DE4431598A1 - Verfahren zum Herstellen eines Implantates aus Zellkulturen - Google Patents
Verfahren zum Herstellen eines Implantates aus ZellkulturenInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Herstellen
eines Implantates aus Zellkulturen, insbesondere Knorpelzellen,
wie dieses im Hauptpatent . . . (Patentanmeldung P 43
06 661.5) beschrieben ist. Bei diesem Verfahren werden die
Zellen auf eine im implantierten Zustand resorbierbare
Trägerstruktur aufgebracht, wobei als Trägerstruktur eine
dreidimensionale, im wesentlichen formstabile und entsprechend
der gewünschten Form des Implantates vorgeformte Trägerstruktur
mit einer zusammenhängenden inneren Oberfläche und einem
geringen Volumen verwendet wird. In den inneren Hohlraum dieser
Trägerstruktur werden die Zellen eingebracht, wonach
anschließend die die Zellen aufnehmende Trägerstruktur mit
einem Material ummantelt wird, durch die eine Nährlösung in das
Innere der Trägerstruktur hindurchströmen, vorzugsweise
hindurchdiffundieren, kann. Das gesamte Gebilde der ummantelten
Trägerstruktur mit den aufgenommenen Zellen wird anschließend
mit einer Nährlösung zumindest solange perfundiert, d. h.
durchströmt, bis sich zumindest teilweise eine die Zellen
aneinanderbindende interzelluläre Matrix ausgebildet hat.
Anschließend wird die Trägerstruktur implantiert, die
allmählich im Körper resorbiert wird, wobei sich gleichzeitig
die Zellenmatrix weiterbildet.
Das Material für die Ummantelung der Trägerstruktur wird
hierbei so gewählt, daß die für den Aufbau der interzellulären
Matrix notwendigen Zellenprodukte, insbesondere Kollagene und
Proteoglykane im Inneren der Trägerstruktur zurückgehalten
werden und aus dem Zellverband nicht ausgeschwemmt werden. Als
Material für diese Umhüllung ist z. B. Agarose geeignet. Auch
andere Materialien können in Betracht gezogen werden, sofern
sie die gewünschten Eigenschaften nach Art einer semipermeablen
Membran aufweisen.
Als Trägerstruktur wird vorzugsweise ein dreidimensionales
Vlies aus Polymerfasern verwendet, wobei die Fasern
selbstverständlich noch vorbereitet werden können, um die
Adhäsion von Zellen zu begünstigen.
Ferner ist es vorteilhaft, die Zellen in einer Suspension mit
der Nährlösung in die Trägerstruktur einzubringen, wobei
zusätzlich die Suspension mit einem Fremdmaterial, wiederum
etwa Agarose versetzt wird. Dieses Fremdmaterial erhöht zum
einen die Viskosität der Suspension, dient jedoch zum anderen
auch dazu, intensiv vermehrte Knorpelzellen, die sich in ihrer
Form verändert haben und mehr Fibroplasten ähneln, wiederum zu
Knorpelzellen zu redifferenzieren. Für eine solche
"Rückbildung" benötigen die Zellen ein umgebendes Medium, z. B.
die erwähnte Agarose.
Bei dem beschriebenen Verfahren können zwei Phasen der
Implantatentwicklung unterschieden werden. Als erste Phase kann
man die Vorformung bzw. Konditionierung des Gewebes in vitro
betrachten. Die zweite Phase hingegen umfaßt die Reifung und
Einheilung des Gewebes in vivo, d. h. nach der Implantation. Wie
im Hauptpatent erwähnt, besteht während der ersten Phase
prinzipiell die Möglichkeit, die Gewebeentwicklung zu steuern,
indem vorzugsweise über das Perfusionssystem bestimmte
Bedingungen und Faktoren, wie z. B. Zugabe von Serum oder
gewebsmorphogener Proteine, vorgegeben werden. Nach der
Transplantation in vivo besteht jedoch derzeit keine
Möglichkeit mehr, die Gewebebildung zu beeinflussen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, das in dem
Hauptpatent angegebene Verfahren zu verbessern und insbesondere
die Gewebebildung durch zusätzliche Maßnahmen zu begünstigen.
Mit der Erfindung wird hierzu vorgeschlagen, in die
Trägerstruktur resorbierbare Mikrokörper einzubetten, in denen
die Gewebebildung beeinflussende Faktoren aufgenommen sind, die
ihrerseits bei der allmählichen Resorption der Mikrokörper
freigegeben werden. Als Mikrokörper können z. B. poröse
Mikrokugeln mit einem Durchmesser zwischen etwa 10 und 200
Mikrometern, vorzugsweise zwischen 20 und 50 Mikrometern, aus
einem resorbierbaren Material, z. B. aus Polylactid verwendet
werden, in die die gewünschten Faktoren zur
Gewebedifferenzierung oder zur Entzündungshemmung eingebunden
sind. Derartige Faktoren können z. B. Peptid-Faktoren, z. B.
entzündungshemmende Cyclopeptid-Antibiotika, wie Gyclosporin A,
oder geeignete rekombinante gewebsmorphogene Proteine sein, die
im Transplantat langsam, d. h. über mehrere Monate hinweg,
freigesetzt werden. Wenn die Mikrokörper, z. B. die erwähnten
porösen Mikrokugeln, in ihrer Größe den Zellen ähneln, können
diese beim Kulturansatz der Zellsuspension beigemischt werden
und so in gleicher Weise wie die Zellen im Polymervlies
verteilt werden. Die Degradation der Mikrokörper muß bei der
Herstellung so eingestellt werden, daß sich die Freisetzung der
Faktoren über die gewünschte Zeit, z. B. mehrere Monate,
erstreckt.
Wie oben erwähnt, ist es vorteilhaft, neben der resorbierbaren
Trägerstruktur, insbesondere aus einem Polymervlies, auch noch
ein Fremdmaterial, z. B. Agarose, einzusetzen. Anstelle der
Agarose können auch andere Materialien verwendet werden, die
eine semipermeable Membran um die Trägerstruktur mit den oben
erwähnten günstigen Eigenschaften aufweisen. Besonders
vorteilhaft sind hierbei Hydrogele aus extrazellulären
Matrixkomponenten zu verwenden, vorzugsweise etwa ein Copolymer
aus Chondroitinsulfat, z. B. Chondroitin-4-sulfat und Kollagen,
z. B. Kollagen Typ II, und/oder Hyaluronsäure.
Chondroitinsulfate und Hyaluronsäure sind die Hauptbestandteile
der Binde- und Stützgewebesubstanz und auch im Knorpelgewebe,
dort allerdings mit einem speziellen Protein verknüpft,
vorhanden. Diese knorpeltypischen Matrixkomponenten können eine
Redifferenzierung der Zellen beschleunigen und stellen
geeignete Bausteine für die Neubildung der extrazellulären
Matrix zur Verfügung. Es ist auch denkbar, derartige
Komponenten synthetisch herzustellen. Weitere Fremdmaterialien
für die Trägerstruktur sind z. B. Glykosaminoglykane bzw.
Kollagen-GAG-Copolymere, in die die Zellen suspendiert sind.
Neben dem erwähnten Chondroitinsulfat und dem Kollagen ist auch
ein Keratansulfat denkbar. Statt der natürlichen Kollagene oder
Proteoglykane können auch synthetische Polypeptide, z. B.
Polylysin oder Polysaccharide verwendet werden. Hierbei ist es
sogar denkbar, die Trägerstruktur fort zulassen, wenn es
gelingt, nach dem Herstellen der Zellsuspension die
extrazellulären Matrixkomponenten in geeigneter Weise zu
vernetzen, z. B. durch Bestrahlung mit UV-Licht. An diese
vernetzte Struktur können sich dann die Zellen anlagern.
Die Erfindung ist in Ausführungsbeispielen anhand der Zeichnung
näher erläutert. In dieser stellen dar
Fig. 1 einen Ausschnitt aus einer Trägerstruktur mit daran
angelagerten Zellen sowie Mikrokugeln, die in Molekülen einer
extrazellulären Matrix suspendiert sind;
Fig. 2 eine schematische Schnittzeichnung der verwendeten
Mikrokugeln.
Eine in Fig. 1 nur im Ausschnitt gezeigte dreidimensionale
Trägerstruktur aus Polymerfasern 1 wird mit einer Suspension 2
getränkt, in der Zellen 3, in diesem Fall Knorpelzellen, und
poröse Mikrokugeln 4, die etwa die gleiche Größe wie die Zellen
haben, suspendiert sind. Die Suspension 2 besteht entweder aus
Agarose und/oder einem der oben genannten Fremdmaterialien,
d. h. z. B. extrazellulären Matrixkomponenten, die Bausteine für
die Bildung der extrazellulären Matrix liefern.
Die nach der Implantation des Implantates resorbierbaren
Mikrokugeln 4 weisen, wie schematisch in Fig. 2 dargestellt
ist, kleine Hohlräume 5 auf, in die die Gewebebildung
beeinflussende Faktoren, z. B. entzündungshemmende Faktoren wie
Antibiotika etc. eingebunden sind. Bei der allmählichen
Resorption der Mikrokugeln werden dann diese Faktoren verzögert
freigegeben.
Die gesamte Trägerstruktur wird noch mit einer Hülle, z. B. der
erwähnten Agarose ummantelt, wonach anschließend, wie im
Hauptpatent beschrieben, die derart vorbereitete Trägerstruktur
in eine Perfusionsapparatur eingesetzt und mit Nährlösung
durchströmt wird. Anstatt die Trägerstruktur mit Agarose oder
einem anderen Hydrogel zu ummanteln, ist es auch möglich, die
Trägerstruktur mit Polyelektrolytkomplexen zu verkapseln, die
ebenfalls bei geeigneter Zusammensetzung die Eigenschaften
einer semipermeablen Membran aufweisen, d. h. für den hier
gewünschten Zweck die Diffusion mit Nährlösung ermöglichen,
jedoch das Ausschwemmen von extrazellulären Komponenten aus dem
Inneren der Trägerstruktur verhindern. Ein solcher
Polyelektrolytkomplex aus Polyanionen und Polykationen kann
z. B. aus Protoglykanen und Polylysin aufgebaut werden. Dieser
Polyelektrolytkomplex umschließt die vorbereitete
Trägerstruktur praktisch vollständig mit einem semipermeablen
Häutchen.
Claims (12)
1. Verfahren zum Herstellen eines Implantates aus
Zellkulturen, insbesondere Knorpelzellen, wobei
die Zellen auf eine resorbierbare dreidimensionale, im wesentlichen formstabile und entsprechend der gewünschten Form des Implantats vorgeformte Trägerstruktur mit einer zusammenhängenden inneren Oberfläche und einem geringen Volumen aufgebracht werden,
in den inneren Hohlraum der Trägerstruktur die Zellen eingebracht werden,
die die Zellen aufnehmende Trägerstruktur mit einem Material ummantelt wird, durch das die Nährlösung hindurchdiffundieren kann und
die die Zellen aufnehmende Trägerstruktur mit einer Nährlösung zumindest solange perfundiert wird, bis sich zumindest teilweise eine die Zellen aneinanderbindende interzelluläre Matrix ausgebildet hat,
dadurch gekennzeichnet, daß in die Trägerstruktur (1) resorbierbare Mikrokörper (4) eingebracht werden, in denen die Gewebebildung beeinflussende Faktoren aufgenommen sind, die ihrerseits bei der allmählichen Resorption der Mikrokörper freigegeben werden.
die Zellen auf eine resorbierbare dreidimensionale, im wesentlichen formstabile und entsprechend der gewünschten Form des Implantats vorgeformte Trägerstruktur mit einer zusammenhängenden inneren Oberfläche und einem geringen Volumen aufgebracht werden,
in den inneren Hohlraum der Trägerstruktur die Zellen eingebracht werden,
die die Zellen aufnehmende Trägerstruktur mit einem Material ummantelt wird, durch das die Nährlösung hindurchdiffundieren kann und
die die Zellen aufnehmende Trägerstruktur mit einer Nährlösung zumindest solange perfundiert wird, bis sich zumindest teilweise eine die Zellen aneinanderbindende interzelluläre Matrix ausgebildet hat,
dadurch gekennzeichnet, daß in die Trägerstruktur (1) resorbierbare Mikrokörper (4) eingebracht werden, in denen die Gewebebildung beeinflussende Faktoren aufgenommen sind, die ihrerseits bei der allmählichen Resorption der Mikrokörper freigegeben werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als
Mikrokörper poröse Mikrokugeln verwendet werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß gekennzeichnet, daß die Mikrokörper einen Durchmesser
aufweisen, der etwa demjenigen der Zellen entspricht und
etwa zwischen 10 und 200 Mikrometern, vorzugsweise zwischen
20 und 50 Mikrometern, liegt.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß als Material für die Mikrokörper
resorbierbare Polymere, vorzugsweise Polylactide, verwendet
werden.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß als die Gewebebildung beeinflussende
Faktoren entzündungshemmende Faktoren, insbesondere
Antibiotika verwendet werden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als
Antibiotika Cyclopeptid-Antibiotika, wie Cyclosporin A
verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß als die Gewebebildung beeinflussende
Faktoren rekombinante gewebsmorphogene Proteine verwendet
werden.
8. Verfahren insbesondere nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in die
Trägerstruktur (1) ein die Redifferenzierung von intensiv
vermehrten Zellen beeinflussendes Fremdmaterial eingegeben
wird, insbesondere ein Hydrogel aus extrazellulären
Matrixkomponenten.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als
Fremdmaterial ein Copolymer aus Chondroitin-4-sulfat und
Kollagen Typ II und/oder Hyaluronsäure verwendet wird.
10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als
Fremdmaterial Kollagene, Proteoglykane, synthetische
Polypeptide oder Polysaccharide verwendet werden.
11. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als
Fremdmaterial extrazellulären Matrixkomponenten analoge
Materialien verwendet werden, die gegebenenfalls durch eine
spezielle Behandlung, z. B. UV-Bestrahlung vernetzen.
12. Verfahren insbesondere nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägerstruktur
mit Polyelektrolytkomplexen ummantelt wird.
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|---|---|---|---|
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| DE4431598C2 DE4431598C2 (de) | 1997-03-20 |
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