KR20140145011A - EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 증식 및 치료능력 탐지 마커 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 EGF(Epidermal growth factor) 또는 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 증식능력 또는 치료능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물 및 탐지방법에 관한 것이다.

Description

EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 증식 및 치료능력 탐지 마커 및 이의 용도{Detection markers of proliferation and therapeutic potency of adipocyte-derived stem cells cultured in media containing EGF or bFGF and use thereof}
본 발명은 EGF(Epidermal growth factor) 또는 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하는 배지에서 배양한, 지방유래 줄기세포의 치료능력 또는 증식능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물 및 탐지방법에 관한 것이다.
지방조직은 이와 동량의 골수에서 분리할 수 있는 줄기세포에 비하여 1,000배 이상의 줄기세포를 다량 포함하고 있어, 이러한 이유로 지방조직 유래 줄기세포(adipocyte-derived stem cells, ASC)를 생체이식 재료로 이용하고자 하는 연구가 다양하게 진행되고 있다. 지방유래 줄기세포는 또한, 골수유래 줄기세포와 같은 다분화능을 가지고 있어 연골, 뼈, 지방 또는 근육세포 등으로 분화가 가능하다. 또한, 지방유래 줄기세포는 골수유래 줄기세포와 세포 표면 마커의 발현양상이 유사하고 in vivo 및 in vitro 모두에서 자가 또는 동종 이식시에도 면역반응을 유발시키지 않고, 오히려 면역반응을 조절하는 기능을 갖는 것으로 보고되고 있어 세포치료의 효과적인 수단으로서 각광받고 있다.
한편, 기존에 개시된 기저배지를 이용한 표준 세포배양법을 사용하여 지방유래 줄기세포를 체외배양 하는 경우, 세포배양에 장시간이 소요되어 임상적으로 유효한 세포 수를 얻기에 어려웠다. 따라서 표준 세포배양법의 경우, 실제 임상 적용에 있어 실효성이 떨어지는 문제점이 있었다. 이에 본 발명자들은 효과적인 임상적 치료방법을 보일 수 있는 배양법을 개발하고자 하였고, 이에 EGF(Epidermal growth factor) 또는 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하는 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포가 표준 세포배양법에 의한 지방유래 줄기세포에 비해 우수한 임상적 효과를 가짐을 확인하였으나(대한민국 공개특허 제10-2010-0118491호), 상기와 같은 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 우수한 임상적 효능과 관련된 객관적인 분자생물학적 특성분석은 아직 이루어지지 않은 상태이다.
특히, 기저배지에서 배양된 줄기세포에 비해 증식배지에서 배양된 줄기세포의 우수한 세포증식과 치료효과를 대변하면서, 일정 수준 이상의 치료 효과를 가지는 줄기세포 치료제를 실제 의약품으로서 재현성있게 생산하기 위해서는, 상기와 같은 증식배지를 이용한 개선된 배양법에 의해 획득한 줄기세포의 분화능력, 증식능력 및 역가와 같은 약효를 반영할 수 있는 품질관리 시험법 개발이 필요하다. 특히, 세포치료제 수율 증가 및 치료제 품질을 측정하는 방법을 개발하기 위해서는 이를 대변할 바이오 마커가 필요하다.
이러한 배경하에 본 발명자들은, 지방유래 줄기세포가 기저배지에 비해 증식배지에서 배양하는 경우, 그 증식능이 우수하며, 또한 오랜 계대 배양에도 줄기세포의 특성을 잘 유지하며 분열할 수 있을 뿐만 아니라, 분화능을 비롯한 치료적 효능이 높다는 점에 착안하여, 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포와 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포 간의 발현 차이를 보이는 마커를 개발하고자 예의 노력한 결과, AGPAT9(1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase 9), ANXA10(annexin A10), IGF2BP3(insulin-like growth factor 2 binding protein 3) 및 PTGER2(prostaglandin E receptor 2) 유전자의 발현이 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에서 증가되어 있고, ITGA11(integrin, alpha 11), PAWR(PRKC, apoptosis, WT1, regulator) 및 SFRP2(secreted frizzled-related protein 2) 유전자의 발현이 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에서 감소되어 있음을 확인하여, 상기 유전자들은 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 증식능력, 면역억제능, 분화능력 등을 비롯한 치료적 활성 측정 등에 이용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 AGPAT9(1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase 9), ANXA10(annexin A10), IGF2BP3(insulin-like growth factor 2 binding protein 3), PTGER2(prostaglandin E receptor 2), ITGA11(integrin, alpha 11), PAWR(PRKC, apoptosis, WT1, regulator) 및 SFRP2(secreted frizzled-related protein 2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, EGF(Epidermal growth factor) 또는 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 치료능력 탐지를 위한 마커 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 증식능력 탐지를 위한 마커 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 마커 검출용 조성물을 포함하는, EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 치료능력 및 증식능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 지방유래 줄기세포의 치료능력 또는 증식능력을 탐지하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 치료능력 탐지 마커 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "지방유래 줄기세포(adipocyte-derived stem cell, ASC)"는 지방세포, 골모세포, 연골모세포, 근섬유모세포 등 대부분의 중간엽 세포로 분화할 수 있는 지방조직으로부터 분리된 줄기세포로서, 지방전구세포, 기질세포, 다분화능 지방유래 세포(multipotent adipose-derived cells) 또는 지방유래 성체줄기세포(adipose derived adult stem cells) 등으로 불려온 세포를 의미한다. 상기 지방유래 줄기세포는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 인간에게 이식할 수 있는 돼지, 소, 영장류 및 인간 등을 포함하는 포유류로부터 유래한 지방유래 줄기세포일 수 있다.
본 발명에서 용어, "EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 치료능력을 탐지하기 위한 마커"란 EGF 또는 bFGF를 포함하지 않은 기저배지에서 배양한 세포와 EGF 또는 bFGF를 포함하는 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포를 비교했을 때, 그 발현 여부에 유의한 차이를 보이는 유기 생체 분자를 의미한다. 또한, 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포는 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에 비하여 면역억제능력 또는 분화능력 등의 치료능력이 우수하다(대한민국 공개특허 제10-2010-0118491호). 따라서, 기저배지와 비교하였을 때 발현량의 차이를 확인함으로써 지방유래 줄기세포의 치료능력을 탐지할 수 있는 마커를 의미하며, 구체적으로는 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR 및 SFRP2로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자로서, 증식배지에서 배양된 지방유래 줄기세포에서 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3 및 PTGER2는 기본배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에 비하여 그 발현이 증가되고, ITGA11, PAWR 및 SFRP2는 그 발현이 감소되는 유전자이다.
또한, 본 발명에서 사용되는 상기 유전자들은 미국국립보건원의 GenBank 등 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 그 예로 AGPAT9(NM_032717.3, NP_001243351.1), ANXA10(NM_007193.3, NP_009124.2), IGF2BP3(NM_006547.2, NP_006538.2), PTGER2(NM_000956.2, NP_000947.2), ITGA11(NM_001004439.1, NP_001004439.1), PAWR(NM_002583.2, NP_002574.2) 또는 SFRP2(NM_003013.2, NP_003004.1)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포와 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포를 서로 비교하였을 때, 상기 유전자들은 양 배지에서 발현의 차이를 보이므로, 이러한 발현 차이에 기초하여 상기 유전자들은 지방유래 줄기세포의 치료능력 탐지를 위한 마커로서 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, “EGF(epidermal growth factor)”란 이의 수용체인 EGFRdp 결합하여 세포의 증식, 성장 및 분화를 촉진할 수 있는 성장인자를 의미한다. 상기 EGF는 여러 가지 상피세포의 증식을 촉진하는 활성을 가지며 생쥐의 T세포나, 사람의 섬유아세포도 증식시킬 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 EGF는 지방유래 줄기세포의 배양배지에 포함되어 이의 증식 및 분화능력과 같은 치료적 활성을 상승시키는 역할을 하는 단백질을 의미한다.
본 발명에서 용어, “bFGF(basic fibroblast growth factor)”란 혈관신생 또는 상처치료 등과 같은 생물학적 과정에 관여하는 성장인자이다. 본 발명의 목적상 상기 bFGF는 상기 EGF와 같이 지방유래 줄기세포의 배지에 포함되어 이의 증식 및 분화능력과 같은 치료적 활성을 상승시키는 역할을 하는 단백질을 의미한다.
본 발명에서 용어, "기저배지"는 지방유래 줄기세포, 특히 이를 포함하는 스트로마-혈관 분획을 배양하기 위한 배지이다. 상기 기본배지는 DMEM 배지, 또는 DMEM/F12 등의 지방유래 줄기세포의 배양에 혈청을 포함하는 배지일 수 있으며, 상기 혈청은 세포배양에 통상적으로 사용되는 FBS(Fetal bovine serum) 등일 수 있으며, 이는 약 10% 내외, 즉 8 내지 12% 가량으로 포함될 수 있으나, 당업계에 통상적으로 사용되는 지방유래 줄기세포 배양배지라면 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 기저배지로서 10% FBS가 포함된 DMEM 배지를 이용하였다. 본 발명에서 상기 “기저배지”는 “기본배지”와 혼용될 수 있다.
본 발명에서 용어, “증식배지”는 지방유래 줄기세포의 증식능 또는 분화능의 향상을 위해 사용되는 배지로서, 상기 기저배지에 bFGF(basic fibroblast growth factor) 또는 EGF(epidermal growth factor)를 추가로 하는 배지를 말한다. 상기 증식배지에는 EGF 또는 bFGF를 각각 0.1 ng/㎖ 내지 100 ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다. 본 발명에서 상기 “증식배지”는 “EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지”와 혼용될 수 있다.
상기 기저배지 및 증식배지에 대한 정보 등은 대한민국 공개특허 제10-2010-0118491호에 개시되어 있으며, 상기 제10-2010-0118491호의 명세서 전체는 본 발명의 참고자료로서 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, “치료능력”이란 줄기세포의 치료적 활성(therapeutic activity)을 의미하며, 본 발명의 줄기세포를 세포치료제 등으로 사용할 경우 “역가”라고도 한다. 바람직하게는 지방유래 줄기세포의 증식능력, 분화능력, 면역조절능력 또는 이들 능력 모두를 의미하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "분화능력"이란 지방유래 줄기세포가 지방세포, 골모세포, 연골모세포, 근섬유모세포, 골모세포, 근육세포 또는 신경세포 등으로 분화될 수 있는 능력을 의미한다. 본 발명에서 분화능력이 높은 지방유래 줄기세포는 지방세포, 골모세포, 연골모세포, 근섬유모세포, 골모세포, 근육세포 또는 신경세포로의 분화 유도가 용이하게 일어나는 세포를 의미하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 “면역조절능력”은 바람직하게는 면역억제능력을 말하며, 상기 면역억제능력은 bFGF 또는 EGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래줄기세포가 면역 세포의 활성을 억제할 수 있는 것을 의미한다. 특히, 중간엽 줄기세포의 경우 APC(antigen presenting cell)를 억제함으로써 면역억제효과에 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 지방유래 줄기세포를 면역억제제로 사용하여 면역질환을 치료할 수 있다.
본 발명에서 “치료능력이 높은 지방유래 줄기세포”는, 기저배지에서 배양된 지방유래 줄기세포에 비하여 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3 및 PTGER2로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현 수준이 증가되어 있고, ITGA11, PAWR 및 SFRP2로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현이 감소되어 있는 지방유래 줄기세포로서, 기저배지에서 배양된 지방유래 줄기세포에 비하여 세포증식이 빠르거나 면역 억제능이 좋거나 분화 효율이 높은 등 치료제로서의 활성(역가)이 좋은 지방유래 줄기세포를 의미한다.
이와 같은 유전자의 발현 수준은 mRNA 또는 단백질의 양을 측정함으로써 확인할 수 있다.
본 발명에서 용어, “mRNA 수준 측정”이란 지방유래 줄기세포의 분화능력을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 지방유래 줄기세포의 치료능력을 나타내는 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 유전자 mRNA의 수준을 RT-PCR 및 Real-time PCR을 통하여 확인하였다(실시예 3).
유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 쌍 또는 프로브이며, AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR 및 SFRP2 유전자의 핵산 서열은 각각 NM_032717.3, NM_007193.3, NM_006547.2, NM_000956.2, NM_001004439.1, NM_002583.2 및 NM_003013.2에 밝혀져 있으므로, 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
본 발명에서 용어, "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본 발명에서 프라이머는 바람직하게는 AGPAT9에 대한 프라이머는 서열번호 3 및 4인 프라이머 쌍, ANXA10에 대한 프라이머는 서열번호 5 및 6인 프라이머 쌍, IGF2BP3에 대한 프라이머는 서열번호 7 및 8인 프라이머 쌍, PTGER2에 대한 프라이머는 서열번호 9 및 10인 프라이머쌍, ITGA11에 대한 프라이머는 서열번호 11 및 12인 프라이머쌍, PAWR에 대한 프라이머는 서열번호 13 및 14인 프라이머쌍, 또는 SFRP2에 대한 프라이머는 서열번호 15 및 16인 프라이머쌍일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수개의 염기 내지는 수백개의 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링이 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브 또는 RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR 또는 SFRP2 폴리뉴클레오타이드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 지방유래 줄기세포의 분화 능력을 알 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자에 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그날을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자 및 바이오틴 등이 있다.
본 발명에서 용어, “단백질 수준측정”이란 지방유래 줄기세포의 분화능력을 탐지하기 위하여 생물학적 시료에서 지방유래 줄기세포의 치료능력을 나타내는 마커 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다.
본 발명에서 용어, “항체”란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하고, 구체적으로는 본 발명의 마커 유전자인 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR 또는 SFRP2가 코딩하는 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 본 발명의 마커 단백질이 규명되었으므로 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 다클론 항체는 상기 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 및 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다. 단일클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol.,222:58, 1-597, 1991) 기술 등을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다. 또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다. 단백질 수준의 측정 방법으로는 웨스턴 블랏(Western blot), 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 웨스턴 블랏을 이용하여 상기 단백질의 수준을 측정하였다 (실시예 4).
본 발명의 일 실시예에서는 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포가 상기 인자를 포함하지 않은 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포보다 증식능력, 면역억제, 혹은 분화능력 등의 치료활성이 우수함에 기초하여(대한민국 공개특허 제10-2010-0118491호), EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포와 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포 간의 발현에 유의한 차이를 보이는 유전자를 확인한 결과, EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에서는 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3 및 PTGER2의 발현이 증가되어 있고, ITGA11, PAWR 및 SFRP2의 발현이 감소되어 있음을 확인하였다(도 4 및 도 5). 이에, AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3 및 PTGER2 단백질의 높은 발현 수준이나 ITGA11, PAWR 또는 SFRP2 단백질의 낮은 발현 수준이 지방유래 줄기세포의 치료활성을 나타낼 수 있는 마커가 될 수 있음을 확인하였다(도 6).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 증식능력 탐지를 위한 마커 검출용 조성물을 제공한다.
상기 지방유래 줄기세포, EGF, bFGF, mRNA 또는 이의 단백질 수준의 측정 및 유전자들에 대해서는 상기에서 기재한 바와 같다.
본 발명에서 용어, “증식능력”이란 세포가 자율적, 또는 호르몬 등의 외인적 자극에 의해 DNA합성, 세포분열을 수반하는 세포수의 증가를 할 수 있는 능력을 말하며, 증식하지 않고 있지만 그 능력을 잠재적으로 유지하고 있는 경우도 포함된다. 줄기세포는 in vitro 배양시 자가 복제능(Self renewal capacity)이 있어 증식능을 가지나, 계대배양이 진행될수록 증식능이 감소하여 결과적으로 순수하고 많은 양의 줄기세포를 얻는 데는 한계점이 있다. 따라서, 줄기세포를 치료제로서 효과적으로 이용하기 위해서는 단기간에 많은 양의 줄기세포를 수득할 수 있는 배양법이 필요하다.
본 발명에서는 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양된 지방유래 줄기세포가 기저배지에서 배양된 지방유래 줄기세포에 비해 증식능력이 우수함을 확인하였고, 이러한 증식능력의 차이를 나타내는, 기저배지 또는 증식배지에서 배양된 지방유래 줄기세포 간의 발현 차이를 보이는 유전자를 규명하였다.
구체적으로, 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포는 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, 및 PTGER2으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현이 기저배지에서 배양된 지방유래 줄기세포에 비하여 증가되어 있고, ITGA11, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현이 기저배지에서 배양된 지방유래 줄기세포에 비하여 감소되어 있다. 상기와 같은 발현 특징을 보이는 지방유래 줄기세포는, 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포, 특히 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, 또는 PTGER2 유전자의 발현이 감소되어 있거나, ITGA11, PAWR 또는 SFRP2 유전자의 발현이 증가되어 있는 지방유래 줄기세포에 비하여 세포증식이 잘 일어나서 세포수율이 높으며, 또한 세포증식, 면역억제, 분화능력과 같은 임상적 치료효과가 높은 특징을 보인다.
본 발명의 일 실시예에서는 기저배지와 증식배지에서 같은 양의 지방유래 줄기세포를 5계대 동안 키웠을 때 증식배지에서의 세포증식이 평균 2배 이상 증가한 것을 확인하였다(실시예 1 및 도 2).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 분화능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물을 포함하는, EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 분화능력 탐지를 위한 마커 검출용 키트를 제공한다.
상기 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 분화능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물에 대해서는 상기에서 언급한 바와 같다.
본 발명의 마커 검출용 키트에는 EGF 또는 bFGF를 포함하는 증식배지에서 배양함에 따라 발현이 증가 또는 감소하는 마커 유전자 또는 이들의 단백질을 선택적으로 인지할 수 있는 프라이머 또는 항체뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구 및 시약 등이 포함된다. 이러한 도구나 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소의 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 마커 검출용 키트는 바람직하게는 RT-PCR 키트, DNA 키트 또는 단백질 칩 키트일 수 있다. 상기 단백질 칩에 상기 유전자가 코딩하는 단백질에 대한 항체가 제공되는 경우에는, 2개 이상의 항체에 대한 항원-항체 복합체 형성을 관측할 수 있어 지방유래 줄기세포의 분화능력 탐지에 있어 보다 유리하다.
상기 RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함할 수 있으며, 그 외 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
상기 DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있으며, 상기 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
상기 단백질 칩 키트는 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 키트일 수 있다. 단백질 칩을 이용하는 방법은 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성하고, 이를 판독하여 단백질의 존재 또는 발현수준을 확인할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 마이크로어레이를 이용하여 기저배지와 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 마커 유전자들의 발현 차이를 확인하였다(실시예 2 및 도 3).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 증식능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물을 포함하는, EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 증식능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 키트를 제공한다.
상기 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 증식능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 조성물 및 사용할 수 있는 마커 검출용 키트는 상기에서 설명한 바와 같다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 지방유래 줄기세포의 분화능력을 탐지하는 방법을 제공한다.
상기 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지, 상기 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준 측정 및 지방유래 줄기세포의 분화능력에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 방법은 추가적으로, ITGA11, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 양이 대조군인 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에서 측정한 값에 비해 적으면, 분화능력이 대조군에 비하여 높은 것으로 판단하는 단계, 또는 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3 및 PTGER2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 양이 대조군인 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에서 측정한 값에 비해 많으면, 분화능력이 대조군에 비하여 낮은 것으로 판단하는 단계를 포함하는 지방유래 줄기세포의 분화능력을 탐지하는 방법일 수 있다. 이 때, 대조군인 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포와 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포는 계대수가 동일하거나 1 계대 이하 차이인 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서는 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포가 상기 인자를 포함하지 않은 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포보다 증식능력, 분화능력 등의 치료활성이 우수함에 기초하여(대한민국 공개특허 제10-2010-0118491호), EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포와 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포 간의 발현에 유의한 차이를 보이는 유전자를 확인한 결과, EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에서는 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3 및 PTGER2의 발현이 증가되어 있고, ITGA11, PAWR 및 SFRP2의 발현이 감소되어 있음을 확인하였다(도 4 및 도 5). 따라서 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3 및 PTGER2의 발현이 증가되어 있거나 ITGA11, PAWR 및 SFRP2의 발현이 감소되어 있는 지방유래 줄기세포는, AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3 및 PTGER2의 발현이 감소되어 있거나 ITGA11, PAWR 및 SFRP2의 발현이 증가되어 있는 지방유래 줄기세포에 비하여 분화능력이 우수함을 시사한다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 지방유래 줄기세포의 증식능력을 탐지하는 방법을 제공한다.
상기 EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지, 상기 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준 측정 및 지방유래 줄기세포의 증식능력에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
바람직하게는 ITGA11, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 양이 대조군인 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에서 측정한 값에 비해 적으면, 증식능력이 대조군에 비하여 높은 것으로 판단하는 단계, 또는 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3 및 PTGER2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 양이 대조군인 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에서 측정한 값에 비해 많으면, 증식능력이 대조군에 비하여 낮은 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는 지방유래 줄기세포의 증식능력을 탐지하는 방법일 수 있다.
본 발명은 증식배지에서 배양된 임상적 효능이 증가된 지방유래 줄기세포를 판단할 수 있는 마커들을 제공함으로써 지방유래 줄기세포의 효능을 검증하는 것에 있어 보다 유용한 자료를 제공할 수 있다. 또한 개선된 배양법을 이용하여 배양한 지방유래 줄기세포의 증식능력, 분화능력 등으로 대변되는 치료제 활성을 탐지하는 마커로서 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 기저배지와 증식배지에서의 지방유래 줄기세포의 세포형상을 나타낸 그림이다.
도 2는 기저배지와 증식배지에서의 지방유래 줄기세포의 세포성장 차이를 나타낸 그림이다.
도 3은 Illumina 24K chip을 이용한 3 세트의 기저배지에서 배양한 세포와 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 마이크로어레이 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 17명의 공여자로부터 채취한 지방유래 줄기세포에서 도 3에서 선별한 증식배지에서 증가하는 유전자들의 발현양 변화를 RT-PCR과 real-time PCR을 통해 증명한 것으로, RPL13A는 대조 유전자이다. 도 4a는 증식배지에서 증가하는 APPAT9의 결과를 나타낸 것이고, 도 4b는 ANXA10, 도 4c는 IGF2BP3, 도 4d는 PTGER2의 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 17명의 공여자로부터 채취한 지방유래 줄기세포에서 도 3에서 선별한 증식배지에서 감소하는 유전자들의 발현량 변화를 RT-PCR과 real-time PCR 을 통해 증명한 것으로, RPL13A는 대조 유전자이다. 도 5a는 증식배지에서 감소하는 ITGA11의 결과를 나타낸 것이며 도 5b는 PAWR, 도 5c는 SFRP2의 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 상기 유전자들의 기저배지와 증식배지에서의 단백질 변화를 나타낸 결과이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에서 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 기저배지와 증식배지에 따른 지방유래 줄기세포의 세포증식 능력 검증
실시예 1-1: 인간 지방 유래 스트로마 줄기세포의 배양
공여자로부터 지방 조직을 분리하였고(안트로젠, 경기도, 대한민국), 얻어진 지방 조직으로부터 지방 유래 스트로마 줄기세포를 분리하였다. 혈액을 제거하기 위해 지방 조직을 같은 부피의 KRB(Krebs-Ringer Bicarbonate) 용액으로 34회 세척하였다. 지방 조직과 같은 부피의 콜라게나제 용액을 넣어 37℃ 수욕에서 반응시켰다. 이를 원심분리용 튜브에 옮겨 넣고 20℃, 1200 rpm에서 10 분 동안 원심분리하였다. 상층액인 지방층을 제거하고, 아래층인 콜라게나제 용액을 흔들리지 않도록 조심해서 분리하였다. 기저배지를 넣어 현탁시킨 후, 20℃, 1200 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 이때, 아래에 가라앉는 것이 스트로마-혈관 분획이므로, 상층액을 제거하였다. 스트로마-혈관 분획을 기저배지에 현탁시켜 배양용기에 접종하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양액 제거 후 인산염 완충용액으로 세척하고, 기저배지, 또는 기저배지에 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)가 1 ng/㎖ 농도로 포함된 배지, 또는 기저배지에 표피세포 성장인자(EGF)가 5 ng/㎖ 농도로 포함된 배지를 이용하여 증식시켰다. 지방유래 스트로마 줄기세포가 배양용기의 80-90% 정도로 자라면 트립신을 처리하여 단일 세포로 분리하여 수득하였다. 얻어진 세포를 증식배지로 1:31:4로 희석하여 계대 배양을 수행하였다(공개번호 10-2010-0118491). 배양배지의 조성에 따른 유전자 발현 차이를 분석하기 위하여 10% FBS가 포함된 DMEM인 기저배지로 배양한 5계대 세포와 기저배지에 1ng/㎖ bFGF가 포함된 증식배지로 배양한 5계대 세포를 수집하였다.
총 5개 로트 배양결과 기저배지로 배양할 때보다 증식배지로 배양할 때 증식속도가 높았으며, 섬유아세포 형태를 안정적으로 유지하였다. 도 1에 기저배지와 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 형태사진을 나타내었다. 도 2는 기저배지와 증식배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 CPDL(cell population doubling level)의 예를 나타내었다.
실시예 2: 마이크로 어레이 실험에 의한 지방유래 줄기세포의 배지별 유전자 발현 증감 확인
실시예 2-1: 인간 지방 유래 스트로마 줄기세포의 배양
공여자 17명으로부터 지방 조직을 분리하고 (안트로젠, 경기도, 대한민국) 실시예 1에서와 같이 지방유래 줄기세포를 배양하였다.
실시예 2-2: 총 RNA 분리
총 RNA는 QIAGEN 킷트(RNeasy Maxi kit: cat #75162)를 사용하여 분리하였고, Experion RNA StdSens(Bio-Rad사) 칩을 이용하여 정량하였다. 우선 상기 배양된 지방유래 줄기세포를 150 ㎕의 베타 멀캅토 에탄올을 첨가한 15 ㎖의 키트 내 분해 완충액에 용해시켰다. 여기에 15 ㎖의 70% 에탄올을 넣어 잘 섞은 후, 3000 g에서 5분간 원심분리하여 총 RNA를 막에 부착시켰다. 두 차례의 세척을 한 후, 1.2 ㎖의 RNase가 없는 물을 첨가하여 총 RNA를 분리하였다.
실시예 2-3: 마이크로어레이 실시
상기 추출된 총 RNA를 Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit(Ambion사)를 이용하여 하이브리드화 하였다. T7 Oligo(dT) 프라이머를 이용하여 cDNA를 합성하고, biotin-UTP를 이용하여 in vitro 전사(in vitro transcription)을 실시하여 biotin-labeled cRNA를 제조하였다. 제조된 cRNA는 NanoDrop을 이용하여 정량하였다. 지방유래 줄기세포에서 제조된 cRNA를 Human-6 V2(Illumina사) 칩에 하이브리드화 하였다. 하이브리드화 후, 비특이적 하이브리드화를 제거하기 위하여 Illumina Gene Expression System 세척액 (Illumina사)을 이용하여 DNA 칩을 세척하였고 세척된 DNA 칩은 streptavidin-Cy3(Amersham사) 형광 염색약으로 표지하였다. 형광 표지된 DNA 칩은 공촛점 (confocal) 레이저 스캐너(Illumina사)를 이용하여 스캐닝하여 각 스팟에 존재하는 형광의 데이터를 얻어서 TIFF 형태의 이미지 파일로 저장하였다. TIFF 이미지 파일을 BeadStudio version 3(Illumina 사)으로 정량하여 각 스팟의 형광값을 정량하였다. 정량된 결과는 Avadis Prophetic version 3.3(Strand Genomics사) 프로그램으로 'quantile' 기능을 이용하여 보정하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3은 기저배지에서 배양한 계대수 5인 세포와 증식배지에서 배양한 계대수 5 세포에서 측정된 상기 유전자들의 발현 차이를 보여준다. AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, 및 PTGER2유전자는 기저배지에 비해 증식배지에서 현저한 증가를 보이는 유전자이며, ITGA11, PAWR 및 SFRP2는 기저배지에 비해 증식배지에서 그 발현이 감소한 유전자이다. 이러한 결과로부터 상기 유전자들이 기저배지와 증식배지를 비교할 때 발현차이를 크게 나타내므로, 이를 임상적 유효성이 높은 증식배지에 배양한 지방줄기세포를 판단하는 용도로 사용할 수 있음을 알 수 있다. 단, 이러한 결과는 줄기세포와 분화된 줄기세포를 구별하는 알려진 마커와는 다른 양상을 보일 수 있으며, 계대수 및 분화여부에 따라서도 다른 양상을 보일 수 있다. 예를 들면 IGF2BP3는 분화 전 줄기세포상태에서는 계대에 따라 증가하지만 분화가 시작되면 급격히 줄어들고, ITM2A의 경우 줄기세포상태에서는 계대에 따라 대체로 줄어들지만 분화가 시작되면 늘어난다.
실시예 3: 개별 공여자의 지방유래 줄기세포로부터 기저배지와 증식배지에서 발현 차이를 보이는 유전자 개별적 확인
17쌍의 공여자 지방줄기세포 샘플 (기저배지와 증식배지 배양세포)를 이용하여 실시예 2에서 확인된 유전자들의 발현량을 RT-PCR 방법을 통하여 분석하였다. 실시예 2의 방법을 통하여 총 RNA를 분리하였다.
실시예 3-1: cDNA 합성과 주형의 농도 보정
시료 각각의 총 RNA 2㎍, 프라이머인 50M Oligo(dT) 1 ㎕와 10 mM dNTP 2.5 ㎕,를 넣고 RNase 저해제인 DEPC가 들어 있는 멸균수로 전체가 25μl 가 되도록 하여 RNA/primer 혼합용액을 만들었다. 65℃에서 5분간 반응시킨 후 55℃로 옮겨 보관하였다. 다음 10X RT buffer 5μl, 25 mM MgCl2 10㎕, 0.1 M DTT 5㎕, RNase inhibitor 1㎕, SuperScriptIII RT 효소를 1㎕ 넣고 전체가 25㎕ 가 되도록 한 후 55℃에서 보관 중인 RNA/primer 혼합용액과 섞어준 후, 55℃에서 50분간 반응시켰다. 그 후 85℃에서 5분간 반응시켜 RT 효소를 불활성화한 후 얼음에 넣어 반응을 종결시켰다. 마커 유전자를 정량하기 위한 표준 유전자로서 RPL13A를 사용하였다. 표준 유전자의 프라이머를 이용하여 RT-PCR 반응을 수행하고 표준 유전자 RPL13A의 발현량이 동일해지도록 cDNA의 농도를 보정하였다. 우선 각각의 cDNA를 20배 희석한 후 희석된 샘플 2㎕를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR은 2x PCR premix (Hot start) 15㎕, 2㎕의 PRL13A 정방향 프라이머, 2㎕ 의 PRL13A 역방향 프라이머, 11㎕의 증류수를 넣어 사용하였고 20 cycle, 23 cycle, 25 cycle을 수행하였다. 이 때 RT-PCR 반응 조건은 94℃ 30초, 50℃ 30초, 72℃ 1분으로 수행하였다. 사용된 RPL13A 프라이머는 정방향 5'-CATCGTGGCTAAACAGGTACTG-3' (서열번호 1), 역방향 5'-GCACGACCTTGAGGGCAGC-3' (서열번호 2)이다. PCR 산물을 2% 아가로스 젤에 로딩하여 전기영동한 후 젤 사진을 찍고, 이미지를 TotalLab v1.0 프로그램(Nonlinear Dynamix사)으로 정량한 후, 다시 보정하여 PCR을 수행하여 정량하는 방식으로 각 시료의 농도를 동일하게 보정하였다.
실시예 3-2: RT - PCR / Real - Time PCR 을 이용한 발현량 분석
동일한 양이 되도록 희석한 cDNA를 상기 유전자들의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. cDNA는 3㎕, 2x premix 10㎕, 프라이머 각 2 ㎕ (20 pmole), 증류수 2㎕를 섞어 총 용액 20㎕로 만들고 PCR 반응은 94℃ 1분, 54℃ 30초, 72℃ 1분으로 하였으며 각 유전자마다 사이클은 달리하였다. PCR 산물을 확인하기 위하여 2% 아가로스 젤을 이용하여 전기영동하고 이미지 장비를 이용하여 분석하였다. Realtime RT-PCR은 Qiagen사 (CA, USA)의 DNASYBRI 시약과 LightCycler(Roche)를 이용하였다. Melt Curve 분석을 이용하여 PCR 산물의 질을 평가하였고 유전자 발현량은 LightCycler version 3.5 software (Roche)를 사용하여 분석하였다. 상기 RT-PCR/Real-Time PCR에서 사용한 유전자들의 특이적 프라이머와 대조 프라이머의 서열 (서열번호 1 내지 16)은 표 1에 명시하였다.
그 결과를 도 4, 5에 나타내었다. 그 결과 상기의 유전자들은 확연히 기저배지에 비례하여 증식배지에서 증가하거나 감소하는 것이 확인되었다. 따라서 AGPAT9 (94.1%, 17개 중 16개 샘플에서 증가) ANXA10 (94.1%, 17개 중 16개 샘플에서 증가), IGF2BP3 (100%, 17개 중 17개 샘플에서 증가), PTGER2 (100%, 17개 중 17개 샘플에서 증가)(도 4 a-d), ITGA11 (94.1%, 17개 중 16개 샘플에서 감소), PAWR (94.1%, 17개 중 16개 샘플에서 감소), SFRP2 (94.1%, 17개 중 16개 샘플에서 감소) (도 5 a-c), 상기 유전자들은 증식배지에서 배양된 임상적 효능이 증가된 지방유래 줄기세포를 판단할 수 있는 마커로서 또는 개선된 배양법을 이용하여 배양한 지방유래 줄기세포의 품질의 일관성을 탐지하는 마커 등으로 사용할 수 있을 것으로 보인다.
유전자( REF ) 프라이머 서열번호
RPL13A(NM_012423.02) F: 5'-catcgtggctaaacaggtactg-3' 서열번호 1
R: 5'-gcacgaccttgagggcagc-3' 서열번호 2
AGPAT9(NM_032717.3) F: 5'-aatcttgacaacggatggat-3' 서열번호 3
R: 5'-caaaccagacatgaggacaa-3' 서열번호 4
ANXA10(NM_007193.3) F: 5'-cgagacaaaccagcctattt-3' 서열번호 5
R: 5'-tggtcagcaggtctatttca-3' 서열번호 6
IGF2BP3(NM_006547.2) F: 5'-cacctgatgagaatgaccaa-3' 서열번호 7
R: 5'-actttgcagagccttctgtt-3' 서열번호 8
PTGER2(NM_000956.2) F: 5'-cacctcattctcctggctat-3' 서열번호 9
R: 5'-gaggtcccatttttcctttc-3' 서열번호 10
ITGA11(NM_001004439.1) F: 5'-tgaggtccctaaaagcactc-3' 서열번호 11
R: 5'-cagtcctcttgcttggagat-3' 서열번호 12
PAWR(NM_002583.2) F: 5'-caggagccacctagaacagt-3' 서열번호 13
R: 5'-tacctgaaacatttgcatcc-3' 서열번호 14
SFRP2(NM_003013.2) F: 5'-aaaatcatcctggagaccaa-3' 서열번호 15
R: 5'-tgtcgttcatctcctcacag-3' 서열번호 16
실시예 4: 선별된 유전자의 계대에 따른 단백질 발현 조사
공여자 지방줄기세포 샘플 (기저배지와 증식배지에서 배양)을 이용하여 실시예 3에서 확인된 유전자 중 일부의 발현량을 웨스턴 블랏 분석법으로 단백질 정량을 통하여 분석하였다.
구체적으로, 60 mm 디쉬에서 키워진 세포를 PBS로 한번 헹구어낸 후, 차가운 단백질용 용해 완충액 (RIPA cell lysis buffer: 50 mM Tris-Cl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 10% 글리세롤, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 20 mM NaF, 1 mM EDTA, 단백질분해효소 저해제)를 첨가하여, 세포의 단백질을 준비하였다. 준비되어진 각 단백질 시료를 30㎍씩 사용하여 10% 혹은 12% SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 겔(gel)에 걸어 크기별로 단백질을 분리해 낸 후, 이를 PVDF 막에 잘 옮겨주었다.
단백질이 옮겨진 필터를 적당한 크기로 잘라낸 후, 각 단백질에 해당하는 항체를 붙여주었다. 항체에 대한 정보는 다음과 같다. anti-ANXA10 (Santa Cruz, sc-70009), anti-IGF2BP3 (Santa Cruz, sc-100766), anti-PTGER2 (abcam, ab16151), anti-ITGA11 (ab107858), anti-PAWR (Sigma A0545), anti-ACTIN (Sigma, A5316). 각각의 단백질의 양은 ImmobilonTM 웨스턴 블럿팅 검출 시약 (Western Blotting Detection reagents) (Millipore)를 사용하여 밴드(band)로 확인하였다.
그 결과, 상기 유전자 중 RT-PCR을 통하여 증식배지에서 mRNA 수준이 증가하는 유전자인 ANXA10, IGF2BP3, PTGER2의 경우, 기저배지에서 단백질 발현이 낮고 증식배지에서 단백질 발현이 높아, mRNA 실험결과와 부합함을 관찰하였고, 증식배지에서 계대 증가에 따라 mRNA 수준이 감소하는 유전자인 ITGA11, PAWR의 경우 기저배지에서 단백질 발현이 높고 증식배지에서 단백질 발현이 감소함을 관찰하여, 마찬가지로 mRNA 실험결과와 부합하는 것을 확인하였다(도 6).
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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Claims (11)

  1. AGPAT9(1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase 9), ANXA10(annexin A10), IGF2BP3(insulin-like growth factor 2 binding protein 3), PTGER2(prostaglandin E receptor 2), ITGA11(integrin, alpha 11), PAWR(PRKC, apoptosis, WT1, regulator) 및 SFRP2(secreted frizzled-related protein 2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, EGF(Epidermal growth factor) 또는 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 치료능력 탐지를 위한 마커 검출용 조성물.
  2. AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 증식능력 탐지를 위한 마커 검출용 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유전자 mRNA의 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍 또는 프로브를 포함하는 것인 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인 조성물.
  5. 제1항의 조성물을 포함하는, EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 치료능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 키트.
  6. 제2항의 조성물을 포함하는, EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 증식능력을 탐지하기 위한 마커 검출용 키트.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 마커 검출용 키트.
  8. EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 지방유래 줄기세포의 치료능력 탐지 방법.
  9. EGF 또는 bFGF를 포함하는 배지에서 배양한 지방유래 줄기세포의 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3, PTGER2, ITGA11, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 지방유래 줄기세포의 증식능력 탐지 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 방법은 ITGA11, PAWR 및 SFRP2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 양이 대조군인 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에서 측정한 값에 비해 적으면, 치료능력이 대조군에 비하여 높은 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 지방유래 줄기세포의 치료능력 탐지 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 방법은 AGPAT9, ANXA10, IGF2BP3 및 PTGER2로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 유전자 mRNA 또는 이의 단백질의 양이 대조군인 기저배지에서 배양한 지방유래 줄기세포에서 측정한 값에 비해 많으면, 치료능력이 대조군에 비하여 높은 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 지방유래 줄기세포의 치료능력 탐지 방법.
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KR20150019126A (ko) * 2013-08-12 2015-02-25 한국생명공학연구원 줄기세포 배양액에서 탐지 가능한 지방유래 줄기세포의 증식 및 치료능력 탐지용 마커 및 이의 용도

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