KR100973324B1 - 사람 중간엽 줄기세포에서 운동 신경세포로의 분화 유도방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 조성물이 최적화된 배지에서 배양함으로써 골수 내에 존재하는 중간엽 줄기세포를 성숙한 신경세포 및 운동 신경세포로 분화시키는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 최적화된 배지에서 배양함으로써 골수 내에 존재하는 중간엽 줄기세포를 성숙한 신경세포 및 운동 신경세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다. 상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 방법으로 중간엽 줄기세포를 운동 신경세포로 효과적으로 분화시킴으로써 신경 질환의 치료를 위한 신경세포 또는 운동 신경세포를 제공할 수 있다.

중간엽 줄기세포, 신경세포로의 분화, 운동 신경세포

Description

사람 중간엽 줄기세포에서 운동 신경세포로의 분화 유도 방법{Method for inducing differentiation of human mesenchymal stem cells into motor neurons}

본 발명은 조성물이 최적화된 배지에서 배양함으로써 골수 내에 존재하는 중간엽 줄기세포를 성숙한 신경세포 및 운동 신경세포로 분화시키는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 최적화된 배지에서 배양함으로써 골수 내에 존재하는 중간엽 줄기세포를 성숙한 신경세포 및 운동 신경세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

세포 대체 요법을 위해 성체 줄기세포를 이용하는 경우에 있어서, 골수에 존재하는 중간엽 줄기세포로부터 신경세포를 분화시켜 사용할 수 있다면 세포 공급 문제를 해결할 수 있을 뿐만 아니라 자가 골수를 이용하므로 면역 거부 반응을 포함한 치료상의 문제점도 해결할 수 있는 이점을 갖는다. 이전까지 한 종류의 줄기세포는 특정 계통에 속하는 조직 세포들만으로 분화되는 것으로 여겨져 왔다. 중간엽 줄기세포의 경우에는 혈청과 혈소판 유래 성장인자(platelet-derived growth factor), 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor), TGF- β(transforming growth factor-β) 또는 EGF 등을 포함한 여러 가지 성장인자들의 존재 하에서 생체외 군집(in vitro colonies)을 형성할 수 있으며, 대략 초기 부착 세포의 1/3 정도가 다분화능력을 지니고 있어 골아세포, 연골아세포, 지방세포 등의 결합조직 세포로 분화할 수 있다고 보고되어 있다. 또한, 페라리 등은 골수가 새로운 근육을 형성할 수 있는 근형성 전구세포(myogenic precursor cell)의 원천이라고 보고하였다(Ferrari G et al ., Science 279:1528, 1998).

또한, 최근 일련의 연구들은 이처럼 결합조직으로만 분화되는 것으로 여겨져 왔던 중간엽 줄기세포가 신경 계통 세포들로 분화될 수 있음을 보고하고 있다. 예를 들어 산체스 등(Sanchez-Ramos et al., Exp Neurology 164:247-256, 2000)은 레티논산(retinoic acid)과 BDNF(brain-derived neurotrophic factor)을 첨가하여 배양하였을 때 골수 중간엽 줄기세포로부터 신경세포 및 성상교세포가 분화됨을 보고하고 있고, 데일 우드베리 등(Dale Woodbury et al ., J Neuro Res 61:364-370, 2000)은 β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol) 또는 DMSO(dimethyl sulfoxide)와 같은 항산화 물질이 골수 중간엽 줄기세포를 신경세포로 분화시킬 수 있음을 보고한 바 있다.

그러나, 중간엽 줄기세포로부터 신경세포를 분화시켜 사용하는 것엔 아직 여러 가지 한계가 있다. 즉, 다양한 화합물을 포함한 DMEM 배지로 분화를 유도시킬 수 있었으나, 그 결과의 재현성이 낮을 뿐만 아니라 신경세포로의 분화의 표지가 발현되지 않았다. Zhao 등(Zhao et al ., Exp Neurol, 190, 396-406, 2004)은 2회에 걸친 전-유도 방식을 도입하여 안정적인 신경세포 분화를 시도하였다. 그리하 여 이전의 시도에 비해 분화의 정도가 좋아졌으나 분화 유도시간이 24시간으로 길고 신경세포로의 분화의 표지가 성숙신경 세포로 분화되었다고 보기에 충분한 정도로 발현되지 않았다.

이에, 본 발명자들은 2회에 걸친 전-유도 방식을 도입하고, 유도배지를 최적화한 결과, 성숙 신경세포 분화표지의 발현을 관찰하여 재현성 있게 중간엽 줄기세포로부터 신경세포를 분화시킬 수 있을 뿐만 아니라 운동 신경세포 분화 표지 분자의 발현을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 최적화된 운동 신경세포 유도배지 및 배양방법을 이용하여 중간엽 줄기세포로부터 신경세포뿐만 아니라 나아가 운동 신경세포로의 재현성 높은 분화를 이루어 세포치료에 이용할 수 있는 신경세포를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

1) 중간엽 줄기세포를 β-머캅토에탄올이 0.5 내지 3 mM 포함된 배지에서 2회에 나누어 전-유도하는 단계;

2) 단계 1)의 전-유도된 중간엽 줄기세포를 레티논산(retinoic acid) 및 포스콜린(forskolin)을 포함하는 1차 운동 신경세포 분화 유도배지로 1.5일 내지 2.5일 동안 1차 분화 유도하는 단계;

3) 단계 2)의 1차 분화 유도된 중간엽 줄기세포를 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor; 이하, bFGF), 레티논산, 포스콜린을 포함하는 2차 운동 신경세포 분화 유도배지로 1.5일 내지 2.5일 동안 2차 분화 유도하는 단계; 및,

4) 단계 3)의 2차 분화 유도된 중간엽 줄기세포를 염기성 섬유아세포 성장인자, 레티논산, 포스콜린 및 SHH(sonic hedgehog)를 포함하는 3차 운동 신경세포 분화 유도배지로 3일 내지 5일 동안 3차 분화 유도하는 단계를 포함하는 운동 신경세 포 분화 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 전-유도된 중간엽 줄기세포를 운동 신경세포로 분화하도록 유도하는 레티논산 및 포스콜린을 포함하는 1차 운동 신경세포 분화 유도배지, bFGF, 레티논산 및 포스콜린을 포함하는 2차 운동 신경세포 분화 유도배지 및 염기성 섬유아세포 성장인자, 레티논산, 포스콜린 및 SHH를 포함하는 3차 운동 신경세포 분화 유도배지를 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 방법으로 분화된 운동 신경세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 운동 신경세포를 포함하는 퇴행성 신경질환 치료제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 운동 신경세포를 퇴행성 신경질환에 걸린 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 상기 환자의 퇴행성 신경질환의 치료방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 운동 신경세포를 퇴행성 신경질환의 치료제의 제조에 사용하는 용도를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 1) 중간엽 줄기세포를 β-머캅토에탄올이 0.5 내지 3 mM 포함된 배지에서 2회에 나누어 전-유도하는 단계;

2) 단계 1)의 전-유도된 중간엽 줄기세포를 레티논산(retinoic acid) 및 포스콜린(forskolin)을 포함하는 1차 운동 신경세포 분화 유도배지로 1.5일 내지 2.5 일 동안 1차 분화 유도하는 단계;

3) 단계 2)의 1차 분화 유도된 중간엽 줄기세포를 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor; 이하, bFGF), 레티논산, 포스콜린을 포함하는 2차 운동 신경세포 분화 유도배지로 1.5일 내지 2.5일 동안 2차 분화 유도하는 단계;

4) 단계 3)의 2차 분화 유도된 중간엽 줄기세포를 염기성 섬유아세포 성장인자, 레티논산, 포스콜린 및 SHH(sonic hedgehog)를 포함하는 3차 운동 신경세포 분화 유도배지로 3일 내지 5일 동안 3차 분화 유도하는 단계로 이루어진 운동 신경세포 분화 방법을 제공한다.

상기 중간엽 줄기세포는 바람직하게는 인간의 골수로부터 분리하여 사용할 수 있는데, 골수에서 단핵세포를 분리한 후 이들을 1 내지 2주간 배양하면 분화되기 쉬운 조혈 줄기세포는 모두 분화되어 성숙한 혈구 세포들을 만들기 때문에 남아 있는 무한 증식 세포인 줄기세포만을 분리하는 방법에 의해서 손쉽게 중간엽 줄기세포만을 얻을 수 있다. 아울러, 골수에서 분리한 단핵세포에서 중간엽 줄기세포를 분리해내지 않고, 중간엽 줄기세포를 포함하는 단핵세포들 전체를 본 발명의 방법에 따라 배양하여도 신경세포의 대량 생산이라는 동일한 효과를 얻을 수 있다.

단계 1)의 전-유도는 β-머캅토에탄올의 농도를 높여가면서 2회에 걸쳐 수행하는 것이 바람직하고, 첫 번째 전-유도에 비해 두 번째 전-유도시 β-머캅토에탄올의 농도가 1.5 내지 2배 증가하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 2배 증가한다.　 또한, 두 번째 전-유도 시간은 첫 번째 전-유도 시간의 1/4 내지 1/8로 단 축시키는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 1/8로 단축하는 것이 바람직하다.

단계 2)의 1차 운동 신경세포 분화 유도배지는 레티논산을 0.8 내지 1.2 μM 포함하고, 포스콜린을 4 내지 6 μM 포함하는 것이 바람직하고, 레티논산을 1 μM, 포스콜린을 5 μM 포함하는 것이 가장 바람직하다. 단계 2)의 1차 분화 유도는 1.5일 내지 2.5일 동안 수행할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1.8일 내지 2.2일이며, 2일 동안 수행하는 것이 가장 바람직하다.

단계 3)의 2차 운동 신경세포 분화 유도배지는 bFGF를 8 내지 12 ng/㎖ 포함하고, 레티논산은 0.8 내지 1.2 μM 포함하고, 포스콜린을 4 내지 6 μM 포함하는 것이 바람직하고, bFGF를 10 ng/㎖, 레티논산을 1 μM, 포스콜린을 5 μM 포함하는 것이 가장 바람직하다. 단계 3)의 2차 분화 유도는 1.5일 내지 2.5일 동안 수행할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1.8일 내지 2.2일이며, 2일 동안 수행하는 것이 가장 바람직하다.

단계 4)의 3차 운동 신경세포 분화 유도배지는 bFGF를 8 내지 12 ng/㎖ 포함하고, 레티논산은 0.8 내지 1.2 μM 포함하고, 포스콜린을 4 내지 6 μM 포함하며, SHH(sonic hedgehog)를 4 내지 6 nM 포함하는 것이 바람직하고, bFGF를 10 ng/㎖, 레티논산을 1 μM, 포스콜린을 5 μM, SHH를 5 nM 포함하는 것이 가장 바람직하다. 단계 4)의 3차 분화 유도는 3일 내지 5일 동안 수행할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 3.5일 내지 4.5일이며, 4일 동안 수행하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 방법에 의해 중간엽 세포를 유사 운동 신경세포로 분화시키는 데 성공하였고, 상기 분화된 유사 운동 신경세포를 상기 화합물들이 포함되지 않은 기 본배지에서 4일간 배양한 후에도 상기 분화상태를 유지하는 것을 확인하였다(도 1 참조). 또한, 상기 분화상태를 여러 신경세포 표지, 신호전달 표지 및 운동 신경세포 표지를 이용하여 RT-PCR의 방법으로 확인한 결과, 신경세포 표지 인자인 NF-L(neurofilament 68 kDa), NF-M(neurofilament 160 kDa) 및 NF-H(neurofilament 200 kDa) 중 NF-L 및 NF-M이 미처리 대조군에 비해 더욱 많이 발현되며(도 2 참조), 운동 신경세포 표지인 Islet-1도 유사하게 증가한 것을 확인하였다(도 5 참조). 아울러, 본 발명의 방법에 의한 처리 후 기본 배지에서 추가로 배양한 후에도 NF-L, NF-M 및 Islet-1의 발현량이 유지되는 것을 확인하였다(도 2 및 도 5 참조).

또한, 레티논산 하위 신호분자인 RAR-α(retinoic acid receptor-α), RAR-β(retinoic acid receptor-β)의 발현이 증가하는 것으로 보아 중간엽 줄기세포가 레티논산의 영향을 받는 것을 알 수 있었으며(도 3 참조), SHH(sonic hedgehog)의 하위 분자인 Smo(smoothened, seven-pass G-protein-coupled receptor), Gli2(Glioma-associated oncogene homologue family-2), Gli3(Glioma-associated oncogene homologue family-3)의 발현양상이 증가하는 것으로 SHH(sonic hedgehog)의 신호를 받아 중간엽 줄기세포가 운동 신경세포로 분화하는데 기여하는 것을 알 수 있었다(도 4 참조).

아울러, 세포면역형광화학법(immunofluorescence cytochemistry method)으로 중간엽 줄기세포가 신경세포로 분화하여 신경세포 표지인 NF-M 단백질의 발현을 확인할 수 있었고, 기본 배지에서도 신경세포 분화를 유지하는 것을 확인할 수 있었다(도 6 참조).

레티논산(retinoic acid)은 발생과정에서 축엽중배엽(paraxial mesoderm)에서 발현되며 class I과 class II 호메오도메인(homeodomain) 단백질의 발현을 조절하고, 복측 신경 아형(ventral neuronal subtype)의 분화를 촉진시킨다.

또한, 포스콜린(forskolin, 7 beta-acetoxy-8, 13-epoxy-1 alpha, 6 beta, 9 alpha-trihydroxy-labd-14-ene-11-one)은 아데닐사이클라제(adenylcyclase)를 활성화하고 순환 AMP의 양을 증가시킴으로 세포 수용체를 자극한다. cAMP는 중요한 신호 전달체로서 호르몬에 대한 세포의 적절한 반응에 필요하고, 세포 생존과 분화에 필요한 단백질 전사를 활성화하는 기전에도 중요한 역할을 한다.

또한, 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor; 이하, bFGF)는 발생과정에서 결절(node)과 전 체절 중배엽(presomitic mesoderm)에서 발현되며 레티논산과 함께 신경세포의 특성화를 조절한다.

아울러, SHH(sonic hedgehog)은 발생과정에서 척삭(notochord)과 바닥판(floor plate)에서 발현되며, 척추동물의 기관형성(organogenesis)에 중요하고, 발생과정의 뇌, 척수에서 모르포겐(morphogen)으로 작용한다. 척수의 발생 진행과정에서 접합 축색돌기(commissural axon)를 끌어당기는 축색돌기 지시 단서(axonal guidance cue)로 작용할 뿐만 아니라 성체에서 성체 줄기세포의 세포 분열을 조절하고, bFGF 및 레티논산과 함께 운동 신경세포 분화에 기여한다.

또한, 본 발명은 전-유도된 중간엽 줄기세포를 운동 신경세포로 분화하도록 유도하는 레티논산 및 포스콜린을 포함하는 1차 운동 신경세포 분화 유도배지, bFGF, 레티논산, 포스콜린을 포함하는 2차 운동 신경세포 분화 유도배지 및 염기성 섬유아세포 성장인자, 레티논산, 포스콜린 및 SHH를 포함하는 3차 운동 신경세포 분화 유도배지를 포함하는 운동 신경세포 분화 유도배지를 제공한다.

상기 1차 내지 3차 운동 신경세포 분화 유도배지는 순차적으로 적정한 기간 동안 사용될 때에 상기 전-유도된 중간엽 줄기세포를 운동 신경세포로 분화시킬 수 있다. 상기 배지들의 사용 순서가 바뀌거나 상기 배지들 중 하나 이상의 사용을 수행하지 않을 경우 원하는 운동 신경세포로의 분화를 방해할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 방법으로 분화된 운동 신경세포를 제공한다.

본 발명의 방법에 의해 중간엽 세포의 분화를 유도한 결과, 운동 신경세포 표지인 Islet-1이 유의하게 증가하였고, 본 발명의 방법에 의한 처리 후 기본 배지에서 추가로 배양한 후에도 Islet-1의 발현량이 유지되는 것을 확인함으로써 운동 신경세포로 분화한 것을 확인하였다(도 5 참조).

또한, 본 발명은 상기 운동 신경세포를 포함하는 퇴행성 신경질환 치료제를 제공한다.

상기 퇴행성 신경질환은 운동 신경세포의 손상과 사멸로 생기는 질환으로써, 이에는 근육위축가쪽경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 척수손상(spinal cord injury), 파킨슨씨병, 알츠하이머, 피크병(Pick's disease), 헌팅톤 병(Huntington's disease) 및 외상성 중추 신경계 질환(traumatic central nervous system diseases) 등이 있다.

본 발명의 치료제는, 당업자에게 공지의 방법으로 제제화하는 것이 가능하다. 예를 들면, 필요에 따라서 물 혹은 그 이외의 약학적으로 허용할 수 있는 액과의 무균성 용액, 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 약리학상 허용되는 담체 혹은 매체, 구체적으로는, 멸균수나 생리 식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 부형제, 비히클(vehicle), 방부제, 결합제 등과 적당히 조합하여, 일반적으로 인정된 제약 실시에 요구되는 단위 용량 형태로 혼화하는 것에 의해 제제화하는 것을 생각된다. 상기 제제에 있어서 유효 성분량은 지시받은 범위의 적당한 용량을 얻을 수 있도록 하는 것이다. 또한, 주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 부형액을 이용해 통상의 제제 실시에 따라 처방할 수가 있다.

주사용의 수용액으로서는, 예를 들면 생리 식염수, 포도당이나 그 외의 보조약을 포함한 등장용액, 예를 들면 D-소르비톨, D-만노스, D-만니톨, 염화 나트륨을 들 수 있어 적당한 용해 보조제, 예를 들면 알코올, 구체적으로는 에탄올, 폴리 알코올, 예를 들면 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리소르베이트 80(TM), HCO-50으로 병용할 수 있다.

유성액으로서는 참기름, 콩기름을 들 수 있어 용해 보조제로서 안식향산벤질, 벤질 알코올과 병용할 수 있다. 또한, 완충제, 예를 들면 인산염 완충액, 초산나트륨 완충액, 무통화제, 예를 들면, 염산 프로 카인, 안정제, 예를 들면 벤질 알코올, 페놀, 산화 방지제와 배합할 수 있다. 조제된 주사액은 통상, 적당한 앰플에 충전시킨다.

환자의 체내에의 투여는 바람직하게는 비경구투여이며, 구체적으로는 정맥에의 1회 내지 3회의 투여가 기본이지만 그 이상의 투여라도 좋다. 또, 투여 시간은 단시간이라도 장시간 지속 투여라도 좋다. 더욱 구체적으로는, 주사제형, 경피투여형등을 들 수 있다. 주사제형의 예로서는 예를 들면, 정맥내 주사, 동맥내 주사, 선택적 동맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하주사, 뇌실내 주사, 뇌내 주사, 골수액강내 주사 등에 의해 투여할 수가 있지만, 바람직하게는 정맥내 주사이다. 정맥내 주사의 경우, 통상의 수혈의 요령에서의 이식이 가능해져 환자를 수술할 필요가 없고, 나아가 국소 마취도 필요 없기 때문에, 환자 및 의사 쌍방의 부담이 가볍다. 또 병동에서의 이식 조작이 가능한 점으로써 매우 적합하다. 장래의 구급의료의 발전을 고려하면, 구급 반송중, 혹은 발증 현장의 투여도 생각할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 운동 신경세포를 퇴행성 신경질환에 걸린 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 상기 환자의 퇴행성 신경질환의 치료방법을 제공한다.

상기 운동 신경세포의 치료적 유효량은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 1×10⁴ cell/㎏ 내지 1×10⁸ cell/㎏인 것이 바람직하고, 1×10⁵ cell/㎏ 내지 1×10⁷ cell/㎏인 것이 더욱 바람직하고, 5×10⁵ cell/㎏ 내지 5×10⁶ cell/㎏인 것이 가장 바람직하다.

상기 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 비경구투여 방법이라면 어느 것이나 사용 가능하고, 전신 투여 또는 국소 투여가 가능하나, 전신 투여가 더 바람직하며, 정맥내 투여가 가장 바람직하다.

아울러, 본 발명은 상기 운동 신경세포를 퇴행성 신경질환의 치료제의 제조에 사용하는 용도를 제공한다.

퇴행성 신경질환의 치료에 있어서, 본 발명의 방법에 의해 골수에 존재하는 중간엽 줄기세포로부터 운동 신경세포를 분화시켜 사용함으로써 세포 공급 문제 및 면역 거부 반응을 포함한 치료상의 문제를 해결할 수 있는 이점을 갖는다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 방법으로 중간엽 줄기세포를 운동 신경세포로 효과적으로 분화시킴으로써 신경 질환의 치료를 위한 신경세포 또는 운동 신경세포를 제공할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 신경세포 분화의 재현

<1-1> 인간 중간엽 줄기세포( human mesenchymal stem cell ; hMSC )의 배양

저온 보관된 중간엽 줄기세포(Poietics Normal Human Mesenchymal Stem Cells)는 Cambrex(USA)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 상기 중간엽 줄기세포는 기본 배지(MSCGM, 500 ㎖; Cambrex, USA)와 성장 보충제로 구성된 MSC 성장 배지(중간엽 세포 성장 보충제, 10 ㎖ 200 mM L-glutamine, 0.5 ㎖ 페니실린-스트렙토마이신 혼합물; Cambrex, USA)로 2 계대를 배양한 후, 10% FBS(Gibco, USA)와 100 ng/㎖ 페니실린, 100 U/㎖ 스트렙토마이신이 함유된 DMEM(Gibco, USA) 배지로 37℃, 5% CO₂의 배양기에서 배양하였다. 배양기에서 3일 동안 배양한 후, 배지를 제거하고 인산완충용액(phosphate-buffered saline, PBS)으로 세척하여 남아있는 여분의 배지를 제거하였다. 0.1% 트립신/EDTA(Gibco, USA)으로 세포를 떼어내고 새로운 배지로 1:3으로 희석하여 계대 배양하였다.

<1-2> hMSC 의 신경분화 유도

중간엽세포는 계대 배양하는 동안 DMEM 배지에 10% FBS와 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 일반 배지에서 배양하였다. 신경분화를 위해 1 mM β-머캅토에탄올(Sigma, USA)이 포함된 일반 배지로 24 시간 동안 키운 후, 2 mM β-머캅토에탄올이 포함된 일반 배지로 바꿔주고 3 시간 동안 배양하여 전-유도를 수행하였다. 전-유도 후에 1 μM 레티논산(retinoic acid; Sigma, USA), 5 μM 포르스콜린(forskolin; Sigma, USA)을 포함한 배지로 2일 동안 분화시켰고, 1 μM 레티논 산, 5 μM 포르스콜린, 10 ng/㎖ bFGF(Peprotech, USA)이 포함된 배지로 2일 동안 분화시킨 후, 마지막으로 1 μM 레티논산, 5 μM 포르스콜린, 10 ng/㎖ bFGF, 5 nM Shh(sonic hedgehog; R&D systems, USA)가 포함된 배지를 넣은 운동 신경세포유도배지(motor neuronal induction media; MNIM)로 바꿔준 후 4일 동안 배양하여 중간엽 세포를 유사운동 신경세포로 분화시켰고, 이 후, 운동 신경세포 유도를 위한 화합물이 포함되지 않은 기본 배지로 4일 동안 배양하여 분화조건이 유지되는지 확인하였다(MNIM+CM 군). 기본 배지(기본배지: complete media, CM)에서 계속 배양한 미처리 군을 대조군으로 사용하였다.

그 결과, MNIM 처리군의 세포가 신경세포 유사 형태로 변하는 것을 관찰할 수 있었고, 기본 배지로 바꾸어 배양하여도 신경세포 유사 형태가 유지되는 것을 관찰하였다(도 1).

< 실시예 2> 신경분화 확인

<2-1> RT - PCR 을 통한 신경분화 표지의 확인

실시예 1-2의 방법으로 수득한, 미처리 대조군, MNIM 처리군, MNIM+CM 처리군 중간엽 줄기세포로부터 트리졸 용액(Invitrogen, USA)을 이용하여 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA 2 ㎍를 MMLV 역전사효소(MMLV reverse transcriptase, MMLV RTase; Promega, USA)를 이용하여 역전사(reverse transcription, RT) 반응을 수행하였다. 더욱 상세하게는, 0.5 ㎍ 올리고(dT) 프라이머, 2.5 mM dNTPs, 5× MMLV 완충용액, RNase 억제제, MMLV RTase를 이용하여 50 ㎕ 부피로 수행하였다. 상기 RT 산물을 주형 DNA로 하고, 표 1의 프라이머 쌍을 이용하여 94℃ 5분, 94℃ 45초, 55-65℃ 45초, 72℃ 45초, 35-40회 반복, 74℃ 7분의 조건으로 PCR 증폭기(Bio-Rad, USA)를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 음성 대조군으로는 RT 산물 대신에 물을 이용하였고, PCR의 정확도와 동일한 배분을 위해 Taq 중합효소, 2.5 mM dNTPs, 표 1의 프라이머 쌍과 10X 완충용액이 포함된 마스터 믹스를 만들어서 각 반응 튜브에 나눠 담고, 주형으로 상기 RT-산물 혹은 물을 첨가하여 PCR을 수행하였다. 상기의 반응 완료 후 생성된 PCR 산물을 1.5%-2% 아가로스 젤 상에서 전기영동 하였고, 트랜스일루미네이터를 이용하여 밴드의 크기를 확인하였다.

PCR 프라이머 쌍

이름		시퀀스	산물 크기
인간 NF-L	정방향	TCCTACTACACCAGCCATGTC (서열번호 1)	285bp
	역방향	TCCCCAGCACCTTCAACTTTC (서열번호 2)
인간 NF-M	정방향	TGGGAAATGGCTCGTCATTTG (서열번호 3)	333bp
	역방향	CTTCATGGAAACGGCCAATTC (서열번호 4)
인간 NF-H	정방향	CAGCTGCGAGAATACCAG (서열번호 5)	273bp
	역방향	CAGTCACTTCTTCAGTCACT (서열번호 6)
인간 RARα	정방향	GTGGATATAGCACACCATCC (서열번호 7)	324bp
	역방향	CTCACAGACTCCTTGGACAT (서열번호 8)
인간 RARβ	정방향	AGTTGGACGATCTCACAGAG (서열번호 9)	382bp
	역방향	AACACAAGGTCAGTCAGAGG (서열번호 10)
인간 Gli2	정방향	ACCAGAATCGCACCCACTCC (서열번호 11)	392bp
	역방향	GCATCTCCACGCCACTGTC (서열번호 12)
인간 Gli3	정방향	CACTACCTCAAAGCGGGAAG (서열번호 13)	403bp
	역방향	TGTTGGACTGTGTGCCATTT (서열번호 14)
인간 Smo	정방향	CTGGTACGAGGACGTGGAGG (서열번호 15)	131bp
	역방향	AGGGTGAAGAGCGTGCAGAG (서열번호 16)
인간 Islet1	정방향	AATTTGCGCTTCGGGAGGAC (서열번호 17)	331bp
	역방향	AACCAGACCCGGATCACACG (서열번호 18)
인간 베타-액틴	정방향	CCACGAAACTACCTTCAACTCC (서열번호 19)	267bp
	역방향	TCATACTCCTGCTGCTTGCTGATCC (서열번호 20)

그 결과, MNIM에 의해 hMCS 내에서 유도시간에 따라 NF-M과 NF-L의 성숙 신경 표지(mature neuronal marker)의 발현량에 차이가 있음을 확인하였다. 즉, 미처리 대조군에서는 NF-M과 NF-L의 발현이 거의 없었으나, hMSC를 MNIM으로 처리한 군에서는 상기 두 유전자의 발현이 증가하는 결과를 나타내었다(도 2). 또한, MNIM 처리군이 미처리 대조군에 비해서 운동 신경세포 표지(Islet-1)의 발현량이 확연히 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 5). 또한, 분화시킨 후 분화 전 배양에 사용하였던 기본 배지로 배양한 후에도 성숙 신경 표지인 NF-M과 NF-L, 운동 신경세포 표지인자인 Islet1의 유전자 발현이 유지되는 것을 확인하였다(도 5).

또한, 레티논산 하위 신호분자인 RAR-α(retinoic acid receptor-α), RAR-β(retinoic acid receptor-β)의 발현이 증가하였고(도 3), SHH(sonic hedgehog)의 하위 분자인 Smo(smoothened, seven-pass G-protein-coupled receptor), Gli2(Glioma-associated oncogene homologue family-2), Gli3(Glioma-associated oncogene homologue family-3)의 발현량도 증가하였다(도 4).

<2-2> 세포면역형광화학법에 의한 신경분화 표지의 확인

커버 슬립(Fisher Scientific, USA)을 20 ㎍/㎖의 PDL(Sigma, USA)로 하루 동안 코팅한 후, 10 ㎍/㎖의 라미닌(Sigma, USA)을 3시간 동안 재코팅하고 증류수로 5번 세척해주었다. 실시예 1-2의 방법으로 배양한 중간엽 줄기세포를 0.1% 트립신/EDTA로 용기에서 떼어낸 후 상기 방법으로 제조한 PDL-라미닌 코팅 커버 슬립에 심어서 하루 동안 10% FBS가 포함된 DMEM(1000 ㎎/ℓ 글루코오스; WelGENE, Korea) 배지에서 배양하였다. 미처리 대조군, MNIM 처리군 및 MNIM+CM 처리군의 세포에 4%(v/v) 파라 포름알데히드를 실온에서 30분 동안 처리하였고 1× PBS로 3번 세척하였다. 이어서, 0.2% 트리톤X 100을 10분 동안 처리하여 투과하였고 1× PBS로 3번 세척하였다. 이후, 비특이 결합을 막기 위해 5% 염소 혈장이 포함된 차단 완충용액을 1시간 동안 처리하였다. 차단 완충용액(5% 염소 혈장이 포함된 1× PBS)으로 희석한 일차 항체 NF-M(neurofilament 150 kDa; Chemicon, USA)이 상기 방법으로 전-처리된 실험군의 세포에 결합하도록 4℃의 조건에서 밤새 반응하였고, 1× PBS로 3번 세척한 후 차단 완충용액에 1:500으로 희석한 Alexa546 결합 항-래빗(Molecular probe, USA) 이차항체와 어두운 상온에서 추가로 1시간 동안 반응하였다. 상기 반응 결과를 FluoView^TM 공초점현미경(FluoView^TM Confocal Microscope; Olympus, Japan)으로 조직학적 분석하였다.

그 결과, 미처리 대조군에서는 신경세포 표지인 NF-M이 발현되지 않았으나, MNIM 처리군에서 NF-M의 발현이 증가하는 것을 볼 수 있었고, 세포의 형태가 MNIM에 의해 뉴런-유사 세포(neuron-like cell)로 분화되는 것을 더욱 확실하게 관찰할 수 있었다(도 6).

도 1은 중간엽 줄기세포에 여러 배지를 처리한 후 형태적 변화 정도를 나타낸 도이다:

a: 미처리 대조군;

b: MNIM 처리군; 및,

c: MNIM+CM 처리군.

도 2는 중간엽 줄기세포에 여러 배지를 처리한 후 신경세포 표지 단백질(NF-L, NM-M, NF-H) 유전자의 발현 정도를 나타낸 도이다.

도 3은 중간엽 줄기세포에 여러 배지를 처리한 후 RA 신호 전달 단백질(RARa, RARb) 유전자의 발현 정도를 나타낸 도이다.

도 4는 중간엽 줄기세포에 여러 배지를 처리한 후 SHH 신호 전달 단백질(Gli2, Gli3) 유전자의 발현 정도를 나타낸 도이다.

도 5는 중간엽 줄기세포에 여러 배지를 처리한 후 운동 신경세포 표지 단백질(Islet1) 유전자의 발현 정도를 나타낸 도이다.

도 6은 중간엽 줄기세포에 여러 배지를 처리한 후 신경세포 표지 단백질(NF- M)의 발현을 면역형광법으로 확인한 그림이다(빨간색: NF-M, 초록색: GFP).

<110> Seoul national university industry foundation <120> Method for inducing differentiation of human mesenchymal stem cells into motor neurons <130> 7P-11-37 <160> 20 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human NF-L forward primer <400> 1 tcctactaca ccagccatgt c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human NF-L reverse primer <400> 2 tccccagcac cttcaacttt c 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human NF-M forward primer <400> 3 tgggaaatgg ctcgtcattt g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human NF-M reverse primer <400> 4 cttcatggaa acggccaatt c 21 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human NF-H forward primer <400> 5 cagctgcgag aataccag 18 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human NF-H reverse primer <400> 6 cagtcacttc ttcagtcact 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human RAR alpha forward primer <400> 7 gtggatatag cacaccatcc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human RAR alpha reverse primer <400> 8 ctcacagact ccttggacat 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human RAR beta forward primer <400> 9 agttggacga tctcacagag 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human RAR beta reverse primer <400> 10 aacacaaggt cagtcagagg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human Gli2 forward primer <400> 11 accagaatcg cacccactcc 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human Gli2 reverse primer <400> 12 gcatctccac gccactgtc 19 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human Gli3 forward primer <400> 13 cactacctca aagcgggaag 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human Gli3 reverse primer <400> 14 tgttggactg tgtgccattt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human Smo forward primer <400> 15 ctggtacgag gacgtggagg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human Smo reverse primer <400> 16 agggtgaaga gcgtgcagag 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human Islet1 forward primer <400> 17 aatttgcgct tcgggaggac 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human Islet1 reverse primer <400> 18 aaccagaccc ggatcacacg 20 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human beta-actin forward primer <400> 19 ccacgaaact accttcaact cc 22 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human beta-actin reverse primer <400> 20 tcatactcct gctgcttgct gatcc 25

Claims (20)

1) 중간엽 줄기세포를 β-머캅토에탄올이 0.5 내지 3 mM 포함된 배지에서 1차 전-유도(pre induction) 및 상기 1차 전-유도 중간엽 줄기세포에 β-머캅토에탄올이 0.5 내지 3 mM 포함된 배지에서 다시 처리하는 2차 전-유도를 수행하는 단계;

2) 단계 1)의 전-유도된 중간엽 줄기세포를 레티논산(retinoic acid) 및 포스콜린(forskolin)을 포함하는 1차 운동 신경세포 분화 유도배지로 1.5일 내지 2.5일 동안 1차 분화 유도하는 단계;

3) 단계 2)의 1차 분화 유도된 중간엽 줄기세포를 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor; 이하, bFGF), 레티논산, 포스콜린을 포함하는 2차 운동 신경세포 분화 유도배지로 1.5일 내지 2.5일 동안 2차 분화 유도하는 단계; 및,

4) 단계 3)의 2차 분화 유도된 중간엽 줄기세포를 염기성 섬유아세포 성장인자, 레티논산, 포스콜린 및 SHH(sonic hedgehog)를 포함하는 3차 운동 신경세포 분화 유도배지로 3일 내지 5일 동안 3차 분화 유도하는 단계로 이루어진 운동 신경세포 분화 방법.

제 1항에 있어서, 전-유도는 1차 전-유도에 비해 2차 전-유도시 β-머캅토에탄올의 농도가 1.5 내지 2배 증가하는 것을 특징으로 하는 운동신경세포 분화 방법.

제 1항에 있어서, 2차 전-유도는 1차 전-유도 시간의 1/4 내지 1/8로 줄어드는 것을 특징으로 하는 운동신경세포 분화 방법.

제 1항에 있어서, 2차 전-유도는 1차 전-유도 시간의 1/8로 줄어드는 것을 특징으로 하는 운동신경세포 분화 방법.

제 1항에 있어서, 단계 2)의 1차 운동 신경세포 분화 유도배지는 0.8 내지 1.2 μM의 레티논산 및 4 내지 6 μM 포스콜린을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

제 1항에 있어서, 단계 2)의 1차 분화 유도는 1.5일 내지 2.5일 동안 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

제 1항에 있어서, 단계 3)의 2차 운동 신경세포 분화 유도배지는 8 내지 12 ng/㎖의 bFGF, 0.8 내지 1.2 μM의 레티논산 및 4 내지 6 μM 포스콜린을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

제 1항에 있어서, 단계 3)의 2차 분화 유도는 1.5일 내지 2.5일 동안 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

제 1항에 있어서, 단계 4)의 3차 운동 신경세포 분화 유도배지는 8 내지 12 ng/㎖의 bFGF, 0.8 내지 1.2 μM의 레티논산, 4 내지 6 μM 포스콜린 및 4 내지 6 nM SHH(sonic hedgehog)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

제 1항에 있어서, 단계 4)의 3차 분화 유도는 3일 내지 5일 동안 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

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