EP1100871A2 - Verfahren zur herstellung einer knorpelzellsuspension - Google Patents

Verfahren zur herstellung einer knorpelzellsuspension

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Publication number
EP1100871A2
EP1100871A2 EP99931242A EP99931242A EP1100871A2 EP 1100871 A2 EP1100871 A2 EP 1100871A2 EP 99931242 A EP99931242 A EP 99931242A EP 99931242 A EP99931242 A EP 99931242A EP 1100871 A2 EP1100871 A2 EP 1100871A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
serum
cartilage
cells
cartilage cells
frozen
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP99931242A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jürgen Steinmeyer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Verigen Transplantation Services International AG
Original Assignee
Verigen Transplantation Services International AG
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Filing date
Publication date
Application filed by Verigen Transplantation Services International AG filed Critical Verigen Transplantation Services International AG
Publication of EP1100871A2 publication Critical patent/EP1100871A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells

Definitions

  • the invention relates to a method for producing a cartilage cell suspension which is to be used for the treatment of cartilage defects in the knee joint.
  • Cartilage is a tissue that consists of 70 to 80% by weight water.
  • the structure of the cartilage is such that the cartilage cells are distributed in a matrix that is produced and excreted by the cartilage cells.
  • cartilage In contrast to bone, cartilage is not supplied by the nervous, vascular or lymphatic systems.
  • the matrix of the articular cartilage essentially consists of type II collagen and the proteoglycans.
  • Proteoglycans are proteins with long polysaccharide chains, the glycosaminoglycans. These include keratan sulfate, chondroitin 4 sulfate and chondroitin 6 sulfate.
  • Cartilage cells are isolated from a piece of the patient's cartilage and grown in vitro in a culture medium containing fetal calf serum. After the in vitro propagation, these cartilage cells are first used to produce an artificial piece of cartilage tissue in vitro, in which the cartilage cells are stimulated to produce an extracellular matrix.
  • This matrix consists of collagen fibrils and sulfated proteoglycans, which include chondroitin-6-sulfate and keratan sulfate.
  • an artificial piece of cartilage tissue is grown in vitro, which consists of cartilage cells distributed in a matrix consisting of substances produced and excreted by these cartilage cells.
  • This artificial cartilage tissue can then be transplanted to the patient.
  • a disadvantage of this method is that the use of foreign sera, here fetal calf serum, cannot prevent the transmission of diseases which can be caused by viruses or bacteria, for example.
  • foreign sera here fetal calf serum
  • spongioform bovine encephalopathy spongioform bovine encephalopathy
  • cartilage cells to be transplanted can be contaminated with foreign proteins when cultivated with fetal calf serum and that problems with immunological reactions can occur in the patient after the transplantation.
  • cartilage defects in the knee joint by transplanting in vitro cultivated cartilage cells into the damaged area of the cartilage tissue was already done in 1994 by Brittberg et al. in the New England Journal of Medicine 331, pages 889-895.
  • Cartilage cells are isolated from the patient's cartilage. These cells are multiplied in vitro and a cartilage cell suspension is produced which contains approximately 2.6 to 5 ⁇ 10 ⁇ cells. This cartilage cell suspension is then surgically transplanted into the patient's cartilage defects.
  • the company co.don ® Society for Molecular Medicine and Biotechnology mbH offers a modified process for cartilage cell isolation and reproduction as a service. However, no antibiotics or fungistatic agents are added to the culture medium. This is to ensure that the cells' ability to proliferate and differentiate is retained.
  • a disadvantage of this cultivation method for cartilage cells is, however, that the cartilage cells cannot be frozen.
  • the company co.don ® explains that it is important for long-term therapy success to keep the cartilage cells differentiable. This is not possible if cartilage cells after the Propagation would be frozen because the freezing of cartilage cells leads to the formation of different stages of maturity.
  • the disadvantage of not being able to freeze the cartilage cells after the multiplication is, in particular, that the doctor is forced at a predetermined point in time after the removal of the cartilage cells to transplant the cartilage cell suspension produced from these cartilage cells back into the patient. This time inflexibility is economically very disadvantageous for those involved such as the doctor, the health insurance companies and the patient.
  • the technical task was therefore to find a process for producing cartilage cell suspensions in which the problems mentioned do not occur.
  • it was the task to make the period between cartilage removal and cartilage cell transplantation flexible and still prevent the risk of irreversible dedifferentiation and loss of the ability of the cells to proliferate through cultivation over a longer period of time.
  • the technical problem was solved by a method for producing a cartilage cell suspension, the cartilage cells being propagated in a culture medium which contains serum or serum substitute and the cartilage cells being frozen at a temperature of below -10 ° C. after the cell multiplication.
  • These cartilage cells preferably originate from cartilage tissue isolated from patients.
  • the cartilage cells are grown in a culture medium which contains 5 to 50% by volume of serum or serum replacement, preferably 10% by volume of serum or serum replacement.
  • This serum is selected from the group consisting of human serum, fetal calf serum, calf serum, serum from other mammalian species, serum from other animal species or combinations thereof. It is particularly advantageous to use the patient's own serum or serum substitute, since here the transmission of diseases from other organisms and immunological reactions to foreign proteins can be completely ruled out.
  • the cells are frozen in a medium which contains human serum, fetal calf serum, calf serum, serum from other mammalian species, serum from other animal species, serum replacement, serum albumin or combinations thereof.
  • a medium which contains human serum, fetal calf serum, calf serum, serum from other mammalian species, serum from other animal species, serum replacement, serum albumin or combinations thereof.
  • the use of the patient's own serum or serum replacement is particularly advantageous.
  • cartilage cells are frozen in a medium which contains antifreeze agents which are selected from the Group alkyl sulfoxides, for example methyl ethyl sulfoxide, diethyl sulfoxide, dibutyl sulfoxide, methyl butyl sulfoxide, ethyl butyl sulfoxide, dimethyl sulfoxide, or other suitable cell-penetrating organic solvents such as, for example, polyalcohols such as ethylene glycol, propylene glycol, butanediol, glycerol or combinations thereof.
  • anti-freeze agents ensure the viability of the cartilage cells after freezing and thawing.
  • cartilage cells are frozen in a medium which contains a glycosaminoglycan, preferably hyaluronic acid, dermatan sulfate, heparin sulfate, keratan sulfate, chondroitin sulfate or combinations thereof.
  • a glycosaminoglycan preferably hyaluronic acid, dermatan sulfate, heparin sulfate, keratan sulfate, chondroitin sulfate or combinations thereof.
  • cartilage cells are frozen according to the following scheme:
  • the cartilage cell suspension is at a rate of -0.1 ° C to -30 ° C per minute, preferably at a rate of -0.1 ° C to -3 ° C per minute, particularly preferably at -1 ° C per minute Temperatures cooled down to -150 ° C. After a temperature of up to -150 ° C has been reached, the cells can be brought into an environment which has a temperature of below -130 ° C, preferably of -196 ° C. The freezing speed can be varied in this last step.
  • the cartilage cells can be frozen at any time after the start of the individual multiplication steps.
  • the cartilage cells to be multiplied and the human serum which is added to the culture medium come from the same individual.
  • the cartilage cells are in their
  • cells are used which, after stimulation, differentiate into cells which produce the extracellular matrix which is typical for articular cartilage, where they include substances such as type II collagen and sulfated proteoglycans, which, for example, chondroitin 6-sulfate, chondroitin Contain 4-sulfate and keratan sulfate.
  • substances such as type II collagen and sulfated proteoglycans, which, for example, chondroitin 6-sulfate, chondroitin Contain 4-sulfate and keratan sulfate.
  • the procedure is in particular as follows.
  • Cartilage tissues are isolated from humans or from a mammal or other animal species. These cartilage tissues can be hyaline articular cartilage, nasal septum cartilage or costal cartilage. Chondrocytes are isolated from the removed cartilage tissue by adding proteolytic enzymes, for example pronase, papain, collagenase, trypsin, chondroitinase ABC, chondroitinase AC II, hyaluronidase, elastase, cathepsin G or mixtures thereof, in a test tube. The cells to be isolated are cartilage cells, which are also called chondrocytes. The following cells are defined as cartilage cells in the sense of this application:
  • cells isolated from cartilage tissue which are also called chondrocytes
  • Cells such as cartilage cells, other cells from Mammaliem or other animals, but also plant cells, bacterial cells, and cells from other organisms that differentiate after stimulation into cells that produce the extracellular matrix typical of articular cartilage, whereby they include substances such as type II collagen and sulfated proteoglycans, which contain, for example, chondroitin 6 sulfate, chondroitin 4 sulfate and keratan sulfate; 3.
  • cartilage cells such as cartilage cells, other cells from Mammaiiem or other animals, but also plant cells, bacterial cells, and cells from other organisms that produce extracellular matrix typical for the articular cartilage, whereby they include substances such as type II Collagen and sulfated proteoglycans, for example
  • cartilage cells are grown in a culture medium. It is also possible to genetically modify and multiply the isolated cartilage cells.
  • the multiplication of the cartilage cells takes place in a culture medium with or without serum, ⁇ -ketoglutarate, L-glutamine, buffer, vitamin C and / or other vitamin addition as well as with and without antibacterial active substances and / or antifungal substances.
  • the serum additive to the culture medium can be selected from the group of human serum, fetal calf serum, calf serum, serum from other mammalian species, serum from other animal species, serum replacement or combinations thereof.
  • Antifreezes which can be used are alkyl sulfoxides, for example methyl ethyl sulfoxide, diethyl sulfoxide, dibutyl sulfoxide, methyl butyl sulfoxide, ethyl butyl sulfoxide, but preferably dimethyl sulfoxide (DMSO) or other suitable cell-penetrating organic solvents, such as, for example, polyalcohols, for example ethylene glycol, propylene glycol, butanediol and glycerol combinations, and glycerol combinations Antifreeze among themselves.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • polyalcohols for example ethylene glycol, propylene glycol, butanediol and glycerol combinations, and glycerol combinations Antifreeze among themselves.
  • the freezing medium can consist of 90 vol.% Serum and 10 vol.% DMSO or 40 vol.% Serum, 50 vol.% Culture medium and 10% DMSO.
  • Glycosaminoglycans for example hyaluronic acid, dermatan sulfate, heparin sulfate, keratin sulfate, but preferably chondroitin
  • suifat in a concentration of 1 to 10 wt .-%, preferably 2.5 wt .-% are added to a freezing medium.
  • This freezing medium can consist of 1 to 95% by volume of serum, preferably 10 to 90% by volume of serum.
  • a cultural dium can be any buffered physiological solution, for example buffered
  • Saline solutions and culture media such as DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) can be used.
  • the freezing medium can contain other additives such as ⁇ -tocopherol, vitamin C, synovial fluid, hyaluronic acid and lecithin.
  • the cells are frozen directly in the culture bottle or in other glass or plastic vessels, preferably cryotubes.
  • the cells should be subjected to the following freezing procedure within 360 minutes, preferably after 30 to 40 minutes after the addition of the freezing medium:
  • the cartilage cells are at a rate of -0.1 ° C to -30 ° C per minute, preferably -0.1 ° C to -3 ° C per minute, particularly preferably at -1 ° C per minute to temperatures of up to -150 ° C frozen. After reaching a temperature of up to -150 ° C, preferably from -70 ° C to -80 ° C, the frozen cartilage cell suspension can be brought to temperatures below -130 ° C, preferably to -196 ° C.
  • articular cartilage tissue which is removed from the weight-loaded and / or non-weight-loaded area of human knee joints, is digested in order to isolate the chondrocytes. To do this, proceed as follows: 1. The removed cartilage tissue is washed several times with sterile GBSS (Gey 's buffered saline, Gibco) and then cut into small pieces with a scalpel in a sterile glass petri dish (approx. 1 mm 3 ).
  • GBSS Gibco
  • the solution containing the digested cartilage is suctioned off and centrifuged through a nylon filter with a pore size of 20 or 50 ⁇ m (Spectrapor) into a 50 ml centrifuge tube (Greiner). The centrifugation
  • the cell pellet is washed twice with 10 ml of HBSS (Hanks buffered saline, Gibco), with the cell suspension then 5 minutes each time.
  • HBSS Hormoned saline
  • the isolated chondrocytes obtained above are in a density of about 1 x 10 2 to 5 x 10 6 cells / cm 2 , preferably with a density of 5 x 10 2 to 1 x 10 5 cells / cm 2 , particularly preferably with a density of
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco
  • a 3: 1 or 1: 1 mixture of DMEM and Nutrient Mixture Ham's F12 (Gibco) can be used as the culture medium, which additionally contains 10% human serum.
  • the culture medium is first suctioned off and the chondrocytes adhering to the bottom with PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline solution without Ca + - or
  • trypsin-EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • Trypsin 1 250 describes a trypsin preparation, whereby 1 g trypsin degrades 250 g substrate. The trypsin has the task of cleaving the adhesion proteins, while EDTA binds all divalent cations.
  • the culture bottle is then placed in an incubator at 37 ° C. for 5, better for 10 to 15 minutes. 5. After the ⁇ -minute incubation in the incubator, the proteolytic enzymes in the cell suspension are inactivated by adding the culture medium, the final concentration of human serum being 10% (v / v). The chondrocytes are now centrifuged again
  • the chondrocytes are then either further cultivated and, if appropriate, subcultured in order to move to a later one
  • the chondrocytes are centrifuged for 5 minutes at 150 to 200 x g at 4 ° C. The supernatant is removed. Sufficient fresh, ice-cooled (antibiotic-free) culture medium with 10% (v / v) human serum is added to the cell suspension so that the cells are twice as concentrated as is ultimately desired for cryopreservation.
  • the chondrocyte suspension is then poured into chilled cryotubes in small 1 ml portions. Each of these tubes contains approximately 1 x 10 6 cells.
  • the chondrocytes in the vapor phase which forms above the liquid phase in the nitrogen storage container, can now be cooled at a defined rate. This cooling rate is approximately -1 ° C per minute.
  • a polystyrene box can also be used, which has a wall thickness of 2 to 4 cm, preferably 5 to 10 mm.
  • the polystyrene box is closed and placed in a -70 ° C freezer, in which the cells then cool at a rate of approximately -1 ° C per minute. After approximately 12 hours, the cartilage cells are transferred to the nitrogen storage container.

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Abstract

Der Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Knorpelzellsuspension, das dadurch gekennzeichnet ist, daß Knorpelzellen in einem Kulturmedium vermehrt werden, das Serum oder Serumersatz enthält, und daß die Knorpelzellen nach der Zellvermehrung bei einer Temperatur von unter -10 °C eingefroren werden.

Description

Verfahren zur Herstellung einer Knorpelzellsuspension
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Knorpelzellsuspension, die zur Behandlung von Knorpeldefekten im Kniegelenk eingesetzt wer- den soll.
Schädigungen im Gelenkknorpel treten häufig bei Unfällen insbesondere Sportunfällen auf. Besondere Probleme ergeben sich aus der schlechten Regenerationsfähigkeit des Knorpelgewebes. Solche Knorpeldefekte können langfristig zu einer Arthrose und sogar zu einem vollständigen Verlust der Gelenkfunktion führen.
Knorpel ist ein Gewebe, das zu 70 bis 80 Gew.-% aus Wasser besteht. Die Struktur des Knorpels ist dergestalt, daß die Knorpelzellen in einer Matrix verteilt sind, die von den Knorpelzellen produziert und ausgeschieden wird. Im Gegen- satz zu Knochen wird Knorpel nicht vom Nerven-, Gefäß- oder Lymphsystem versorgt. Die Matrix des Gelenkknorpels besteht im wesentlichen aus Typ II Kollagen und den Proteoglykanen. Proteoglykane sind Proteine mit langen Polysaccharid- ketten, den Glykosaminoglykanen. Dazu gehören Keratansulfat, Chondroitin-4- Sulfat und Chondroitin-6-Sulfat.
Eine Möglichkeit im Stand der Technik zur Behandlung von Knorpeldefekten wird in der US 5,723,331 vorgeschlagen. Hierbei werden Knorpelzellen aus einem Knorpelstück des Patienten isoliert und in einem Kultivierungsmedium, das fötales Kälberserum enthält, in vitro vermehrt. Diese Knorpelzellen werden nach der in- vitro-Vermehrung zunächst dazu benutzt, in vitro ein künstliches Knorpelgewebestück herzustellen, in dem die Knorpelzellen stimuliert werden, eine extrazelluläre Matrix zu produzieren. Diese Matrix besteht aus Kollagenfibrillen und sulfatierten Proteoglykanen, die unter anderem Chondroitin-6-Sulfat und Keratansulfat beinhalten. Auf diese Weise wird in vitro ein künstliches Knorpelgewebestück heran- gezüchtet, das aus Knorpelzellen besteht, die in einer Matrix verteilt sind, die aus von diesen Knorpelzellen produzierten und ausgeschiedenen Substanzen besteht. Dieses künstliche Knorpelgewebe kann dann dem Patienten transplantiert werden. Nachteilig bei diesem Verfahren ist jedoch, daß durch die Verwendung von Fremdseren, hier fötales Kälberserum, eine Übertragung von Krankheiten, die beispielsweise von Viren oder Bakterien verursacht werden können, nicht ausge- schlössen werden kann. Hierbei wird insbesondere darauf verwiesen, daß es neuerdings als gesichert gilt, daß die Übertragung der spongioformen bovinen Encephalopathie („Rinderwahnsinn") auf den Menschen möglich erscheint.
Weiterhin ist es nachteilig, daß die zu transplantierenden Knorpelzellen bei der Kultivierung mit fötalem Kälberserum mit Fremdeiweißen kontaminiert werden können und es nach der Transplantation bei dem Patienten zu Problemen mit immunologischen Reaktionen kommen kann.
Die Behandlung von Knorpeldefekten im Kniegelenk mittels Transplantation von in vitro kultivierten Knoφelzellen in den geschädigten Bereich des Knorpelgewebes, wurde bereits 1994 von Brittberg et al. im New England Journal of Medicine 331 , Seiten 889-895 vorgestellt. Hierbei werden Knorpelzellen aus dem Knorpel des Patienten isoliert. Diese Zellen werden in vitro vermehrt und so eine Knorpelzellsuspension hergestellt, die circa 2,6 bis 5 x 10β Zellen enthält. Diese Knorpel- zellsuspension wird dann operativ in die Knorpeldefekte des Patienten transplantiert.
Die Firma co.don® Gesellschaft für molekulare Medizin und Biotechnologie mbH bietet ein modifiziertes Verfahren zur Knorpelzellisolierung und Vermehrung als Dienstleistung an. Hierbei werden jedoch keine Antibiotika bzw. Fungistatika in das Kulturmedium gegeben. Damit soll erreicht werden, daß die Proliferationsund Differenzierungsfähigkeit der Zellen erhalten bleibt.
Nachteilig bei diesem Kultivierungsverfahren für Knorpelzellen ist jedoch, daß die Knorpelzellen nicht eingefroren werden können. So legt die Firma co.don® dar, daß es für einen langfristigen Therapieerfolg wichtig sei, die Knorpelzellen differenzierungsfähig zu halten. Dies sei nicht möglich, wenn Knorpelzellen nach der Vermehrung eingefroren würden, da das Einfrieren von Knorpelzellen zur Bildung von verschiedenen Reifestadien führe.
Der Nachteil, die Knorpelzellen nach der Vermehrung nicht einfrieren zu können, liegt insbesondere darin, daß der Arzt zu einem vorbestimmten Zeitpunkt nach der Entnahme der Knorpelzellen gezwungen ist, die aus diesen Knorpelzellen hergestellte Knorpelzellsuspension wieder in den Patienten zu transplantieren. Diese zeitliche Unflexibilität ist für die Beteiligten wie den Arzt, die Krankenkassen und den Patienten ökonomisch sehr nachteilig.
Weiterhin ist es besonders nachteilig, die Knorpelzellen nach erreichen der gewünschten Zellmasse noch länger zu subkultivieren, falls sich die Transplantation verzögern sollte. Eine weitere Subkultivierung über einen längeren Zeitraum ist kostenintensiv und kann zur irreversiblen Dedifferenzierung und Verlust der Proli- ferationsfähigkeit der Knorpelzellen führen.
Die technische Aufgabe war es daher, ein Verfahren zur Herstellung von Knorpelzellsuspensionen zu finden, bei dem die genannten Probleme nicht auftreten. So war es insbesondere die Aufgabe, den Zeitraum zwischen Knorpelentnahme und Knorpelzelltransplantation flexibel zu gestalten und dennoch der Gefahr einer irreversiblen Dedifferenzierung und Verlust der Proliferationsfähigkeit der Zellen durch Kultivierung über einen längeren Zeitraum vorzubeugen.
Die technische Aufgabe wurde durch ein Verfahren zur Herstellung einer Knor- pelzellsuspension gelöst, wobei die Knorpelzellen in einem Kulturmedium vermehrt werden, das Serum oder Serumersatz enthält und wobei die Knorpelzellen nach der Zellvermehrung bei einer Temperatur von unter -10 °C eingefroren werden. Diese Knorpelzellen stammen bevorzugt aus von Patienten isoliertem Knorpelgewebe.
Es wurde nämlich überraschenderweise gefunden, daß die Differenzierungs- und Proliferationsfähigkeit von in vitro vermehrten Knorpelzellen auch nach Einfrieren nicht vermindert ist und daher der Therapieerfolg gesichert ist. Besonders vorteilhaft ist hier, daß der Zeitraum zwischen Knorpelentnahme vom Patienten und Transplantation der Knorpelzellsuspension in den geschädigten Knorpel des Patienten beliebig sein kann und somit allen Beteiligten wie Arzt, Patient und Krankenkasse eine größtmögliche zeitliche Flexibilität bei der Terminierung der Transplantation erhalten bleibt. Somit können z.B. alle Formalitäten zwischen Arzt, Krankenkasse und Patient vor der Transplantation erledigt werden, sowie zeitliche Engpässe im Krankenhaus, von Patienten bedingte zeitliche Aufschübe der Operation oder Operationen ausschließende Ursachen überwunden werden.
Besonders vorteilhaft ist hierbei, daß die teure Subkultivierung der Knorpelzellen über einen längeren Zeitraum entfällt und daher auch nicht die Gefahr besteht, daß die Zellen ihre Differenzierungs- und Proliferationsfähigkeit verlieren.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Knorpelzellen in einem Kulturmedium vermehrt, das 5 bis 50 Vol.-% Serum oder Serumersatz, vorzugsweise 10 Vol.-% Serum oder Serumersatz enthält. Dabei ist dieses Serum ausgewählt aus der Gruppe humanes Serum, fötales Kälberserum, Kälberserum, Serum anderer Säugetierspezies, Serum anderer Tierspezies oder Kombinatio- nen derselben. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung von patienteneigenem Serum oder Serumersatz, da hier die Übertragung von Krankheiten aus anderen Organismen sowie immunologische Reaktionen gegenüber Fremdeiweißen ganz ausgeschlossen werden kann.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen in einem Medium eingefroren, das humanes Serum, fötales Kälberserum, Kälberserum, Serum anderer Säugetierspezies, Serum anderer Tierspezies, Serumersatz, Serumalbumin oder Kombinationen derselben enthält. Auch hier ist die Verwendung von patienteneigenem Serum oder Serumersatz besonders vorteilhaft.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Knorpelzellen in einem Medium eingefroren, das Gefrierschutzmittel enthält, die ausgewählt sind aus der Gruppe Alkylsulfoxide, z.B. Methylethylsulfoxid, Diethylsulfoxid, Dibutylsulfoxid, Methylbutylsulfoxid, Ethylbutylsulfoxid, Dimethylsulfoxid, oder andere geeignete zellpenetrierende organische Lösungsmittel wie z.B. Polyalkohole wie Ethylengly- kol, Propylenglykol, Butandiol, Glycerin oder Kombinationen derselben. Mit diesen Gefrierschutzmitteln wird die Überlebensfähigkeit der Knorpelzellen nach dem Einfrieren und Wiederauftauen gewährleistet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Knorpelzellen in einem Medium eingefroren, das ein Glykosaminoglykan enthält, vorzugsweise Hyaluron- säure, Dermatansulfat, Heparinsulfat, Keratansulfat, Chondroitinsulfat oder Kombinationen derselben.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die Knorpelzellen nach folgendem Schema eingefroren:
Die Knorpelzellsuspension wird mit einer Geschwindigkeit von -0,1 °C bis -30 °C pro Minute, vorzugsweise mit einer Geschwindigkeit von -0,1 °C bis -3 °C pro Minute, besonders bevorzugt mit -1 °C pro Minute auf Temperaturen von bis zu -150 °C abgekühlt. Nach Erzielen einer Temperatur von bis zu -150 °C können die Zellen in eine Umgebung gebracht werden, die eine Temperatur von unter -130 °C, vorzugsweise von -196 °C besitzt. Bei diesem letzten Schritt kann die Einfriergeschwindigkeit variiert werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können die Knorpelzellen nach Beginn der einzelnen Vermehrungsschritte zu jedem Zeitpunkt eingefroren werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stammen die zu vermehrenden Knorpelzellen und das humane Serum, das zum Kulturmedium zugefügt wird, vom gleichen Individuum. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die Knorpelzellen in ihrer
Erbsubstanz gentechnisch verändert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden Zellen verwendet, die nach Stimulation zu Zellen differenzieren, die die für Gelenkknorpel typische extrazelluläre Matrix produzieren, wobei sie unter anderem Substanzen wie Typ-Il- Kollagen und sulfatierte Proteoglykane, die beispielsweise Chondroitin-6-Sulfat, Chondroitin-4-Sulfat und Keratan-Sulfat enthalten, ausscheiden.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung einer Knorpelzellsuspension wird insbesondere wie folgt vorgegangen.
Es werden Knorpelgewebe aus dem Menschen oder aus einem Säugetier oder anderen Tierspezies isoliert. Diese Knorpelgewebe können hyaliner Gelenkknor- pel, Knoφel des Nasenseptums oder Rippenknorpel sein. Aus dem entnommenen Knorpelgewebe werden Chondrozyten isoliert, indem proteolytische Enzyme beispielsweise Pronase, Papain, Kollagenase, Trypsin, Chondroitinase ABC, Chon- droitinase AC II, Hyaluronidase, Elastase, Cathepsin G oder Gemische derselben in einem Reagenzgefäß zugegeben werden. Die zu isolierenden Zellen sind Knorpelzellen, die auch Chondrozyten genannt werden. Als Knorpelzellen im Sinne dieser Anmeldung sind folgende Zellen definiert:
1. aus Knorpelgewebe isolierte Zellen, die auch Chondrozyten genannt werden; 2. Zellen wie z.B. Knorpelzellen, sonstige Zellen aus Mammaliem oder anderen Tieren, aber auch Pflanzenzellen, Bakterienzellen, und Zellen anderer Organismenreiche, die nach Stimulation zu Zellen differenzieren, die die für Gelenkknorpel typische extrazelluläre Matrix produzieren, wobei sie unter anderem Substanzen wie Typ-Il-Kollagen und sulfatierte Proteogly- kane, die beispielsweise Chondroitin-6-Sulfat, Chondroitin-4-Sulfat und Keratan-Sulfat enthalten, ausscheiden; 3. gentechnisch veränderte Zellen wie z.B. Knorpelzellen, sonstige Zellen aus Mammaiiem oder anderen Tieren, aber auch Pflanzenzellen, Bakterienzellen, und Zellen anderer Organismenreiche, die für den Gelenkknorpel typische extrazelluläre Matrix produzieren, wobei sie unter anderem Substan- s zen wie Typ-Il-Kollagen und sulfatierte Proteoglykane, die beispielsweise
Chondroitin-6-Sulfat, Chondroitin-4-Sulfat und Keratansulfat enthalten, ausscheiden.
Diese Zellen werden in einem Kulturmedium vermehrt. Weiterhin ist es möglich, o die isolierten Knorpelzellen gentechnisch zu verändern und zu vermehren. Die Vermehrung der Knorpelzellen erfolgt in einem Kulturmedium mit oder ohne Serum, α-Ketoglutarat, L-Glutamin, Puffer-, Vitamin C- und/oder sonstigem Vitaminzusatz sowie mit und ohne antibakterielle Wirkstoffe und/oder antimykotisch wirksame Substanzen. Dabei kann der Serumzusatz zu dem Kulturmedium ausge- 5 wählt sein aus der Gruppe humanes Serum, fötales Kälberserum, Kälberserum, Serum anderer Säugetierspezies, Serum anderer Tierspezies, Serumersatz oder Kombinationen derselben. Nach der Vermehrung der Knorpelzellen werden diese eingefroren. Dazu wird ein spezielles Einfriermedium hergestellt. Dieses besteht aus Kombinationen von Gefrierschutzmitteln mit oder ohne Seren, Kulturmedien 0 oder Serumalbumin. Als Gefrierschutzmittel können Alkylsulfoxide, beispielsweise Methylethylsulfoxid, Diethylsulfoxid, Dibutylsulfoxid, Methylbutylsulfoxid, Ethylbutylsulfoxid, vorzugsweise jedoch Dimethylsulfoxid (DMSO) oder andere geeignete zellpenetrierende organische Lösungsmittel, wie zum Beispiel Polyalkohole, beispielsweise Ethylenglykol, Propylenglykol, Butandiol und Glycerin, verwendet 5 werden, sowie Kombinationen einzelner Gefrierschutzmittel untereinander. So kann das Einfriermedium beispielsweise aus 90 Vol.-% Serum und 10 Vol.-% DMSO oder 40 Vol.-% Serum, 50 Vol.-% Kulturmedium und 10 % DMSO bestehen. Weiterhin können Glykosaminoglykane, beispielsweise Hyaluronsäure, Dermatansulfat, Heparinsulfat, Keratansulfat, vorzugsweise jedoch Chondroitin-
3 suifat in einer Konzentration von 1 bis 10 Gew.-%, vorzugsweise 2,5 Gew.-% zu einem Einfriermedium zugesetzt werden. Dieses Einfriermedium kann aus 1 bis 95 Vol.-% Serum, vorzugsweise 10 bis 90 Vol.-% Serum bestehen. Als Kulturme- dium kann jede gepufferte physiologische Lösung, beispielsweise gepufferte
Salzlösungen und Kulturmedien wie DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) verwendet werden. Das Einfriermedium kann weitere Zusätze wie beispielsweise α-Tocopherol, Vitamin C, Synovialflüssigkeit, Hyaluronsäure und Lecithin enthal- ten.
Das Einfrieren der Zellen erfolgt direkt in der Kulturflasche oder in anderen Glasoder Kunststoffgefäßen, vorzugsweise Kryoröhrchen. Die Zellen sollten innerhalb von 360 Minuten, vorzugsweise nach 30 bis 40 Minuten nach Zusatz des Ein- friermediums folgender Einfrierprozedur unterworfen werden:
Die Knorpelzellen werden mit einer Geschwindigkeit von -0,1 °C bis -30 °C pro Minute, vorzugsweise -0,1 °C bis -3 °C pro Minute, besonders bevorzugt mit -1 °C pro Minute auf Temperaturen von bis zu -150 °C eingefroren. Nach Erreichen ei- ner Temperatur von bis zu -150 °C, vorzugsweise von -70 °C bis -80 °C, kann die gefrorene Knoφelzellsuspension auf Temperaturen unter -130 °C, vorzugsweise auf -196 °C gebracht werden.
Anhand des nachfolgenden Beispiels wird das erfindungsgemäße Verfahren nä- her erläutert:
Beispiel
I. Chondrozytenisolierung aus artikularem Knorpelgewebe
Durch enzymatische Verdauung wird artikulares Knorpelgewebe, das aus dem gewichtsbelasteten und/oder nicht-gewichtsbelasteten Bereich menschlicher Kniegelenke entnommen wird, verdaut, um die Chondrozyten zu isolieren. Hierzu wird wie folgt verfahren: 1. Das entnommene Knorpelgewebe wird mehrmals mit sterilem GBSS (Gey's gepufferte Salzlösung, Gibco) gewaschen und anschließend mit einem Skalpell in einer sterilen Glaspetrischale in kleine Stücke geschnitten (ca. 1 mm3).
5
2. Die zerkleinerten Knorpelstücke werden nach Absaugen der GBSS-Lösung in eine sterile Kunststoffpetrischale überführt.
3. Nach Zusatz einer sterilen 0,8 %igen Pronaselösung (Calbiochem) in ιo GBSS werden die Knorpelstücke 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert.
4. Anschließend wird die Pronaselösung abgesaugt, die Knorpelstücke einmal mit steriler GBSS-Lösung gewaschen, dann eine sterile 0,5 %ige Kollagenaselösung (CLS 2, Worthington oder CellSystems) in GBSS hin- i5 zugefügt und nun über Nacht (ca. 18 Stunden) bei 37 °C inkubiert.
5. Die den verdauten Knorpel enthaltene Lösung wird abgesaugt und durch einen Nylonfilter mit einer Porenweite von 20 oder 50 μm (Spectrapor) in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen (Greiner) zentrifugiert. Die Zentrifugation
20 erfolgt für 10 Minuten bei 600 x g in dem Ausschwingrotor einer Zentrifuge
(Eppendorf). Der Überstand wird abgesaugt.
6. Das Zellpellet wird 2 x mit 10 ml HBSS (Hanks gepufferte Salzlösung, Gibco) gewaschen, wobei jeweils anschließend die Zellsuspension 5 Minu-
25 ten lang bei 600 x g in dem Ausschwingrotor einer Zentrifuge (Eppendorf) zentrifugiert wird. Das Zellpellet wird in HBSS resuspendiert. Anschließend erfolgt die Zellzählung in einer Neubauer-Kammer. Danach wird die Zellsuspension 5 Minuten lang bei 600 x g in dem Ausschwingrotor einer Zentrifuge (Eppendorf) zentrifugiert. II. Zellproliferation
1. Die oben erhaltenen isolierten Chondrozyten werden in einer Dichte von ca. 1 x 102 bis 5 x 106 Zellen/cm2, vorzugsweise mit einer Dichte von 5 x 102 bis 1 x 105 Zellen/cm2, besonders bevorzugt mit einer Dichte von
1 x 103 bis 1 x 104 Zellen/cm2 in einer Zellkulturflasche ausgesät und in einem Brutschrank bei 37 °C, und einer Atmosphäre enthaltend 5 % CO2 bei 95 %iger relativer Luftfeuchte in Gegenwart eines Kulturmediums kultiviert.
2. Als Kulturmedium wird DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco) eingesetzt, das mit humanem Serum supplementiert wurde. Alternativ kann auch eine 3:1 oder 1 :1 Mischung von DMEM und Nutrient Mixture Ham's F12 (Gibco) als Kulturmedium verwendet werden, das zusätzlich 10 % humanes Serum enthält.
3. Sobald die Chondrozytenkultur konfluent oder besser subkonfluent ist, werden die Zellen von dem Boden der Kulturflasche enzymatisch oder mechanisch mit Hilfe eines Zellschabers gelöst. Hierzu wird zunächst das Kulturmedium abgesaugt und die am Boden anhaftenden Chondrozyten mit PBS (Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Ca +- oder
Mg2+-lonen, Gibco) gewaschen.
4. Nach Entfernen der PBS-Lösung werden nun die adhärenten Zellen mit einer Trypsin-EDTA-(Ethylendiamintetraessigsäure)-Lösung von der Plas- tikoberfläche der Kulturflasche abgelöst. Die Trypsin-EDTA-Lösung enthält
0,05 % 1 :250 Trypsin und 0,02 % (w/v) EDTA in einer gepufferten Salzlösung pH 7,2. Diese gepufferte Salzlösung enthält keine Ca2+ oder Mg2+- lonen. Trypsin 1 :250 bezeichnet eine Trypsinpräparation, wobei 1 g Trypsin 250 g Subtrat abbaut. Das Trypsin hat dabei die Aufgabe, die Adhäsi- onsproteine zu spalten, während EDTA alle zweiwertigen Kationen bindet.
Die Kulturflasche wird anschließend für 5, besser für 10 bis 15 Minuten in einen Brutschrank bei 37 °C gestellt. 5. Nach der δminütigen Inkubation im Brutschrank werden die proteolytischen Enzyme in der Zellsuspension durch das Hinzufügen des Kulturmediums inaktiviert, wobei die Endkonzentration von humanem Serum 10 % (v/v) betragen sollte. Die Chondrozyten werden jetzt nochmals zentrifugiert, das
Trypsin-EDTA-Kulturmedium abpipettiert und frisches Kulturmedium hinzugefügt, da Reste von EDTA stören können.
6. Nach Bestimmung der Zelldichte werden die Chondrozyten nun entweder weiter kultiviert und gegebenenfalls subkultiviert, um zu einem späteren
Zeitpunkt oder direkt eingefroren zu werden.
III. Kryokonservierung der Chondrozyten
1. Zunächst werden, nach Bestimmung der Zellzahl, die Chondrozyten für 5 Minuten mit 150 bis 200 x g bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird entnommen. Zu der Zellsuspension wird soviel frisches, eisgekühltes (antibiotikafreies) Kulturmedium mit 10 % (v/v) humanem Serum hinzugefügt, daß die Zellen doppelt so konzentriert vorliegen wie letztlich für die Kryokonservierung gewünscht ist.
2. Das Einfrieren von Chondrozyten erfolgt in Gegenwart eines Gefrierschutzmittels. Hierzu wird zunächst eine doppeltkonzentrierte Lösung nach folgendem Rezept angesetzt:
40 % (v/v) Kulturmedium, 40 % (v/v) humanes Serum und 20 % (v/v) DMSO oder Glycerin. Diese Mischung wird in der beschriebenen Reihenfolge angesetzt und durch Umrühren vermischt. Mit Hilfe eines 0,2-μm-Einmalfilters wird diese Lösung in ein steriles Zentrifugenröhrchen gefüllt. 3. Diese doppeltkonzentrierte Lösung wird nun zum gleichen Volumen der in Kulturmedium suspendierten Chondrozyten gegeben, so daß man die benötigten Konzentrationsverhältnisse der Einfrierlösung erhält.
4. Die Chondrozytensuspension wird anschließend in kleinen Portionen von je 1 ml in gekühlte Kryoröhrchen gefüllt. In jedem dieser Röhrchen befinden sich dann ca. 1 x 106 Zellen.
5. Mit Hilfe einer speziellen Gefrierhalterung lassen sich nun die Chondro- zyten in der Dampfphase, die sich über der flüssigen Phase im Stickstoffvorratsbehälter bildet, mit einer definierten Rate abkühlen. Diese Abkühlrate beträgt etwa -1 °C pro Minute.
6. Alternativ zu Punkt 5 kann auch eine Polystyrol-Box verwendet werden, die eine Wanddicke von 2 bis 4 cm, vorzugsweise von 5 bis 10 mm besitzt.
Dann wird die Polystyrol-Box verschlossen und in eine -70 °C-Gefriertruhe gestellt, in der die Zellen dann mit einer Geschwindigkeit von etwa -1 °C pro Minute abkühlen. Nach etwa 12 Stunden werden die Knorpelzellen in den Stickstoffaufbewahrungsbehälter überführt.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung einer Knorpelzellsuspension, dadurch gekennzeichnet, daß die Knorpelzellen in einem Kulturmedium vermehrt werden, das Serum oder Serumersatz enthält, und daß die Knorpelzellen nach der Zellvermehrung bei einer Temperatur von unter -10 °C eingefroren werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium, in dem die Knorpelzellen vermehrt werden, 5 bis 50 Vol.-% Serum oder Serumersatz, vorzugsweise 10 Vol.-% Serum oder Serumersatz enthält.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Serum ausgewählt ist aus der Gruppe humanes Serum, fötales Kälber- serum, Kälberserum, Serum anderer Säugetierspezies, Serum anderer
Tierspezies oder Kombinationen derselben.
4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Knorpelzellen in einem Medium eingefroren werden, das einen Zusatz enthält ausgewählt aus der Gruppe humanes Serum, fötales Kälberserum, Kälberserum, Serum anderer Säugetierspezies, Serum anderer Tierspezies, Serumersatz, Serumalbumin oder Kombinationen derselben.
5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Knoφelzellen in einem Medium eingefroren werden, das Alkylsulfoxide und/oder Polyalkohole als Gefrierschutzmittel in einer Konzentration von 2 bis 40 Vol.-%, vorzugsweise 10 bis 20 Vol.-% enthält.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Alkylsul- foxide ausgewählt sind aus der Gruppe Methylethylsulfoxid, Diethylsulf- oxid, Dibutylsulfoxid, Methylbutylsulfoxid, Ethylbutylsulfoxid und Dimethylsulfoxid.
7 Verfahren nach den Ansprüchen 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyalkohole ausgewählt sind aus der Gruppe Ethylenglykol, Propy- lenglykol, Butandiol und Glycerin.
5
8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Knorpelzellen in einem Medium eingefroren werden, das ein Glykosa- minoglykan enthält.
ιo 9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Knorpelzellen mit einer Geschwindigkeit von -0.1 °C bis -30 °C pro Minute, vorzugsweise -0.1 °C bis -3 °C pro Minute, besonders bevorzugt mit - 1 °C pro Minute auf bis zu -150 °C eingefroren werden.
15 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die gefrorenen Knorpelzellen nach Erreichen einer Temperatur von bis zu -150 °C auf Temperaturen unter -130 °C, vorzugsweise auf -196 °C überführt werden.
11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß 20 die Knoφelzellen und das humane Serum vom gleichen Individuum stammen.
12. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, daß die Knoφelzellen in ihrer Erbsubstanz gentechnisch verändert sind.
25
13. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß Zellen verwendet werden, die nach Stimulation zu Zellen differenzieren, die die für Gelenkknorpel typische extrazelluläre Matrix produzieren, wobei diese Zellen Substanzen ausscheiden enthaltend Typ-Il-Kollagen und sul-
30 fatierte Proteoglykane.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die sulfatier- ten Proteoglykane Substanzen enthalten ausgewählt aus der Gruppe Chondroitin-6-Sulfat, Chondroitin-4-Sulfat und Keratansulfat.
s 15. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Knorpelzellen aus von Patienten isoliertem Knorpelgewebe stammen.
16. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Einfrieren der Knorpelzellen nach Beginn der einzelnen Vermehrungs- o schritte zu jedem Zeitpunkt erfolgen kann.
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