WO2021034162A1 - 유사교세포로 분화 유도된 후기 단계의 인간 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

유사교세포로 분화 유도된 후기 단계의 인간 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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stroke
mesenchymal stem
ghmsc
stem cells
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장미숙
고성호
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서울대학교 산학협력단
한양대학교 산학협력단
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    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of stroke containing late stage human mesenchymal stem cells induced differentiation into pseudoglial cells as an active ingredient.
  • Stroke refers to a neurological symptom that occurs when a blood vessel supplying blood to a part of the brain is blocked (cerebral infarction) or burst (cerebral hemorrhage), and the nervous system of that part is damaged. Stroke can be divided into two major categories. First, a blood vessel is blocked, which damages a part of the brain that was supplied with blood by the blood vessel, which is called infarction and is also called ischemic stroke or infarct stroke. Is called. The second is the bursting of blood vessels in the brain, which is called hemorrhage or hemorrhagic stroke. It is known that ischemic stroke is more common than hemorrhagic stroke, about 85%. Stroke is a neurological disease caused by damage to the nervous system and is a very difficult disease to deal with.
  • glial cells In order to treat a stroke, it is important to restore the damaged nervous system. However, neurons, which are neurons, do not recover once damaged, so the function of glial cells must be restored. Among the glial cells, it is reported that astrocytes that secrete growth factors to improve the microenvironment are the most helpful in the treatment of stroke.
  • the nervous system consists of nerve cells (neuron) and glial cells (glia cells).
  • Glial cells are cells that support the nervous system, making up about 90% of the nervous system, supplying necessary substances to neurons, and maintaining homeostasis for a suitable chemical environment. Unlike neurons that transmit information, glial cells do not have an information transmission function, and unlike neurons, they can recover after loss. Therefore, cancer that occurs in the brain is caused by glial cells, not neurons.
  • Glia cells are the most distributed cells in the brain, and the size of glia cells is about 1/10 the size of nerve cells, but it is estimated to be about 10 times the number of neurons, or hundreds of billions.
  • glial cells In the glial cells present in the central nervous system, astrocytes that maintain the blood-brain barrier, absorb glucose from the blood and supply it to neurons, help tissue regeneration, and improve the microenvironment, the central nervous system myelin sheath ( There are olggodendrocytes that form myelin sheeth, microglia and radial glia, which act as immune cells of the central nervous system. Glia cells present in the peripheral nervous system form peripheral nervous system myelin sheaths. There are schwann cells and satellite cells that supply nutrients to neurons.
  • Stem cells are considered a promising treatment for intractable neurological diseases such as stroke because of their ability to replace damaged or lost cells in the nervous system. Meanwhile, it has been reported that embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) can differentiate into various neurons and replace the damaged nervous system. However, clinical trials have not been made because of the problem that these cells can cause unwanted cancer. Therefore, ongoing clinical trials use adult stem cells, particularly early secreted human mesenchymal stem cells (hMSCs).
  • hMSCs human mesenchymal stem cells
  • Bone marrow-derived mesenchymal stem cells are capable of self-renewal while maintaining growth in a laboratory, and can differentiate into various cells. (Bianco et al., 2001; Pittenger et al., 1999; Prockop, 1997). In addition, MSCs have the potential to cross-differentiate into various neuron-like neurons with neuronal activity (Munoz-Elias et al., 2003; Sanchez-Ramos et al., 2000; Trzaska et al., 2007; Woodbury et al., 2000).
  • hMSC Human mesenchymal stem cells
  • Mesenchymal stem cells of adult stem cells include early passage hMSC (hMSC) in the early stage of culture and lagte passage hMSC (10 passages or more) in the late stage of culture, and hMSC in the late stage of culture is a growth factor or growth factor.
  • hMSC early passage hMSC
  • lagte passage hMSC 10 passages or more
  • hMSC in the late stage of culture is a growth factor or growth factor.
  • hMSCs mesenchymal stem cells obtained from human adult stem cells to have the characteristics of glial cells to solve the above problems, and the differentiation-induced mesenchymal stem cells ( It was confirmed that glia-like cell induced by hMSC (hereinafter abbreviated as ghMSC) was induced to differentiate into pseudoglia cells that secrete a large amount of growth factors and cytokines, thereby enhancing the paracrine effect, thereby showing an excellent effect in the treatment of stroke.
  • ghMSC glia-like cell induced by hMSC
  • Another object of the present invention is to provide a method for treating stroke by administering to an individual an effective amount of late stage human mesenchymal stem cells induced to differentiate into pseudoglial cells.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a late stage human mesenchymal stem cell that is induced to differentiate into pseudoglial cells.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment of stroke containing late stage human mesenchymal stem cells induced differentiation into pseudoglial cells as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for treating stroke by administering to an individual an effective amount of late stage human mesenchymal stem cells induced to differentiate into pseudoglial cells.
  • the present invention provides a method for producing a late stage human mesenchymal stem cell differentiated into pseudoglial cells.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of stroke containing late stage human mesenchymal stem cells induced differentiation into pseudoglial cells as an active ingredient.
  • late stage human mesenchymal stem cells glia-like cells, ghMSCs
  • ghMSCs glia-like cells
  • the infarct volume was 50% or more.
  • the neurological function was significantly improved than the control group and the group treated with human mesenchymal stem cells (hMSCs), which was the effect of treating stroke (cerebral infarction) by the Akt pathway of IGFBP-4 via IGF-1R.
  • the differentiated pseudoglial cells of the present invention can be usefully used as a cell therapy for stroke.
  • Figure 1a is a diagram confirming the morphological change of pseudoglial cells in a bright-field image during the ghMSC induction process.
  • 1B is a human mesenchymal stem cell (hMSC) and a stellate glial cell marker GFAP, S100 ⁇ , SLC1A3, SLC1A2, oligodendrocyte marker Sox10, oligodendrocyte precursor
  • hMSC human mesenchymal stem cell
  • GFAP stellate glial cell marker GFAP
  • S100 ⁇ SLC1A3, SLC1A2
  • oligodendrocyte marker Sox10 oligodendrocyte precursor
  • 1C is a diagram illustrating the expression of GFAP and S100 ⁇ , which are markers of astrocytes, by immunohistochemical staining.
  • 1D is a diagram showing the ratio of expression of GFAP and S100 ⁇ , which are markers of astrocytes, in all pseudoglial cells, respectively.
  • 2A is a diagram showing an increase in cell viability when pseudoglial cells are treated in an oxygen-glucose deficient environment (OGD).
  • OGD oxygen-glucose deficient environment
  • 2B is a diagram showing that the mRNA expression level of IGFBP-4 is increased three times or more in pseudoglia cells than that of human mesenchymal stem cells.
  • Figure 2c is a diagram showing that the expression of IGFBP-4 protein is increased in the pseudoglia cells than human mesenchymal stem cells.
  • Figure 2d is a diagram showing that IGFBP-4 has a neuroprotective effect.
  • Figure 2e is a diagram of measuring cell viability by treating human IGFBP-4 before and after OGD treatment.
  • FIG. 2F is a diagram showing a relationship between the PI3K/Akt pathway as a result of examining the mechanism that represents the neuronal protective effect of pseudoglial cells.
  • 2G is a diagram showing a relationship between the IGF1R pathway as a result of examining the mechanism of the neuronal protective effect of pseudoglial cells.
  • Figure 3a is a diagram showing that the phosphorylation of Akt was significantly increased when the concentrated culture medium (ghMSC-CM) of pseudoglial cells was treated.
  • 3B is a diagram showing that the phosphorylated Akt significantly increased when treated with the concentrated culture medium of pseudoglial cells (ghMSC-CM) was significantly reduced by anti-BP-4.
  • Figure 3c is a diagram showing that the expression of phosphorylated Akt increased by the concentrated culture medium (ghMSC-CM) of pseudoglial cells was reduced when PPP, an IGF-1R inhibitor, was treated in a concentrated culture medium of pseudoglial cells (ghMSC-CM). to be.
  • 3D shows that the expression of Bax in the mitochondria that was increased when treated with the concentrated culture medium (ghMSC-CM) of pseudoglial cells was decreased, which was shown to inhibit IGFBP-4 by anti-BP-4, Akt inhibition by wortmannin, and IGF of PPP. It is a diagram showing that Bax expression in mitochondria increased again due to -1R inhibition.
  • Figure 3e shows that when processing the concentrated culture medium of pseudoglial cells (ghMSC-CM), the decreased cytoplasmic Bax expression is increased, which is, IGFBP-4 inhibition by anti-BP-4, Akt inhibition by wortmannin and IGF- in PPP. It is a diagram showing that the expression of Bax in the cytoplasm again decreased due to 1R inhibition.
  • 3F shows that the OGD treatment did not change the expression of IGF-1 and IGF-2 outside the cells, but the treatment of pseudoglial cells after the OGD treatment significantly increased the expression of IGF-1 outside the cells compared to the control and OGD treatment groups. This increase is a diagram showing that it was restored to its original state by treatment with anti-IGFBP-4 antibody.
  • Figure 4a is a schematic diagram of a study to confirm the therapeutic effect of pseudoglia in cerebral infarction.
  • Figure 4b is a result of injection of pseudoglial cells (ghMSC) one day after induction of cerebral infarction, the infarct volume was significantly reduced by 50% or more, and the effect of pseudoglial cells (ghMSC) was about 20 than that of human mesenchymal stem cells (hMSCs). % was high, and this effect was almost completely blocked by anti-BP-4 antibody.
  • ghMSC pseudoglial cells
  • Figure 4c shows that the neurological function is improved when the cerebral infarction is treated using pseudoglial cells (ghMSC), and this is a diagram showing that the effect disappears when treated with an anti-BP-4 antibody.
  • ghMSC pseudoglial cells
  • 5A to 5F show that phosphorylated Akt (pAkt) and Bcl-xl significantly increased in the brain injected with pseudoglial cells, and cytochrome c, Bax and cleaved caspase-3 significantly decreased, and these changes were anti- It is a diagram confirming that it was significantly reduced by the BP-4 antibody.
  • FIG. 7 is a diagram schematically showing a mechanism of protecting neurons through IGFBP-4 of pseudoglial cells (ghMSCs).
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment of stroke containing, as an active ingredient, late-passage human mesenchymal stem cells (ghMSC) induced differentiation into glia-like cells.
  • ghMSC late-passage human mesenchymal stem cells
  • the present invention provides a method for treating stroke comprising administering to an individual a late-passage human mesenchymal stem cell (ghMSC) induced differentiation into a glia-like cell.
  • ghMSC late-passage human mesenchymal stem cell
  • the present inventors obtained ghMSCs with increased paracrine activity by inducing differentiation of late stage hMSCs with low neuronal function recovery effect into pseudoglial cells.
  • ghMSC has been shown to significantly protect primary cultured cortical neurons damaged by an oxygen-glucose deficient environment (OGD), and even in in vivo experiments, the brain of the mouse model was significantly protected from cerebral infarction, and neurological behavioral function was remarkable by ghMSC transplantation. Was recovered.
  • OGD oxygen-glucose deficient environment
  • IGFBP-4 which is highly expressed in ghMSC compared to hMSC, improved the survival of damaged cortical neurons due to oxygen-glucose deprivation (OGD) and decreased infarct volume.
  • IGBP-4 enhances the phosphorylation of Akt through IGF-1R signal.
  • the pseudoglia is any one or more from the group consisting of oligodendroglia, astrocytes, microglia, and radial glia.
  • the stroke is an ischemic stroke or a hemorrhagic stroke.
  • the ghMSC is induced to differentiate from late human mesenchymal stem cells.
  • the ghMSC releases IGFBP-4 (insulin-like growth factor binding protein-4).
  • the ghMSC treats stroke by activating the PI3K/Akt pathway of IGFBP-4 via IGF-1R.
  • the effective dose of the composition is 10 3 to 10 9 cells/kg, preferably 10 4 to 10 8 cells/kg, and more preferably 6 ⁇ 10 5 to 6 ⁇ 10 7 cells per 1 kg body weight. Cells/kg, and can be administered 2 to 3 times a day.
  • the composition as described above is not necessarily limited thereto, and may vary depending on the condition of the patient and the degree of onset of the disease.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may contain 10 to 95% by weight of differentiation-induced pseudoglial cells from human mesenchymal stem cells, which are active ingredients, based on the total weight of the composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include one or more active ingredients exhibiting the same or similar functions in addition to the active ingredients.
  • the pseudoglial cells differentiated from the human mesenchymal stem cells of the present invention may be present in a pharmaceutical composition for treatment.
  • Such pharmaceutical compositions may contain a physiologically acceptable matrix or a physiologically acceptable excipient in addition to the cells.
  • the type of matrix and/or excipient will depend on others depending on the intended route of administration.
  • This pharmaceutical composition may also optionally contain other suitable excipients or active ingredients for use with stem cell treatment.
  • the dosage of the composition may be increased or decreased depending on the route of administration, the degree of disease, sex, weight, age, and the like. Therefore, the dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • administration means introducing a predetermined substance to a patient in an appropriate manner, and the route of administration of the composition may be administered through any general route as long as it can reach the target tissue.
  • Intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, and rectal administration may be administered, but are not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered by any device capable of moving the active substance to target cells.
  • Preferred modes of administration and formulations are intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, drop injections and the like.
  • injectables include aqueous solvents such as physiological saline solution and ring gel solution, non-aqueous solvents such as vegetable oils, higher fatty acid esters (e.g., oleic acid ethyl, etc.), alcohols (e.g. ethanol, benzyl alcohol, propylene glycol, glycerin, etc.).
  • It can be prepared by using, and stabilizers for preventing deterioration (e.g., ascorbic acid, sodium hydrogen sulfite, sodium pyrosulfite, BHA, tocopherol, EDTA, etc.), emulsifiers, buffers for pH control, and for inhibiting the growth of microorganisms.
  • Pharmaceutical carriers such as preservatives (eg, mercuric nitrate, thimerosal, benzalkonium chloride, phenol, cresol, benzyl alcohol, etc.) may be included.
  • the present invention provides a method for producing pseudoglial cells differentiated from human mesenchymal stem cells.
  • step 2) first culturing the late human mesodermal stem cells obtained in step 1) in a DMEM medium containing 10% FBS and 1mM ⁇ -mercaptoethanol for 22 to 26 hours;
  • the pseudoglial cells differentiated from the human mesenchymal stem cells were prepared by putting pseudoglial cells, FBS stock solution, and DMSO in DMEM medium containing fetal calf serum (FBS) to prepare a frozen vial, and a freezing container containing isopropanol. Put the prepared frozen vial in the -80°C cryogenic freezer (DEEP freezer) overnight, and then put the prepared frozen vial in the liquid nitrogen storage tank (LN2 tank) to freeze it.
  • DEEP freezer -80°C cryogenic freezer
  • the pseudoglial cells induced differentiation from the frozen human mesenchymal stem cells are thawed in a 37°C water bath, and the cells in a frozen vial with a little ice are mixed well using a pipette in a biosafety hood, and right After mixing with DMEM medium containing fetal serum (FBS) and placing in a conical tube, the cell pellet precipitated with a centrifuge is mixed with DMEM medium containing fetal fetal calf serum (FBS), and tryphan blue dye Can be used by mixing and spreading on a cell culture dish.
  • FBS fetal serum
  • tryphan blue dye Can be used by mixing and spreading on a cell culture dish.
  • the human mesenchymal stem cells may be adult stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, blood, cord blood, liver, skin, gastrointestinal tract, placenta, or uterus. More preferably, they are bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
  • the pseudoglia may be any one or more from the group consisting of oligodendroglia, astrocyte, microglia, and radial glia.
  • analysis of the ghMSC obtained in the present invention revealed that 60 to 70% are astrocytes, 10 to 20% are in progress or other glial cells, and about 10% are undifferentiated hMSCs.
  • astrocytes are glial cells with the greatest paracrine effect, the presence of many astrocytes means that they have a high activity to promote regeneration and recovery of surrounding tissues, which means that they are excellent in the treatment of stroke.
  • the manufacturing method of the present invention is an optimized method to increase the efficacy of late hMSC.
  • composition is characterized in that it is administered for the treatment or improvement of a lesion in a subject having a stroke.
  • the present invention provides a composition for delivery of insulin-like growth factor binding protein-4 (IGFBP-4) in an individual containing glia-like cells differentiated from human bone marrow-derived mesenchymal stem cells as an active ingredient.
  • IGFBP-4 insulin-like growth factor binding protein-4
  • stem cells induced differentiation from human mesenchymal stem cells (hMSCs) into pseudoglia cells have a change in shape (see Fig. 1A), which is a molecule of astrocytes and oligodendrocytes. It was confirmed that the characteristics were shown (see Fig. 1b). Astrocyte markers (GFAP, S100 ⁇ , SLC1A3), Schwann cells/oligo dendrosite marker (Sox10), oligodendrosite precursor marker (PDGFR ⁇ ) and related genes were found to increase in ghMSC compared to hMSC.
  • Astrocyte markers GFAP, S100 ⁇ , SLC1A3
  • Sox10 Schwann cells/oligo dendrosite marker
  • PDGFR ⁇ oligodendrosite precursor marker
  • This neuronal protective mechanism is shown to be through the Akt pathway of IGFBP-4 via IGF-1R (see FIGS. 3A to 3C).
  • IGFBP-4 When the culture medium of late human mesenchymal stem cells is treated with the concentrated culture medium of primary cortical neurons in an oxygen-glucose-deficient environment, the expression of the proapoptic protein Bax in the mitochondria increases and the expression in the cytoplasm decreases.
  • Akt activity induced by IGFBP-4 reduces endogenous Bax migration from the cytoplasm to mitochondria, and increases the survival of neurons by regulating the expression of IGF-1 and IGF-2 outside the cell ( 3D, 3E and 3F).
  • the present invention shows a neuroprotective effect of IGFBP-4 secreted by ghMSC in an in vitro/in vivo ischemic stroke model.
  • Late-passage hMSC ghMSC
  • IGFBP-4 released from cells is achieved through IGF-1R and PI3/Akt, or ERK signaling.
  • IGF-1R-mediated apoptosis signaling is associated with extracellular IGF-1 and IGF-2, and their levels are associated with being regulated by IGFBP-4 released by ghMSC. It was found that IGFBP-4 interacts with IGF-1 and IGF-2, binds to these proteins, and inhibits the activity of IGF (Fig. 3f).
  • IGFBP-4 oversecreting IGFBP-4 containing the differentiated pseudoglial cells of the present invention to activate the Akt pathway via IGF-1R, it can be usefully used as a cell therapy for stroke.
  • the composition for cell therapy of the present invention is preferably a pharmaceutical composition, and can be formulated by a method known to those skilled in the art. For example, if necessary, it can be used parenterally in the form of an injection in a sterile solution or suspension of water or other pharmaceutically acceptable liquids.
  • a pharmacologically acceptable carrier or medium specifically, sterile water or physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspending agent, surfactant, stabilizer, excipient, vehicle, preservative, binder, etc. It is believed to be formulated by blending into the unit dosage form required for pharmaceutical practice. In the above formulation, the amount of the active ingredient is such that an appropriate dose within the indicated range can be obtained.
  • the sterile composition for injection can be formulated according to the practice of conventional preparations using a vehicle such as distilled water for injection.
  • the aqueous solution for injection may include, for example, an isotonic solution containing physiological saline, glucose or other adjuvants, such as D-sorbitol, D-mannose, and sodium chloride, and suitable dissolution aids, such as alcohol, Specifically, it may be used in combination with ethanol, polyalcohol, such as propylene glycol, polyethylene glycol, and nonionic surfactants such as polysorbate 80(TM), and HCO-50.
  • Sesame oil and soybean oil are mentioned as the oily liquid, and it can be used together with benzyl benzoate and benzyl alcohol as a dissolution aid.
  • a buffering agent such as a phosphate buffer solution, a sodium acetate buffer solution, a painless agent such as procaine hydrochloride, a stabilizer such as benzyl alcohol, phenol, and antioxidant.
  • the prepared injection solution is usually filled in suitable ampoules.
  • Administration to the patient's body is preferably parenteral, specifically, one administration to the injured site is basic, but multiple administrations may also be used. Further, the administration time may be short or sustained for a long time. More specifically, an injection formulation, a transdermal dosage form, etc. are mentioned.
  • the effective dose of the composition is 10 3 to 10 9 cells/kg, preferably 10 4 to 10 8 cells/kg, and more preferably 6 ⁇ 10 5 to 6 ⁇ 10 7 cells per 1 kg body weight. Cells/kg, and can be administered 2 to 3 times a day.
  • the composition as described above is not necessarily limited thereto, and may vary depending on the condition of the patient and the degree of onset of the disease.
  • hMSCs (Cambrex Bioscience, Walkersville, MD, USA) extracted from normal human bone marrow are low-glucose Dulbecco's supplemented with 10% fetal calf serum (FBS; Gibco, Waltham, MA, MA, USA). It was cultured in modified Eagle's medium (DMEM). Cells (passages 6-12) were subcultured 12 to 15 times in an environment of 37°C and 5% CO 2 to obtain a late-passage hMSC.
  • FBS modified Eagle's medium
  • hMSCs human mesenchymal stem cells
  • ghMSCs pseudoglial cells
  • the late stage human mesenchymal stem cells obtained in Example 1 were used as a primary differentiation medium [(DMEM-low glucose medium, 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin mixture, 1 mM ⁇ -mercaptoethanol ( ⁇ - mercaptoethanol)] and cultured for 24 hours. Thereafter, the human mesenchymal stem cells were washed with PBS (phosphate buffered solution) and then a secondary differentiation medium (DMEM-low glucose medium, 10% FBS, 1% penicillin-strepto).
  • PBS phosphate buffered solution
  • Mycin mixture 0.28 ⁇ g / ml tretinoin (all-trans-retinoic acid) was replaced and cultured After 3 days, the mesenchymal stem cells were washed with PBS and then the third differentiation medium [DMEM-low glucose medium, 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin mixture, 10 mM forskolin, 10 ng/ml human basic-fibroblast growth factor, 5 ng/ml human platelet derived growth factor-AA (human platelet derived growth factor) -AA), 200 ng/ml heregulin 1-beta1] and cultured for 8 days at this time, the third differentiation medium was changed once every two days. The morphology was observed under a microscope, and cell survival during the differentiation induction process was observed through bright-field imaging (Fig. 1A).
  • Pseudomonas glial cells (1 ⁇ 10 4 cells/cm 2 ) were rinsed twice with PBS and incubated for 18 hours in Neurobasal-A medium (NB medium) without serum. The concentrated culture solution was collected and precipitated at 1500 g for 5 minutes in a centrifuge to remove cell debris, and then used in the experiment.
  • a frozen vial was prepared according to ml. Put the prepared frozen vial into a freezer container containing 100% isopropanol and store it overnight in a -80°C cryogenic freezer (DEEP freezer), and then put the prepared frozen vial into a liquid nitrogen storage tank (LN2 tank) for storage. I did.
  • the frozen vial stored in the liquid nitrogen storage tank was thawed in a 37°C water bath for about 2 minutes, and the cells in the frozen vial with a little ice were mixed well using a pipette in a biosafety hood.
  • 1 ml of the cell concentrate in the frozen vial was mixed with 10 ml of DMEM medium containing 10% FBS and placed in a 15 ml conical tube. Centrifuge was rotated at a speed of 1,200 rpm for 5 minutes, leaving the precipitated cell pellet, and all the supernatant was sucked.
  • DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) was put into a 15 ml conical tube and the cell pellet was released with a pipette. 11 ⁇ l of the cell pellet and 11 ⁇ l of tryphan blue dye were mixed. Of these, 10 ⁇ l was injected into a cell counter to count the number of cells contained in 1 ml, and plated on a cell culture dish at 2,000 cells/cm 2.
  • FBS fetal bovine serum
  • Pseudoglial cells were induced from human mesenchymal stem cells by the method of Example 2, and pseudoglial cells and induced pseudoglial cells were frozen, thawed, and used for analysis. In order to confirm the characteristics of the induced pseudoglial cells, the degree of expression of the glial cell marker was confirmed by quantitative RT-PCR and immunohistochemical staining.
  • cDNA synthesis reverse transcription was performed at 42° C. for 1 hour using M-MLV reverse transcriptase (Promega).
  • Genes expressed in cDNA were identified with respective gene-specific primers of SEQ ID NOs: 1 to 24 using SYBR FAST qPCR Kits (KAPA Biosystems).
  • the level of expression of the target gene was confirmed based on GAPDH using the Ct method.
  • cultured cells were fixed with 4% paraformaldehyde (PFA), and cultured with a blocking solution of 5% standard goat serum and 0.1% Triton-X100. It was stained with GFAP (1:200; Merck millipore), S100 (1:250; Dako) in a refrigerator at 4° C. for one day. The staining solution was washed several times with PBS, and stained with secondary antibodies Alexa Fluor®488 anti-mouse IgG (Molecular Probes) and Alexa Fluor®546 anti-rabbit IgG (Molecular Probes) for 1 hour at room temperature. After that, the nuclei were stained with 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Santa Cruz Biotechnology). The sample was observed with a digital inverted fluorescence microscope (DM5000B; Leica).
  • PFA paraformaldehyde
  • the neuroprotective effect of pseudoglial cells differentiated from posterior human mesenchymal stem cells was confirmed as follows.
  • a primary cortical neuron concentrated culture solution was prepared. Briefly, the cerebral cortex was obtained from an E17 SD rat embryo. Separated cells were 50 ⁇ g/ml poly-D-lysine (PDL) in Neurobasal-A medium (NB; Gibco) added with 10% fetal bovine serum (FBS) and 7.5 ⁇ 10 4 on a 5 ⁇ g/ml laminin-coated plate. cell/cm 2 Smeared with. This culture was replaced with NB medium supplemented with 2% B27 (Gibco) after 24 hours. The medium in which the primary cortical neurons were concentrated was replaced every 3 or 4 days to obtain a culture solution in which the primary cortical neurons were concentrated.
  • PDL poly-D-lysine
  • FBS fetal bovine serum
  • OGD oxygen-glucose deficiency
  • the neuroprotective effect of human mesenchymal stem cells and pseudoglial cells differentiated therefrom was confirmed using a culture solution in which primary cortical neurons induced oxygen-glucose deficiency (OGD) of Experimental Example 2-1 were concentrated.
  • OGD oxygen-glucose deficiency
  • human mesenchymal stem cells and pseudoglial cells (1 ⁇ 10 4 cells/cm 2 ) were rinsed twice with PBS and cultured in NB medium without serum for 18 hours.
  • the collected culture medium was added to the concentrated culture medium of primary cortical neurons treated with oxygen-glucose deprivation (OGD).
  • OGD oxygen-glucose deprivation
  • IGFBP-4 antibody anti-BP-4; R&D Systems
  • 50 ⁇ M PD98059 Promega Corp, Madison, WI, USA
  • 100 nM wortmannin Sigma-Aldrich
  • PPP PPP
  • Santa Cruz Biotechnology Santa Cruz, CA, USA
  • rhBP-4 recombinant human IGFBP-4
  • the OGD-treated primary cortical neuron-enriched culture medium was cultured in a concentrated culture medium (ghMSC-CM) of prepared pseudoglial cells.
  • Quantitative RT-PCR was performed in the same manner and conditions as in Experimental Example 1, except that IGFBP-4 specific primers of SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26 were used.
  • MTT assay Cell viability was measured using MTT assay.
  • MTT reagent was added to the neurons cultured in a 4-well plate at a final concentration of 1 mg/ml, and incubated at 37° C. for 1 hour. The MTT solution was carefully aspirated and formazan crystals were dissolved in 130 ⁇ l of DMSO. The absorbance was measured at 554 nm through a microplate reader.
  • ELISA was performed twice with PBS, followed by additional treatment in Neurobasal media without serum protein according to experimental conditions, followed by incubation for 30 hours. The supernatant is turned down in a centrifuge at 1200 rpm for 5 minutes. It was analyzed using IGFBP-4 DuoSet ELISA for human (R&D systems). The optimum density was measured with a microplate reader (Epoch2, Bio-Tek, Winooski, VT, USA) at 450 nm.
  • FIG. 2A it was confirmed that the cell viability was increased when the concentrated culture solution of pseudoglial cells was treated compared to the case where the concentrated culture solution of human mesenchymal stem cells was treated.
  • Figs. 2b and 2c it was confirmed that in the case of pseudoglia in human mesenchymal stem cells, IGFBP-4 was expressed three times or more.
  • IGFBP-4 itself showed a neuroprotective effect. The above results suggest that pseudoglial cells derived from human mesenchymal stem cells overexpress IGFBP-4 to exhibit neuroprotective effects.
  • IGFBP-4 exhibits a neuroprotective effect
  • inhibitors of PI3K/IGF and ERK signaling mechanisms were treated, and cell viability was measured in the same manner and conditions as in Experimental Example 2-2.
  • IGFBP-4-mediated signaling which has a neuroprotective effect by ghMSC-CM.
  • PI3K phosphoinositide 3-kinase
  • Akt extracellular signal-regulated kinase
  • IGF-1R IGF-1 receptor
  • PPP an IGF-1R inhibitor
  • the degree of Akt phosphorylation induced by the concentrated culture medium (ghMSC-CM) of pseudoglial cells was measured at different time periods after OGD treatment. It was confirmed by Western blotting whether co-culture with pseudoglial cells induces Akt phosphorylation.
  • cells were washed twice with cold PBS, and RIPA buffer solution (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1% NP40, 0.25% sodium deoxycholate, 150 mM NaCl, 1 mM Na3VO4, 0.2 mg/ml leupeptin, 0.2 mg/ml aprotinin, 0.1M PMSF, and 0.5M sodium fluoride).
  • RIPA buffer solution 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1% NP40, 0.25% sodium deoxycholate, 150 mM NaCl, 1 mM Na3VO4, 0.2 mg/ml leupeptin, 0.2 mg/ml aprotinin, 0.1M PMSF, and 0.5M sodium fluoride.
  • the separated supernatant was diluted in 3% BSA blocking solution at a ratio of 1:1000 Akt (Cell Signaling, Beverly, MA, USA), pAkt (Cell Signaling), and ⁇ -tubulin (SigmaAldrich) with S
  • Akt phosphorylation of Akt was significantly increased when the concentrated culture medium (ghMSC-CM) of pseudoglial cells was treated for 30 minutes (Fig. 3A).
  • pAkt degree of phosphorylation of Akt
  • OGD treatment the significantly increased pAkt (P ⁇ 0.01) by incubation with ghMSC-CM was significantly reduced by anti-BP-4 (Fig. 3b).
  • ghMSC-CM which was first cultured with PPP, an IGF-1R inhibitor, significantly decreased the expression of pAkt, which was increased by ghMSC-CM (Fig. 3c).
  • Oxygen-glucose-deficient environment (OGD) in cortical neurons increases Bax levels in mitochondria, which are pro-apoptotic proteins, and decreases Bax levels in cytoplasm (see Figs. 3D and 3E). Therefore, in order to confirm the apoptosis inhibitory effect of pseudoglial cells, the same method was used except that the primary antibody of Bax (BD Pharmingen, San Jose, CA, USA) and COX IV (Cell Signaling) was used in Experimental Example 3-1. And conditions were subjected to Western blotting to measure the expression level of the protein.
  • OGD Oxygen-glucose-deficient environment
  • pseudoglial cells interfered with Bax translocation induced by apoptosis, and significantly restored the expression of mitochondria and cytoplasmic Bax induced by OGD to control levels (FIGS. 3D and 3E ).
  • the treatment effect of pseudoglial cells was reduced by inhibition of IGFBP-4 by anti-BP-4, Akt inhibition by wortmannin, and IGF-1R inhibition by PPP, which are included in the neuroprotective signaling pathway of IGF-1 dependent IGFBP-4. This inhibition made the expression level of mitochondrial Bax to the level of OGD treatment, and returned the reduced cytoplasmic Bax to the value treated with OGD (FIGS. 3D and 3E ).
  • IGFBP-4-induced Akt activity decreased endogenous Bax migration from the cytoplasm to mitochondria, thereby increasing neuronal survival.
  • IGFBP-4 has a high affinity for IGF-1 and IGF-2, and IGFBP-4 regulates the activities of IGF-1 and IGF-2 in vitro/in vivo, so IGFBP-4 is OGD-treated 1 Whether it regulates the expression of IGF-1 and IGF-2 outside cells in primary cortical neurons was confirmed using ELISA in the same manner and conditions as in Experimental Example 2-2.
  • MAP Arterial pressure
  • HR heart rate
  • a laser Doppler flowmeter (ALF21; Advance, Tokyo, Japan) and a wire-type probe (0.3 mm in diameter; Unique Medical, Tokyo) inserted through a small-burr hole on the side of only 2 mm in the monolayer of the cortical surface. , Japan) was used to measure local cerebral blood flow (rCBF) to evaluate the ischemic core of caudate and putamen. The presence of cerebral infarction was evaluated through MRI 24 hours after transient MCA occlusion.
  • mice were sacrificed 1 day and 4 weeks after cerebral infarction, and brains were photographed by MRI, and long-term neurological behavioral results were evaluated.
  • the SD rat model for cerebral infarction was divided into four groups. The first group was used as a control group, the second group was treated with human mesenchymal stem cells (hMSC), the third group was treated with pseudoglia, and the last group was pseudoglia and anti-BP4 antibody (100 ⁇ g). /ml) was treated together. Finally, 200,000 cells were placed in 10 ⁇ l of NB medium and transplanted to the side of the rat brain.
  • hMSC human mesenchymal stem cells
  • the neurological results of 4 groups of rats were evaluated weekly for neurological behavioral function using a beam-walking test and a sticky-tape test. This was performed by an investigator who did not know about the experimental group temporarily before and after middle cerebral artery occlusion (MCAo) and 1, 2, 3, and 4 weeks after cell transplantation.
  • MCAo middle cerebral artery occlusion
  • the modified sticky tape test was carried out by making a sleeve using a 3cm piece of green paper tape. It was 1cm wide and wrapped around the forefoot so that the tape adhered to itself and the fingers slightly protruded from the sleeve. Typical reactions in rats are either pulling the tape using their mouth to remove the tape, or rubbing the tape off with the opposite foot. After attaching the tape, the mice were placed in the cage and observed for 30 seconds. The timer was turned on while the rat tried to remove the tape. The test was repeated 3 times on each test day, and the two highest scores were averaged. The exercise test data represented the mean duration and right/left ratio.
  • mice treated with pseudoglia reduced the time it took to remove the sticky tape from the limb to 40 seconds, but this reduction disappeared when treated with anti-BP-4 antibody.
  • Brains of rats perfused with PBS were perfused with 4% paraformaldehyde (PFA). Then, the brain was rapidly removed, fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) for one day, and incubated in 30% sugar solution for 3 days.
  • Brain tissue was mounted using an optimal cutting temperature (OCT) compound (Leica, Wetzlar, Germany), and brain slices were prepared with a thickness of 20 ⁇ m using a motorized cryostat (Leica, Wetzlar, Germany). Brain tissue was treated with 3% hydrogen peroxide on Mito Silane-coated slides to inhibit peroxidase activity inside the brain tissue.
  • OCT optimal cutting temperature
  • Tissues were pAKT (1:500), p-ERK (1:500), truncated caspase-3 (1:500; Cell signaling), Bcl-xl (1:250; Cell Signaling), Bax (1:100; Abcam), cytochrome C (1:500; Santa Cruz Biotechnology), and NeuN (1:500; Millipore, MA, USA) were diluted in a 10% FBS blocking solution and stained overnight at 4°C. After washing the stained tissue several times with PBS, the residual primary antibody was washed with 5% FBS.
  • TRITC tetramethylrhodamineisothiocyanate
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • Rats of each group were euthanized, and brain tissue was perfused with PBS and stored at -80°C. Frozen brain tissue was microdissected in cold plates. The tissue was homogenized with RIPA II cell lysis buffer (100mM Na 3 VO 4 , 100mM PMSF, 100mM NaF and protease inhibitor) and Q55 sonicator (Qsonica, Melville, NY, USA). The same amount of protein (40 ⁇ g) was separated by 12% SDS-PAGE for 25 minutes and transferred to a nitrocellulose membrane for 1 hour and 30 minutes.
  • RIPA II cell lysis buffer 100mM Na 3 VO 4 , 100mM PMSF, 100mM NaF and protease inhibitor
  • Q55 sonicator Qsonica, Melville, NY, USA
  • Akt(1:500), ERK(1:500; Cell Signaling), NeuN(1:200; Abcam, UK), Bax(1:500; Cell Signaling), pAkt(1:200), p-ERK(1 :500; Cell Signaling), and the primary antibody against cleaved caspase-9 (1:500; Cell Signaling) were diluted in a 2% skim milk blocking solution. Incubated for one day, and treated with anti-rabbit or anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody (1:2000, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA) to obtain solution A and solution B (West-Q Chemiluminescent Substrate Kit, GenDEPOT). ).
  • phosphorylated Akt pAkt
  • Bcl-xl in the brain injected with pseudoglial cells significantly increased more than twice, and cytochrome c, Bax and cleaved caspase-3 were It was significantly reduced to less than 10%.
  • the change induced by these pseudoglial cells ghMSC was significantly reduced by the anti-BP-4 antibody (FIGS. 5A to 5F ).

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Abstract

본 발명은 인간 중간엽 줄기세포로부터 분화된 유사교세포를 유효성분으로 함유하는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 인간 중간엽 줄기세포로부터 분화된 유사교세포(glia-like cell, ghMSCs)를 뇌경색을 유발한 동물 모델에 주입한 결과, 경색 부피(infarct volume)가 50% 이상 현저히 감소하고, 신경작용 기능이 대조군 및 인간 중간엽 줄기세포(hMSCs)를 처리한 군보다 현저히 개선되었으며, 이는 IGF-1R을 경유한 IGFBP-4의 Akt 경로에 의해 허혈성 뇌졸중(뇌경색)이 치료되는 효과를 확인하였는바, 본 발명의 분화된 유사교세포는 뇌졸중의 세포 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

유사교세포로 분화 유도된 후기 단계의 인간 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물
본 발명은 유사교세포로 분화 유도된 후기 단계의 인간 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
뇌졸중이란 뇌 일부분에 혈액을 공급하고 있는 혈관이 막히거나(뇌경색) 터짐(뇌출혈)으로써 그 부분의 신경계가 손상되어 나타나는 신경학적 증상을 의미한다. 뇌졸중은 크게 두 가지로 나눌 수 있는데, 첫째는 혈관이 막히는 것으로 혈관에 의해 혈액을 공급받던 뇌의 일부가 손상되는데, 이를 뇌경색(Infarction)이라고 하며 허혈성 뇌졸중(Iscemic stroke), 또는 경색성 뇌졸중으로도 불린다. 둘째는 뇌혈관이 터지는 것으로 뇌 안에 피가 고여 그 부분의 뇌가 손상당한 것으로 뇌출혈(Hemorrhage) 또는 출혈성 뇌졸중(Hemorrhagic stroke)이라고 한다. 허혈성 뇌졸중이 약 85% 정도로 출혈성 뇌졸중보다 더 많은 것으로 알려져 있다. 뇌졸중은 신경계가 손상되어 일어나는 신경질환으로서 다루기가 매우 힘든 질환이다.
뇌졸중을 치료하기 위해서는 손상된 신경계를 회복시키는 것이 중요하다. 그러나 신경세포인 뉴런은 한 번 손상되면 회복되지 않으므로 교세포의 기능을 회복시켜야 한다. 교세포 중에서도 성장인자들을 분비하여 미세환경(microenvironment)을 개선시키는 성상세포가 뇌졸중 치료에 가장 크게 도움이 된다는 보고가 있다.
신경계(nervous system)는 신경세포(neuron)와 신경교세포(glia cell)로 이루어진다. 신경교세포는 신경계를 지탱하는 세포로서 신경계의 약 90%를 구성하며, 뉴런에 필요한 물질을 공급하고, 적합한 화학적 환경을 위한 항상성을 유지하는 역할을 한다. 신경교세포는 정보를 전달하는 뉴런과 달리 정보전달 기능은 없으며, 뉴런과 다르게 손실 후 회복이 가능하다. 이에 뇌에 발생하는 암은 뉴런이 아닌 교세포에서 발생하는 것이다. 교세포는 뇌 속에 가장 분포되어 있는 세포로 교세포의 크기는 신경세포의 1/10 정도이나 수적으로는 약 10배 정도로, 수천억개가 될 것으로 추정된다. 중추신경계에 존재하는 교세포에는, 혈액 뇌 장벽(blood-brain barrier)을 유지하고 혈액에서 포도당을 흡수하여 뉴런에 공급하고, 조직 재생을 도와 미세 환경을 개선시키는 성상세포(astrocyte), 중추신경계 수초(myelin sheeth)를 형성하는 희소돌기세포(olggodendrocyte), 중추신경계의 면역세포 역할을 하는 미세아교세포(microglia) 및 방사 신경교세포(radial glia)가 있다.말초신경계에 존재하는 교세포에는 말초신경계 수초를 형성하는 슈반세포(schwann cell)와 뉴런에 영양을 공급하는 위성 세포(satellite cell)이 있다.
줄기세포는 신경계에서 손상되거나, 손실된 세포를 대체할 수 있는 능력 때문에 뇌졸중과 같이 다루기 힘든 신경질환들의 유망한 치료제로 고려된다. 그 동안 배아줄기세포(ESCs)와 유도만능줄기세포(iPSCs)가 다양한 신경세포들로 분화될 수 있고, 손상된 신경계를 대체할 수 있다고 보고되었다. 그러나 이런 세포들은 원하지 않는 암을 발생시킬 수 있다는 문제때문에 임상적인 시도가 이루어지지 않았다. 따라서 현재 진행 중인 임상 시험은 성체 줄기 세포, 특히 초기 분비된 인간 중간엽 줄기세포(hMSCs)를 사용하고 있다.
골수 유래 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSC)는 실험실 내에서 생장을 유지함과 동시에 자기재생을 할 수 있으며, 다양한 세포로 분화될 수 있다. (Bianco et al., 2001; Pittenger et al., 1999; Prockop, 1997). 또한, MSC는 신경세포의 활성을 가지는 다양한 유사신경세포로 교차분화 할 수 있는 잠재성을 갖는다(Munoz-Elias et al., 2003; Sanchez-Ramos et al., 2000; Trzaska et al., 2007; Woodbury et al., 2000). 인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cells, hMSC)는 높은 가소성(plasticity)과 낮은 면역 거부 반응 때문에 손상된 신경계를 치료하기 위한 세포치료제로서 연구되고 있다(Thuret et al., 2006). 본 발명자들은 이식된 hMSC가 생체 외(ex vivo) 척수손상 모델에서 손상된 신경 섬유의 성장과 척수조직 세포의 생존을 증가시킨다는 것을 입증하였다(Cho et al., 2009).
성체줄기세포의 중간엽 줄기세포에는 배양 초기 단계의 hMSC(early passage hMSC)와 배양 후기 단계의 hMSC(lagte passage hMSC, 10 passage 이상)가 있는데, 배양 후기 단계의 hMSC는 성장인자(growth factor)나 사이토카인들을 덜 분비하여 주변 분비 작용(paracrine effect)이 떨어져 신경계 회복력이 감소하게 된다. 이에 손상된 신경계의 치료를 위해서는 초기 hMSC를 이용하고 있는데, 배양 초기 단계에서는 hMSC를 얻을 수 있는 양이 매우 제한되어 있어, 치료를 위한 충분한 양을 얻기 어려웠다.
이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고자 인간 성체줄기세포로부터 얻은 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, hMSCs)를 신경교세포의 특성을 갖도록 분화 유도시켰으며, 상기 유사교세포로 분화유도된 중간엽 줄기세포(glia-like cell induced by hMSC, 이하 ghMSC라 약칭)는 성장인자와 사이토카인을 다량 분비하는 유사교세포로 분화 유도되어 주변 분비 작용(paracrine effect)가 강화되어 뇌졸중 치료에 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
인간 중간엽 줄기세포로부터 분화된 유사교세포 ghMSC를 뇌경색을 유발한 동물 모델에 주입한 결과, 경색 부피(infarct volume)가 50% 이상 현저히 감소하고, 신경작용 기능이 대조군 및 인간 중간엽 줄기세포(hMSCs)를 처리한 군보다 현저히 개선된 효과를 확인하고, 이는 IGF-1R을 경유한 IGFBP-4의 Akt 경로에 의한 것임을 확인하여 뇌졸중(뇌경색)이 치료되는 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 유사교세포로 분화 유도된 후기 단계의 인간 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 유사교세포로 분화 유도된 후기 단계의 인간 중간엽 줄기세포의 유효량을 개체에 투여하여 뇌졸중을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 유사교세포로 분화 유도된 후기 단계의 인간 중간엽 줄기세포의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 유사교세포로 분화 유도된 후기 단계의 인간 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 유사교세포로 분화 유도된 후기 단계의 인간 중간엽 줄기세포의 유효량을 개체에 투여하여 뇌졸중을 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 유사교세포로 분화 유도된 후기 단계의 인간 중간엽 줄기세포의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 유사교세포로 분화 유도된 후기 단계의 인간 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 유사교세포로 분화 유도된 후기 단계의 인간 중간엽 줄기세포(glia-like cell, ghMSCs)를 뇌경색을 유발한 동물 모델에 주입한 결과, 경색 부피(infarct volume)가 50% 이상 현저히 감소하고, 신경작용 기능이 대조군 및 인간 중간엽 줄기세포(hMSCs)를 처리한 군보다 현저히 개선되었으며, 이는 IGF-1R을 경유한 IGFBP-4의 Akt 경로에 의해 뇌졸중(뇌경색)이 치료되는 효과를 확인하였는바, 본 발명의 분화된 유사교세포는 뇌졸중의 세포 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 ghMSC 유도 과정에서 유사교세포가 형태적으로 변화하는 것을 bright-field image로 확인한 도이다.
도 1b는 인간 중간엽 줄기세포(hMSC)와 이로부터 유도된 유사교세포(ghMSC)에서 성상 아교 세포의 마커인 GFAP, S100β, SLC1A3, SLC1A2, 희소돌기 신경교세포의 마커인 Sox10, 희소돌기 신경교세포 전구체 마커인 PDGFRα 및 허혈성 조건에서 중요한 역할을 하는 마커인 PAPP-A의 발현을 나타낸 도이다.
도 1c는 성상 아교 세포의 마커인 GFAP, S100β의 발현을 면역조직화학 염색으로 확인한 도이다.
도 1d는 성상 아교 세포의 마커인 GFAP, S100β의 발현이 전체 유사교세포에서 각각 발현하는 비율을 나타낸 도이다.
도 2a는 산소-포도당 결핍 환경(OGD)에서 유사교세포를 처리한 경우 세포 생존능이 증가하는 것을 나타낸 도이다.
도 2b는 유사교세포에서 인간 중간엽 줄기세포보다 IGFBP-4의 mRNA 발현량이 3배 이상 증가하는 것을 나타낸 도이다.
도 2c는 유사교세포에서 인간 중간엽 줄기세포보다 IGFBP-4 단백질의 발현이 증가하는 것을 나타낸 도이다.
도 2d는 IGFBP-4가 신경세포 보호 효과가 있다는 것을 나타낸 도이다.
도 2e는 OGD 처리 전 후에 인간 IGFBP-4를 처리하여 세포 생존능을 측정한 도이다.
도 2f는 유사교세포의 신경세포 보호 효과를 나타내는 기전을 알아본 결과, PI3K/Akt 경로가 관계가 있음을 나타낸 도이다.
도 2g는 유사교세포의 신경세포 보호 효과를 나타내는 기전을 알아본 결과, IGF1R 경로가 관계가 있음을 나타낸 도이다.
도 3a는 유사교세포의 농축된 배양액(ghMSC-CM)을 처리하였을 때, Akt의 인산화가 유의미하게 증가한 것을 나타낸 도이다.
도 3b는 유사교세포의 농축된 배양액(ghMSC-CM)을 처리하였을 때, 유의미하게 증가한 인산화된 Akt는 항-BP-4에 의해 크게 감소한 것을 나타낸 도이다.
도 3c는 IGF-1R 저해제인 PPP를 유사교세포의 농축된 배양액(ghMSC-CM)에 처리하였을 때 유사교세포의 농축된 배양액(ghMSC-CM)에 의해 증가한 인산화된 Akt의 발현을 감소시킨 것을 나타낸 도이다.
도 3d는 유사교세포의 농축된 배양액(ghMSC-CM)을 처리하였을 때, 증가하였던 미토콘드리아 내의 Bax의 발현이 감소되고, 이는 항-BP-4의 IGFBP-4 저해, wortmannin의 Akt 저해와 PPP의 IGF-1R 저해로 미토콘드리아 내의 Bax 발현이 다시 증가한 것을 나타낸 도이다.
도 3e는 유사교세포의 농축된 배양액(ghMSC-CM)을 처리하였을 때, 감소하였던 세포질의 Bax 발현을 증가시키고, 이는 항-BP-4의 IGFBP-4 저해, wortmannin의 Akt 저해와 PPP의 IGF-1R 저해로 세포질의 Bax 발현이 다시 감소한 것을 나타낸 도이다.
도 3f는 OGD 처리는 세포 외부의 IGF-1 및 IGF-2의 발현을 변화시키지 않았으나, OGD 처리 후 유사교세포의 처리는 세포 외부 IGF-1의 발현을 대조군 및 OGD 처리군에 비해 유의미하게 증가시켰고 이러한 증가는 항-IGFBP-4 항체 처리에 의해 다시 원상 복귀되었음을 나타낸 도이다.
도 4a는 뇌경색에서 유사교세포의 치료 효과를 확인하기 위한 연구의 개략도이다.
도 4b는 뇌경색 유도 후 1일 후에 유사교세포(ghMSC)를 주사한 결과 경색 부피(infarct volume)가 50% 이상 현저히 감소했고 유사교세포(ghMSC)의 효과는 인간 중간엽 줄기세포(hMSCs)보다 약 20% 높았으며, 이러한 효과는 항-BP-4 항체에 의해 거의 완전히 차단되었음을 나타낸 도이다.
도 4c는 유사교세포(ghMSC)를 이용하여 뇌경색을 치료한 경우 신경작용 기능이 향상된 것을 나타낸 것이며, 이와 같은 효과는 항-BP-4 항체로 처리한 경우 사라졌음을 나타낸 도이다.
도 5a 내지 도 5f는 유사교세포가 주입된 뇌에서 인산화된 Akt(pAkt)와 Bcl-xl은 유의미하게 증가하였고, cytochrome c, Bax 및 절단된 caspase-3는 현저하게 감소함과 이러한 변화는 항-BP-4 항체에 의해 현저히 감소한 것을 확인한 도이다.
도 6은 NeuN(neuronal marker) 및 pAkt 발현이 유사교세포가 이식된 뇌에서 증가하였고, Bax 및 절단된 caspase-9는 유사교세포 주입에 따라 감소하였으나, 이러한 효과는 항-BP-4 항체와 같이 주입 시 감소한 것을 확인한 도이다.
도 7은 유사교세포(ghMSCs)의 IGFBP-4를 통한 신경세포 보호 기전을 모식적으로 나타낸 도이다.
본 발명은 유사교세포(glia-like cell)로 분화 유도된 후기 단계(late-passage)의 인간 중간엽 줄기세포(ghMSC)를 유효성분으로 함유하는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 유사교세포(glia-like cell)로 분화 유도된 후기 단계(late-passage)의 인간 중간엽 줄기세포(ghMSC)를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌졸중의 치료 방법을 제공한다.
hMSC와 차별화된 신경세포나 교세포를 사용하는 것이 신경장애에 대한 신경 재건 접근법(neuroconstructive approach)으로 사용될 수 있다는 보고가 있다. 특히, hMSCs의 주변 분비 활동은 임상 시험에 중요한 영향을 미치는 것으로 간주된다. 그러나 대부분의 임상 실험은 후기(late-passage) 세포의 주변 분비 활성(paracrine activity)이 현저히 낮기 때문에 높은 비용에도 불구하고 지금까지 passage 5보다 낮은 초기 mMSC만을 사용해 왔다. 즉 본 발명자들이 확인한 바와 같이, passage 11부터 14까지의 후기 hMSC를 이식하는 것은 뇌졸중을 유도한 마우스의 행동 회복에 거의 영향을 미치지 않았다.
본 발명자들은 신경 기능 회복 효과가 낮은 후기 단계의 hMSC를 유사교세포로 분화 유도하여 주변 분비 활성(paracrine activity)을 증가시킨 ghMSC를 수득하였다. ghMSC는 산소-포도당 결핍 환경(OGD)에 의해 손상된 1차 배양 피질 뉴런을 상당히 보호한다는 것을 보여주었고, 생체 내 실험에서도 마우스 모델의 뇌가 뇌경색으로부터 유의미하게 보호되고 신경 행동 기능이 ghMSC 이식에 의해 현저하게 회복되었다. 또한, Akt 신호 전달 기전 경로 구성 요소가 활성화되었고, ghMSC 이식에 의해 뇌의 antiapoptotic 경로가 강화되었으며, 항-BP-4에 의해 뇌졸중 보호 효과가 차단되었음을 확인하였다. 상기 결과를 종합하면 후기 hMSC에서 유도되어 IGBP-4를 방출하는 ghMSC가 뇌졸중을 치료하기 위한 바람직한 세포 공급원이라는 것을 보여준다. 또한, 본 발명자들은 ghMSC에서 방출된 IGFBP-4가 체외 및 생체 내 허혈성 뇌졸중 모델에서 신경보호 효과를 나타낸다는 것을 처음으로 밝혔다. hMSC에 비해 ghMSC에서 높게 발현되는 IGFBP-4는 산소-포도당 결핍 환경(oxygen-glucose deprivation, OGD)에 의한 손상 피질 뉴런의 생존을 향상시켰고, 경색 부피를 감소시켰다. 또한, IGBP-4가 IGF-1R 신호를 통하여 Akt의 인산화를 강화시킨다는 것을 확인하였다.
상기 유사교세포는 희소 돌기 아교 세포(oligodendroglia), 성상 아교 세포(astrocyte), 미세 아교 세포(microglia) 및 방사 신경교세포(radial glia)로 구성된 군으로부터 어느 하나 이상이다.
상기 뇌졸중은 허혈성 뇌졸중(Ischemic stroke) 또는 출혈성 뇌졸중(hemorrhagic stroke)이다.
상기 ghMSC는 후기 인간 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된다.
상기 ghMSC는 IGFBP-4(insulin-like growth factor binding protein-4)를 방출한다.
상기 ghMSC는 IGF-1R을 경유한 IGFBP-4의 PI3K/Akt 경로 활성화에 의해 뇌졸중을 치료한다.
상기 조성물의 유효 용량은 체중 1㎏당 세포의 경우에 10 3 내지 10 9 세포/㎏이고, 바람직하게는 10 4 내지 10 8 세포/㎏이며, 더 바람직하게는 6×10 5 내지 6×10 7 세포/㎏이고, 하루 2 내지 3회 투여될 수 있다. 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 발병 정도에 따라 변할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 인간 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 유사교세포를 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 인간 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 유사교세포는 치료를 위해 약학적 조성물로 존재할 수 있다. 이러한 약학적 조성물은 세포에 추가로 생리학적으로 받아들여질 수 있는 매트릭스(matrix) 또는 생리학적으로 받아들여질 수 있는 부형제를 포함할 수 있다. 매트릭스 및/또는 부형제의 유형은 의도된 투여 루트에 따라 다른 것들에 의존할 것이다. 이 약학적 조성물은 또한 줄기세포 치료시 함께 사용되는 다른 적합한 부형제 또는 활성 성분을 선택적으로 포함할 수 있다.
또한, 조성물의 투여량은 투여 경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르(예, 올레인산에칠 등), 알코올 류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약학적 담체를 포함할 수 있다.
본 발명은 인간 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 유사교세포의 제조방법을 제공한다.
상기 인간 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 유사교세포의 제조방법은
1) 인간 중간엽 줄기세포를 배양하여 후기(late-passage) 인간 중배엽 줄기세포를 얻는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 얻은 후기 인간 중배엽 줄기세포를 10% FBS 및 1mM β-머캅토에탄올을 함유하는 DMEM 배지로 22 내지 26시간 동안 1차 배양하는 단계;
3) 10% FBS 및 0.28 ㎍/㎖ 트레티노인(all-trans-retinoic acid)을 함유하는 DMEM 배지로 68 내지 76시간 동안 2차 배양하는 단계; 및
4) 10% FBS, 10ng/㎖ bFGF(basic Fibroblast Growth factor), 5ng/㎖ PDGF-AA, 10μM 포스콜린(Forskolin) 및 200ng/㎖ HRG-β1 (Heregulin-β1)을 함유하는 DMEM 배지로 8일 동안 3차 배양하는 단계; 를 포함한다.
상기 인간 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 유사교세포는 우태아 혈청(FBS)을 함유한 DMEM 배지 안에 유사교세포와 FBS 원액 및 DMSO를 넣어 냉동 바이알을 제작하고, 아이소프로판올(isopropanol)을 함유한 냉동 컨테이너에 제작한 냉동 바이알을 넣고 -80℃ 초저온 냉동고(DEEP freezer)에서 밤새 보관한 후, 액체질소 저장 탱크(LN2 탱크)에 제작한 냉동 바이알을 넣어 냉동시킬 수 있다.
상기 냉동한 인간 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 유사교세포는 37℃ 수조에서 해동시키고, 약간의 얼음이 있는 상태의 냉동 바이알 안의 세포를 생물학적 안전 캐비닛(biosafety hood) 안에서 파이펫을 이용해 잘 섞고, 우태아혈청(FBS)을 함유한 DMEM 배지와 섞어 코니컬 튜브에 넣은 후, 원심분리기로 침전시킨 세포 펠렛을 우태아 혈청(FBS)을 함유한 DMEM 배지와 혼합하고, 트리판 블루(tryphan blue) 염색약을 섞고 세포 배양 접시에 도말하여 사용할 수 있다.
상기 인간 중간엽 줄기세포는 골수, 지방조직, 혈액, 제대혈, 간장, 피부, 위장관, 태반 또는 자궁으로부터 유래한 성체 줄기세포일 수 있다. 더욱 바람직하게 골수 유래 중간엽 줄기세포이다.
상기 유사교세포는 희소 돌기 아교 세포(oligodendroglia), 성상 아교 세포(astrocyte), 미세 아교 세포(microglia) 및 방사 신경교세포(radial glia)로 구성된 군으로부터 어느 하나 이상일 수 있다.
실제로 본 발명에서 얻어지는 ghMSC를 분석해보면 60 내지 70%는 성상세포이고, 10 내지 20%가 분화가 진행 중이거나 다른 교세포이며, 10% 정도는 미분화 hMSC인 것으로 나타났다.
성상세포가 주변 분비(paracrine) 효과가 가장 큰 교세포이므로 성상 세포가 많이 존재한다는 것은 주변 조직의 재생 및 회복을 촉진시키는 활성이 크다는 것으로, 뇌졸중 치료에 효과가 뛰어나다는 것을 의미한다.
따라서, 본 발명의 제조방법이 후기 hMSC의 효능을 높이는데 최적화된 방법임을 알 수 있다.
상기 조성물은 뇌졸중(stroke)을 가지는 개체의 병변의 치료 또는 개선을 위해 투여되는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포로부터 분화된 유사교세포(glia-like cell)을 유효성분으로 함유하는 개체 내 IGFBP-4(insulin-like growth factor binding protein-4) 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 구체적 실시 예에서, 인간 중간엽 줄기세포(hMSCs)로부터 유사교세포로 분화 유도된 줄기세포(ghMSCs)는 형상이 변화하고(도 1a 참조), 이는 성상 아교 세포 및 희소돌기 신경교세포의 분자적 특징을 보임을 확인하였다(도 1b 참조). 성상세포의 마커(GFAP, S100β, SLC1A3), 슈반 세포/올리고 덴드로사이트의 마커(Sox10) 및 올리고 덴드로사이트 전구체의 마커(PDGFRα)와 관련 유전자들이 hMSC에 비해 ghMSC에서 증가함을 확인하였다.
또한, 상기 유사교세포는 허혈성 조건에서 중요한 역할을 하는 IGFBP-4, IGF-1, PAPP-A(Pregnancy-associated plasma protein A), protease의 mRNA 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 1c 및 도 1d 참조).
또한, 산소-포도당 결핍 환경(OGD)의 1차 피질 뉴런이 농축된 배양액에 후기 인간 중간엽 줄기세포의 농축된 배양액을 처리한 경우, 신경세포의 생존능이 증가하고, IGFBP-4를 과발현하여 신경세포 보호 효과를 나타냄을 확인하였다(도 2 참조). 산소-포도당 결핍 환경(OGD)의 1차 피질 뉴런이 농축된 배양액에 후기 인간 중간엽 줄기세포가 농축된 배양액을 처리한 경우 Akt의 인산화가 증가되었다. 그러나 항 BP-4를 처리하면 증가되었던 Akt의 인산화가 크게 감소하였다. 이러한 신경세포 보호 기전은 IGF-1R을 경유한 IGFBP-4의 Akt 경로를 통한 것임을 나타낸다(도 3a 내지 도 3c 참조). 산소-포도당 결핍 환경의 1차 피질 뉴런의 농축 배양액에 후기 인간 중간엽 줄기세포가 농축된 배양액을 처리한 경우 proapoptic 단백질인 Bax의 미토콘드리아 내의 발현은 증가하고 세포질 내의 발현은 감소한다. 이러한 결과는 IGFBP-4에 의해 유도된 Akt 활성이 세포질에서 미토콘드리아로의 내생적 Bax 이동을 감소시키며, 세포 외부 IGF-1 및 IGF-2의 발현을 조절하여 신경세포의 생존을 증가시킨 것임을 나타낸다(도 3d, 도 3e 및 도 3f 참조).
본 발명은 시험관 내/생체 내 허혈성 뇌졸중 모델에서 ghMSC가 분비한 IGFBP-4가 신경보호 효과를 보여준 것으로서 후기 단계(late-passage) hMSC(ghMSC)는 IGFBP-4를 방출하고, 허혈성 뇌졸중을 치료하는데 적합한 세포임을 보였다. 나아가, ghMSC에 의한 뇌졸중 치료기전은 세포에서 방출된 IGFBP-4가 IGF-1R과 PI3/Akt와, 또는 ERK 신호전달을 통해 이루어진다.
시험관 내/생체 내에서 ghMSC의 처리 및 주입에 의한 pAkt의 수준이 상당히 증가했다. 하지만, 이러한 효과는 항-BP-4 또는 PPP의 처리 및 주입으로 상반된 결과를 나타냈다. 이러한 결과는 ghMSC에서 분비한 IGFBP-4가 IGF-1R 신호전달에 의해 Akt의 인산화를 향상시킴을 보여준다. Akt의 활성화는 Bax의 미토콘드리아 전이를 방해하고, 따라서 미토콘드리아에 의한 세포 자멸사를 억제한다. 이러한 활성은 산소-포도당 결핍 환경으로 인한 Bax의 미토콘드리아 전이가 ghMSC-CM에 있는 IGFBP-4에 의해 방해되었고, ghMSC로부터 나온 IGFBP-4에 의해 Bax의 발현 자체가 감소함을 제시한다(도 3d 및 3e).
IGF-1R 매개 세포자멸사 신호전달이 세포 외에 존재하는 IGF-1과 IGF-2과 연관이 있고, 이들의 수준은 ghMSC에서 방출하는 IGFBP-4에 의해 조절되는 것과 연관이 있다. IGFBP-4는 IGF-1과 IGF-2와 상호작용하고, 이들 단백질과 결합하여 IGF의 활성을 저해하는 역할로 밝혀졌다(도 3f).
또한, 유사교세포를 뇌경색을 유발한 동물 모델에 주입한 결과, 경색 부피(infarct volume)가 50% 이상 현저히 감소하고, 신경작용 기능이 beam-walking 테스트와 sticky tape 테스트에서 대조군 및 인간 중간엽 줄기세포(hMSCs)를 처리한 군보다 현저히 개선된 효과를 확인하고, 이는 IGF-1R을 경유한 IGFBP-4의 Akt 경로에 의한 것임을 확인하였다(도 4b 및 도 4c 참조).
따라서, 본 발명의 분화된 유사교세포를 함유하는 IGFBP-4를 과분비하여 IGF-1R를 경유한 Akt 경로를 활성화 시켜 뇌졸중의 세포 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 세포 치료용 조성물은 바람직하게는 약학적 조성물이며, 당업자에게 공지의 방법으로 제재화하는 것이 가능하다. 예를 들면, 필요에 따라 물 혹은 그외 약학적으로 허용 가능한 액과의 무균성 용액, 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 약리학상 허용되는 담체 혹은 매체, 구체적으로는 멸균수나 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 부형제, 비히클(vehicle), 방부제, 결합제 등과 적절히 조합하여 일반적으로 인정된 제약 실시에 요구되는 단위 용량 형태로 혼화하는 것에 의해 제제화하는 것으로 여겨진다. 상기 제재에 있어서 유효 성분량은 지시받은 범위의 적당 용량을 얻을 수 있도록 하는 것이다. 또, 주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 비히클을 이용해 통상의 제재 실시에 따라 처방할 수 있다. 이때 주사용 수용액으로는 예를 들면, 생리식염수, 포도당이나 그 외 보조약을 포함한 등장용액, 예를 들면, D-소르비톨, D-만노스, 염화나트륨을 들 수 있어 적당한 용해 보조제, 예를 들면 알코올, 구체적으로 에탄올, 폴리알코올, 예를 들면 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리소르베이트 80(TM), HCO-50으로 병용할 수 있다. 유성액으로서는 참기름, 콩기름을 들 수 있어 용해 보조제로서 안식향산벤질, 벤질 알코올과 병용할 수 있다. 또, 완충제, 예를 들면 인산염 완충액, 초산나트륨 완충액, 무통화제, 예를 들면 염산 프로카인, 안정화제, 예를 들면 벤질 알코올, 페놀, 산화방지제와 배합할 수 있다. 조제된 주사액은 통상 적당한 앰플에 충전시킨다.
환자의 체내에의 투여는 바람직하게는 비경구 투여이며, 구체적으로는 손상부위에 1회 투여가 기본이지만 여러 차례 투여도 좋다. 또, 투여시간은 단시간이라도 장시간 지속 투여라도 좋다. 더욱 구체적으로는 주사 제형, 경피 투여형 등을 들 수 있다.
상기 조성물의 유효 용량은 체중 1㎏당 세포의 경우에 10 3 내지 10 9 세포/㎏이고, 바람직하게는 10 4 내지 10 8 세포/㎏이며, 더 바람직하게는 6×10 5 내지 6×10 7 세포/㎏이고, 하루 2 내지 3회 투여될 수 있다. 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 발병 정도에 따라 변할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 인간 중간엽 줄기세포(hMSC)의 배양
정상적인 인간의 골수로부터 추출된 성인 인간 중간엽 줄기세포 hMSCs(Cambrex Bioscience, Walkersville, MD, USA)는 10% 우태아혈청(FBS; Gibco, Waltham, MA, MA, USA)이 첨가된 저-글루코오스 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)에서 배양되었다. 세포(passages 6-12)는 37℃, 5%의 CO 2의 환경에서 12번 내지 15번 계대 배양하여 후기 단계(late-passage)의 hMSC를 수득하였다.
<실시예 2> 인간 중간엽 줄기세포(hMSCs)의 유사교세포(ghMSCs)로의 유도
상기 실시예 1에서 수득한 후기 단계의 인간 중간엽 줄기세포를 1차 분화 배지[(DMEM-저포도당 배지, 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 혼합물, 1 mM β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol)]로 교체하여 24시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 인간 중간엽 줄기세포를 PBS(인산 완충 용액)으로 세척 후 2차 분화 배지(DMEM-저포도당 배지, 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 혼합물, 0.28 ㎍/㎖ 트레티노인(all-trans-retinoic acid)로 교체하여 배양하였다. 3일 후, 상기 중간엽 줄기세포를 PBS로 세척한 후 3차 분화 배지[DMEM-저포도당 배지, 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 혼합물, 10mM 폴스콜린(forskolin), 10ng/ml 인간 섬유아세포 성장인자(human basic-fibroblast growth factor), 5ng/ml 인간 혈소판 유도성장인자-AA(human platelet derived growth factor-AA), 200ng/ml 헤레귤린 1-베타1(heregulin-β1)]로 교체하여 8일 동안 배양하였다. 이때, 상기 3차 분화 배지는 이틀에 한번 교체하였다. 분화유도를 위해 배양중인 hMSC의 형태를 현미경으로 관찰하였다. 분화유도 과정 동안의 세포 생존은 bright-field imaging을 통해 관찰되었다(도 1a).
<실시예 3> 유사교세포의 농축된 배양액(ghMSC-CM)의 제조
유사교세포(1×10 4 cells/cm 2)는 PBS로 두 번 헹구고 혈청이 없는 Neurobasal-A 배지(NB 배지)에 18시간 동안 배양하였다. 농축된 배양액을 모아서 원심분리기로 1500g로 5분 동안 침전시켜 세포 찌꺼기를 제거한 후, 실험에 사용하였다.
<실시예 4> 유사교세포(ghMSC)의 냉동 및 해동
<4-1> 유사교세포의 냉동
10% 우태아 혈청(FBS)을 함유한 DMEM 배지 안의 1~2×10 5 수의 인간 중간엽 줄기세포(또는 유사 교세포)와 FBS 원액 및 DMSO를 각각 5:4 1의 비율로 전체 부피를 1㎖로 맞추어 냉동 바이알을 제작했다. 100% 아이소프로판올(isopropanol)을 함유한 냉동 컨테이너에 제작한 냉동 바이알을 넣고 -80℃ 초저온 냉동고(DEEP freezer)에서 밤새 보관한 후, 액체질소 저장 탱크(LN2 탱크)에 제작한 냉동 바이알을 넣어 보관하였다.
<4-2> 유사교세포의 해동
액체질소 저장 탱크에 보관한 냉동 바이알을 37℃ 수조에서 약 2분간 해동시키고, 약간의 얼음이 있는 상태의 냉동 바이알 안의 세포를 생물학적 안전 캐비닛(biosafety hood) 안에서 파이펫을 이용해 잘 섞어주었다. 냉동 바이알 안의 1 ㎖의 세포 농축액을 10% FBS 함유한 DMEM 배지 10㎖과 섞어 15㎖ 코니컬 튜브에 넣었다. 원심분리기 1,200 rpm 속도로 5분간 돌려 침전시킨 세포 펠렛을 남기고, 상층액을 모두 흡입(suction)시켰다. 10% 우태아 혈청(FBS)을 함유한 DMEM 배지 1㎖을 15㎖ 코니컬 튜브에 넣어 세포 펠렛을 파이펫으로 풀어주었다. 상기 세포 펠렛 11㎕와 트리판 블루(tryphan blue) 염색약 11㎕을 섞었다. 이 중 10㎕을 세포 계수기에 주입하여 1㎖ 안에 함유된 세포 수를 계산하고, 2,000 cells/cm 2 로 세포 배양 접시에 도말하였다.
< 실험예 1> 후기 단계(late-passage) 인간 중간엽 줄기세포(late-passage human mesenchymal stem cells)로부터 유도된 유사교세포(ghMSCs)의 특성 분석
상기 실시예 2의 방법으로 인간 중간엽 줄기세포로부터 유사교세포를 유도하였고, 유도 중인 유사교세포와 유도된 유사교세포를 냉동시키고, 해동하여 분석에 사용하였다. 유도된 유사교세포의 특성을 확인하기 위해, 교세포 마커의 발현 정도를 정량적 RT-PCR 및 면역조직화학 염색으로 확인하였다.
구체적으로, 정량적 RT-PCR은 RNA는 TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 추출되었고, DNase를 처리하였다. cDNA 합성을 위해 M-MLV 역전사 효소(Promega)를 이용하여 42℃에서 1시간 동안 역전사를 진행하였다. SYBR FAST qPCR Kits(KAPA Biosystems)를 사용하여 cDNA에서 발현되는 유전자를 서열번호 1 내지 24의 각 유전자-특이적인 프라이머로 확인하였다. 타겟 유전자의 발현 정도는 Ct 방법을 이용하여 GAPDH를 기준으로 확인하였다. ΔCt 값은 Ct 값을 뺀 값이며, 임계값의 사이클 번호는(ΔCt=Ct(Target)-Ct(GAPDH))로 측정되었다. 내인성 GAPDH에 대한 대상 유전자의 상대적 값은 GAPDH=2-tCt의 fold-change로 결정되었다.
또한, 면역조직화학염색은 배양세포를 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정시키고, 5% 표준 염소 혈청과 0.1% Triton-X100의 블로킹 용액으로 배양하였다. GFAP(1:200; Merck millipore), S100(1:250; Dako)로 하루 동안 4℃ 냉장고에서 염색하였다. 수차례 PBS로 염색 용액을 씻고, 2차 항체 Alexa Fluor®488 anti-mouse IgG (Molecular Probes) 및 Alexa Fluor®546 anti-rabbit IgG (Molecular Probes)로 1시간 동안 실온에서 염색했다. 그 후 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)(Santa Cruz Biotechnology) 로 핵을 염색하였다. 디지털 도립 형광현미경(DM5000B; Leica)으로 시료를 관찰하였다.
그 결과, 도 1b에 나타난 바와 같이, 방사 신경교세포(radial glia) 마커인 Nestin, Sox2, Pax6, Vimentin, GFAP, 성상 아교 세포 마커인 FAP, S100β, SLC1A3과 희소돌기 신경교세포의 마커인 Sox10의 발현이 ghMSC에서 hMSC보다 증가함을 확인하였다. 또한, 허혈성 조건에서 중요한 역할을 하는 IGFBP-4와 IGF-1 pregnancy-associated plasma protein-A (PAPP-A)의 ghMSC에서 hMSC 보다 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 1b). 또한, 도 1c 및 도 1d에서 나타난 바와 같이, 희소돌기 신경교세포의 마커인 Sox10 및 GFAP가 전체 유사교세포(ghMSCs)에서 각각 45% 및 40% 발현하는 것을 확인하였다. 상기 결과는 인간 중간엽 줄기세포로부터 유도한 유사교세포에는 주변 세포들의 성장을 도와 주변 환경을 개선시키는 성상 아교 세포, 희소돌기 신경교세포가 많이 포함되어 있어 뇌졸중을 치료할 가능성을 제시한다.
< 실험예 2> 유사 교세포의 산소-포도당 결핍(Oxygen- gluose deprivation, OGD) 처리된 일차 피질 뉴런에 대한 신경보호 효과 확인
후행성 인간 중간엽 줄기세포로부터 분화된 유사교세포의 신경보호 효과를 하기와 같이 확인하였다.
<2-1> 1차 피질 뉴런이 농축된 배양액(Primary Cortical Neuron-Enriched Culture)의 제조 및 1차 피질 뉴런에 대한 산소-포도당 결핍(Oxygen Glucose Deprivation, OGD) 처리
동물과 관련된 모든 절차는 서울대 동물보호 및 이용위원회 (Seoul, Republic of Korea)의 승인을 받았다. 앞서 설명한 방법에 따라 일차 피질 뉴런 농축 배양액을 준비하였다. 간단히 말해서, 대뇌 피질은 E17 SD 랫트(Rat) 배아에서 얻었다. 분리된 세포는 10% 우태아혈청(FBS)이 첨가된 Neurobasal-A 배지(NB; Gibco)에서 50㎍/ml 폴리-D-라이신(PDL)과 5㎍/ml 라미닌 코팅 플레이트에 7.5 ×10 4 cell/cm 2 로 도말하였다. 이 배양액은 24시간 후에 2% B27(Gibco)로 보충된 NB 배지로 교체되었다. 1차 피질 뉴런이 농축된 배지는 3 또는 4일마다 교체하여 1차 피질 뉴런이 농축된 배양액을 얻었다.
산소-포도당 결핍(OGD)를 유도하기 위해 피질 뉴런을 phosphate-buffered saline (PBS; pH 7.4)와 95% 질소 가스로 두 번 헹구었고, 5% CO 2 gas mixture-injected glucose-free DMEM(OGD 배양액)이 추가되었다. 그리고 세포들을 가습된 방에 놓고, 탈산화된 가스(95% N 2, 5% CO 2)를 받고 37℃ 배양기에 3시간 동안 보관하였다. OGD는 배양액을 교체함으로써 종료되었고, 이어서 37℃ 배양기에서 24시간 동안 5% CO 2로 재산소화(reoxygenation)가 이루어졌다. 산소-포도당 결핍(oxygen-glucose deprivation, OGD)을 통한 세포 사멸 유도 모델은 혈액의 공급 중단에 따른 허혈 상태와 유사한 환경을 설정해 주어, 허혈 상태에 따른 뇌 신경세포 사멸을 유도하는 것이다.
<2-2> 유사교세포의 농축된 배양액의 신경 보호 효과 확인
인간 중간엽 줄기세포와 이로부터 분화된 유사교세포의 신경보호 효과를 상기 실험예 2-1의 산소-포도당 결핍(OGD)이 유도된 1차 피질 뉴런이 농축된 배양액을 이용하여 확인하였다.
구체적으로, 인간 중간엽 줄기세포와 유사교세포(1 ×10 4 cells/cm 2)는 PBS로 두 번 헹구고 혈청 없는 NB 배지에 18시간 동안 배양하였다. 수집된 배양액은 산소-포도당 결핍(oxygen-glucose deprivation, OGD) 처리된 1차 피질 뉴런 농축 배양액에 추가되었다.
유사교세포의 농축된 배양액(ghMSC-CM)에 40㎍/ml IGFBP-4 항체(anti-BP-4; R&D Systems), 50μM PD98059(Promega Corp, Madison, WI, USA), 100nM wortmannin(Sigma-Aldrich), 500M picropodophyllin (PPP; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), 또는 재조합 인간 IGFBP-4(rhBP-4; PeproTech)을 각각 15, 30, 15 또는 30분 처리하여 전배양 되었다. OGD 처리된 일차 피질 뉴런 농축 배양액은 준비된 유사교세포의 농축된 배양액(ghMSC-CM)에서 배양되었다.
정량적 RT-PCR은 IGFBP-4 특이적인 서열번호 25 및 서열번호 26의 프라이머를 사용한 것을 제외하고 상기 실험예 1과 동일한 방법 및 조건으로 시행하였다.
세포 생존능은 MTT 분석을 이용하였다. MTT 시약은 최종 농도 1mg/ml로 4 웰 플레이트에 배양된 뉴런에 첨가되었고, 37℃, 1시간 동안 배양하였다. MTT 용액은 조심스럽게 흡입하고 130㎕의 DMSO에 포르마잔 결정을 녹여내었다. 흡광도는 554nm에서 마이크로플레이트 리더기를 통해 측정하였다.
ELISA 수행은 PBS로 두 번 세척하고, 혈청 단백질이 없는 Neurobasal media에서 실험 조건에 따라 추가적인 처리를 하여 30시간 동안 배양되었다. 상층액을 원심분리기 1200rpm 속도로 5분간 돌려 다운시킨다. IGFBP-4 DuoSet ELISA for human(R&D systems)을 사용하여 분석하였다. 최적 밀도는 450nm에서 마이크로플레이트 리더기(Epoch2, Bio-Tek, Winooski, VT, USA)로 측정되었다.
그 결과, 도 2a에 나타난 바와 같이, 인간 중간엽 줄기세포의 농축된 배양액을 처리한 경우보다, 유사교세포의 농축된 배양액을 처리한 경우 세포 생존능이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 도 2b 및 도 2c에 나타난 바와 같이, 인간 중간엽 줄기세포에서 유사교세포의 경우 IGFBP-4가 3배 이상 많이 발현되는 것을 확인하였다. 또한 도 2d 및 도 2e에 나타난 바와 같이, IGFBP-4 자체로 신경보호 효과를 보였다. 상기 결과는 인간 중간엽 줄기세포로부터 유도된 유사교세포가 IGFBP-4를 과발현하여 신경보호 효과를 나타낸다는 것을 제시한다.
<2-3> IGFBP-4의 신경세포 보호 기전 확인
IGFBP-4가 어떤 기전으로 신경보호 효과를 보이는지 확인하기 위해 PI3K/IGF와 ERK 신호전달 기전의 저해제를 처리하여 상기 실험예 2-2와 동일한 방법 및 조건으로 세포 생존능을 측정하였다.
그 결과, ghMSC-CM에 의한 신경세포 보호 효과를 보이는 IGFBP-4-중개 신호전달을 규명하기 위해 IGF와 관련된 두 가지 다른 신호전달 경로, phosphoinositide 3-kinase(PI3K)/Akt와 extracellular signal-regulated kinase(ERK) 경로를 규명했다. PI3K/Akt 저해제인 Wortmannin은 OGD 처리된 1차 피질 뉴런에 대하여 농축된 배양액이 보이는 신경보호 효과를 제거했다(도 2f). 그러나 ERK 저해제인 PD98059를 처리한 경우 영향이 없었다(도 2f). PI3K/Akt 경로는 IGF-1 수용체(IGF-1R) 신호전달과 관련이 되어 있고, IGF-1R 저해제인 PPP는 ghMSC-CM의 신경보호 효과를 감소시켰다(도 2g). 이러한 결과는 저산소 손상된 일차 피질 뉴런에서 IGFBP-4에 의한 IGF1R 경로가 신경세포 보호에 중요한 역할을 하는 것을 암시한다.
<실험예 3> 유사교세포 농축 배양액에서 IGFBP-4-중개 신호전달 기전 확인
<3-1> 유사교세포 농축 배양액에서 IGFBP -4 및 IGF -1R에 의한 Akt 활성화 확인
IGFBP-4 중개 신경보호 효과에서 Akt 활성화를 시험하기 위해, 유사교세포의 농축된 배양액(ghMSC-CM)에 의해 유도된 Akt 인산화 정도를 OGD 처리 후 다른 시간대마다 측정하였다. 유사교세포와의 공동 배양이 Akt 인산화를 유발하는 지를 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다.
구체적으로, 세포는 차가운 PBS로 2번 세척하고, RIPA 완충용액(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1% NP40, 0.25% sodium deoxycholate, 150 mM NaCl, 1 mM Na3VO4, 0.2 mg/ml leupeptin, 0.2 mg/ml aprotinin, 0.1M PMSF, 및 0.5M sodium fluoride)에 배양한다. 분리시킨 상층액은 SDS-PAGE 일차 항체로 Akt(Cell Signaling, Beverly, MA, USA), pAkt(Cell Signaling), 및 α-tubulin(SigmaAldrich) 1:1000의 비율로 3% BSA 블로킹 용액에 희석되었다. 염소-항-토끼 또는 염소-항-마우스 HRP-결합된 이차 항체(1:5000; Sigma-Aldrich)와 배양한 후, 검출하고자 하는 항원은 웨스턴 블랏 검출 키트(Thermo Fisher Scientific, Inc.)로 검출하였다. 미토콘드리아와 세포질 조각은 Mitochondrial Fraction kit (Active Motif, Carlsbad, CA, USA)로 분리하였다.
그 결과, Akt의 인산화는 유사교세포의 농축된 배양액(ghMSC-CM)을 30분 처리하였을 때, 유의미하게 증가했다(도 3a). 또한, ghMSC-CM 처리후, OGD 처리와 항 IGFBP-4 항체를 함께 처리하거나 처리하지 않고 인산화된 Akt(pAkt) 정도를 확인하였다. OGD 처리 후 ghMSC-CM과 배양되어 유의미하게 증가된 pAkt(P<0.01)는 항-BP-4에 의해 크게 감소되었다(도 3b). 덧붙여서, IGF-1R 저해제인 PPP와 먼저 배양된 ghMSC-CM은 유의미하게 ghMSC-CM에 의해 증가한 pAkt의 발현을 감소시켰다(도 3c). 이러한 결과는 IGF-1R을 경유한 IGFBP-4의 Akt 경로 유도 활성은 OGD로 손상된 일차 피질 뉴런의 유사교세포 중개 신경보호 효과에 주요한 역할을 함을 암시한다.
<3-2> 유사교세포 농축 배양액에서 미토콘드리아 내의 Bax 수준 확인
피질 뉴런에서 산소-포도당 결핍 환경(OGD)는 pro-apoptotic protein인 미토콘드리아의 Bax 수준을 증가시키고 세포질의 Bax 수준을 감소시킨다(도 3d 및 도 3e 참조). 따라서 유사교세포의 세포 자멸사 억제 효과를 확인하기 위해 상기 실험예 3-1에서 Bax(BD Pharmingen, San Jose, CA, USA), COX IV(Cell Signaling)의 1차 항체를 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법 및 조건으로 웨스턴 블랏팅을 수행하여 단백질의 발현량을 측정하였다.
그 결과, 유사교세포의 처리는 세포 자멸사(apoptosis)에 의해 유도된 Bax translocation을 방해하고, 유의미하게 OGD로 유도된 미토콘드리아 및 세포질 Bax의 발현을 대조군 수준으로 회복시켰다(도 3d 및 도 3e). 그러나 유사교세포의 처리 효과는 IGF-1 의존 IGFBP-4의 신경보호 신호전달 경로에 포함된 항-BP-4의 IGFBP-4 저해, wortmannin의 Akt 저해와 PPP의 IGF-1R 저해로 감소했다. 이러한 저해는 미토콘드리아 Bax의 발현 수준을 OGD 처리한 정도의 수준으로 만들었고, 감소된 세포질 Bax를 OGD 처리한 값으로 복귀시켰다(도 3d 및 도 3e).
이러한 결과는 IGFBP-4에 유도된 Akt 활성이 세포질에서 미토콘드리아로의 내생적 Bax 이동을 감소시켜 신경세포 생존을 증가시킨 것으로 보인다.
<3-3> 유사교세포 농축 배양액에서 세포 외부 IGF -1과 IGF -2 발현을 조절 확인
IGF-1 및 IGF-2에 대해 IGFBP-4가 높은 친화성을 갖고, IGFBP-4가 IGF-1 및 IGF-2의 활성을 시험관 내/생체 내에서 조절하므로, IGFBP-4가 OGD 처리된 1차 피질성 뉴런에서 세포 외부의 IGF-1 및 IGF-2의 발현을 조절하는지를 상기 실험예 2-2와 동일한 방법 및 조건으로 ELISA를 사용하여 확인하였다.
그 결과, 도 3f에 나타난 바와 같이, OGD 처리는 세포 외부의 IGF-1 및 IGF-2의 발현을 변화시키지 않았다. 그러나 OGD 처리 후 유사교세포의 처리는 세포 외부 IGF-1의 발현을 대조군 및 OGD 처리군에 비해 유의미하게 증가시켰다. 그러나 이러한 증가는 항-IGFBP-4 항체 처리에 의해 다시 원상 복귀되었다. 유사하게 OGD 처리 후 유사교세포의 처리는 IGFBP-4 저해(P<0.05) 후에 발현이 감소된 대조군보다 IGF-2의 세포 외부 발현을 증가시켰다. 이러한 결과는 유사교세포에서 높게 발현되는 IGFBP-4가 OGD 처리가 유도한 1차 피질성 뉴런의 손상에 대해 신경세포 보호 과정에서 세포 외부 IGF-1과 IGF-2 발현을 조절하는데 주요한 역할을 함을 암시한다.
< 실험예 4> 대뇌 경색(Cerebral infarction)에서 유사교세포의 신경보호 효과 확인
<4-1> 실험동물의 일시적 뇌경색 유발
뇌경색을 유발하기 위해 실험동물에 2시간 동안 일시적 경련을 일으켰다.
구체적으로, 270~300g의 수컷 Sprague-Dawley 랫트(Orient Bio, Seoul, Korea)를 사용했다. 7일 동안 신경 검사를 위해 적응 및 사전 훈련을 시행한 후 SD 랫트의 왼쪽 중뇌 동맥(MCA)을 뇌 내 필라멘트 기법을 사용하여 2시간 동안 폐색(occlusion)하였다. 쥐들은 30%의 산소와 70%의 아산화질소가 혼합된 이소플루란으로 마취되었다. thermistor-controlled heating pad에 의해 체온은 36.6±0.5℃로 유지되었다. 동맥 pH, pCO2, pO2, 헤마토크리트(hematocrit)는 혈액 분석 시스템을 사용하여 오른쪽 대퇴골 카테터에서 얻은 0.1ml 동맥혈로 측정되었다(International Technidyne, Edison, NJ, USA). 대퇴부 도관(femoral catheter)으로 동맥 압력을 모니터링하고, 데이터 획득 시스템과 실험실 컴퓨터(MacLab Bridge Amplifier, AD Instruments Pty Ltd., Castle Hill, Australia)를 사용하여 200/s의 샘플링 속도로 위상성 압력, 평균 동맥 압력(MAP), 심박수(HR)를 기록하였다. 폐색(occlusion)하고 2시간 후, 재관류(reperfusion)를 수행했다. 가짜 수술(sham surgery)은 왼쪽 공동 경동맥(common carotid artery)에 실을 삽입한 다음 바로 빼는 방식으로 진행되었다. 다른 가짜 수술 절차는 일시적인 MCAo의 경우와 동일했다. laser Doppler flowmeter (ALF21; Advance, Tokyo, Japan)와 피질 표면의 단층부에 단 2mm 측면의 작은 버러 구멍 (small-burr hole)을 통해 삽입한 wire-type probe (0.3 mm in diameter; Unique Medical, Tokyo, Japan)를 이용하여 국부 대뇌 혈류(rCBF)를 측정하여 caudate와 putamen의 허혈성 핵심 (Ischemic core)을 평가하였다. 일시적인 MCA 폐색 후 24시간 경과 후 MRI를 통해 뇌경색의 존재를 평가하였다.
<4-2> 뇌경색을 유발한 랫트 모델에서 유사교세포 이식에 의한 뇌경색 치료 효과 확인
뇌경색에 유사교세포 이식에 의한 치료 효과를 측정하기 위해, 뇌경색을 유발하고 1일 후 및 4주 후 쥐들을 희생하여 뇌를 MRI로 촬영하고, 장기적인 신경학적 행동 결과를 평가하였다.
구체적으로, 뇌경색에 대한 유사교세포 이식에 의한 치료 효과를 측정하기 위해, 뇌경색 SD 랫트 모델을 4개의 군으로 나누었다. 첫 번째 그룹은 대조군으로 사용되었고, 두 번째 그룹은 인간 중간엽 줄기세포(hMSC)로 처리한 군, 세 번째 군은 유사교세포로 처리한 군 및 마지막 군은 유사교세포와 항-BP4 항체(100 ㎍/ml)를 함께 처리한 군이다. 최종적으로 20만 개 세포를 10㎕의 NB 배지에 넣고 랫트 뇌의 옆쪽에 이식하였다.
모든 MRI 이미지들은 47mm의 ds 현미경 코일을 지닌 3-테슬라의 MR 기계를 사용하여 얻어졌다. 쥐들은 희생되고, 그들의 뇌는 분자 생물학적 측정을 위해 사용되었다.
4개의 군의 랫트에 대해 신경학적인 결과를 beam-walking 테스트와 sticky-tape 테스트를 이용하여 신경 행동 기능을 매주 평가하였다. 이는 일시적으로 중뇌 동맥 폐색(MCAo) 전과, 세포 이식 후 1주, 2주, 3주, 및 4주 후에 실험군에 대해 모르는 조사관에 의해 수행되었다.
Beam walking 테스트를 위해, 쥐들은 중뇌 동맥 폐색(MCAo) 3일 전에 나무로 만들어진 beam을 걷는 훈련을 받았다. 이는 바닥으로부터 60cm 떨어진 곳에 설치되었고, 그들의 집으로 돌아가기 위해 설치된 beam이다. 0점은 beam을 발의 미끄러짐 없이 횡단했을 때, 1점은 beam의 옆쪽을 쥐고 횡단했을 때, 2점은 횡단하긴 했으나 beam 위에서 걷는 게 불가능해 보였을 때, 3점은 걷는 것에 어려움이 있어 beam을 횡단하는데 상당한 양의 시간이 걸렸을 때, 4점은 beam을 건너는 게 불가능하였을 때, 5점은 beam 위에서 몸을 움직이는 게 불가능하거나 사지를 움직이는 게 불가능 했을 때, 6점은 beam 위에서 10초 동안 머무르는 게 불가능했을 때로 점수화하였다.
변형된 Sticky tape 테스트는 초록색 종이테이프의 3cm 되는 조각을 이용하여 소매를 만들어 수행되는데, 1cm의 폭과 앞발의 주변에 감싸서 테이프가 스스로 붙게 하고 손가락들을 소매로부터 약간 돌출되게 하였다. 쥐들에게서 전형적인 반응은 테이프를 제거하기 위해 입을 사용하여 테이프를 당기거나 혹은 반대쪽의 발을 이용해 테이프를 떼어내려 비비는 행동을 한다. 테이프 부착 이후, 쥐는 케이지에 두고 30초 동안 관찰하였다. 타이머는 쥐가 테이프를 제거하기 위해 노력할 동안 켰다. 테스트는 테스트 한 날마다 3번 반복하고, 가장 높은 두 점수를 평균 냈다. 운동 테스트 데이터는 지속시간과 오른쪽/왼쪽 비율의 평균값을 나타냈다.
그 결과, 도 4b에 나타난 바와 같이, MRI에서 뇌경색 유도 후 1일 후에 유사교세포(ghMSC)를 주사하면 경색 부피(infarct volume)가 50% 이상 현저히 감소했으며 유사교세포(ghMSC)의 효과는 인간 중간엽 줄기세포(hMSCs)보다 약 20% 높았다. 이러한 효과는 항-BP-4 항체에 의해 거의 완전히 차단되었다.
또한, 도 4c에 나타난 바와 같이, 신경작용 기능은 유사교세포(ghMSC)로 처리된 그룹에서 현저하게 개선되었다. beam-walking 테스트에서 유사교세포(ghMSC)를 이용한 치료는 세포주입 후 3주 차에 신경 행동적 향상을 보이는 평균성능점수를 0.6점으로 극적으로 낮췄고, 이러한 변화는 항-BP-4 항체로 차단되었다. sticky-tape 테스트에서 유사교세포(ghMSC)로 치료한 쥐는 사지에서 끈적한 테이프를 제거하는 데 걸리는 시간을 40초로 줄였지만, 이 감소는 항-BP-4 항체로 처리한 경우 사라졌다.
< 실험예 5> ghMSC에 의해 보호된 뇌에서 PI3K / Akt 경로의 IGFBP -4 매개 활성화를 생체 내 모델에서 확인
상기 실험예 3에서 시험관 내(in vitro)에서 유사교세포에 의해 IGFBP-4에 의해 PI3K/Akt 경로가 활성화됨을 확인하였다. 이에 생체 내 랫트 모델에서도 유사교세포에 의해 IGFBP-4에 의해 PI3K/Akt 경로가 활성화되는지 여부를 확인하였다.
상기 실험예 4에서 사용된 4종류 군마다 5마리의 랫트가 면역 조직 화학염색 분석에 사용되었다. PBS로 관류된(perfused) 랫트의 뇌는 4% 파라포름알데히드(PFA)로 관류되었다. 그리고 뇌를 빠르게 제거하여 4% 파라포름알데히드(PFA)에 하루 동안 고정하고, 30% 설탕 용액에 3일 동안 배양하였다. 뇌 조직은 optimal cutting temperature(OCT) compound(Leica, Wetzlar, Germany)를 이용하여 마운팅을 하고, motorized cryostat( Leica, Wetzlar, Germany)를 이용하여 20㎛ 두께로 뇌 절편을 제작하였다. 뇌 조직은 Mito Silane 코팅 슬라이드에 3% 과산화수소를 처리하여 뇌 조직 내부 과산화효소 활동을 저지시켰다. 조직은 pAKT(1:500), p-ERK(1:500), 절단된 caspase-3(1:500; Cell signaling), Bcl-xl(1:250; Cell Signaling), Bax(1:100; Abcam), cytochrome C (1:500; Santa Cruz Biotechnology), 및 NeuN (1:500; Millipore, MA, USA)를 10% FBS 블로킹 용액에 희석하여 4℃에서 하룻밤 동안 염색을 진행하였다. 염색된 조직을 PBS로 수차례 세척 후, 5% FBS로 잔여 일차 항체를 세척하였다. tetramethylrhodamineisothiocyanate (TRITC) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 또는 fluorescein isothiocyanate (FITC) (Invitrogen) 에 부착된 이차 항체를 반응시켰다. 조직은 DAPI mounting solution (Vector Laboratories, H-500)로 마운팅이 되었고, 형광 현미경(Olympus, Center Valley, PA, USA)으로 형광을 확인하였다.
각 군의 쥐는 안락사시키고, 뇌 조직은 PBS로 관류하여 -80℃에 보관하였다. 언 뇌 조직은 차가운 플레이트에서 microdissect 하였다. 조직은 RIPA II cell lysis 완충용액(100mM Na 3VO 4, 100mM PMSF, 100mM NaF 및 프로테아제 억제제) 및 Q55 소니케이터(Qsonica, Melville, NY, USA)로 균질화하였다. 같은 양의(40㎍) 단백질은 25분 동안 12% SDS-PAGE로 분리하고, 나이트로셀룰로오스 막으로 1시간 30분 동안 이동시켰다. Akt(1:500), ERK(1:500; Cell Signaling), NeuN(1:200; Abcam, UK), Bax(1:500; Cell Signaling), pAkt(1:200), p-ERK(1:500; Cell Signaling), 및 절단된 caspase-9(1:500; Cell Signaling)에 대한 일차 항체는 2% 스킴 밀크 블로킹 용액에 희석하였다. 하루 동안 배양하고, 항-토끼 또는 항-마우스 HRP가 결합된 이차 항체(1:2000, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)를 처리하여 용액 A 및 용액 B(West-Q Chemiluminescent Substrate Kit, GenDEPOT)로 검출하였다.
그 결과, 도 5a 내지 도 5f에 나타난 바와 같이, 유사교세포가 주입된 뇌에서 인산화된 Akt(pAkt)와 Bcl-xl은 두 배 이상 유의미하게 증가하였고, cytochrome c, Bax 및 절단된 caspase-3는 10% 미만으로 현저하게 감소하였다. 그러나 이러한 유사교세포(ghMSC)가 유도한 변화는 항-BP-4 항체에 의해 현저히 감소하였다(도 5a 내지 도 5f)
또한, 도 6에서 나타난 바와 같이, 웨스턴 블랏팅에서 NeuN(neuronal marker) 및 pAkt 발현이 유사교세포가 이식된 뇌에서 두 배 이상 증가하였다. 그리고 Bax 및 절단된 caspase-9는 유사교세포주입에 따라 감소하였다(도 6). 이러한 효과는 항-BP-4 항체와 같이 주입 시 감소했다. 상기 결과는 IGFBP-4가 뇌경색에 대한 유사교세포의 신경보호 효과에 대해 핵심적인 역할을 한다는 것을 보여준다.

Claims (13)

  1. 유사교세포(glia-like cell)로 분화 유도된 후기 단계(late-passage)의 인간 중간엽 줄기세포(ghMSC)를 유효성분으로 함유하는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유사교세포는 희소 돌기 아교 세포(oligodendroglia), 성상 아교 세포(astrocyte), 미세 아교 세포(microglia) 및 방사 신경교세포(radial glia)로 구성된 군으로부터 어느 하나 이상인 것인, 뇌졸중 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 뇌졸중은 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke) 또는 출혈성 뇌졸중(hemorrhagic stroke)인 것인, 뇌졸중 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 후기(late-passage) 인간 중간엽 줄기세포는 10 내지 15 passage인 것인, 뇌졸중 치료용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 ghMSC는 골수, 지방조직, 혈액, 제대혈, 간장, 피부, 위장관, 태반 및 자궁으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 유래되는 것인, 뇌졸중 치료용 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 ghMSC는 IGFBP-4(insulin-like growth factor binding protein-4)를 방출하는 것인, 뇌졸중 치료용 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 ghMSC는 IGF-1R을 경유한 IGFBP-4의 PI3K/Akt 경로 활성화에 의해 뇌졸중을 치료하는 것인, 뇌졸중 치료용 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 ghMSC는 6×10 5 내지 6×10 7 세포/㎏으로 투여되는 것인, 뇌졸중 치료용 약학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 ghMSC는 세포 치료제로 사용되는 것인, 뇌졸중 치료용 약학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 ghMSC는 비경구로 투여되는 것인, 뇌졸중 치료용 약학적 조성물.
  11. 1) 인간 중간엽 줄기세포를 배양하여 후기(late-passage) 인간 중간엽 줄기세포를 얻는 단계;
    2) 상기 단계 1)에서 얻은 후기 인간 중간엽 줄기세포를 10% FBS 및 1mM β-머캅토에탄올을 함유하는 DMEM 배지로 22 내지 26시간 동안 1차 배양하는 단계;
    3) 10% FBS 및 0.28 ㎍/㎖ 트레티노인(all-trans-retinoic acid)을 함유하는 DMEM 배지로 68 내지 76시간 동안 2차 배양하는 단계; 및
    4) 10% FBS, 10ng/㎖ bFGF(basic Fibroblast Growth factor), 5ng/㎖ PDGF-AA, 10μM 포스콜린(Forskolin) 및 200ng/㎖ HRG-β1 (Heregulin-β1)을 함유하는 DMEM 배지로 8일 동안 3차 배양하는 단계; 를 포함하는 유사교세포로 분화 유도된 후기 단계의 인간 중간엽 줄기세포(ghMSC)의 제조 방법.
  12. 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 후기 단계의 유사교세포(ghMSC)을 유효성분으로 함유하는 개체 내 IGFBP-4(insulin-like growth factor binding protein-4) 전달용 조성물.
  13. 유사교세포(glia-like cell)로 분화 유도된 후기 단계(late-passage)의 인간 중간엽 줄기세포(ghMSC)를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌졸중의 치료 방법.
PCT/KR2020/011244 2019-08-22 2020-08-24 유사교세포로 분화 유도된 후기 단계의 인간 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물 WO2021034162A1 (ko)

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