KR20170006159A - 생체외에서 운동 뉴런의 배양 방법 및 그 배양 키트 - Google Patents

생체외에서 운동 뉴런의 배양 방법 및 그 배양 키트 Download PDF

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Abstract

본 명세서는 생체외에서 운동 뉴런을 배양하는 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 본 명세서의 배양 방법은 배양판 위에서 시반세포와 운동 뉴런을 공동배양하는 단계를 포함하는 것이다. 이러한 방법에 의하면 종래 기술과 달리 생체외 조건에서 운동 뉴런을 생존하는 상태로 안정적으로 배양할 수 있다. 그러므로 이러한 배양방법은 운동 뉴런에 관한 질병의 약물 테스트에 있어서 생체내 실험이 아니라 생체외 실험을 가능하게 하며, 생체외 실험에 의해서도 약물의 효과를 안정적이고 효과적으로 검증할 수 있는 테스트 플랫폼으로서 기능할 수 있는 효과를 나타낸다.

Description

생체외에서 운동 뉴런의 배양 방법 및 그 배양 키트{METHOD FOR INCUBATION OF MOTOR NEURON IN VITRO AND INCUBATION KIT THEREOF}
본 명세서는 운동 뉴런의 배양 방법 및 배양 키트에 관한 것이다.
운동 뉴런 질환(Motor neuron disease)은 운동 신경에 점진적인 퇴행이 일어나는 중증 신경계 질환군으로 뇌에서 나와 연수 또는 척수로 전달되는 상위 운동신경이나 척수에서부터 근육으로 전달되는 하위 운동신경 모두에 영향을 줄 수 있다. 상위 운동신경이 손상되면 신체의 과도한 반사 반응이 나타나고, 하위 운동신경이 손상되면 근육이 진행적으로 위축(atrophy)되고, 쇠약해진다. 운동신경원 병은 여러 다른 형태로 나타나지만, 일반적으로 희귀성 질환에 속한다.
이러한 운동 뉴런 질환의 정확한 원인은 아직 밝혀져 있지 않으며 이러한 질환에는 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis-ALS), 원발성 측삭 경화증(Primary lateral sclerosis), 베르드니히-호프만 병(Werdni-Hoffman disease), 쿠겔베르그-벨란더 증후군(Kugelberg-Welander syndrome), 진행성 척수성 근육위축(Progressive spinal muscular atrophy), 진행성 구마비(Progressive bulbar palsy), 가족성 운동 뉴런 질환(Familial motor neuron disease) 등이 있다.
대부분 이러한 운동 뉴런 질환은 수초 형성의 이상으로 발생되는 병으로서 수초는 신경이 뇌에서 보내지는 메시지를 최대속도로 전달하고 해석할 수 있도록 도와주는 기능을 한다. 신경이 이러한 수초는 소실하게 되면, 적절한 기능을 할 수가 없고 메시지를 전달하는데 있어서도 정상보다 느려지게 된다.
운동 뉴런 질환의 치료를 위한 약물을 검증하기 위한 실험은 이러한 질병을 가지는 운동신경에 대하여 수행되어야 하기 때문에 생체내 실험을 통하여 수행되는 것이 대부분이다. 이러한 생체내 실험은 그 검증 실험의 방법이 용이하지 않으며 일반적으로 마우스와 같은 동물을 대상으로 수행되는 것이기 때문에, 생체외에서 운동 뉴런에 대한 약물의 효과를 평가할 수 있는 방법의 요구가 대두되었다. 또한 신경 손상 후 수초의 재형성을 촉진할 수 방법을 정량적으로 평가하여 효과적인 신경재생으로 이루는데 초점을 맞추고 있다.
종래 운동 뉴런을 생체외에서 배양하는 방법으로, 운동 뉴런을 다른 세포들과 공동으로 배양하는 방법이 발표된 바 있으나, 생체외 조건의 배양판에서 안정하고 효과적으로 운동 뉴런 배양과 수초 형성 할 수 있는 기술은 제안되지 않았다.
KR 0973324 B1
Jeon et. al., Nature Methods, A microfluidic culture platform for CNS axonal injury,regeneration and transport, PUBLISHED ONLINE 21 JULY 2005; DOI:10.1038/NMETH777 Callizot et. al., Experimental cell research. A new long term in vitro model of myelination, 2011 Oct 1;317(16):2374-83. doi: 10.1016/j.yexcr.2011.07.002.
상기 문제점을 해결하기 위하여, 본 명세서는 생체외에서 운동 뉴런을 생존상태에서 안정적으로 배양하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 일 측면에 있어서 시반세포와 운동 뉴런 세포를 공동배양하는 단계를 포함하는 운동 뉴런의 배양 방법을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 따른 배양방법에 의하면 종래 기술과 달리 생체외(in vitro)조건에서 운동 뉴런을 생존하는 상태로 안정적으로 배양할 수 있다. 따라서, 이러한 방법은 운동 뉴런을 이용하여 연구를 수행함에 있어서 세포단위에서뿐 아니라 분자학적 연구를 수행하는데 용이하며, 특히 신경 손상에 관한 생체외 연구에서의 한계점을 극복할 수 있는 효과를 나타낸다. 즉, 본 발명의 일 측면에 따른 방법으로 운동 뉴런을 배양하는 것은 운동 뉴런에 관한 질병의 경우 약물의 효과를 검증하기 위한 테스트에 있어서 종래와 같이 생체내 실험에 의하는 것이 아니라 생체외 실험에 의해서도 이를 안정하고 효과적으로 검증할 수 있는 테스트 플랫폼으로서 기능할 수 있는 효과를 나타낸다.
특히, 본 발명의 일 측면에 따른 방법에 의하면 운동 뉴런 질환을 가지고 있는 개체로부터 수득된 운동신경을 안정하고 효과적으로 배양할 수 있기 때문에, 여러 가지 질환을 가지고 있는 운동신경을 생체외에서 배양할 수 있다. 이에 따라, 평가하고자 하는 약물이 치료의 대상으로 하는 질병을 가지는 운동 뉴런에 대하여 생체외에서 그 효능을 쉽고 효과적으로 평가할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 측면에 따른 배양방법의 순서도와 배양시 첨가하는 배지의 종류를 나타낸 개략도에 해당한다.
도 2는 단독 배양한 운동 뉴런과 공동배양한 운동 뉴런의 배양기간에 따른 배양 상태를 나타낸 현미경촬영 사진이다.
도 3은 단독 배양한 운동 뉴런과 공동배양한 운동 뉴런의 배양기간에 따른 세포 생존수를 나타낸 사진(도3a) 및 그래프(도3b)이다.
도 4는 단독 배양한 운동 뉴런과 공동배양한 운동 뉴런의 축삭 길이를 비교한 사진 및 그래프이다.
도 5는 시반세포의 배양 기간에 따른 운동 뉴런의 배양 여부를 나타낸 현미경 사진이다.
도 6a 및 도 6b는 공동배양시 배양 시점별로 바이오마커에 의해 염색된 운동 뉴런의 광초첨 현미경 촬영 사진이다.
도 7은 공동배양시 수초 생성-전 시반세포와 수초를 생성하는 시반세포의 변화 과정을 나타낸 그림(A)과 배양 시점별로 두 세포의 비율의 변화를 나타낸 그래프이다(B).
도 8은 공동배양시 수초 형성 단백질의 발현 정도를 웨스턴블롯으로 정량적으로 분석한 사진(A) 및 그래프(B)이다.
도 9는 공동배양으로 인해 수초가 형성된 운동 뉴런의 모습을 투과 전자 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 10은 공동배양시 코엔자임 Q10을 첨가하는 경우 배양 시점별로 바이오마커에 의해 염색된 운동 뉴런의 광초첨 현미경 촬영 사진이다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 1) 시반세포 위에 운동 뉴런 세포를 시딩하는 단계; 및 2) 운동 뉴런 세포와 시반세포를 공동배양하는 단계;를 포함하는 생체외(in vitro)에서 운동 뉴런을 배양하는 방법에 관한 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 시반세포는 고체, 액체 또는 겔 배지 위에 시딩된 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 시반세포는 배지 위에 시딩될 수 있으며, 이러한 배지는 배양 용기에 도말 된 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 배양 용기는 배지가 도말 될 수 있는 것이면 제한되지 않으며, 본 명세서에 기재된 배양판이 포함될 수 있고, 그 밖에 실험적으로 사용될 수 있는 튜브, 시험관, 비커, 플라스크 등 배지가 도말 되어 세포를 배양할 수 있는 것이면 제한되지 않는다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 방법은 시딩된 시반세포를 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 시반세포의 배양은 6일 내지 10일 동안 수행될 수 있다. 본 발명의 일 측면에 있어서, 시반세포의 배양은 6일 이상 수행되어야 하며, 5일 이하로 수행되는 경우 운동 뉴런을 시딩하였을 때에 시반세포와 운동 뉴런이 배양판에 부착되지 못하고 떨어져, 생체외에서 운동 뉴런의 배양이 잘 이루어 지지 않게 될 수 있다. 구체적으로 시반세포의 배양은 6일 이상, 7일 이상, 8일 이상, 9일 이상, 10일 이상, 11일 이상, 12일 이상 및/또는 12일 이하, 11일 이하, 10일 이하, 9일 이하, 8일 이하, 7일 이하, 6일 이하의 기간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 시반세포의 배양은 제1배지 및 제2배지 중 하나 이상을 첨가하여 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제1배지는 말 혈청(horse serum), 글루타민, 페니실린/스트렙토마이신(penicilin/streptomycin), 인간 헤레굴린 베타-1(human heregulin beta-1), 및 포스콜린(forskolin) 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 제1배지는 말 혈청, 글루타민, 페니실린/스트렙토마이신, 인간 헤레굴린 베타-1, 및 포스콜린으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제2배지는 상기 제1배지에 인간 염기성 섬유아세포 성장인자 및 소 뇌하수체 추출물 중 하나 이상을 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제1배지는 시반세포를 배양하기 위한 배지라면 제한되지 않고 사용될 수 있으며, 상업적으로 사용될 수 있는 배지로서 론자사의 고-글루코스 DMEM 배지(4.5g/L glucose w/o L-글루타민 또는 페놀레드)가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제1배지는 무수염화칼슘(calcium chloride anhydrous), 덱스트로오스, 질산제2철 9수화물(ferric nitrate nonahydrate), 무수 황산 마그네슘(magnesium sulfate anhydrous), 염화칼륨(potassium chloride), 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate), 염화나트륨(sodium chloride), L-아르기닌 모노하이드로클로라이드(L-arginine monohydrochloride), 글라이신(glycine), L-히스티딘 모노하이드로클로라이드 모노하이드레이트(L-histidine monohydrochloride monohydrate), L-이소루신(L-isoleucine), L-루신(L-leucine), L-라이신 모노하이드로클로라이드(L-lysine monohydrochloride), L-메티오닌(L-methionine), L-페닐알라닌(L-phenylalanie), L-세린(L-serine), L-트레오닌(L-threonine), L-트립토판(L-tryptophan), L-발린(L-valine), D-판토텐산 칼슘(D-calcium pantothenate), 염화콜린(choline chloride), 엽산(folic acid), I-이노시톨(I-inositol), 나이아신 아미드(niacinamide), 피리독신 모노하이드로클로라이드(pyridoxine monohydrochloride), 리보플라빈(riboflavin), 티아민 모노하이드로클로라이드(thiamine monohydrochloride), 피브루산 나트륨염(pyruvic acid sodium salt), L-티로신 디소디움염 디하이드레이트(L-tyrosine disodium salt, dehydrate), L-시스틴 디하이드로클로라이드(L-cystine dihydrochloride), 무수 인산수소나트륨(sodium phosphate monobasic, anhydrous)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제1배지는 제1배지의 총부피를 기준으로 하여 하기와 같은 농도로 각 물질들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 0.1~0.3g/L의 무수염화칼슘; 3.5~5.5 g/L의 덱스트로오스; 0.05~0.2mg/L의 질산제2철 9수화물; 90~110mg/L의 무수 황산 마그네슘; 0.3~0.5g/L의 염화칼륨; 3.0~5.0g/L의 탄산수소나트륨; 5.5~7.5g/L의 염화나트륨; 75.0~95.0mg/L의 L-아르기닌 모노하이드로클로라이드; 20.0~40.0mg/L의 글라이신; 35.0~50.0mg/L의 L-히스티딘 모노하이드로클로라이드 모노하이드레이트; 80.0~120.0mg/L의 L-이소루신; 80.0~120.0mg/L의 L-루신; 130.0~160.0mg/L의 L-라이신 모노하이드로클로라이드; 20.0~40.0mg/L의 L-메티오닌; 55.0~75.0mg/L의 L-페닐알라닌; 35.0~50.0mg/L의 L-세린; 85.0~110.0mg/L의 L-트레오닌; 13.0~20.0mg/L의 L-트립토판; 85.0~110.0mg/L의 L-발린; 2.0~6.0mg/L의 D-판토텐산 칼슘; 2.0~6.0mg/L의 염화콜린; 2.0~6.0mg/L의 엽산; 4.0~10.0mg/L의 I-이노시톨; 2.0~6.0mg/L의 나이아신 아미드; 2.0~6.0mg/L의 피리독신 모노하이드로클로라이드; 0.30~0.50mg/L의 리보플라빈; 2.0~6.0mg/L의 티아민 모노하이드로클로라이드; 90.0~120.0mg/L의 피브루산 나트륨염; 90.0~120.0mg/L의 L-티로신 디소디움염 디하이드레이트; 50.0~70.0mg/L의 L-시스틴 디하이드로클로라이드; 90.0~120.0mg/L의 무수 인산수소나트륨.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제1배지는 고-글루코스 DMEM(High-glucose Dulbecco’s modified eagle medium)에 말 혈청, 글루타민, 페니실린/스트렙토마이신, 인간 헤레굴린 베타-1, 및 포스콜린을 첨가한 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 페니실린/스트렙토마이신은 각각의 항생제를 0.1:1 내지 1:0.1의 비율로 혼합한 것일 수 있으며, 구체적으로 페니실린과 스트렙토마이신이 0.9:1.1 내지 1.1:0.9, 더욱 구체적으로 1:1의 비율로 혼합된 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제1배지는 8~12% 말 혈청, 1mM 내지 8mM의 글루타민, 50~150units/ml 의 페니실린/스트렙토마이신, 0.5~5ng/ml의 인간 헤레굴린 베타-1, 및 0.1~1.5μM의 포스콜린을 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로 본 발명의 일 측면에 있어서, 제1배지의 총부피를 기준으로 제1배지에 포함된 말 혈청은 6부피%이상, 7부피%이상, 8부피%이상, 9부피%이상, 10부피%이상, 11부피%이상, 12부피%이상, 13부피%이상, 14부피%이상, 15부피%이상 및/또는 15부피%이하, 14부피%이하, 13부피%이하, 12부피%이하, 11부피%이하, 10부피%이하, 9부피%이하, 8부피%이하, 7부피%이하, 6부피%이하 일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제1배지에 포함된 글루타민은 제1배지의 총부피에 대하여 0.1mM 이상, 1mM 이상, 2mM 이상, 3mM 이상, 4mM 이상, 5mM 이상, 6mM 이상, 7mM 이상, 8mM 이상, 9mM 이상, 10mM 이상 및/또는 10 mM 이하, 9 mM 이하, 8 mM 이하, 7 mM 이하, 6 mM 이하, 5 mM 이하, 4 mM 이하, 3 mM 이하, 2 mM 이하, 1 mM 이하, 0.1 mM 이하 일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제1배지에 포함된 페니실린/스트렙토마이신은 제1배지의 총부피에 대하여 10 units/ml 이상, 20 units/ml 이상, 50 units/ml 이상, 70 units/ml 이상, 90 units/ml 이상, 100 units/ml 이상, 120 units/ml 이상, 140 units/ml 이상, 150 units/ml 이상, 200 units/ml 이상, 및/또는 200 units/ml 이하, 150 units/ml 이하, 130 units/ml 이하, 110 units/ml 이하, 100 units/ml 이하, 80 units/ml 이하, 60 units/ml 이하, 40 units/ml 이하, 20 units/ml 이하, 10 units/ml 이하일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제1배지에 포함된 인간 헤레굴린 베타-1은 제1배지의 총부피에 대하여 0.1 ng/ml 이상, 0.5 ng/ml 이상, 1 ng/ml 이상, 2 ng/ml 이상, 3 ng/ml 이상, 4 ng/ml 이상, 5 ng/ml 이상, 6 ng/ml 이상, 및/또는 6 ng/ml 이하, 5 ng/ml 이하, 4 ng/ml 이하, 3 ng/ml 이하, 2 ng/ml 이하, 1 ng/ml 이하, 0.1 ng/ml 이하일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제1배지에 포함된 포스콜린은 제1배지의 총부피에 대하여 0.1 μM 이상, 0.2 μM 이상, 0.3 μM 이상, 0.4 μM 이상, 0.5 μM 이상, 0.6 μM 이상, 0.7 μM 이상, 0.8 μM 이상, 0.9 μM 이상, 1.0 μM 이상, 1.1 μM 이상, 1.3 μM 이상, 1.5 μM 이상, 및/또는 1.5 μM 이하, 1.3 μM 이하, 1.2 μM 이하, 1.1 μM 이하, 1.0 μM 이하, 0.9 μM 이하, 0.8 μM 이하, 0.7 μM 이하, 0.6 μM 이하, 0.5 μM 이하, 0.4 μM 이하, 0.3 μM 이하, 0.2 μM 이하, 0.1 μM 이하일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제2배지는 제2배지의 총부피에 대해 1~20ng/ml의 인간 염기성 섬유아세포 성장인자 및 10~30μg/ml의 소 뇌하수체 추출물을 포함할 수 있다. 구체적으로 본 발명의 일 측면에 있어서, 제2배지에 포함된 인간 염기성 섬유아세포 성장인자는 제2배지의 총부피에 대해 1 ng/ml 이상, 5 ng/ml 이상, 10 ng/ml 이상, 15 ng/ml 이상, 20 ng/ml 이상, 및/또는 20 ng/ml 이하, 15 ng/ml 이하, 13 ng/ml 이하, 10 ng/ml 이하, 7 ng/ml 이하, 5 ng/ml 이하, 3 ng/ml 이하, 1 ng/ml 이하, 0.1 ng/ml 이하일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 일 측면에 있어서, 제2배지에 포함된 소 뇌하수체 추출물은 제2배지의 총부피에 대해 1 μg/ml 이상, 5 μg/ml 이상, 10 μg/ml 이상, 13 μg/ml 이상, 15 μg/ml 이상, 17 μg/ml 이상, 20 μg/ml 이상, 23 μg/ml 이상, 25 μg/ml 이상, 27 μg/ml 이상, 30 μg/ml 이상, 40 μg/ml 이상, 및/또는 40 μg/ml 이하, 30 μg/ml 이하, 27 μg/ml 이하, 25 μg/ml 이하, 23 μg/ml 이하, 20 μg/ml 이하, 17 μg/ml 이하, 15 μg/ml 이하, 13 μg/ml 이하, 10 μg/ml 이하, 5 μg/ml 이하, 1 μg/ml 이하일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 시반세포의 배양은 시반세포를 시딩한 후에 제1배지를 첨가하여 배양하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 시반세포의 배양은 제1배지의 첨가 후, 3일 내지 5일 째에 제1배지를 제2배지로 교체하여 배양하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 시반세포의 배양은 배지 위에 1x104 내지 5x104 의 세포수를 올리고, 35 내지 40℃, 더 구체적으로 36~38℃의 온도 및 4~6% CO2조건에서 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 1)운동 뉴런을 시딩하는 단계는 시반세포의 세포층(cell layer)위에 운동 뉴런을 시딩하는 것일 수 있다. 구체적으로 이러한 시반세포의 세포층은 공급 세포층(feeder cell layer)일 수 있으며, 이러한 시반세포는 운동 뉴런의 배양시에 운동 뉴런의 축삭 주변으로 이동하여 축삭에 수초를 형성할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 1)단계에서 시딩되는 운동 뉴런은 3x103 내지 1x104개의 세포수일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 2)단계는 제3배지 및 제4배지 중 하나 이상을 첨가하여 운동 뉴런과 시반세포를 공동배양하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제3배지는 말 혈청(horse serum), B-27® 무혈청 서플먼트(B-27® serum-free supplement), L-글루타민, 베타-머캅토에탄올(Beta-mercaptoethanol), 포스콜린, 소 뇌하수체 추출물, 및 뇌유래 신경영양인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로 제3배지는 말 혈청, B-27® 무혈청 서플먼트, L-글루타민, 베타-머캅토에탄올, 포스콜린, 소 뇌하수체 추출물, 및 뇌유래 신경영양인자를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, B-27® 무혈청 서플먼트는 비오틴, DL 알파 토코페롤 아세테이트, DL 알파-토코페롤, 비타민 A, BSA(Bovine serum albumin)(fatty acid free Fraction V), 카탈라아제, 인간 재조합 인슐린, 인간 프랜스페린, 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제, 코르티코스테론, D-갈락토오스, 에탄올아민 HCL, 글루타티온, L-카르니틴 HCL, 리놀레산, 리놀렌산, 프로게스테론, 푸트레신 2HCL, 아셀렌산나트륨(sodium selenite), 및 트리아이오도-L-티로민(Triiodo-L-Thyronine, T3)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제4배지는 제 3배지에 L-아스코르브산을 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제3배지는 신경세포를 배양하기 위한 배지라면 제한되지 않고 사용될 수 있으며, 예를 들어 상업적으로 사용될 수 있는 배지로서 론자사의 뉴로베이살TM 배지(NeurobasalTM medium) 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제3배지는 글라이신, L-알라닌, L-아르기닌 하이드로클로라이드, L-아스파라진-H2O, L-시스테인, L-히스티딘 하이드로클로라이드-H2O, L-이소루신, L-루신, L-라이신 하이드로클로라이드, L-메티오닌, L-페닐알리닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, 염화 콜린, D-판토텐산 칼슘, 엽산, 나이아신 아미드, 염산 피리독신(Pyridoxal hydrochloride), 리보플라빈, 티아민 하이드로클로라이드, 비타민 B12, I-이노시톨, 무수 염화칼슘, 질산제2철 9수화물, 무수 염화 마그네슘, 염화칼륨, 탄산수소나트륨, 염화나트륨, 인산수소나트륨, 황산아연, 덱스트로오스, HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), 페놀레드, 소디움 피루베이트(Sodium Pyruvate)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제3배지는 제3배지의 총부피를 기준으로 하여 하기와 같은 농도로 각 물질들 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 20.0~40.0mg/L의 글라이신; 1.0~3.0mg/L의 L-알라닌; 75.0~95.0mg/L의 L-아르기닌 하이드로클로라이드; 0.5~1.0mg/L의 L-아스파라진-H2O; 25.0~40.0mg/L의 L-시스테인; 35.0~50.0mg/L의 L-히스티딘 하이드로클로라이드-H2O; 90.0~115.0mg/L의 L-이소루신; 90.0~115.0mg/L의 L-루신; 135.0~155.0mg/L의 L-라이신 하이드로클로라이드; 20.0~40.0mg/L의 L-메티오닌; 55.0~75.0mg/L의 L-페닐알리닌; 6.5~8.5mg/L의 L-프롤린; 35.0~50.0mg/L의 L-세린; 85.0~105.0mg/L의 L-트레오닌; 10.0~20.0mg/L의 L-트립토판; 65.0~80.0mg/L의 L-티로신; 85.0~110.0mg/L의 L-발린; 2.0~6.0mg/L의 염화 콜린; 2.0~6.0mg/L의 D-판토텐산 칼슘; 2.0~6.0mg/L의 엽산; 2.0~6.0mg/L의 나이아신 아미드; 2.0~6.0mg/L의 염산 피리독신; 0.2~0.6mg/L의 리보플라빈; 2.0~6.0mg/L의 티아민 하이드로클로라이드; 0.003~0.009mg/L의 비타민 B12; 6.0~8.0mg/L의 I-이노시톨; 180.0~220.0mg/L의 무수 염화칼슘; 0.05~0.2mg/L의 질산제2철 9수화물; 70.0~90.0mg/L의 무수 염화 마그네슘; 350.0~450.0mg/L의 염화칼륨; 2000.0~2400.0mg/L의 탄산수소나트륨; 2800.0~3200.0mg/L의 염화나트륨; 100.0~150.0mg/L의 인산수소나트륨; 0.10~0.30mg/L의 황산아연; 3.5~5.5g/L의 덱스트로오스, 2.2~3.2g/L의 HEPES; 7.5~9.0mg/L의 페놀레드; 20.0~30.0mg/L의 소디움 피루베이트.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제3배지는 뉴로베이살 배지(Neurobasal medium)에 말 혈청, B-27® 무혈청 서플먼트, L-글루타민, 베타-머캅토에탄올, 포스콜린, 소 뇌하수체 추출물, 및 뇌유래 신경영양인자를 첨가한 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제3배지는 0.5~5% 말 혈청, 0.1~5X 농도의 B-27® 무혈청 서플먼트, 0.1~1.5mM의 L-글루타민, 1~50uM 의 베타-머캅토에탄올, 0.1~1.5M의 포스콜린, 1~40μg/ml의 소 뇌하수체 추출물, 및 1~30ng/ml 의 뇌유래 신경영양인자를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 제4배지는 1~100ng/ml의 L-아스코르브산을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로 제4배지에 포함된 L-아스코르브산은 제4배지의 총부피에 대해 1 ng/ml 이상, 5 ng/ml 이상, 10 ng/ml 이상, 20 ng/ml 이상, 30 ng/ml 이상, 40 ng/ml 이상, 45 ng/ml 이상, 50 ng/ml 이상, 55 ng/ml 이상, 60 ng/ml 이상, 70 ng/ml 이상, 80 ng/ml 이상, 90 ng/ml 이상, 100 ng/ml 이상, 및/또는 100 ng/ml 이하, 90 ng/ml 이하, 80 ng/ml 이하, 70 ng/ml 이하, 60 ng/ml 이하, 55 ng/ml 이하, 50 ng/ml 이하, 45 ng/ml 이하, 40 ng/ml 이하, 30 ng/ml 이하, 20 ng/ml 이하, 10 ng/ml 이하, 5 ng/ml 이하, 1 ng/ml 이하일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제3배지에 포함된 말 혈청은 0.5% 이상, 1%이상, 1.5%이상, 2%이상, 2.5%이상, 3%이상, 4%이상, 5%이상, 및/또는 5%이하, 4%이하, 3%이하, 2.5%이하, 2%이하, 1.5%이하, 1%이하, 0.5%이하 일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제3배지에 포함된 B-27® 무혈청 서플먼트는 0.1X 농도 이상, 0.5X 농도 이상, 0.7X 농도 이상, 0.9X 농도 이상, 1.0X 농도 이상, 1.1X 농도 이상, 1.3X 농도 이상, 1.5X 농도 이상, 2.0X 농도 이상, 3.0X 농도 이상, 4.0X 농도 이상, 5.0X 농도 이상, 및/또는 0.1X 농도 이하일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제3배지에 포함된 L-글루타민은 제3배지의 총부피에 대해 0.1 mM 이상, 0.2 mM 이상, 0.3 mM 이상, 0.4 mM 이상, 0.5 mM 이상, 0.6 mM 이상, 0.7 mM 이상, 0.8 mM 이상, 0.9 mM 이상, 1.0 mM 이상, 1.3 mM 이상, 1.5 mM 이상, 및/또는 1.5 mM 이하, 1.3 mM 이하, 1.1 mM 이하, 1.0 mM 이하, 0.9 mM 이하, 0.8 mM 이하, 0.7 mM 이하, 0.6 mM 이하, 0.5 mM 이하, 0.4 mM 이하, 0.3 mM 이하, 0.2 mM 이하, 0.1 mM 이하일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제3배지에 포함된 베타-머캅토에탄올은 제3배지의 총부피에 대해 0.1 uM이상, 0.5 uM이상, 1.0 uM이상, 5.0 uM이상, 10.0uM이상, 15.0uM이상, 20.0uM이상, 21.0uM이상, 22.0uM이상, 23.0uM이상, 24.0uM이상, 25.0uM이상, 26.0uM이상, 27.0uM이상, 28.0uM이상, 29.0uM이상, 30.0uM이상, 35.0uM이상, 40.0uM이상, 45.0uM이상, 50.0uM이상, 60.0uM이상, 70.0 uM이상, 및/또는 70.0 uM이하, 60.0 uM이하, 50.0 uM이하, 45.0 uM이하, 40.0uM이하, 35.0uM이하, 30.0uM이하, 29.0uM이하, 28.0uM이하, 27.0uM이하, 26.0uM이하, 25.0uM이하, 24.0uM이하, 23.0uM이하, 22.0uM이하, 21.0uM이하, 20.0uM이하, 15.0uM이하, 10.0uM이하, 5.0uM이하, 1.0uM이하, 0.5uM이하, 0.1uM이하 일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제3배지에 포함된 포스콜린은 제3배지의 총부피에 대해 0.1M 이상, 0.2M 이상, 0.3M 이상, 0.4M 이상, 0.5M 이상, 0.6M 이상, 0.7M 이상, 0.8M 이상, 0.9M 이상, 1.0M 이상, 1.3M 이상, 1.5M 이상, 및/또는 1.5M 이하, 1.3M 이하, 1.1M 이하, 1.0M 이하, 0.9M 이하, 0.8M 이하, 0.7M 이하, 0.6M 이하, 0.5M 이하, 0.4M 이하, 0.3M 이하, 0.2M 이하, 0.1M 이하일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제3배지에 포함된 소 뇌하수체 추출물은 제3배지의 총부피에 대해 1μg/ml 이상, 5μg/ml 이상, 10μg/ml 이상, 15μg/ml 이상, 17μg/ml 이상, 18μg/ml 이상, 19μg/ml 이상, 20μg/ml 이상, 21μg/ml 이상, 22μg/ml 이상, 23μg/ml 이상, 25μg/ml 이상, 30μg/ml 이상, 40μg/ml 이상, 50μg/ml 이상, 및/또는 50μg/ml 이하, 40μg/ml 이하, 30μg/ml 이하, 25μg/ml 이하, 23μg/ml 이하, 22μg/ml 이하, 21μg/ml 이하, 20μg/ml 이하, 19μg/ml 이하, 18μg/ml 이하, 17μg/ml 이하, 15μg/ml 이하, 10μg/ml 이하, 5μg/ml 이하, 1μg/ml 이하일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 제3배지에 포함된 뇌유래 신경영양인자는 제3배지의 총부피에 대해 1ng/ml 이상, 5ng/ml 이상, 7ng/ml 이상, 8ng/ml 이상, 9ng/ml 이상, 10ng/ml 이상, 11ng/ml 이상, 12ng/ml 이상, 13ng/ml 이상, 15ng/ml 이상, 20ng/ml 이상, 30ng/ml 이상, 및/또는 30ng/ml 이하, 20ng/ml 이하, 15ng/ml 이하, 13ng/ml 이하, 12ng/ml 이하, 11ng/ml 이하, 10ng/ml 이하, 9ng/ml 이하, 8ng/ml 이하, 7ng/ml 이하, 6ng/ml 이하, 5ng/ml 이하, 1ng/ml 이하일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 2)단계는 운동 뉴런을 시반세포 위에 시딩 한 후에 제3배지를 첨가하여 배양하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 2)단계는 제3배지를 첨가하여 배양 후 5일 내지 9일째에 제4배지로 교체하여 배양하는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 2)단계는 제3배지를 첨가하여 배양 후 6일 내지 8일째, 더 구체적으로 7일째에 제4배지로 교체하여 배양하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 2)단계는 공동배양으로부터 4일 내지 7일 이후,코엔자임Q10(coenzyme Q10)을 2일 내지 4일 간격으로 더 첨가하여 배양하는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 3)단계는 공동배양으로부터 4일 내지 7일 이후, 더 구체적으로 6일 이후에 코엔자임Q10을 2일 내지 4일 간격, 더 구체적으로 3일 간격으로 더 첨가하여 배양하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 2) 단계의 공동배양은 5일 내지 40일 동안 수행하는 것일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 2)단계의 공동배양은 5일 이상, 10일 이상, 15일 이상, 20일 이상, 21일 이상, 25일 이상, 30일 이상, 40일 이상, 50일 이상, 60일 이상, 70일 이상, 또는 100일 이상 동안 수행하거나, 100일 이하, 70일 이하, 50일 이하, 30일 이하, 25일 이하, 22일 이하, 20일 이하, 10일 이하, 또는 5일 이하 동안 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 2)단계의 공동배양은 2일 내지 4일 주기로 배지의 50%를 교체하고 35℃ 내지 40℃, 더 구체적으로 36~38℃의 온도 및 4~6% CO2조건에서 수행하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 방법은 2) 단계 이후에 3)공동 배양으로 시반세포가 운동 뉴런의 수초(myelin)를 형성하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 방법은 3) 단계 이후에 수초가 형성된 운동 뉴런을 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 시반세포의 배양은 배양판에서 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 배양판은 커버슬립(coverslip) 또는 배양디쉬(culture dish)일 수 있으나, 이제 제한되는 것은 아니며 고체 또는 겔 형 배지가 도말 될 수 있는 용기라면 제한 없이 사용될 수 있다.
본 명세서에서 배양판은 세포를 배양할 수 있는 기판을 의미하는 것으로서, 이러한 기판 위에 배지를 도말하고 그 배지 위에 세포를 시딩하여 배양할 수 있는 것을 의미할 수 있다. 이러한 배양판은 그 크기와 모양이 제한되지 않으며, 세포를 배양할 수 있는 공간을 가지고 있을 수 있으며, 이러한 공간은 평평한 면으로 구성된 것일 수 있으나 반드시 평평할 필요는 없다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 운동 뉴런은 운동 뉴런 질환(Motor neuron disease)을 가지는 개체로부터 수득된 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 운동 뉴런 질환은 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis-ALS), 원발성 측삭 경화증(Primary lateral sclerosis), 베르드니히-호프만 병(Werdni-Hoffman disease), 쿠겔베르그-벨란더 증후군(Kugelberg-Welander syndrome), 진행성 척수성 근육위축(Progressive spinal muscular atrophy), 진행성 구마비(Progressive bulbar palsy), 및 가족성 운동 뉴런 질환(Familial motor neuron disease)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 개체는 포유류일 수 있다.
본 발명은 일 측면에 있어서, 제3배지 및 제4배지를 포함하는 운동 뉴런의 배양키트에 관한 것일 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 키트는 제1배지 및 제2배지를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 키트는 본 발명의 일 측면에 따른 생체외에서 운동 뉴런을 배양하는 방법에 기재된 설명서를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 키트는 코엔자임 Q10을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 설명서는 4) 단계에서 공동-배양 시 공동배양으로부터 4일 내지 7일 이후, 코엔자임Q10(coenzyme Q10)을 2일 내지 4일 간격으로 더 첨가하여 배양한다는 내용이 기재된 것일 수 있다.
이하, 실시예 및 시험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 시험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 하기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1] 세포 배양을 위한 배지
(1) A-1 배지(시반세포 배양)
50ml 고-글루코스 DMEM(High-glucose Dulbecco’s modified eagle medium)(Lonza사)에 5ml 말 혈청 (최종농도: 10부피% 말 혈청, horse serum)(Gibco사), 200mM L-글루타민 5ml (최종농도: 4mM의 L-글루타민, glutamine)(Invritrogen사), 100units/ml의 페니실린/스트렙토마이신(1:1비율) 0.5ml(최종농도: 1 부피% 페니실린/스트렙토마이신, penicilin/streptomycin)(Sigma사), 100ng/ml 인간 헤레귤린 베타-1 1ul(최종농도: 2ng/ml의 인간 헤레굴린 베타-1, human heregulin beta-1)(Sigma사), 및 5mM 포스콜린 5ul(최종농도:0.5μM 의 포스콜린, forskolin)(Sigma사)를 첨가하여 A-1 배지를 제조하였다.
(2) A-2 배지(시반세포 배양)
상기 (1)에서 제조된 A-1배지에 100ug/ml 인간 연기성 섬유아세표 성장인자50ul (최종농도: 10ng/ml, human basic fibroblast growth factor)(Sigma사), 및 1mg/ml 소 뇌하수체 추출물 1ml (최종농도: 20μg/ml의 소 뇌하수체 추출물, bovine pituitary extract)(Sigma사)을 더 첨가하여 A-2배지를 제조하였다.
(3) B 배지(시반세포와 운동 뉴런의 공동배양)
50ml 뉴로베이살TM 배지(NeurobasalTM medium)(Lonza사)에 말 혈청 5ml (최종농도: 2부피% 말 혈청, horse serum)(Gibco사), 1X 농도의 B-27® 무혈청 서플먼트(supplement)(Gibco사), 200mmM L-글루타민 125ul(최종농도: 0.5mM의 L-글루타민, L-glutamine)(Invitrogene 사) 1mM 베타-머캅토에탄올 1.25ml (최종농도: 25uM 베타-머캅토에탄올(Beta-mercaptoethanol (Sigma사), 5mM 포스콜린 5ul (최종농도: 0.5 M의 포스콜린)(Sigma사), 1mg/ml 소 뇌하수체 추출물 1ml (최종농도: 20μg/ml의 소 뇌하수체 추출물)(Sigma사), 및 10ug/ml 뇌유래 신경영양인자 50ul (최종농도: 10ng/ml의 뇌유래 신경영양인자, brain-derived neurotrophic factor, BDNF)(Sigma사)를 첨가하여 B 배지를 제조하였다.
(4) C 배지(시반세포와 운동 뉴런의 공동배양)
(3)에서 제조한 B배지에 10mg/ml L- 아스코르브산 250ul (최종농도: 50ug/ml의 L-아스코르브산)(Sigma사)을 더 첨가하여 C 배지를 제조하였다.
[실시예 2] 시반세포와 운동 신경 세포의 공동배양 및 그 시스템
(1) 커버슬립 상에 마트리겔의 코팅
성장 인자가 제거된 마트리겔(Growth factor reduced-matrigel)(Life technologies사)을 고-글르코스 배지(Lonza사)에 1:3 의 비율로 희석하였다. 그런 뒤 12mmφ의 커버슬립(coverslips)에 이를 30μl씩 도말하였다(coverslips에 약 3mm 두께로 도말됨). 그리고 커버슬립을 37℃ 배양기에 넣고 45분간 배양하여 코팅하였다. 이러한 커버슬립은 60mmφ 디쉬에 놓여져 있다.
(2) 시반세포의 분리 및 배양
1) 생후 4일령인 ICR(CD-1®) outbred mice (Samtaco사) 한 세트 (10-15마리)를 준비하였다. 준비된 마우스들에 대해 소독된 가위를 이용하여 마우스의 경추부분을 빠르게 절단하였다. 그런 뒤 경추이하 부분을 60φ 디쉬에 담긴 70% 알코올에 좌골신경을 꺼내기 전 까지 담가 놓았다.
2) 수술용 집게(forseps)와 칼을 이용하여 경추 이하 부분의 피부를 잘라 벗겨내고 대퇴근육 근처에서 좌골신경(sciatic nerve)를 뽑아내었다. 이렇게 추출한 좌골신경을 4℃의 PBS(Lonza사) 3ml이 담긴 15ml 하나의 튜브에 담가 놓았다.
3) 그런 뒤 2.5% 트립신 500ul(Sigma사)와 10mg/ml 콜라게네이즈 500ul(Roshe사)를 튜브에 분주하고, 3ml PBS를 더 넣어주었다.
4)그런 뒤 이를 37℃의 워터 베스(Water bath)에서 30분간 인큐베이션(incubation) 시켰다.
5) 30분 후 이를 190 x g으로 5분간 원심분리(2-16p,Sigma사) 하였다.
6) 원심분리 후, 상층액을 제거하였다.
7) 부유물이 제거된 시료에 말 혈청의 10%(Horse Serum)(Gibco사)가 들어간?DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)(Gibco사)로 3회 세척(washing)하였다. 세척 후 190 x g 에서 5분간 원심분리 하였다.
8) 원심분리 후, 상층액을 제거하였다.
9) 상층액이 제거된 침전물에 1ml의 A-1배지를 넣고 현탁(suspension) 시켰다.
10) 세포의 수를 헤마토사이토미터(Hematocytometer, MARIEN사)기로 측정한 뒤 각 웰(coverslip)당 3x104 개의 요구 세포수를 상기 (1)에서 성장인자가 제거된 마트리겔로 코팅된 커버슬립 상에 올렸다.
11) 그런 뒤 1시간30분~2시간 가량 37℃ 5% CO2 조건에서 인큐베이션(incubation)시켰다.
12) 세포가 커버슬립에 부착되었는지를 현미경 20x 렌즈(TS100,Nikon)로 확인한 뒤 실시예 1에서 제조한 A-1 배지를 마트리겔로 코팅된 커버슬립이 들어있는 60mmφ 디쉬에 3ml넣고, 37℃ 5% CO2 조건에서 배양하였다.
13) 시반 세포를 마트리겔로 코팅된 커버슬립에 시딩(seeding)하고 배양한 후 4 일째에 A-2 배지로 바꾸고 37℃ 5% CO2 조건에서 2일 더 배양하였다.
(3) 운동 뉴런의 분리 및 배양
1) 이소플루레인(Isofluran(하나제약주식회사))을 사용하여 임신 14일째의 CD-1® 마우스(Samtaco사)를 호흡 마취하였다.
2) 마취 상태를 확인 한 후, 경추 탈골을 하였다.
3) 경추 탈골시킨 쥐의 배 쪽을 알코올로 소독한 후 개복하고, 임신한 마우스의 태아(fetus)를 꺼내 4 ℃의 HBSS(hank’s balanced salt solution)(Lonza사)에 넣어두었다.
4) 태아 척수(fetal spinal cord)의 요추(lumbar) 부분의 절개(dissection)를 진행하였다.
5) 태아 마우스로부터 각각 분리한 척수를 HBSS(hank’s balanced salt solution)(Lonza사)에 보관하였다.
6) 분리된 척수에 1% 트립신 용액(trypsin solution)(Worthington사)을 20μl 넣고 37℃ 워터 베스(water bath)에서 인큐베이션(incubation)시켰다.
7) 1% 트립신 저해제(trypsin inhibitor)(Sigma사)를 20μl 넣고 200ul짜리 피펫을 (Pipette, eppendorf사) 이용하여 10 내지 20회 가량 척수 조직을 분쇄하였다.
8) 7)의 척수를 준비된 면역 패닝(immunopanning) 디쉬(dish) 위에 올렸다. 면역 패닝 디쉬의 경우, p75 항체 (Abcam사)가 포함된 10mM의 트리스-Cl 용액(T＆I사)을 24웰에 300μl씩 넣은 후 4℃ 에서 운동 뉴런의 배양 하루 전부터 보관하여 웰의 바닥을 코팅시켜 준비하였다.
9) 8)의 면역 패닝 디쉬에 올려진 척수를 상온에서 45분간 인큐베이션 시켰다.
10) 인큐베이션 후 면역 패닝 디쉬를 글루타맥스 1(Glutamax1)(Gibco사)이 들어간 뉴로 베이살 배지(Neurobasal medium)(Invitrogen사)로 두 번 세척 하였다.
11) 탈분극 용액(Depolarization solution)(증류수에 0.8% 염화나트륨, 30mM 의 염화칼륨, 및 2mM의 염화칼슘(Merk사)을 혼합한 혼합물)을 이용하여 디쉬에 부착된 운동 뉴런을 탈착시켰다.
12) 탈착된 운동 뉴런 세포를 15ml 튜브에 보관하였다.
13) 이러한 튜브를 400Xg에서 5분 동안 원심분리 하였다.
14) 원심분리 후 튜브의 상층액을 제거하였다.
15) 상층액이 제거된 운동 뉴런 세포들에 실시예 1에서 제조한 B 배지를 첨가하여 재현탁시켰다.
16) 세포의 수를 확인하였다.
(4) 시반세포와 운동 뉴런의 공동배양
1) 60mmφ의 배양 디시에서 배양한 시반세포가 담긴 커버슬립을 35mmφ의 배양 디시로 옮기고, 상기 (2)에 따라서 12mmφ 커버슬립 위에서 6일 동안 배양한 시반세포에 운동 뉴런을 5X103 내지 1X104 개의 세포수로 올렸다.
2) 그런 뒤 커버슬립을 37℃ 배양기에서 1시간 정도 배양한 뒤, 운동 뉴런 세포의 부착을 현미경 20X 렌즈로(TS100,Nikon) 확인하였다.
3) 현미경으로 부착을 확인한 후, 배양 디시(culture dish)(35mmφ) 위에 나머지 B 배지를 2ml 가량 채워 주었다. 그런 뒤 시반세포와 운동 뉴런을 3일에 한 번씩 50%의 배지를 새롭게 교체하면서 37℃, 5 % CO2 조건으로 배양기에서 공동배양 하였다.
4) 시반세포와 운동 뉴런을 공동 배양한(co-culture)후 7일째에 C 배지로 교체하여 배양하였다.
5) C배지를 3일에 한번씩 50% 배지만 교체하면서, 37℃, 5 % CO2 조건으로 배양기에서 배양하였다.
6) 상기 배양을 통해 커버슬립 위에서 수초(myelin)가 형성된 운동 뉴런을 수득할 수 있었다.
[시험예 1] 운동 뉴런의 단독배양 및 공동배양 시 뉴런의 수초 형성 및 생존여부 비교
상기 실시예 2에 따른 운동 뉴런의 배양 방법에 따라 운동 뉴런을 배양하였으며, 이와 비교하기 위하여 실시예 2의 (3)에 따라서 수득한 운동 뉴런을 (1)에 따라 준비된 마트리겔로 코팅한 커버슬립에 시딩하여 37℃, CO2 배양기에 단독으로 배양하였다. 운동 뉴런 단독시, 배양 배지는 50ml 뉴로베이살 배지(Neurobasal medium)(Invitrogen사)에 말 혈청 5ml (최종농도: 2부피% 말 혈청, horse serum)(Gibco사), 1X 농도의 B-27® 무혈청 서플먼트(B-27® serum-free supplement)(Gibco사), 100X 글루타맥스 500ul(최종농도: 1X 글루타맥스, glutamax)(Life technologies사) 1μM 베타-머캅토에탄올 500ul (최종농도: 0.01uM 베타-머캅토에탄올(Beta-mercaptoethanol (Sigma사), 및 10ug/ml 뇌유래 신경영양인자 50ul (최종농도: 10ng/ml의 BDNF, brain-derived neurotrophic factor)(Sigma사)를 첨가하여 제조하였다.
상기 공동배양과 단독배양되는 운동 뉴런의 생존여부 및 수초 형성 정도를 확인하기 위하여 각각의 배양 시점에 따라 현미경(50μm 스케일바)으로 커버슬립에서 배양되는 운동 뉴런을 확인하였다. 이러한 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 따르면, 운동 뉴런을 커버슬립 위에서 단독배양 하는 경우, 배양 후 14일 이후에는 운동 뉴런이 모두 사멸하는 것을 관찰할 수 있었다. 이에 반하여 본 발명의 일 측면에 따라 운동 뉴런을 공동배양한 경우에는 공동배양 후 21일 까지도 운동 뉴런이 생존한 것을 확인할 수 있었다.
특히, 본 발명의 일 측면에 따른 공동배양의 경우, 시반세포가 배양되어 생성된 공급 세포층(feeder cell layer)위에 운동 뉴런을 시딩하게 되면 시반세포가 운동 뉴런의 축삭(axon)주변으로 이동한 후에 축삭의 두께가 두꺼워지는 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로 공동배양의 그림에서 배양 0일째에 세포들은 세포층을 형성하고 있는 시반세포들이며, 배양 7일의 사진은 이러한 시반세포들이 축삭 주변으로 이동하여 빈공간이 많이 형성된 것을 나타낸다. 배양 14일 및 21일의 사진에서는 이렇게 축삭 주변으로 이동한 시반세포에 의해 운동 뉴런의 축삭이 두꺼워지고 수초가 생성되는 것을 확인할 수 있다.
따라서, 이러한 시반세포의 작용으로 인하여 운동 뉴런을 시반세포와 공동배양 하는 경우, 단독배양에 비하여 생체외에서 운동 뉴런을 안정적이고 오랫동안 배양할 수 있다.
[시험예 2] 운동 뉴런의 단독배양 및 공동배양에 따른 운동 뉴런의 세포 생존수 비교
시험예 1에서와 마찬가지로 단독으로 배양된 운동 뉴런과 시반세포와 공동배양된 운동 뉴런의 세포생존수를 확인하기 위하여 각 커버슬라이드에 염색법을 수행하여 생존 세포와 사멸한 세포의 수를 측정하였다.
이러한 실험은 커버슬립 위에서 운동 뉴런의 배양시점 따라 세포를 칼세인(Calcein)(Abcam사)과 프로피디움 아이오다이드(Propidium iodide, PI)(Abcam사)로 염색하여 생존 세포의 수를 칼세인으로 염색된 세포의 수로 측정하고 사멸한 세포를 PI로 염색된 세포의 수로 측정하였다. 배양 시점에 따라 염색된 세포를 현미경으로 촬영하였으며, 이러한 결과를 도 3a에 나타내었다. 도 3a에서 생존 또는 사멸세포의 수를 계산하여 도 3b에 생존/사멸 세포에 대한 그래프로서 나타내었다.
도 3a 및 도 3b에 따르면, 운동 뉴런을 단독배양하는 경우에는 배양 14일째에 대부분의 세포들이 사멸하는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 본 발명의 일 측면에 따른 방법으로 공동배양한 운동 뉴런의 경우 배양 21일째에도 사멸한 세포가 극히 적었고, 대부분의 세포 생존 상태를 유지하는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 이러한 결과에 따르면 본 발명의 일 측면에 따른 방법으로 운동 뉴런을 시반세포와 공동배양하는 경우 생체외에서 운동 뉴런을 안정적이고 오랫동안 배양할 수 있다.
[시험예 3] 단독배양 및 공동배양 시 운동 뉴런의 축삭의 길이 비교
시험예 1에서와 마찬가지로 단독으로 배양된 운동 뉴런과 시반세포와 공동배양된 운동 뉴런의 축삭의 길이를 비교하기 위하여 하기의 실험을 진행하였다.
시험예 1에 따른 운동 뉴런의 단독 배양과정과 실시예 2에 따른 공동 배양과정에 있어서 배양 후 2일째에 각 운동 뉴런을 축삭의 바이오 마커인 Tuj-1(Neuron-specific class III beta-tubulin, NP_001105456.1)(Abcam사)으로 염색한 뒤 이를 공초점 현미경(50μm 스케일바)(Leica사)과 ImageJ software(NIH사)로 확인하였다.
구체적으로, 2일째 키운 단독배양 운동 뉴런과 공동배양 운동 뉴런 샘플 각각을 4% 파라포름알데히드 (paraformladehyde)(T＆I사)에 15분간 담가 고정을 시킨 후, 0.2% 트리톤 엑스-100(triton X-100)(Sigma사)으로 15 분간 담가 놓았다. 그 후, Tuj-1의 1차 항체로 24시간동안 4℃ 에서 염색시킨 후, 다음날 Tuj-1의 2차 항체에 1시간 동안 담가놓은 후, 마지막으로 DAPI(4’,6-diamidino-2-phenylindole) 염색약으로 세포 핵을 염색 후 공초점 현미경으로 확인하였다. 이러한 결과를 도 4에 나타내었으며, A)는 공초점 현미경으로 촬영한 사진에 해당하며, B)는 축삭의 길이를 그래프로 표현한 것에 해당한다.
도 4에 따르면 운동 뉴런을 단독배양한 것에 비하여 시반세포와 공동배양 하였을 경우에 운동 뉴런의 축삭의 길이가 현저하게 증가된 것을 확인할 수 있었으며, 이는 대략 4배에 해당하는 것이다. 따라서, 단독배양에 비하여 공동배양시 운동 뉴런의 축삭의 길이가 현저하게 증가한다는 것을 확인할 수 있었으며, 이에 따라 본 발명의 일 측면에 따른 방법으로 운동 뉴런을 생체외에서 현저하게 배양할 수 있음을 확인할 수 있었다.
[시험예 4] 시반세포의 배양시기에 따른 운동 뉴런의 배양 가부
상기 실시예 2에 따른 운동 뉴런의 배양 방법에 따르되, 커버슬립 위에서 시반세포를 5일 동안 배양한 뒤 운동 뉴런을 시당한 것과, 시반세포를 7일 동안 배양한 뒤 운동 뉴런을 시딩한 경우 운동 뉴런이 잘 배양되고 수초를 형성하는지 여부를 현미경(50μm 스케일바)(Zeiss LSM 700)으로 관찰하였으며, 이러한 결과를 도 5에 현미경 사진으로 나타내었다.
도 5에 따르면, 5일 동안 배양한 시반세포에 운동 뉴런을 시딩하는 경우, 시반세포가 커버슬립 위에 붙지 못하고 떨어지는 것을 확인하였으며, 이에 따라 시반세포층이 존재하지 않아 운동 뉴런도 잘 배양되지 못하는 것을 확인하였다. 반면, 7일동안 배양한 시반세포에 운동 뉴런을 시딩하는 경우 공동-배양이 잘 수행되는 것을 확인할 수 있었으며 운동 뉴런이 잘 생존하고 더불어 수초도 잘 형성되는 것을 확인하였다.
따라서, 이러한 결과에 따르면 커버슬립 위에 시반세포를 6일 이상 배양한 뒤 운동 뉴런을 시딩하여 공동-배양을 수행해야 생체외에서 운동 뉴런을 잘 배양할 수 있다는 점을 확인할 수 있었다.
[시험예 5] 공동배양에 의한 수초 형성의 확인
시반세포와 운동 뉴런의 공동배양시 운동 뉴런의 축삭에서 수초가 형성되는지 여부를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 진행하였다.
실시예 2에 따른 공동배양 과정에 있어서, 배양 시점별로 DAPI(4’,6-diamidino-2-phenylindole)(파랑), Sox10(Transcription factor Sox-10, NM_006941)(1:500, 노랑), MBP(Myelin basic protein, NP_001020252)(1:500, 초록), Tuj-1(1:1000, 빨강), MAG(Myelin associated glycoprotein, NP_001186145)(빨강) 바이오마커(모두 Abcam사에서 입수)로 운동 뉴런을 염색하였으며 이를 광초점 현미경(50μm 스케일바)으로 염색 정도를 확인하였다.
DAPI의 경우 핵을 염색하기 위한 것이며, Sox-10은 시반세포의 전사인자로서 시반세포의 핵을 염색하기 위한 것이고, MBP는 수초 형성 단백질로서 수초가 생성되는지 여부를 확인하기 위한 것이고 Tuj-1은 축삭을 염색하여 그 변화정도를 확인하기 위한 것이고, MAG는 수초 형성시 수초 절흔(Schmit lanterman incisures, 또는 Myelin incisures)에서 발현되는 단백질로서 수초 형성 여부를 확인하기 위한 것 이다.
이러한 결과를 도 6a 및 도 6b에 나타내었으며, 도 6에 따르면 배양 10일째부터 수초형성 단백질의 발현이 시작된 것을 확인할 수 있었으며, 이는 시반세포가 분화되기 시작된 것을 의미하고 축삭 주위를 시반세포가 둘러싸고 있음을 의미하는 것이다. 또한, 이러한 수초형성 단백질의 발현은 Tuj-1의 염색 부분과 거의 일치하는 것으로 미루어 보아 시반세포가 운동 뉴런의 축삭 근처에서 수초를 형성하는 것이라고 판단할 수 있다.
또한, 도 6b에 따르면 본 발명의 일측면에 따른 공동배양을 진행할 경우 공동배양 후 27일 및 35일 까지도 수초 형성과 관련된 단백질들이 계속 발현되어 있는 것을 확인할 수 있으며, 이는 생체외 환경에서 운동 뉴런을 안정하게 배양할 수 있다는 것을 의미한다.
따라서, 본 발명의 일 측면에 따른 공동배양에 따르면 시반세포는 운동 뉴런의 축삭 근처에서 수초를 형성하게 되고, 이러한 수초형성에 의하여 생체외에서 운동 뉴런을 배양할 수 있다.
[시험예 6] 공동배양시 수초 생성전 시반세포(pre-myelinating Schwann cell)와 수초를 생성하는 시반세포(myelinating Schwann cell)의 비율
본 발명의 일 측면에 따른 공동배양에 있어서, 시반세포들이 수초를 형성하기 전과 수초를 형성한 후의 비율이 배양 기간에 따라 어떻게 변화하는지를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 진행하였다.
실시예 2에 따른 공동배양 과정에 있어서, 배양 시점별로 세포를 MBP-항체(Abcam사)로 염색하고, 그 발현 양상을 공초점 현미경으로 확인하여 수초 생성-전 시반세포(pre-myelinating Schwann cell)와 수초 형성 시반세포(myelinating Schwann cell)의 비율을 측정하였다. 이러한 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7의 A)는 운동 뉴런의 축삭에서 수초 생성-전 시반세포가 수초를 형성하는 시반세포로 변화하는 과정을 나타낸 도식도이며, B)는 배양 과정에 있어서 배양 시점에 따른 수초 생성-전 시반세포와 수초 생성 시반세포의 비율을 나타낸 그래프이다.
도 7의 B)에 따르면, 배양 14일째 까지만 하여도 수초 생성-전 시반세포가 대부분의 비율을 차지하나, 배양 21일째에 되어서는 수초 생성 시반세포가 월등히 많은 비율을 차지하고 있는 것을 확인할 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 일 측면에 따른 공동배양에 의해 시반세포는 운동 뉴런의 축삭 근처에서 수초를 형성하며, 특히 배양 21일째에 수초 생성 시반세포가 월등이 많은 비율로 나타나므로 치밀한 수초를 형성하는 것을 확인할 수 있다.
[시험예 7] 공동 배양시 MBP 발현의 정량적 확인
실시예 2에 따른 공동배양 과정에서, 배양 시점에 따라 MBP 단백질의 발현이 어떻게 변화하는지를 확인하기 위하여 웨스턴 블롯(Western blotting)을 통해 단백질의 발현을 정량적으로 측정하였다.
구체적으로, 실시예 2에 따른 공동배양 과정에서 공동배양 1일, 7일, 14일, 및 21일째의 운동 뉴런을 수거하여 단백질로 전환한 후, 6μg씩 겔에 로딩하였으며, 수초 형성 단백질과 시반세포의 전사인자 중 하나인 Krox20(NP_000390)의 발현을 확인하였다. 이러한 발현의 확인은 abcam사에서 구입한 Krox20 마커와 웨스턴 블롯키트(Life technology사)를 이용하고, myImageAnalysis™ Software를 사용하여 분석하였다. 이러한 결과를 도 8에 나타내었으며, 도 8의 (A)는 배양 시점에 따른 두 단백질의 로딩 결과를 나타낸 사진이며, (B) 및 (C)는 각각의 단백질에 대하여 이러한 로딩결과를 배양 1일째의 이미지 강도를 기준으로 표준화하여 정량적으로 나타낸 그래프에 해당한다.
도 8에 따르면 시반세포의 전사인자인 Krox20은 배양 일자에 따라서 그 발현이 점차 증가하는 것을 확인할 수 있으며, 이는 공동배양에 의하여 시반세포가 분화를 계속한다는 것 의미한다. 또한, MBP의 경우 배양 21일째에 그 발현이 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있으며 이러한 결과는 상기 시험에 6에서 배양 21일째에 수초를 형성하는 시반세포의 비율이 현저하게 증가하는 것과 유사한 결과를 시사하는 것에 해당한다.
따라서, 본 발명의 일 측면에 따른 공동배양시 수초 형성 단백질이 배양에 따라서 증가하는 것을 정량적으로 확인할 수 있었으며, 이는 공동배양에 따라 운동 뉴런의 축삭에서 수초가 형성된다는 것을 의미한다.
[시험예 8] 운동 뉴런에서 수초 형성 여부의 확인
실시예 2에 따라 공동배양된 운동 뉴런의 수초 형성여부를 투과 전자 현미경(transmission electron microscopy)으로 직접 확인하였다.
실시예 2에 따라 21일 동안 공동배양된 운동 뉴런을 투과 전자 현미경으로 100nm 스케일 및 200nm 스케일로 촬영하였으며, 이러한 결과를 도 9에 나타내었다. 도면에서 N은 운동 뉴런을 나타내는 것이며 m은 수초초(myelin sheaths)를 나타낸다.
도 9에 따르면, 왼쪽 사진(100nm 스케일)에서 수초초들이 운동 뉴런을 둘러싸고 있는 것을 확인할 수 있으며 오른 쪽 사진(200nm 스케일)에서 운동 뉴런의 섬유가 두꺼운 수초초를 가지고 있음을 확인할 수 있고, 그 두께는 대략 0.2 μm이었다. 따라서, 이러한 결과에 따르면 본 발명의 일 측면에 따른 공동배양 방법에 의해 생체외에서 시반세포가 운동 뉴런의 축삭을 둘러싸 수초를 형성하는 것을 확인할 수 있고, 이를 통해 운동 뉴런이 생체외에서 계속 생존상태를 유지하고 배양될 수 있다.
[시험예 9] 코엔자임 Q10의 첨가시 수초 형성 단백질의 발현 양상
실시예 2에 따른 공동배양 과정에 있어서, 공동배양 시점으로부터 6일 째에 코엔자임 Q10을 1μM씩 3일에 한번 간격으로 투여하였으며, 시험예 5에 따른 방법과 동일한 염색 방법으로 세포들을 염색하였다. 이를 광초점 현미경(50μm 스케일바)으로 촬영하였으며 이러한 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 따르면 코엔자임 Q10을 처리하는 경우 코엔자임 Q10을 처리하지 않은 공동배양(도 6)에 비하여 3일 먼저 수초 형성 단백질이 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로 도 10에서 수초 형성 단백질은 공동배양 후 7일째에 발현이 시작되는 것을 확인할 수 있으나, 도 6에서 수초 형성 단백질은 공동배양 후 10일째에 발현되었다. 또한, 코엔자임 Q10을 처리하고 그 다음날인 공동배양 7일째에 확인하였을 때, 수초 형성 단백질이 바로 발현되는 것으로 보아 코엔자임 Q10이 수초 형성 단백질의 발현을 매우 촉진시키고 수초 형성을 촉진시킬 수 있다는 점을 확인할 수 있었다.
따라서, 이러한 결과를 통해 코엔자임 Q10이 수초 형성 단백질의 발현을 촉진시키는 것을 확인할 수 있으며, 본 발명의 일 측면에 따른 공동배양 방법에 있어서 배양시 코엔자임 Q10을 함께 첨가하여 배양하는 경우 수초의 형성을 촉진할 수 있으며 그에 따라 운동 뉴런을 더욱 빠른 기간 내에 안정하게 배양할 수 있다.
이상으로 본 명세서의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일뿐이며, 이에 본 명세서의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 명세서의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (41)

1) 시반세포 위에 운동 뉴런 세포를 시딩하는 단계; 및
2) 운동 뉴런 세포와 시반세포를 공동배양하는 단계;를 포함하는 생체외(in vitro)에서 운동 뉴런을 배양하는 방법.
제1항에 있어서,
시반세포는 고체 또는 겔 배지 위에 시딩된 것인 방법.
제2항에 있어서,
상기 방법은 시딩된 시반세포를 배양하는 단계를 더 포함하는 방법.
제3항에 있어서,
상기 시반세포의 배양은 6일 내지 10일 동안 수행되는 방법.
제3항에 있어서,
상기 시반세포의 배양은 제1배지 및 제2배지 중 하나 이상을 첨가하여 수행하는 것이고,
상기 제1배지는 말 혈청(horse serum), 글루타민, 페니실린/스트렙토마이신(penicilin/streptomycin), 인간 헤레굴린 베타-1(human heregulin beta-1), 및 포스콜린(forskolin)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것이고;
상기 제2배지는 상기 제1배지에 인간 염기성 섬유아세포 성장인자 및 소 뇌하수체 추출물 중 하나 이상을 더 포함하는 것인 방법.
제5항에 있어서,
상기 1배지는 무수염화칼슘(calcium chloride anhydrous), 덱스트로오스, 질산제2철 9수화물(ferric nitrate nonahydrate), 무수 황산 마그네슘(magnesium sulfate anhydrous), 염화칼륨(potassium chloride), 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate), 염화나트륨(sodium chloride), L-아르기닌 모노하이드로클로라이드(L-arginine monohydrochloride), 글라이신(glycine), L-히스티딘 모노하이드로클로라이드 모노하이드레이트(L-histidine monohydrochloride monohydrate), L-이소루신(L-isoleucine), L-루신(L-leucine), L-라이신 모노하이드로클로라이드(L-lysine monohydrochloride), L-메티오닌(L-methionine), L-페닐알라닌(L-phenylalanie), L-세린(L-serine), L-트레오닌(L-threonine), L-트립토판(L-tryptophan), L-발린(L-valine), D-판토텐산 칼슘(D-calcium pantothenate), 염화콜린(choline chloride), 엽산(folic acid), I-이노시톨(I-inositol), 나이아신 아미드(niacinamide), 피리독신 모노하이드로클로라이드(pyridoxine monohydrochloride), 리보플라빈(riboflavin), 티아민 모노하이드로클로라이드(thiamine monohydrochloride), 피브루산 나트륨염(pyruvic acid sodium salt), L-티로신 디소디움염 디하이드레이트(L-tyrosine disodium salt, dehydrate), L-시스틴 디하이드로클로라이드(L-cystine dihydrochloride), 무수 인산수소나트륨(sodium phosphate monobasic, anhydrous)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
제5항에 있어서,
상기 제1배지는 고-글루코스 DMEM(High-glucose Dulbecco’s modified eagle medium)에 말 혈청, 글루타민, 페니실린/스트렙토마이신, 인간 헤레굴린 베타-1, 및 포스콜린을 첨가한 것인 방법.
제5항에 있어서,
상기 제1배지는 8~12% 말 혈청, 1mM 내지 8mM의 글루타민, 50~150units/ml 의 페니실린/스트렙토마이신, 0.5~5ng/ml의 인간 헤레굴린 베타-1, 및 0.1~1.5μM의 포스콜린을 포함하는 것인 방법.
제5항에 있어서,
상기 제2배지는 제2배지의 총부피에 대해 1~20ng/ml의 인간 염기성 섬유아세포 성장인자 및 10~30μg/ml의 소 뇌하수체 추출물을 포함하는 것인 방법.
제5항에 있어서,
상기 시반세포의 배양은 시반세포를 시딩한 후에 제1배지를 첨가하여 배양하는 방법.
제10항에 있어서,
상기 시반세포의 배양은 제1배지의 첨가 후, 3일 내지 5일 째에 제1배지를 제2배지로 교체하여 배양하는 방법.
제3항에 있어서,
상기 시반세포의 배양은 배지 위에 1x104 내지 5x104 의 세포수를 올리고, 35 내지 40℃의 온도 및 4~6% CO2조건에서 수행하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 1)운동 뉴런을 시딩하는 단계는 시반세포의 세포층(cell layer)위에 운동 뉴런을 시딩하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 1)단계에서 시딩되는 운동 뉴런은 3x103 내지 1x104개의 세포수인 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 2)단계는 제3배지 및 제4배지 중 하나 이상을 첨가하여 운동 뉴런과 시반세포를 공동배양 하고,
상기 제3배지는 말 혈청(horse serum), B-27® 무혈청 서플먼트(B-27® serum-free supplement), L-글루타민, 베타-머캅토에탄올(Beta-mercaptoethanol), 포스콜린, 소 뇌하수체 추출물, 및 뇌유래 신경영양인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것이고;
상기 제4배지는 제 3배지에 L-아스코르브산을 더 포함하는 것인 방법.
제15항에 있어서,
상기 제3배지는 글라이신, L-알라닌, L-아르기닌 하이드로클로라이드, L-아스파라진-H2O, L-시스테인, L-히스티딘 하이드로클로라이드-H2O, L-이소루신, L-루신, L-라이신 하이드로클로라이드, L-메티오닌, L-페닐알리닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, L-발린, 염화 콜린, D-판토텐산 칼슘, 엽산, 나이아신 아미드, 염산 피리독신(Pyridoxal hydrochloride), 리보플라빈, 티아민 하이드로클로라이드, 비타민 B12, I-이소시톨, 무수 염화칼슘, 질산제2철 9수화물, 무수 염화 마그네슘, 염화칼륨, 탄산수소나트륨, 염화나트륨, 인산수소나트륨, 황산아연, 덱스트로오스, HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), 페놀레드, 소디움 피루베이트(Sodium Pyruvate)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
제15항에 있어서,
상기 제3배지는 뉴로베이살 배지(Neurobasal medium)에 말 혈청, B-27® 무혈청 서플먼트, L-글루타민, 베타-머캅토에탄올, 포스콜린, 소 뇌하수체 추출물, 및 뇌유래 신경영양인자를 첨가한 것인 방법.
제15항에 있어서,
상기 제3배지는 0.5~5% 말 혈청, 0.1~5X 농도의 B-27® 무혈청 서플먼트, 0.1~1.5mM의 L-글루타민, 1~50uM의 베타-머캅토에탄올, 0.1~1.5M의 포스콜린, 1~40μg/ml의 소 뇌하수체 추출물, 및 1~30ng/ml 의 뇌유래 신경영양인자를 포함하는 것인 방법.
제15항에 있어서,
상기 제4배지는 1~100ng/ml의 L-아스코르브산을 포함하는 것인 방법.
제15항에 있어서,
상기 2)단계는 운동 뉴런을 시반세포 위에 시딩 한 후에 제3배지를 첨가하여 배양하는 방법.
제20항에 있어서,
상기 3)단계는 제 3배지를 첨가하여 배양 후 5일 내지 9일째에 제4배지로 교체하여 배양하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 2)단계는 공동배양으로부터 4일 내지 7일 이후, 코엔자임Q10(coenzyme Q10)을 2일 내지 4일 간격으로 더 첨가하여 배양하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 2) 단계의 공동배양은 5일 내지 40일 동안 수행하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 2)단계의 공동배양은 2일 내지 4일 주기로 배지의 50%를 교체하고 35℃ 내지 40℃의 온도 및 4~6% CO2조건에서 수행하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 방법은 2) 단계 이후에 3)공동 배양으로 시반세포가 운동 뉴런의 수초(myelin)를 형성하는 단계를 더 포함하는 방법.
제25항에 있어서,
상기 방법은 3) 단계 이후에 수초가 형성된 운동 뉴런을 수득하는 단계를 더 포함하는 방법.
제3항에 있어서,
상기 시반세포의 배양은 커버슬립(coverslip) 또는 배양디쉬(culture dish)에서 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서,
상기 운동 뉴런 세포는 운동 뉴런 질환(Motor neuron disease)을 가지는 개체로부터 수득된 것인 방법.
제28항에 있어서,
상기 운동 뉴런 질환은 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis-ALS), 원발성 측삭 경화증(Primary lateral sclerosis), 베르드니히-호프만 병(Werdni-Hoffman disease), 쿠겔베르그-벨란더 증후군(Kugelberg-Welander syndrome), 진행성 척수성 근육위축(Progressive spinal muscular atrophy), 진행성 구마비(Progressive bulbar palsy), 및 가족성 운동 뉴런 질환(Familial motor neuron disease)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 방법.
제28항에 있어서,
상기 개체는 포유류인 방법.
제3배지, 및 제4배지를 포함하고,
상기 제3배지는 말 혈청(horse serum), B-27® 무혈청 서플먼트(supplement), L-글루타민, 베타-머캅토에탄올(Beta-mercaptoethanol), 포스콜린, 소 뇌하수체 추출물, 및 뇌유래 신경영양인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)를 포함하는 것이고;
상기 제4배지는 제3배지에 L-아스코르브산을 더 포함하는 것인 운동 뉴런의 배양키트.
제31항에 있어서,
제1배지 및 제2배지를 더 포함하고,
상기 제1배지는 말 혈청(horse serum), 글루타민, 페니실린/스트렙토마이신(penicilin/streptomycin), 인간 헤레굴린 베타-1(human heregulin beta-1), 및 의 포스콜린(forskolin)를 포함하는 것이고;
상기 제2배지는 상기 제1배지에 인간 염기성 섬유아세포 성장인자 및 소 뇌하수체 추출물을 더 포함하는 것인 운동신경의 배양키트.
제31항에 있어서,
상기 제3배지는 뉴로베이살 배지(Neurobasal medium)에 말 혈청, B-27® 무혈청 서플먼트, L-글루타민, 베타-머캅토에탄올, 포스콜린, 소 뇌하수체 추출물, 및 뇌유래 신경영양인자를 첨가한 것인 배양키트.
제31항에 있어서,
상기 제3배지는 0.5~5% 말 혈청, 0.1~5X 농도의 B-27® 무혈청 서플먼트, 0.1~1.5mM의 L-글루타민, 1~50uM의 베타-머캅토에탄올, 0.1~1.5M의 포스콜린, 1~40μg/ml의 소 뇌하수체 추출물, 및 1~30ng/ml 의 뇌유래 신경영양인자를 포함하는 것인 배양키트.
제31항에 있어서,
상기 제4배지는 1~100ng/ml의 L-아스코르브산을 포함하는 것인 배양키트.
제32항에 있어서,
상기 제1배지는 고-글루코스 DMEM(High-glucose Dulbecco’s modified eagle medium)에 말 혈청, 글루타민, 페니실린/스트렙토마이신, 인간 헤레굴린 베타-1, 및 포스콜린을 첨가한 것인 배양키트.
제32항에 있어서,
상기 제1배지는 8~12% 말 혈청, 1mM 내지 8mM의 글루타민, 50~150units/ml 의 페니실린/스트렙토마이신, 0.5~5ng/ml의 인간 헤레굴린 베타-1, 및 0.1~1.5μM의 포스콜린을 포함하는 것인 배양키트.
제32항에 있어서,
상기 제2배지는 1~20ng/ml의 인간 염기성 섬유아세포 성장인자 및 10~30ng/ml의 소 뇌하수체 추출물을 포함하는 것인 배양키트.
제31항에 있어서,
상기 키트는 제15항에 따른 생체 외에서 운동 뉴런을 배양하는 방법이 기재된 설명서를 더 포함하는 배양키트.
제31항에 있어서,
상기 키트는 제20항에 따른 생체 외에서 운동 뉴런을 배양하는 방법이 기재된 설명서를 더 포함하는 배양키트.
제39항에 있어서,
상기 키트는 코엔자임 Q10을 더 포함하고;
상기 설명서는 4) 단계에서 공동-배양 시 공동배양으로부터 4일 내지 7일 이후, 코엔자임Q10(coenzyme Q10)을 2일 내지 4일 간격으로 더 첨가하여 배양한다는 내용이 기재된 배양키트.
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