WO2008069122A1 - 間葉系幹細胞の軟骨細胞分化マーカー - Google Patents

間葉系幹細胞の軟骨細胞分化マーカー Download PDF

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WO2008069122A1
WO2008069122A1 PCT/JP2007/073160 JP2007073160W WO2008069122A1 WO 2008069122 A1 WO2008069122 A1 WO 2008069122A1 JP 2007073160 W JP2007073160 W JP 2007073160W WO 2008069122 A1 WO2008069122 A1 WO 2008069122A1
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WO
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tgf
differentiation
gene
mesenchymal stem
chondrocytes
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PCT/JP2007/073160
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English (en)
French (fr)
Inventor
Junya Toguchida
Tomoki Aoyama
Koji Hayashi
Hideyuki Harada
Original Assignee
Kyoto University
Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.
Sumitomo Chemical Company, Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells

Definitions

  • the present invention relates to a chondrocyte differentiation marker for mesenchymal stem cells. For more details, see TGF
  • the present invention relates to a marker for differentiation of human mesenchymal stem cells into chondrocytes using / 33, and a method for determining cartilage differentiation ability using the marker.
  • Cartilage is mainly present in joints around bone tissue, and its relatively soft tissue structure acts to relieve the friction of bone tissue. When that part is damaged and worn, Pain and degeneration of joints occur. With aging, diseases characterized by cartilage damage and degeneration, such as osteoarthritis, have increased in recent years!
  • cartilage tissue is a tissue that does not invade blood vessels and is said to be extremely difficult to repair once degeneration / abrasion occurs (see Non-Patent Document 1).
  • fundamental pathologic treatment is performed, and it is also a disease.
  • drugs used for osteoarthritis are symptomatic treatments such as analgesics and lubricants, and fundamental treatments for degeneration and wear are being implemented!
  • Patent Document l WO98 / 032333
  • Patent Document 2 JP-A-2006-59
  • Patent Document 3 WO02 / 095399
  • Non-Patent Document 1 Latest Medicine 54 (12) 103-109, 1999
  • Non-Patent Document 2 Science 276: 71-74, 1997
  • Non-Patent Document 3 Proc.Natl Acad.Sci., USA 99 (7) 4397-4402,2002
  • Non-Patent Document 4 Cell Tissue Res 320: 269-276,2005
  • An object of the present invention is to provide a marker for early determination of the quality of MSC used for cartilage transplantation, a method for determining the chondrocyte differentiation ability of MSC using the marker, and the like.
  • the present inventors searched for a marker that can determine the quality of MSC at an early stage, and selected a group of genes whose expression varies when MSCs differentiate into soft bone.
  • the following devised techniques were introduced in order to overcome the complexity of the culture method such as 3D culture and the addition of various growth factors.
  • MSC clones that differentiate into cartilage and MSC clones that do not differentiate into cartilage were established, and factors other than “differentiation” such as 3D culture and addition of various growth factors were reduced as much as possible.
  • (3) Comprehensive gene expression analysis by micro ray was performed on multiple independent clones as early as 24 hours of induction of cartilage differentiation, and a group of genes whose expression varies in common was extracted. The effectiveness of the selected gene group was confirmed by a method (quantitative RT-PCR method) different from Microarray.
  • the effectiveness of the selected gene group was examined in several primary culture MSCs supplied from independent donors, and the effectiveness was confirmed.
  • TGF / 3/3 gene was selected. It became clear that the TGF / 33 gene was induced not only in cloned MSCs but also in primary cultured MSCs at an early stage of 24 hours for induction of cartilage differentiation. From this, it became clear that the expression induction of TGF / 33 can be used as an index of differentiation from MSC to chondrocytes (an index of differentiation ability of MSC to chondrocytes).
  • the present invention has been completed based on the above findings.
  • the present invention provides:
  • a chondrocyte differentiation marker for mesenchymal stem cells comprising a polynucleotide consisting of at least 18 consecutive nucleotides in the nucleotide sequence of the TGF ⁇ 3 gene and / or a polynucleotide complementary to the polynucleotide;
  • a method for measuring the differentiation potential of mesenchymal stem cells into chondrocytes comprising the following steps (a), (b) and (c):
  • a kit for measuring the differentiation potential of mesenchymal stem cells into chondrocytes comprising the differentiation marker according to any one of (1) to (3) as a component,
  • chondrocyte differentiation marker for mesenchymal stem cells comprising an antibody that specifically binds to TGF / 33,
  • TGF ⁇ 3 is a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
  • a kit for measuring the differentiation potential of mesenchymal stem cells into chondrocytes comprising the differentiation marker according to (8) or (9) as a component,
  • a chondrocyte differentiation marker for mesenchymal stem cells comprising a vector containing a TGF / 33 expression regulatory region and a reporter gene;
  • a method for measuring the differentiation potential of mesenchymal stem cells into chondrocytes comprising the following steps (a), (b) and (c):
  • a kit for measuring the differentiation potential of mesenchymal stem cells into chondrocytes comprising the differentiation marker according to any one of (14) to (16) as a component,
  • a polynucleotide comprising at least 18 consecutive nucleotides in the nucleotide sequence of the TGF ⁇ 3 gene and / or complementary to the polynucleotide for measuring the differentiation potential from mesenchymal stem cells to chondrocytes
  • TGF ⁇ 3 gene is a gene consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • TGF ⁇ 3 gene is a gene consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • TGF ⁇ 3 is a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
  • a marker for differentiation of MSC into chondrocytes is provided. Since TGF / 3, which is the differentiation machine of the present invention, is a gene that specifically and early expresses MSCs that induce differentiation into cartilage, cell transplantation therapy can be performed by examining the expression level of TGF / 3. MSCs that are suitable for use can be determined early. Furthermore, MSC quality assessment just before transplantation can be performed using the expression of TGF / 33 of the present invention as an index.
  • TGF / 3 expression is a phenomenon peculiar to the differentiation from MSC to chondrocytes
  • examining the expression level of TGF / 3 in the study of the differentiation mechanism from MSC to chondrocytes Is also useful.
  • gene or “DNA” includes not only double-stranded DNA but also its constituents. Used to encompass each single-stranded DNA such as the sense strand (positive strand) and antisense strand (complementary strand). That is, in this specification, unless otherwise specified, a gene (DNA) is a double-stranded DNA, a single-stranded DNA containing cDNA (positive strand), and a single-stranded strand having a sequence complementary to the positive strand. DNA (complementary strand) and any of these fragments are included.
  • the “gene” or “DNA” includes a “gene” or “DNA” represented by a specific base sequence (SEQ ID NO: 1) and a protein (SEQ ID NO: 2) encoded thereby. Included are “genes” or “DNAs” that encode proteins (eg, homologues (such as homologue splice variants), variants and derivatives) that have similar biological functions.
  • the “gene” or “DNA” encoding such homologue, variant or derivative is specifically represented by SEQ ID NO: 1 under the stringent conditions described in (1-1) below. Examples thereof include “gene” or “DNA” having a base sequence that hybridizes with the complementary sequence of the base sequence shown.
  • TGF / 3 3 transforming growth factor-beta 3
  • DNA of TGF / 3 3 a specific base is used unless otherwise specified by a SEQ ID NO. It is used to include the gene (DNA) encoding the human TGF / 33 gene (DNA) represented by the sequence (SEQ ID NO: 1) and its homologues, mutants and derivatives. Specifically, the human TGF / 3 3 gene (GenBank Accession No. J03241) described in SEQ ID NO: 1, mouse TGF ⁇ 3 gene (GenBank Accession No. NM_009368), rat TGF ⁇ 3 gene (GenBank Accession No. NM_01317 4 ) and the like are included.
  • polynucleotide is used to include both RNA and DNA.
  • the DNA includes both cDNA and synthetic DNA.
  • the RNA includes all of total RNA, mRNA, rRNA, and synthetic RNA.
  • protein or “(poly) peptide” includes a specific amino acid sequence ( Not only the “protein” or “(poly) peptide” shown in SEQ ID NO: 2), but also its homologues (homologia splice variant) and mutations, as long as their biological functions are equivalent. Body, mature body and the like are included. Variants herein include naturally occurring allelic variants, non-naturally occurring variants, and variants having amino acid sequences modified by artificial deletions, substitutions, additions and insertions. Is done. The mutant includes a protein having a sequence identity of 70%, preferably 80%, more preferably 95%, and even more preferably 97% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. I can give you a power S.
  • TGF / 3 3 protein or simply "TGF / 3 3” is used in this specification, it is represented by a specific amino acid sequence IJ (SEQ ID NO: 2) unless otherwise specified by the SEQ ID NO. It is used to include human TGF / 33 and its homologues, mutants, and matured forms. Specifically, human TGF / 3 3 (GenBank Accession ⁇ ⁇ ⁇ 10600) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, mouse TGF / 3 3 (GenBank Accession No. NP_033394), rat TGF ⁇ 3 (GenBank Accession ( ⁇ ⁇ ⁇ _037306) and the like are included.
  • antibody refers to an antigen binding property such as a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, a chimeric antibody, a single chain antibody, or a fragment generated by a Fab fragment or Fab expression library. Some of the above antibodies are included.
  • the “chondrocyte differentiation marker for mesenchymal stem cells” refers to a marker for detecting a factor that specifically increases expression when mesenchymal stem cells (MSC) differentiate into chondrocytes. It means one by one. In other words, MSC is known to differentiate in three directions: adipocytes 'osteoblasts' chondrocytes under appropriate culture conditions, but not expressed when differentiated into adipocytes and osteoblasts. However, it means a marker for detecting a factor that is expressed during differentiation into chondrocytes. The present invention reveals that the expression of TGF / 3 is specifically increased during differentiation of MSCs into chondrocytes.
  • the marker is a polynucleotide capable of specifically recognizing and binding to the TGF / 33 gene.
  • a reporter vector a vector containing an expression regulatory region of TGF / 33 and a reporter gene that can substitute for detection of increased expression of the TGF / 33 gene can be used as the marker.
  • the polynucleotide can be effectively used as a primer for amplifying the TGF / 33 gene expressed in cultured MSC or the like, or as a probe for detecting the TGF / 33 gene. Further, the antibody can be effectively used as a probe for detecting TGF / 33 protein expressed in cultured MSC or the like.
  • test MSC refers to an MSC that has been collected and cultured from a patient with cartilage damage (cartilage defect, etc.) by a conventional method and then induced to differentiate cartilage for about 24 hours using TGF / 33. Point to. Induction is carried out by adding TGF / 33-containing cartilage differentiation-inducing medium (see Example 1 described later) to cells and performing plate (monolayer) culture or three-dimensional culture for about 24 hours. More preferably, three-dimensional culture is performed.
  • TGF / 3 3 gene (hereinafter sometimes referred to as the gene of the present invention), TGF / 3 3 protein
  • the TGF / 33 gene in the present invention is a known gene.
  • the human TGF / 3 3 gene the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 is known (GenBank Accession No. J03241).
  • GenBank Accession No. NM_009368 is known as the mouse TGF / 3 3 gene
  • GenBank Accession No. NM_013174 is known as the rat TGF / 3 3 gene.
  • the TGF ⁇ 3 gene of the present invention has a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or an appropriate portion of the nucleotide sequence disclosed in each of the above accession numbers, a hybridization probe or PCR.
  • a human bone marrow cell-derived cDNA library (TaKaRa) can be used for cloning.
  • the black One Jung can be easily carried out by those skilled in the art according to a basic book such as Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
  • TGF / 33 can be used as an index of differentiation from MSC to chondrocytes. Based on this new knowledge, by measuring the gene expression (expression level) of TGF / 33, it can be easily determined that MSC has the ability to differentiate into chondrocytes, and the quality evaluation of transplanted chondrocytes Can be done accurately.
  • the polynucleotide can determine whether or not the test MSC has the ability to differentiate into chondrocytes by measuring the expression level of TGF ⁇ 3 in the test MSC. It is useful as a tool (marker) that can be used.
  • the chondrocyte differentiation marker of the present invention comprises a polynucleotide comprising at least 18 consecutive nucleotides and / or a polynucleotide complementary to the polynucleotide in the base sequence of the TGF / 33 gene. It is what.
  • complementary polynucleotide refers to the nucleotide sequence power of the TGF ⁇ 3 gene, the full-length arrangement IJ of the resulting polynucleotide, or at least a continuous sequence in the nucleotide sequence 18 Basically complementary to the partial sequence that has a base sequence of base length (here, for convenience, these are also “positive strands! /”) Based on the base pairing relationship such as A: T and G: C It means a polynucleotide having a general relationship.
  • such a complementary strand is not limited to forming a complete complementary sequence with the target positive strand base sequence, but has a complementary relationship that allows hybridization with the target positive strand under stringent conditions. It may be a thing.
  • the stringent conditions here bind the complex or probe as taught by Berger and immel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA). It can be determined based on the melting temperature (Tm) of the nucleic acid. For example, as washing conditions after hybridization, the conditions of about “1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 37 ° C.” can be mentioned.
  • the complementary strand is preferably one that maintains a hybridized state with the target positive strand even when washed under such conditions.
  • the more stringent hybridization conditions should be about “0.5 X SSC, 0.1% SDS, 42 ° C”, and the more stringent hybridization conditions should be about “0.1 X SSC, 0.1% SDS, 65 ° C”.
  • the target Examples include a strand composed of a base sequence that is completely complementary to the base sequence of the normal strand, and a strand composed of a base sequence having at least 90%, preferably 95% homology with the strand. .
  • the polynucleotide on the positive strand side has a complementary relationship with the base sequence of the above-mentioned complementary strand except for the TGF ⁇ 3 base sequence or a partial sequence thereof.
  • a chain consisting of a base sequence can be included.
  • normal-strand polynucleotide and complementary-strand (reverse-strand) polynucleotide may each be used as a marker in a single-stranded form, or may be used as a marker in a double-stranded form.
  • the chondrocyte differentiation marker of the present invention may specifically be a polynucleotide having a TGF / 33 gene base sequence (full-length sequence) strength, and a polynucleotide comprising its complementary sequence. It may be.
  • the full-length stretched polynucleotide is a polynucleotide comprising a partial sequence of its complementary sequence. Also good.
  • examples of the partial sequence include polynucleotides having at least 18 consecutive base lengths arbitrarily selected from the base sequences of the full-length sequences and their complementary sequences.
  • the limitation of “at least 18 bases” is based on the grounds that the presence of at least 18 bases in the TGF / 3 3 gene is sufficient to identify (detect) the TGF / 3 3 gene. is there.
  • “selectively (specifically)” means that, for example, in the Northern plot method, the TGF / 33 gene or a polynucleotide derived therefrom can be specifically detected, and RT-PCR
  • the force that means that the TGF / 3 3 gene or the polynucleotide derived therefrom is specifically produced is not limited thereto, and those skilled in the art will recognize that the above-mentioned detected product or product is the TGF / 3 3 gene. Anything that can be judged to have been derived from this.
  • the marker of the present invention is, for example, based on the nucleotide sequence of the TGF / 3 3 gene described in SEQ ID NO: 1, and sequence 3 (HYPERLINK http: //www.genome.wi.mit.eau/ cgi-bin / primer / primer3.cgi)! /, can be designed using Vector NTI (Infomax).
  • a primer or probe candidate arrangement IJ obtained by applying the TGF / 33 base sequence to primer 3 or Vector NTI software, or a polynucleotide containing at least the sequence as a primer or probe is used. be able to.
  • the primer include a polynucleotide containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 9, 10, 13, 14, 17, 18, 29, 30 or 31.
  • the marker of the present invention is not limited as long as it has a length of at least 18 bases as described above. Specifically, the length is appropriately selected and set according to the use of the marker. That's the power S.
  • Measurement (determination) of the differentiation ability from MSC to chondrocytes is performed by evaluating the presence or expression level (expression level) of TGF / 3 3 gene in mesenchymal stem cells (MSC) for test.
  • the marker of the present invention is used as a primer for specifically recognizing and amplifying RNA produced by expression of the TGF / 33 gene or a polynucleotide derived therefrom, or a polynucleotide derived therefrom. It can be used as a probe for specifically detecting.
  • the marker of the present invention when used as a primer in the measurement of differentiation ability into chondrocytes, those having a base length of usually 18 bp to 100 bp, preferably 18 bp to 50 bp, more preferably 18 bp to 35 bp can be exemplified.
  • a polynucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 9, 10, 13, 14, 17, 18, 29, 30 or 31 is exemplified.
  • those having a base length of usually 18 bp to the entire sequence, preferably 18 bp to lkb, more preferably 100 bp to lkb can be exemplified.
  • the marker of the present invention is a known method for specifically detecting a specific gene, such as Northern blotting, RT-PCR, in situ hybridization, chip analysis, etc. Or it can utilize as a probe. By using this, it is possible to evaluate the presence / absence or expression level (expression level) of TGF / 33 gene in MSC with the power S.
  • the sample to be measured was collected from a patient with cartilage disorder (cartilage defect, etc.), cultured, and tested for MSC induction for about 24 hours.
  • Total RNA prepared according to a conventional method may be used, and various polynucleotides prepared based on the RNA may also be used! /.
  • the gene expression level of the TGF ⁇ 3 gene in MSC can be detected or quantified using a DNA chip.
  • the marker according to the polynucleotide of the present invention can be used as a probe for a DNA chip (for example, in the case of Gene Chip HG-U133A manufactured by Affymetrix, it is used as a 25 bp long polynucleotide probe). ).
  • a DNA chip is hybridized with a labeled DNA or RNA prepared based on RNA prepared from a test MSC, and the probe (marker of the present invention) formed by the hybridized with the labeled DNA or RNA. Is detected using the label of the labeled DNA or RNA as an indicator, and the presence or expression level (expression level) of the TGF / 33 gene in the cell can be evaluated.
  • the present invention provides an antibody that specifically binds to the expression product of TGF / 3 3 gene (TGF 133) as a marker for measuring the ability of MSCs to differentiate into chondrocytes.
  • TGF ⁇ 3 (TGF ⁇ 3 protein) in the present invention is a known protein.
  • a protein shown in SEQ ID NO: 2 is known as human TGF / 3 (GenBank Accession No. P10600).
  • GenBank Accession No. NP_033394 is known as mouse TGF / 33
  • GenBank Accession No. NP_037306 is known as rat TGF / 33.
  • the TGF ⁇ 3 can be obtained by introducing an expression vector containing the cloned TGF ⁇ 3 gene into a cell, and isolating and purifying TGF / 33 secreted from the cell (transformed cell). Yes (Molecular Endocrinology, Vol 3, 1977-1986, 1989).
  • the expression product (protein) of TGF ⁇ 3 is based on the knowledge that the expression of TGF / 3/3 gene is remarkably increased in MSC having cartilage differentiation ability! This is based on the idea that it can be determined whether or not the test MSC has the ability to differentiate cartilage by detecting the presence or absence and the degree of its expression.
  • the above antibody can be used to determine whether or not the MSC has the ability to differentiate chondrocytes by detecting the presence or level of expression of TGF / 33 in the test MSC ( It is useful as a marker.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be a polyclonal antibody using TGF ⁇ 3 as an immunizing antigen or a monoclonal antibody thereof. Further, an antibody having an antigen binding property to a polypeptide (including oligopeptide) consisting of at least 8 consecutive amino acids, preferably 15 amino acids, more preferably 20 amino acids in the amino acid sequence of TGF / 3 3 is also present. It is included in the antibody of the invention.
  • the antibody of the present invention can also be produced according to these conventional methods (Current Protocol in Molecular Biology, Chapter 11-12-12.13 (2000)). ).
  • TGF / 3 that has been expressed and purified in Escherichia coli or animal cells according to a conventional method or synthesized according to a conventional method is used.
  • a polypeptide having a partial amino acid sequence of 3 can be used to immunize a non-human animal such as a rabbit and obtain it from the sera of the immunized animal according to a conventional method.
  • a non-human animal such as a mouse is immunized with TGF / 33 expressed in Escherichia coli or animal cells or purified according to a conventional method, or a polypeptide having a partial amino acid sequence thereof.
  • Spleen cells and myeloma cells can be obtained from hybridoma cells prepared by cell fusion (Current protocols in Molecular Biology ed. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4-11.11).
  • TGF / 3 used as an immunogen for antibody production is based on DNA cloning and the construction of each plasmid based on the sequence information (SEQ ID NO: 1) of the TGF / 3 3 gene provided by the present invention. It can be obtained by constructing, transfecting the host, culturing the transformant and recovering the protein from the culture. These procedures are known to those skilled in the art or described in the literature (Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983), DNA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985)). It can be performed according to the above.
  • a recombinant DNA capable of expressing a gene encoding TGF ⁇ 3 in a desired host cell is prepared, introduced into the host cell, transformed, and transformed.
  • TGF / 3 By recovering TGF / 3 from a culture obtained by culturing the recombinant, TGF / 33 as an immunogen for producing the antibody of the present invention can be obtained.
  • the partial peptide of TGF / 33 can also be produced by a general chemical synthesis method (peptide synthesis) according to the amino acid sequence information (SEQ ID NO: 2) of TGF / 33 provided by the present invention. .
  • TGF ⁇ 3 of the present invention includes not only a protein having each amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, but also homologues thereof.
  • the homologue is composed of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and TGF / Examples include proteins that can generate antibodies that recognize 3 (having equivalent immunological properties).
  • the number of amino acid mutations and mutation sites in the protein are not limited as long as the immunological activity is maintained. Indicators that determine how many amino acid residues need to be substituted, inserted or deleted without loss of immunological activity are computer programs well known to those skilled in the art, such as DNA Star software. Can be found.
  • the number of mutations is typically within 10% of all amino acids, preferably within 5% of all amino acids, and more preferably within 1% of all amino acids.
  • the amino acid to be substituted is not particularly limited as long as the protein obtained after substitution retains immunological activity equivalent to TGF / 33, but from the viewpoint of maintaining the structure of the protein, the polarity of the residue,
  • the amino acid is preferably an amino acid having properties similar to the amino acid before substitution, such as charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and amphiphilicity.
  • Ala, Val, Leu, lie, Pro, Met, Phe, and Trp are amino acids that are classified as nonpolar amino acids
  • Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, and Gin are mutually uncharged amino acids.
  • Asp and Glu are amino acids that are classified as acidic amino acids
  • Lys, Arg, and His are amino acids that are classified as basic amino acids. Therefore, amino acids belonging to the same group can be appropriately selected using these as indices.
  • the antibody of the present invention may be prepared using a polypeptide (including an oligopeptide) having a partial amino acid sequence of TGF ⁇ 3 as an immunogen.
  • the polypeptide used for the production of such an antibody does not need to have a functional biological activity, but preferably has the same immunogenic properties as TGF / 3 3.
  • Preferred examples include polypeptides having this immunogenic property and consisting of at least 8 consecutive amino acids, preferably 15 amino acids, more preferably 20 amino acids in the amino acid sequence of TGF / 33.
  • the production of antibodies against such polypeptides can also be carried out by enhancing the immunological reaction using various adjuvants depending on the host.
  • adjuvants include Freund's adjuvant, mineral gels such as aluminum hydroxide, and surface active substances such as lysolecithin, pull mouth nick polyol, polyanion, peptides, oil emulsions, keyhole limpet hemocyanin and dinitrophenol, BCG Human adjuvants such as (Bacille Calmette Guerin) and Corynebaterum-Parvum are included.
  • the antibody of the present invention has a property of specifically binding to TGF ⁇ 3, it is possible to specifically detect TGF / 33 expressed in a test MSC by using the antibody. Can do. That is, the antibody of the present invention is useful as a probe for detecting the expression of TGF / 33 in a test MSC.
  • a cell extract was prepared from a test MSC collected and cultured from a cartilage disorder patient and induced to induce cartilage differentiation for about 24 hours according to a conventional method.
  • a conventional method for example, ELISA, RIA,
  • detection methods such as Western blotting, intracellular TGF / 33 can be detected by using the antibody as a probe according to a conventional method.
  • the present invention provides a method for measuring chondrocyte differentiation ability of MSC using the above-described marker of the present invention.
  • the measurement method of the present invention comprises the following: the expression level (level) of TGF / 3 in a test MSC collected from a patient with cartilage disorder and cultured for about 24 hours to induce cartilage differentiation; Is to determine whether the test MSC has the ability to differentiate into chondrocytes by detecting the protein expression level (level) of TGF / 33 and measuring its gene expression level or protein mass. It is.
  • the measurement method of the present invention is effectively used in the quality evaluation of MSC used for transplantation.
  • the measurement method of the present invention includes the following steps (a), (b) and (c):
  • the sample derived from the test MSC used herein includes an RNA-containing sample prepared from the test MSC, a sample containing a polynucleotide further prepared therefrom, or a sample containing a protein prepared from MS C. (Cell extracts and the like). Samples containing such RNA, polynucleotide or protein can be prepared from MSC according to conventional methods.
  • the measurement method of the present invention is specifically carried out as follows according to the type of sample used as a measurement target.
  • RNA When RNA is used as a measurement object, the ability to differentiate MSC into chondrocytes can be specifically measured by a method including the following steps (a), (b) and (c):
  • RNA prepared from a test MSC or a complementary polynucleotide transcribed therefrom, and the differentiation marker of the present invention (a) RNA prepared from a test MSC or a complementary polynucleotide transcribed therefrom, and the differentiation marker of the present invention (a polynucleotide comprising at least 18 consecutive nucleotides in the base sequence of the TGF / 33 gene, and (Or a chondrocyte differentiation marker of MSC containing a polynucleotide complementary to the polynucleotide),
  • the measurement method of the present invention includes TGF in the RNA.
  • the marker of the present invention comprising the aforementioned polynucleotide (containing a polynucleotide comprising at least 18 consecutive nucleotides in the nucleotide sequence of the TGF / 33 gene and / or a polynucleotide complementary to the polynucleotide).
  • the marker of the present invention comprising the aforementioned polynucleotide (containing a polynucleotide comprising at least 18 consecutive nucleotides in the nucleotide sequence of the TGF / 33 gene and / or a polynucleotide complementary to the polynucleotide).
  • Can be carried out by performing known methods such as Northern blotting, RT-PCR, DNA chip analysis, and in situ hybridization analysis.
  • the presence or absence and expression level of TGF / 33 gene in RNA can be detected and measured by using the marker of the present invention as a probe.
  • the marker complement of the present invention is a radioisotope ( 32 P Etc.) and a fluorescent substance, and this is hybridized with RNA derived from a test MSC that has been transferred to a nylon membrane or the like according to a conventional method, and then the formed duplex (DNA) and RNA duplex.
  • a method of detecting and measuring a signal derived from a marker label (RI or fluorescent substance) with a radiation detector (BAS-1800II, manufactured by Fuji Film) or a fluorescence detector can be exemplified.
  • the marker (probe DNA) is labeled according to the protocol and hybridized with RNA derived from the test MSC. It is also possible to use a method of detecting and measuring a signal derived from the above-mentioned label with a multi-bioimager STORM860 (Amersh Pharmacia Biotech).
  • the presence / absence and expression level of the TGF / 33 gene in RNA can be detected and measured by using the marker of the present invention as a primer.
  • a pair of cDNA prepared from the marker of the present invention is prepared so that cDNA can be prepared from RNA derived from the test MSC according to a conventional method, and this can be converted into a saddle type and the target TGF / 33 gene region can be amplified.
  • An example is a method of hybridizing these primers and performing PCR according to a conventional method and detecting the resulting amplified double-stranded DNA.
  • the amplified double-stranded DNA was detected by a method of detecting the labeled double-stranded DNA produced by performing the PCR using a primer previously labeled with RI or a fluorescent substance. It is possible to use a method in which double-stranded DNA is transferred to a nylon membrane or the like according to a conventional method and detected using the labeled single molecule of the present invention as a probe and hybridized therewith.
  • the produced labeled double-stranded DNA product can be measured with an Agilent 2100 bioanalyzer (manufactured by Yokogawa Analytical Systems).
  • the quantitative RT-PCR method is preferably used from the viewpoints of simplicity and quantification.
  • the strengths detailed in the examples below, such as P The method using rime Script RT reagent Kit (Perfect Real Time) (Takarano) and SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time) (Takarabio) is briefly described as follows.
  • LAMP method Loop-mediated Isothermal Amplification method; see Nucleic Acids Research 28 (12) e63, 2000, Virus Vol. 54, No. 1, 107-112, 2004, etc.
  • An amplification method has been developed, and this method is also exemplified as a preferred method of the RT-PCR method.
  • the specific experimental method of the LAMP method is shown below.
  • Primers are designed using the LAMP method primer design support software (PrimerExplorer, http://nmerexplorer.jp/); 5 ⁇ .
  • the reaction product can detect the presence or absence of gene amplification depending on the degree of white turbidity, but it is more reliable to perform electrophoresis in order to further increase the reliability or to have quantitativeness.
  • stain with ethidium bromide and check reaction products by UV Take a picture and quantify the reaction product signal.
  • perform the reaction in a quantitative thermal cycler (Applied Biosystems 7900HT Fast real-time PCR system, etc.) and quantify.
  • a DNA chip on which the above-described marker of the present invention is attached as a DNA probe is prepared, and the RNA force derived from the test MSC is measured. It can be mentioned a method of detecting a double strand of DNA and cRNA formed by hybridization with cRNA prepared according to a conventional method by binding with a labeled probe prepared from the marker of the present invention.
  • the DNA chip an existing DNA chip capable of detecting and measuring the gene expression level of TGF / 33 of the present invention can also be used.
  • a DNA chip capable of detecting and measuring the expression level of such a gene includes Affymetrix's Gene Chip Human Genome U133A.
  • the ability of MSCs to differentiate into chondrocytes is measured by detecting TGF / 33 in the sample and measuring the amount. Specifically, it can be carried out by a method comprising the following steps (a), (b) and (c):
  • TGF / 33 is detected by a known method such as Western blotting, ELISA, or RIA. And a method for quantification.
  • the marker of the present invention is used as a primary antibody, and then a radioisotope such as i, a fluorescent substance, horseradish peroxidase (HR) is used as a secondary antibody.
  • a radioisotope such as i, a fluorescent substance, horseradish peroxidase (HR)
  • HR horseradish peroxidase
  • a labeled antibody labeled with an enzyme such as (P) an antibody that binds to the primary antibody
  • the signal derived from the radioisotope and fluorescent substance of the resulting labeled compound is measured with a radiation measuring instrument (BAS-1800II: Fuji Film Etc.), and by detecting and measuring with a fluorescence detector.
  • ECL Plus Wes Multi-bioimager STORM860 (Amershamf)
  • a labeled antibody an antibody that binds to the primary antibody
  • an enzyme such as horseradish peroxidase (HRP) as a secondary antibody
  • the signal derived from the resulting chromogenic material can be quantitatively analyzed by detecting the reaction in the solid phase by detecting the signal derived from the resulting color developing substance with a microplate reader (Molecular Probe, etc.) or a fluorescence detector.
  • the measurement (judgment) of chondrocyte differentiation ability of MSC is based on the expression level (expression level) of TGF / 3 3 gene in the test MSC, or the protein level (expression level) of the expression product of these genes. ) Is compared with the gene expression level or protein level in MSC (negative control) or primary cultured chondrocytes (positive control) that do not have the ability to differentiate into chondrocytes, and the difference between the two is determined. be able to.
  • the measurement of the chondrocyte differentiation ability of MSC using the marker of the present invention was carried out by collecting and culturing from a patient and inducing TGF ⁇ 3 in a test MSC that was induced for chondrogenesis for about 24 hours. This is done by measuring the expression level of the gene or TGF / 3 3 protein.
  • the test MSC In order for the test MSC to be judged to have the ability to differentiate into chondrocytes, at least the ability to express the TGF ⁇ 3 gene or TGF ⁇ 3 protein in the MSC has the ability to differentiate into chondrocytes. It is necessary to exceed the expression level in no MSC (eg, AO clone in the Examples).
  • TGF ⁇ 3 gene expression level / ⁇ -actin gene expression level is determined.
  • a cell having a correction value of 0.1 or more when the correction value for primary cultured chondrocytes is 1 can be determined as a cell having cartilage differentiation ability.
  • the same determination as described above is performed immediately before transplantation (about 3 days before), and a positive cell can be determined as a transplant cell.
  • the measurement of the chondrocyte differentiation potential of MSC using the marker of the present invention is compared with the conventional method (a method for confirming the differentiation potential of the cell by determining the final differentiation form).
  • the quality of MSCs used for transplantation can be evaluated early and easily with a small amount of cells.
  • the MSC determined to be transplantable that is, having a chondrocyte differentiation ability by the evaluation using the marker of the present invention, can be transplanted (returned) to a patient in an undifferentiated state, it can be differentiated into chondrocytes. Or, after differentiation, it can be transplanted (returned) to the patient.
  • the present invention provides a kit for measuring the differentiation potential of MSCs into chondrocytes, comprising the marker of the present invention as a component.
  • the kit is effectively used to measure the ability of MSCs to differentiate into chondrocytes.
  • the kit may be a kit comprising only the marker according to the polynucleotide of the present invention, or a kit comprising the marker of the present invention and other components. There may be.
  • the kit is an RT-PCR kit
  • other components than the marker of the present invention include TGF / 33, cartilage differentiation-inducing medium (refer to the examples for composition), and RNA extraction Examples include devices (for example, RNeasy kit), primers for 0-actin gene amplification for correction, standard cartilage cDNA, RT reaction mixture, PCR reaction mixture, and the like.
  • the kit when the kit is a kit for measuring TGF ⁇ 3 protein, the kit may be a kit comprising only the marker related to the antibody of the present invention, or the marker of the present invention and other The kit containing an ingredient may be sufficient.
  • the kit is an ELISA kit, components other than Marker 1 (antibody) of the present invention include standard cartilage protein, human TGF ⁇ 3 protein, measurement plate, plate washing solution, detection secondary antibody, coloring solution, Name the coloring reaction stop solution and so on.
  • the present invention also provides a chondrocyte differentiation marker for mesenchymal stem cells, comprising a vector containing a TGF / 33 expression regulatory region and a reporter gene.
  • the present invention by measuring the expression level of the TGF / 33 gene in the test MSC, the ability of the test MSC to differentiate into chondrocytes is determined at an early stage. It became clear that it can be judged. Therefore, instead of measuring the expression level of the TGF / 3 3 gene itself, a reporter vector containing the expression regulatory region of the TGF / 3 3 gene and the reporter gene is introduced into the test MSC, and the expression level of the reporter gene is By measuring the (reporter activity), the expression level of the TGF / 33 gene can also be estimated.
  • the present invention also provides a chondrocyte differentiation marker for mesenchymal stem cells comprising such a reporter vector.
  • the “TGF / 3 3 expression regulatory region” may be any region as long as it is known as a TGF / 3 3 expression regulatory region.
  • the expression regulatory region of human TGF / 33 described in Genbank No .: AF107885 can be mentioned.
  • an expression regulatory region containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 32 can be mentioned.
  • the "reporter gene” can be any gene known as a reporter gene, and specifically includes genes such as luciferase, GFP, CAT, ALP, and ⁇ Gal.
  • Various reporter vectors incorporating these reporter genes are commercially available.
  • PGV-B vector Toyo Ink
  • MultiColor-Luc registered
  • pSLG-test Vector Toyo Ink Co., Ltd.
  • pCAT R 3_Basic Vector
  • exogenous promoter used when the TGF / 33 gene enno or sensor region is used
  • promoters such as SV40, 13 globin, and thymidine kinase.
  • a reporter vector (promoter vector) in which such a promoter and the above-described reporter gene are already incorporated is already on the market (Promega GL3-Promoter DNA vector), and these are also preferably used.
  • the present invention provides a method for measuring chondrocyte differentiation ability of MSC using a marker comprising the above-described reporter vector.
  • the measurement method of the present invention comprises measuring and expressing the expression level of a reporter gene in a test MSC collected and cultured from a cartilage disorder patient and induced for cartilage differentiation for about 24 hours. It is determined whether or not it has the ability to differentiate into cells.
  • the measurement method of the present invention is effectively used in the quality evaluation of MSC used for transplantation.
  • the measurement method of the present invention includes the following steps (a), (b) and (c):
  • examples of the method for introducing the reporter vector of the present invention into the test MSC include known methods such as the lipofectin method, the calcium phosphate method, the DEAE dextran method, the electroporation method, and the microinjection method.
  • the reporter vector may be introduced before differentiation induction by TGF / 33 to MSCs from which patient force has been collected, or after induction of differentiation for about 24 hours. Preferably, it is introduced after differentiation induction.
  • the expression level of the reporter gene is measured after a certain time.
  • the expression level of the reporter gene is determined by measuring luciferase activity.
  • the luciferase activity The property can be measured, for example, by emitting light using a PicaGene Dual SeaPansy system (Toyo Ink) and detecting the amount of luminescence with a luminometer.
  • Measurement (determination) of chondrocyte differentiation potential of MSC is based on the expression level of reporter gene (eg, luciferase activity) in test MSC, MSC (negative control) that does not have the ability to differentiate into chondrocytes, or primary This can be done by comparing the expression level of the reporter gene in cultured chondrocytes (positive control) and determining the difference between the two.
  • reporter gene eg, luciferase activity
  • a firefly luciferase reporter gene inserted with a TGF ⁇ 3 promoter region and a Renilla luciferase reporter vector inserted with an SV40 promoter region are introduced into a test MSC. After that time, measure the reporter activity in the MSC. The ratio of firefly luciferase activity to renilla luciferase activity is the relative TGF / 33 promoter activity in the test MSC.
  • the same reporter gene as above was introduced into an AO clone that does not have the ability to differentiate into chondrocytes.
  • the reporter activity in the AO clone was measured, and the relative TGF / 3 3 promoter activity in the AO clone was measured. Measure. If the reporter activity in the test MSC is more than twice that in the AO clone, it is determined that the MSC is suitable for transplantation. Alternatively, it is determined that the MSC is suitable for transplantation when it is equal to or higher than the relative TGF / 3 3 promoter activity in primary cultured chondrocytes measured in the same manner.
  • the measurement of chondrocyte differentiation ability of MSC using the reporter vector of the present invention is compared with the conventional method (a method for confirming the differentiation ability of the cell by determining the final differentiation form). Therefore, it is possible to evaluate the quality of MSC used for transplantation early and easily with a small amount of cells. It also has the advantage that measurement can be performed simply by introducing a reporter vector that does not require preparation of RNA or protein.
  • the MSC determined to be transplantable that is, having a chondrocyte differentiation ability by the evaluation using the marker of the present invention, can be transplanted (returned) to a patient without being differentiated, Alternatively, after differentiation, the patient can be transplanted (returned).
  • the present invention provides a kit for measuring the differentiation potential of MSCs into chondrocytes, which contains a differentiation marker comprising the reporter vector of the present invention as a component.
  • the kit is effectively used for measuring the ability of MSCs to differentiate into chondrocytes.
  • the kit may be a kit consisting only of the reporter vector of the present invention, or may be a kit containing other components.
  • other components include TGF / 33, dexamethasone, selenate, ascorbic acid, insulin, transferrin, proline, BSA, sodium pyruvate, and fetal bovine serum.
  • the genes that change early in the differentiation induction of MSC may include specific genes that determine and maintain differentiation in a specific direction! Since MSC primary cultured cells are heterogeneous cell populations, immortalized MSC clones with different differentiation potentials, that is, clones with and without cartilage differentiation ability, were prepared and analyzed.
  • Human MSC (Mesenchymal stem cells) purchased from BIOWHITTAKER, compared to human papillo-mauinoles ⁇ 6, ⁇ 7 s. Cancer Surv., 12 (1992), pp. 197-217.) and the human TERT gene (AG Bodnar, M. Ouellette, M. Frolkis, SE Holt, CP. Chiu, GB Morin, CB Harley, JW Shay) , S. Lichtsteiner and WE Wright, Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells. Science 279 (1998), pp.
  • an immortalized MSC AOC clone (clone 17 and clone 51) that can induce differentiation in three directions of cartilage, bone, and fat and an AO clone (clone 9) that can differentiate only in two directions of bone and fat. And clone 14) were used.
  • Two AOC clones and two AO clones were cultured under the following three conditions (1) to (3), and total RNA was extracted after 24 hours.
  • Three-dimensional culture is a culture method that can maintain an environment closer to that of a living body than plate culture.
  • the three-dimensional culture was performed as follows. That is, 0.5 mL of 2 ⁇ 10 5 cells, with or without the addition of TGF / 3 3, cartilage differentiation induction medium [DMEM + high glucos e (4.5%), Dexamethasone (0.
  • Microarray analysis was performed using Affymetrix GeneChip Human Genome U133A. Labeled based on cDNA prepared from 10 g of total RNA extracted from the above sample c RNA was prepared and hybridized with the GeneChip array. After fluorescent staining, the stained image of the GeneChip array was read with a scanner and analyzed with Microarray Suite version 5.0 (Affymetrix). Thus, data on the gene expression level (Signal) and presence / absence (Detection) of each sample was obtained.
  • the data of 0) was used for selection of expression variable genes.
  • genes other than those described above were additionally selected for genes whose expression was increased or decreased only when AOC clones were induced to differentiate into cartilage.
  • As an increased expression gene it is expressed only in the samples of two AOC clones that induce cartilage differentiation (Detection is Present), and there is no expression in other samples of AOC clones and all samples of AO clones! /, ( Detection was Absent) Probe set was selected and 7 probe sets were obtained.
  • Detection is Absent
  • Probe set was selected and 7 probe sets were obtained.
  • a gene with decreased expression there is no expression in the cartilage differentiation-inducing samples of the two AOC clones (Detection is Absent), and it is expressed in other samples of the AOC clone and all samples of the AO clone! (Present) probe set was selected to obtain 15 probe sets.
  • the expression result of the gene extracted by the microarray was confirmed by RT-PCR.
  • two AOC clones and two AO clones were reverse-transcribed from the RNA used in the microarray, and cDNA was prepared for confirmation.
  • the COMP gene, TGF / 33 gene, DAPK3 gene, and KCNG1 gene extracted as genes with increased expression in the microarray were selected, and gene expression was confirmed by RT-PCR.
  • BAC T gene was used as a control.
  • COMP Cartilage oligomeric matrix protein (GenBank accession numbe: NM_000095, 314bp)
  • DAP death-associated protein kinase 3 (GenBank accession number: NM—001348, 448bp)
  • K ivJGr l potassium voltage-gated channel, suofamily G, member 1 (GenBank accessi on number: AK128721, 522bp)
  • TGP ⁇ 3 Transiorming growth factor beta 3 (GenBank accession number: J0324U 6 78bp)
  • BACT beta actin (GenBank accession number NM—001101, 218bp)
  • the cDNA synthesis reaction was performed according to a conventional method. Random hexamer and dNTP were added at 65 ° C for 5 minutes, cooled on ice, then reverse transcriptase (Superscript IV) was added, 25 ° C for 5 minutes, 40 ° C for 50 minutes, 70 ° C For 15 minutes.
  • the PCR reaction was performed using the cDNA synthesized above, denatured at 95 ° C for 5 minutes, then denatured at 95 ° C for 1 minute, annealing at 58 ° C for 1 minute, and extension at 72 ° C for 1 minute for 30 cycles. And finally 7 minutes at 72 ° C.
  • the gene product was visualized by agarose electrophoresis.
  • TGF / 33 gene in each clone was compared by quantitative RT-PCR.
  • Immortalized MSC clones (hBM01E6E7hT clone) with different differentiation potentials Immortalized MSC that can induce differentiation in three directions of cartilage, bone, and fat AOC clone 4 strain and AO clone that can differentiate only in two directions of bone and fat Two strains and primary culture MSC (hBM49) were used.
  • TGF ⁇ 3 (10 ng / mL) added: Three-dimensional culture was performed by the method described in Example 1, and TGF ⁇ 3 was added (induction of cartilage differentiation).
  • cDNA was prepared in the same manner as in Example 2.
  • the results were corrected by dividing the expression level of TGF / 3 3 by the expression level of BACT, and then calculated as the expression correction value of TGF / 3 3 in cartilage primary culture as 1, and the relative expression level was displayed in a graph.
  • TGF / 33 is effective as a differentiation marker expressed in the early stage of induction of differentiation from MSC to chondrocytes.
  • TGF / 3 gene expressed in the early stage of induction of chondrocyte differentiation is regulated by autocrine.
  • SB-431542 (TOCRIS) is a phosphorylation inhibitor of TGF beta receptor type l and an antagonist that blocks the action of TGF ⁇ 3.
  • RNA extraction using RNeasy clean up kit (Qiagen) 24 hours after the start of cell seeding or induction of cartilage differentiation.
  • cDNA synthesis and PCR were performed as described above.
  • TGF / 3 3 expression was clearly induced by induction of cartilage differentiation (TGF / 3 3 treatment) in both monolayer and 3D cultures.
  • This induction of expression was attenuated by a phosphorylation inhibitor of TGF beta receptor typel (SB-431542), indicating that expression of TGF / 3 was regulated by autocrine.
  • SB-431542 phosphorylation inhibitor of TGF beta receptor typel
  • TGF / 3 The ability of TGF / 3 to be expressed by induction of cartilage differentiation in MSC primary cultured cells was examined.
  • RNA extraction using RNeasy clean up kit (Qiagen) 24 hours after cell seeding or initiation of induction of cartilage differentiation by TGF / 33.
  • cDNA production quantitative PCR was carried out in the same manner as in Example 3.
  • huBM43 results for huBM43 are shown in Figs. 4 and 5, and the results for huBM49 are shown in Figs. 6 and 7, respectively.
  • MSC primary cultured cells the same induction of TGF / 33 expression as that of immortalized clones and the decrease in expression by inhibitors were observed in the early induction of differentiation into chondrocytes. Based on this, it was confirmed that the induction of TGF / 33 expression by autocrine observed in cloned MSC (AOC) was a phenomenon also observed in primary cultured cells.
  • AOC autocrine observed in cloned MSC
  • RNA was extracted with RNA using RNeasy clean up kit (Qiagen) 24 hours after the start of cell seeding or induction of cartilage differentiation.
  • cDNA preparation and quantitative PCR were performed in the same manner as in Example 3.
  • Induction of cartilage differentiation by TGF / 33 was performed for 2 weeks by a conventional method (Stem Cells 23: 958-64, 2005), and GAG (Glycosaminoglycan) was quantified.
  • GAG quantification (Stem Cells 23: 958-64, 2005) (Biyscan sulfated glycosaminoglycan assay kit (using Biocolor gel)
  • Figure 3 compares the correlation between TGF / 3 expression and GAG production during induction of cartilage differentiation in cell lines that can induce cartilage differentiation (AOC clone) and cell lines that cannot induce cartilage differentiation (AO clone). Shown in 8. The result is a correlation between the induction of TGF / 3 expression and the conventional method for evaluating cartilage differentiation (GAG quantitative value), and the expression induction value of TGF / 3 3 at the early stage of MSC culture should be used as an index of cartilage differentiation. The validity of was proved.
  • Example 7 Example 7
  • RNA was extracted with RNA using RNeasy clean up kit (Qiagen) 24 hours after the start of cell seeding or induction of cartilage differentiation.
  • cDNA was prepared in the same manner as in Example 3. Quantitative PCR was performed using Taqman Mastermix (Applied Biosystems) with 7300 real time PCR system (Applied Biosystems). PCR primers and Taqman probe were used as follows, and “95 ° C for 15 seconds, 60 ° C for 1 minute” was amplified for 40 cycles.
  • TGF / 3 3 Forward (5'- AAACATTCACGAGGTGATGGAA-3,) (SEQ ID NO: 29)
  • TGF / 3 3 Reverse (5'-GATCTCCACGGCCATGGT-3,) (SEQ ID NO: 30)
  • TGF / 3 3 Taqman (5'-TCAAATTCAAAGGCGTGGACAATGAGGA-3,) (SEQ ID NO: 3 1)
  • the results were corrected by dividing the TGF / 3 3 expression level by the 18S expression level (measured in the same manner as TGF / 3 3 using Pre-Developed Taqman Assay Reagents; Human 18S rRNA (Applied Biosystems)).
  • the corrected expression value of TGF / 33 in cartilage primary culture was calculated as 1, and the relative expression level was displayed in a graph.
  • the amount of intracellular DNA was determined by staining the extracted cell culture with 0.2% Triton X-100 with Picogreen staining reagent (Invitrogen), and using the PicoGreen dsDNA Quantitation Kit (Invitro gen)) and fluorescence ELI using SpectraMax plate reader (Molecular Devices)
  • Figure 9 shows the results of comparing the correlation between TGF ⁇ 3 expression and GAG production during primary cartilage MSC induction.
  • the correlation between GAG / DNA and TGF / 33 expression induction was 0.715, and when the Pearson correlation coefficient was tested, the P value was 0.046, which was judged to be significant.
  • the expression induction value of TGF / 3 3 at the initial stage of MSC culture can be used as an index of cartilage differentiation. The validity was confirmed.
  • Three-dimensional culture 2 ⁇ 10 5 cells were suspended in DMEM / F12, centrifuged at 120 Orpm for 5 minutes in a 15 ml centrifuge tube, and allowed to stand.
  • TGF ⁇ 3 Transforming growth factor beta 3 (GenBank accession number: NM—009368, 504bp)
  • beta actin (GenBank accession number: X03672, 218bp)
  • MMA2 was originally able to express TGF3 gene without adding TGF / 33, and it expressed expression of articular cartilage-specific genes such as Col2al, Col9al, Agc, etc. The expression of these genes was enhanced. Especially for the TGF / 3 3 gene Increased expression was remarkable. When SB-431642 was added here, the expression of these genes decreased. This was the same expression variation as the gene (PAI-1) specifically regulated by TGF beta signal.
  • TGF / 3/3 is involved in the regulation of TGF / 3/3 expression
  • a luciferase assay using the promoter region of the human TGF / 33 gene was performed.
  • PCR primers corresponding to each part were prepared. Using human genomic DNA from donor peripheral blood as a template, gene fragments amplified using each PCR primer set were cloned into the multiple cloning site of PGV-B vector (Toyo Ink). The gene sequence and insertion direction were confirmed by sequencing.
  • the constructed vectors are as follows.
  • pRL-TK manufactured by Promega was used for correction of gene transfer efficiency.
  • the cells include (1) human immortalized mesenchymal stem cell line (AOC clone) that can differentiate into bone, cartilage, and fat. (2) human immortalized mesenchymal stem cell line (AO) that can differentiate into bone and fat. Clones) and (3) human mesenchymal stem cell primary culture (MSC). Each cell was seeded on a culture plate at a density of 5000 ce lis m 2 in a 6-well plate. 24 hours later, the vector prepared above (1 ⁇ g / well) was transfected with Lipofection LTX (manufactured by Invitrogen). At that time, recombinant TGF / 33 (10 ng / ml) and SB431542 (luM) were also added as necessary.
  • AOC clone human immortalized mesenchymal stem cell line
  • AO human immortalized mesenchymal stem cell line
  • MSC human mesenchymal stem cell primary culture
  • Noreciferase activity was performed 24 hours after gene transfer using the Luminometer (STRATEC Biomedical Systems) with PicaGene Dual SeaPansy system (Toyo Ink). The results were expressed as relative values with the luciferase activity in the empty vector (PGV-B) as 1.
  • the activity increased with the addition of TGF / 33, and the force decreased with the addition of the inhibitor SB431542. It was clarified that it is essential for the increase in transcriptional activity by these two smad-binding domain strengths STGF / 3.
  • the transcriptional activity of the TGF / 3 3 gene depends on the TGF / 3 3 signal itself, and (2) the TGF ⁇ 3 expression regulatory region including the above two smad binding regions It was revealed that the transcriptional activity (expression level) of TGF / 33 can be measured by using the reporter vector.
  • MSCs are collected from cartilage-deficient patients by conventional methods and plated on plastic culture dishes. Isolate 2 x 10 5 cells to be used for transplantation, and use them to determine the ability to induce cartilage differentiation.
  • TGF / 33 10 ng / ml
  • RNA is extracted, and the expression level of the TGF / 33 gene is analyzed by the quantitative RT-PCR method similar to the above example.
  • the ratio of the expression level of the TGF ⁇ 3 gene to the expression level of the actin gene (correction gene) is the corrected value in the primary cultured chondrocytes. Cells with a value of 0.1 or more when 1 are determined as cells having cartilage differentiation ability.
  • the above cells are further cultured for about 3 weeks in plate culture in TGF / 33 (10 ng / ml) -added cartilage differentiation induction medium, and if necessary, the same determination as above about 3 days before transplantation And about 10 million positive cells are transplanted into a cartilage-deficient patient.
  • MSCs are collected from cartilage-deficient patients by conventional methods and plated on plastic culture dishes. Isolate 40,000 cells to be used for transplantation and use them to determine the ability to induce cartilage differentiation.
  • Dissociated cells are seeded in a 6-well plate (5000 cells / m 2 ), and a cartilage differentiation induction medium supplemented with TGF / 3 (10 ng / ml) is added.
  • a reporter vector comprising the expression regulatory region (-843 to +118) of TGF / 33 prepared in Example 9 and a luciferase gene, and SV40 promoter Introduce a renilla luciferase reporter vector containing the template region, and measure the reporter activity in the MSC 24 hours later.
  • the ratio of firefly luciferase activity to renilla luciferase activity is the relative TGF / 3 3 promoter activity in the test MSC.
  • the same reporter gene as described above was introduced into an AO clone that does not have the ability to differentiate into chondrocytes. After 24 hours, the reporter activity in the AO clone was measured, and the relative TGF / 3 3 promoter in the AO clone was measured. Measure activity. Reporter activity in the test MSC If it is more than twice that in the AO clone, it is determined that the MSC is suitable for transplantation. Alternatively, a cell having a cartilage differentiation ability is determined when it is equal to or higher than the relative TGF / 33 promoter activity in primary cultured chondrocytes measured in the same manner.
  • the cells were further cultured for about 3 weeks in a plate culture in a TGF ⁇ 3 (10 ng / ml) -added cartilage differentiation-inducing medium, and if necessary, about 3 days before transplantation. The same determination is made, and about 10 million positive cells are transplanted into a cartilage-deficient patient.
  • TGF / 3 which is a differentiation marker of the present invention, is a gene that is specifically and early expressed in cells that induce differentiation into cartilage, it can be used for cell transplantation treatment by examining the expression level of TGF / 3. Possible MSCs can be determined early. Furthermore, by examining the expression level of TGF / 33 of the present invention, the quality of MSC cells immediately before transplantation can be evaluated.
  • Figure 1 shows the expression of each gene (COMP, TGF / 3/3, DAP3, KCNG) in AOC clones that can induce cartilage differentiation and AO clones that cannot induce cartilage differentiation. It is a figure which shows the result analyzed by PCR. 3D culture (in the figure, 3D culture: +) or monolayer culture (in the figure, 3D culture :—), with or without TGF / 3 3 addition (in the figure, TGFB3: +) or without (in the figure, TGFB3: Fi) under the condition of 1)
  • FIG. 2 shows the results of quantitative RT-PCR analysis of TGF / 33 expression in AOC clones capable of inducing cartilage differentiation and AO clones incapable of inducing cartilage differentiation.
  • Relative values with the value of TGF ⁇ 3 in primary cultured chondrocytes as 1.
  • Monolayer culture (left in the figure) No rod, no differentiation induction) or three-dimensional culture (right bar in the figure, when cartilage differentiation was induced).
  • hBM49 is a primary cultured MSC as a comparative control.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of RT-PCR analysis of the expression of TGF / 3 in AOC clones that can induce cartilage differentiation and AO clones that cannot induce cartilage differentiation.
  • Monolayer culture in the figure, 3D culture:-
  • three-dimensional culture in the figure, 3D culture: +
  • TGF / 3 3 in the figure, TGFbeta3: +
  • TGF beta receptor type (I) phosphorylation inhibitor added (in the figure, SB 4 315 42 : +) or without (in the figure, SB 4 315 42 :—) It was.
  • FIG. 4 shows the results of RT-PCR analysis of TGF / 33 expression in MSC primary cultured cells (huBM43).
  • Monolayer culture in the figure, monolayer
  • 3D culture in the figure, 3D
  • TGF / 3 3 in the figure, + TGFb3
  • TGF beta rece ptor Cultivation was performed with or without the addition of a typel phosphorylation inhibitor (SB 4 315 42 1 M in the figure) or DMSO in the figure.
  • FIG. 5 shows the results of quantitative RT-PCR analysis of TGF / 3 expression in MSC primary cultured cells (huBM43).
  • Monolayer culture monolayer in the figure or three-dimensional culture (3D in the figure), with or without TGF / 3 3 (in the figure, + TGFb3) or without (not shown in the figure), TGF b eta receptor typel Culturing was performed with or without the addition of a phosphorylation inhibitor (SB431542 1 M in the figure) or DMSO in the figure.
  • SB431542 1 M in the figure DMSO in the figure.
  • KS730C is a chondrocyte used as a comparative control.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of RT-PCR analysis of TGF / 33 expression in MSC primary cultured cells (huBM49).
  • Monolayer culture monolayer in the figure
  • three-dimensional culture (3D in the figure)
  • TGF / 3 3 in the figure, + TGFb3
  • TGF beta rec eptor Cultivation was performed with or without the addition of a typel phosphorylation inhibitor (SB431542 1 M in the figure) or DMSO in the figure.
  • FIG. 7 shows the results of quantitative RT-PCR analysis of TGF / 33 expression in MSC primary cultured cells (huBM49).
  • Monolayer culture monolayer in the figure or three-dimensional culture (3D in the figure), with or without TGF / 3 3 (in the figure, + TGFb3) or without (not shown in the figure), TGF b eta receptor typel With or without phosphorylation inhibitor (SB431542 1 M in the figure) or without ( Figure Medium, DMSO).
  • KS730C is a chondrocyte used as a comparative control.
  • Fig. 8 is a graph comparing the correlation between the expression of TGF ⁇ 3 and the amount of GAG produced during induction of cartilage differentiation in cell lines capable of inducing cartilage differentiation and cell lines incapable of inducing cartilage differentiation. is there.
  • the expression value of TGF ⁇ 3 is expressed as a relative value with the value of TGF ⁇ 3 in primary cultured chondrocytes being 1, and the amount of GAG production is a relative value corrected by the amount of DNA.
  • FIG. 9 is a graph comparing the correlation between the expression of TGF / 3 3 and the amount of GAG produced during induction of cartilage differentiation in donor-derived MSC primary cultured cells.
  • the expression value of TGF / 33 is expressed as a relative value with the value of TGF / 33 in cartilage primary culture being 1, and the amount of GAG production is a relative value corrected by the amount of DNA.
  • FIG. 10 shows the results of RT-PCR analysis of the expression of each gene (Tgft3, Col2al, Col9al, Agc, PAI-l) in MMA2, an articular chondrocyte cell line derived from p53KO mice.
  • TGF beta3 in the figure
  • TGF beta receptor typel phosphorylation inhibitor added SB431542 1 M in the figure, or DMSO in the figure
  • FIG. 11 is a graph showing the results of luciferase assembly using a reporter vector containing an expression regulatory region of TGF / 33 and a luciferase gene. In the figure (a),
  • SBE indicates the binding site of smad, a transcription factor responsible for TGF ⁇ signaling.
  • + TGFb3 indicates the case where TGF / 3 3 is added, and
  • + SB431542 indicates the case where TGF / 3 3 and SB431542 are added.
  • the results of luciferase activity were expressed as relative values when the luciferase activity in an empty vector (PGV-B vector) that does not contain the TGF / 3 3 expression regulatory region was 1.

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Abstract

　間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化マーカーを提供すること。 　TGFβ3(transforming growth factor-beta 3)遺伝子の塩基配列における、連続する少なくとも18塩基からなるポリヌクレオチド及び／または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有する、間葉系幹細胞の軟骨細胞分化マーカー、前記マーカーを利用した間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化能測定方法等。

Description

明 細 書
間葉系幹細胞の軟骨細胞分化マーカー
技術分野
[0001] 本発明は、間葉系幹細胞の軟骨細胞分化マーカーに関する。さらに詳しくは、 TGF
/3 3を利用したヒト間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化マーカー、および当該マーカ 一を利用した軟骨分化能判定方法などに関する。
背景技術
[0002] 軟骨は主として骨組織の周辺である関節部分に存在し、その比較的柔軟な組織構 造により骨組織の摩擦を和らげる働きをしている力 その部分が損傷 ·磨耗されること により、関節部分の痛みや変性が生じる。高齢化に伴い、軟骨損傷や変性を特徴と する疾患、例えば変形性関節症等が近年増加して!/、る。
[0003] 一般に、軟骨組織は血管侵入が無い組織であり、一度変性 ·磨耗が生じると修復 するのは極めて困難であると言われている（非特許文献 1を参照)。また、根本的な病 態治療が行われてレ、てレ、なレ、疾患でもある。例えば、変形性関節症に用いられて!/、 る薬剤は、鎮痛剤 ·潤滑剤等の対症療法がほとんどであり、変性や磨耗に対する根 本的治療は実施されて!/、なレ、。
そのような観点から、自家培養軟骨を移植する試みが行われており、米国では、す でに移植療法として実用化されている。し力、しながら、採取可能な自家軟骨量が限ら れている、定着率が必ずしも高くない、といった問題点も指摘されている。
[0004] 上記のような問題点を解決するため、比較的多くの量を採取可能な、未分化な細 胞を患部に移植し、患部周辺の健常な組織という「場」の力を借りて、患部に埋めた 未分化な細胞を正常に分化させる試みがなされている（非特許文献 1を参照）。これ には、主として骨髄に存在する間葉系幹細胞（Mesenchymal stem cells: MSC)が用 いられているが、それは、この MSCが適切な培養条件の下では、脂肪細胞'骨芽細 胞 ·軟骨細胞それぞれに分化することが明らかにされているからである（非特許文献 2を参照)。
[0005] MSCを高い頻度で軟骨に分化させる方法については、これまでに検討が加えられ ており、 TGF /3 3や BMPの存在下で、それらが達成されることが報告されている（特許 文献 1を参照）。また、 FGF存在下では比較的大量の MSCが得られることも示されて いる（特許文献 2を参照）。一方、 MSCから分化させた軟骨細胞についての「品質」に 関する考察もなされており、増殖能や軟骨特異的遺伝子発現をモニターすることで、 品質チェックが可能であることが示唆されてレ、る（特許文献 3を参照）。
しかしながらこれまでの検討では、 MSCから分化誘導した「移植用軟骨」の品質検 定につ!/、ては述べられて!/、たものの、「細胞移植治療の実用に耐え得る MSCを早期 に選抜する」とレ、う観点からの検討は何もなされて!/、なかった。
ちなみに既存の判定方法では、 in vitroで特殊な培養条件下に MSCから軟骨細胞 への分化誘導を行い、最終分化形態を判定することで、その細胞の性能（分化能)を 確認しているが、判定までに約 3週の期間を要し、かつ多くの細胞を用いる必要性が ある。そのため早期にかつ簡便に、細胞移植治療に用いる MSCの品質を評価する方 法が望まれて!/、る状況にある。
[0006] また、軟骨分化時のマーカー遺伝子を探索するという目的で、 MSCや軟骨様細胞 を軟骨分化条件下で培養した際に発現変動する遺伝子を同定する試みがなされて おり、分化時の軟骨の性質をさらに明らかにする遺伝子群の同定も行われている（非 特許文献 3および 4を参照）。し力、しながら、 3次元培養や種々の成長因子の添加な どの軟骨分化条件の煩雑さにも起因し、上述のような「実用に耐えうる MSCを早期に 選抜する」という観点からは、これまで検討が行われてこな力、つた。
[0007] 特許文献 l : WO98/032333号公報
特許文献 2：特開 2006-59号公報
特許文献 3： WO02/095399号公報
非特許文献 1：最新医学 54(12)103-109、 1999
非特許文献 2 : Science 276:71-74， 1997
非特許文献 3 : Proc.Natl Acad.Sci., USA 99(7) 4397-4402,2002
非特許文献 4 : Cell Tissue Res 320: 269-276,2005
発明の開示
発明が解決しょうとする課題 [0008] 本発明は、軟骨移植に用いられる MSCの品質を早期に判定するためのマーカー、 および当該マーカーを用いた MSCの軟骨細胞分化能の判定方法などを提供するこ とを課題とする。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者らは、 MSCの品質を早期に判定できるマーカーを探索すベぐ MSCが軟 骨に分化する際に発現変動する遺伝子群の選抜を行った。その際、 3次元培養や種 々の成長因子の添加等、培養方法の煩雑さを克服するため、下記の工夫した手法を 導入した。（1)軟骨に分化する MSCクローン、軟骨に分化しない MSCクローンを複数 樹立し、 3次元培養や種々成長因子の添加等の「分化」以外の要因を可能な限り低 減した。（2)Microarrayによる網羅的な遺伝子発現解析を、軟骨分化誘導 24時間とい う早期に、複数の独立したクローンについて実施し、共通に発現変動する遺伝子群 を抽出した。また Microarrayとは異なる手法（定量的 RT-PCR法）により、選抜した遺 伝子群の有効性を確認した。（3)選抜された遺伝子群の有効性を、独立したドナーか ら供給された複数の初代培養 MSCにつ!/、て検討実施し、有効性を確認した。
その結果、軟骨分化能を有さなレ、MSCクローンを軟骨分化誘導しても発現しな!/、が 、軟骨分化能を有する MSCクローンを軟骨分化誘導した際に特異的に発現する遺伝 子として、 TGF /3 3遺伝子が選抜された。 TGF /3 3遺伝子は、クローン化 MSCのみなら ず、初代培養 MSCにおいても、軟骨分化誘導 24時間という初期に発現誘導すること が明ら力、となった。このことから、 TGF /3 3の発現誘導を MSCから軟骨細胞への分化 の指標（MSCの軟骨細胞への分化能の指標）と出来ることが明らかとなった。
さらに TGF /3 3の発現誘導と従来の軟骨分化評価結果が相関していたことから、培 養初期での TGF /3 3の発現誘導値を指標として、移植に用いる MSCの品質評価を行 うことの妥当性が証明された。
本発明は、以上のような知見に基づき完成するに至ったものである。
[0010] すなわち本発明は、
(1) TGF β 3遺伝子の塩基配列における、連続する少なくとも 18塩基からなるポリヌク レオチド及び/または該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有する、間 葉系幹細胞の軟骨細胞分化マーカー、 (2) TGF β 3遺伝子が配列番号： 1に記載の塩基配列からなる遺伝子である、前記 (1 )記載の分化マーカー、
(3) プライマーまたはプローブとして使用される、前記 (1)または (2)記載の分化マーカ
(4) 下記の工程 (a)、（b)及び (c)を含む、間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化能の測 定方法：
(a)被験用の間葉系幹細胞から調製された RNAまたはそれから転写された相補的ポ リヌクレオチドと、前記 (1)〜(3)いずれか記載の分化マーカーとを結合させる工程、
(b)各分化マーカーに結合した、間葉系幹細胞由来の RNAまたは該 RNAから転写さ れた相補的ポリヌクレオチドの量を測定する工程、
(c)上記 (b)の測定結果に基づいて、間葉系幹細胞が軟骨細胞への分化能を有する か否かを判断する工程、
(5) RT-PCR法により行われる、前記 (4)記載の測定方法、
(6) 移植に用いる間葉系幹細胞の品質評価のために行われる、前記 (4)または (5)記 載の測定方法、
(7) 前記 (1)〜(3)いずれか記載の分化マーカーを成分として含有する、間葉系幹細 胞の軟骨細胞への分化能測定用キット、
(8) TGF /3 3に特異的に結合する抗体を含有する、間葉系幹細胞の軟骨細胞分化 マーカー、
(9) TGF β 3が配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である、前記 (8) 記載の分化マーカー、
(10) 下記の工程 (a)、（b)及び (c)を含む、間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化能の測 定方法：
(a)被験用の間葉系幹細胞由来のタンパク質と前記 (8)または (9)記載の分化マーカ 一とを結合させる工程、
(b)各分化マーカーに結合した、間葉系幹細胞由来のタンパク質の量を測定するェ 程、
(c)上記 (b)の測定結果に基づいて、間葉系幹細胞が軟骨細胞への分化能を有する か否かを判断する工程、
(11) ELISA法により行われる、前記 (10)記載の測定方法、
(12) 移植に用いる間葉系幹細胞の品質評価のために行われる、前記 (10)または (11 )記載の測定方法、
(13) 前記 (8)または (9)記載の分化マーカーを成分として含有する、間葉系幹細胞の 軟骨細胞への分化能測定用キット、
(14) TGF /3 3の発現調節領域とレポーター遺伝子とを含有するベクターよりなる、間 葉系幹細胞の軟骨細胞分化マーカー、
(15) TGF 13 3の発現調節領域が配列番号： 32に記載の塩基配列を含有する、前記 ( 14)記載の分化マーカー、
(16) レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である、前記 (14)または (15)記載の 分化マーカー、
(17) 下記の工程 (a)、（b)及び (c)を含む、間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化能の測 定方法：
(a)被験用の間葉系幹細胞に前記 (14)〜(16)いずれか記載の分化マーカーを導入 する工程、
(b)各分化マーカーが含有するレポーター遺伝子の発現量を測定する工程、
(c)上記 (b)の測定結果に基づいて、間葉系幹細胞が軟骨細胞への分化能を有する か否かを判断する工程、
(18) 移植に用いる間葉系幹細胞の品質評価のために行われる、前記 (17)記載の測 定方法、
(19) 前記 (14)〜(16)いずれか記載の分化マーカーを成分として含有する、間葉系幹 細胞の軟骨細胞への分化能測定用キット、
(20) 間葉系幹細胞から軟骨細胞への分化能を測定するための、 TGF β 3遺伝子の 塩基配列における、連続する少なくとも 18塩基を含有するポリヌクレオチド及び/ま たは該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの使用、
(21) TGF β 3遺伝子が配列番号： 1に記載の塩基配列からなる遺伝子である、前記（ 20)記載の使用、 (22) 間葉系幹細胞から軟骨細胞への分化能を測定するための、 TGF β 3に特異的 に結合する抗体の使用、
(23) TGF β 3が配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である、前記 (2 2)記載の使用、
(24) 間葉系幹細胞から軟骨細胞への分化能を測定するための、 TGF β 3の発現調 節領域とレポーター遺伝子とを含有するベクターの使用、
(25) TGF 13 3の発現調節領域が配列番号： 32に記載の塩基配列を含有する、前記 ( 24)記載の使用、
(26) レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である、前記 (24)または (25)記載の 使用、ならびに
(27) 間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化能を測定するための、前記 (7)、（13)または（ 19)記載のキットの使用、に関する。
発明の効果
[0011] 本発明により、 MSCの軟骨細胞への分化マーカーが提供される。本発明の分化マ 一力一である TGF /3 3は、軟骨へ分化誘導する MSCが特異的かつ早期に発現する 遺伝子であるため、 TGF /3 3の発現量を調べることにより、細胞移植治療に用いるの に適した MSCを早期に判定することができる。さらに本発明の TGF /3 3の発現を指標 として、移植直前の MSCの品質評価も行うことができる。
TGF /3 3の発現誘導は、 MSCから軟骨細胞への分化に特有の現象であるため、当 該 TGF /3の発現量を調べることは、 MSCから軟骨細胞への分化メカニズムの研究に おいても有用である。
発明を実施するための最良の形態
[0012] 以下、本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号 による表示は、 IUPAC- IUBの規定〔IUPAC- IUB Communication on Biological Nome nclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細 書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における慣 用記号に従う。
[0013] 本明細書において「遺伝子」または「DNA」とは、 2本鎖 DNAのみならず、それを構 成するセンス鎖 (正鎖)およびアンチセンス鎖 (相補鎖)といった各 1本鎖 DNAを包含す る趣旨で用いられる。すなわち本明細書において遺伝子 (DNA)とは、特に言及しな い限り、 2本鎖 DNA、 cDNAを含む 1本鎖 DNA (正鎖）、並びに該正鎖と相補的な配列 を有する 1本鎖 DNA (相補鎖）、およびこれらの断片のいずれもが含まれる。また当該 「遺伝子」または「DNA」には、特定の塩基配列（配列番号： 1)で示される「遺伝子」ま たは「DNA」だけでなぐこれによりコードされるタンパク質 (配列番号: 2)と生物学的機 能が同等であるタンパク質 (例えば同族体 (ホモログゃスプライスバリアントなど）、変 異体及び誘導体）をコードする「遺伝子」または「DNA」が包含される。かかる同族体、 変異体または誘導体をコードする「遺伝子」または「DNA」としては、具体的には、後 述の (1-1)項に記載のストリンジェントな条件下で、配列番号： 1で示される塩基配列の 相補配列とハイブリダィズする塩基配列を有する「遺伝子」または「DNA」を挙げること ができる。
[0014] 従って本明細書において「TGF /3 3(transforming growth factor-beta 3)遺伝子」ま たは「TGF /3 3の DNA」といった用語を用いる場合、配列番号で特に指定しない限り、 特定塩基配列（配列番号: 1)で示されるヒト TGF /3 3遺伝子（DNA)や、その同族体、 変異体及び誘導体などをコードする遺伝子（DNA)を包含する趣旨で用いられる。具 体的には、配列番号: 1に記載のヒト TGF /3 3遺伝子（GenBank Accession No. J03241 )や、マウス TGF β 3遺伝子 (GenBank Accession No. NM_009368)、ラット TGF β 3遺 伝子 (GenBank Accession No. NM_013174)などが包含される。また、これらヒト TGF /3 3遺伝子、マウス TGF β 3遺伝子、ラット TGF β 3遺伝子の相補配歹 I]とストリンジェントな 条件下でハイブリダィズする塩基配列を含有する遺伝子や、前記ヒト、マウス、ラット Τ GF /3 3遺伝子と 70%、好ましくは 80%、より好ましくは 95%、さらにより好ましくは 97% 以上の配列同一性を有する塩基配列を有する遺伝子なども包含される。
[0015] 本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、 RNAおよび DNAのいずれをも包含する 趣旨で用いられる。なお、上記 DNAには、 cDNA、及び合成 DNAのいずれもが含まれ る。また上記 RNAには、 total RNA, mRNA、 rRNA、及び合成の RNAのいずれもが含 よれ 。
[0016] 本明細書において「タンパク質」または「(ポリ)ペプチド」には、特定のアミノ酸配列（ 配列番号： 2)で示される「タンパク質」または「(ポリ)ペプチド」だけでなく、これらと生 物学的機能が同等であることを限度として、その同族体 (ホモログゃスプライスバリア ント）、変異体、成熟体などが包含される。ここで変異体には、天然に存在するアレル 変異体、天然に存在しない変異体、及び人為的に欠失、置換、付加および揷入され ることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、上記変異 体としては、配列番号: 2で示されるアミノ酸配列と、 70%、好ましくは 80%、より好まし くは 95%、さらにより好ましくは 97%以上の配列同一性を有するタンパク質を挙げるこ と力 Sできる。
[0017] 従って本明細書において「TGF /3 3タンパク質」または単に「TGF /3 3」といった用語 を用いる場合、配列番号で特に指定しない限り、特定アミノ酸配歹 IJ (配列番号: 2)で 示されるヒト TGF /3 3やその同族体、変異体、成熟体などを包含する趣旨で用いられ る。具体的には、配列番号 :2に記載のアミノ酸配列を有するヒト TGF /3 3 (GenBank Ac cession Νο·Ρ10600)や、マウス TGF /3 3 (GenBank Accession No. NP_033394)、ラット TGF β 3 (GenBank Accession Νο·ΝΡ_037306)などが包含される。また、これらヒト TGF β 3、マウス TGF /3 3、ラット TGF /3 3のアミノ酸配列と 70%、好ましくは 80%、より好まし くは 95%、さらにより好ましくは 97%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する タンパク質なども包含される。
[0018] 本明細書でいう「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体 、一本鎖抗体、または Fabフラグメントや Fab発現ライブラリーによって生成されるフラ グメントなどのように抗原結合性を有する上記抗体の一部が包含される。
[0019] 本明細書において「間葉系幹細胞の軟骨細胞分化マーカー」とは、間葉系幹細胞 ( MSC)が軟骨細胞へ分化する際に、特異的に発現上昇する因子を検出するためのマ 一力一を意味する。すなわち、 MSCは適切な培養条件の下では、脂肪細胞'骨芽細 胞'軟骨細胞の 3方向に分化することが知られているが、脂肪細胞、骨芽細胞へ分化 する際には発現しないが、軟骨細胞へ分化する際には発現する因子を検出するた めのマーカーを意味する。本発明は、 MSCから軟骨細胞への分化において、 TGF /3 3が特異的に発現上昇することを明らかにしたものである。従って前記マーカーとして 具体的には、 TGF /3 3遺伝子を特異的に認識して結合することのできるポリヌクレオ チドや、 TGF /3 3タンパク質を特異的に認識して結合することのできる抗体が包含さ れる。さらに TGF /3 3遺伝子の発現上昇の検出を代用し得るレポーターベクター (TG F /3 3の発現調節領域とレポーター遺伝子とを含有するベクター）も、当該マーカーと して用いること力 Sでさる。
前記ポリヌクレオチドは、培養 MSCなどで発現した TGF /3 3遺伝子を増幅するため のプライマー、または TGF /3 3遺伝子を検出するためのプローブとして有効に利用す ること力 Sできる。また前記抗体は、培養 MSCなどで発現した TGF /3 3タンパク質を検出 するためのプローブとして有効に利用することができる。
[0020] 本明細において「被験用 MSC」とは、軟骨障害 (軟骨欠損等)の患者より常法により 採取して培養した後、 TGF /3 3により 24時間程度軟骨分化誘導を行った MSCを指す 。誘導は、細胞に TGF /3 3含有軟骨分化誘導培地 (後述の実施例 1を参照)を加え、 平板 (単層)培養若しくは三次元培養を 24時間程度行うことにより実施される。より望ま しくは三次元培養を行う。
[0021] 以下 TGF /3 3遺伝子（以下本発明の遺伝子と称する場合がある）、 TGF /3 3タンパク
(以下本発明のタンパク質と称する場合がある）、およびそれらの派生物について、 具体的な用途を説明する (後述の (1)〜(3))。なおレポーターベクターの利用につ!/、て は後述する (後述の (4))。
[0022] (1)間葉系幹細胞の軟骨細胞分化マーカー
(1-1)ポリヌクレオチド
本発明における TGF /3 3遺伝子は公知の遺伝子である。例えばヒト TGF /3 3遺伝子 としては、配列番号: 1に示すポリヌクレオチドが知られている（GenBank Accession No .J03241)。またマウス TGF /3 3遺伝子としては GenBank Accession No. NM_009368が 、ラット TGF /3 3遺伝子としては GenBank Accession No. NM_013174が、それぞれ知ら れている。
[0023] 本発明の TGF β 3遺伝子は、配列番号： 1に記載の塩基配列、または前記各ァクセ ッシヨン番号に開示された塩基配列の適当な部分をハイブリダィゼーシヨンのプロ一 ブまたは PCRのプライマーに用いて、例えばヒト骨髄細胞由来の cDNAライブラリー（T aKaRa社製）をスクリーニングすることなどによりクローニングすることができる。該クロ 一ユングは、例えば Molecular Cloning 2nd Edt. Cold Spring Harbor Laboratory Pres s (1989)等の基本書に従い、当業者ならば容易に行うことができる。
[0024] 本発明は前記のように、 TGF /3 3の発現を MSCから軟骨細胞への分化の指標とでき ることを明ら力、にした。この新たな知見に基き、 TGF /3 3の遺伝子発現 (発現量)を測 定することによって、 MSCが軟骨細胞への分化能を有することを容易に判定でき、移 植用軟骨細胞の品質評価を正確に行うことができる。
[0025] 従って上記ポリヌクレオチドは、被験用 MSCにおける TGF β 3の発現量を測定する ことによって、該被験用の MSCが軟骨細胞への分化能を有しているか否かを判定す ることのできるツール（マーカー）として有用である。
[0026] 本発明の軟骨細胞分化マーカーは、 TGF /3 3遺伝子の塩基配列において、連続す る少なくとも 18塩基からなるポリヌクレオチド及び/または該ポリヌクレオチドに相補的 なポリヌクレオチドを含有することを特徴とするものである。
[0027] ここで「相補的なポリヌクレオチド (相補鎖、逆鎖）」とは、 TGF β 3遺伝子の塩基配列 力、らなるポリヌクレオチドの全長配歹 IJ、または該塩基配列において少なくとも連続した 18塩基長の塩基配列を有するその部分配列（ここでは便宜上、これらを「正鎖」とも!/、 う）に対して、 A:Tおよび G:Cといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関 係にあるポリヌクレオチドを意味するものである。ただし、かかる相補鎖は、対象とする 正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリ ンジェントな条件でハイブリダィズすることができる程度の相補関係を有するものであ つてもよい。なお、ここでストリンジェントな条件は、 Berger and immel (1987， Guide t o Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA)に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解 温度 (Tm)に基づ!/、て決定することができる。例えばハイブリダィズ後の洗浄条件とし て、通常「1 X SSC、 0.1%SDS、 37°C」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかか る条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダィズ状態を維持するものであることが 好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダィズ条件として「0.5 X SSC、 0.1% SDS、 42°C」程度、さらに厳しいハイブリダィズ条件として「0.1 X SSC、 0.1%SDS、 65°C」 程度の洗浄条件を挙げることができる。具体的には、このような相補鎖として、対象の 正鎖の塩基配列と完全に相補的な関係にある塩基配列からなる鎖、並びに該鎖と少 なくとも 90%、好ましくは 95%の相同性を有する塩基配列からなる鎖を例示することが できる。
[0028] ここで、正鎖側のポリヌクレオチドには、 TGF β 3の塩基酉己列、またはその部分配列 を有するものだけでなぐ上記相補鎖の塩基配列に対してさらに相補的な関係にある 塩基配列からなる鎖を含めることができる。
[0029] さらに上記正鎖のポリヌクレオチド及び相補鎖（逆鎖）のポリヌクレオチドは、各々一 本鎖の形態でマーカーとして使用されても、また二本鎖の形態でマーカーとして使用 されてもよい。
[0030] 本発明の軟骨細胞分化マーカーは、具体的には、 TGF /3 3遺伝子の塩基配列（全 長配列）力もなるポリヌクレオチドであってもよレ、し、その相補配列からなるポリヌクレ ォチドであってもよい。また TGF /3 3遺伝子もしくは該遺伝子に由来するポリヌクレオ チドを選択的に（特異的に)認識するものであれば、上記全長配歹ほたはその相補 配列の部分配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。この場合、部分配列として は、上記全長配歹ほたはその相補配列の塩基配列から任意に選択される少なくとも 1 8個の連続した塩基長を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
ここで「少なくとも 18塩基」との限定は、 TGF /3 3遺伝子の連続する少なくとも 18塩基 部分があれば、 TGF /3 3遺伝子を特定 (検出)するのに十分であるという根拠に基くも のである。
[0031] ここで「選択的に（特異的に)認識する」とは、例えばノーザンプロット法においては 、 TGF /3 3遺伝子またはこれらに由来するポリヌクレオチドが特異的に検出できること 、また RT-PCR法においては、 TGF /3 3遺伝子またはこれらに由来するポリヌクレオチ ドが特異的に生成されることを意味する力 それに限定されることなぐ当業者が上記 検出物または生成物が TGF /3 3遺伝子に由来するものであると判断できるものであれ ばよい。
[0032] 本発明のマーカーは、例えば配列番号： 1に記載の TGF /3 3遺伝子の塩基配列をも とに、 列 ュ primer 3 ( HYPERLINK http://www.genome.wi.mit.eau/cgi-bin/primer/ primer3.cgi)ある!/、はベクター NTI (Infomax社製）を利用して設計すること力 Sできる。具 体的には TGF /3 3の塩基配列を primer 3またはベクター NTIのソフトウェアにかけて 得られる、プライマーまたはプローブの候補配歹 IJ、若しくは少なくとも該配列を一部に 含むポリヌクレオチドをプライマーまたはプローブとして使用することができる。プライ マーとしては、例えば配列番号： 9、 10、 13、 14、 17、 18、 29、 30または 31に示される塩 基配列を含有するポリヌクレオチドが例示される。
[0033] 本発明のマーカーは、上述するように連続する少なくとも 18塩基の長さを有するも のであればよいが、具体的にはマーカーの用途に応じて、長さを適宜選択し設定す ること力 Sでさる。
[0034] (1-2)プローブまたはプライマーとしてのポリヌクレオチド
MSCから軟骨細胞への分化能の測定 (判定)は、被験用の間葉系幹細胞 (MSC)に おける、 TGF /3 3遺伝子の発現の有無または発現レベル (発現量)を評価することに よって行われる。この場合、本発明のマーカーは、 TGF /3 3遺伝子の発現によって生 じた RNAまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に認識し増幅するためのプ ライマーとして、または該 RNAまたはそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に検出 するためのプローブとして利用することができる。
[0035] 本発明のマーカーを軟骨細胞への分化能の測定においてプライマーとして用いる 場合には、通常 18bp〜100bp、好ましくは 18bp〜50bp、より好ましくは 18bp〜35bpの 塩基長を有するものが例示できる。具体的には、例えば配列番号: 9、 10、 13、 14、 17 、 18、 29、 30または 31に示される塩基配列を含有するポリヌクレオチドが例示される。 また検出プローブとして用いる場合には、通常 18bp〜全配列の塩基数、好ましくは 18 bp〜lkb、より好ましくは 100bp〜lkbの塩基長を有するものが例示できる。
[0036] 本発明のマーカーは、ノーザンブロット法、 RT-PCR法、 in situハイブリダーゼーショ ン法、チップ解析などといった、特定遺伝子を特異的に検出する公知の方法におい て、常法に従ってプライマーまたはプローブとして利用することができる。該利用によ つて MSCにおける TGF /3 3遺伝子の発現の有無または発現レベル (発現量）を評価 すること力 Sでさる。
測定対象試料としては、使用する検出方法の種類に応じて、軟骨障害 (軟骨欠損 等）の患者より採取、培養して 24時間程度軟骨分化誘導を行った被験用 MSCから、 常法に従って調製した total RNAを用いてもよいし、さらに該 RNAをもとにして調製さ れる各種のポリヌクレオチドを用いてもよ!/、。
[0037] また、 MSCにおける TGF β 3遺伝子の遺伝子発現レベルは、 DNAチップを利用して 検出あるいは定量することができる。この場合、本発明のポリヌクレオチドに係るマー カーは DNAチップのプローブとして使用することができる（例えば、ァフィメトリックス社 の Gene Chip HG-U133Aの場合、 25bpの長さのポリヌクレオチドプローブとして用い られる）。かかる DNAチップを、被験用 MSCから調製された RNAをもとに調製される標 識 DNAまたは RNAとハイブリダィズさせ、該ハイブリダィズによって形成された上記プ ローブ（本発明のマーカー）と標識 DNAまたは RNAとの複合体を、該標識 DNAまたは RNAの標識を指標として検出することにより、細胞内での TGF /3 3遺伝子の発現の有 無または発現レベル (発現量)が評価できる。
[0038] (1-3)抗体
本発明は、 MSCの軟骨細胞分化能を測定するためのマーカーとして、 TGF /3 3遺 伝子の発現産物 (TGF 13 3)に特異的に結合する抗体を提供する。
[0039] 本発明における TGF β 3(TGF β 3タンパク質)は公知のタンパク質である。例えばヒ ト TGF /3 3としては、配列番号: 2に示すタンパク資が知られている（GenBank Accessio n No. P10600)。またマウス TGF /3 3としては GenBank Accession No. NP_033394が、 ラット TGF /3 3としては GenBank Accession No. NP_037306力 それぞれ知られている 。当該 TGF β 3は、クローユングした TGF β 3遺伝子を含有する発現ベクターを細胞 に導入し、当該細胞（形質転換細胞)から分泌される TGF /3 3を単離、精製することに より得ることができる（Molecular Endocrinology, Vol 3， 1977-1986， 1989)。
[0040] 本発明は、軟骨分化能を有する MSCにおいて TGF /3 3遺伝子が顕著に発現上昇し て!/、ると!/、う知見をもとに、 TGF β 3の発現産物（タンパク質）の有無やその発現の程 度を検出することによって、被験用 MSCが軟骨分化能を有するか否かを判定すること ができると!/、う発想に基づくものである。
上記抗体は、従って、被験用 MSCにおける TGF /3 3の発現の有無またはその程度 を検出することによって、該 MSCが軟骨細胞分化能を有しているか否かを測定するこ とのできるツール（マーカー）として有用である。 [0041] 本発明の抗体は、その形態に特に制限はなぐ TGF β 3を免疫抗原とするポリクロ ーナル抗体であっても、またそのモノクローナル抗体であってもよい。さらに TGF /3 3 のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する 8アミノ酸、好ましくは 15アミノ酸、より好ましく は 20アミノ酸からなるポリペプチド (オリゴペプチドを含む）に対して抗原結合性を有す る抗体も、本発明の抗体に含まれる。
[0042] これらの抗体の製造方法は、すでに周知であり、本発明の抗体もこれらの常法に従 つて製造することカできる (Current Protocol in Molecular Biology, Chapter 11· 12〜1 1.13(2000))。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に 従って大腸菌や動物細胞等で発現し精製した TGF /3 3を用いて、あるいは常法に従 つて合成した TGF /3 3の部分アミノ酸配列を有するポリペプチドを用いて、家兎等の 非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一 方、モノクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌や動物細胞等で発現し精 製した TGF /3 3、あるいはその部分アミノ酸配列を有するポリペプチドをマウス等の非 ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイ ブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edi t. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11·4〜11.11)。
[0043] 抗体の作製に免疫原として使用される TGF /3 3は、本発明により提供される TGF /3 3 遺伝子の配列情報 (配列番号： 1)に基づいて、 DNAクローニング、各プラスミドの構 築、宿主へのトランスフエクシヨン、形質転換体の培養および培養物からのタンパク質 の回収の操作により得ることができる。これらの操作は、当業者に既知の方法、あるい は文献記載の方法（Molecular Cloning, T.Maniatis et al., CSH Laboratory (1983)， D NA Cloning, DM. Glover, IRL PRESS (1985))などに準じて行うことができる。
[0044] 具体的には TGF β 3をコードする遺伝子が所望の宿主細胞中で発現できる組み換 え DNA (発現ベクター）を作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該形質転 換体を培養して得られる培養物から TGF /3 3を回収することによって、本発明の抗体 製造のための免疫原としての TGF /3 3を得ることができる。また TGF /3 3の部分ぺプチ ドは、本発明により提供される TGF /3 3のアミノ酸配列情報 (配列番号: 2)に従って、 一般的な化学合成法 (ペプチド合成）によって製造することもできる。 [0045] なお、本発明の TGF β 3には、配列番号： 2に示す各アミノ酸配列を有するタンパク 質のみならず、その相同物も包含される。該相同物としては、配列番号: 2で示される アミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミ ノ酸配列からなり、且つ改変前の元のタンパク質と同様に TGF /3 3を認識する抗体を 生じさせ得る（同等の免疫学的性質を有する)タンパク質を挙げることができる。
[0046] なお、タンパク質におけるアミノ酸の変異数や変異部位は、その免疫学的活性が保 持される限り制限はない。免疫学的活性を喪失することなくアミノ酸残基が、どのよう に、何個置換、揷入あるいは欠失されればよいかを決定する指標は、当業者に周知 のコンピュータプログラム、例えば DNA Star softwareを用いて見出すことができる。例 えば変異数は、典型的には、全アミノ酸の 10%以内であり、好ましくは全アミノ酸の 5 %以内であり、さらに好ましくは全アミノ酸の 1%以内である。また置換されるアミノ酸 は、置換後に得られるタンパク質が、 TGF /3 3と同等の免疫学的活性を保持している 限り、特に制限されないが、タンパク質の構造保持の観点から、残基の極性、電荷、 可溶性、疎水性、親水性並びに両親媒性など、置換前のアミノ酸と似た性質を有す るアミノ酸であることが好ましい。例えば、 Ala、 Val、 Leu、 lie, Pro, Met, Phe及び Trp は互いに非極性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、 Gly、 Ser、 Thr、 Cys、 Tyr、 Asn 及び Ginは互いに非荷電性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、 Asp及び Gluは互い に酸性アミノ酸に分類されるアミノ酸であり、また Lys、 Arg及び Hisは互いに塩基性ァ ミノ酸に分類されるアミノ酸である。ゆえに、これらを指標として同群に属するアミノ酸 を適宜選択することができる。
[0047] 本発明の抗体は、 TGF β 3の部分アミノ酸配列を有するポリペプチド (オリゴペプチド を含む)を免疫原として用いて調製されるものであってよい。かかる抗体の製造のため に用いられるポリペプチドは、機能的な生物活性を有することは要しないが、 TGF /3 3 と同様な免疫原特性を有するものであることが望ましい。好ましくはこの免疫原特性 を有し、且つ TGF /3 3のアミノ酸配列において少なくとも連続する 8アミノ酸、好ましく は 15アミノ酸、より好ましくは 20アミノ酸からなるポリペプチドを例示することができる。
[0048] 力、かるポリペプチドに対する抗体の製造は、宿主に応じて種々のアジュバントを用 いて免疫学的反応を高めることによって行うこともできる。限定はされないが、そのよう なアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル 、並びにリゾレシチン、プル口ニックポリオル、ポリア二オン、ペプチド、油乳剤、キー ホールリンペットへモシァニン及びジニトロフエノールのような表面活性物質、 BCG ( カルメット ゲラン桿菌）やコリネバタテリゥム-パルヴムなどのヒトアジュバントが含ま れる。
[0049] 本発明の抗体は、 TGF β 3に特異的に結合する性質を有することから、該抗体を利 用することによって、被験用 MSCにおいて発現した TGF /3 3を特異的に検出すること ができる。すなわち本発明の抗体は、被験用 MSCにおける TGF /3 3の発現を検出す るためのプローブとして有用である。
[0050] 具体的には、例えば軟骨障害の患者より採取、培養して 24時間程度軟骨分化誘導 を行った被験用 MSCから、常法に従って細胞抽出液を調製し、例えば ELISA法、 RIA 法、ウェスタンブロット法など公知の検出方法において、上記抗体を常法に従ってプ ローブとして使用することによって、細胞内の TGF /3 3を検出することができる。
[0051] (2)間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化能の測定方法
本発明は、前述した本発明のマーカーを利用した、 MSCの軟骨細胞分化能の測定 方法を提供するものである。
[0052] 具体的には、本発明の測定方法は、軟骨障害の患者から採取 '培養し 24時間程度 軟骨分化誘導を行った被験用 MSCにおける TGF /3 3の遺伝子発現量 (レベル)、また は TGF /3 3のタンパク発現量 (レベル)を検出し、その遺伝子発現量またはそのタンパ ク質量を測定することにより、被験用 MSCが軟骨細胞への分化能を有するか否かを 判断するものである。本発明の測定方法は、移植に用いる MSCの品質評価において 有効に用いられる。
[0053] 本発明の測定方法は次の (a)、（b)及び (c)の工程を含むものである：
(a)被験用 MSC由来の試料と本発明のマーカーを接触させる工程、
(b)前記試料中の TGF /3 3遺伝子の発現量 (発現レベル)、または TGF /3 3のタンパク 質量 (発現レベル)を、上記マーカーを指標として測定する工程、
(c) (b)の結果をもとに、 MSCが軟骨細胞への分化能を有するか否かを判断する工程 [0054] ここで用いられる被験用 MSC由来の試料としては、被験用 MSCから調製される RNA 含有試料、若しくはそれからさらに調製されるポリヌクレオチドを含む試料、または MS Cから調製されるタンパク質を含む試料 (細胞抽出物等)を挙げることができる。かかる RNA、ポリヌクレオチドまたはタンパク質を含む試料は、 MSCから常法に従って調製 すること力 Sでさる。
本発明の測定方法は、測定対象として用いる試料の種類に応じて、具体的には下 記のようにして実施される。
[0055] (2-1)測定対象の試料として RNAを利用する場合
測定対象物として RNAを利用する場合、 MSCの軟骨細胞への分化能の測定は、具 体的に下記の工程 (a)、（b)及び (c)を含む方法によって実施することができる：
(a)被験用の MSCから調製された RNAまたはそれから転写された相補的ポリヌクレオ チドと、前記本発明の分化マーカー（TGF /3 3遺伝子の塩基配列における、連続する 少なくとも 18塩基からなるポリヌクレオチド及び/または該ポリヌクレオチドに相補的 なポリヌクレオチドを含有する、 MSCの軟骨細胞分化マーカー)とを結合させる工程、
(b)各分化マーカーに結合した、 MSC由来の RNAまたは該 RNAから転写された相補 的ポリヌクレオチドの量を測定する工程、
(c)上記 (b)の測定結果に基づいて、 MSCが軟骨細胞への分化能を有するか否かを 判断する工程。
[0056] 測定対象物として RNAを利用する場合は、本発明の測定方法は、該 RNA中の TGF
β 3遺伝子の発現量 (発現レベル)を検出し、測定することによって実施される。具体 的には、前述のポリヌクレオチドからなる本発明のマーカー（TGF /3 3遺伝子の塩基 配列における、連続する少なくとも 18塩基からなるポリヌクレオチド及び/または該ポ リヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドを含有するマーカー)をプライマーまたはプ ローブとして用いて、ノーザンブロット法、 RT-PCR法、 DNAチップ解析法、 in situハイ ブリダィゼーシヨン解析法などの公知の方法を行うことにより実施できる。
[0057] ノーザンプロット法を利用する場合は、本発明の上記マーカーをプローブとして用 いることによって、 RNA中の TGF /3 3遺伝子の発現の有無や発現レベルを検出、測定 すること力 Sできる。具体的には、本発明のマーカー湘補鎖)を放射性同位元素（32Pな ど)や蛍光物質などで標識し、それを、常法に従ってナイロンメンブレン等にトランス ファーした被験用 MSC由来の RNAとハイブリダィズさせた後、形成されたマーカー (D NA)と RNAとの二重鎖を、マーカーの標識物（RI若しくは蛍光物質）に由来するシグ ナルを放射線検出器 (BAS-1800II、富士フィルム社製）または蛍光検出器で検出、 測定する方法を例示することができる。また、 AlkPhos Direct Labelling and Detection System (Amersham Pharmacia Biotech社製)を用いて、該プロトコ一ノレに従ってマー カー（プローブ DNA)を標識し、被験用 MSC由来の RNAとハイブリダィズさせた後、マ 一力一の標識物に由来するシグナルをマルチバイオイメージヤー STORM860 (Amers h讓 Pharmacia Biotech社製）で検出、測定する方法も使用することができる。
[0058] RT-PCR法を利用する場合は、本発明のマーカーをプライマーとして用いることによ つて、 RNA中の TGF /3 3遺伝子の発現の有無や発現レベルを検出、測定することが できる。具体的には、被験用 MSC由来の RNAから常法に従って cDNAを調製してこれ を铸型とし、標的の TGF /3 3遺伝子の領域が増幅できるように、本発明のマーカーか ら調製した一対のプライマーをハイブリダィズさせて、常法に従って PCRを行い、得ら れた増幅二本鎖 DNAを検出する方法を例示することができる。なお、増幅された二 本鎖 DNAの検出は、上記 PCRを予め RIや蛍光物質で標識しておいたプライマーを用 いて行うことによって産生される標識二本鎖 DNAを検出する方法、産生された二本鎖 DNAを常法に従ってナイロンメンブレン等にトランスファーさせて、標識した本発明マ 一力一をプローブとして使用してこれとハイブリダィズさせて検出する方法などを用い ること力 Sできる。なお、生成された標識二本鎖 DNA産物はアジレント 2100バイオアナ ライザ (横河アナリティカルシステムズ社製)などで測定することができる。
[0059] また、 SYBR Green RT-PCR Reagents (Applied Biosystems社製)を用いて、該プロ トコールに従って RT-PCR反応液を調製し、 ABI PRISM 7700 Sequence Detection Sy stem (Applied Biosystems社製)で反応させて、該反応物を検出する方法や、 PrimeS cript RT-PCR reagent Kit (Perfect Real Time) (タカラバイオ社製）等を用いて添付の プロトコールに従って行う方法なども例示される。
[0060] RT-PCR法においては、簡便さと定量性の観点から、定量的 RT-PCR法を用いるこ とが好ましい。定量的 RT-PCRについては後述の実施例に詳述している力 例えば P rime Script RT reagent Kit (Perfect Real Time) (タカラノ ィォ社製)と SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time) (タカラバィォ社製)を用いた方法について簡単に述べると以 下のようになる。
まず、以下の反応液をトータル 10 μ 1の液量にて氷上で作製する： 5 X PrimeScript B uffer (ror Real I'ime) 2 μ ΐ^ PrimeScript RT enzyme Mixl 0.5 μ i、 uligo dT Primer 25p mol、 Random 6 mers 50pmol、 Total RNA 500ng、 RNase Free滅菌蒸留水。この反応 液を 37°Cで 15分間保温して逆転写反応を行い、 85°C5秒間保温することで逆転写酵 素を失活させ、逆転写反応を終結させる。
次に、以下の反応液を、トータル 25 1の液量で作製する： SYBR Premix Ex Taq (2 X ) 12.5 μ U PCR Forward Primer 0.2 μ mol、 PCR Reverse Primer 0.2 μ moi、逆 反応液（cDNA溶液） 2 1、滅菌蒸留水。次に、 Thermal Cycler Dice Real Time Syste m (タカラバイオ社製）を用い、 Hold (初期変性） Cycle : 1 (95°C lOsec)、 2 Step PCR Cycle： 40 (95°C 5sec、 60°C 30sec)、 Dissociationの反応を行い、終了後、解析を行う 。リアルタイム PCRを TaqManプローブ検出で行う場合には、 PrimeScript RT-PCR rea gent Kit (Perfect Real Time) (タカラバイオ社製）等を用いて実施する。
[0061] また最近、 LAMP法 (Loop-mediated Isothermal Amplification法； Nucleic Acids Res earch 28(12)e63， 2000、ウィルス 54巻第 1号 107-112、 2004等参照）と呼ばれる簡易か つ迅速な遺伝子増幅法が開発されており、本法も、 RT-PCR法の好ましい手法として 例示される。当該 LAMP法の具体的実験方法を以下に示す。
[0062] まず、 25 1の反応系として、以下のものを含む反応液ミックスを氷上にて調製する： 0.8 n molの FIPおよび BIPプライマー、 0.2 μ molの F3および Β3プライマー、 400 μ mol の dNTPミックス、 1Mの betaine (シグマ社）、 20mMの Tris_HCl(pH.8.8)、 10mMの KC1、 10mMの硫酸アンモニゥム、 4mMの硫酸マグネシウム、 0.1%の Triton X- 100と 1 μ gのト 一タル RNA、 5Uの eAMV逆転写酵素（シグマ社）、 10Uの RNase inhibitor (東洋紡）、 4 U/microL Bst DNAポリメラーゼ（New England Biolabs)。これを 65°Cで 1時間反応さ せた後、 80°Cで 10分間反応させて反応を終了する。
なお、プライマー（FIP、 BIP, F3、 B3)の設計は、 LAMP法専用プライマー設計支援ソ フ卜 (PrimerExplorer、 http:/ / nmerexplorer.jp/)で; 5<施する。 反応産物は、白濁の程度により遺伝子増幅の有無を検出することが出来るが、さら に信頼性を増す、若しくは定量性を持たせるためには電気泳動したほうが確実であ る。ァガロース電気泳動した後、ェチジゥムブロマイドで染色し、 UVにより反応産物を 確認する。写真を撮り、反応産物のシグナルを定量化する。もしくは、定量的なサー マルサイクラ一（Applied Biosystems 7900HT Fastリアルタイム PCRシステム等）で反 応を実施し、定量化する。
[0063] DNAチップ解析を利用する場合は、本発明の上記マーカーを DNAプローブ（1本鎖 または 2本鎖）として貼り付けた DNAチップを用意し、これに被験用 MSC由来の RNA 力、ら常法に従って調製された cRNAとハイブリダィズさせて、形成された DNAと cRNAと の二本鎖を、本発明のマーカーから調製される標識プローブと結合させて検出する 方法を挙げること力できる。また、上記 DNAチップとして、本発明の TGF /3 3の遺伝子 発現レベルの検出、測定が可能な既存の DNAチップを用いることもできる。かかる遺 伝子の発現レベルを検出、測定すること力できる DNAチップとしては、 Affymetrix社の Gene Chip Human Genome U133Aなどを挙げること力 Sできる。
[0064] (2-2)測定対象の試料としてタンパク質を用いる場合
測定対象物としてタンパク質を用いる場合は、 MSCの軟骨細胞への分化能の測定 は、試料中の TGF /3 3を検出し、その量を測定することによって実施される。具体的に は下記の工程 (a)、（b)及び (c)を含む方法によって実施することができる：
(a)被験用 MSC由来のタンパク質と抗体に関する本発明の分化マーカー（TGF /3 3に 特異的に結合する抗体）とを結合させる工程、
(b)各分化マーカーに結合した、 MSC由来のタンパク質の量を測定する工程、
(c)上記 (b)の測定結果に基づいて、 MSCが軟骨細胞への分化能を有するか否かを 判断する工程。
[0065] より具体的には、本発明のマーカーとして TGF /3 3に特異的に結合する抗体を用い て、ウェスタンブロット法、 ELISA法、 RIA法などの公知方法で、 TGF /3 3を検出、定量 する方法を挙げることができる。
[0066] ウェスタンブロット法は、一次抗体として本発明のマーカーを用いた後、二次抗体と して i などの放射性同位元素、蛍光物質、ホースラディッシュペルォキシターゼ（HR P)などの酵素等で標識した標識抗体 (一次抗体に結合する抗体)を用い、得られる 標識化合物の放射性同位元素、蛍光物質などに由来するシグナルを放射線測定器 (BAS-1800II :富士フィルム社製など）、蛍光検出器などで検出し、測定することによ つて実施できる。また、一次抗体として本発明のマーカーを用いた後、 ECL Plus Wes
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いて、 該プロトコールに従って検出し、マルチバイオイメージヤー STORM860(アマシャムフ
Figure imgf000023_0002
[0067] ELISA法は、一次抗体として本発明のマーカーを用いた後、二次抗体としてホース ラディッシュペルォキシターゼ（HRP)などの酵素等で標識した標識抗体（一次抗体に 結合する抗体)を用い、得られる発色物質などに由来するシグナルをマイクロプレー トリーダー（Molecular Probe社製など）、蛍光検出器などで検出し、固相における反 応を測定することによって定量解析できる。
[0068] (2-3)間葉系幹細胞の軟骨細胞分化能の測定
MSCの軟骨細胞分化能の測定 (判定)は、被験用 MSCにおける TGF /3 3遺伝子の発 現量 (発現レベル)、もしくはこれらの遺伝子の発現産物である TGF /3 3のタンパク質 量 (発現レベル)を、軟骨細胞への分化能を有さない MSC (ネガティブコントロール)や 初代培養軟骨細胞 (ポジティブコントロール)における当該遺伝子発現レベルまたは 当該タンパク質レベルと比較し、両者の違いを判定することなどによって行うことがで きる。
[0069] 具体的には、本発明のマーカーを利用した、 MSCの軟骨細胞分化能の測定は、患 者から採取 '培養し、 24時間程度軟骨分化誘導を行った被験用 MSCにおける TGF β 3遺伝子若しくは TGF /3 3タンパクの発現量を測定することにより行われる。被験用 MS Cが軟骨細胞への分化能を有すると判断されるためには、最低限、当該 MSCにおけ る TGF β 3遺伝子若しくは TGF β 3タンパクの発現量力 軟骨細胞への分化能を有さ ない MSC (例えば実施例における AOクローン)における発現量よりも多いことが必要 である。
[0070] より具体的には、本発明のポリヌクレオチドに関するマーカーをプライマーに用いて 定量的 RT-PCRを行!/、、 βァクチン遺伝子 (補正用遺伝子)の発現量に対する TGF β 3遺伝子の発現量の比 (TGF β 3遺伝子発現量/ β -actin遺伝子発現量;以下補正値) を求める。この補正値が、初代培養軟骨細胞における補正値を 1とした場合に 0.1以 上を示した細胞を、軟骨分化能を有する細胞と判定することができる。
さらに、必要に応じて移植直前 (約 3日前)に前記と同じ判定を行い、陽性となった細 胞を、移植用細胞と判定することができる。
[0071] 本発明の抗体に関するマーカーを用いた場合も、前記と同様の基準に従い、 ELIS A法等を用いて判定を行うことができる。
[0072] 以上のように、本発明のマーカーを用いた MSCの軟骨細胞分化能の測定は、従来 法 (最終分化形態を判定することでその細胞の分化能を確認する手法)に比して、少 量の細胞で、早期に、かつ簡便に、移植に用いる MSCの品質評価を行うことができる
〇
なお、本発明のマーカーを用いた評価により、移植可能、すなわち軟骨細胞分化 能を有すると判定された MSCは、未分化なまま患者に移植する（戻す)こともできれば 、軟骨細胞への分化途中、または分化させた後に、患者に移植する（戻す)ことも可 能である。
[0073] (3)間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化能の測定キット
本発明は、本発明のマーカーを成分として含有する、 MSCの軟骨細胞への分化能 測定用キットを提供する。当該キットは、 MSCの軟骨細胞分化能を測定するために有 効に用いられる。
前記キットが TGF /3 3遺伝子測定用キットの場合、当該キットは、前記本発明のポリ ヌクレオチドに係るマーカーのみからなるキットであっても、また本発明のマーカーと 他の成分とを含むキットであっても良い。キットが RT-PCR用キットの場合、本発明の マーカー (RT-PCR用プライマー)以外の他の成分としては、 TGF /3 3、軟骨分化誘導 培地 (組成については実施例参照)、 RNA抽出用デバイス (例えば RNeasy kit),補正 用の 0 -actin遺伝子増幅用プライマー、標準軟骨 cDNA、 RT反応用混合液、 PCR反 応用混合液などを挙げることができる。
[0074] また前記キットが TGF β 3タンパク測定用キットの場合、当該キットは、前記本発明 の抗体に係るマーカーのみからなるキットであっても、また本発明のマーカーと他の 成分とを含むキットであっても良い。キットが ELISA用キットの場合、本発明のマーカ 一 (抗体)以外の他の成分としては、標準軟骨タンパク、ヒト TGF β 3タンパク、測定用 プレート、プレート洗浄液、検出用 2次抗体、発色液、発色反応停止液などを挙げる こと力 Sでさる。
[0075] (4)レポーターベクターを利用した間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化能の測定 (4-1)レポーターベクターよりなる間葉系幹細胞の軟骨細胞分化マーカー
本発明はまた、 TGF /3 3の発現調節領域とレポーター遺伝子とを含有するベクター よりなる、間葉系幹細胞の軟骨細胞分化マーカーを提供する。
前記のように、本発明においては、被験用 MSCにおける TGF /3 3遺伝子の発現量を 測定することによって、当該被験用の MSCが軟骨細胞への分化能を有しているか否 力、を早期に判定できることが明らかとなった。従って、 TGF /3 3遺伝子の発現量そのも のを測定する代わりに、 TGF /3 3遺伝子の発現調節領域とレポーター遺伝子とを含 有するレポーターベクターを被験用 MSCに導入し、レポーター遺伝子の発現量 (レポ 一ター活性)を測定することによつても、 TGF /3 3遺伝子の発現量を推量することがで きる。本発明は、このようなレポーターベクターよりなる、間葉系幹細胞の軟骨細胞分 化マーカーをも提供するものである。
[0076] ここで「TGF /3 3の発現調節領域」とは、 TGF /3 3の発現調節領域として知られてい る領域であれば、如何なる領域であっても用いることができる。具体的には、 Genbank 番号: AF107885に記載のヒト TGF /3 3の発現調節領域が挙げられる。具体的には、 T GF βシグナル伝達を担う転写因子である smadの結合部位を 2箇所含む発現調節領 域が挙げられる。さらに具体的には、配列番号: 32に記載の塩基配列を含有する発 現調節領域が挙げられる。また、当該配列番号: 32に記載の塩基配列と同様に発現 調節領域として機能するものであれば、当該配列に対してほたは複数個の塩基の 置換、欠失および/または付加された配列であっても使用することができる。
[0077] 前記で「レポーター遺伝子」とは、レポーター遺伝子として公知の如何なる遺伝子 であっても用いることができ、具体的にはルシフェラーゼ、 GFP、 CAT, ALP、 β Galな どの遺伝子が挙げられる。これらレポーター遺伝子を組み込んだレポーターベクター が種々市販されており、例えば PGV-Bベクター（東洋インキ社）、 MultiColor-Luc (登 録商標） pSLG-test Vector (東洋インキ社）、 pCAT(R)3_Basic Vector (プロメガ社）な どを禾 IJ用すること力できる。
TGF /3 3遺伝子のェンノ、ンサ一領域を利用する場合に用いる外来プロモーターとし ては、例えば SV40、 13グロビン、チミジンキナーゼ等のプロモーターが例示される。 既にこのようなプロモーターと前記レポーター遺伝子とが組みこまれたレポーターべ クタ一 (プロモーターベクター)も巿販されており (ί列えばプロメガ社 GL3-Promoter DNAベクター）、これらも好適に使用される。
[0078] (4-2)間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化能の測定
本発明は、前述したレポーターベクターよりなるマーカーを利用した、 MSCの軟骨 細胞分化能の測定方法を提供する。
具体的には、本発明の測定方法は、軟骨障害の患者から採取 '培養し 24時間程度 軟骨分化誘導を行った被験用 MSCにおけるレポーター遺伝子の発現量を測定する ことにより、被験用 MSCが軟骨細胞への分化能を有するか否かを判断するものである 。本発明の測定方法は、移植に用いる MSCの品質評価において有効に用いられる。
[0079] 本発明の測定方法は、次の (a)、（b)及び (c)の工程を含むものである：
(a)被験用 MSCに本発明のレポーターベクターよりなるマーカーを導入する工程、
(b)各マーカーが含有するレポーター遺伝子の発現量を測定する工程、
(c)上記 (b)の測定結果に基づいて、 MSCが軟骨細胞への分化能を有するか否かを 判断する工程。
[0080] ここで、被験用 MSCに本発明のレポーターベクターを導入する方法としては、公知 の手法、例えばリポフエクチン法、リン酸カルシウム法、 DEAEデキストラン法、エレク トロポレーシヨン法、マイクロインジェクション法などが例示される。当該レポーターべ クタ一は、患者力も採取した MSCに対して、 TGF /3 3による分化誘導を行う前に導入 しても良ぐまた 24時間程度分化誘導を行った後に導入しても良い。好ましくは分化 誘導を行った後に導入する。
[0081] レポーター遺伝子導入後、一定時間後に、レポーター遺伝子の発現量を測定する 。例えばレポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子の場合、ルシフェラーゼ活性を 測定することによってレポーター遺伝子の発現量を判定する。当該ルシフェラーゼ活 性は、例えば PicaGene Dual SeaPansy system (東洋インキ)を用いて発光させ、発光 量をルミノメーターで検出することにより、測定することができる。
[0082] MSCの軟骨細胞分化能の測定 (判定)は、被験用 MSCにおけるレポーター遺伝子の 発現量 (例えばルシフェラーゼ活性）を、軟骨細胞への分化能を有さない MSC (ネガ ティブコントロール)や初代培養軟骨細胞 (ポジティブコントロール)における当該レポ 一ター遺伝子の発現量と比較し、両者の違!/、を判定することなどによって行うことが できる。
[0083] 具体的には、患者から採取 '培養し、 24時間程度軟骨分化誘導を行った被験用 MS Cにおけるレポーター遺伝子の発現量を測定することにより行われる。被験用 MSCが 軟骨細胞への分化能を有すると判断されるためには、最低限、当該 MSCにおけるレ ポーター遺伝子の発現量が、軟骨細胞への分化能を有さない MSC (例えば実施例 における AOクローン)における発現量よりも多いことが必要である。
[0084] より具体的には、例えば、被験用 MSCに、 TGF β 3のプロモーター領域を揷入した ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子と、 SV40プロモーター領域を揷入したゥミシ ィタケルシフェラーゼレポーターベクターを導入し、 24時間後、その MSCにおけるレ ポーター活性を測定する。ホタルルシフェラーゼ活性とゥミシィタケルシフェラーゼ活 性の比を、被験用 MSCにおける相対的 TGF /3 3プロモーター活性とする。別途、軟骨 細胞への分化能を有さない AOクローンに上記と同じレポーター遺伝子を導入し、 24 時間後、その AOクローンにおけるレポーター活性を測定し、 AOクローンにおける相 対的 TGF /3 3プロモーター活性を測定する。被験用 MSCにおけるレポーター活性が 、 AOクローンにおけるそれに比して、 2倍以上であれば、移植に適した MSCと判定す る。あるいは、同様に測定した、初代培養軟骨細胞における相対的 TGF /3 3プロモー ター活性と比較して、同等以上である場合に、移植に適した MSCと判定する。
[0085] 以上のように、本発明のレポーターベクターを用いた MSCの軟骨細胞分化能の測 定は、従来法 (最終分化形態を判定することでその細胞の分化能を確認する手法)に 比して、少量の細胞で、早期に、かつ簡便に、移植に用いる MSCの品質評価を行うこ と力 Sできる。また RNAやタンパク等を調製する手間も無ぐレポーターベクターを導入 するだけで測定可能であるという長所も有する。 なお、本発明のマーカーを用いた評価により、移植可能、すなわち軟骨細胞分化 能を有すると判定された MSCは、未分化なまま患者に移植する（戻す)こともできれば 、軟骨への分化途中、または分化させた後に、患者に移植する（戻す)ことも可能で ある。
[0086] (4-3)間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化能の測定キット
本発明は、本発明のレポーターベクターよりなる分化マーカーを成分として含有す る、 MSCの軟骨細胞への分化能測定用キットを提供する。当該キットは、 MSCの軟骨 細胞分化能を測定するために有効に用いられる。
前記キットは、前記本発明のレポーターベクターのみからなるキットであっても、また 他の成分とを含むキットであっても良い。ここで他の成分としては、 TGF /3 3、デキサメ タゾン、セレン酸、ァスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、プロリン、 BSA、ピルビ ン酸ナトリウム、胎牛血清などを挙げることができる。
[0087] 以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により なんら限定されるものではなレ、。
実施例 1
[0088] MSCの軟骨分化誘導初期に変化する遺伝子の検索
MSCの分化誘導初期に変化する遺伝子群には分化を特定方向に決定し、維持す る特異的遺伝子が含まれて!/、る可能性がある。 MSC初代培養細胞はへテロな細胞 集団であることから、分化能の異なる不死化 MSCクローン、すなわち軟骨分化能を持 つクローンと持たなレ、クローンを調製し、これ用いて解析を行った。
[0089] 1.実験方法
1)試料
BIOWHITTAKER社より購入したヒト MSC (Mesenchymal stem cells)に対して、ヒトパ ピロ一マウイノレス Ε6，Ε7(Κ· Munger, M. Scheffner, J.M. Huibregtse and P.M. Howley ， Interactions of HPV E6 and E7 oncoproteins with tumour suppressor gene product s. Cancer Surv., 12 (1992)， pp. 197-217.)及びヒト TERT遺伝子 (A.G. Bodnar, M. O uellette, M. Frolkis, S.E. Holt, CP. Chiu, G.B. Morin, C.B. Harley, J.W. Shay, S. Lichtsteiner and W.E. Wright， Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells. Science 279 (1998)， pp. 349-352.)を導入し、薬剤選抜（G4 18 100 μ g/ml、または hygromycin B 50 g/ml)により不死化した親細胞株を取得し た（Biochem Biophys Res Commun. 295(2): 354-61，2002)。クローニングリング法を用 い、親細胞株から 100クローンを樹立した。これらのクローン (hBM01E6E7hT clone)に ついては、それぞれ軟骨、骨、脂肪の 3方向への分化能が異なることを、常法（Scienc e 284: 143-7， 1999)に従い確認した。以下の解析には、軟骨、骨、脂肪の 3方向に 分化誘導可能な不死化 MSCである AOCクローン（クローン 17とクローン 51)と骨、脂肪 の 2方向のみ分化可能である AOクローン（クローン 9とクローン 14)を用いた。
[0090] 2)培養条件
AOCクローン 2株および AOクローン 2株について、以下の (1)〜(3)の 3種類の条件で 培養を行い、 24時間後にトータル RNAを抽出した。
(1) 2 X 105個の細胞を 60mm培養皿に播種し通常の培地 (DMEM+10%FBS)にて平板培 養 (単層培養)、 TGF β 3の添加なし
(2)三次元培養、 TGF β 3の添加なし
(3)三次元培養、 TGF β 3 (10ng/mL)の添加あり
[0091] 三次元培養は平板培養と比べ、より生体内に近い環境を保つことの可能な培養方 法である。当該三次元培養は以下の通りに実施した。すなわち、 2 X 105個の細胞に 0 .5mLの、 TGF /3 3の添加無しもしくは有りの、軟骨分化誘導培地 [DMEM +high glucos e (4.5%), Dexamethasone(0.丄 μ Μ)，Ascorbic acid(0.17mM), Insulin(6.25 μ g/ml), Lin oleic acid (5.33 μ g/ml), Proline(0.35mM), Selenous acid(6.25ng/ml), Sodium pyruvat e(lmM), Transferrin (6.25mg/ml), BSA (1.25mg/ml)]を添加した。 15mLの遠心管内 で懸濁した後、 1200rpmで 5分間遠心し、遠心管を試験管立てに立てたまま 37°C、 C 0 5%の培養槽内で静置した。
[0092] 3)RNA抽出及びマイクロアレイ解析
上記 (1)〜(3)の試料を細胞播種または軟骨分化誘導開始から 24時間後に、 RNeas y clean up kit (Qiagen社）を用いてトータル RNAを抽出した。
マイクロアレイ解析は Affymetrix社 GeneChip Human Genome U133Aを用いて行つ た。上記の試料より抽出した total RNA各 10 gから作製した cDNAをもとにラベル化 c RNAを調製し、 GeneChipアレイとハイブリダィズした。蛍光染色後、 GeneChipアレイ の染色像をスキャナーで読み込み、 Microarray Suite version 5.0(Affymetrix社製)で 解析した。こうして各試料の遺伝子発現量（Signal)と発現の有無（Detection)のデー タを得た。
2試料間での遺伝子発現の比較についても、 Microarray Suite version 5.0で解析し た。 2試料間での遺伝子発現の増減（Change)および発現変動倍率（Signal Log Rati
0)のデータは発現変動遺伝子の選抜に利用した。
[0093] 2.結果
1)軟骨分化誘導により 2倍以上発現変動した遺伝子の選抜
AOCクローン 2株、 AOクローン 2株のそれぞれについて、（1)軟骨分化誘導（三次元 培養、 TGF β 3添加）と三次元培養のみ（TGF β 3添加なし）の遺伝子発現の比較解 祈と、（2)軟骨分化誘導 (三次元培養、 TGF /3 3添加）と平板培養 (単層培養、 TGF /3 3 添加なし)の遺伝子発現の比較解析を、 Microarray Suite version 5.0によって解析し た。 2倍以上発現変動（増加、減少）遺伝子として、 GeneChipプローブセットのうち、 Si gnal Log Ratioが 1以上で Changeが I (2倍以上増カロ）、あるいは Signal Log Ratioが- 1 以下で Changeが D (2倍以上減少）に該当するプローブセットを選抜した。さらに AOC クローン間、 AOクローン間で共通に 2倍以上発現増カロ、減少したプローブセットを選 抜し、これを軟骨分化誘導によって 2倍以上発現変動したプローブセットとした。この プローブセットの数を、まとめて表 1に示す。
[0094] [表 1]
Figure imgf000030_0001
各クローンで 2倍以上発現変動したプローブセット（計 641)の遺伝子発現量（Signal )のデータを用いて、 Spotfire DecisionSite (Spotfire社）の階層型クラスタリングで分析 した。すなわちプローブセットごとに Signalデータを Z-scoreに変換した後、 Clustering method : UPGMA、 Similarity measure : Correlationの条件で分析した。その結果、 AO Cクローン 2株間、 AOクローン 2株間で、それぞれ類似した発現変動パターンを示した
〇
[0096] 2)AOCクローンの軟骨分化誘導時のみに発現変動する遺伝子の選抜
AOCクローン 2株で共通に 2倍以上発現変動したプローブセットは 66 (増加 39、減少 27)あった。この中でいずれかの AOクローンで 2倍以上発現変動したプローブセット を除くと、変動プローブセットは 6 (増加 4、減少 2)であった。
[0097] さらに上記以外の方法で、 AOCクローンの軟骨分化誘導時のみで発現増加または 減少した遺伝子を追加選抜した。発現増加遺伝子として、 2つの AOCクローンの軟骨 分化誘導の試料のみで発現しており（Detectionが Present)、 AOCクローンの他の試 料、および AOクローンの全試料での発現がな!/、（Detectionが Absent)プローブセット を選抜し、 7プローブセットを得た。また発現減少遺伝子として、 2つの AOCクローンの 軟骨分化誘導の試料のみで発現が無く（Detectionが Absent)、 AOCクローンの他の 試料、および AOクローンの全試料で発現して!/、る（Detectionが Present)プローブセ ットを選抜し、 15プローブセットを得た。
[0098] 以上のようにして、軟骨分化誘導時（三次元培養、 TGF β 3処理）に AOCクローン 2 株で共通に発現増加し、 AOクローン 2株では発現増加していない遺伝子として最終 的に 10遺伝子を得た。また AOCクローンで共通に発現減少し、 AOクローン 2株で発 現減少してレ、な!/、遺伝子として最終的に 17遺伝子を得た。
実施例 2
[0099] RT-PCRによる遺伝子発現の確認
RT-PCRにより、前記マイクロアレイで抽出された遺伝子の発現結果を確認した。す なわち、 AOCクローン 2株、 AOクローン 2株においてマイクロアレイで用いた RNAを逆 転写し cDNAを作製して確認を行った。具体的には、マイクロアレイで発現増加遺伝 子として抽出された COMP遺伝子、 TGF /3 3遺伝子、 DAPK3遺伝子および KCNG1遺 伝子を選択して、 RT-PCRによる遺伝子発現の確認を行った。コントロールとして BAC T遺伝子を用いた。
各遺伝子の正式名称、 GenBank Accession number,増幅される遺伝子の長さ、お よび用いたプライマー配列を以下に列挙する。
[0100] COMP： Cartilage oligomeric matrix protein(GenBank accession numbe： NM_000095, 314bp)
(sense; 5，一 caggacgactttgatgcaga— 3，(0己歹 lj番号： 3)ゝ antisense;5'-aagctggagctgtcctggt a-3' (配列番号 : 4))
DAP ： death - associated protein kinase 3 (GenBank accession number : NM— 001348， 448bp)
(sense; 5'— catcctggagctggtctct— 3' (酉己歹 lj番号： 5)、 antisense;5，_gtactcctcgtcgaagtcgt— 3' (配列番号 : 6》
Kし ivJGr l： potassium voltage-gated channel, suofamily G, member 1 (GenBank accessi on number: AK128721, 522bp)
(sense; 5'_gcaacagctacctggacaa_3， (酉己列番号： 7)、 antisense;5'-cacttccgaacaagatgtca ct-3' (配列番号: 8》
TGP β 3： Transiorming growth factor beta 3(GenBank accession number： J0324U 6 78bp)
(sense:5，_acccaggaaaacaccgagtc_3' (酉己列番号： 9)； antisense: 5，- cacacagcagttctcctc caag-3' (配列番号： 10》
BACT : beta actin (GenBank accession number NM— 001101、 218bp)
(sense: 5，一 aagagaggcatcctcaccct— 3 酉己歹 号： 11ノ、 antisense: 5 ' -tacatggctggggtgt tgaa-3' (配列番号： 12))
[0101] cDNA合成反応は、常法に従い実施した。すなわち、 Random hexamerと dNTPを加 え 65°Cで 5分おき、氷上にて冷やした後に逆転写酵素（Superscript Π)を加えて 25°C で 5分、 40°Cで 50分、 70°Cで 15分反応させた。 PCR反応は、上記で合成した cDNAを 用い、まず denatureを 95°Cで 5分行った後、「denature 95°C 1分、 annealing 58°C 1分、 extension 72°C 1分」を 30サイクル行い、最後に 72°Cで 7分行った。遺伝子産物をァガ ロース電気泳動し、可視化した。
[0102] 結果を図 1に示す。軟骨分化誘導可能な AOCクローンを 3次元培養し、 TGF /3 3で 分化誘導した際に、調べたいずれの遺伝子についても発現増加が認められた。一方 、軟骨分化誘導不可能な AOクローンに対して同様の処理（3次元培養、 TGF /3 3処 理)を施しても、これらの遺伝子の発現増加は認められな力 た。以上の結果より、こ れら COMP遺伝子、 TGF /3 3遺伝子、 DAPK3遺伝子および KCNG1遺伝子は、軟骨 細胞への分化誘導初期 (誘導 24時間後)に特異的に発現する遺伝子であること、すな わち MSCから軟骨細胞への分化のマーカーとなり得ることが明らかとなった。このうち 遺伝子発現の変動が顕著であった TGF /3 3に着目して、以下の解析を継続した。 実施例 3
[0103] TGF β 3遣ィ云早 現量の定量評 iffiによろ比較
定量的 RT-PCRにより、各クローンにおける TGF /3 3遺伝子の発現量を比較した。
1.実験方法
1)細胞
分化能の異なる不死化 MSCクローン (hBM01E6E7hT clone)のうち軟骨、骨、脂肪の 3方向に分化誘導可能な不死化 MSCである AOCクローン 4株と骨、脂肪の 2方向のみ 分化可能である AOクローン 2株、及び初代培養 MSC(hBM49)を用いた。
[0104] 2)試料の調製
AOCクローン 4株、 AOクローン 2株、初代培養 MSC(hBM49 :ドナー由来 MSC、京都 大学医学部の倫理委員会の承認受領済)について以下の 2種類の条件で培養した。
1.単層培養、 TGF /3 3添加なし： 2 X 105個の細胞を 60mm培養皿に播種し、通常の培 地 (DMEM+10%FBS)にて平板培養した（分化誘導なし)。
2.三次元培養： TGF β 3(10ng/mL)添加あり：実施例 1記載の方法で三次元培養を行 い、 TGF β 3を添加した (軟骨分化誘導)。
[0105] 3)RNA由出と RT反応
上記の細胞を細胞播種または軟骨分化誘導開始から 24時間後に RNeasy clean up kit (Qiagen社）を用いて RNA抽出した。 cDNAの作製は実施例 2と同様に行った。
[0106] 4)定量的 RT-PCR
SYBR Green Mastermix(Applied Biosystems社を用い、 7300 real time PCR system (Applied Biosystems社）にて実施した。 PCRプライマーは、以下のものを用い、「95°C 15秒、 58°C30秒、 72°C1分」を 40サイクル増幅した。 TGF B 3(sense : 5，_acccaggaaaacaccgagtc_3， (酉己列番号： 13)； antisense: 5'-cacacagcag ttctcctccaag-3' (配列番号： 14))
βΑυΤ sense:
Figure imgf000034_0001
: I sノ； antisense：。 -tacatggctgggg tgttgaa-3' (配列番号： 16))
結果は TGF /3 3発現量を BACT発現量で除することで補正した後、軟骨初代培養に おける TGF /3 3の発現補正値を 1として計算し、相対発現量をグラフ表示した。
[0107] 2.結果
結果を図 2に示す。軟骨分化誘導が不可能なクローン (AOクローン)では軟骨分化 誘導処理を行っても TGF /3 3の発現が認められな力、つた力 軟骨分化誘導可能なク ローン (AOCクローン)では、分化誘導を行うことにより初代培養軟骨細胞より高いレべ ルの TGF /3 3の発現が認められた。以上の結果より、 TGF /3 3は、 MSCから軟骨細胞 への分化誘導初期に発現する分化マーカーとして有効であることが示された。
実施例 4
[0108] TGF β 3遺伝子発現制御の autocrine機構の検討
軟骨細胞への分化誘導初期に発現する TGF /3 3遺伝子が、 autocrineに発現制御 を受けているか否かの検討を行った。
[0109] 1.実験方法
1)細胞
AOCクローンおよび AOクローンを 1株ずつ用いた。
2)培養方法
以下の 8種類の条件で 24時間培養し、 mRNAを抽出した。なお SB-431542 (TOCRIS 社)は、 TGF beta receptor type lのリン酸化阻害剤であり、 TGF β 3の作用を遮断する 拮抗剤である。
[01 10] 1.単層培養： 2 X 105個の細胞を 60mm培養皿に播種し通常の培地 (DMEM+ 10%FBS) にて平板培養した。
2.単層培養に SB-431542を 1マイクロモル添加。
3.単層培養に TGF β 3を 10ナノグラム/ミリリットル添加。
4.単層培養に TGF β 3を 10ナノグラム/ミリリットルと SB-431542を 1マイクロモル添加。 5.三次元培養： 2 X 105個の細胞を TGF /3 3以外の軟骨誘導培地に懸濁し、 15ミリリット ルの遠心管を用いて 1200rpmにて 5分遠心し静置した。
6.三次元培養に SB-431542を 1マイクロモル添加。
7.三次元培養に TGF β 3を 10ナノグラム/ミリリットル添加。
8.三次元培養に TGF β 3を 10ナノグラム/ミリリットルと SB-431542を 1マイクロモル添加
〇
[0111] 3)RNA抽出
上記の試料を細胞播種または軟骨分化誘導開始から 24時間後に、 RNeasy clean u p kit (Qiagen社）を用いて RNA抽出した。 cDNAの合成、 PCRは前記と同様にして行つ た。
2.結果
結果を図 3に示す。軟骨分化誘導が可能なクローン (AOC)では、単層培養、 3次元 培養のいずれにおいても、軟骨分化誘導 (TGF /3 3処理)によって TGF /3 3の明らかな 発現誘導が認められた。この発現誘導は、 TGF beta receptor typelのリン酸化阻害 剤 (SB-431542)により減弱したことから、 TGF /3 3は autocrineにより発現制御されてい ることが示された。また、この現象は軟骨誘導不可能なクローン (AO)では認められな 力、つたことから、 TGF /3 3の autocrine発現誘導が軟骨分化誘導に重要であることが示 唆された。
実施例 5
[0112] MSC初代培着細胞の軟骨分化誘導における TGF B 3の発現解析
MSC初代培養細胞の軟骨分化誘導により、 TGF /3 3が発現するか否力、を検討した。
1.実験方法
1)細胞
継代 3代目の MSC初代培養細胞（ドナー由来 MSC、京都大学医学部の倫理委員会 の承認受領済） 2株 (huBM43，huBM49)を用いた。
2)細胞培養と RNA調製、定量的 PCR
上記の細胞を、細胞播種または TGF /3 3による軟骨分化誘導開始から 24時間後に RNeasy clean up kit (Qiagen社）を用いて RNA抽出した。 cDNAの作製、定量的 PCR は実施例 3と同様に実施した。
[0113] 2.結果
huBM43の結果を図 4及び図 5に、また huBM49の結果を図 6および図 7に、それぞ れ示す。 MSC初代培養細胞においても、軟骨細胞への分化誘導初期に、不死化ク ローンと同様の TGF /3 3の発現誘導と阻害剤による発現の低下が認められた。このこ と力、ら、クローン化 MSC(AOC)で認められた TGF /3 3の autocrineによる発現誘導は、 初代培養細胞においても認められる現象であることが確認された。
実施例 6
[0114] TGF B 3遺伝子発現 GAG産牛量 の相閗
軟骨分化誘導時の TGF β 3の発現と GAGの産生量の相関を比較した。
1.実験方法
1)細胞
AOCクローン 9株および AOクローン 7株を用いた。
2)細胞培養と RNA調製、定量的 PCR
上記の細胞を、細胞播種または軟骨分化誘導開始から 24時間後に RNeasy clean u p kit (Qiagen社）を用いて RNA抽出した。 cDNAの作製、定量的 PCRは実施例 3と同様 に実施した。
[0115] 3)軟骨基質評価法（glycosaminoglycan(GAG)定量）
TGF /3 3による軟骨分化誘導を常法 (Stem Cells 23:958-64， 2005)により 2週間行い 、 GAG (Glycosaminoglycan)定量を行った。 GAG定量 (Stem Cells 23:958-64， 2005) (ュ、 Biyscan sulfated glycosaminoglycan assay kit(Biocolorネェリを用レヽてノロトコ一ノレ通 りに fiつた。
[0116] 2.結果
軟骨分化誘導可能な細胞株 (AOCクローン)、および軟骨分化誘導不可能な細胞 株 (AOクローン)において軟骨分化誘導時の TGF /3 3の発現と GAGの産生量の相関 を比較した結果を図 8に示す。 TGF /3 3の発現誘導と従来の軟骨分化評価法 (GAG定 量値)とが相関する結果となり、 MSCの培養初期での TGF /3 3の発現誘導値を軟骨分 化の指標とすることの妥当性が証明された。 実施例 7
[0117] 初代培着骨髄聞 榦細朐 (MSC)を用い軟骨分化誘導した際の TGF β 3遣ィ云子発 現 GACHi の木目
軟骨分化誘導時の TGF β 3の発現と GAGの産生量の相関を比較した。
1.実験方法
1)細胞
異なるドナー 9名力 調製した初代培養骨髄間葉系幹細胞 (継代 2代目のドナー由 来 MSC、京都大学医学部の倫理委員会の承認受領済）を用いた。
[0118] 2)細胞培養と RNA調製、定量的 PCR
上記の細胞を、細胞播種または軟骨分化誘導開始から 24時間後に RNeasy clean u p kit (Qiagen社）を用いて RNA抽出した。 cDNAの作製は実施例 3と同様に実施した。 定量的 PCRは、 Taqman Mastermix(Applied Biosystems社)を用い、 7300 real time P CR system (Applied Biosystems社）にて実施した。 PCRプライマーおよび Taqmanプロ ーブは以下のものを用い、「95°C15秒、 60°C1分」を 40サイクル増幅した。
TGF /3 3 Forward (5'- AAACATTCACGAGGTGATGGAA- 3，）（配列番号： 29) TGF /3 3 Reverse (5'- GATCTCCACGGCCATGGT- 3，）（配列番号： 30)
TGF /3 3 Taqman (5'- TCAAATTCAAAGGCGTGGACAATGAGGA- 3，）（配列番号： 3 1)
結果は TGF /3 3発現量を、 18S発現量 (Pre-Developed Taqman Assay Reagents; Hum an 18S rRNA (Applied Biosystems社)を用いて TGF /3 3と同様に測定)で除することで 補正した後、軟骨初代培養における TGF /3 3の発現補正値を 1として計算し、相対発 現量をグラフ表示した。
[0119] 3)軟骨基質評価法 (GAG定量）
TGF /3 3による軟骨分化誘導を常法 (Stem Cells 23:958-64， 2005)により 2週間行い 、 GAG定量を行った。 GAG定量は、実施例 6と同様に実施した。
[0120] 4)DNA量の測定
細胞内 DNA量は、 0.2% Triton X-100により培養細胞力、ら抽出した抽出液を、ピコグ リーン染色試薬 (Invitrogen社)で、染色し、 PicoGreen dsDNA Quantitation Kit (Invitro gen社)により、 SpectraMaxプレートリーダー（Molecular Devices社)を用いた蛍光 ELI
SA法により測定した。
[0121] 5)有意差検定
TGF β 3発現量と GAG定量値の相関係数はスペアマンの順位相関を用いて求めた
。また、有意差検定は、ピアソンの相関係数の検定法を用いて行った。
[0122] 2.結果
初代培養 MSCにおいて軟骨分化誘導時の TGF β 3の発現と GAGの産生量の相関 を比較した結果を図 9に示す。 GAG/DNAと TGF /3 3発現誘導の相関は 0.715で、ピア ソンの相関係数の検定を実施した場合、 P値が 0.046となり、有意差があると判定され た。 TGF /3 3の発現誘導と従来の軟骨分化評価法 (GAG定量値)とが相関する結果と なり、 MSCの培養初期での TGF /3 3の発現誘導値を軟骨分化の指標とすることの妥 当性が確認された。
実施例 8
[0123] 成熟軟骨細胞の TGF B 3処理による遺伝子発現解析
成熟軟骨細胞の TGF β 3処理による遺伝子発現解析を行った。
1.実験方法
Ρ53ΚΟマウス由来関節軟骨細胞株であり、関節軟骨としての性質を非常によく保持 している ΜΜΑ2 (J Bone Miner Res 20(3)， 377-89,2005)を、以下の 3種類の条件で 24 時間培養後、 Qiagenの RNeasy clean up kitを用いて RNA抽出した。 cDNAの合成は 実施例 2と同様にして行った。
[0124] (1)三次元培養： 2 X 105個の細胞を DMEM/F12に懸濁し 15ミリリットルの遠心管で 120 Orpm 5分遠心し静置した。
(2)三次元培養に TGF /3 3 10ナノグラム/ミリリットル添カロ
(3)三次元培養に TGF /3 3 10ナノグラム/ミリリットルと SB-431542を 1マイクロモル添加
[0125] また、同様の条件で 2週間培養し、細胞塊の形態を観察した。
実施例 2と同様の方法により、 TGF /3 3、 Col2al、 Col9al、 Age, PAI-1の各遺伝子に ついて PCRを実施して増幅した後、産物を電気泳動して可視化した。プライマーの由 来となる遺伝子の正式名称、 GenBank Accession number,増幅される遺伝子の長さ 、および用いたプライマー配列を以下に列挙する。
[0126] TGF β 3： Transforming growth factor beta 3(GenBank accession number : NM— 009368 、 504bp)
(sense:5'- tactatgccaacttctgctc_3' (酉己列番号： 17) ; antisense: 5，- cactcgctatccgttctct a-3' (配列番号： 18))
Col2al : COLLAGEN. TYPE II， ALPHA- KGenBank accession number: M6516 17 3bp)
(sense:5'- cacactggtaagtggggcaagaccg— 3' (酉己歹 IJ番号： 19) ; antisense: 5'— ggattgtgttgtt tcagggttcggg-3' (配列番号： 20》
Col9al : COLLAGEN, TYPE IX， ALPHA- KGenBank accession number : D 1751 44 8bp)
(sense:5，- gaccagcacatcaagcaggt_3， (酉己列番号： 21) ; antisense: 5' - gcaagaggctggctca cagaa-3' (配列番号 :22》
Agc :AGGRECAN KGenBank accession number: NM_007424、 636bp)
(sense:5'-gtccctggtcagccccacttg -3， (目己列番号： 23)； antisense: 5'-cactgacacacctcgga agca-3' (配列番号： 24》
PAM : PLASMINOGEN ACTIVATOR INHIBITOR KGenBank accession number, 1 93bp)
(sense:5，- tccagggcttcatgccccact_3'(BE^IJ§ : 25) ; antisense: 5' - gaagtagagggcattc accagca -3' (配列番号： 26》
Bact： beta actin (GenBank accession number: X03672、 218bp)
(sense:5'- aagagaggtatcctgaccct_3'(SE^IJ§ : 27) ; antisense: 5，- tacatggctggggtgttg aa-3' (配列番号: 28》
[0127] 2.結果
RT-PCRの結果
結果を図 10に示す。 MMA2は TGF /3 3を加えなくても、もともと TGF 3遺伝子の発 現が認められ、 Col2al, Col9al，Agcなどの関節軟骨特異的遺伝子の発現を認めるが 、 TGF /3 3をカロえることで、これらの遺伝子の発現は亢進した。特に TGF /3 3遺伝子の 発現亢進が顕著であった。ここに SB-431642を加えるとこれらの遺伝子発現は低下し た。これは TGF beta signalで特異的に制御される遺伝子 (PAI-1)と同様の発現変動 であった。
[0128] 2)三次元培養の形態
約 2週間の培養で、 SB-431642を加えない条件では、 TGF /3 3添カロ'非添加に関わ らず丸!/、pelletが観察される力 S、 SB-431642を加えた場合には pelletを形成せずに形 が崩れてしまった。 SB-431642を加えた場合に認められた現象、すなわち関節軟骨 特異的遺伝子発現の顕著な減弱と、軟骨塊の形態維持ができなくなったことは、内 因性を含めた TGF β 3の作用が遮断されたことにより関節軟骨としての分化形質を維 持できなくなつたものと予想された。以上の結果より、成熟した関節軟骨でも関節軟 骨としての分化形質維持のためには TGF /3 3の発現が必要であることが示された。ま た上記の結果より、 TGF /3 3の発現を指標として、移植直前の MSCの品質評価も行え ることが示された。
実施例 9
[0129] ルシフェラーゼアツセィによる TGF β 3転写活性の測定
TGF /3 3の発現調節に TGF /3 3が関与しているかどうかを検討するため、ヒト TGF /3 3遺伝子のプロモーター領域を用いたルシフェラーゼアツセィを行った。
1)ベクターの構築
ヒト TGF /3 3発現調節領域の配列情報（Genbank番号: AF107885)に従い、各部分 に該当する PCRプライマーを作成した。ドナー末梢血由来のヒトゲノム DNAをテンプ レートにして、各 PCRプライマーセットを用いて増幅した遺伝子断片を、 PGV-Bベクタ 一（東洋インキ社製）のマルチクローニングサイトにクローユングした。遺伝子配列お よび揷入方向は、シークェンシングにより確認した。構築したベクターは下記の通りで ある。なお、遺伝子導入効率の補正用として、 pRL-TK (プロメガ社製）を用いた。
[0130] -843 to+118 (配列番号： 32)：
TGFbシグナル伝達を担う転写因子である smadの結合部位を 2箇所含む転写調節領 域断片
-606 to+118 (配列番号： 32の第 238位〜第 961位）： smadの結合部位を 1箇所含む転写調節領域断片
-432 to+118 (配列番号： 32の第 412位〜第 961位）：
smadの結合部位を 1箇所含む転写調節領域断片
-272 to+118 (配列番号： 32の第 572位〜第 961位）：
smadの結合部位を 1箇所含む転写調節領域断片
-239 to+118 (配列番号： 32の第 605位〜第 961位）：
smadの結合部位を含まな!/、転写調節領域断片
-38 to+118 (配列番号： 32の第 806位〜第 961位）：
smadの結合部位および TATA配列を含まない転写調節領域断片
[0131] 2)ルシフェラーゼアツセィ
細胞としては、（1)骨、軟骨、脂肪に分化可能なヒト不死化間葉系幹細胞株 (AOCク ローン)、 (2)骨、脂肪に分化可能なヒト不死化間葉系幹細胞株 (AOクローン)、（3)ヒト間 葉系幹細胞初代培養（MSC)、の 3種類を用いた。各細胞を培養用プレートに 5000 ce lisん m2の密度で 6穴プレートに播種した。 24時間後、上記で作製したベクター（1〃 g/ well)を Lipofection LTX(Invitrogen社製)を用いて、遺伝子導入した。その際、リコンビ ナント TGF /3 3(10ng/ml)と SB431542(luM)も、必要に応じて加えた。
ノレシフェラーゼアツセィは、遺伝子導入 24時間後、 PicaGene Dual SeaPansy system (東洋インキ)で Luminometer (STRATEC Biomedical Systems)を用いて行った。結果 は、空ベクター（PGV-B)におけるルシフェラーゼ活性を 1とし、相対値として表した。
[0132] 3)結果
結果を図 11に示す。 TGF /3 3発現調節領域の各断片を比較した結果、転写開始点 より- 614bp上流の smad結合領域を含んだベクターが高!/、ルシフェラーゼ活性を示し 、同部位が遺伝子転写に重要な領域であることが明らかになった（図中 (b))。また、こ れは軟骨に分化が可能な細胞 (AOCクローン、初代培養 MSC)で強い活性を示し (図 中 (d)、（h))、軟骨に分化が不可能な細胞 (AOクローン)では転写活性が低い（図中 (f)) ことから、細胞自立的にもこの smad結合領域を含んだ遺伝子断片に対する反応性 が認められた。さらに smad結合領域を 2箇所含む遺伝子断片では TGF /3 3の添加に より活性が上昇し、阻害剤 SB431542の添加で低下した力 smad結合領域を 1箇所し か含まない場合にはこの上昇、低下が少なぐこの 2箇所の smad結合領域力 STGF /3 3 による転写活性上昇に必須であることが明らかとなった。以上により、（ TGF /3 3遺伝 子の転写活性は、 TGF /3 3シグナルそのものに依存していること、また (2)上記の 2箇 所の smad結合領域を含む TGF β 3発現調節領域を有するレポーターベクターを用い ることにより、 TGF /3 3の転写活性 (発現量)を測定できることが明らかとなった。
実施例 10
[0133] TGF Β 3の 旨ネ^した移械 田朐,の。口。籠平
軟骨欠損の患者より常法により MSCを採取し、プラスチック培養皿の上で平板培養 する。移植に用いる予定の細胞のうち 2 X 105を分離し、これを用いて以下の軟骨分 化誘導能の判定を行う。
分離した細胞に TGF /3 3(10ng/ml)を添加した軟骨分化誘導培地を加え、 1200rpm で 5分間遠心し、試験管立てに立てて 37°C，CO 5%の培養槽内で 24時間静置する。 R NAを抽出し、前記実施例と同様の定量的 RT-PCR法により TGF /3 3遺伝子の発現量 を解析する。 0ァクチン遺伝子 (補正用遺伝子)の発現量に対する TGF β 3遺伝子の 発現量の比 (TGF β 3遺伝子発現量/ β -actin遺伝子発現量;以下補正値)が、初代 培養軟骨細胞における補正値を 1とした場合に 0.1以上を示した細胞を、軟骨分化 能を有する細胞と判定する。
前記の細胞 (採取した MSC)を TGF /3 3(10ng/ml)添加軟骨分化誘導培地中、平板培 養にてさらに 3週間程度培養し、必要に応じて移植 3日前頃に前記と同じ判定を行い 、陽性となった細胞 1000万個程度を、軟骨欠損の患者に移植する。
実施例 11
[0134] TGF B 3の 旨ネ^した移械 ffl細 の。口。籠平 (2)
軟骨欠損の患者より常法により MSCを採取し、プラスチック培養皿の上で平板培養 する。移植に用いる予定の細胞のうち 40000個を分離し、これを用いて以下の軟骨分 化誘導能の判定を行う。
分離した細胞を 6穴プレートに播種 (5000 cellsん m2)し、 TGF /3 3(10ng/ml)を添加し た軟骨分化誘導培地を加える。実施例 9で作製した TGF /3 3の発現調節領域 (-843 〜+118)とルシフェラーゼ遺伝子とを含むレポーターベクター、および、 SV40プロモー ター領域を揷入したゥミシィタケルシフェラーゼレポーターベクターを導入し、 24時間 後、その MSCにおけるレポーター活性を測定する。ホタルルシフェラーゼ活性とゥミシ ィタケルシフェラーゼ活性の比を、被験用 MSCにおける相対的 TGF /3 3プロモーター 活性とする。別途、軟骨細胞への分化能を有さない AOクローンに上記と同じレポ一 ター遺伝子を導入し、 24時間後、その AOクローンにおけるレポーター活性を測定し、 AOクローンにおける相対的 TGF /3 3プロモーター活性を測定する。被験用 MSCにお けるレポーター活性力 AOクローンにおけるそれに比して 2倍以上であれば、移植に 適した MSCと判定する。あるいは、同様に測定した、初代培養軟骨細胞における相 対的 TGF /3 3プロモーター活性と比較して、同等以上である場合に、軟骨分化能を 有する細胞と判定する。
[0135] 前記の細胞 (採取した MSC)を TGF β 3(10ng/ml)添加軟骨分化誘導培地中、平板培 養にてさらに 3週間程度培養し、必要に応じて移植 3日前頃に前記と同じ判定を行い 、陽性となった細胞 1000万個程度を、軟骨欠損の患者に移植する。
産業上の利用可能性
[0136] 本発明により、ヒト MSCの軟骨細胞への分化マーカーが提供される。本発明の分化 マーカーである TGF /3 3は、軟骨へ分化誘導する細胞が特異的かつ早期に発現する 遺伝子であるため、 TGF /3 3の発現量を調べることにより、細胞移植治療に用いること の可能な MSCを早期に判定することができる。さらに本発明の TGF /3 3の発現量を調 ベることにより、移植直前の MSC細胞の品質評価も行うことができる。
図面の簡単な説明
[0137] [図 1]図 1は、軟骨分化誘導可能な AOCクローン、および軟骨分化誘導不可能な AO クローンにおける各遺伝子（COMP, TGF /3 3, DAP 3, KCNG)の発現を、 RT-PCRで 解析した結果を示す図である。 3次元培養 (図中、 3D culture : + )又は単層培養 (図中 、 3D culture :— )で、 TGF /3 3の添加有り (図中、 TGFB3： +)又は無し (図中、 TGFB3: 一)の条件で fiつた。
[図 2]図 2は、軟骨分化誘導可能な AOCクローン、および軟骨分化誘導不可能な AO クローンにおける TGF /3 3の発現を、定量的 RT-PCRで解析した結果を示す図である 。初代培養軟骨細胞での TGF β 3の値を 1とした相対値で示した。 単層培養 (図中左 の棒、分化誘導なし)もしくは 3次元培養 (図中右の棒、軟骨分化誘導時)の条件で、 培養を行った。 hBM49は、比較対照としている初代培養 MSCである。
[図 3]図 3は、軟骨分化誘導可能な AOCクローン、および軟骨分化誘導不可能な AO クローンにおける TGF /3 3の発現を、 RT-PCRで解析した結果を示す図である。単層 培養 (図中、 3D culture : -),もしくは 3次元培養 (図中、 3D culture : +)で、 TGF /3 3の添 加有り（図中、 TGFbeta3 : +)又は無し (図中、 TGFbeta3:—）、 TGF beta receptor type (I)リン酸化阻害剤の添加有り（図中、 SB431542： + )又は無し（図中、 SB431542:—） の条件で、培養を行った。
[図 4]図 4は、 MSC初代培養細胞（huBM43)における TGF /3 3の発現を、 RT-PCRで解 析した結果を示す図である。単層培養 (図中、 monolayer)もしくは 3次元培養 (図中、 3 D)で、 TGF /3 3の添加有り（図中、 +TGFb3)又は無し (図中、記載無し)、 TGF beta rece ptor typelリン酸化阻害剤の添加有り（図中、 SB431542 1 M)又は無し（図中、 DM SO)の条件で、培養を行った。
[図 5]図 5は、 MSC初代培養細胞（huBM43)における TGF /3 3の発現を、定量的 RT-P CRで解析した結果を示す図である。単層培養 (図中、 monolayer)もしくは 3次元培養（ 図中、 3D)で、 TGF /3 3の添加有り（図中、 +TGFb3)又は無し (図中、記載無し)、 TGF b eta receptor typelリン酸化阻害剤の添加有り（図中、 SB431542 1 M)又は無し（図 中、 DMSO)の条件で、培養を行った。 KS730Cは、比較対照として用いた軟骨細胞で ある。
[図 6]図 6は、 MSC初代培養細胞（huBM49)における TGF /3 3の発現を、 RT-PCRで解 析した結果を示す図である。単層培養 (図中、 monolayer)もしくは 3次元培養 (図中、 3 D)で、 TGF /3 3の添加有り (図中、 +TGFb3)又は無し (図中、記載無し)、 TGF beta rec eptor typelリン酸化阻害剤の添加有り（図中、 SB431542 1 M)又は無し（図中、 DM SO)の条件で、培養を行った。
[図 7]図 7は、 MSC初代培養細胞（huBM49)における TGF /3 3の発現を、定量的 RT-P CRで解析した結果を示す図である。単層培養 (図中、 monolayer)もしくは 3次元培養（ 図中、 3D)で、 TGF /3 3の添加有り（図中、 +TGFb3)又は無し (図中、記載無し)、 TGF b eta receptor typelリン酸化阻害剤の添加有り（図中、 SB431542 1 M)又は無し（図 中、 DMSO)の条件で、培養を行った。 KS730Cは、比較対照として用いた軟骨細胞で ある。
[図 8]図 8は、軟骨分化誘導可能な細胞株、および軟骨分化誘導不可能な細胞株に おいて軟骨分化誘導時の TGF β 3の発現と GAGの産生量の相関を比較したグラフで ある。 TGF β 3の発現値は初代培養軟骨細胞での TGF β 3の値を 1とした相対値で示 し、 GAG産生量は DNA量で補正した相対値である。
[図 9]図 9は、ドナー由来の MSC初代培養細胞における、軟骨分化誘導時の TGF /3 3 の発現と GAGの産生量の相関を比較したグラフである。 TGF /3 3の発現値は軟骨初 代培養における TGF /3 3の値を 1とした相対値で示し、 GAG産生量は DNA量で補正し た相対値である。
[図 10]図 10は、 p53KOマウス由来関節軟骨細胞株である MMA2における各遺伝子（ Tgft3，Col2al，Col9al，Agc，PAI-l)の発現を、 RT-PCRで解析した結果を示す図であ る。 3次元培養で TGF β 3の添加有り（図中、 TGF beta3)、 TGF beta receptor typelリ ン酸化阻害剤の添加有り（図中、 SB431542 1 M)、又は無し (図中、 DMSO)、の条件 で、培養を行った。
[図 11]図 11は、 TGF /3 3の発現調節領域とルシフェラーゼ遺伝子とを含むレポータ 一ベクターを用いてルシフェラーゼアツセィを行った結果を示すグラフである。図中 (a
)，(c)，(e)，(g)は各レポーターベクターの構築図を、また (b)，(d)，(f)，(h)はルシフェラーゼァ ッセィの結果を示す。図 (a)および (b)は TGF /3 3の responsive elementを AOCクローン を用いて調べた結果を示す。また図 (c)〜(h)は、 TGF /3 3または阻害剤 (SB431542)を 添加した場合の各細胞（図 (c)及び (d) :AOCクローン、（e)及び (ί) : AOクローン、（g)及 び (h)：初代培養 MSC)におけるルシフェラーゼ活性を調べた結果を示す。図中「SBE 」は TGF βシグナル伝達を担う転写因子である smadの結合部位を示す。「+TGFb3」 は TGF /3 3を添加した場合を、また「+SB431542」は TGF /3 3および SB431542を添加し た場合を示す。ルシフェラーゼアツセィの結果は、 TGF /3 3発現調節領域を含まない 空ベクター (PGV-Bベクター)におけるルシフェラーゼ活性を 1とした場合の相対値で 示した。
配列表フリーテキスト [0138] 配列番号： 3〜配列番号： 31に記載の塩基配列は PCRプライマーである。

Claims

請求の範囲
[1] TGF β 3(transforming growth factor-beta 3)遺伝子の塩基配列における、連続する 少なくとも 18塩基からなるポリヌクレオチド及び/または該ポリヌクレオチドに相補的 なポリヌクレオチドを含有する、間葉系幹細胞の軟骨細胞分化マーカー。
[2] TGF β 3遺伝子が配列番号： 1に記載の塩基配列からなる遺伝子である、請求項 1 記載の分化マーカー。
[3] プライマーまたはプローブとして使用される、請求項 1または 2記載の分化マーカー
〇
[4] 下記の工程 (a)、（b)及び (c)を含む、間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化能の測定方 法：
(a)被験用の間葉系幹細胞から調製された RNAまたはそれから転写された相補的ポ リヌクレオチドと、請求項 1〜3いずれか記載の分化マーカーとを結合させる工程、
(b)各分化マーカーに結合した、間葉系幹細胞由来の RNAまたは該 RNAから転写さ れた相補的ポリヌクレオチドの量を測定する工程、
(c)上記 (b)の測定結果に基づいて、間葉系幹細胞が軟骨細胞への分化能を有する か否力、を判断する工程。
[5] RT-PCR法により行われる、請求項 4記載の測定方法。
[6] 移植に用いる間葉系幹細胞の品質評価のために行われる、請求項 4または 5記載 の測定方法。
[7] 請求項;!〜 3いずれか記載の分化マーカーを成分として含有する、間葉系幹細胞 の軟骨細胞への分化能測定用キット。
[8] TGF 13 3に特異的に結合する抗体を含有する、間葉系幹細胞の軟骨細胞分化マ 一力一。
[9] TGF β 3が配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項 8記 載の分化マーカー。
[10] 下記の工程 (a)、（b)及び (c)を含む、間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化能の測定方 法：
(a)被験用の間葉系幹細胞由来のタンパク質と請求項 8または 9記載の分化マーカ 一とを結合させる工程、
(b)各分化マーカーに結合した、間葉系幹細胞由来のタンパク質の量を測定するェ 程、
(c)上記 (b)の測定結果に基づいて、間葉系幹細胞が軟骨細胞への分化能を有する か否力、を判断する工程。
[11] ELISA法により行われる、請求項 10記載の測定方法。
[12] 移植に用いる間葉系幹細胞の品質評価のために行われる、請求項 10または 11記 載の測定方法。
[13] 請求項 8または 9記載の分化マーカーを成分として含有する、間葉系幹細胞の軟 骨細胞への分化能測定用キット。
[14] TGF β 3の発現調節領域とレポーター遺伝子とを含有するベクターよりなる、間葉系 幹細胞の軟骨細胞分化マーカー。
[15] TGF 13 3の発現調節領域が配列番号： 32に記載の塩基配列を含有する、請求項 1
4記載の分化マーカー。
[16] レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である、請求項 14または 15記載の分化 マーカー。
[17] 下記の工程 (a)、（b)及び (c)を含む、間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化能の測定方 法：
(a)被験用の間葉系幹細胞に請求項 14〜； 16いずれか記載の分化マーカーを導入 する工程、
(b)各分化マーカーが含有するレポーター遺伝子の発現量を測定する工程、
(c)上記 (b)の測定結果に基づいて、間葉系幹細胞が軟骨細胞への分化能を有する か否力、を判断する工程。
[18] 移植に用いる間葉系幹細胞の品質評価のために行われる、請求項 17記載の測定 方法。
[19] 請求項 14〜； 16いずれか記載の分化マーカーを成分として含有する、間葉系幹細 胞の軟骨細胞への分化能測定用キット。
[20] 間葉系幹細胞から軟骨細胞への分化能を測定するための、 TGF β 3遺伝子の塩基 配列における、連続する少なくとも 18塩基を含有するポリヌクレオチド及び/または 該ポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドの使用。
[21] TGF β 3遺伝子が配列番号： 1に記載の塩基配列からなる遺伝子である、請求項 2 0記載の使用。
[22] 間葉系幹細胞から軟骨細胞への分化能を測定するための、 TGF β 3に特異的に結 合する抗体の使用。
[23] TGF β 3が配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項 22 記載の使用。
[24] 間葉系幹細胞から軟骨細胞への分化能を測定するための、 TGF β 3の発現調節領 域とレポーター遺伝子とを含有するベクターの使用。
[25] TGF β 3の発現調節領域が配列番号： 32に記載の塩基配列を含有する、請求項 2
4記載の使用。
[26] レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である、請求項 24または 25記載の使用
〇
[27] 間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化能を測定するための、請求項 7、 13または 19 記載のキットの使用。
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