이오리액터에서 모두 유의하게 증가하였다 (도 7a). 혈관형성 마커의 유전자 발현은 바이오리액터 조직이 혈관형성 및 혈관생성을 겪고 있음을 나타냈다 (도 7b). VEGF, VEGF-B 및 CD133의 발현 수준은 태아 간 세포와 비교하여 바이오리액터 샘플에서 모두 증가되었고, 특히 VEGF 및 CD133에서 특히 유의한 차이를 나타내었다 (p<0.05).
RNA 시퀀싱 데이터에 기초해 볼 때, 조혈 분화의 암시가 존재한다 (도 7c). 더 초기의 조혈 줄기 세포의 마커 (Gata-2, SCF 및 IL-7R)의 마커는 바이오리액터 샘플에서 하향 조절되었는데, 태아 조직에서 발견되는 수준에서 성인 간에서의 수준과 일치하는 수준으로 이행하였다. 동시에, 림프 및 골수 계통의 성숙 조혈 세포의 유전적 프로파일은 또한 태아 간, 바이오리액터 및 성인 간에서 상이하다. 바이오리액터 샘플은 성인 간에서 발견되는 것과 유사한 CD3의 유전자 발현 수준을 가지며; Rag1 발현은 상승하고 (둘 모두의 유전자 (Rag1과 CD3)는 T 세포와 관련됨), CSF 발현 (골수 세포에 의해 발현됨)은 태아 및 성인 간 둘 모두와 비교하여 유의하게 높다. 이들 마커는 가능한 조혈을 나타내지만, 정확한 해석이 가능하도록 더 광범위한 분석이 필요하다.
세포 생존력. 간 세포 건강을 평가하기 위해 사용되는 아미노트랜스퍼라제 효소인 ALT와 AST를 2 일, 4 일, 6 일, 8 일, 10 일, 12 일 및 14 일째에 평가하였다. 이 실험 동안 어느 시점에서도 ALT 수준은 검출 하한을 초과하지 않았다 (데이터는 제시되지 않음). 따라서, ALT는 이 생체 외 모델 시스템에 대한 민감한 바이오마커가 아닌 것으로 결정되었다. Bio_FL724는 배양 전 기간에 걸쳐 검출 하한 (4U/L)을 넘는 측정 가능한 수준의 AST를 가진 유일한 바이오리액터였다 (데이터는 제시되지 않음). 각 바이오리액터에 대한 LDH 수준 (도 8a)은 초기에는 높았지만 시간이 지남에 따라 감소했다. 그러나, 배양 첫째 날 이후, 각 시점에서의 LDH에 대한 측정치는 초기 측정치보다 유의하게 낮았다 (p<0.05). 이 데이터의 해석은 초기 며칠 동안 단리 절차 및/또는 시딩 과정으로부터의 스트레스로 인해 더 큰 턴오버(turnover)를 지닌 세포가 존재하였다는 것이다. 이 회복 기간 후에, 세포는 빠른 간 기관형성을 암시하는 표현형 형질을 발생시켰다.
배지 중의 전장 K18 (FL-K18) 수준 (따라서, 세포로부터 분비되거나 방출됨)은 괴사에 특이적이며; 값은 모든 바이오리액터에서 기준선 (25.3 U/L)보다 높았다. FL-K18 수준의 경향은 모든 3 개의 바이오리액터에서 유사하였다. 수준은 2 일째에 유의하게 높았고 (도 8a), 이는 세포 스트레스 또는 분리 절차로부터의 손상으로 인한 것으로 추정된다. 2 일째 이후, 수준이 유의하게 감소하였고, 4 일째 및 6 일째에는 2 일째의 초기 판독값보다 유의하게 낮았다 (p<0.05). 배양시 세포 괴사가 적음을 암시하는 FL-K18의 초기 하강은 완전한 세포 사멸에 반응하는 것일 수 있고, 특히 Bio_FL728 및 Bio_FL732의 경우 남아 있는 세포는 더 건강한 세포의 선택이 존재함을 나타낸다. 그러나, 8 일째 내지 12 일째 동안 FL-K18이 증가하였고, 이어서 수준이 다시 하강하였다.
검출된 ccK18 (도 8a)의 수준은 FL-K18 수준과 유사한 경향을 따르는데, 수준은 대략 6 일째에 상승하기 시작하고, 대략 8 일째에 정점에 이르고, 이어서 감소한다. 이 데이터가 높은 아폽토시스 조건을 암시할 수 있지만, 배양 전체 시간에 걸쳐 수준의 유의한 차이는 없었고, 이는 시간이 지남에 따른 아폽토시스의 유의한 증가는 없음을 암시한다.
종합해 보면, 세포 생존력 및 건강을 기술하는 데이터는 분리 및 시딩 과정에서 손상된 세포가 제거된 경우 세포는 2일 내지 3일의 과도기를 경험한 후, 남아 있는 세포가 안정화되고, 이어서 분화됨을 암시하였다.
FL-K18 및 ccK18의 상승은 모든 3 개의 바이오리액터에서 세포에 의한 알부민의 분비 증가에 또한 상응하였다. 이 증가는 정상 세포 주기 과정의 일부로서 아폽토시스를 겪고 있는 최종 분화된 다배체 간세포로 인한 것으로 가정된다. 이러한 아폽토시스의 정점 이후, ccK18 수준이 즉시 하강하였고, 이는 전구 세포가 손실된 중심 주위 간세포를 대체하기 위해 성숙을 겪고 있음을 암시한다.
AFP (도 8b). 각 바이오리액터는 샘플 수집의 첫째날인 2 일째에 구별되는 AFP의 출발 수준을 나타내었고, 이는 t=0에서의 태아 간 세포 사이의 유전자 발현의 차이와 일치한다. AFP의 초기 값에 관계없이, 시간이 지남에 따른 생산의 급격한 하락이 존재하였다.
알부민 (도 8b). 모든 3 개의 바이오리액터에서 알부민 생산 수준은 초기에는 낮았지만, 시간이 지남에 따라 꾸준히 상승하였고, 6 일째 내지 10 일째 사이에 유의하게 높은 수준이 나타났다 (p<0.05). 개별 바이오리액터에 의해 생산된 알부민의 실제 양은 달랐지만, 생산 증가의 전반적인 경향은 모든 바이오리액터에서 일관되었다. 수준은 8 일째까지 정점에 이르렀고, 10 일째까지 감소하였다. 상승과 하강은 세포가 후기 계통 단계인 알부민의 대량 생산에 의해 나타나는 아토사이트(atocyte)로 분화하는 것에 상응하는 것으로 가정된다. 세포는 후속하여 아폽토시스를 겪었고, 이는 전구 세포가 재생 과정을 계속함에 따라 알부민 생산의 감소를 가져왔다. 데이터의 이러한 해석은 각 시점에서 측정된 ccK18 수준에 의해 또한 뒷받침된다.
요소 (도 8b). AFP와 알부민의 생산과는 달리, 14일에 걸쳐 요소 수준은 급격하게 변하지 않았다. 모든 3 개의 바이오리액터는 2 일째에 가장 많은 양의 요소 분비를 나타냈고, 그 이후에는 약간 감소했다. 10 일째까지 요소 수준은 2 일째의 초기 값보다 유의하게 낮았으며 (p<0.05), 전반적으로 분비는 시간이 지남에 따라 일정하게 유지되는 것으로 나타났다.
세포 대사체학 (Cell Metabolomics) 세포의 기능성을 대사 활성에 의해 평가하고, 핵 자기 공명 (MR) 분광법에 의해 측정하였다 (도 9). 주성분 분석 (PCA, 도 9b)을 수행하였고, 이는 바이오리액터 중 2개인 Bio_FL724 및 Bio_FL732가 세 번째인 Bio_FL732와 비교하여 배양시 더 유사하게 반응하였음을 나타낸다. 모든 바이오리액터에서 세포는 배지에 제공된 글루코스, 글루타민, 피루베이트 및 아세테이트를 소비 및 대사하였고, 이들을 락테이트의 생산으로 전환시켰다 (도 9a). 이러한 작용은 세포가 해당 과정을 겪고 크렙(Kreb) 주기로 들어간다는 것을 결정적으로 보여준다. Bio_FL724는 2 일째까지 즉시 활성이었으며, Bio_FL728은 6 일째까지 유사한 경향을 나타냈다. 세 번째 바이오리액터인 Bio_FL732는 8 일째까지 대사적으로 활성이 되었지만, 다른 두 바이오리액터보다 훨씬 낮은 수준이었다. 이는 2 개의 바이오리액터인 Bio_FL728 및 Bio_FL732가 시딩 과정으로부터의 가능한 스트레스로부터 회복해야 하는 지체 시간이 존재하였거나 분리시에 세포가 Bio_FL724만큼 건강하지 않아서 대사적으로 활성이 되는데 더 많은 시간을 필요로 하였음을 암시한다. VIP 플롯 (도 9c)은 분리에 기여하는 대사 산물을 나타낸다. VIP >= 1.0이 중요한 것으로 간주된다.
투과 전자 현미경 (TEM) 각각의 바이오리액터에서의 세포의 조직화를 TEM에 의해 추가로 평가하였다. 기능적이기 위해, 상피 세포는 세포 극성, 이웃 세포와의 세포 신호전달, 및 매트릭스와의 상호 작용에서 중요한 세포-세포 연결부를 형성해야 한다. 간세포가 함께 모여서 분비된 담즙을 수송하기 위한 필수 배열인 담세관 (도 10a 내지 도 10c)을 사이에 지닌 시트 또는 판을 형성함에 따라 연접 복합체 (도 10e, 도 10f)의 성분이 TEM 영상화에 의해 시각화되었다. 이 간세포 유사 세포들 사이에 굴모양의 공간이 관찰되었으며 (도 10a), 담세관 공간 주위에 가능한 분비성 소포가 나타났다 (도 10b). 간세포외에도, 분화 과정에서 내피 세포, 성상 (Ito) 세포, 및 줄기 세포를 암시하는 물리적 특성을 지닌 여러 세포가 존재하였고, 이는 TEM에 의해 확인되었다 (데이터는 제시되지 않음). 세포의 시딩은 전체 바이오매트릭스 스캐폴드에 걸쳐 균일하지 않았으며, 이는 TEM 영상에 표시된 기관발생 과정 결과 내에서 다양한 단계의 세포를 지닌 부위를 초래하였다. 세포와 관련이 없는 영상에 지질 소적이 나타났는데 (데이터는 제시되지 않음), 이는 괴사와 아폽토시스 데이터에 나타난 것과 유사하게 영상화를 위한 샘플의 준비 동안 또는 배양시 세포의 노화 과정 동안 일어났을 수 있는 세포 파괴의 표시일 수 있다.
실험 5: 스캐폴드 중의 콜라겐의 특성 규명
혈액 및 간질 유체의 양을 최소화하기 위해 조직을 린싱한다. 대부분의 원섬유 콜라겐은 사람들이 사용하는 전형적인 초기 린스인 인산염 완충 식염수 (PBS)로 추출할 수 없다. 그러나, 프로콜라겐(procollagen), 콜라겐 단량체 (원섬유가 형성되기 전) 및 비-원섬유 콜라겐 유형 (예를 들어, IV형, VI형)을 포함하는 가교되지 않은 콜라겐 및 관련 매트릭스 성분은 PBS로 추출할 수 있다. 따라서, 초기 린스는 기초 배지 (아미노산, 영양분, 지질, 비타민, 미량 원소 등의 혼합체)를 사용하여 콜라겐을 용액이 되지 않게 하는 이온 강도로 수행한다.
다른 사람들에 의해 사용되는 탈지 단계는 조직이 탈지 처리되는데 긴 시간 (때때로 수 시간 또는 심지어 수 일)이 소요된다. SDS는 매트릭스에 매우 단단히 결합하고 매트릭스를 독성이 되게 한다. Triton-X 및 기타 이러한 강력한 세정제는 다양한 매트릭스 성분을 가용화한다. 하나의 절차는 SDS에 이어 Triton-X를 사용하는데, 이는 "매우 깨끗한" 스캐폴드를 가져오는 절차이지만, 실제로는 많은 것이 손실되었기 때문에 "깨끗한"것으로 보이는 것이다. 따라서, 저농도의 담즙산염과 나트륨 데옥시콜레이트는 포스포리파아제와 함께 신속하고 매우 온화한 탈지를 가져온다. 탈지는 20분 내지 30분 내에 수행한다.
추출이 저 이온 강도 완충액 (1 M 미만의 NaCl의 완충액)을 사용하여 추출이 수행된 경우 가교되지 않은 콜라겐의 유의한 손실이 초래되고; 1 M NaCl의 완충액은 전부는 아니지만 (네트워크 콜라겐은 아님) 일부 콜라겐 (대부분 I형 콜라겐)을 보존한다. 따라서, 본 발명의 방법은 콜라겐 (원섬유 또는 네트워크; 가교되거나 가교되지 않은 것)을 어느 것도 잃지 않으므로 이에 결합된 모든 것을 보존한다. 대조적으로, 증류수를 사용하는 방법은 고도로 가교된 콜라겐외의 물에 가용화되는 모든 콜라겐뿐만 아니라 이에 결합된 성분을 잃을 수 있다.
핵산은 당업계의 표준 방법에 따라 분리한다.
바이오매트릭스 스캐폴드를 분리함으로써 수득되는 차별점은 상청액을 수집하고, 투석하고, 동결 건조시키고, 아미노산, 가교 결합, 웨스턴 블롯, 및 성장 인자 분석에 의해 콜라겐 함량을 측정하는 것에 의해 특성 규명된다. 이는 이 방법에 의해 보존된 콜라겐을 결정할 것이다. 병렬 추출은 a) PBS를 사용하여; b) 저 이온 강도 완충액을 사용하여; c) 다양한 탈지 방법 후에; d) 증류수를 사용하여 수행한다. 이들 각 단계로부터의 상청액을 수집하여 콜라겐이 손실되었는지의 여부 및 손실 정도를 평가하기 위해 아미노산 분석을 수행한다. 콜라겐 양이 상당한 것으로 결정된 경우, 상청액 중의 콜라겐을 [3H]-NaBH4로 처리하고, 가수 분해하고, 가교 결합 분석을 수행한다. 또한, 항체를 사용한 웨스턴 블럿 분석을 수행하여 가교의 정도와 존재하는 콜라겐의 유형을 확인한다. 추가로, 성장 인자 분석을 수행하여 생성된 스캐폴드를 특성 규명한다.
예시적인 구현예
비제한적인 예시적 구현예가 이하 본원에 제공된다:
[1] 생체공학적 조직 생성용 컨테이너로서, 상기 생성은 상피 및 중간엽 세포를 바이오매트릭스 스캐폴드 내로 또는 바이오매트릭스 스캐폴드 상으로 도입하는 것을 포함하고, 상기 바이오매트릭스 스캐폴드는 콜라겐을 포함하는, 생체공학적 조직 생성용 컨테이너.
[2] [1]에 있어서, 상피 및 중간엽 세포는 성숙 계통 파트너인, 컨테이너.
[3] [1] 또는 [2]에 있어서, 상피 및 중간엽 세포는 시딩 배지 중에 있고, 상기 시딩 배지는 초기 인큐베이션 기간 후에 분화 배지로 교체되는, 컨테이너.
[4] [3]에 있어서, 상기 분화 배지는,
a. 기초 배지,
b. 지질, 인슐린, 트랜스페린, 항산화제,
c. 구리,
d. 칼슘,
e. 상피 세포의 증식 또는 유지를 위한 하나 이상의 신호, 및/또는
f. 중간엽 세포의 증식 또는 유지를 위한 하나 이상의 신호를 포함하는, 컨테이너.
[5] [3] 또는 [4]에 있어서, 상기 시딩 배지는 무혈청이거나, 선택적으로 수 시간의 지속 기간에 걸쳐, 약 2% 내지 10%의 태아 혈청으로 보충되는, 컨테이너.
[6] [3] 내지 [5]에 있어서, 상기 시딩 배지는,
a. 기초 배지
b. 지질
c. 인슐린
d. 트랜스페린
e. 산화 방지제를 포함하는, 컨테이너.
[7] [3] 내지 [6] 중 어느 하나에 있어서, 상기 시딩 배지 중의 상기 상피 및 중간엽 세포는 상기 바이오매트릭스 스캐폴드 내로 도입되기 전에 상기 시딩 배지에서 4℃에서 4 내지 6 시간 동안 인큐베이션되는, 컨테이너.
[8] [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서, 상기 바이오매트릭스 스캐폴드는 3차원인, 컨테이너.
[9] [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 있어서, 상기 바이오매트릭스 스캐폴드 중의 콜라겐은 (i) 신생 콜라겐, (ii) 응집된 그러나 가교되지 않은 콜라겐 분자, (iii) 가교된 콜라겐을 포함하는, 컨테이너.
[10] [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 있어서, 상기 시딩 배지 중의 상기 상피 및 중간엽 세포는 다수의 간격으로 도입되고, 각각의 간격에는 휴지 기간이 뒤따르는, 컨테이너.
[11] [10]에 있어서, 상기 간격은 약 10 분이고, 상기 휴지 기간은 약 10 분인, 컨테이너.
[12] [10] 또는 [11]에 있어서, 상기 시딩 밀도는 상기 바이오매트릭스 스캐폴드의 습윤 중량 그램당 약 1200만개 이하의 세포이고, 1회 이상의 간격 동안 도입되는, 컨테이너.
[13] [10] 내지 [12] 중 어느 하나에 있어서, 상기 시딩 배지 중의 상기 상피 및 중간엽 또는 비-실질 세포는 1회 이상의 간격 동안 약 15 ml/분의 속도로 도입되는, 컨테이너.
[14] [10] 내지 [13] 중 어느 하나에 있어서, 상기 시딩 배지 중의 상기 상피 및 중간엽 세포는 10 분 간격으로 도입되고, 각각 10 분의 휴지 기간이 뒤따르는, 컨테이너.
[15] [10] 내지 [14] 중 어느 하나에 있어서, 상기 시딩 배지 중의 상기 상피 및 중간엽 세포는 3회의 간격 후에 1.3 ml/분의 속도로 도입되는, 컨테이너.
[16] [1] 내지 [15] 중 어느 하나에 있어서, 상기 상피 및 중간엽 세포는 태아 또는 신생아 기관으로부터 분리된 세포를 포함하는, 컨테이너.
[17] [1] 내지 [15] 중 어느 하나에 있어서, 상기 상피 및 중간엽 세포는 성인 또는 아동 공여자로부터 분리된 세포를 포함하는, 컨테이너
[18] [1] 내지 [17] 중 어느 하나에 있어서, 상기 상피 및 중간엽 세포는,
a. 줄기 세포, 수임 전구세포, 이배체 성체 세포, 다배체 성체 세포, 및/또는 최종 분화된 세포 중 하나 이상을 포함하는 상피 세포 및/또는
b. 혈관모세포, 내피의 전구체, 성숙 내피, 성상 세포의 전구체, 성숙 성상 세포, 간질의 전구체, 성숙 간질, 평활근 세포, 조혈 세포의 전구체, 및/또는 성숙 조혈 세포 중 하나 이상을 포함하는 중간엽 세포를 포함하는, 컨테이너.
[19] [1] 내지 [18] 중 어느 하나에 있어서, 상기 상피 및 중간엽 세포는,
a. 담도계 줄기 세포, 담낭 유래 줄기 세포, 간 줄기 세포, 간모세포, 수임 간세포 및 담즙 전구세포, axin2+ 전구세포 (예를 들어, axin2+ 간 전구세포), 성숙 실질 세포 (예를 들어, 간세포, 담관세포), 췌장 줄기 세포, 및 췌장 수임 전구세포, 섬 세포, 및/또는 선방 세포 중 하나 이상을 포함하는 상피 세포, 및/또는
b. 혈관모세포, 성상 세포 전구체, 성상 세포, 중간엽 줄기 세포, 혈관 주위 세포, 평활근 세포, 간질 세포, 내피 세포 전구체, 내피 세포, 조혈 세포 전구체, 및/또는 조혈 세포 중 하나 이상을 포함하는 중간엽 세포를 포함하는, 컨테이너.
[20] [1] 내지 [19] 중 어느 하나에 있어서, 상기 상피 세포는 담도계, 간, 췌장, 간-췌장 공통관, 및/또는 담낭으로부터의 줄기 세포 및 이의 후손 중 하나 이상을 포함하고 그리고/또는 중간엽 세포는 혈관모세포, 내피세포 및 성상 세포의 전구체, 중간엽 줄기 세포, 성상 세포, 간질, 평활근 세포, 내피세포, 골수 유래 줄기 세포, 조혈 세포 전구체, 및/또는 조혈 세포 중 하나 이상을 포함하는, 컨테이너.
[21] [1] 내지 [20] 중 어느 하나에 있어서, 상기 상피 및 중간엽 세포는 각각 약 80%의 상피 및 20%의 중간엽으로 구성되는, 컨테이너.
[22] [1] 내지 [21] 중 어느 하나에 있어서, 상기 상피 및 중간엽 세포는 적어도 50%의 줄기 세포 및/또는 전구 세포를 포함하는, 컨테이너.
[23] [1] 내지 [22] 중 어느 하나에 있어서, 상기 상피 및 중간엽 세포는 임의의 최종 분화된 간세포 및/또는 췌장 세포를 포함하지 않는, 컨테이너.
[24] [1] 내지 [23] 중 어느 하나에 있어서, 상기 바이오매트릭스 스캐폴드는 하나 이상의 콜라겐 관련 매트릭스 성분을 포함하고, 상기 매트릭스 성분은 상기 매트릭스 성분과 관련된 라미닌, 니도겐, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 하이알루로난, 비-황산화 글리코사미노글리칸, 황산화 글리코사미노글리칸, 성장 인자 및/또는 사이토카인 중 하나 이상을 포함하는, 컨테이너.
[25] [1] 내지 [24] 중 어느 하나에 있어서, 상기 바이오매트릭스 스캐폴드는 생체 내에서 발견되는 매트릭스 결합 신호전달 분자의 20% 내지 50% 초과를 포함하는, 컨테이너.
[26] [1] 내지 [25] 중 어느 하나에 있어서, 상기 바이오매트릭스 스캐폴드는 조직의 혈관계의 매트릭스 잔재를 포함하고, 그리고/또는 상기 매트릭스 잔재는 상기 생체공학적 조직에서 상기 세포의 혈관 지지를 제공하는, 컨테이너.
[27] (i) 기관에서 발견되는 천연 콜라겐 및/또는 (ii) 기관에서 발견되는 혈관계의 매트릭스 잔재를 포함하는, 세포외 매트릭스를 포함하는 3차원 스캐폴드.
[28] [1] 내지 [26] 중 어느 하나의 컨테이너에서 생성된 3차원 미세 기관.
[29] 천연 간의 특징을 이루는 구역화 의존성 표현형 형질을 포함하는 생체공학적 조직으로서, 상기 표현형 형질은 (a) 줄기/전구세포, 이배체 성체 세포 및/또는 관련 중간엽 전구체 세포의 형질을 갖는 문맥 주위 영역, (b) 성숙 실질 세포 및 중간엽 세포의 굴모양의 판의 형질을 지닌 세포를 갖는 중간 선방 영역, 및/또는 (c) 최종 분화된 상피 및 유창 내피세포와 관련된 아폽토시스 세포 및/또는 중심 정맥의 내피세포에 연결된 axin2+ 간 전구 세포의 형질을 갖는 중심 주위 영역을 포함하는, 생체공학적 조직.
[30] [29]에 있어서, 상기 표현형 형질은 문맥 주위 구역의 이배체 상피 세포 및/또는 중간엽 세포와 관련된 형질을 추가로 포함하는, 생체공학적 조직.
[31] [29] 또는 [30]에 있어서, 상기 표현형 형질은 천연 간의 상기 중간 선방 영역에서 발견되는 성숙 상피 세포 및/또는 중간엽 세포의 형질을 추가로 포함하는, 생체공학적 조직.
[32] [29] 내지 [31] 중 어느 하나에 있어서, 상기 표현형 형질은 상기 중심 주위 구역의 상피 또는 실질 및/또는 중간엽 세포의 형질을 추가로 포함하는, 생체공학적 조직.
[33] [29] 내지 [32] 중 어느 하나에 있어서, (i) 유창 내피 세포와 관련된 다배체 간세포, 및/또는 (ii) 중심 정맥의 내피세포에 연결된 이배체 간 전구세포 (예를 들어, axin2+ 세포)를 추가로 포함하는, 생체공학적 조직.
[34] [29] 내지 [33] 중 어느 하나에 있어서, 상기 문맥 주위 영역은 간 줄기 세포, 간모세포, 수임 전구세포, 및/또는 이배체 성체 간세포를 포함하는 줄기/전구 세포 니치의 형질이 풍부한, 생체공학적 조직.
[35] [29] 내지 [34] 중 어느 하나에 있어서, 상기 상피 및 중간엽 세포는 간세포 및/또는 담관세포의 전구체 및/또는 성숙 형태를 포함하는 상피 세포를 추가로 포함하는, 생체공학적 조직.
[36] [29] 내지 [35] 중 어느 하나에 있어서, 상기 상피 및 중간엽 세포는 성상 세포, 혈관 주위 세포, 평활근 세포, 간질, 내피세포 및/또는 조혈 세포의 전구체 및/또는 성숙 형태를 포함하는 중간엽 세포를 추가로 포함하는, 생체공학적 조직.
[37] [29] 내지 [36] 중 어느 하나의 생체공학적 조직으로 이루어진 3차원 미세 기관.
[38] [1] 내지 [26] 중 어느 하나의 컨테이너에서 생성된 [37]의 3차원 미세 기관.
[39] 설명서가 첨부된, [1] 내지 [26] 중 어느 하나의 컨테이너에서 미세 기관을 배양하기 위한 키트.
[40] 기관에 대한 치료제를 평가하는 방법으로서, 상기 치료제를 [29] 내지 [38] 중 어느 하나의 생체공학적 조직 또는 3차원 미세 기관에 투여하는 것을 포함하는, 기관에 대한 치료제를 평가하는 방법.
[41] a. 지질, 인슐린, 트랜스페린, 항산화제를 함유하는 기초 배지,
b. 구리,
c. 칼슘,
d. 상피 세포의 증식 및/또는 유지를 위한 하나 이상의 신호, 및/또는
e. 중간엽 세포의 증식 및/또는 유지를 위한 하나 이상의 신호를 포함하는, 상피 및 중간엽 세포 둘 모두를 위한 분화 배지.
[42] [41]에 있어서, 상기 기초 배지는 쿠보타 배지인, 분화 배지.
[43] [41] 또는 [42]에 있어서, 하나 이상의 지질 결합 단백질을 추가로 포함하는, 분화 배지.
[44] [43]에 있어서, 상기 하나 이상의 지질 결합 단백질은 고밀도 지질단백질 (HDL)인, 분화 배지.
[45] [41] 내지 [44] 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 정제된 지방산을 추가로 포함하는, 분화 배지.
[46] [45]에 있어서, 상기 하나 이상의 정제된 지방산은 팔미틴산, 팔미톨레인산, 스테아린산, 올레인산, 리놀레인산, 및/또는 리놀렌산을 포함하는, 분화 배지.
[47] [41] 내지 [46] 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 당을 추가로 포함하는, 분화 배지.
[48] [47]에 있어서, 상기 하나 이상의 당은 갈락토스, 글루코스, 및/또는 프룩토스를 포함하는, 분화 배지.
[49] [41] 내지 [48] 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 글루코코르티코이드를 추가로 포함하는, 분화 배지.
[50] [49]에 있어서, 상기 하나 이상의 글루코코르티코이드는 덱사메타손 및/또는 하이드로코르티손을 포함하는, 분화 배지.
[51] 천연 췌장의 특징을 이루는 구역화 의존성 표현형 형질을 포함하고 그리고/또는 상기 췌장의 머리에 있는 췌장 세포와 관련된 구역화 및/또는 상기 췌장의 꼬리에 있는 췌장 세포와 관련된 구역화를 포함하는, 생체공학적 조직.

Claims (51)

  1. 생체공학적(bioengineered) 조직 생성용 컨테이너로서, 상기 생성은 상피 및 중간엽 세포를 바이오매트릭스 스캐폴드(biomatrix scaffold) 내로 또는 바이오매트릭스 스캐폴드 상으로 도입하는 것을 포함하고, 상기 바이오매트릭스 스캐폴드는 콜라겐을 포함하는, 생체공학적 조직 생성용 컨테이너.
  2. 제1항에 있어서, 상피 및 중간엽 세포는 성숙 계통 파트너인, 컨테이너.
  3. 제1항에 있어서, 상피 및 중간엽 세포는 시딩(seeding) 배지 중에 있고, 상기 시딩 배지는 초기 인큐베이션 기간 후에 분화 배지로 교체되는, 컨테이너.
  4. 제3항에 있어서, 상기 분화 배지는,
    a. 기초 배지,
    b. 지질, 인슐린, 트랜스페린, 항산화제,
    c. 구리,
    d. 칼슘,
    e. 상피 세포의 증식 또는 유지를 위한 하나 이상의 신호, 및/또는
    f. 중간엽 세포의 증식 또는 유지를 위한 하나 이상의 신호를 포함하는, 컨테이너.
  5. 제3항에 있어서, 상기 시딩 배지는 무혈청이거나, 선택적으로 수 시간의 지속 기간에 걸쳐, 약 2% 내지 10%의 태아 혈청으로 보충되는, 컨테이너.
  6. 제3항에 있어서, 상기 시딩 배지는,
    a. 기초 배지
    b. 지질
    c. 인슐린
    d. 트랜스페린
    e. 산화 방지제를 포함하는, 컨테이너.
  7. 제3항에 있어서, 상기 시딩 배지 중의 상기 상피 및 중간엽 세포는 상기 바이오매트릭스 스캐폴드 내로 도입되기 전에 상기 시딩 배지에서 4℃에서 4 내지 6 시간 동안 인큐베이션되는, 컨테이너.
  8. 제1항에 있어서, 상기 바이오매트릭스 스캐폴드는 3차원인, 컨테이너.
  9. 제1항에 있어서, 상기 바이오매트릭스 스캐폴드 중의 콜라겐은 (i) 신생 콜라겐, (ii) 응집된 그러나 가교되지 않은 콜라겐 분자, (iii) 가교된 콜라겐을 포함하는, 컨테이너.
  10. 제10항에 있어서, 상기 시딩 배지 중의 상기 상피 및 중간엽 세포는 다수의 간격으로 도입되고, 각각의 간격에는 휴지 기간이 뒤따르는, 컨테이너.
  11. 제10항에 있어서, 상기 간격은 약 10 분이고, 상기 휴지 기간은 약 10 분인, 컨테이너.
  12. 제10항에 있어서, 상기 시딩 밀도는 상기 바이오매트릭스 스캐폴드의 습윤 중량 그램당 약 1200만개 이하의 세포이고, 1회 이상의 간격 동안 도입되는, 컨테이너.
  13. 제10항에 있어서, 상기 시딩 배지 중의 상기 상피 및 중간엽 또는 비-실질 세포는 1회 이상의 간격 동안 약 15 ml/분의 속도로 도입되는, 컨테이너.
  14. 제10항에 있어서, 상기 시딩 배지 중의 상기 상피 및 중간엽 세포는 10 분 간격으로 도입되고, 각각 10 분의 휴지 기간이 뒤따르는, 컨테이너.
  15. 제10항에 있어서, 상기 시딩 배지 중의 상기 상피 및 중간엽 세포는 3회의 간격 후에 1.3 ml/분의 속도로 도입되는, 컨테이너.
  16. 제1항에 있어서, 상기 상피 및 중간엽 세포는 태아 또는 신생아 기관으로부터 분리된 세포를 포함하는, 컨테이너.
  17. 제1항에 있어서, 상기 상피 및 중간엽 세포는 성인 또는 아동(child) 공여자로부터 분리된 세포를 포함하는, 컨테이너
  18. 제1항에 있어서, 상기 상피 및 중간엽 세포는,
    a. 줄기 세포, 수임 전구세포, 이배체 성체 세포, 다배체 성체 세포, 및/또는 최종 분화된 세포 중 하나 이상을 포함하는 상피 세포 및/또는
    b. 혈관모세포, 내피의 전구체, 성숙 내피, 성상 세포의 전구체, 성숙 성상 세포, 간질의 전구체, 성숙 간질, 평활근 세포, 조혈 세포의 전구체, 및/또는 성숙 조혈 세포 중 하나 이상을 포함하는 중간엽 세포를 포함하는, 컨테이너.
  19. 제1항에 있어서, 상기 상피 및 중간엽 세포는,
    a. 담도계 줄기 세포, 담낭 유래 줄기 세포, 간 줄기 세포, 간모세포, 수임 간세포 및 담즙 전구세포, axin2+ 전구세포 (예를 들어, axin2+ 간 전구세포), 성숙 실질 세포 (예를 들어, 간세포, 담관세포), 췌장 줄기 세포, 및 췌장 수임 전구세포, 섬 세포, 및/또는 선방 세포 중 하나 이상을 포함하는 상피 세포, 및/또는
    b. 혈관모세포, 성상 세포 전구체, 성상 세포, 중간엽 줄기 세포, 혈관 주위 세포, 평활근 세포, 간질 세포, 내피 세포 전구체, 내피 세포, 조혈 세포 전구체, 및/또는 조혈 세포 중 하나 이상을 포함하는 중간엽 세포를 포함하는, 컨테이너.
  20. 제1항에 있어서, 상기 상피 세포는 담도계, 간, 췌장, 간-췌장 공통관, 및/또는 담낭으로부터의 줄기 세포 및 이의 후손 중 하나 이상을 포함하고 그리고/또는 중간엽 세포는 혈관모세포, 내피세포 및 성상 세포의 전구체, 중간엽 줄기 세포, 성상 세포, 간질, 평활근 세포, 내피세포, 골수 유래 줄기 세포, 조혈 세포 전구체, 및/또는 조혈 세포 중 하나 이상을 포함하는, 컨테이너.
  21. 제1항에 있어서, 상기 상피 및 중간엽 세포는 각각 약 80%의 상피 및 20%의 중간엽으로 구성되는, 컨테이너.
  22. 제1항에 있어서, 상기 상피 및 중간엽 세포는 적어도 50%의 줄기 세포 및/또는 전구 세포를 포함하는, 컨테이너.
  23. 제1항에 있어서, 상기 상피 및 중간엽 세포는 임의의 최종 분화된 간세포 및/또는 췌장 세포를 포함하지 않는, 컨테이너.
  24. 제1항에 있어서, 상기 바이오매트릭스 스캐폴드는 하나 이상의 콜라겐 관련 매트릭스 성분을 포함하고, 상기 매트릭스 성분은 상기 매트릭스 성분과 관련된 라미닌, 니도겐, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 하이알루로난, 비-황산화 글리코사미노글리칸, 황산화 글리코사미노글리칸, 성장 인자 및/또는 사이토카인 중 하나 이상을 포함하는, 컨테이너.
  25. 제1항에 있어서, 상기 바이오매트릭스 스캐폴드는 생체 내에서 발견되는 매트릭스 결합 신호전달 분자의 20% 내지 50% 초과를 포함하는, 컨테이너.
  26. 제1항에 있어서, 상기 바이오매트릭스 스캐폴드는 조직의 혈관계(vascular tree)의 매트릭스 잔재를 포함하고, 그리고/또는 상기 매트릭스 잔재는 상기 생체공학적 조직에서 상기 세포의 혈관 지지를 제공하는, 컨테이너.
  27. (i) 기관에서 발견되는 천연 콜라겐 및/또는 (ii) 기관에서 발견되는 혈관계의 매트릭스 잔재를 포함하는, 세포외 매트릭스를 포함하는 3차원 스캐폴드.
  28. 제1항의 컨테이너에서 생성된 3차원 미세 기관(micro-organ).
  29. 천연 간의 특징을 이루는 구역화(zonation) 의존성 표현형 형질을 포함하는 생체공학적 조직으로서, 상기 표현형 형질은 (a) 줄기/전구세포, 이배체 성체 세포 및/또는 관련 중간엽 전구체 세포의 형질을 갖는 문맥 주위 영역, (b) 성숙 실질 세포 및 중간엽 세포의 굴모양의(sinusoidal) 판의 형질을 지닌 세포를 갖는 중간 선방(mid-acinar) 영역, 및/또는 (c) 최종 분화된 상피 및 유창 내피세포(fenestrated endothelia)와 관련된 아폽토시스 세포 및/또는 중심 정맥의 내피세포에 연결된 axin2+ 간 전구 세포의 형질을 갖는 중심 주위 영역을 포함하는, 생체공학적 조직.
  30. 제29항에 있어서, 상기 표현형 형질은 문맥 주위 구역의 이배체 상피 세포 및/또는 중간엽 세포와 관련된 형질을 추가로 포함하는, 생체공학적 조직.
  31. 제29항에 있어서, 상기 표현형 형질은 천연 간의 상기 중간 선방 영역에서 발견되는 성숙 상피 세포 및/또는 중간엽 세포의 형질을 추가로 포함하는, 생체공학적 조직.
  32. 제29항에 있어서, 상기 표현형 형질은 상기 중심 주위 구역의 상피 또는 실질 및/또는 중간엽 세포의 형질을 추가로 포함하는, 생체공학적 조직.
  33. 제29항에 있어서, (i) 유창 내피 세포와 관련된 다배체 간세포, 및/또는 (ii) 중심 정맥의 내피세포에 연결된 이배체 간 전구세포 (예를 들어, axin2+ 세포)를 추가로 포함하는, 생체공학적 조직.
  34. 제29항에 있어서, 상기 문맥 주위 영역은 간 줄기 세포, 간모세포, 수임 전구세포, 및/또는 이배체 성체 간세포를 포함하는 줄기/전구 세포 니치(niche)의 형질이 풍부한, 생체공학적 조직.
  35. 제29항에 있어서, 상기 상피 및 중간엽 세포는 간세포 및/또는 담관세포의 전구체 및/또는 성숙 형태를 포함하는 상피 세포를 추가로 포함하는, 생체공학적 조직.
  36. 제29항에 있어서, 상기 상피 및 중간엽 세포는 성상 세포, 혈관 주위 세포, 평활근 세포, 간질, 내피세포 및/또는 조혈 세포의 전구체 및/또는 성숙 형태를 포함하는 중간엽 세포를 추가로 포함하는, 생체공학적 조직.
  37. 제29항의 생체공학적 조직으로 이루어진 3차원 미세 기관.
  38. 제1항의 컨테이너에서 생성된 제37항의 3차원 미세 기관.
  39. 설명서가 첨부된, 제1항의 컨테이너에서 미세 기관을 배양하기 위한 키트.
  40. 기관에 대한 치료제를 평가하는 방법으로서, 상기 치료제를 제29항의 생체공학적 조직 또는 3차원 미세 기관에 투여하는 것을 포함하는, 기관에 대한 치료제를 평가하는 방법.
  41. a. 지질, 인슐린, 트랜스페린, 항산화제를 함유하는 기초 배지,
    b. 구리,
    c. 칼슘,
    d. 상피 세포의 증식 및/또는 유지를 위한 하나 이상의 신호, 및/또는
    e. 중간엽 세포의 증식 및/또는 유지를 위한 하나 이상의 신호를 포함하는, 상피 및 중간엽 세포 둘 모두를 위한 분화 배지.
  42. 제41항에 있어서, 상기 기초 배지는 쿠보타 배지(Kubota's Medium)인, 분화 배지.
  43. 제41항에 있어서, 하나 이상의 지질 결합 단백질을 추가로 포함하는, 분화 배지.
  44. 제43항에 있어서, 상기 하나 이상의 지질 결합 단백질은 고밀도 지질단백질 (HDL)인, 분화 배지.
  45. 제41항에 있어서, 하나 이상의 정제된 지방산을 추가로 포함하는, 분화 배지.
  46. 제45항에 있어서, 상기 하나 이상의 정제된 지방산은 팔미틴산, 팔미톨레인산, 스테아린산, 올레인산, 리놀레인산, 및/또는 리놀렌산을 포함하는, 분화 배지.
  47. 제41항에 있어서, 하나 이상의 당을 추가로 포함하는, 분화 배지.
  48. 제47항에 있어서, 상기 하나 이상의 당은 갈락토스, 글루코스, 및/또는 프룩토스를 포함하는, 분화 배지.
  49. 제41항에 있어서, 하나 이상의 글루코코르티코이드를 추가로 포함하는, 분화 배지.
  50. 제49항에 있어서, 상기 하나 이상의 글루코코르티코이드는 덱사메타손 및/또는 하이드로코르티손을 포함하는, 분화 배지.
  51. 천연 췌장의 특징을 이루는 구역화 의존성 표현형 형질을 포함하고 그리고/또는 상기 췌장의 머리에 있는 췌장 세포와 관련된 구역화 및/또는 상기 췌장의 꼬리에 있는 췌장 세포와 관련된 구역화를 포함하는, 생체공학적 조직.
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