JP2016521569A - Ｅｇｆ又はｂｆｇｆを含む培地で培養した脂肪由来幹細胞の増殖及び治療能力を検出するマーカー並びにその用途 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ＥＧＦ(ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ)又はｂＦＧＦ(ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ)を含む培地で培養した脂肪由来幹細胞の増殖能力又は治療能力を検出するためのマーカー検出用組成物及び検出方法に関する 。【選択図】【図３】
Description
本発明は、 ＥＧＦ（上皮増殖因子）又はｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）を含む培地で培養した、脂肪由来幹細胞の治療能力又は増殖能力を検出するためのマーカー検出用組成物及び検出方法に関する。
脂肪組織は、それと同量の骨髄から分離することのできる幹細胞に比べて１,０００倍以上の幹細胞を大量に含んでおり、それ故に脂肪組織由来幹細胞(ａｄｉｐｏｃｙｔｅ-ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＡＳＣ)を生体移植材料として利用しようとする研究が様々に行われている。脂肪由来幹細胞はまた、骨髄由来幹細胞のような多分化能を有しており、軟骨、骨、脂肪又は筋肉細胞などに分化することができる。また、脂肪由来幹細胞は、骨髄由来幹細胞と細胞表面のマーカーの発現様相が類似しており、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの両方において自家移植又は同種移植の際にも、免疫反応を誘発せず、むしろ免疫反応を調節する機能を有することが報告されており、細胞治療の効果的な手段として脚光を浴びている。
一方、従来公知の基礎培地を利用した標準的な細胞培養法を用いて、脂肪由来幹細胞を体外培養する場合、細胞培養に長時間を要するため、臨床的に有効な細胞数を得るのが困難であった。従って、標準的な細胞培養法の場合、実際の臨床への応用において実効性が低いという問題があった。そこで、本発明者らは、効果的な臨床的治療方法を示しうる培養法の開発を試み、それによって、ＥＧＦ又はｂＦＧＦを含む増殖培地で培養した脂肪由来幹細胞が、標準細胞培養法による脂肪由来幹細胞に比べて優れた臨床的効果を有することを確認したが、(特許文献１)、前記のようなＥＧＦ又はｂＦＧＦを含む培地で培養した脂肪由来幹細胞の優れた臨床的効能に関連した客観的な分子生物学的特性の分析は未だ行われていない状況にある。
特に、基礎培地で培養した幹細胞に比べて増殖培地で培養した幹細胞の優れた細胞増殖と治療効果を示すと共に、一定水準以上の治療効果を有する幹細胞治療剤を実際の医薬品として再現できるように生産するためには、前記のような増殖培地を使用した改善された培養法によって得られた幹細胞の分化能力、増殖能力及び力価などの薬効を反映しうる品質管理試験法の開発が必要である。特に、細胞治療剤の収率増加及び治療剤の品質を測定する方法を開発するためには、これを示すバイオマーカーが必要である。
Kohler及びMilstein(1976)European Jounral of Immunology 6：511-519
Clackson et al, Nature, 352：624-628, 1991; Marks et al,J. Mol. Biol., 222：58, 1-597,1991
本発明者らは、脂肪由来幹細胞を増殖培地で培養した場合、基礎培地に比べてその増殖能において優れており、また、長期間継代培養しても幹細胞の特性をよく維持しながら分裂しうるだけでなく、分化能をはじめとする治療的効能が高いという点に着目して、基礎培地で培養した脂肪由来幹細胞と増殖培地で培養した脂肪由来幹細胞間の発現の差を示すマーカーを開発しようと鋭意努力した結果、１-アシルグリセロール-３-リン酸-Ｏ-アシルトランスフェラーゼ (ＡＧＰＡＴ９)、アネキシンＡ１０(ＡＮＸＡ１０)、インスリン様増殖因子２結合タンパク質３（ＩＧＦ２ＢＰ３)及びプロスタグランジンＥ受容体２（ＰＴＧＥＲ２)遺伝子の発現が、増殖培地で培養した脂肪由来幹細胞において増加しており、インテグリンα１１（ＩＴＧＡ１１)、ＰＡＷＲ(ＰＲＫＣ、アポトーシス、ＷＴ１、制御因子)及び分泌型フリッツルド関連タンパク質２（ＳＦＲＰ２) 遺伝子の発現が、増殖培地で培養した脂肪由来幹細胞で減少していることを確認し、前記遺伝子が、増殖培地で培養した脂肪由来幹細胞の増殖能力、免疫抑制能、分化能力などをはじめとする治療的活性の測定などに利用できることを確認し、本発明を成功するに至った。
本発明の一つの目的は、1-アシルグリセロール-３-リン酸-Ｏ-アシルトランスフェラーゼ（ＡＧＰＡＴ９)、アネキシンＡ１０（ＡＮＸＡ１０)、インスリン様増殖因子２結合タンパク質３(ＩＧＦ２ＢＰ３)、プロスタグランジンＥ受容体２(ＰＴＧＥＲ２)、インテグリンα１１（ＩＴＧＡ１１)、ＰＡＷＲ(ＰＲＫＣ、アポトーシス、ＷＴ１、制御因子)及び分泌型フリッツルド関連タンパク質２（ＳＦＲＰ２)からなる群れから選択される１つ以上の遺伝子のｍＲＮＡ又は、そのタンパク質レベルを測定する製剤を含む、上皮増殖因子（ＥＧＦ)又は塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ)を含む培地で培養した脂肪由来幹細胞の治療能力を検出するためのマーカー検出用組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、ＡＧＰＡＴ９、ＡＮＸＡ１０、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＰＴＧＥＲ２、ＩＴＧＡ１１、ＰＡＷＲ及びＳＦＲＰ２からなる群より選択される１つ以上の遺伝子のｍＲＮＡ又はそのタンパク質レベルを測定する製剤を含む、ＥＧＦ又はｂＦＧＦを含む培地で培養した脂肪由来幹細胞の増殖能力を検出するためのマーカー検出用組成物を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、前記マーカー検出用組成物を含む、ＥＧＦ又はｂＦＧＦを含む培地で培養した脂肪由来幹細胞の治療能力及び増殖能力を検出するためのマーカー検出用キットを提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ＥＧＦ又はｂＦＧＦを含む培地で培養した脂肪由来幹細胞のＡＧＰＡＴ９、ＡＮＸＡ１０、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＰＴＧＥＲ２、ＩＴＧＡ１１、ＰＡＷＲ及びＳＦＲＰ２からなる群より選択される１つ以上の遺伝子のｍＲＮＡ又はそのタンパク質レベルを測定する段階を含む、脂肪由来幹細胞の治療能力又は増殖能力を検出する方法を提供することである。
本発明は、増殖培地で培養された臨床的効能の増加した脂肪由来幹細胞を判断することのできるマーカーを提供することにより、脂肪由来幹細胞の効能を検証するにあたり、より有用な資料を提供することができる。また、改善された培養法を用いて培養した脂肪由来幹細胞の増殖能力、分化能力などで確認される治療剤の活性を検出するマーカーとして効率的に用いることができる。
本発明は、ＡＧＰＡＴ９、ＡＮＸＡ１０、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＰＴＧＥＲ２、ＩＴＧＡ１１、ＰＡＷＲ及びＳＦＲＰ２からなる群より選択される１つ以上の遺伝子のｍＲＮＡ又はそのタンパク質レベルを測定する製剤を含む、ＥＧＦ又はｂＦＧＦを含む培地で培養した脂肪由来幹細胞の治療能力検出用組成物を提供する。
本発明における用語「脂肪由来幹細胞(ＡＳＣ)」とは、脂肪細胞、骨母細胞、軟骨母細胞、筋線維母細胞などほとんどの中間葉細胞に分化しうる脂肪組織から分離された幹細胞であって、脂肪前駆細胞、基質細胞、多分化能脂肪由来細胞 (ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ａｄｉｐｏｓｅ-ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌｓ)又は脂肪由来成体幹細胞(ａｄｉｐｏｓｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ)などと言われる細胞を意味する。前記脂肪由来幹細胞は、特にこれに限定されるものではないが、ヒトに移植することができる豚、牛、霊長類及びヒトなどを含む哺乳類に由来する脂肪由来幹細胞であってもよい。
本発明における用語「ＥＧＦ又はｂＦＧＦを含む培地で培養した脂肪由来幹細胞の治療能力を検出するためのマーカー」とは、ＥＧＦ又はｂＦＧＦを含まない基礎培地で培養した細胞とＥＧＦ又はｂＦＧＦを含む増殖培地で培養した脂肪由来幹細胞を比較した際に、その発現有無に有意な差を示す有機生体分子を意味する。また、増殖培地で培養した脂肪由来幹細胞は、基礎培地で培養した脂肪由来幹細胞に比べて免疫抑制能力又は分化能力などの治療能力に優れている(特許文献１)。従って、基礎培地と比較した際の発現量の差を確認することで、脂肪由来幹細胞の治療能力を検出することのできるマーカーを意味し、具体的にはＡＧＰＡＴ９、ＡＮＸＡ１０、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＰＴＧＥＲ２、ＩＴＧＡ１１、ＰＡＷＲ及びＳＦＲＰ２からなる群より選択される１つ以上の遺伝子であって、増殖培地で培養された脂肪由来幹細胞におけるＡＧＰＡＴ９、ＡＮＸＡ１０、ＩＧＦ２ＢＰ３及びＰＴＧＥＲ２は基礎培地で培養した脂肪由来幹細胞に比べて、その発現が増加し、ＩＴＧＡ１１、ＰＡＷＲ及びＳＦＲＰ２は、その発現が減少する遺伝子である。
また、本発明で使用される前記遺伝子は、米国国立衛生研究所のＧｅｎＢａｎｋなどの公知のデータベースから得ることができ、その例としてＡＧＰＡＴ９(ＮＭ_０３２７１７.３、ＮＰ_００１２４３３５１．１)、ＡＮＸＡ１０(ＮＭ_００７１９３．３、ＮＰ_００９１２４．２)、ＩＧＦ２ＢＰ３(ＮＭ_００６５４７．２、ＮＰ_００６５３８．２)、ＰＴＧＥＲ２(ＮＭ_０００９５６．２、ＮＰ_０００９４７．２)、ＩＴＧＡ１１(ＮＭ_００１００４４３９．１、ＮＰ_００１００４４３９．１)、ＰＡＷＲ(ＮＭ_００２５８３．２、ＮＰ_００２５７４．２)又はＳＦＲＰ２(ＮＭ_００３０１３．２、ＮＰ_００３００４.１)であってもよいが、これに限定されるものではない。
基礎培地で培養した脂肪由来幹細胞と増殖培地で培養した脂肪由来幹細胞を相互に比較した場合、前記遺伝子は両培地で発現の差を示すので、このような発現の差に基づいて前記遺伝子は、脂肪由来幹細胞の治療能力を検出するためのマーカーとして使用することができる。
本発明における用語「ＥＧＦ(上皮増殖因子)」とは、その受容体であるＥＧＦＲに結合し、細胞の増殖、成長及び分化を促進しうる増殖因子を意味する。前記ＥＧＦは、様々な上皮細胞の増殖を促進する活性を有し、マウスのＴ細胞や、ヒトの線維芽細胞も増殖させることができる。本発明の目的上、前記ＥＧＦは脂肪由来幹細胞の培養培地に含まれてその増殖及び分化能力などの治療的活性を上昇させる役割を果たすタンパク質を意味する。
本発明における用語「ｂＦＧＦ(塩基性線維芽細胞増殖遺伝子)」とは、血管新生又は創傷治療などの生物学的過程に関与する成長因子である。本発明の目的上、前記ｂＦＧＦは、前記ＥＧＦのように脂肪由来幹細胞の培地に含まれてその増殖及び分化能力のような治療的活性を上昇させる役割を果たすタンパク質を意味する。
本発明における用語「基礎培地」とは、脂肪由来幹細胞、特にこれを含む間質血管細胞群（Ｓｔｒｏｍａｌ Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｆｒａｃｔｉｏｎ）を培養するための培地である。前記基礎培地は、ＤＭＥＭ培地、又はＤＭＥＭ/Ｆ１２などの脂肪由来幹細胞の培養に血清を含む培地であってもよく、前記血清は、細胞培養に通常使用されるＦＢＳ(ウシ胎児血栓)などであってもよい。また、これは約１０％前後、すなわち８〜１２％程度含むことができるが、当業界で一般的に使用される脂肪由来幹細胞培養培地であれば特にこれに限定されるものではない。本発明の一実施例では、基礎培地として１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を用いた。本発明における前記「基礎培地」は「基本培地」と混用することができる。
本発明における用語「増殖培地」とは、脂肪由来幹細胞の増殖能又は分化能を向上させるために用いられる培地であって、前記基礎培地にｂＦＧＦ又はＥＧＦをさらに添加した培地を意味する。前記増殖培地にはＥＧＦ又はｂＦＧＦをそれぞれ０．１ｎｇ/ｍｌ〜１００ｎｇ/ｍｌの濃度で含むことができる。本発明における前記「増殖培地」は、「ＥＧＦ又はｂＦＧＦを含む培地」と混用することができる。
前記基礎培地及び増殖培地に関する情報などは、特許文献１に開示されており、前記特許文献１の明細書全体は、本発明の参考資料として含めることができるが、これに限定されるものではない。
本発明における用語「治療能力」とは、幹細胞の治療的活性(ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ)を意味し、本発明の幹細胞を細胞治療剤などとして使用する場合は、「力価」ともいう。好ましくは、脂肪由来幹細胞の増殖能力、分化能力、免疫調節能力、又はこれらの能力全てを意味するが、これに限定されるものではない。
本発明における用語「分化能力」とは、脂肪由来幹細胞が脂肪細胞、骨母細胞、軟骨母細胞、筋線維母細胞、筋肉細胞又は神経細胞などに分化することのできる能力を意味する。本発明において分化能力の高い脂肪由来幹細胞とは、脂肪細胞、骨母細胞、軟骨母細胞、筋線維母細胞、骨母細胞、筋肉細胞又は神経細胞への分化誘導が容易に起こる細胞を意味するが、これに限定されるものではない。
本発明における用語「免疫調節能力」とは、好ましくは、免疫抑制能力を意味し、該免疫抑制能力とは、ｂＦＧＦ又はＥＧＦを含む培地で培養した脂肪由来幹細胞が免疫細胞の活性を抑制できることを意味する。特に、中間葉幹細胞の場合、ＡＰＣ(抗原提示細胞)を抑制することにより、免疫抑制効果に関与することが知られている。従って、本発明の脂肪由来幹細胞を免疫抑制剤として用いることにより自己免疫疾患を治療することができる。
本発明における用語「治療能力の高い脂肪由来幹細胞」とは、基礎培地で培養された脂肪由来幹細胞に比べて、ＡＧＰＡＴ９、ＡＮＸＡ１０、ＩＧＦ２ＢＰ３及びＰＴＧＥＲ２からなる群より選択される１つ以上の遺伝子の発現レベルが増加しており、ＩＴＧＡ１１、ＰＡＷＲ及びＳＦＲＰ２からなる群より選択される１つ以上の発現が減少している脂肪由来幹細胞であって、基礎培地で培養された脂肪由来幹細胞に比べて細胞増殖が速かったり、免疫抑制能が良好であったり、分化効率が高いなど、治療薬としての活性(力価)が良好な脂肪由来幹細胞を意味する。
このような遺伝子の発現レベルは、ｍＲＮＡ又はタンパク質の量を測定することによって確認することができる。
本発明における用語「ｍＲＮＡレベルの測定」とは、脂肪由来幹細胞の分化能力を診断するために生物学的試料において、脂肪由来幹細胞の治療能力を示すマーカー遺伝子のｍＲＮＡの存在有無と発現の程度を確認する過程であって、ｍＲＮＡの量が測定される。そのための分析方法としては、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(ＲＴ-ＰＣＲ)、競争逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(コンペティティブＲＴ-ＰＣＲ)、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(リアルタイムＲＴ-ＰＣＲ)、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ(ＲＮａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ、ＲＰＡ) 、ノーザンブロッテイング(Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ)やＤＮＡチップなどがあるが、これらに限定されるものではない。本発明の一実施例では、前記遺伝子のｍＲＮＡレベルをＲＴ-ＰＣＲ及びリアルタイム-ＰＣＲにより確認した(実施例３)。
遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定する製剤は、好ましくは、プライマー対又はプローブであって、ＡＧＰＡＴ９、ＡＮＸＡ１０、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＰＴＧＥＲ２、ＩＴＧＡ１１、ＰＡＷＲ及びＳＦＲＰ２遺伝子の核酸配列は、それぞれＮＭ_０３２７１７.３、ＮＭ_００７１９３．３、ＮＭ_００６５４７．２、ＮＭ_０００９５６．２、ＮＭ_００１００４４３９．１、ＮＭ_００２５８３．２及びＮＭ_００３０１３．２に公表されているので、当業者は、前記配列に基づいてこれらの遺伝子の特定領域を特異的に増幅するプライマー又はプローブを設計することができる。
本発明における用語「プライマー」とは、短い自由３ '末端にヒドロキシ基を有する核酸配列であって、相補的な鋳型と塩基対を形成することができ、鋳型鎖のコピーのための開始点として機能する短い核酸配列を意味する。本発明におけるプライマーは、好ましくは、ＡＧＰＡＴ９に対するプライマーは配列番号３及び４のプライマー対であり、ＡＮＸＡ１０に対するプライマーは配列番号５及び６のプライマー対であり、ＩＧＦ２ＢＰ３に対するプライマーは配列番号７及び８のプライマー対であり、ＰＴＧＥＲ２に対するプライマーは配列番号９及び１０のプライマー対であり、ＩＴＧＡ１１に対するプライマーは配列番号１１及び１２のプライマー対、ＰＡＷＲに対するプライマーは配列番号１３及び１４のプライマー対、又はＳＦＲＰ２のプライマーは、配列番号１５及び１６のプライマー対であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明における用語「プローブ」とは、ｍＲＮＡと特異的結合が達成可能な、短いものでは数個〜数百個の塩基に該当するＲＮＡ又はＤＮＡなどの核酸断片を意味し、標識化（ｌａｂｅｌｉｎｇ）されているので特定のｍＲＮＡの存在有無を確認することができる。プローブは、オリゴヌクレオチド・プローブ、単鎖ＤＮＡプローブ、二重鎖ＤＮＡプローブ又はＲＮＡプローブなどの形態に作製することができる。本発明では、ＡＧＰＡＴ９、ＡＮＸＡ１０、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＰＴＧＥＲ２、ＩＴＧＡ１１、ＰＡＷＲ又はＳＦＲＰ２のポリヌクレオチドと相補的なプローブを用いてハイブリダイゼーションを実施して、ハイブリダイゼーションするか否かによって脂肪由来幹細胞の分化能力が分かる。適切なプローブの選択及びハイブリダイゼーション条件は、当業界に公知のものに基づいて変更することができる。
本発明のプライマーは、適切な緩衝溶液及び適切な温度で、重合反応(すなわち、ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写ポリミラーゼ)のための試薬及び異なる４つのヌクレオシドトリホスフェートの存在下でＤＮＡ合成を開始することができる。本発明のプライマーは、各マーカー遺伝子に特異的なプライマーであって、７個〜５０個のヌクレオチド配列を有するセンス及びアンチセンス核酸である。プライマーは、ＤＮＡ合成の開始点として作用するプライマーの基本的な性質を変化させない、追加の特徴を混入することができる。本発明のプライマー又はプローブは、ホスホルアミダイト固体支持体の方法、又はその他の周知の方法を用いて化学的に合成することができる。このような核酸配列もまた、当該分野に公知の多くの方法を用いて修飾することができる。このような修飾の非限定的な例としては、メチル化、キャップ形成（ｃａｐｐｉｎｇ）、天然ヌクレオチド１つ以上の同族体への置換、及びヌクレオチド間の修飾、例えば、非荷電連結体(例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミダイト、カルバミン酸など)又は荷電性連結体(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)への修飾がある。核酸は、１つ以上の付加的に共有結合された残基、例えば、タンパク質(例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ-Ｌ-リジンなど)、挿入剤(例えば、アクリジン、ソラルレンなど)、キレート剤(例えば、金属、放射性金属、鉄、酸化性金属など)、及びアルキル化剤を含むことができる。本発明の核酸配列もまた、検出可能なシグナルを直接又は間接的に提供することができる標識を用いて修飾することができる。標識の例としては、放射性同位元素、蛍光性分子及びビオチンなどがある。
本発明における用語「タンパク質レベルの測定」とは、脂肪由来幹細胞の分化能力を検出するために生物学的試料において脂肪由来幹細胞の治療能力を示すマーカー遺伝子から発現したタンパク質の存在有無と発現程度を確認する過程であって、好ましくは、前記遺伝子のタンパク質に対して特異的に結合する抗体を用いてタンパク質の量を確認することができる。
本発明における用語「抗体」とは、特異的な抗原性部位を認識するタンパク質分子を意味する。本発明の目的上、抗体とは、マーカータンパク質に対して特異的に結合する抗体を意味し、具体的には、本発明のマーカー遺伝子であるＡＧＰＡＴ９、ＡＮＸＡ１０、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＰＴＧＥＲ２、ＩＴＧＡ１１、ＰＡＷＲ又はＳＦＲＰ２がコードするタンパク質に対して特異的に結合する抗体を意味し、多クローン抗体、単クローン抗体、及び組換え抗体が全てを含まれる。本発明のマーカータンパク質が解明されたため、これを用いた抗体の生成は、当業界に公知の技術を用いて容易に製造できる。 多クローン抗体は、前記マーカータンパク質抗原を動物に注射し、動物から採血することによって抗体が含まれた血清を取得するという当業界に公知の方法によって生産することができる。このような多クローン抗体には、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、サル、ウマ、ブタ、ウシ及びイヌなどの任意の動物種の宿主から製造することができる。単クローン抗体は、当業界に公知のハイブリドーマ法(ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｍｅｔｈｏｄ)(非特許文献１)、又はファージ抗体ライブラリー(非特許文献２)の技術などを用いて製造することができる。前記方法で製造された抗体は、ゲル電気泳動、透析、塩析沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、又はアフィニティークロマトグラフィーなどの方法を用いて分離、精製することができる。また、本発明の抗体は、２つの完全長の軽鎖及び２つの完全長の重鎖を持つ完全な形態であるだけでなく、抗体分子の機能的な断片を含む。抗体分子の機能的な断片とは、少なくとも抗原結合機能を保持している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ ')、Ｆ(ａｂ')２、及びＦｖなどがある。タンパク質レベルの測定方法としては、ウエスタンブロット(Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ)、エライザ(ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ)、放射線免疫分析(Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＲＩＡ)、放射免疫拡散法(ｒａｄｉｏ ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ)、オクタロニー(Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ)免疫拡散法、ロケット(ｒｏｃｋｅｔ)免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈降分析法(Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ)、補体固定分析法(Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ)、フローサイトメトリー分析(Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ、ＦＡＣＳ)、及びプロテインチップ(ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｉｐ)などがあるが、これに限定されるものではない。本発明の一実施例では、ウエスタンブロットを用いて前記タンパク質レベルを測定した(実施例４)。
本発明の一実施例では、ＥＧＦ又はｂＦＧＦを含む培地で培養した脂肪由来幹細胞が前記因子を含まない基礎培地で培養した脂肪由来幹細胞よりも増殖能力、免疫抑制、あるいは分化能力などの治療活性が優れていることに基づき(特許文献１)、ＥＧＦ又はｂＦＧＦを含む培地で培養した脂肪由来幹細胞と基礎培地で培養した脂肪由来幹細胞間の発現に有意な差を示す遺伝子を確認した結果、ＥＧＦ又はｂＦＧＦを含む培地で培養した脂肪由来幹細胞では、ＡＧＰＡＴ９、ＡＮＸＡ１０、ＩＧＦ２ＢＰ３及びＰＴＧＥＲ２の発現が増加しており、ＩＴＧＡ１１、ＰＡＷＲ及びＳＦＲＰ２の発現が減少していることを確認した(図４及び図５)。よって、ＡＧＰＡＴ９、ＡＮＸＡ１０、ＩＧＦ２ＢＰ３及びＰＴＧＥＲ２タンパク質の高発現レベルやＩＴＧＡ１１、ＰＡＷＲ又はＳＦＲＰ２タンパク質の低発現レベルが脂肪由来幹細胞の治療活性を示すことのできるマーカーとなり得ることを確認した(図６)。
別の態様として、本発明は、ＡＧＰＡＴ９、ＡＮＸＡ１０、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＰＴＧＥＲ２、ＩＴＧＡ１１、ＰＡＷＲ及びＳＦＲＰ２からなる群より選択される１つ以上の遺伝子のｍＲＮＡ又はそのタンパク質レベルを測定する製剤を含む、ＥＧＦ又はｂＦＧＦを含む培地で培養した脂肪由来幹細胞の増殖能力を検出するためのマーカー検出用組成物を提供する。
前記脂肪由来幹細胞、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ｍＲＮＡ又はそのタンパク質レベルの測定及び遺伝子については、前記に記載した通りである。
本発明における用語「増殖能力」とは、細胞が自律的に、又はホルモンなどの外因的刺激によってＤＮＡ合成、細胞分裂を伴う細胞数を増加することのできる能力を意味し、増殖はしていないくても、その能力を潜在的に維持している場合も含まれる。幹細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養時に自己複製能(Ｓｅｌｆ ｒｅｎｅｗａｌ ｃａｐａｃｉｔｙ)があるため増殖能を有しているが、継代培養が進むにつれて、増殖能が低下していくので、結果的には純粋で大量の幹細胞を取得するには限界がある。従って、幹細胞を治療剤として効果的に利用するためには、短期間に大量の幹細胞を取得できる培養法が必要となる。
本発明では、ＥＧＦ又はｂＦＧＦを含む培地で培養された脂肪由来幹細胞が基礎培地で培養された脂肪由来幹細胞に比べて増殖能力に優れていることを確認し、このような増殖能力の差を示す基礎培地又は増殖培地で培養された脂肪由来幹細胞間の発現に差を示す遺伝子を見出した。
具体的には、増殖培地で培養した脂肪由来幹細胞は、ＡＧＰＡＴ９、ＡＮＸＡ１０、ＩＧＦ２ＢＰ３及びＰＴＧＥＲ２からなる群より選択される１つ以上の遺伝子の発現が基礎培地で培養された脂肪由来幹細胞に比べて増加しており、ＩＴＧＡ１１、ＰＡＷＲ及びＳＦＲＰ２からなる群より選択される１つ以上の遺伝子の発現が基礎培地で培養された脂肪由来幹細胞に比べて減少している。前記のような発現の特徴を示す脂肪由来幹細胞は、基礎培地で培養された脂肪由来幹細胞、特にＡＧＰＡＴ９、ＡＮＸＡ１０、ＩＧＦ２ＢＰ３又はＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現が減少しているか、ＩＴＧＡ１１、ＰＡＷＲ又はＳＦＲＰ２遺伝子の発現が増加している脂肪由来幹細胞に比べて細胞増殖が良好に行われるので細胞収率が高く、かつ細胞増殖、免疫抑制、分化能力などの臨床的治療効果が高いという特徴を示す。
本発明の一実施例では、基礎培地と増殖培地で同量の脂肪由来幹細胞を５継代の期間にわたって培養した時、増殖培地での細胞増殖が平均２倍以上増加したことを確認した(実施例１及び図２) 。
さらに別の態様として、本発明は、前記ＥＧＦ又はｂＦＧＦを含む培地で培養した脂肪由来幹細胞の分化能力を検出するためのマーカー検出用組成物を含むＥＧＦ又はｂＦＧＦを含む培地で培養した脂肪由来幹細胞の分化能力を検出するためのマーカー検出用キットを提供する。
前記ＥＧＦ又はｂＦＧＦを含む培地で培養した脂肪由来幹細胞の分化能力を検出するためのマーカー検出用組成物については、前述の通りである。
本発明のマーカー検出用キットには、ＥＧＦ又はｂＦＧＦを含む増殖培地で培養することによって発現が増加若しくは減少するマーカー遺伝子、又はこれらのタンパク質を選択的に認知することのできるプライマー又は抗体だけでなく、免疫学的分析に使用される当分野で一般的に使用されるツール及び試薬などが含まれる。これらのツールや試薬としては、適切な担体、検出可能なシグナルを生成することのできる標識物質（マーカー）、溶解剤、洗浄剤、緩衝剤、安定化剤などが含まれるが、これらに限定されるものではない。標識物質（マーカー）が酵素である場合には、酵素活性を測定することのできる基質及び反応停止剤を含むことができる。適切な担体としては、これに限定されるものではないが、可溶性担体、例えば、当分野に公知の生理学的に許容される緩衝液、例えばＰＢＳ、不溶性担体、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、多糖類、ラテックスに金属をメッキした磁性微粒子のような高分子、その他、紙、ガラス、金属、アガロース、及びこれらの組み合わせであってもよい。
本発明のマーカー検出用キットは、好ましくは、ＲＴ-ＰＣＲキット、ＤＮＡキット又はプロテインチップキットであってもよい。前記プロテインチップに前記遺伝子がコードするタンパク質に対する抗体が提供される場合には、２つ以上の抗体に対する抗原‐抗体複合体の形成を観察することができ、脂肪由来幹細胞の分化能力の検出においてより有利である。
前記ＲＴ-ＰＣＲキットは、マーカー遺伝子に対する特異的な各プライマー対を含むことができ、その他テストチューブ又は他の適切な容器、反応緩衝液(ｐＨ及びマグネシウム濃度は多様)、デオキシヌクレオチド(ｄＮＴＰｓ)、Ｔａｑ-ポリメラーゼ及び逆転写酵素などの酵素、ＤＮＡｓｅ、ＲＮＡｓｅ阻害剤ＤＥＰＣ-水(ＤＥＰＣ-ｗａｔｅｒ)、滅菌水などを含むことができる。
前記ＤＮＡチップキットは、遺伝子又はその断片に該当するcＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドが付着している基板、及び蛍光標識プローブを作製するための試薬、製剤、酵素などを含むことができ、前記基板は、対照群の遺伝子又はその断片に該当するcＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドを含むことができる。
前記プロテインチップキットは、マーカーに対して１つ以上の抗体が基板上の所定の位置に配置されて高密度に固定化されたキットであってもよい。プロテインチップを利用する方法は、試料からタンパク質を分離し、分離したタンパク質をプロテインチップとハイブリダイゼーションして抗原−抗体複合体を形成し、これを読み取ってタンパク質の存在又は発現レベルを確認することができる。
本発明の一実施例では、マイクロアレイを用いて基礎培地と増殖培地で培養した脂肪由来幹細胞のマーカー遺伝子の発現の差を確認した(実施例２及び図３)。
さらに別の態様として、本発明は、前記ＥＧＦ又はｂＦＧＦを含む培地で培養した脂肪由来幹細胞の増殖能力を検出するためのマーカー検出用組成物を含む、ＥＧＦ又はｂＦＧＦを含む培地で培養した脂肪由来幹細胞の増殖能力を検出するためのマーカー検出用キットを提供する。
前記ＥＧＦ又はｂＦＧＦを含む培地で培養した脂肪由来幹細胞の増殖能力を検出するためのマーカー検出用組成物及び使用できるマーカー検出用キットは、前記において説明した通りである。
さらに別の態様として、本発明は、ＥＧＦ又はｂＦＧＦを含む培地で培養した脂肪由来幹細胞のＡＧＰＡＴ９、ＡＮＸＡ１０、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＰＴＧＥＲ２、ＩＴＧＡ１１、ＰＡＷＲ及びＳＦＲＰ２からなる群より選択される１つ以上の遺伝子のｍＲＮＡ又はそのタンパク質レベルを測定する段階を含む、脂肪由来幹細胞の分化能力を検出する方法を提供する。
前記ＥＧＦ又はｂＦＧＦを含む培地、前記遺伝子のｍＲＮＡ又はそのタンパク質レベルの測定及び脂肪由来幹細胞の分化能力については、前記において説明した通りである。
前記方法は、さらに、ＩＴＧＡ１１、ＰＡＷＲ及びＳＦＲＰ２からなる群より選択される１つ以上の遺伝子のｍＲＮＡ又はそのタンパク質の量が対照群である基礎培地で培養した脂肪由来幹細胞で測定した値に比べて少なければ、分化能力が対照群に比べて高いものと判断する段階、又はＡＧＰＡＴ９、ＡＮＸＡ１０、ＩＧＦ２ＢＰ３及びＰＴＧＥＲ２からなる群より選択される１つ以上の遺伝子のｍＲＮＡ又はそのタンパク質の量が対照群である基礎培地で培養した脂肪由来幹細胞で測定した値に比べて多いければ、分化能力が対照群に比べて低いものと判断する段階を含む、脂肪由来幹細胞の分化能力を検出する方法であってもよい。このとき、対照群である基礎培地で培養した脂肪由来幹細胞と増殖培地で培養した脂肪由来幹細胞は、継代数が同じか、又は１継代以下の差であることが好ましい。
本発明の一実施例では、ＥＧＦやｂＦＧＦを含む培地で培養した脂肪由来幹細胞が前記因子を含まない基礎培地で培養した脂肪由来幹細胞よりも増殖能力、分化能力などの治療活性が優れていることに基づき(特許文献１)、ＥＧＦ又はｂＦＧＦを含む培地で培養した脂肪由来幹細胞と基礎培地で培養した脂肪由来幹細胞間の発現に有意な差を示す遺伝子を確認した結果、ＥＧＦ又はｂＦＧＦを含む培地で培養した脂肪由来幹細胞ではＡＧＰＡＴ９、ＡＮＸＡ１０、ＩＧＦ２ＢＰ３及びＰＴＧＥＲ２の発現が増加しており、ＩＴＧＡ１１、ＰＡＷＲ及びＳＦＲＰ２の発現が減少していることが確認された(図４及び図５)。従って、ＡＧＰＡＴ９、ＡＮＸＡ１０、ＩＧＦ２ＢＰ３及びＰＴＧＥＲ２の発現が増加していたり、ＩＴＧＡ１１、ＰＡＷＲ及びＳＦＲＰ２の発現が減少している脂肪由来幹細胞は、ＡＧＰＡＴ９、ＡＮＸＡ１０、ＩＧＦ２ＢＰ３及びＰＴＧＥＲ２の発現が減少していたり、ＩＴＧＡ１１、ＰＡＷＲ及びＳＦＲＰ２の発現が増加している脂肪由来幹細胞に比べて分化能力に優れていることを示唆している。
さらに別の態様として、本発明は、ＥＧＦ又はｂＦＧＦを含む培地で培養した脂肪由来幹細胞のＡＧＰＡＴ９、ＡＮＸＡ１０、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＰＴＧＥＲ２、ＩＴＧＡ１１、ＰＡＷＲ及びＳＦＲＰ２からなる群より選択される１つ以上の遺伝子のｍＲＮＡ又はそのタンパク質レベルを測定する段階を含む、脂肪由来幹細胞の増殖能力を検出する方法を提供する。
前記ＥＧＦ又はｂＦＧＦを含む培地、前記遺伝子のｍＲＮＡ又はそのタンパク質レベルの測定及び脂肪由来幹細胞の増殖能力については、前記で説明した通りである。
好ましくは、ＩＴＧＡ１１、ＰＡＷＲ及びＳＦＲＰ２からなる群より選択される１つ以上の遺伝子のｍＲＮＡ又はそのタンパク質の量が対照群である基礎培地で培養した脂肪由来幹細胞で測定した値に比べて少なければ、増殖能力が対照群に比べて高いものと判断する段階、又はＡＧＰＡＴ９、ＡＮＸＡ１０、ＩＧＦ２ＢＰ３及びＰＴＧＥＲ２からなる群より選択される１つ以上の遺伝子のｍＲＮＡ又はそのタンパク質の量が対照群である基礎培地で培養した脂肪由来幹細胞で測定した値に比べて多ければ、増殖能力が対照群に比べて低いものと判断する段階をさらに含む、脂肪由来幹細胞の増殖能力を検出する方法であってもよい。
以下、本発明を下記の実施例においてより具体的に説明する。しかし、これらの例は、単に本発明を例示するためのものであり、これらによって本発明が限定されるものではない。
実施例１：基礎培地と増殖培地による脂肪由来幹細胞の細胞増殖能力の検証
実施例１−１：ヒト脂肪由来間質幹細胞の培養
ドナーから脂肪組織を分離し（Ａｎｔｏｒｏｇｅｎ社、大韓民国京畿道所在)、得られた脂肪組織から脂肪由来間質幹細胞を分離した。血液を除去するために脂肪組織を同じ容量のＫＲＢ（クレブスリンガー重炭酸塩)溶液で３４回洗浄した。脂肪組織と同じ容量のコラゲナーゼ溶液を入れ、３７℃の水浴中で反応させた。これを遠心分離用チューブに移し入れ、２０℃、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄み液である脂肪層を除去し、下層のコラゲナーゼ溶液が揺れないように注意して分離した。基礎培地を入れて懸濁させた後、２０℃、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。この時、下に沈むものが間質血管細胞群であるので、上澄み液を除去した。間質血管細胞群を基礎培地に懸濁させ、培養容器に接種して３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。培養液を除去した後、リン酸緩衝溶液で洗浄し、基礎培地又は基礎培地に塩基性線維芽細胞増殖因子(ｂＦＧＦ)が1ｎｇ/ｍｌの濃度で含まれた培地、又は基礎培地に上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)が５ｎｇ/ｍｌの濃度で含まれた培地を用いて増殖させた。脂肪由来間質幹細胞が培養容器の８０〜９０％程度に成長したらトリプシンを処理し、単一細胞に分離して取得した。得られた細胞を増殖培地で１：３１：４に希釈して継代培養を行った(特許文献１)。培養培地の組成による遺伝子発現の差を分析するために、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭである基礎培地で培養した５継代細胞と基礎培地に１ｎｇ/ｍｌｂＦＧＦを含む増殖培地で培養した５継代の細胞を回収した。
実施例１−１：ヒト脂肪由来間質幹細胞の培養
ドナーから脂肪組織を分離し（Ａｎｔｏｒｏｇｅｎ社、大韓民国京畿道所在)、得られた脂肪組織から脂肪由来間質幹細胞を分離した。血液を除去するために脂肪組織を同じ容量のＫＲＢ（クレブスリンガー重炭酸塩)溶液で３４回洗浄した。脂肪組織と同じ容量のコラゲナーゼ溶液を入れ、３７℃の水浴中で反応させた。これを遠心分離用チューブに移し入れ、２０℃、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄み液である脂肪層を除去し、下層のコラゲナーゼ溶液が揺れないように注意して分離した。基礎培地を入れて懸濁させた後、２０℃、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。この時、下に沈むものが間質血管細胞群であるので、上澄み液を除去した。間質血管細胞群を基礎培地に懸濁させ、培養容器に接種して３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。培養液を除去した後、リン酸緩衝溶液で洗浄し、基礎培地又は基礎培地に塩基性線維芽細胞増殖因子(ｂＦＧＦ)が1ｎｇ/ｍｌの濃度で含まれた培地、又は基礎培地に上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)が５ｎｇ/ｍｌの濃度で含まれた培地を用いて増殖させた。脂肪由来間質幹細胞が培養容器の８０〜９０％程度に成長したらトリプシンを処理し、単一細胞に分離して取得した。得られた細胞を増殖培地で１：３１：４に希釈して継代培養を行った(特許文献１)。培養培地の組成による遺伝子発現の差を分析するために、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭである基礎培地で培養した５継代細胞と基礎培地に１ｎｇ/ｍｌｂＦＧＦを含む増殖培地で培養した５継代の細胞を回収した。
全５つのロットの培養の結果、基礎培地で培養した場合よりも、増殖培地で培養した場合に増殖速度が速く、線維芽細胞の形態を安定的に維持した。図１に基礎培地と増殖培地で培養した脂肪由来幹細胞の形態の写真を示した。図２は、基礎培地と増殖培地で培養した脂肪由来幹細胞の細胞集団倍加数（ＣＰＤＬ）の例を示した。
実施例２：マイクロアレイ実験による脂肪由来幹細胞の培地別遺伝子発現の増減の確認
実施例２-１：ヒト脂肪由来間質幹細胞の培養
ドナー１７人から脂肪組織を分離して、(Ａｎｔｏｒｏｇｅｎ社、大韓民国京畿道所在)実施例１と同様に、脂肪由来幹細胞を培養した。
実施例２-１：ヒト脂肪由来間質幹細胞の培養
ドナー１７人から脂肪組織を分離して、(Ａｎｔｏｒｏｇｅｎ社、大韓民国京畿道所在)実施例１と同様に、脂肪由来幹細胞を培養した。
実施例２-２：全ＲＮＡの分離
全ＲＮＡは、ＱＩＡＧＥＮキット(ＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉ ｋｉｔ：ｃａｔ＃７５１６２)を使用して分離し、Ｅｘｐｅｒｉｏｎ ＲＮＡ ＳｔｄＳｅｎｓ(Ｂｉｏ-Ｒａｄ社)チップを用いて定量した。まず、培養された前記脂肪由来幹細胞を１５０μｌのβ-メルカプトエタノールを添加した１５ｍｌのキット内の分解緩衝液に溶解させた。これに１５ｍｌの７０％エタノールを入れてよく混ぜた後、３０００ｇで５分間遠心分離することによって全ＲＮＡを膜に付着させた。二回洗浄した後、１．２ｍｌのＲＮａｓｅの存在しない水を加えて全ＲＮＡを分離した。
全ＲＮＡは、ＱＩＡＧＥＮキット(ＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉ ｋｉｔ：ｃａｔ＃７５１６２)を使用して分離し、Ｅｘｐｅｒｉｏｎ ＲＮＡ ＳｔｄＳｅｎｓ(Ｂｉｏ-Ｒａｄ社)チップを用いて定量した。まず、培養された前記脂肪由来幹細胞を１５０μｌのβ-メルカプトエタノールを添加した１５ｍｌのキット内の分解緩衝液に溶解させた。これに１５ｍｌの７０％エタノールを入れてよく混ぜた後、３０００ｇで５分間遠心分離することによって全ＲＮＡを膜に付着させた。二回洗浄した後、１．２ｍｌのＲＮａｓｅの存在しない水を加えて全ＲＮＡを分離した。
実施例２-３：マイクロアレイの実施
前記抽出された全ＲＮＡをＩｌｌｕｍｉｎａ ＴｏｔａｌＰｒｅｐ ＲＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ(Ａｍｂｉｏｎ社)を用いてハイブリダイゼーションした。Ｔ７ Ｏｌｉｇｏ(ｄＴ)プライマーを用いてcＤＮＡを合成し、ビオチン-ＵＴＰを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写(ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ)を実施してビオチン標識ｃＲＮＡを製造した。製造されたｃＲＮＡは、ナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を用いて定量した。脂肪由来幹細胞で製造されたｃＲＮＡをＨｕｍａｎ-６ Ｖ２(Ｉｌｌｕｍｉｎａ社)チップにハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーションした後、非特異的ハイブリダイゼーションを除去するために、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ洗浄液(Ｉｌｌｕｍｉｎａ社)を用いてＤＮＡチップを洗浄し、洗浄したＤＮＡチップは、ストレプトアビジン-Ｃｙ３(Ａｍｅｒｓｈａｍ社)の蛍光染色剤で標識した。蛍光標識されたＤＮＡチップは、共焦点レーザースキャナー(Ｃｏｎｆｕｃａｌ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｅｒ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社)を用いてスキャンし、各スポットに存在する蛍光のデータを得てＴＩＦＦ形式のイメージファイルとして保存した。ＴＩＦＦイメージファイルをＢｅａｄ Ｓｔｕｄｉｏ ｖｅｒｓｉｏｎ ３(Ｉｌｌｕｍｉｎａ社)で定量し、各スポットの蛍光値を定量した。定量した結果は、Ａｖａｄｉｓ Ｐｒｏｐｈｅｔｉｃ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．３(Ｓｔｒａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社)プログラムで「クォンタイル（ｑｕａｎｔｉｌｅ）」機能を用いて補正した。
前記抽出された全ＲＮＡをＩｌｌｕｍｉｎａ ＴｏｔａｌＰｒｅｐ ＲＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ(Ａｍｂｉｏｎ社)を用いてハイブリダイゼーションした。Ｔ７ Ｏｌｉｇｏ(ｄＴ)プライマーを用いてcＤＮＡを合成し、ビオチン-ＵＴＰを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写(ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ)を実施してビオチン標識ｃＲＮＡを製造した。製造されたｃＲＮＡは、ナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を用いて定量した。脂肪由来幹細胞で製造されたｃＲＮＡをＨｕｍａｎ-６ Ｖ２(Ｉｌｌｕｍｉｎａ社)チップにハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーションした後、非特異的ハイブリダイゼーションを除去するために、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ洗浄液(Ｉｌｌｕｍｉｎａ社)を用いてＤＮＡチップを洗浄し、洗浄したＤＮＡチップは、ストレプトアビジン-Ｃｙ３(Ａｍｅｒｓｈａｍ社)の蛍光染色剤で標識した。蛍光標識されたＤＮＡチップは、共焦点レーザースキャナー(Ｃｏｎｆｕｃａｌ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｅｒ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社)を用いてスキャンし、各スポットに存在する蛍光のデータを得てＴＩＦＦ形式のイメージファイルとして保存した。ＴＩＦＦイメージファイルをＢｅａｄ Ｓｔｕｄｉｏ ｖｅｒｓｉｏｎ ３(Ｉｌｌｕｍｉｎａ社)で定量し、各スポットの蛍光値を定量した。定量した結果は、Ａｖａｄｉｓ Ｐｒｏｐｈｅｔｉｃ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．３(Ｓｔｒａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社)プログラムで「クォンタイル（ｑｕａｎｔｉｌｅ）」機能を用いて補正した。
その結果を図３に示した。図３は、基礎培地で培養した継代数５の細胞と増殖培地で培養した継代数５の細胞で測定された前記遺伝子の発現の差を示す。ＡＧＰＡＴ９、ＡＮＸＡ１０、ＩＧＦ２ＢＰ３及びＰＴＧＥＲ２遺伝子は、基礎培地に比べ増殖培地で著しい増加を示す遺伝子であり、ＩＴＧＡ１１、ＰＡＷＲ及びＳＦＲＰ２は、基礎培地に比べ増殖培地でその発現が減少した遺伝子である。このような結果から、前記遺伝子が基礎培地と増殖培地を比較した場合に大きな発現の差を示すので、これを臨床的有効性の高い増殖培地に培養した脂肪幹細胞を判断する用途で使用できることが分かる。ただし、このような結果は、幹細胞と分化した幹細胞を区別する公知のマーカーとは異なる様相を示すことがあり、継代数及び分化の有無によっても異なる様相を示しうる。例えば、ＩＧＦ２ＢＰ３は分化前の幹細胞の状態では、継代によって増加するが、分化が開始されると急激に減少し、ＩＴＭ２Ａの場合、幹細胞の状態では継代によって殆ど減少するが、分化が開始されると増える。
実施例３：個々のドナーの脂肪由来幹細胞から基礎培地と増殖培地における発現の差を示す遺伝子の個々の確認
１７組のドナーの脂肪幹細胞の試料(基礎培地と増殖培地の培養細胞)を用いて、実施例２で確認された遺伝子の発現量をＲＴ-ＰＣＲ法により分析し、実施例２の方法により全ＲＮＡを分離した。
１７組のドナーの脂肪幹細胞の試料(基礎培地と増殖培地の培養細胞)を用いて、実施例２で確認された遺伝子の発現量をＲＴ-ＰＣＲ法により分析し、実施例２の方法により全ＲＮＡを分離した。
実施例３-１：cＤＮＡ合成と鋳型濃度の補正
各試料の全ＲＮＡ２μｇ、プライマーである５０Ｍ オリゴ(ｄＴ)１μｌと１０ｍＭ ｄＮＴＰ ２．５μｌを入れて、ＲＮａｓｅ阻害剤であるＤＥＰＣが含まれている滅菌水で全体が２５μｌ になるようにしてＲＮＡ/プライマー混合溶液を作製した。６５℃で５分間反応させた後、５５℃に移して保管した。次に、１０× ＲＴ 緩衝液５μｌ 、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２１０μｌ、０．１ Ｍ ＤＴＴ５μｌ、ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ１μｌ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素１μｌを入れて全体が２５μｌになるようにした後、５５℃で保管中のＲＮＡ/プライマー混合溶液と混合してから５５℃で５０分間反応させた。その後、８５℃で５分間反応させることで逆転写酵素を不活性化させた後、氷に入れて反応を終結させた。マーカー遺伝子を定量するための標準的な遺伝子としてＲＰＬ１３Ａを使用した。標準遺伝子のプライマーを使用してＲＴ-ＰＣＲ反応を行い、標準遺伝子ＲＰＬ１３Ａの発現量が等しくなるようにcＤＮＡの濃度を補正した。まず、それぞれのcＤＮＡを２０倍希釈した後、希釈された試料２μｌを用いて、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは、２×ＰＣＲ ｐｒｅｍｉｘ(Ｈｏｔ ｓｔａｒｔ社)１５μｌ、２μｌのＰＲＬ１３Ａ正方向プライマー、２μｌのＰＲＬ１３Ａ逆方向プライマー、１１μｌの蒸留水を入れて使用し、２０サイクル、２３サイクル、２５サイクルを行った。この時のＲＴ-ＰＣＲ反応条件は、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で１分行った。使用されたＲＰＬ１３Ａプライマーは正方向５'-ＣＡＴＣＧＴＧＧＣＴＡＡＡＣＡＧＧＴＡＣＴＧ-３ '(配列番号１)、逆方向５'-ＧＣＡＣＧＡＣＣＴＴＧＡＧＧＧＣＡＧＣ-３'(配列番号２)である。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルにロードして電気泳動した後、ゲルの写真を撮り、画像をＴｏｔａｌＬａｂ ｖ１．０プログラム(Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｘ社)で定量した後、再び補正してＰＣＲを行って定量するという方法で、各試料の濃度を同様に補正した。
各試料の全ＲＮＡ２μｇ、プライマーである５０Ｍ オリゴ(ｄＴ)１μｌと１０ｍＭ ｄＮＴＰ ２．５μｌを入れて、ＲＮａｓｅ阻害剤であるＤＥＰＣが含まれている滅菌水で全体が２５μｌ になるようにしてＲＮＡ/プライマー混合溶液を作製した。６５℃で５分間反応させた後、５５℃に移して保管した。次に、１０× ＲＴ 緩衝液５μｌ 、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２１０μｌ、０．１ Ｍ ＤＴＴ５μｌ、ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ１μｌ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素１μｌを入れて全体が２５μｌになるようにした後、５５℃で保管中のＲＮＡ/プライマー混合溶液と混合してから５５℃で５０分間反応させた。その後、８５℃で５分間反応させることで逆転写酵素を不活性化させた後、氷に入れて反応を終結させた。マーカー遺伝子を定量するための標準的な遺伝子としてＲＰＬ１３Ａを使用した。標準遺伝子のプライマーを使用してＲＴ-ＰＣＲ反応を行い、標準遺伝子ＲＰＬ１３Ａの発現量が等しくなるようにcＤＮＡの濃度を補正した。まず、それぞれのcＤＮＡを２０倍希釈した後、希釈された試料２μｌを用いて、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは、２×ＰＣＲ ｐｒｅｍｉｘ(Ｈｏｔ ｓｔａｒｔ社)１５μｌ、２μｌのＰＲＬ１３Ａ正方向プライマー、２μｌのＰＲＬ１３Ａ逆方向プライマー、１１μｌの蒸留水を入れて使用し、２０サイクル、２３サイクル、２５サイクルを行った。この時のＲＴ-ＰＣＲ反応条件は、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で１分行った。使用されたＲＰＬ１３Ａプライマーは正方向５'-ＣＡＴＣＧＴＧＧＣＴＡＡＡＣＡＧＧＴＡＣＴＧ-３ '(配列番号１)、逆方向５'-ＧＣＡＣＧＡＣＣＴＴＧＡＧＧＧＣＡＧＣ-３'(配列番号２)である。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルにロードして電気泳動した後、ゲルの写真を撮り、画像をＴｏｔａｌＬａｂ ｖ１．０プログラム(Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｄｙｎａｍｉｘ社)で定量した後、再び補正してＰＣＲを行って定量するという方法で、各試料の濃度を同様に補正した。
実施例３-２：ＲＴ-ＰＣＲ / リアルタイムＰＣＲを用いた発現量の分析
同じ量になるように希釈したcＤＮＡを用いて、前記遺伝子のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行った。cＤＮＡ３μｌ、２× ｐｒｅｍｉｘ１０μｌ、プライマー各２μｌ(２０ ｐｍｏｌｅ)、蒸留水２μｌを混合して溶液の総量を２０μｌになるように作製し、ＰＣＲ反応は９４℃で１分、５４℃で３０秒、７２℃で１分とし、各遺伝子ごとのサイクルは異なるようにした。ＰＣＲ産物を確認するために、２％アガロースゲルを用いて電気泳動し、イメージ装置を用いて分析した。リアルタイムＲＴ-ＰＣＲは、Ｑｉａｇｅｎ社(ＣＡ、ＵＳＡ)のＤＮＡＳＹＢＲＩ試薬とＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ(Ｒｏｃｈｅ社)を用いた。融解曲線（Ｍｅｌｔ Ｃｕｒｖｅ ）分析により、ＰＣＲ産物の質を評価し、遺伝子発現量は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．５ ｓｏｆｔｗａｒｅ(Ｒｏｃｈｅ社)を用いて分析した。前記ＲＴ-ＰＣＲ/リアルタイムＰＣＲで使用した遺伝子の特異的プライマーと対照プライマーの配列(配列番号１〜１６)は、表１に記載した。
同じ量になるように希釈したcＤＮＡを用いて、前記遺伝子のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行った。cＤＮＡ３μｌ、２× ｐｒｅｍｉｘ１０μｌ、プライマー各２μｌ(２０ ｐｍｏｌｅ)、蒸留水２μｌを混合して溶液の総量を２０μｌになるように作製し、ＰＣＲ反応は９４℃で１分、５４℃で３０秒、７２℃で１分とし、各遺伝子ごとのサイクルは異なるようにした。ＰＣＲ産物を確認するために、２％アガロースゲルを用いて電気泳動し、イメージ装置を用いて分析した。リアルタイムＲＴ-ＰＣＲは、Ｑｉａｇｅｎ社(ＣＡ、ＵＳＡ)のＤＮＡＳＹＢＲＩ試薬とＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ(Ｒｏｃｈｅ社)を用いた。融解曲線（Ｍｅｌｔ Ｃｕｒｖｅ ）分析により、ＰＣＲ産物の質を評価し、遺伝子発現量は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．５ ｓｏｆｔｗａｒｅ(Ｒｏｃｈｅ社)を用いて分析した。前記ＲＴ-ＰＣＲ/リアルタイムＰＣＲで使用した遺伝子の特異的プライマーと対照プライマーの配列(配列番号１〜１６)は、表１に記載した。
その結果を図４、５に示した。その結果、前記遺伝子は基礎培地に比べて増殖培地において増加或いは減少することが確認された。従って、ＡＧＰＡＴ９(９４．１％、１７個のうち１６個の試料で増加)ＡＮＸＡ１０(９４．１％、１７個のうち１６個の試料で増加)、ＩＧＦ２ＢＰ３(１００％、１７個のうち１７個の試料で増加)、ＰＴＧＥＲ２(１００％、１７個中１７個の試料で増加)(図４ａ〜ｄ)、ＩＴＧＡ１１(９４．１％、１７個のうち１６個の試料で減少)、ＰＡＷＲ(９４．１％、１７個のうち１６個の試料で減少)、ＳＦＲＰ２(９４．１％、１７個のうち、１６個の試料で減少)(図５ａ〜ｃ)、前記遺伝子は、増殖培地で培養された臨床的効能が増加した脂肪由来幹細胞を判断することのできるマーカーとして、又は改善された培養法を用いて培養した脂肪由来幹細胞の品質の一貫性を検出するマーカーなどとして使用されることが見込まれる。
実施例４：選別された遺伝子の継代によるタンパク質の発現の調査
ドナーの脂肪幹細胞の試料(基礎培地と増殖培地で培養)を用いて、実施例３で確認された遺伝子のうち一部の発現量をウエスタンブロット分析法でタンパク質定量を介して分析した。
ドナーの脂肪幹細胞の試料(基礎培地と増殖培地で培養)を用いて、実施例３で確認された遺伝子のうち一部の発現量をウエスタンブロット分析法でタンパク質定量を介して分析した。
具体的には、６０ｍｍディッシュで培養された細胞をＰＢＳで一度すすいだ後、冷たいタンパク質の溶解緩衝液(ＲＩＰＡ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ：５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ-Ｃｌ(ｐＨ ７．５)、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ-４０、１０％グリセロール、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ ＤＴＴ、２０ｍＭ ＮａＦ、1 ｍＭ ＥＤＴＡ、タンパク質分解酵素阻害剤)を添加して、細胞のタンパク質を準備した。準備された各タンパク質試料を３０μｇずつ使用して、１０％若しくは１２％ＳＤＳ-ＰＡＧＥ(ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動)ゲル（ｇｅｌ）にかけてサイズ別にタンパク質を分離した後、これをＰＶＤＦ膜に移した。
タンパク質の移されたフィルターを適当な大きさにカットした後、それぞれのタンパク質に対応する抗体で処理した。抗体についての詳細は、以下の通りである。 ａｎｔｉ-ＡＮＸＡ１０(Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ-７０００９)、ａｎｔｉ-ＩＧＦ２ＢＰ３(Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ-１００７６６)、ａｎｔｉ-ＰＴＧＥＲ２(ａｂｃａｍ、ａｂ１６１５１)、ａｎｔｉ-ＩＴＧＡ１１(ａｂ１０７８５８)、ａｎｔｉ-ＰＡＷＲ(Ｓｉｇｍａ Ａ０５４５)、ａｎｔｉ- ＡＣＴＩＮ(Ｓｉｇｍａ、Ａ５３１６)。各タンパク質の量はＩｍｍｏｂｉｌｏｎＴＭウエスタンブロテイング検出試薬(Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔｓ)(Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ)を使用して、バンド(ｂａｎｄ)で確認した。
その結果、前記の遺伝子の中で、ＲＴ-ＰＣＲを通じて増殖培地でｍＲＮＡレベルが増加する遺伝子であるＡＮＸＡ１０、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＰＴＧＥＲ２の場合、基礎培地ではタンパク質の発現が減少し、増殖培地ではタンパク質の発現が増加しているため、ｍＲＮＡ実験結果と一致しており、増殖培地では継代の増加に伴ってｍＲＮＡレベルが減少する遺伝子であるＩＴＧＡ１１、ＰＡＷＲの場合においては、基礎培地でタンパク質の発現が増加し、増殖培地でタンパク質の発現が減少しているため、同様にｍＲＮＡの実験結果と一致することが確認された(図６)。
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形で実施可能であることを理解しうるであろう。これに関連し、前述した実施例は、全ての面において例示的なものであり、限定的ではないものとして理解すべきである。本発明の範囲は前述の詳細な説明よりも、後述の特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるあらゆる変更又は変形された形態が本発明の範囲に含まれるものとして解釈されるべきである。
Claims (11)
- １-アシルグリセロール-３-リン酸-Ｏ-アシルトランスフェラーゼ９(ＡＧＰＡＴ９)、アネキシンＡ１０（ＡＮＸＡ１０)、インスリン様増殖因子２結合タンパク質３（ ＩＧＦ２ＢＰ３)、プロスタグランジンＥ受容体２（ＰＴＧＥＲ２)、インテグリンα１１（ＩＴＧＡ１１)、ＰＡＷＲ(ＰＲＫＣ、アポトーシス、ＷＴ１、制御因子)及び分泌型フリッツルド関連タンパク質２（ＳＦＲＰ２)からなる群より選択される１つ以上の遺伝子のｍＲＮＡ又はそのタンパク質レベルを測定する製剤を含む、上皮増殖因子（ＥＧＦ)又は塩基性線維芽細胞増殖遺伝子(ｂＦＧＦ)を含む培地で培養した脂肪由来幹細胞の治療能力を検出するためのマーカー検出用組成物。
- ＡＧＰＡＴ９、ＡＮＸＡ１０、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＰＴＧＥＲ２、ＩＴＧＡ１１、ＰＡＷＲ及びＳＦＲＰ２からなる群より選択される１つ以上の遺伝子のｍＲＮＡ又はそのタンパク質レベルを測定する製剤を含む、ＥＧＦ又はｂＦＧＦを含む培地で培養した脂肪由来幹細胞の増殖能力を検出するためのマーカー検出用組成物。
- 前記遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定する製剤が、前記遺伝子に特異的に結合するプライマー対又はプローブを含む、請求項１又は２に記載の組成物。
- 前記タンパク質レベルを測定する製剤が、前記タンパク質に特異的な抗体を含むものである、請求項１又は２に記載の組成物。
- 請求項１の組成物を含む、ＥＧＦ又はｂＦＧＦを含む培地で培養した脂肪由来幹細胞の治療能力を検出するためのマーカー検出用キット。
- 請求項２の組成物を含む、ＥＧＦ又はｂＦＧＦを含む培地で培養した脂肪由来幹細胞の増殖能力を検出するためのマーカー検出用キット。
- 前記キットが、ＲＴ-ＰＣＲキット、ＤＮＡチップキット又はタンパク質チップキットである、 請求項５又は６に記載のマーカー検出用キット。
- ＥＧＦ又はｂＦＧＦを含む培地で培養した脂肪由来幹細胞のＡＧＰＡＴ９、ＡＮＸＡ１０、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＰＴＧＥＲ２、ＩＴＧＡ１１、ＰＡＷＲ及びＳＦＲＰ２からなる群より選択される１つ以上の遺伝子のｍＲＮＡ又はそのタンパク質レベルを測定する段階を含む、脂肪由来幹細胞の治療能力を検出する方法。
- ＥＧＦ又はｂＦＧＦを含む培地で培養した脂肪由来幹細胞のＡＧＰＡＴ９、ＡＮＸＡ１０、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＰＴＧＥＲ２、ＩＴＧＡ１１、ＰＡＷＲ及びＳＦＲＰ２からなる群より選択される１つ以上の遺伝子のｍＲＮＡ又はそのタンパク質レベルを測定する段階を含む、脂肪由来幹細胞の増殖能力を検出する方法。
- 前記方法が、ＩＴＧＡ１１、ＰＡＷＲ及びＳＦＲＰ２からなる群より選択される１つ以上の遺伝子のｍＲＮＡ、又はそのタンパク質の量が対照群である基礎培地で培養した脂肪由来幹細胞で測定した値に比べて少なければ、治療能力が対照群に比べて高いものと判断する段階をさらに含む、請求項８に記載の脂肪由来幹細胞の治療能力を検出する方法。
- 前記方法が、ＡＧＰＡＴ９、ＡＮＸＡ１０、ＩＧＦ２ＢＰ３及びＰＴＧＥＲ２からなる群より選択される１つ以上の遺伝子のｍＲＮＡ又はそのタンパク質の量が対照群である基礎培地で培養した脂肪由来幹細胞で測定した値に比べて多ければ、治療能力が対照群に比べて高いものと判断する段階をさらに含む、請求項８に記載の脂肪由来幹細胞の治療能力を検出する方法。
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