KR102408550B1 - 유사교세포로 분화 유도된 후기 단계의 인간 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
유사교세포로 분화 유도된 후기 단계의 인간 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 치료용 약학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 유사교세포로 분화 유도된 후기 단계의 인간 중간엽 줄기세포(ghMSC)를 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 후기 단계의 인간 중간엽 줄기세포로부터 분화된 유사교세포를 아밀로이드 베타에 의해 독성이 유발된 신경 줄기 세포와 공동으로 배양한 경우, 감소되었던 신경 줄기 세포의 생존력, 증식력이 증가하고, 증가하였던 신경 줄기 세포의 세포 독성이 감소하는 효과를 확인하였으며, 염증조절복합체의 발현이 감소하고, 알츠하이머 유발 마우스 모델에서 공간지각능력에 대한 장기 기억력 개선 및 공간 인지력 개선 효과를 확인한 바, 본 발명의 약학적 조성물은 알츠하이머의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 유사교세포로 분화 유도된 후기 단계의 인간 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
알츠하이머 질환(Alzheimer's Disease, AD)은 노화에 관련된 대표적인 신경 퇴행성 질환이다. 알츠하이머 질환이 발병한 경우, 전두엽 및 측두엽에서 시작하여 뇌의 다른 부위로 점차적으로 퍼지며 병이 진행된다. 알츠하이머 질환의 주요한 병리학적 특징은 아밀로이드 베타 단백질의 축적으로 인한 아밀로이드 플라크(amyloid plaque)와 미세소관(microtubule)에 관련된 타우 단백질(tau protein)이 신경세포에서 신경섬유다발(neurofibrillary tangle, NFT)을 형성하는 것이다. 아밀로이드 플라크(amyloid plaque)와 신경섬유다발(neurofibrillary tangle, NFT)의 형성은 신경퇴행, 시냅스 기능 장애 및 치매(dementia)로 이어진다.
아밀로이드 플라크(amyloid plaque)는 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein, APP)에 의해 생성된다. 아밀로이드 전구체 단백질은 신경 세포의 세포막을 관통하는 막전이 단백질로, 신경 세포의 성장, 생존 및 손상 후 복구에 매우 중요하다. 알츠하이머 질환이 발병한 경우, 아밀로이드 전구체 단백질 (amyloid precursor protein, APP)이 γ- 세크레타아제(secretase) 및 β- 세크레타아제(secretase) 효소에 의해 분해, 절단되면서 39~43개의 아미노산으로 이루어진 아밀로이드 베타(amyloid beta)가 생성되고, 이는 신경 세포의 외부에 고밀도로 축적된 덩어리인 아밀로이드 플라크(amyloid plaque)를 형성한다.
현재까지 알츠하이머병의 근본적인 치료방법은 개발되지 않았지만, 각국에서 사용되고 있는 치료제로는 아세틸콜린에스테라아제 억제제가 대부분이며 이는 병의 진행을 완전히 막을 수 없고, 약간의 병리적 증상을 완화시키거나 진행 정도를 늦추는 효과만 있다. 이 계열의 약물로는 도네페질(donepezil), 리바스티그민(rivastingmine), 갈란타민(galantamine), 타크린(tacrine) 등이 있다.
신경계(nervous system)는 신경세포(neuron)와 신경교세포(glia cell)로 이루어진다. 신경교세포는 신경계를 지탱하는 세포로서 신경계의 약 90%를 구성하며, 뉴런에 필요한 물질을 공급하고, 적합한 화학적 환경을 위한 항상성을 유지하는 역할을 한다. 신경교세포는 정보를 전달하는 뉴런과 달리 정보전달 기능은 없으며, 뉴런과 다르게 손실 후 회복이 가능하다. 이에 뇌에 발생하는 암은 뉴런이 아닌 교세포에서 발생하는 것이다. 교세포는 뇌 속에 가장 분포되어 있는 세포로 교세포의 크기는 신경세포의 1/10 정도이나 수적으로는 약 10배 정도로, 수천억개가 될 것으로 추정된다. 중추신경계에 존재하는 교세포에는, 혈액 뇌 장벽(blood-brain barrier)을 유지하고 혈액에서 포도당을 흡수하여 뉴런에 공급하고, 조직 재생을 도와 미세 환경을 개선시키는 성상세포(astrocyte), 중추신경계 수초(myelin sheeth)를 형성하는 희소돌기세포(olggodendrocyte), 중추신경계의 면역세포 역할을 하는 미세아교세포(microglia) 및 방사 신경교세포(radial glia)가 있다.말초신경계에 존재하는 교세포에는 말초신경계 수초를 형성하는 슈반세포(schwann cell)와 뉴런에 영양을 공급하는 위성 세포(satellite cell)이 있다.
줄기세포는 신경계에서 손상되거나, 손실된 세포를 대체할 수 있는 능력 때문에 알츠하이머와 같이 다루기 힘든 신경질환들의 유망한 치료제로 고려된다. 그 동안 배아줄기세포(ESCs)와 유도만능줄기세포(iPSCs)가 다양한 신경세포들로 분화될 수 있고, 손상된 신경계를 대체할 수 있다고 보고되었다. 그러나 이런 세포들은 원하지 않는 암을 발생시킬 수 있다는 문제때문에 임상적인 시도가 이루어지지 않았다. 따라서 현재 진행 중인 임상 시험은 성체 줄기 세포, 특히 초기 분비된 인간 중간엽 줄기세포(hMSCs)를 사용하고 있다.
골수 유래 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSC)는 실험실 내에서 생장을 유지함과 동시에 자기재생을 할 수 있으며, 다양한 세포로 분화될 수 있다. (Bianco et al., 2001; Pittenger et al., 1999; Prockop, 1997). 또한, MSC는 신경세포의 활성을 가지는 다양한 유사신경세포로 교차분화 할 수 있는 잠재성을 갖는다(Munoz-Elias et al., 2003; Sanchez-Ramos et al., 2000; Trzaska et al., 2007; Woodbury et al., 2000). 인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cells, hMSC)는 높은 가소성(plasticity)과 낮은 면역 거부 반응 때문에 손상된 신경계를 치료하기 위한 세포치료제로서 연구되고 있다(Thuret et al., 2006). 본 발명자들은 이식된 hMSC가 생체 외(ex vivo) 척수손상 모델에서 손상된 신경 섬유의 성장과 척수조직 세포의 생존을 증가시킨다는 것을 입증하였다(Cho et al., 2009).
성체줄기세포의 중간엽 줄기세포에는 배양 초기 단계의 hMSC(early passage hMSC)와 배양 후기 단계의 hMSC(lagte passage hMSC, 10 passage 이상)가 있는데, 배양 후기 단계의 hMSC는 성장인자(growth factor)나 사이토카인들을 덜 분비하여 주변 분비 작용(paracrine effect)이 떨어져 신경계 회복력이 감소하게 된다. 이에 손상된 신경계의 치료를 위해서는 초기 hMSC를 이용하고 있는데, 배양 초기 단계에서는 hMSC를 얻을 수 있는 양이 매우 제한되어 있어, 치료를 위한 충분한 양을 얻기 어려웠다.
이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고자 인간 성체줄기세포로부터 얻은 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, hMSCs)를 신경교세포의 특성을 갖도록 분화 유도시켰으며, 상기 유사교세포로 분화유도된 중간엽 줄기세포(glia-like cell induced by hMSC, 이하 ghMSC라 약칭)는 성장인자와 사이토카인을 다량 분비하는 유사교세포로 분화 유도되어 주변 분비 작용(paracrine effect)가 강화되어 알츠하이머 치료에 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
이에 본 발명자들은 신경교세포의 특성을 가지도록 중간엽 줄기세포를 분화유도시켰으며, 상기 분화 유도된 유사교세포를 아밀로이드 베타에 의해 독성이 유발된 신경 줄기 세포와 공동으로 배양한 경우, 감소되었던 신경 줄기 세포의 생존력, 증식력이 증가하고, 증가하였던 신경 줄기 세포의 세포 독성이 감소하는 효과를 확인였으며, 염증조절복합체의 발현이 감소하고, 알츠하이머 유발 마우스 모델에서 공간지각능력에 대한 장기 기억력 개선 및 공간 인지력 개선 효과를 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 유사교세포(glia-like cell)로 분화 유도된 후기 단계(late-passage)의 인간 중간엽 줄기세포(ghMSC)를 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 유사교세포(glia-like cell)로 분화 유도된 후기 단계(late-passage)의 인간 중간엽 줄기세포(ghMSC)를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 알츠하이머의 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 유사교세포(glia-like cell)로 분화 유도된 후기 단계(late-passage)의 인간 중간엽 줄기세포(ghMSC)를 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 유사교세포(glia-like cell)로 분화 유도된 후기 단계(late-passage)의 인간 중간엽 줄기세포(ghMSC)를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 알츠하이머의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 유사교세포(glia-like cell)로 분화 유도된 후기 단계(late-passage)의 인간 중간엽 줄기세포(ghMSC)를 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 후기 단계의 인간 중간엽 줄기세포로부터 분화된 유사교세포를 아밀로이드 베타에 의해 독성이 유발된 신경 줄기 세포와 공동으로 배양한 경우, 감소되었던 신경 줄기 세포의 생존력, 증식력이 증가하고, 증가하였던 신경 줄기 세포의 세포 독성이 감소하는 효과를 확인하였으며, 염증조절복합체의 발현이 감소하고, 알츠하이머 유발 마우스 모델에서 공간지각능력에 대한 장기 기억력 개선 및 공간 인지력 개선 효과를 확인한 바, 본 발명의 약학적 조성물은 알츠하이머의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 ghMSC 유도 과정에서 유사교세포가 형태적으로 변화하는 것을 bright-field image로 확인한 도이다.
도 1b는 인간 중간엽 줄기세포(hMSC)와 이로부터 유도된 유사교세포(ghMSC)에서 성상 아교 세포의 마커인 GFAP, S100β, SLC1A3, SLC1A2, 희소돌기 신경교세포의 마커인 Sox10, 희소돌기 신경교세포 전구체 마커인 PDGFRα 및 허혈성 조건에서 중요한 역할을 하는 마커인 PAPP-A의 발현을 나타낸 도이다.
도 1c는 성상 아교 세포의 마커인 GFAP, S100β의 발현을 면역조직화학 염색으로 확인한 도이다.
도 1d는 성상 아교 세포의 마커인 GFAP, S100β의 발현이 전체 유사교세포에서 각각 발현하는 비율을 나타낸 도이다.
도 2는 아밀로이드 베타에 의해서 신경 줄기 세포의 생존력이 감소했지만, 아밀로이드 베타와 유사교세포 insert well이나 신경교세포 배양액(CM)을 함께 처리했을 경우에는 신경 줄기 세포의 생존력이 증가하는 것을 CCK-8 분석을 통해 확인한 도이다.
도 3은 아밀로이드 베타에 의해서 신경 줄기 세포의 생존력이 감소했지만, 아밀로이드 베타와 유사교세포 insert well이나 신경교세포 배양액(CM)을 함께 처리했을 경우에는 신경 줄기 세포의 생존력이 증가하는 것을 Trypan blue 염색을 통해 확인한 도이다.
도 4는 아밀로이드 베타 독성에 의해 증가되었던 신경 줄기 세포의 세포독성이 유사교세포와의 공동 배양으로 인해 감소된 것을 젖산 탈수소 효소(LDH) 수치 측정을 통해 확인한 도이다.
도 5는 아밀로이드 베타 독성에 의해 감소되었던 신경 줄기 세포의 증식력이 유사교세포와의 공동 배양으로 인해 증가된 것을 BrdU 분석을 통해 확인한 도이다.
도 6a는 신경줄기세포(NSC), 아밀로이드 베타를 처리한 신경 줄기 세포(NSC+Aβ) 및 유사교세포를 처리한 군(NSC+Aβ+ghMSC)에서 염증조절복합체인 NLRP3, caspase-1, 및 전염증성 사이토카인인 IL-1β의 발현 변화를 확인한 도이다.
도 6b는 신경줄기세포(NSC), 아밀로이드 베타를 처리한 신경 줄기 세포(NSC+Aβ) 및 유사교세포를 처리한 군(NSC+Aβ+ghMSC)에서 염증조절복합체인 NLRP3의 발현을 확인한 것으로, 아밀로이드 베타에 의해 증가한 NLRP3의 발현이 유사교세포 처리에 의해 통계적으로 유의할 정도로 발현이 감소한 것을 확인한 도이다.
도 6c는 신경줄기세포(NSC), 아밀로이드 베타를 처리한 신경 줄기 세포(NSC+Aβ) 및 유사교세포를 처리한 군(NSC+Aβ+ghMSC)에서 염증조절복합체인 caspase-1의 발현을 확인한 것으로, 아밀로이드 베타에 의해 증가한 caspase-1의 발현이 유사교세포 처리에 의해 통계적으로 유의할 정도로 발현이 감소한 것을 확인한 도이다.
도 6d는 신경줄기세포(NSC), 아밀로이드 베타를 처리한 신경 줄기 세포(NSC+Aβ) 및 유사교세포를 처리한 군(NSC+Aβ+ghMSC)에서 전염증성 사이토카인인 IL-1β의 발현을 확인한 것으로, 아밀로이드 베타에 의해 증가한 IL-1β의 발현이 유사교세포 처리에 의해 통계적으로 유의할 정도로 발현이 감소한 것을 확인한 도이다.
도 7은 비히클 투여군, 인간 중간엽 줄기세포(hMSC) 투여군 및 유사교세포(ghMSC) 투여군에서 escape latency를 확인한 것으로, 유사교세포(ghMSC)가 공간지각능력에 대한 장기 기억력 개선에 치료 효과를 나타냄을 확인한 도이다.
도 8은 비히클 투여군, 인간 중간엽 줄기세포(hMSC) 투여군 및 유사교세포(ghMSC) 투여군에서 escape latency를 확인한 것으로, 유사교세포(ghMSC)가 알츠하이머로 인한 기억력 및 공간 인지력 저하 개선에 효과를 나타냄을 확인한 도이다.
도 1b는 인간 중간엽 줄기세포(hMSC)와 이로부터 유도된 유사교세포(ghMSC)에서 성상 아교 세포의 마커인 GFAP, S100β, SLC1A3, SLC1A2, 희소돌기 신경교세포의 마커인 Sox10, 희소돌기 신경교세포 전구체 마커인 PDGFRα 및 허혈성 조건에서 중요한 역할을 하는 마커인 PAPP-A의 발현을 나타낸 도이다.
도 1c는 성상 아교 세포의 마커인 GFAP, S100β의 발현을 면역조직화학 염색으로 확인한 도이다.
도 1d는 성상 아교 세포의 마커인 GFAP, S100β의 발현이 전체 유사교세포에서 각각 발현하는 비율을 나타낸 도이다.
도 2는 아밀로이드 베타에 의해서 신경 줄기 세포의 생존력이 감소했지만, 아밀로이드 베타와 유사교세포 insert well이나 신경교세포 배양액(CM)을 함께 처리했을 경우에는 신경 줄기 세포의 생존력이 증가하는 것을 CCK-8 분석을 통해 확인한 도이다.
도 3은 아밀로이드 베타에 의해서 신경 줄기 세포의 생존력이 감소했지만, 아밀로이드 베타와 유사교세포 insert well이나 신경교세포 배양액(CM)을 함께 처리했을 경우에는 신경 줄기 세포의 생존력이 증가하는 것을 Trypan blue 염색을 통해 확인한 도이다.
도 4는 아밀로이드 베타 독성에 의해 증가되었던 신경 줄기 세포의 세포독성이 유사교세포와의 공동 배양으로 인해 감소된 것을 젖산 탈수소 효소(LDH) 수치 측정을 통해 확인한 도이다.
도 5는 아밀로이드 베타 독성에 의해 감소되었던 신경 줄기 세포의 증식력이 유사교세포와의 공동 배양으로 인해 증가된 것을 BrdU 분석을 통해 확인한 도이다.
도 6a는 신경줄기세포(NSC), 아밀로이드 베타를 처리한 신경 줄기 세포(NSC+Aβ) 및 유사교세포를 처리한 군(NSC+Aβ+ghMSC)에서 염증조절복합체인 NLRP3, caspase-1, 및 전염증성 사이토카인인 IL-1β의 발현 변화를 확인한 도이다.
도 6b는 신경줄기세포(NSC), 아밀로이드 베타를 처리한 신경 줄기 세포(NSC+Aβ) 및 유사교세포를 처리한 군(NSC+Aβ+ghMSC)에서 염증조절복합체인 NLRP3의 발현을 확인한 것으로, 아밀로이드 베타에 의해 증가한 NLRP3의 발현이 유사교세포 처리에 의해 통계적으로 유의할 정도로 발현이 감소한 것을 확인한 도이다.
도 6c는 신경줄기세포(NSC), 아밀로이드 베타를 처리한 신경 줄기 세포(NSC+Aβ) 및 유사교세포를 처리한 군(NSC+Aβ+ghMSC)에서 염증조절복합체인 caspase-1의 발현을 확인한 것으로, 아밀로이드 베타에 의해 증가한 caspase-1의 발현이 유사교세포 처리에 의해 통계적으로 유의할 정도로 발현이 감소한 것을 확인한 도이다.
도 6d는 신경줄기세포(NSC), 아밀로이드 베타를 처리한 신경 줄기 세포(NSC+Aβ) 및 유사교세포를 처리한 군(NSC+Aβ+ghMSC)에서 전염증성 사이토카인인 IL-1β의 발현을 확인한 것으로, 아밀로이드 베타에 의해 증가한 IL-1β의 발현이 유사교세포 처리에 의해 통계적으로 유의할 정도로 발현이 감소한 것을 확인한 도이다.
도 7은 비히클 투여군, 인간 중간엽 줄기세포(hMSC) 투여군 및 유사교세포(ghMSC) 투여군에서 escape latency를 확인한 것으로, 유사교세포(ghMSC)가 공간지각능력에 대한 장기 기억력 개선에 치료 효과를 나타냄을 확인한 도이다.
도 8은 비히클 투여군, 인간 중간엽 줄기세포(hMSC) 투여군 및 유사교세포(ghMSC) 투여군에서 escape latency를 확인한 것으로, 유사교세포(ghMSC)가 알츠하이머로 인한 기억력 및 공간 인지력 저하 개선에 효과를 나타냄을 확인한 도이다.
본 발명은 유사교세포(glia-like cell)로 분화 유도된 후기 단계(late-passage)의 인간 중간엽 줄기세포(ghMSC)를 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 유사교세포(glia-like cell)로 분화 유도된 후기 단계(late-passage)의 인간 중간엽 줄기세포(ghMSC)를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 알츠하이머의 치료 방법을 제공한다.
hMSC와 차별화된 신경세포나 교세포를 사용하는 것이 신경장애에 대한 신경 재건 접근법(neuroconstructive approach)으로 사용될 수 있다는 보고가 있다. 특히, hMSCs의 주변 분비 활동은 임상 시험에 중요한 영향을 미치는 것으로 간주된다. 그러나 대부분의 임상 실험은 후기(late-passage) 세포의 주변 분비 활성(paracrine activity)이 현저히 낮기 때문에 높은 비용에도 불구하고 지금까지 passage 5보다 낮은 초기 mMSC만을 사용해 왔다. 즉 본 발명자들이 확인한 바와 같이, passage 11부터 14까지의 후기 hMSC를 이식하는 것은 알츠하이머를 유도한 마우스의 행동 회복에 거의 영향을 미치지 않았다.
본 발명자들은 신경 기능 회복 효과가 낮은 후기 단계의 hMSC를 유사교세포로 분화 유도하여 주변 분비 활성(paracrine activity)을 증가시킨 ghMSC를 수득하였다. 신경 줄기 세포에 아밀로이드 베타를 처리한 알츠하이머의 세포 모델에서 유사교세포를 처리한 경우 세포 생존능 및 증식력이 증가하고, 세포 독성이 감소함을 확인하였다. 생체 내 실험에서도 마우스 모델의 신경 행동 기능이 ghMSC 이식에 의해 현저하게 회복되었다. 상기 결과를 종합하면 후기 hMSC에서 유도된 ghMSC가 알츠하이머를 치료하기 위한 바람직한 세포 공급원이라는 것을 보여준다.
상기 유사교세포는 희소 돌기 아교 세포(oligodendroglia), 성상 아교 세포(astrocyte), 미세 아교 세포(microglia) 및 방사 신경교세포(radial glia)로 구성된 군으로부터 어느 하나 이상이다.
상기 후기(late-passage) 인간 중간엽 줄기세포는 10 내지 15 passage이다.
상기 인간 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 유사교세포는 우태아 혈청(FBS)을 함유한 DMEM 배지 안에 유사교세포와 FBS 원액 및 DMSO를 넣어 냉동 바이알을 제작하고, 아이소프로판올(isopropanol)을 함유한 냉동 컨테이너에 제작한 냉동 바이알을 넣고 -80℃ 초저온 냉동고(DEEP freezer)에서 밤새 보관한 후, 액체질소 저장 탱크(LN2 탱크)에 제작한 냉동 바이알을 넣어 냉동시킬 수 있다.
상기 냉동한 인간 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 유사교세포는 37℃ 수조에서 해동시키고, 약간의 얼음이 있는 상태의 냉동 바이알 안의 세포를 생물학적 안전 캐비닛(biosafety hood) 안에서 파이펫을 이용해 잘 섞고, 우태아혈청(FBS)을 함유한 DMEM 배지와 섞어 코니컬 튜브에 넣은 후, 원심분리기로 침전시킨 세포 펠렛을 우태아 혈청(FBS)을 함유한 DMEM 배지와 혼합하고, 트리판 블루(tryphan blue) 염색약을 섞고 세포 배양 접시에 도말하여 사용할 수 있다.
상기 조성물의 유효 용량은 체중 1㎏당 세포의 경우에 103 내지 10 9 세포/㎏이고, 바람직하게는 104 내지 108 세포/㎏이며, 더 바람직하게는 6×105 내지 6×107 세포/㎏이고, 하루 2 내지 3회 투여될 수 있다. 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 발병 정도에 따라 변할 수 있다.
상기 유사교세포는 아밀로이드 베타로 인해 유발된 신경 줄기 세포의 세포 생존능 감소를 증가시킨다.
상기 유사교세포는 아밀로이드 베타로 인해 유발된 신경 줄기 세포의 세포 증식력 감소를 증가시킨다.
상기 유사교세포는 아밀로이드 베타로 인해 유발된 신경 줄기 세포의 세포 독성 증가를 감소시킨다.
상기 조성물은 신경 줄기 세포의 생존력을 증가시킨다.
상기 조성물은 염증조절복합체(inflammasome) 인자들의 발현을 감소시킨다.
상기 염증조절복합체는 NLRP3(NLR family pyrin domain-containing protein 3), 카스파아제-1(caspase-1), 및 IL-1β로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이다.
상기 조성물은 해마 의존적 공간 학습 능력을 향상시킨다.
상기 조성물은 공간 인지력을 향상시킨다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 인간 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 유사교세포를 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 인간 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 유사교세포는 치료를 위해 약학적 조성물로 존재할 수 있다. 이러한 약학적 조성물은 세포에 추가로 생리학적으로 받아들여질 수 있는 매트릭스(matrix) 또는 생리학적으로 받아들여질 수 있는 부형제를 포함할 수 있다. 매트릭스 및/또는 부형제의 유형은 의도된 투여 루트에 따라 다른 것들에 의존할 것이다. 이 약학적 조성물은 또한 줄기세포 치료시 함께 사용되는 다른 적합한 부형제 또는 활성 성분을 선택적으로 포함할 수 있다.
또한, 조성물의 투여량은 투여 경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 약리학상 허용되는 담체 혹은 매체, 구체적으로는 멸균수나 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 부형제, 비히클(vehicle), 방부제, 결합제 등과 적절히 조합하여 일반적으로 인정된 제약 실시에 요구되는 단위 용량 형태로 혼화하는 것에 의해 제제화하는 것으로 여겨진다. 상기 제제에 있어서 유효 성분량은 지시받은 범위의 적당 용량을 얻을 수 있도록 하는 것이다. 또, 주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 비히클을 이용해 통상의 제재 실시에 따라 처방할 수 있다. 이때 주사용 수용액으로는 예를 들면, 생리 식염수, 포도당이나 그외 보조약을 포함한 등장용액, 예를 들면, D-소르비톨, D-만노스, 염화나트륨을 들 수 있어 적당한 용해 보조제, 예를 들면 알코올, 구체적으로 에탄올, 폴리알코올, 예를 들면 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리소르베이트 80(TM), HCO-50으로 병용할 수 있다. 유성액으로서는 참기름, 콩기름을 들 수 있어 용해 보조제로서 안식향산벤질, 벤질 알코올과 병용할 수 있다. 또, 완충제, 예를 들면 인산염 완충액, 초산나트륨 완충액, 무통화제, 예를 들면 염산 프로카인, 안정화제, 예를 들면 벤질 알코올, 페놀, 산화방지제와 배합할 수 있다. 조제된 주사액은 통상 적당한 앰플에 충전시킨다.
환자의 체내에의 투여는 바람직하게는 비경구 투여이며, 구체적으로는 손상부위에의 1회 투여가 기본이지만 여러 차례 투여도 좋다. 또, 투여시간은 단시간이라도 장시간 지속 투여라도 좋다. 더욱 구체적으로는 주사제형, 경피투여형 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르(예, 올레인산에칠 등), 알코올 류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약학적 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 인간 중간엽 줄기세포로부터 유사교세포를 유도하고(도 1a 내지 도 1d), 상기 유사교세포의 알츠하이머 치료 효과를 확인하기 위해, 유사교세포를 신경 줄기 세포에 처리한 결과, 신경 줄기 세포의 생존력이 증가하고(도 2 및 도 3 참조) 아밀로이드 베타 독성에 의해 증가되었던 신경 줄기 세포의 세포독성이 유사교세포와의 공동 배양으로 인해 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 4 참조).
또한, 아밀로이드 베타 독성에 의해 감소되었던 신경 줄기 세포의 증식력이 유사교세포와의 공동 배양으로 인해 증가된 것을 확인하였다(도 5 참조).
또한, 아밀로이드 베타를 2시간 동안 처리한 신경 줄기 세포에서 염증 반응이 증가하여 염증조절복합체인 NLRP3, caspase-1, 및 전염증성 사이토카인인 IL-1β의 증가가 유사교세포와 공동 배양을 통하여 통계적으로 유의할 정도로 발현이 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 6a 내지 도 6d 참조).
또한, 대조군인 인간 중간엽 줄기세포(hMSC) 투여군에 대조하여 인간 유사교세포(ghMSC) 투여군에서 escape latency가 감소하여 인간 유사교세포(ghMSC) 가 공간지각능력에 대한 장기 기억력 개선에 치료 효과를 나타냄을 확인하였다(도 7 참조).
ghMSC 투여군이 대조군에 비해 기억력 및 공간 인지력이 개선된 결과를 보여 인간 유사교세포(ghMSC)가 알츠하이머로 인한 기억력 및 공간 인지력 저하로부터 개선에 효과를 나타냄을 확인하였다(도 8 참조).
따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 알츠하이머의 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
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실시예
1> 신경 줄기 세포
(Neural stem cell)의
배양
동물과 관련된 모든 절차는 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 한양대학교 지침에 따라 수행되었으며 한양대학교 동물윤리위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 사용된 동물의 수와 동물의 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였으며 모든 동물은 한 번만 사용되었다.
임신 13 내지 14주령의 랫트 전두엽으로부터 배아 신경 줄기 세포를 얻어 차가운 Hank's balanced salt solution(HBSS; 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.3 mM Na2HPO4, 0.4 mM KH2PO4, 5.6 mM 포도당, 및 2.5 mM HEPES) (Gibco, BRL, NY, USA) 이 담긴 100mm 페트리 접시에 옮겨 동일한 용액으로 여러 번 세척하였다. 하나의 신경 줄기 세포를 랫트 배아의 전두엽, 외부신경절돌기(lateral ganglionic eminence) 및 배쪽 중뇌(ventral midbrain)으로부터 분리해서, Ca2 +/Mg2 +이 포함되지 않은 PBS(Gibco) 용액에 녹인 폴리-L-오르니틴/피브로넥틴으로 미리 코팅해 둔 배양 접시에 도말하고 basic fibroblast growth factor(bFGF;10 ng/ml, Gibco, Frederick, MD, USA)가 들어있는 N2 배지(DMEM/F12, 25mg/L 인슐린, 100 mg/L 트랜스페린, 30 nM 셀레니트, 100 μM 푸트레신, 20 nM 프로게스테론, 0.2 mM 아스코르브산, 2 nM L-글루타민, 8.6 mM D(+) 글루코오스, 20 nM NaHCO3, Sigma, St. Louis, MO, USA)에 배양하였다. 배양액은 2 내지 3일 마다 교체해주었고, 배양은 37℃ 온도와 5% CO2 환경을 유지하면서 4 내지 6일 동안 유지하여 배아 신경 줄기 세포를 1차 배양하였다.
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실시예
2> 인간
중간엽
줄기세포(
hMSC
)의 배양
정상적인 인간의 골수로부터 추출된 성인 인간 중간엽 줄기세포 hMSCs(Cambrex Bioscience, Walkersville, MD, USA)는 10% 우태아혈청(FBS; Gibco, Waltham, MA, MA, USA)이 첨가된 저-글루코오스 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)에서 배양되었다. 세포(passages 6-12)는 37℃, 5%의 CO2의 환경에서 12번 내지 15번 계대 배양하여 후기 단계(late-passage)의 hMSC를 수득하였다.
<
실시예
3> 인간
중간엽
줄기세포(
hMSCs
)의
유사교세포(ghMSCs)로의
유도
상기 실시예 2에서 수득한 후기 단계의 인간 중간엽 줄기세포를 1차 분화 배지[(DMEM-저포도당 배지, 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 혼합물, 1 mM β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol)]로 교체하여 24시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 인간 중간엽 줄기세포를 PBS(인산 완충 용액)으로 세척 후 2차 분화 배지(DMEM-저포도당 배지, 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 혼합물, 0.28 ㎍/㎖ 트레티노인(all-trans-retinoic acid)로 교체하여 배양하였다. 3일 후, 상기 중간엽 줄기세포를 PBS로 세척한 후 3차 분화 배지[DMEM-저포도당 배지, 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 혼합물, 10mM 폴스콜린(forskolin), 10ng/ml 인간 섬유아세포 성장인자(human basic-fibroblast growth factor), 5ng/ml 인간 혈소판 유도성장인자-AA(human platelet derived growth factor-AA), 200ng/ml 헤레귤린 1-베타1(heregulin-β1)]로 교체하여 8일 동안 배양하였다. 이때, 상기 3차 분화 배지는 이틀에 한번 교체하였다. 분화유도를 위해 배양중인 hMSC의 형태를 현미경으로 관찰하였다. 분화유도 과정 동안의 세포 생존은 bright-field imaging을 통해 관찰되었다(도 1a).
<
실시예
4>
유사교세포의
농축된 배양액(
ghMSC
-CM)의 제조
유사교세포(1×104 cells/cm2)는 PBS로 두 번 헹구고 혈청이 없는 Neurobasal-A 배지(NB 배지)에 18시간 동안 배양하였다. 농축된 배양액을 모아서 원심분리기로 1500g로 5분 동안 침전시켜 세포 찌꺼기를 제거한 후, 실험에 사용하였다.
<
실시예
5> 냉동 및 해동
<5-1>
유사교세포의
냉동
10% 우태아 혈청(FBS)을 함유한 DMEM 배지 안의 1~2×105 수의 인간 중간엽 줄기세포(또는 유사 교세포)와 FBS 원액 및 DMSO를 각각 5:4 1의 비율로 전체 부피를 1㎖로 맞추어 냉동 바이알을 제작했다. 100% 아이소프로판올(isopropanol)을 함유한 냉동 컨테이너에 제작한 냉동 바이알을 넣고 -80℃ 초저온 냉동고(DEEP freezer)에서 밤새 보관한 후, 액체질소 저장 탱크(LN2 탱크)에 제작한 냉동 바이알을 넣어 보관하였다.
<5-2>
유사교세포의
해동
액체질소 저장 탱크에 보관한 냉동 바이알을 37℃ 수조에서 약 2분간 해동시키고, 약간의 얼음이 있는 상태의 냉동 바이알 안의 세포를 생물학적 안전 캐비닛(biosafety hood) 안에서 파이펫을 이용해 잘 섞어주었다. 냉동 바이알 안의 1 ㎖의 세포 농축액을 10% FBS 함유한 DMEM 배지 10㎖과 섞어 15㎖ 코니컬 튜브에 넣었다. 원심분리기 1,200 rpm 속도로 5분간 돌려 침전시킨 세포 펠렛을 남기고, 상층액을 모두 흡입(suction)시켰다. 10% 우태아 혈청(FBS)을 함유한 DMEM 배지 1㎖을 15㎖ 코니컬 튜브에 넣어 세포 펠렛을 파이펫으로 풀어주었다. 상기 세포 펠렛 11㎕와 트리판 블루(tryphan blue) 염색약 11㎕을 섞었다. 이 중 10㎕을 세포 계수기에 주입하여 1㎖ 안에 함유된 세포 수를 계산하고, 2,000 cells/cm2 로 세포 배양 접시에 도말하였다.
<
실험예
1> 후기 단계(late-passage) 인간
중간엽
줄기세포(late-passage human mesenchymal stem cells)로부터 유도된 유사교세포(ghMSCs)의 특성 분석
상기 실시예 3의 방법으로 인간 중간엽 줄기세포로부터 유사교세포를 유도하였고, 유도 중인 유사교세포와 유도된 유사교세포를 냉동시키고, 해동하여 분석에 사용하였다. 유도된 유사교세포의 특성을 확인하기 위해, 교세포 마커의 발현 정도를 정량적 RT-PCR 및 면역조직화학 염색으로 확인하였다.
구체적으로, 정량적 RT-PCR은 RNA는 TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 추출되었고, DNase를 처리하였다. cDNA 합성을 위해 M-MLV 역전사 효소(Promega)를 이용하여 42℃에서 1시간 동안 역전사를 진행하였다. SYBR FAST qPCR Kits(KAPA Biosystems)를 사용하여 cDNA에서 발현되는 유전자를 서열번호 1 내지 24의 각 유전자-특이적인 프라이머로 확인하였다. 타겟 유전자의 발현 정도는 Ct 방법을 이용하여 GAPDH를 기준으로 확인하였다. ΔCt 값은 Ct 값을 뺀 값이며, 임계값의 사이클 번호는(ΔCt=Ct(Target)-Ct(GAPDH))로 측정되었다. 내인성 GAPDH에 대한 대상 유전자의 상대적 값은 GAPDH=2-tCt의 fold-change로 결정되었다.
또한, 면역조직화학염색은 배양세포를 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정시키고, 5% 표준 염소 혈청과 0.1% Triton-X100의 블로킹 용액으로 배양하였다. GFAP(1:200; Merck millipore), S100(1:250; Dako)로 하루 동안 4℃ 냉장고에서 염색하였다. 수차례 PBS로 염색 용액을 씻고, 2차 항체 Alexa Fluor®488 anti-mouse IgG (Molecular Probes) 및 Alexa Fluor®546 anti-rabbit IgG (Molecular Probes)로 1시간 동안 실온에서 염색했다. 그 후 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)(Santa Cruz Biotechnology) 로 핵을 염색하였다. 디지털 도립 형광현미경(DM5000B; Leica)으로 시료를 관찰하였다.
그 결과, 도 1b에 나타난 바와 같이, 방사 신경교세포(radial glia) 마커인 Nestin, Sox2, Pax6, Vimentin, GFAP, 성상 아교 세포 마커인 FAP, S100β, SLC1A3과 희소돌기 신경교세포의 마커인 Sox10의 발현이 ghMSC에서 hMSC보다 증가함을 확인하였다. 또한, IGFBP-4와 IGF-1 pregnancy-associated plasma protein-A (PAPP-A)가 ghMSC에서 hMSC 보다 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 1b). 또한, 도 1c 및 도 1d에서 나타난 바와 같이, 희소돌기 신경교세포의 마커인 Sox10 및 GFAP가 전체 유사교세포(ghMSCs)에서 각각 45% 및 40% 발현하는 것을 확인하였다. 상기 결과는 인간 중간엽 줄기세포로부터 유도한 유사교세포에는 주변 세포들의 성장을 도와 주변 환경을 개선시키는 성상 아교 세포, 희소돌기 신경교세포가 많이 포함되어 있어 알츠하이머를 치료할 가능성을 제시한다.
<
실험예
2> 인간
중간엽줄기세포로부터
분화 유도된
유사교세포(ghMSC)가
손상된 신경
줄기 세포의
생존 및 증식에 미치는 효과 확인
<2-1> 아밀로이드 베타
펩타이드
올리고머 및 인간
중간엽
줄기세포로부터 분화된 유사교세포(ghMSC) 배양액(conditioned media, CM)의 준비
아밀로이드 베타 펩타이드(Sigma)를 먼저 디메틸설폭사이드(DMSO; Panreac, Barcelona, Spain)에 5 mM이 되도록 녹여준 다음, DMEM/F-12(Gibco) 배지를 넣어 최종 농도를 1 mM로 만들고 4℃에서 24시간 동안 배양하여 아밀로이드 베타 펩타이드 올리고머를 준비하였다.
<2-2> 인간
중간엽
줄기세포로부터 분화된
유사교세포
(
ghMSC
) 처리에 의한 신경
줄기 세포(NSC)
생존력 측정(1)
아밀로이드 베타에 의해 독성이 유발된 신경 줄기 세포에서 유사교세포(ghMSC)와 공동 배양하였을 때의 세포 생존능을 CCK-8 분석으로 측정하였다.
구체적으로, CCK-8(Dojindo, Kumamoto, Japan)은 WST-8[2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt]와 1-methoxy PMS의 결합하는 정도를 확인함으로써 신경 줄기 세포의 생존력을 측정하기 위해 사용되는 분석 방법이다. 아밀로이드 베타 올리고머에 의해 유도된 신경독성에 대한 유사교세포의 효과를 확인하기 위해 신경 줄기 세포를 미리 코팅한 24-웰 플레이트에 1×105 cells/cm2로 파종하고, 상기 실험예 2-1에서 준비한 20 μM 아밀로이드 베타 올리고머 및 유사교세포가 8×103 cells/cm2로 파종 되어 있는 0.4 μm 공극의 인서트 웰(insert well)을 처리하였다. 또한 신경 줄기 세포가 코팅된 웰 플레이트에 아밀로이드 베타 올리고머 및 상기 실시예 4에서 제조한 ghMSC 배양액(ghMSC-CM)을 동시에 48시간 동안 처리하였다. 그 후 신경 줄기 세포에 300㎕의 배양액과 30㎕의 CCK-8 시약을 넣어 2시간 배양 후 ELISA 플레이트 측정기(Synergy H1 Hybrid reader, BioTek, Winooski, VT, USA)를 통해 450nm와 650nm에서 신경 줄기 세포의 생존력을 측정하였다.
그 결과, 아밀로이드 베타에 의해서 신경 줄기 세포의 생존력이 감소했지만(NSC+Aβ), 아밀로이드 베타와 유사교세포가 처리된 군(NSC+Aβ+ghMSC insert) 및 유사교세포 배양액(NSC+Aβ+ghMSC CM)을 함께 처리했을 경우에는 신경 줄기 세포의 생존력이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 2).
<2-3> 인간
중간엽줄기세포로부터
분화된 유사교세포(
ghMSC
) 처리에 의한 신경
줄기 세포(NSC)
생존력 측정(2)
아밀로이드 베타에 의해 독성이 유발된 신경 줄기 세포에서 유사교세포와 공동 배양하였을 때 세포 생존능을 트라이판 블루(Tryphan blue) 염색법으로 측정하였다.
구체적으로, 상기 실험예 2-3과 동일한 방법 및 조건으로 신경 줄기 세포에 아밀로이드 베타 올리고머 및 유사교세포 인서트 웰 또는 유사교세포 배양액(ghMSC CM)을 동시에 48시간 동안 처리하였다. 그 후, 신경 줄기 세포를 트라이판 블루(trypan blue) 용액(Gibco)로 2분 동안 염색하고, 살아있는 세포와 죽은 세포를 hemocytometer를 이용해 세포를 계수하였다.
그 결과, 아밀로이드 베타에 의해서 신경 줄기 세포의 생존력이 감소했지만(NSC+Aβ), 아밀로이드 베타와 유사교세포가 처리된 군(NSC+Aβ+ghMSC insert) 및 유사교세포 배양액(NSC+Aβ+ghMSC CM)을 함께 처리했을 경우에는 신경 줄기 세포의 생존력이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 3).
<2-4> 인간
중간엽줄기세포로부터
분화된 유사교세포(
ghMSC
) 처리에 의한 신경
줄기 세포(NSC)
세포 독성 측정
아밀로이드 베타에 의해 유발된 신경 줄기 세포의 독성이 유사교세포와의 공동 배양으로 인해 감소하는 것을 젖산탈수소효소(LDH) 분석을 통하여 확인하였다.
구체적으로, Colorimetric Assay Kit(Roche Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN, USA)는 젖산탈수소효소(LDH)를 방출하는 신경 줄기 세포로부터 세포독성을 정량하기 위해 사용한다. 상기 실험예 2-3과 동일한 방법으로 상기 실험예 2-3과 동일한 방법 및 조건으로 신경 줄기 세포에 아밀로이드 베타 올리고머 및 유사교세포 인서트 웰 또는 유사교세포 배양액(ghMSC CM)을 동시에 48시간 동안 처리하고, 신경 줄기 세포를 200g로 10분 동안 27℃에서 원심분리하였다. 그 후, 제조사의 지시에 따라 상등액을 새 96-웰 플레이트에 옮기고 colorimetric 용액을 첨가해 30분 동안 빛을 차단하고 배양하였다. 세포독성은 ELISA 측정기에서 492nm와 690nm의 파장에서 측정하였다.
그 결과, 아밀로이드 베타 독성에 의해 증가되었던 신경 줄기 세포의 세포독성이 유사교세포와의 공동 배양으로 인해 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 4).
<2-5>
인간
중간엽줄기세포로부터
분화된 유사교세포(
ghMSC
) 처리에 의한 신경
줄기 세포(NSC)
세포 증식력 측정
아밀로이드 베타와 유사교세포가 신경 줄기 세포의 증식력에 어떤 영향을 미치는지 확인하고자 BrdU 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실험예 2-3과 동일한 방법 및 조건으로 신경 줄기 세포에 아밀로이드 베타 올리고머 및 유사교세포 인서트 웰 또는 유사교세포 배양액(ghMSC CM)을 동시에 48시간 동안 처리하였다. BrdU Labeling and Detection Kit(Roche Boehringer-Mannheim) 제조사의 지시에 따라 세포를 10 μM BrdU로 18시간 동안 표지하고, 고정 용액으로 30분 동안 고정시켰다. 고정된 세포에 300㎕의 anti-BrdU-POD working solution을 넣고 2시간 동안 빛을 차단하며 배양하였다. 세포를 세척 용액으로 세 번 세척한 후 300㎕의 기질로 반응시켰다. 빛을 차단하고 5분 동안 배양 후, 세포의 증식력을 ELISA 측정기에서 370nm와 492nm의 파장에서 측정하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 아밀로이드 베타 독성에 의해 감소되었던 신경 줄기 세포의 증식력이 유사교세포와의 공동 배양으로 인해 증가된 것을 확인하였다(n=4).
<
실험예
3> 염증조절복합체(
inflammasome
)의 발현 변화 측정
아밀로이드 베타에 의해 독성이 유발된 신경 줄기 세포에서 유사교세포와 공동 배양하였을 때 NLRP3, caspase-1, 및 IL-1β와 같은 염증조절복합체(inflammasome) 인자들의 발현 정도를 확인하기 위해 웨스턴 블랏팅을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실험예 2-3과 동일한 방법 및 조건으로 신경 줄기 세포에 아밀로이드 베타 올리고머 및 유사교세포 농축액을 48시간 동안 처리하고, 세포를 스크래퍼로 모아 6,000×g로 2분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 세포 펠렛은 차가운 D-PBS로 두 번 헹군 후, lysis buffer(RIPA II cell lysis buffer 1× with Triton, without ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA); 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF); 1 mM sodium fluoride (NaF); 1 mM sodium orthovanadate (Na3VO4); 및 0.5% protease inhibitor cocktail 1×)를 넣고 얼음 위에서 30분 동안 배양하였다. 그 후, 세포들을 소니케이터(Sonoplus, Bandelin Electronics, Berlin, Germany)를 이용해 여러 번 초음파 처리하고 얼음 위에서 다시 30분 동안 배양하였다. 이러한 세포 용해물을 21,100 × g로 15분 동안 4℃에서 원심분리하고, bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (Sigma)를 이용해 단백질 농도를 정량하였다. 같은 양의 단백질을 가지는 용해물 샘플들을 4-12% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE, Invitrogen)에 로딩하였다. SDS-PAGE 진행 후, 단백질들을 PVDF 막 (Millipore, Bedford, MA, USA)으로 옮겨 5% 탈지 분유로 반응을 blocking하고 특정 1차 항체들과 함께 배양하였다. 상기 1차 항체는: NLRP3 (2 ㎍/㎖, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA), caspase-1 (2.5 ㎍/㎖, Novus Biologicals), IL-1β (0.4 ㎍/㎖, Abcam, Burlingame, CA, USA), 그리고 β-액틴(1:4000, Cell signaling, Beverly, MA, USA)와 같다. 막은은 Tris-buffered saline containing 0.1% Tween-20 (TBST)로 세 번 헹군 후, HRP-결합된 항-토끼 항체 (1:2000, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA)와 배양하였다. 막은 West-Q Chemiluminescent substrate kit (GenDEPOT, Katy, TX, USA)에 의해 시각화 되어 이미지 분석기 (ImageQuant LAS 4000; GE Healthcare, Little Chalfont, UK)로 측정하였다.
그 결과, 도 6a 내지 도 6d에 나타난 바와 같이, 아밀로이드 베타를 처리한 신경 줄기 세포(NSC+Aβ)에서 염증 반응이 증가하여 염증조절복합체인 NLRP3, caspase-1, 및 전염증성 사이토카인인 IL-1β의 발현 정도가 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 그러나 이러한 증가한 염증 반응은 유사교세포와 공동 배양(NSC+Aβ+ghMSC)을 통하여 통계적으로 유의할 정도로 발현이 감소한 것을 확인할 수 있었다.
<
실험예
4> 알츠하이머 유발 마우스 모델에서 인간 유사교세포의 알츠하이머 치료 효과 확인
<4-1>
실험 동물의
준비
3xtg 마우스(B6;129, 13개월령, 50±5g)는 The Jackson laboratory(Bar harbor, ME, USA)로부터 구매하였으며, 12시간의 조명주기(08:00~20:00)로 SPF 상태인 한양대학교 실험동물센터(온도 22±2℃, 상대습도 50±10%)에서 사육하였다. 모든 마우스는 방사선 조사된 사료를 자유 급식하도록 하였다. 또한 한양대학교 동물실험윤리위원회 (HNU-IACUC)로부터 과학성과 윤리성에 대한 심사를 거쳐 승인을 받아 수행되었다. 실험 동물은 3개 그룹(비히클 투여 3xTg 그룹, 신경 줄기 세포 투여 3xTg 그룹, 유사교세포 투여 3xTg 그룹)으로 분류하였고, 각 그룹당 5마리씩 배정하였다. 알츠하이머 질환이 유도된 마우스 모델을 이소플루란(Ifran Liq, Hana Pharm, Korea)을 이용해서 마취하고, stereotaxic 기법으로 뇌 내에(AP=-2, L=1, V=1.5) 직접 비히클, 신경 줄기 세포 또는 유사교세포가 투여되었다. 비히클 투여 3xTg 그룹은 neurobasal media(3㎕)를 투여하고, hMSC 투여 3xTg 그룹, ghMSC 투여 3xTg 그룹은 각각 hMSC, ghMSC 2×105 의 세포를 neurobasal media(3㎕)에 분주하여 뇌 내 투여(1회/2주 간격/4번) 하였다. 투여 종료 후 일주일 뒤 모든 마우스는 하기 실험예 4-2 및 4-3의 행동 측정을 실시하였다.
<4-2> 인간 유사교세포 투여가 알츠하이머 질환 마우스 모델에서 해마 의존적 공간 학습 능력에 미치는 영향 확인
알츠하이머 질환이 유도된 마우스 모델에서 인간 유사교세포의 투여가 해마 의존적 공간 학습 능력에 미치는 영향을 확인하기 위해 하기와 같이 모리스 수중 미로 실험을 수행하였다.
구체적으로, 모리스 수중 미로 실험은 5일간은 학습 훈련을, 6일째에는 공간 기억력을 측정하고 7일차부터는 도피대의 위치를 바꾸어 실험하였다. 모리스 수중 미로 실험 장치는 원형 수조와 도피대 및 Computerized video-tracking system camera(Jeoungdo B&P, Korea)로 구성되었다. 수조에는 온도가 24 ± 1℃ 되는 물을 채운 뒤, White icing color(Wilton Co, USA) 약 20ml를 물에 풀어 도피대가 보이지 않도록 하였다. 실험 기간 동안 실험대, 컴퓨터, 의자 등 실험실 내 환경 및 실험자의 위치 또한 일정하게 유지하였다. 수중 미로는 북동(NE), 북서(NW), 남동(SE), 남서(SW)의 사분면으로 나누어 구분하였으며, 이중 남서(SW) 사분면의 중앙부에 도피대를 설치하였다. 수중 미로 학습 훈련은 실험동물 당 1일 4회 12일간 동일한 시간대에 실시하였으며, 매 수영 때마다 실험동물의 머리를 사분면의 각기 다른 방향으로 향하게 한 상태로 수영을 시작하게 하였다. 실험 동물이 60초 동안 수조 속에서 자유롭게 수영하면서 스스로 숨겨진 도피대를 찾아 올라가도록 하였으며, 스스로 도피대를 찾아낸 실험동물은 15초간 도피대 위에서 머물면서 자유롭게 주위를 관찰하도록 하였고 도피대에 도달한 시간을 기록하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 모리스 수중 미로에서 Escape latency의 감소는 장기 기억과 관련된 학습능력을 나타내는 것으로, 하루 4번 12일간 인지 훈련을 실행한 결과 escape latency가 감소하지 않는 비히클 투여 그룹에 비해 인간 유사교세포(ghMSC) 투여 그룹에서 escape latency가 점점 감소하여 3,4,6일과 Reverse 3,4,5일에서 유의한 차이를 보였다. 4일 째에서는 대조군인 인간 중간엽 줄기세포(hMSC) 투여군에 대조하여 인간 유사교세포(ghMSC) 투여 그룹에서 escape latency가 점점 감소하여 유의한 차이를 보였다. 상기 결과는 인간 유사교세포(ghMSC) 가 공간지각능력에 대한 장기 기억력 개선에 치료 효과를 나타냄을 제시한다.
<4-3> 인간 유사교세포 투여가 알츠하이머 질환 마우스 모델에서 공간
인지력에
미치는 영향 확인
알츠하이머 질환이 유도된 마우스 모델에서 인간 유사교세포의 투여가 공간 인지력에 미치는 영향을 확인하기 위해 하기와 같이 Y자 미로 실험을 수행하였다.
실험에 사용된 Y자 미로는 불투명 아크릴 재질로 3개의 arm으로 구성되어 있으며, 각 arm을 A,B,C로 정한 후 중심에 실험 동물을 놓고 5분간 이동경로를 기록하였다(1회/2일 간격/6번). 3개의 서로 다른 arm에 차례로 들어간 경우 1점씩 부여하고, 총 통과 횟수로 나눈 뒤 100을 곱하여 계산하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 5분 동안 실험 동물의 행동을 관찰한 결과, ghMSC 투여 그룹이 비히클 투여 그룹에 비해 유의적인 차이는 없었으나 높은 수치를 나타내어 기억력 및 공간 인지력이 개선된 결과를 보였다. 상기 결과는 인간 유사교세포(ghMSC)가 알츠하이머로 인한 기억력 및 공간 인지력 저하개선에 효과를 나타냄을 제시한다.
<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY R&DB FOUNDATION
Industry-university Cooperation Foundation Hanyang University
<120> A pharmaceutical composition for treating Alzheimer's disease
comprising glia-like cell induced from late-passage human
mesenchymal stem cells as an active ingredient
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<150> KR 10-2019-0103217
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<160> 24
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH forward primer
<400> 1
gtcagtggtg gacctgacct 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH reverse primer
<400> 2
caccaccctg ttgctgtagc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GFAP forward primer
<400> 3
caacctgcag attcgagaaa 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GFAP reverse primer
<400> 4
gtcctgcctc acatcacatc 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nestin forward primer
<400> 5
cacctgtgcc agcctttctt a 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nestin reverse primer
<400> 6
tttcctccca ccctgtgtct 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sox2 forward primer
<400> 7
agtctccaag cgacgaaaaa 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sox2 reverse primer
<400> 8
gcaagaagcc tctccttgaa 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pax6 forward primer
<400> 9
aggtattacg agactggctc c 21
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pax6 reverse primer
<400> 10
tcccgcttat actgggctat tt 22
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vimentin forward primer
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agaactttgc cgttgaagct g 21
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vimentin reverse primer
<400> 12
ccagagggag tgaatccaga tta 23
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sox10 forward primer
<400> 13
cggaccagta cccgcacct 19
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sox10 reverse primer
<400> 14
ggcgcttgtc actttcgttc a 21
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S100beta forward primer
<400> 15
ggagacggcg aatgtgactt 20
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> S100beta reverse primer
<400> 16
gaactcgtgg caggcagtag taa 23
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PDGFR alpha forward primer
<400> 17
tacacttgct attacaacca ca 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> PDGFR alpha reverse primer
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atcctccacg atgactaaat 20
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLC1A3 forward primer
<400> 19
ggttgctgca agcactcatc ac 22
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLC1A3 reverse primer
<400> 20
cacgccattg ttctcttcca gg 22
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLC1A2 forward primer
<400> 21
tgccaacaga ggacatcagc ct 22
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLC1A2 reverse primer
<400> 22
cagctcagac ttggagaggt ga 22
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAPP A forward primer
<400> 23
cagaatgcac tgttacctgg a 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PAPP A reverse primer
<400> 24
gctgatccca attctctttc a 21
Claims (11)
- 유사교세포(glia-like cell)로 분화 유도된 후기 단계(late-passage)의 인간 중간엽 줄기세포(ghMSC)를 유효성분으로 함유하는 알츠하이머 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 유사교세포는 희소 돌기 아교 세포(oligodendroglia), 성상 아교 세포(astrocyte), 미세 아교 세포(microglia) 및 방사 신경교세포(radial glia)로 구성된 군으로부터 어느 하나 이상인 것인, 알츠하이머 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 후기(late-passage) 인간 중간엽 줄기세포는 10 내지 15 passage인 것인, 알츠하이머 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 ghMSC는 골수, 지방조직, 혈액, 제대혈, 간장, 피부, 위장관, 태반 및 자궁으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 유래되는 것인, 알츠하이머 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 염증조절복합체(inflammasome) 인자들의 발현을 감소시키는 것인, 알츠하이머 치료용 약학적 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 염증조절복합체는 NLRP3(NLR family pyrin domain-containing protein 3), 카스파아제-1(caspase-1), 및 IL-1β로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 알츠하이머 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 해마 의존적 공간 학습 능력을 향상시키는 것인, 알츠하이머 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 공간 인지력을 향상시키는 것인, 알츠하이머 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 ghMSC는 6×105 내지 6×107 세포/㎏으로 투여되는 것인, 알츠하이머 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 ghMSC는 세포 치료제로 사용되는 것인, 알츠하이머 치료용 약학적 조성물.
- 삭제
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