DE10038700B4 - Autologe Bindegewebe, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung - Google Patents

Autologe Bindegewebe, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung Download PDF

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Abstract

Corticosteroid-stimulierte autologe Bindegewebe.

Description

  • Die Erfindung betrifft autologe Bindegewebe, Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Stabilisierung und ihre Verwendung als Transplantate. Die Herstellung der Gewebe erfolgt durch Isolation geeigneter Bindegewebszellen, wie Knorpel-, Perichondrium- und/oder Periostzellen sowie der entsprechenden Vorläuferzellen, ihre Vermehrung in vitro (Tissue engineering), Einbettung in eine dreidimensionale Matrix, Implantation und ihre Stimulation durch Corticosteroide. Die erfindungsgemäßen Gewebe eignen sich zur Verwendung als Tissue engineering-Transplantate, insbesondere als Knorpel- und Knochengewebe.
  • Durch operative Rekonstruktion angeborener, traumatologischer und tumorchirurgischer Gewebedefekte entsteht in der plastisch-rekonstruktiven Kopf-Halschirurgie klassischerweise ein hoher Bedarf an verschiedensten Gewebeersatzmaterialien. Zur Wiederherstellung von Form und Funktion werden insbesondere Stützmaterialien wie Knorpel- und Knochengewebe benötigt. Im Kopf-Hals-Bereich findet man eine Vielzahl komplex geformter Strukturen, wie beispielsweise das äußere Ohr, die Trachea und den Oberkiefer. Die individuell stark differierende, komplexe Formgebung dieser Strukturen stellt hohe Anforderungen an das für eine Rekonstruktion ausgewählte Transplantat. Kleinere Defekte lassen sich problemlos mit dem zur Verfügung stehenden körpereigenen Knorpelreservoir, unter Umgehung von Transplantatabstoßungs-Reaktionen, autolog rekonstruieren [Hartig GK, Esclamado RM, Telian SA (1994) Comparison of the chondrogenic potential of free and vascularisized perichondrium in the airway, Ann Otol Rhinol Laryngol 103:9-15; Hammer C, Bujia J, Immunologie vitaler und konservierter Transplantate, Eur Arch Oto Rhino Laryngol Suppl.I 1992:326].
  • Bei der Rekonstruktion größerer Defekte und bei der Rekonstruktion von Knochendefekten stößt man jedoch schnell an die Grenzen der Verfügbarkeit autologer Knorpelreservoirs.
  • Ein weiteres Problem neben der Verfügbarkeit stellt die Formung und Stabilität der autolog entnommenen Knorpeltransplantate dar. Bis heute steht sowohl für die Ohrrekonstruktion [Nagata S (1994): Modification of the stages in total reconstruction of the Auricle: Part I. Grafting the three dimensional costal cartilage framework for lobule-type microtia, Plast Reconstr Surg 93(2):221-253] als auch für die Trachearekonstruktion [Okumura N, Teramachi M, Takimoto Y, Nakamura T, Ikada Y, Shimizu Y (1994) Experimental reconstruction of the intrathoracic trachea using a new prosthesis made from collagen grafted mesh. ASAIO J 40(3 ):834-839] kein den funktionellen und kosmetischen Anforderungen Rechnung tragendes Rekonstruktionsverfahren zur Verfügung. Auch Knochengewebe ist nicht in ausreichendem Maße verfügbar. Der ständig mit der Verbesserung operativer Techniken mitwachsende Bedarf an vitalen, autologen Ersatzmaterialien, bei gleichzeitig begrenzter Verfügbarkeit, führte zur Intensivierung von Untersuchungen zur in vitro-Herstellung autologer vitaler Gewebeersatzmaterialien.
  • Autologer Gewebeersatz kann mit der Methode des Tissue Engineering in ausreichender Menge hergestellt werden (Patente: DE 4306661 A1 , DE 4431598 A1 , US 5891455 , US 5932459 , DE 4431598 A1 ) – die Probleme größerer Gewebsdefekte würden kompensiert. Das Gewebe dient der Transplantation in entsprechende Defekte.
  • In der Schrift WO 97/15655 A2 werden bereits Gewebe und Implantate beschrieben, die insbesondere Knorpelzellen in einer dreidimensionalen Trägerstruktur enthalten und die in Gegenwart von Cyclosporin A kultiviert werden. Da Cyclosporin das Enzym Calcineurin (eine Ca2+/Calmodulin-regulierte Phosphoprotein-phosphatase) und damit die Signalweiterleitung in speziellen Zellen der Immunabwehr (T-Lymphozyten) hemmt, wird es insbesondere bei allogenen Transplantaten verwendet, da mittels T-Zellen zwischen fremd und eigen unterschieden werden kann.
  • Weiterhin sind aus der Druckschrift DE 4431598 A1 Verfahren zum Herstellen von Implantaten aus Zellkulturen in dreidimensionalen Strukturen bekannt, insbesondere aus Knorpelzellen. wobei vorgeformte Trägerstrukturen mit Nährlösungen zum Wachstum der Zellen perfundiert werden (vgl. auch Patentanmeldung DE 4306661 A1
  • Bisherige Versuche haben gezeigt, dass unspezifische und spezifische Abstoßungsreaktionen das Überleben der Transplantate limitiert haben.
  • Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Herstellung autologer vitaler Gewebeersatzmaterialien zu verbessern. Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, dass geeignete Bindegewebszellen, wie Knorpel-, und/oder Perichondrium- und/oder Periostzellen sowie die entsprechenden Vorläuferzellen isoliert, in vitro vermehrt (Tissue engineering), in eine dreidimensionale Matrix eingebettet und durch Corticosteroide stimuliert werden. Zum Wesen der Erfindung gehört die vorübergehende Immunsuppression des Empfängers von Tissue Engineering-Transplantaten.
  • Erfindungsgemäß werden Bindegewebszellen, z.B. stimulierte – d.h. im Wachstum, in der Differenzierung oder der Reifung stimulierte – Chondrozyten isoliert, anschließend vermehrt und mit biokompatiblen Materialien in die gewünschte Transplantat-Form gebracht. Nach der Implantation wird das Transplantat-Bett einmalig mit einem Corticoid behandelt, dann erfolgt eine etwa dreiwöchige systemische Applikation von Corticosteroiden. Als biokompatible Materialien finden Fibrinkleber, Alginat, Hyaluronsäure, Agarose u.a. Verwendung, erfindungsgemäß die Kombinationen Fibrinkleber und Hyaluronsäure sowie Agarose und Fibrinkleber.
  • Überraschenderweise hat sich herausgestellt, dass mit Hilfe einer vorübergehenden Immunmodulation durch Corticosteroide die das Überleben der Transplantate limitierenden unspezifischen und spezifischen Abstoßungsreaktionen bei guter Verträglichkeit für den Empfänger umgangen werden können. Außerdem wird durch die Corticosteroide eine Reifung und Differenzierung des Transplantats in vivo erzielt (in vivo Tissue Engineering).
  • Eine zusätzliche Lösung zum Schutz vor Resorption und zur Stabilisierung von Transplantaten stellt die Verkapselung der autologen Transplantate z. B. mit einer Polyelektrolytmembran dar [Haisch A, Groeger A, Radke C, Ebmeyer J, Sudhoff H, Grasnick G, Jahnke V, Burmester G R, Sittinger M(2000) Macroencapsulation of human cartilage implants: pilot study with polyelectrolyte complex membrane encapsulation Biomaterials 21(2000) 1561-1566].
  • Die Einkapselung heterologer Transplantate mittels gezüchteter Knorpelgewebe ist von Vacanti bereits beschrieben worden ( US 5741685 ); diese Erfindung löst jedoch nicht das Problem der Stabilität des gezüchteten Knorpels selbst.
  • Die erfindungsgemäße Vorgehensweise erlaubt die Herstellung autologer Knorpel- und Knochengewebe, insbesondere plastische Rekonstruktionen und Ersatz bei traumatischen Läsionen (z.B. Ohr, Nase, Trachea, Oesophagus).
  • Die erfindungsgemäßen Corticosteroid-stimulierten autologen Bindegewebe wirken unspezifisch auf das gesamte Abwehrsystem des Körpers – im Unterschied zu Cyclosporinstimuliertem autologen Bindegewebe wie in DE 4431598 A1 (Cyclosporin ist sinnvoll bei allogenen Transplantaten). So werden nicht nur aktivierte Abwehrzellen gebremst, sondern auch Fresszellen (Phagozyten; mit der Fähigkeit, unbelebte oder belebte Fremdpartikel – wie Mikroorganismen, Blutzellen, Gewebstrümmer etc. – aufzunehmen und zu verdauen; Phagozytose). Corticosteroide beeinflussen auch die Differenzierung mesenchymaler Zellen. Bei autologen Geweben wurde Cortison wegen seiner breiteren Wirkung gewählt, da mangels fremder Zellen weniger mit einer spezifischen T-Zell-vermittelten Abwehr zu rechnen ist.
  • Die Merkmale der Erfindung gehen außer aus den Ansprüchen auch aus der Beschreibung hervor, wobei die einzelnen Merkmale jeweils für sich allein oder zu mehreren in Form von Kombinationen vorteilhafte schutzfähige Ausführungen darstellen, für die mit dieser Schrift Schutz beantragt wird. Die Kombination besteht aus bekannten Elementen (Tissue Engineering-Transplantate, Bindegewebszellen und ihre Vermehrung) und aus neuen (Corticosteroide als Mittel zur Verringerung der Abstoßungsreaktionen oder infiltrativer, inflammatorischer Reaktionen bei autologen Transplantaten und Corticosteroide als Wachstums- und Differenzierungsstimulus), die sich gegenseitig beeinflussen und in ihrer neuen Gesamtwirkung einen Gebrauchsvorteil (synergistischen Effekt) und den erstrebten Erfolg ergeben, der darin liegt, dass nunmehr, bei guter Verträglichkeit für den Empfänger, ein Weg zur Verringerung unspezifischer und spezifischer Abstoßungsreaktionen, die das Überleben der Transplantate limitiert haben, aufgezeigt wird.
  • Ein weiteres Kombinationsmerkmal besteht darin, dass die biokompatiblen Materialien in neuen Kombinationen – Fibrinkleber und Hyaluronsäure sowie Agarose und Fibrinkleber – Verwendung finden.
  • Mit dieser Anmeldung werden autologe Bindegewebe beansprucht, die dadurch herstellbar sind, dass geeignete Bindegewebszellen isoliert, in vitro vermehrt (Tissue engineering), in eine dreidimensionale Matrix eingebettet, dann implantiert und durch Corticosteroide stimuliert werden. Die Corticosteroid-stimulierten Bindegewebszellen werden in Gestalt von Knorpel-, und/oder Perichondrium- und/oder Periostzellen und/oder ihren entsprechenden Vorläuferzellen isoliert. Autologe Bindegewebe der genannten Art sind z.B. dadurch herstellbar, dass stimulierte Chondrozyten isoliert, anschließend vermehrt und mit biokompatiblen Materialien in die in die gewünschte Transplantat-Form gebracht werden, nach der Implantation das Transplantat-Bett einmalig mit einem Corticoid behandelt wird und dann eine mehrwöchige systemische Applikation von Corticosteroiden erfolgt.
  • Außerdem wird durch die Corticosteroide eine Reifung und Differenzierung des Transplantats in vivo erzielt (in vivo Tissue Engineering).
  • Eine zusätzliche Lösung zum Schutz vor Resorption und zur Stabilisierung von Transplantaten stellt die Verkapselung der autologen Transplantate z. B. mit einer Polyelektrolytmembran dar.
  • Zur immunologischen Abschirmung bzw. Stabilisierung von autologen und allogenen Tissue Engineering-Transplantaten werden vorübergehend – etwa drei Wochen lang – Corticosteroide in antiphlogistischer Dosierung verabreicht. Die Gabe der Corticosteroide erfolgt z.B.
    • – täglich intramuskulär
    • – einmalig intramuskulär als Langzeitdepot
    • – täglich intravenös oder
    • – täglich oral.
  • Zur immunologischen Abschirmung von autologen und allogenen Tissue Engineering-Transplantaten erfolgt die vorübergehende einmalige oder etwa drei Wochen lange (Perfusionssystem) lokale Gabe von Corticosteroiden in antiphlogistischer Dosierung in das Transplantat-Bett.
  • Die erfindungsgemäße Herstellung von Knochengewebe aus Corticosteroidstimulierten Chondrozyten, Perichondrium-, Periostzellen sowie der entsprechenden Vorläuferzellen beruht z.B. darauf, dass die Stimulation der entsprechenden Bindegewebszellen
    • – vor der Implantation in vitro erfolgt; dazu werden die Corticoide dem Zell-Wachstums-Medium in entsprechender Dosierung zugesetzt
    • – nach der Implantation in vivo erfolgt; die Corticoide werden dem Empfänger des Transplantats appliziert; dabei erfolgt die Applikation als Langzeitdepot intramuskulär, täglich intramuskulär, täglich intravenös oder täglich oral.
  • Die Herstellung von Transplantaten wird mittels einer dreidimensionalen Form aus einem bioresorbierbaren Material vorgenommen oder in Form einer Suspension zum Einbringen (z.B. Injektion) in entsprechende Defekte.
  • Bei der Einkapselung autologer Tissue Engineering-Transplantate zum Zwecke biomechanischen Schutzes und mechanischer immunologischer Abschirmung/Abgrenzung und Matrixakkumulation handelt es sich hinsichtlich der Abgrenzung von Transplantaten um Hydrogele, Hyaluronsäure, Agarose, Alginat, Fibrinkleber o. ä.. Dabei kann die Kapsel/Abgrenzung des Transplantats aus einer oder mehreren Zell-Lagen aus Bindegewebszellen (z.B. Fibroblasten) oder deren Vorläuferzellen bestehen, oder es handelt sich um eine Membran aus Kollagen, Chitosan, Proteoglykanen oder Hyaluronsäure (oder um Gemische davon). Sowohl in das Transplantat als auch in die Matrix lassen sich antientzündliche und antiangiogenetische Faktoren einbringen.
  • Als antientzündlicher Faktor wird insbesondere BMP-7 (BMP – bone morphogenetic protein) in das Transplantat oder in die Kapsel gebracht.
  • Anstelle der Corticosteroide finden auch Cyclosporine oder Inhibitoren inflammatorischer Zytokine Verwendung.
  • Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, ohne sie auf diese Beispiele zu beschränken.
    •
  • Ausführungsbeispiele
  • Beschreibung der Vorgehensweise anhand stimulierter Chondrozyten, stellvertretend für andere Bindegewebszellen
  • Beispiel 0 zur Herstellung eines plastischen Knochenersatzes
  • Aus Knorpelgewebe z. B. des Ohres oder der Nasenscheidewand werden die Knorpelzellen mittels eines Enzymmixes aus Collagenasen und Hyaluronidase isoliert. Die anschließende Vermehrung der Zellen findet in Zellkulturflaschen statt. Als Medium dient z.B. RPMI (handelsübliches Zellkulturmedium), das neben anderen Zusätzen das Serum der Tierspezies bzw. des Menschen enthält. für den das werdende Transplantat hergestellt wird. Sind genügend Zellen gezüchtet. werden diese mit einer Reihe von biokompatiblen Materialien wie Fibrinkleber, Alginat, Hyaluronsäure [Lindenhayn K, Spitzer R, Heilmann HH, Perka C, Pommering K, Mennicke K, Sittinger M (1999) Retention of hyaluronic acid in alginate beads: aspects for in vitro cartilage engineering J Biomed Mat. Res. 44:149-155] Agarose [Verbruggen G, Veys EM, Wieme N, Malfait AM, Gijselbrecht L, Nimmegeers J, Almquist KF, Broddelez C (1990) The synthesis and immobilisation of cartilage-specific proteoglycan by human chondrocytes in different concentrations of agarose. Clin Exp Rheumatol 8:371-378] u.a. in Suspension gebracht und in die gewünschte dreidimensionale Rohform eines bioresorbierbaren (z.B. PLA – Polylactid) Materials z.B. eines Stützmaterials (Wolle, Vlies, Gitter, Schalen) überführt.
  • Nach Implantation des Transplantates in den Empfänger erfolgt die einmalige lokale Gabe eines Corticoids in das Transplantat-Bett und anschließend die vorübergehende (ca. 3 Wochen) systemische Applikation von Corticosteroiden. Die systemische Gabe erfolgt entsprechend der Biorhythmik des endogenen Cortisols. Zur Verhinderung der Nebennierenrinden-Insuffizienz wird die Höhe der Dosis mit den Tagen verringert.
  • Beispiel 1
    • wie Beispiel 0, jedoch mit Knorpel- und Perichondriumzellen anstelle von Chondrozyten sowie Fibrinkleber und Hyaluronsäure als biokompatibles Material.
  • Beispiel 2
    • wie Beispiel 0, jedoch mit Perichondrium- und/oder Periostzellen sowie Fibrinkleber und Agarose als biokompatibles Material.
  • Beispiel 3
    • wie Beispiel 0, jedoch mit Knorpel-, Perichondriumzellen und/oder ihren entsprechenden Vorläuferzellen sowie Fibrinkleber und Agarose als biokompatibles Material.
  • Beispiel 4
    • wie Beispiel 0, jedoch mit Fibrozyten und/oder Fibroblasten.

Claims (19)

  1. Corticosteroid-stimulierte autologe Bindegewebe.
  2. Autologe Bindegewebe nach Anspruch 1, hergestellt aus isolierten Corticosteroidstimulierten Bindegewebszellen.
  3. Autologe Bindegewebe nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass Bindegewebszellen in Gestalt von Chondrozyten, Knorpel-, und/oder Perichondriumund/oder Periostzellen und/oder ihren entsprechenden Vorläuferzellen isoliert werden.
  4. Autologe Bindegewebe nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Stimulation in einem Zellwachstumsmedium erfolgt.
  5. Autologe Bindegewebe nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die stimulierten Bindegewebszellen in eine dreidimensionale Matrix eingebettet werden.
  6. Autologe Bindegewebe nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Stimulation in einer dreidimensionalen Matrix erfolgt.
  7. Autologe Bindegewebe nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Stimulation im Transplantatbett erfolgt.
  8. Verfahren zur Herstellung Corticosteroid-stimulierter autologer Bindegewebe bestehend aus folgenden Schritten: – Isolierung von geeigneten Bindegewebszellen – Vermehrung der Bindegewebszellen in vitro (Tissue Engineering) – Einbetten in eine dreidimensionale Matrix, dadurch gekennzeichnet, dass Corticosteroide einem Zellwachstumsmedium in vitro zugegeben werden.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass den Corticosteroiden zusätzlich Cyclosporin und/oder Inhibitoren inflammatorischer Zytokine zugesetzt werden.
  10. Verfahren nach Anspruch 8 und 9, dadurch gekennzeichnet, dass als Bindegewebszellen Chondrozyten und/oder Perichondrium- und/oder Periostzellen und/oder die entsprechenden Vorläuferzellen eingesetzt werden.
  11. Verfahren nach Anspruch 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Stimulation zusätzlich im Transplantatbett erfolgt.
  12. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass ein Transplantat eine dreidimensionale Form aus einem bioresorbierbaren Material enthält.
  13. Verfahren nach Anspruch 8 und 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Transplantat von einer Kapsel umgeben ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Kapsel aus Hydrogelen, Hyaluronsäure, Agarose, Alginat oder Fibrinkleber besteht.
  15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Kapsel des Transplantats aus einer oder aus mehreren Zell-Lagen aus Bindegewebszellen, deren Vorläuferzellen oder Polyelektrolytkomplexmembranen besteht.
  16. Verfahren nach Anspruch 13. dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Kapsel um eine Membran aus Kollagen, Chitosan, Proteoglykan oder Hyaluronsäure oder Gemischen davon handelt.
  17. Verfahren nach Anspruch 8 und 12, wobei sowohl in das Transplantat als auch in die Matrix antientzündliche und antiangiogenetische Faktoren eingebracht werden.
  18. Verfahren nach Anspruch 13 und 17, wobei BMP-7 als antientzündlicher Faktor ins Transplantat oder in die Kapsel gebracht wird.
  19. Verwendung der autologen Bindegewebe nach den Ansprüchen 1 bis 7 als Transplantate.
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