DE19835368C1

DE19835368C1 - Verfahren zur Herstellung einer Knorpelzellsuspension

Info

Publication number: DE19835368C1
Application number: DE19835368A
Authority: DE
Inventors: Juergen Steinmeyer
Original assignee: Individual
Current assignee: Verigen Transplantation Services International AG
Priority date: 1998-08-05
Filing date: 1998-08-05
Publication date: 2000-02-10
Anticipated expiration: 2018-08-06
Also published as: WO2000008130A2; EP1100871A2; JP2003508008A; WO2000008130A3

Abstract

Der Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Knorpelzellsuspension, die dadurch gekennzeichnet ist, daß Knorpelzellen in einem Kulturmedium vermehrt werden, das Serum oder Serumersatz enthält, und daß die Knorpelzellen nach der Zellvermehrung bei einer Temperatur von unter -10 DEG C eingefroren werden.

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Knorpelzellsuspension, die zur Behandlung von Knorpel defekten im Kniegelenk eingesetzt werden soll.

Schädigungen im Gelenkknorpel treten häufig bei Unfällen ins besondere Sportunfällen auf. Besondere Probleme ergeben sich aus der schlechten Regenerationsfähigkeit des Knorpelgewebes. Solche Knorpeldefekte können langfristig zu einer Arthrose und sogar zu einem vollständigen Verlust der Gelenkfunktion führen.

Knorpel ist ein Gewebe, das zu 70 bis 80 Gew.-% aus Wasser besteht. Die Struktur des Knorpels ist dergestalt, daß die Knorpelzellen in einer Matrix verteilt sind, die von den Knorpelzellen produziert und ausgeschieden wird. Im Gegensatz zu Knochen wird Knorpel nicht vom Nerven-, Gefäß- oder Lymphsystem versorgt. Die Matrix des Gelenkknorpels besteht im wesentlichen aus Typ II Kollagen und den Proteoglykanen. Proteoglykane sind Proteine mit langen Polysaccharidketten, den Glykosaminoglykanen. Dazu gehören Keratansulfat, Chon droitin-4-Sulfat und Chondroitin-6-Sulfat.

Eine Möglichkeit im Stand der Technik zur Behandlung von Knorpeldefekten wird in der US 5,723,331 vorgeschlagen. Hier bei werden Knorpelzellen aus einem Knorpelstück des Patienten isoliert und in einem Kultivierungsmedium, das fötales Käl berserum enthält, in vitro vermehrt. Diese Knorpelzellen wer den nach der in-vitro-Vermehrung zunächst dazu benutzt, in vitro ein künstliches Knorpelgewebestück herzustellen, in dem die Knorpelzellen stimuliert werden, eine extrazelluläre Ma trix zu produzieren. Diese Matrix besteht aus Kollagenfibril len und sulfatierten Proteoglykanen, die unter anderem Chon droitin-6-Sulfat und Keratansulfat beinhalten. Auf diese Wei se wird in vitro ein künstliches Knorpelgewebestück herange züchtet, das aus Knorpelzellen besteht, die in einer Matrix verteilt sind, die aus von diesen Knorpelzellen produzierten und ausgeschiedenen Substanzen besteht. Dieses künstliche Knorpelgewebe kann dann dem Patienten transplantiert werden.

Nachteilig bei diesem Verfahren ist jedoch, daß durch die Verwendung von Fremdseren, hier fötales Kälberserum, eine Übertragung von Krankheiten, die beispielsweise von Viren oder Bakterien verursacht werden können, nicht ausgeschlossen werden kann. Hierbei wird insbesondere darauf verwiesen, daß es neuerdings als gesichert gilt, daß die Übertragung der spongioformen bovinen Encephalopathie ("Rinderwahnsinn") auf den Menschen möglich erscheint.

Weiterhin ist es nachteilig, daß die zu transplantierenden Knorpelzellen bei der Kultivierung mit fötalem Kälberserum mit Fremdeiweißen kontaminiert werden können und es nach der Transplantation bei dem Patienten zu Problemen mit immunolo gischen Reaktionen kommen kann.

Die Behandlung von Knorpeldefekten im Kniegelenk mittels Transplantation von in vitro kultivierten Knorpelzellen in den geschädigten Bereich des Knorpelgewebes, wurde bereits 1994 von Brittberg et al. im New England Journal of Medicine 331, Seiten 889-895 vorgestellt. Hierbei werden Knorpelzellen aus dem Knorpel des Patienten isoliert. Diese Zellen werden in vitro vermehrt und so eine Knorpelzellsuspension herge stellt, die circa 2,6-5 × 10⁶ Zellen enthält. Diese Knor pelzellsuspension wird dann operativ in die Knorpeldefekte des Patienten transplantiert.

Die Firma co.don® Gesellschaft für molekulare Medizin und Biotechnologie mbH bietet ein modifiziertes Verfahren zur Knorpelzellisolierung und Vermehrung als Dienstleistung an.

Hierbei werden jedoch keine Antibiotika bzw. Fungistatika in das Kulturmedium gegeben. Damit soll erreicht werden, daß die Proliferations- und Differenzierungs fähigkeit der Zellen erhalten bleibt.

Nachteilig bei diesem Kultivierungsverfahren für Knorpelzellen ist jedoch, daß die Knorpelzellen nicht eingefroren werden können. So legt die Firma co.don® dar, daß es für einen langfristigen Therapieerfolg wichtig sei, die Knorpelzellen diffe renzierungsfähig zu halten. Dies sei nicht möglich, wenn Knorpelzellen nach der Vermehrung eingefroren würden, da das Einfrieren von Knorpelzellen zur Bildung von verschiedenen Reifestadien führe.

Im weiteren Stand der Technik werden in der Fachpublikation Am. J. Vet. Res. Vol. 53 (12) 1992, (Seiten 2364-2370) zwei getrennte Verfahren beschrieben. Bei dem einen Verfahren handelt es sich um die Isolation von equinen Knorpelzel len aus dem Knorpel wobei die Zellen anschließend in einem Medium vermehrt werden, das 10% fötales Kälberserum enthält. In dem anderen Verfahren werden equine Knorpelzellen aus dem Knorpel isoliert und ohne den Vermehrungsschritt direkt in einem Medium enthaltend 10% fötales Kälberserum sowie eine Gefrier schutzmittel (10% Dimethylsulfoxid) bis zu 9 Monaten bei -196°C eingefroren. Die aufgetauten Chondrocyten können sofort für Implantationszwecke oder als Monolayer- oder dreidimensionale Kultur eingesetzt werden. Auch hier wird als nachteilig beschrieben, daß die Zellen aufgrund der Kultivierung dedifferenzieren. Weiterhin werde die Überlebensfähigkeit der isolierten Zellen durch Cryokonser vierung stark eingeschränkt. Die Autoren untersuchten dabei insbesondere die Überlebensfähigkeit von Knorpelzellen unter Einfluß der Cryokonservierung be zogen auf das Alter des Spendertieres. Es wird jedoch kein Verfahren beschrie ben oder vorgeschlagen, wobei Knorpelzellen zunächst isoliert, vermehrt und an schließend cryokonserviert werden.

Der Nachteil, die Knorpelzellen nach der Vermehrung nicht einfrieren zu können, liegt insbesondere darin, daß der Arzt zu einem vorbestimmten Zeitpunkt nach der Entnahme der Knorpelzellen gezwungen ist, die aus diesen Knorpelzellen hergestellte Knorpelzellsuspension wieder in den Patienten zu transplantieren.

Diese zeitliche Unflexibilität ist für die Beteiligten wie den Arzt, die Krankenkas sen und den Patienten ökonomisch sehr nachteilig.

Weiterhin ist es besonders nachteilig, die Knorpelzellen nach erreichen der ge wünschten Zellmasse noch länger zu subkultivieren, falls sich die Transplantation verzögern sollte. Eine weitere Subkultivierung über einen längeren Zeitraum ist kostenintensiv und kann zur irreversiblen Dedifferenzierung und Verlust der Proli ferationsfähigkeit der Knorpelzellen führen.

Die technische Aufgabe war es daher, ein Verfahren zur Herstellung von Knorpel zellsuspensionen zu finden, bei dem die genannten Probleme nicht auftreten. So war es insbesondere die Aufgabe, den Zeitraum zwischen Knorpelentnahme und Knorpelzelltransplantation flexibel zu gestalten und dennoch der Gefahr einer irreversiblen Dedifferenzierung und Verlust der Proliferationsfähigkeit der Zellen durch Kultivierung über einen längeren Zeitraum vorzubeugen.

Die technische Aufgabe wurde durch ein Verfahren zur Herstel lung einer Knorpelzellsuspension gelöst, wobei die Knorpel zellen in einem Kulturmedium vermehrt werden, das Serum oder Serumersatz enthält und wobei die Knorpelzellen nach der Zellvermehrung bei einer Temperatur von unter -10°C einge froren werden. Diese Knorpelzellen stammen bevorzugt aus von Patienten isoliertem Knorpelgewebe.

Es wurde nämlich überraschenderweise gefunden, daß die Diffe renzierungs- und Proliferationsfähigkeit von in vitro ver mehrten Knorpelzellen auch nach Einfrieren nicht vermindert ist und daher der Therapieerfolg gesichert ist. Besonders vorteilhaft ist hier, daß der Zeitraum zwischen Knorpelent nahme vom Patienten und Transplantation der Knorpelzellsus pension in den geschädigten Knorpel des Patienten beliebig sein kann und somit allen Beteiligten wie Arzt, Patient und Krankenkasse eine größtmögliche zeitliche Flexibilität bei der Terminierung der Transplantation erhalten bleibt. Somit können z. B. alle Formalitäten zwischen Arzt, Krankenkasse und Patient vor der Transplantation erledigt werden, sowie zeit liche Engpässe im Krankenhaus, von Patienten bedingte zeitli che Aufschübe der Operation oder Operationen ausschließende Ursachen überwunden werden.

Besonders vorteilhaft ist hierbei, daß die teure Subkultivie rung der Knorpelzellen über einen längeren Zeitraum entfällt und daher auch nicht die Gefahr besteht, daß die Zellen ihre Differenzierungs- und Proliferationsfähigkeit verlieren.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Knorpelzellen in einem Kulturmedium vermehrt, das 5 bis 50 Vol.% Serum oder Serumersatz, vorzugsweise 10 Vol.% Serum oder Serumer satz enthält. Dabei ist dieses Serum ausgewählt aus der Gruppe humanes Serum, fötales Kälberserum, Kälberserum, Serum anderer Säugetierspezies, Serum an derer Tierspezies oder Kombinationen derselben. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung von patienteneigenem Serum oder Serumersatz, da hier die Über tragung von Krankheiten aus anderen Organismen sowie immunologische Reak tionen gegenüber Fremdeiweißen ganz ausgeschlossen werden kann.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen in einem Medium eingefroren, das humanes Serum, fötales Kälberserum, Kälberse rum, Serum anderer Säugetierspezies, Serum anderer Tierspezies, Serumersatz, Serumalbumin oder Kombinationen derselben enthält. Auch hier ist die Verwen dung von patienteneigenem Serum oder Serumersatz besonders vorteilhaft.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Knorpelzellen in einem Medium eingefroren, das Alkylsulfoxide und/oder Polyalkohole als Gefrier schutzmittel enthält. Dabei sind die Alkylsulfoxide ausgewählt aus der Gruppe Methylethylsulfoxid, Diethylsulfoxid, Dibutylsulfoxid, Methylbutylsulfoxid, Ethyl butylsulfoxid und Dimethylsulfoxid. Polyalkohole als weitere geeignete zellpene trierende organische Lösungsmittel sind ausgewählt aus der Gruppe Ethylengly kol, Propylenglykol, Butandiol und Glycerin. Mit diesen Gefrierschutzmitteln wird die Überlebensfähigkeit der Knorpelzellen nach dem Einfrieren und Wiederauf tauen gewährleistet.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Knorpelzellen in einem Medium eingefroren, das ein Glykosaminoglykan enthält, vorzugsweise Hyaluron säure, Dermatansulfat, Heparinsulfat, Keratansulfat, Chondroitinsulfat oder Kom binationen derselben.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die Knorpelzellen nach folgendem Schema eingefroren:

Die Knorpelzellsuspension wird mit einer Geschwindigkeit von -0,1°C bis -30°C pro Minute, vorzugsweise mit einer Geschwindigkeit von -0,1°C bis -3°C pro Mi nute, besonders bevorzugt mit -1°C pro Minute auf Temperaturen von bis zu -150°C abgekühlt. Nach Erzielen einer Temperatur von bis zu -150°C können die Zellen in eine Umgebung gebracht werden, die eine Temperatur von unter -130°C, vorzugsweise von -196°C besitzt. Bei diesem letzten Schritt kann die Ein friergeschwindigkeit variiert werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stammen die zu vermehrenden Knorpelzellen und das humane Serum, das zum Kulturmedium zugefügt wird, vom gleichen Individuum.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die Knorpelzellen in ihrer Erbsubstanz gentechnisch verändert.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Zellen verwendet, die nach Stimulation zu Zellen differenzieren, die die für Gelenkknorpel typische ex trazelluläre Matrix produzieren, wobei sie unter anderem Substanzen wie Typ-II- Kollagen und sulfatierte Proteoglykane, die beispielsweise Chondroitin-6-Sulfat, Chondroitin-4-Sulfat und Keratan-Sulfat enthalten, ausscheiden.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung einer Knorpelzellsuspension wird insbesondere wie folgt vorgegan gen.

Es werden Knorpelgewebe aus dem Menschen oder aus einem Säu getier oder anderen Tierspezies isoliert. Diese Knorpelgewebe können hyaliner Gelenkknorpel, Knorpel des Nasenseptums oder Rippenknorpel sein. Aus dem entnommenen Knorpelgewebe werden Chondrozyten isoliert, indem proteolytische Enzyme beispiels weise Pronase, Papain, Kollagenase, Trypsin, Chondroitinase ABC, Chondroitinase AC II, Hyaluronidase, Elastase, Cathepsin G oder Gemische derselben in einem Reagenzgefäß zugegeben werden. Die zu isolierenden Zellen sind Knorpelzellen, die auch Chondrozyten genannt werden. Als Knorpelzellen im Sinne dieser Anmeldung sind folgende Zellen definiert:

1. aus Knorpelgewebe isolierte Zellen, die auch Chondro zyten genannt werden;
2. Zellen wie z. B. Knorpelzellen, sonstige Zellen aus Mam maliern oder anderen Tieren, aber auch Pflanzenzellen, Bakterienzellen, und Zellen anderer Organismenreiche, die nach Stimulation zu Zellen differenzieren, die die für Gelenkknorpel typische extrazelluläre Matrix produ zieren, wobei sie unter anderem Substanzen wie Typ-II- Kollagen und sulfatierte Proteoglykane, die beispiels weise Chondroitin-6-Sulfat, Chondroitin-4-Sulfat und Ke ratan-Sulfat enthalten, ausscheiden;
3. gentechnisch veränderte Zellen wie z. B. Knorpelzellen, sonstige Zellen aus Mammaliern oder anderen Tieren, aber auch Pflanzenzellen, Bakterienzellen, und Zellen anderer Organismenreiche, die für den Gelenkknorpel typische ex trazelluläre Matrix produzieren, wobei sie unter anderem Substanzen wie Typ-II-Kollagen und sulfatierte Proteo glykane, die beispielsweise Chondroitin-6-Sulfat, Chon droitin-4-Sulfat und Keratan-Sulfat enthalten, ausschei den.

Diese Zellen werden in einem Kulturmedium vermehrt. Weiterhin ist es möglich, die isolierten Knorpelzellen gentechnisch zu verändern und zu vermehren. Die Vermehrung der Knorpelzellen erfolgt in einem Kulturmedium mit oder ohne Serum, alpha- Ketoglutarat, L-Glutamin, Puffer-, Vitamin C- und/oder son stigem Vitaminzusatz sowie mit und ohne antibakterielle Wirk stoffe und/oder antimykotisch wirksame Substanzen. Dabei kann der Serumzusatz zu dem Kulturmedium ausgewählt sein aus der Gruppe humanes Serum, fötales Kälberserum, Kälberserum, Serum anderer Säugetierspezies, Serum anderer Tierspezies, Serumer satz oder Kombinationen derselben. Nach der Vermehrung der Knorpelzellen werden diese eingefroren. Dazu wird ein spezi elles Einfriermedium hergestellt. Dieses besteht aus Kombina tionen von Gefrierschutzmitteln mit oder ohne Seren, Kultur medien oder Serumalbumin. Als Gefrierschutzmittel können Al kylsulfoxide, beispielsweise Methylethylsulfoxid, Diethylsul foxid, Dibutylsulfoxid, Methylbutylsulfoxid, Ethylbutylsul foxid, vorzugsweise jedoch Dimethylsulfoxid (DMSO) oder ande re geeignete zellpenetrierende organische Lösungsmittel, wie zum Beispiel Polyalkohole, beispielsweise Ethylenglykol, Pro pylenglykol, Butandiol und Glycerin, verwendet werden, sowie Kombinationen einzelner Gefrierschutzmittel untereinander. So kann das Einfriermedium beispielsweise aus 90 Vol.-% Serum und 10 Vol.-% DMSO oder 40 Vol.-% Serum, 50 Vol.-% Kulturme dium und 10% DMSO bestehen. Weiterhin können Glykosaminogly kane, beispielsweise Hyaluronsäure, Dermatansulfat, Heparin sulfat, Keratansulfat, vorzugsweise jedoch Chondroitinsulfat in einer Konzentration von 1 bis 10 Gew.-%, vorzugsweise 2,5 Gew.-% zu einem Einfriermedium zugesetzt werden. Dieses Ein friermedium kann aus 1 bis 95 Vol-% Serum, vorzugsweise 10 bis 90 Vol.-% Serum bestehen. Als Kulturmedium kann jede ge pufferte physiologische Lösung, beispielsweise gepufferte Salzlösungen und Kulturmedien wie DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) verwendet werden. Das Einfriermedium kann wei tere Zusätze wie beispielsweise α-Tocopherol, Vitamin C, Synovialflüssigkeit, Hyaluronsäure und Lecithin enthalten.

Das Einfrieren der Zellen erfolgt direkt in der Kulturflasche oder in anderen Glas- oder Kunststoffgefäßen, vorzugsweise Kryoröhrchen. Die Zellen sollten innerhalb von 360 Minuten, vorzugsweise nach 30 bis 40 Minuten nach Zusatz des Einfrier mediums folgender Einfrierprozedur unterworfen werden:

Die Knorpelzellen werden mit einer Geschwindigkeit von -0,1°C bis -30°C pro Minute, vorzugsweise -0,1°C bis -3°C pro Minute, besonders bevorzugt mit -1°C pro Minute auf Tempera turen von bis zu -150°C eingefroren. Nach Erreichen einer Temperatur von bis zu -150°C, vorzugsweise von -70°C bis -80°C, kann die gefrorene Knorpelzellsuspension auf Tempera turen unter -130°C, vorzugsweise auf -196°C gebracht wer den.

Anhand des nachfolgenden Beispiels wird das erfindungsgemäße Verfahren näher erläutert:

Beispiel 1. Chondrozytenisolierung aus artikulärem Knorpelgewebe

Durch enzymatische Verdauung wird artikuläres Knorpelgewebe, das aus dem gewichtsbelasteten und/oder nicht gewichtsbelasteten Bereich menschlicher Kniegelenke entnommen wird, verdaut, um die Chondrozyten zu isolieren. Hierzu wird wie folgt verfahren:

1. Das entnommene Knorpelgewebe wird mehrmals mit sterilem GBSS (Gey's gepufferte Salzlösung, Gibco) gewaschen und anschließend mit einem Skalpell in einer sterilen Glas petrischale in kleine Stücke geschnitten (ca. 1 mm³).
2. Die zerkleinerten Knorpelstücke werden nach Absaugen der GBSS-Lösung in eine sterile Kunststoffpetrischale über führt.
3. Nach Zusatz einer sterilen 0,8%igen Pronaselösung (Calbiochem) in GBSS werden die Knorpelstücke 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert.
4. Anschließend wird die Pronaselösung abgesaugt, die Knor pelstücke einmal mit steriler GBSS-Lösung gewaschen, dann eine sterile 0,5%ige Kollagenaselösung (CLS 2, Worthington oder CellSystems) in GBSS hinzugefügt und nun über Nacht (ca. 18 Stunden) bei 37°C inkubiert.
5. Die den verdauten Knorpel enthaltene Lösung wird abge saugt und durch einen Nylonfilter mit einer Porenweite von 20 oder 50 µm (Spectrapor) in ein 50 ml Zentrifugen röhrchen (Greiner) zentrifugiert. Die Zentrifugation er folgt für 10 Minuten bei 600 × g in dem Ausschwingrotor einer Zentrifuge (Eppendorf). Der Überstand wird abge saugt.
6. Das Zellpellet wird 2 × mit 10 ml HBSS (Hanks gepufferte Salzlösung, Gibco) gewaschen, wobei jeweils anschließend die Zellsuspension 5 Minuten lang bei 600 × g in dem Ausschwingrotor einer Zentrifuge (Eppendorf) zentrifu giert wird. Das Zellpellet wird in HBSS resuspendiert. Anschließend erfolgt die Zellzählung in einer Neubauer- Kammer. Danach wird die Zellsuspension 5 Minuten lang bei 600 × g in dem Ausschwingrotor einer Zentrifuge (Eppendorf) zentrifugiert.

II. Zellproliferation

1. Die oben erhaltenen isolierten Chondrozyten werden in einer Dichte von ca. 1 × 10²-5 × 10⁶ Zellen/cm², vorzugsweise mit einer Dichte von 5 × 10²- 1 × 10⁵ Zellen/cm², besonders bevorzugt mit einer Dichte von 1 × 10³- 1 × 10⁴ Zellen/cm² in einer Zellkulturflasche ausgesät und in einem Brut schrank bei 37°C, und einer Atmosphäre enthaltend 5% CO₂ bei 95%iger relativer Luftfeuchte in Gegenwart eines Kulturmediums kultiviert.
2. Als Kulturmedium wird DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco) eingesetzt, das mit humanem Serum supplementiert wurde. Alternativ kann auch eine 3 : 1 oder 1 : 1 Mischung von DMEM und Nutrient Mixture Ham's F12 (Gibco) als Kulturmedium verwendet werden, das zusätzlich 10% hu manes Serum enthält.
3. Sobald die Chondrozytenkultur konfluent oder besser subkonfluent ist, werden die Zellen von dem Boden der Kulturflasche enzymatisch oder me chanisch mit Hilfe eines Zellschabers gelöst. Hierzu wird zunächst das Kulturmedium abgesaugt und die am Boden anhaftenden Chondrozyten mit PBS (Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Ca²⁺- oder Mg²⁺-Ionen, Gibco) gewaschen.
4. Nach Entfernen der PBS-Lösung werden nun die adhärenten Zellen mit einer Trypsin-EDTA-(Ethylendiamintetraessigsäure)-Lösung von der Plastikoberfläche der Kulturflasche abgelöst. Die Trypsin-EDTA-Lösung enthält 0,05% 1 : 250 Trypsin und 0,02% (w/v) EDTA in einer gepufferten Salzlösung pH 7,2. Diese gepufferte Salzlösung enthält keine Ca²⁺ oder Mg²⁺-Ionen. Trypsin 1 : 250 bezeichnet eine Trypsinpräparation, wobei 1 g Trypsin 250 g Subtrat ab baut. Das Trypsin hat dabei die Aufgabe, die Adhäsions proteine zu spalten, während EDTA alle zweiwertigen Ka tionen bindet. Die Kulturflasche wird anschließend für 5, besser für 10-15 Minuten in einen Brutschrank bei 37°C gestellt.
5. Nach der 5minütigen Inkubation im Brutschrank werden die proteolytischen Enzyme in der Zellsuspension durch das Hinzufügen des Kulturmediums inaktiviert, wobei die End konzentration von humanem Serum 10% (v/v) betragen sollte. Die Chondrozyten werden jetzt nochmals zentrifu giert, das Trypsin-EDTA-Kulturmedium abpipettiert und frisches Kulturmedium hinzugefügt, da Reste von EDTA stören können.
6. Nach Bestimmung der Zelldichte werden die Chondrozyten nun entweder weiter kultiviert und gegebenenfalls sub kultiviert, um zu einem späteren Zeitpunkt oder direkt eingefroren zu werden.

III. Kryokonservierung der Chondrozyten

1. Zunächst werden, nach Bestimmung der Zellzahl, die Chon drozyten für 5 Minuten mit 150-200 × g bei 4°C zen trifugiert. Der Überstand wird entnommen. Zu der Zell suspension wird soviel frisches, eisgekühltes (antibiotikafreies) Kulturmedium mit 10% (v/v) humanem Serum hinzugefügt, daß die Zellen doppelt so konzen triert vorliegen wie letztlich für die Kryokonservierung gewünscht ist.
2. Das Einfrieren von Chondrozyten erfolgt in Gegenwart ei nes Gefrierschutzmittels. Hierzu wird zunächst eine dop peltkonzentrierte Lösung nach folgendem Rezept ange setzt:
40% (v/v) Kulturmedium, 40% (v/v) humanes Serum und 20% (v/v) DMSO oder Glycerin. Diese Mischung wird in der beschriebenen Reihenfolge angesetzt und durch Umrühren vermischt. Mit Hilfe eines 0,2-µm- Einmalfilters wird diese Lösung in ein steriles Zentrifugenröhrchen gefüllt.
3. Diese doppeltkonzentrierte Lösung wird nun zum gleichen Volumen der in Kulturmedium suspendierten Chondrozyten gegeben, so daß man die benötigten Konzentrationsver hältnisse der Einfrierlösung erhält.
4. Die Chondrozytensuspension wird anschließend in kleinen Portionen von je 1 ml in gekühlte Kryoröhrchen gefüllt. In jedem dieser Röhrchen befinden sich dann ca. 1 × 10⁶ Zellen.
5. Mit Hilfe einer speziellen Gefrierhalterung lassen sich nun die Chondrozyten in der Dampfphase, die sich über der flüssigen Phase im Stickstoffvorratsbehälter bildet, mit einer definierten Rate abkühlen. Diese Abkühlrate beträgt etwa -1°C pro Minute.
6. Alternativ zu Punkt 5 kann auch eine Polystyrol-Box ver wendet werden, die eine Wanddicke von 2-4 cm, vorzugs weise von 5-10 mm besitzt. Dann wird die Polystyrol-Box verschlossen und in eine -70°C-Gefriertruhe gestellt, in der die Zellen dann mit einer Geschwindigkeit von et wa -1°C pro Minute abkühlen. Nach etwa 12 Stunden wer den die Knorpelzellen in den Stickstoffaufbewahrungsbe hälter überführt.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer Knorpelzellsuspension, dadurch gekennzeichnet, daß die Knorpelzellen in einem Kulturmedium vermehrt werden, das Serum oder Serumersatz enthält, und daß die Knorpelzellen nach der Zellvermeh rung bei einer Temperatur von unter -10°C eingefroren werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium, in dem die Knorpelzellen vermehrt wer den, 5 bis 50 Vol.-% Serum oder Serumersatz, vorzugswei se 10 Vol.-% Serum oder Serumersatz enthält.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet, daß das Serum ausgewählt ist aus der Gruppe humanes Serum, fötales Kälberserum, Kälberserum, Serum anderer Säugetierspezies, Serum anderer Tierspezies oder Kombinationen derselben.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekenn zeichnet, daß die Knorpelzellen in einem Medium einge froren werden, das einen Zusatz enthält ausgewählt aus der Gruppe humanes Serum, fötales Kälberserum, Kälberse rum, Serum anderer Säugetierspezies, Serum anderer Tier spezies, Serumersatz, Serumalbumin oder Kombinationen derselben.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekenn zeichnet, daß die Knorpelzellen in einem Medium einge froren werden, das Alkylsulfoxide und/oder Polyalkohole als Gefrierschutzmittel in einer Konzentration von 2- 40 Vol-%, vorzugsweise 10 bis 20 Vol-% enthält.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Alkylsulfoxide ausgewählt sind aus der Gruppe Me thyl-ethylsulfoxid, Diethylsulfoxid, Dibutylsulfoxid, Methylbutylsulfoxid, Ethylbutylsulfoxid und Dimethylsul foxid.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 5 oder 6, dadurch gekenn zeichnet, daß die Polyalkohole ausgewählt sind aus der Gruppe Ethylenglykol, Propylenglykol, Butandiol und Gly cerin.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekenn zeichnet, daß die Knorpelzellen in einem Medium einge froren werden, das ein Glykosaminoglykan enthält.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekenn zeichnet, daß die Knorpelzellen mit einer Geschwindig keit von -0.1°C bis -30°C pro Minute, vorzugsweise -0.1°C bis -3°C pro Minute, besonders bevorzugt mit -1°C pro Minute auf bis zu -150°C eingefroren werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die gefrorenen Knorpelzellen nach Erreichen einer Tempe ratur von bis zu -150°C auf Temperaturen unter -130°C, vorzugsweise auf -196°C überführt werden.

11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekenn zeichnet, daß die Knorpelzellen und das humane Serum vom gleichen Individuum stammen.

12. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekenn zeichnet, daß die Knorpelzellen in ihrer Erbsubstanz gentechnisch verändert sind.

13. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 12, dadurch gekenn zeichnet, daß Zellen verwendet werden, die nach Stimula tion zu Zellen differenzieren, die die für Gelenkknorpel typische extrazelluläre Matrix produzieren, wobei diese Zellen Substanzen ausscheiden enthaltend Typ-II-Kollagen und sulfatierte Proteoglykane.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die sulfatierten Proteoglykane Substanzen enthalten aus gewählt aus der Gruppe Chondroitin-6-Sulfat, Chondroi tin-4-Sulfat und Keratansulfat.

15. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 14, dadurch gekenn zeichnet, daß die Knorpelzellen aus von Patienten iso liertem Knorpelgewebe stammen.