JP2011506274A - ファスチンを阻害するための方法 - Google Patents

ファスチンを阻害するための方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、ファスチンを阻害するのに有用な組成物および方法に関する。これらの組成物および方法を用い、ファスチン関連疾患が阻害されうる。例えば、本発明によると、ファスチンの阻害は哺乳動物における腫瘍細胞の転移を阻害する。本発明の一態様は、ファスチンの発現および／または活性を阻害する方法であって、有効量のファスチン阻害剤を、ファスチンを発現している細胞に投与し、それによって細胞内でのファスチンの発現または活性を阻害するステップを含む方法である。

Description

政府の資金支援
本願に説明される本発明は、国防省（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｆｅｎｓｅ）助成金番号ＢＣ０５０５５８からの資金を使用してなされた。米国政府は本発明における特定の権利を有する。
関連出願の相互参照
本願は、２００７年１１月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／９８９，６０９号明細書の出願日の優先権を主張するものであり、その内容はその全体が具体的に参照により本明細書中に援用される。
本願はまた、２００４年３月２６日に出願された米国特許出願第１０／５５１１５２号明細書、２００４年３月２６日に出願された米国特許出願第１０／５５１１５８号明細書、２００４年３月２６日に出願されたＰＣＴ出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／０９３８０号明細書、２００３年３月２８日に出願された米国仮特許出願第６０／４５８，８２７号明細書に関する。上に参照される出願の各々の内容全体は、それら全体が具体的に参照により本明細書中に援用される。
本発明は、ファスチンの発現および／または活性を阻害するための新規組成物および方法に関する。本発明によると、ファスチンのかかる阻害は、癌細胞の転移を含む細胞遊走の阻害につながる。本発明はまた、ファスチンの発現および／または活性を調節する作用物質を同定するための方法に関する。
癌患者の治療を目的とした診断および治療の双方の様式において有意な改善が認められるが、腫瘍転移は依然として癌における死亡率の主因である。転移は、原発性腫瘍がその初期部位から二次組織または器官へ広がる多段階プロセスである。この転移性プロセスは、細胞遊走／浸潤、塞栓、循環系における生存、遠隔の毛細管床における停止、ならびに器官柔組織への溢出およびその内部での増殖を行うことができる細胞に対して選択的である。腫瘍の広がりが癌患者の死亡の大部分に関与することから、腫瘍転移を阻害する治療剤の開発が極めて望ましい。
本発明は、ファスチンの発現および／または活性を阻害する方法に関する。ファスチンは、運動性細胞においてＦ−アクチンポリマーを束化し、高度に動的な膜突起にする。これらのアクチンベースの架橋された突起は、運動性細胞（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｏｂｉｌｉｔｙ）の先端部が外部へ延長することを支持する。本明細書中で例示されるように、高度に侵襲性の乳房腫瘍細胞内でのファスチンの発現のノックダウンにより、転移癌の動物モデルのインビトロおよびインビボ双方における細胞遊走および浸潤が阻害される。本発明は、ファスチンの発現および／または活性を調節する作用物質を提供する。かかる作用物質は、転移癌を含む、ファスチンの発現および／または活性に関連した疾患および症状を治療し、阻害するのに有用である。
したがって、本発明の一態様は、ファスチンの発現および／または活性を阻害する方法であって、有効量のファスチン阻害剤を、ファスチンを発現している細胞に投与し、それによって細胞内でのファスチンの発現または活性を阻害するステップを含む方法である。例えば、ファスチン阻害剤は、配列番号２、４、６もしくは８からなるファスチンＲＮＡもしくはＤＮＡに特異的に結合する阻害性核酸（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、小分子、ファスチンポリペプチド断片、またはファスチンに特異的に結合する抗体でありうる。
一部の実施形態では、ファスチン阻害剤は、配列番号２、４、６もしくは８からなるファスチンＲＮＡもしくはＤＮＡに特異的に結合する阻害性核酸である。阻害性核酸は、配列番号１３〜６２のいずれかでありうる配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいはそれらの組み合わせでありうる。例えば、阻害性核酸は、阻害性核酸の発現を誘導可能な発現カセットを含む発現ベクターを投与することによって投与してもよい。
ファスチン阻害剤はまた、抗ファスチン抗体でありうる。例えば、抗体は、ファスチンアクチン結合部位へのアクチンの結合を遮断しうるか、またはファスチンアクチン結合部位に特異的に結合しうる。一部の実施形態では、ファスチンアクチン結合部位は、ファスチンアミノ酸Ｔｈｒ３２６、Ｓｅｒ３２８、Ｓｅｒ３２９、Ｌｙｓ３３０、Ａｓｎ３３１、Ｓｅｒ３３３、Ａｒｇ２７６、Ｇｌｎ２７７、Ｍｅｔ２７９、Ａｓｐ２８６、Ｇｌｕ２８７、Ｇｌｎ２９１、Ｔｈｒ３２０、Ｔｈｒ３１８、Ｌｙｓ３１３、Ｔｈｒ３１１、Ｇｌｎ３６２、Ａｓｎ３６０、Ｌｙｓ３５９、Ａｓｐ１６８、Ｐｒｏ１５９、Ａｒｇ１５１、Ｌｙｓ１５０、Ａｒｇ１４９、Ａｒｇ１９７、Ａｒｇ２０１、Ｇｌｕ２０７、Ｇｌｕ２２７、Ｓｅｒ２３７、Ｐｒｏ２３６、Ｌｙｓ２４１、Ｌｙｓ２４７、およびＬｙｓ２５０のいずれかを含む。他の実施形態では、ファスチンアクチン結合部位は、ファスチンアミノ酸Ｈｉｓ３９２、Ｇｌｕ３９１、Ａｌａ４８８、Ｌｙｓ４７１、Ｈｉｓ４７４およびＡｓｐ４７３のいずれかを含む。例えば、抗体は、ファスチンタンパク質に結合される場合、ファスチンアミノ酸Ｈｉｓ３９２およびＨｉｓ４７４の一方または両方へのアクチンの結合を遮断しうる。他の実施形態では、抗体は、ファスチンタンパク質に結合される場合、ファスチンアミノ酸Ｈｉｓ３９２およびＨｉｓ４７４の一方または両方に結合しうる。
一部の実施形態では、ファスチン阻害剤は、式Ｉ：
Figure 2011506274
 （式中、
ＸはＣＨ、Ｎ、ＮＨもしくはＯであり；
Ｒ１はＯＨ、ＣＺ３であるか、またはＲ１およびＲ２がともに−Ｃ＝Ｏであり（式中、Ｚはハロである）；
Ｒ２はＯＨ、ＣＺ３であるか、またはＲ１およびＲ２がともに−Ｃ＝Ｏであり（式中、Ｚはハロである）；
Ｒ３はＨまたは低級アルキルであり；
Ｒ４はＨまたは低級アルキルであり；
Ｒ５はＯＨであり；
Ｒ６はアルキルオキシであり；
Ｙ１およびＹ２は別々に−ＣＨ２−であるか、またはＹ１およびＹ２がともに−Ｃ＝Ｃ−もしくは薬学的に許容されうるその塩を形成する）
の化合物である。使用されうる化合物の例として、次の化合物のいずれか１つまたはかかる化合物の組み合わせが挙げられる。
Figure 2011506274
 一部の実施形態では、ファスチン阻害剤は、式Ｉのマイグラスタチン類似体ではなく、かつ化合物７、８、１３、１４もしくは２０ではない。
細胞は動物、例えばヒトにおけるものである。かかる動物またはヒトは、疾患または症状、例えばファスチンの発現または過剰発現を伴う疾患に罹患している可能性がある。疾患または症状は、例えば、転移癌、神経疾患、神経変性、炎症状態、ウイルス感染、細菌感染、リンパ過形成、ホジキン病または虚血関連組織損傷（ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｌａｔｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｄａｍａｇｅ）でありうる。一部の実施形態では、癌は、上皮性悪性腫瘍（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、リンパ腫、肉腫、メラノーマ、星状細胞腫、中皮腫細胞、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、結腸癌、膵癌、食道癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、尿癌（ｕｒｉｎａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膀胱癌（ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、白血病、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、結腸癌、中枢神経系癌、メラノーマ、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）、腎癌または前立腺癌でありうる。
本発明の別の態様は、ファスチンの阻害剤を同定する方法であって、ａ）ファスチン配列を有する少なくとも１つのタンパク質またはペプチドを、少なくとも１つの試験作用物質と、成分を相互作用させるのに十分な時間接触させるステップと、ｂ）ファスチン配列を有する少なくとも１つのタンパク質またはペプチドと試験作用物質の間に結合が生じているか否かを判定するステップと、を含み、ここでファスチン配列を有する少なくとも１つのタンパク質またはペプチドと試験作用物質の間の結合が、試験作用物質が癌転移の阻害剤であることを示唆する、方法である。例えば、試験作用物質は、ファスチンアクチン結合部位へのアクチンの結合を遮断しうるか、またはファスチンアクチン結合部位に結合しうる。ファスチンアクチン結合部位は、ファスチンアミノ酸Ｔｈｒ３２６、Ｓｅｒ３２８、Ｓｅｒ３２９、Ｌｙｓ３３０、Ａｓｎ３３１、Ｓｅｒ３３３、Ａｒｇ２７６、Ｇｌｎ２７７、Ｍｅｔ２７９、Ａｓｐ２８６、Ｇｌｕ２８７、Ｇｌｎ２９１、Ｔｈｒ３２０、Ｔｈｒ３１８、Ｌｙｓ３１３、Ｔｈｒ３１１、Ｇｌｎ３６２、Ａｓｎ３６０、Ｌｙｓ３５９、Ａｓｐ１６８、Ｐｒｏ１５９、Ａｒｇ１５１、Ｌｙｓ１５０、Ａｒｇ１４９、Ａｒｇ１９７、Ａｒｇ２０１、Ｇｌｕ２０７、Ｇｌｕ２２７、Ｓｅｒ２３７、Ｐｒｏ２３６、Ｌｙｓ２４１、Ｌｙｓ２４７、およびＬｙｓ２５０を含みうる。他の実施形態では、ファスチンアクチン結合部位は、ファスチンアミノ酸Ｈｉｓ３９２、Ｇｌｕ３９１、Ａｌａ４８８、Ｌｙｓ４７１、Ｈｉｓ４７４およびＡｓｐ４７３を含みうる。例えば、試験作用物質は、ファスチンタンパク質に結合される場合、ファスチンアミノ酸Ｈｉｓ３９２およびＨｉｓ４７４の一方または両方へのアクチンの結合を遮断しうる。他の実施形態では、試験作用物質は、ファスチンタンパク質に結合される場合、ファスチンアミノ酸Ｈｉｓ３９２およびＨｉｓ４７４の一方または両方に結合する。本方法は、ファスチンに対する試験作用物質の結合定数を判定するステップをさらに含みうる。本方法はまた、試験作用物質がファスチン媒介性アクチン束形成を阻害するか否かを判定するステップを含みうる。例えば、使用されるアクチンは、Ｆ−アクチンでありうる。
本発明の別の態様は、ファスチンの阻害剤を同定するための方法であって、ａ）表２に従い、ファスチンアミノ酸Ｔｈｒ３２６、Ｓｅｒ３２８、Ｓｅｒ３２９、Ｌｙｓ３３０、Ａｓｎ３３１、Ｓｅｒ３３３、Ａｒｇ２７６、Ｇｌｎ２７７、Ｍｅｔ２７９、Ａｓｐ２８６、Ｇｌｕ２８７、Ｇｌｎ２９１、Ｔｈｒ３２０、Ｔｈｒ３１８、Ｌｙｓ３１３、Ｔｈｒ３１１、Ｇｌｎ３６２、Ａｓｎ３６０、Ｌｙｓ３５９、Ａｓｐ１６８、Ｐｒｏ１５９、Ａｒｇ１５１、Ｌｙｓ１５０、Ａｒｇ１４９、Ａｒｇ１９７、Ａｒｇ２０１、Ｇｌｕ２０７、Ｇｌｕ２２７、Ｓｅｒ２３７、Ｐｒｏ２３６、Ｌｙｓ２４１、Ｌｙｓ２４７、およびＬｙｓ２５０におけるファスチン原子座標からファスチン結合部位の三次元構造画像を生成するステップであって、前記アミノ酸の骨格原子からの±ａ二乗平均平方根偏差は１．５オングストローム以下であるステップと、ｂ）有望な阻害剤をファスチン結合部位内部に存在するように設計または選択し、それによりファスチンの阻害剤を同定するステップと、を含む方法である。
本発明の別の態様は、ファスチンの阻害剤を同定するための方法であって、ａ）表２に従い、ファスチンアミノ酸Ｈｉｓ３９２、Ｇｌｕ３９１、Ａｌａ４８８、Ｌｙｓ４７１、Ｈｉｓ４７４およびＡｓｐ４７３におけるファスチン原子座標からファスチン結合部位の三次元構造画像を生成するステップであって、前記アミノ酸の骨格原子からの±ａ二乗平均平方根偏差は１．５オングストローム以下であるステップと、ｂ）有望な阻害剤をファスチン結合部位内部に存在するように設計または選択し、それによりファスチンの阻害剤を同定するステップと、を含む方法である。
かかる方法は、有望な阻害剤を合成または入手するステップと、有望な阻害剤をファスチンと接触させるステップと、有望な阻害剤がファスチンに結合するか否かを確認するステップと、をさらに含みうる。一部の実施形態では、有望な阻害剤は、約８オングストローム×約１０オングストローム×約１０オングストローム以下である。
一部の実施形態では、本方法は、データセットとしてファスチン原子座標を含むコンピュータシステムを使用して実施される。同定されるファスチンの阻害剤は転移癌の阻害剤でありうる。
本発明の別の態様は、表２のファスチン原子座標を含む機械読取り可能記憶媒体（ｍａｃｈｉｎｅ ｒｅａｄａｂｌｅ ｓｔｏｒａｇｅ ｍｅｄｉｕｍ）である。一部の実施形態では、機械読取り可能記憶媒体は、表２による、ファスチンアミノ酸Ｔｈｒ３２６、Ｓｅｒ３２８、Ｓｅｒ３２９、Ｌｙｓ３３０、Ａｓｎ３３１、Ｓｅｒ３３３、Ａｒｇ２７６、Ｇｌｎ２７７、Ｍｅｔ２７９、Ａｓｐ２８６、Ｇｌｕ２８７、Ｇｌｎ２９１、Ｔｈｒ３２０、Ｔｈｒ３１８、Ｌｙｓ３１３、Ｔｈｒ３１１、Ｇｌｎ３６２、Ａｓｎ３６０、Ｌｙｓ３５９、Ａｓｐ１６８、Ｐｒｏ１５９、Ａｒｇ１５１、Ｌｙｓ１５０、Ａｒｇ１４９、Ａｒｇ１９７、Ａｒｇ２０１、Ｇｌｕ２０７、Ｇｌｕ２２７、Ｓｅｒ２３７、Ｐｒｏ２３６、Ｌｙｓ２４１、Ｌｙｓ２４７、およびＬｙｓ２５０におけるファスチン原子座標を含み、ここで前記アミノ酸の骨格原子からの±ａ二乗平均平方根偏差は１．５オングストローム以下である。他の実施形態では、機械読取り可能記憶媒体は、表２による、ファスチンアミノ酸Ｈｉｓ３９２、Ｇｌｕ３９１、Ａｌａ４８８、Ｌｙｓ４７１、Ｈｉｓ４７４およびＡｓｐ４７３におけるファスチン原子座標を含み、ここで前記アミノ酸の骨格原子からの±ａ二乗平均平方根偏差は１．５オングストローム以下である。あるいは、機械読取り可能記憶媒体は、両方のファスチンアクチン部位における原子座標を含みうる。
本発明の別の態様は、配列番号２、４、６もしくは８からなるファスチンＲＮＡもしくはＤＮＡに特異的に結合する阻害性核酸、小分子、ファスチンポリペプチド断片、またはファスチンに特異的に結合する抗体を含むファスチン阻害剤である。例えば、阻害性核酸は、配列番号１３〜６２のいずれかからなるＲＮＡまたはＤＮＡでありうる。一部の実施形態では、阻害性核酸は、ファスチン阻害性核酸の発現を誘導する発現カセットを含む発現ベクター内で発現される。抗体は、例えば、ファスチンアクチン結合部位に特異的に結合しうるか、またはファスチンアクチン結合部位へのアクチンの結合を遮断し、ここでアクチン結合部位はファスチンアミノ酸Ｔｈｒ３２６、Ｓｅｒ３２８、Ｓｅｒ３２９、Ｌｙｓ３３０、Ａｓｎ３３１、Ｓｅｒ３３３、Ａｒｇ２７６、Ｇｌｎ２７７、Ｍｅｔ２７９、Ａｓｐ２８６、Ｇｌｕ２８７、Ｇｌｎ２９１、Ｔｈｒ３２０、Ｔｈｒ３１８、Ｌｙｓ３１３、Ｔｈｒ３１１、Ｇｌｎ３６２、Ａｓｎ３６０、Ｌｙｓ３５９、Ａｓｐ１６８、Ｐｒｏ１５９、Ａｒｇ１５１、Ｌｙｓ１５０、Ａｒｇ１４９、Ａｒｇ１９７、Ａｒｇ２０１、Ｇｌｕ２０７、Ｇｌｕ２２７、Ｓｅｒ２３７、Ｐｒｏ２３６、Ｌｙｓ２４１、Ｌｙｓ２４７、およびＬｙｓ２５０を含む。他の実施形態では、抗体は、ファスチンアクチン結合部位に特異的に結合しうるか、またはファスチンアクチン結合部位へのアクチンの結合を遮断し、ここでアクチン結合部位はファスチンアミノ酸Ｈｉｓ３９２、Ｇｌｕ３９１、Ａｌａ４８８、Ｌｙｓ４７１、Ｈｉｓ４７４およびＡｓｐ４７３を含む。例えば、抗体は、ファスチンアミノ酸２５９〜４９３を含む配列を有するポリペプチドを使用して生成されうる。あるいは、例えば、抗体は、配列番号９、１０および／もしくは１２を有するポリペプチドを使用して生成されうる。ファスチン阻害剤であるファスチンポリペプチド断片は、ファスチンアミノ酸Ｔｈｒ３２６、Ｓｅｒ３２８、Ｓｅｒ３２９、Ｌｙｓ３３０、Ａｓｎ３３１、Ｓｅｒ３３３、Ａｒｇ２７６、Ｇｌｎ２７７、Ｍｅｔ２７９、Ａｓｐ２８６、Ｇｌｕ２８７、Ｇｌｎ２９１、Ｔｈｒ３２０、Ｔｈｒ３１８、Ｌｙｓ３１３、Ｔｈｒ３１１、Ｇｌｎ３６２、Ａｓｎ３６０、Ｌｙｓ３５９、Ａｓｐ１６８、Ｐｒｏ１５９、Ａｒｇ１５１、Ｌｙｓ１５０、Ａｒｇ１４９、Ａｒｇ１９７、Ａｒｇ２０１、Ｇｌｕ２０７、Ｇｌｕ２２７、Ｓｅｒ２３７、Ｐｒｏ２３６、Ｌｙｓ２４１、Ｌｙｓ２４７、およびＬｙｓ２５０を有するペプチドを含みうる。あるいは、例えば、ファスチン阻害剤であるファスチンポリペプチド断片は、ファスチンアミノ酸Ｈｉｓ３９２、Ｇｌｕ３９１、Ａｌａ４８８、Ｌｙｓ４７１、Ｈｉｓ４７４およびＡｓｐ４７３を含みうる。したがって、本発明によると、ファスチンポリペプチド断片は、ファスチンアミノ酸２５９〜４９３、または配列番号９、１０および／もしくは１２を有するファスチンポリペプチドからなりうる。
本発明の別の態様は、患者における転移癌を治療または阻害する方法であって、患者に本発明のファスチン阻害剤を投与するステップを含む方法である。
本発明の別の態様は、薬剤の製造におけるファスチン阻害剤の使用を含む。例えば、薬剤は、転移癌、神経疾患、神経変性、炎症状態、ウイルス感染、細菌感染、リンパ過形成、ホジキン病または虚血関連組織損傷の治療を目的として使用されうる。一部の実施形態では、薬剤は、哺乳動物における転移癌または癌細胞の治療または阻害を目的として使用される。
コア大環状ケトン（ｍａｃｒｏｋｅｔｏｎｅ）およびコア大環状ラクタム（ｍａｃｒｏｌａｃｔａｍ）によるマウス乳房腫瘍４Ｔ１の細胞遊走の阻害。マイグラスタチン、コア大環状ケトン、およびコア大環状ラクタムの化学構造。 コア大環状ケトンおよびコア大環状ラクタムによるマウス乳房腫瘍４Ｔ１の細胞遊走の阻害。創傷治癒アッセイは、コア大環状ケトン（２μＭ）および大環状ラクタム（２μＭ）が血清によって誘発されるマウス乳房腫瘍４Ｔ１細胞の遊走を阻害することを示した。 コア大環状ケトンおよびコア大環状ラクタムによるマウス乳房腫瘍４Ｔ１の細胞遊走の阻害。４Ｔ１細胞の血清誘発性遊走に対する様々な濃度のコア大環状ケトンの効果のチャンバーアッセイ。データは３つの実験の平均±ＳＤを示す。 コア大環状ケトンおよびコア大環状ラクタムによるマウス乳房腫瘍４Ｔ１の細胞遊走の阻害。４Ｔ１細胞の血清誘発性遊走に対する様々な濃度のコア大環状ラクタムの効果のチャンバーアッセイ。データは３つの実験の平均±ＳＤを示す。 コア大環状ケトンおよびコア大環状ラクタムによるヒト腫瘍細胞遊走の阻害。創傷治癒アッセイは、コア大環状ケトン（２０μＭ）および大環状ラクタム（２０μＭ）が血清によって誘発されるヒト乳房腫瘍ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の遊走を阻害することを示した。 コア大環状ケトンおよびコア大環状ラクタムによるヒト腫瘍細胞遊走の阻害。ヒト乳房、結腸、および前立腺腫瘍細胞の血清誘発性遊走に対するコア大環状ケトンおよびコア大環状ラクタムのＩＣ５０である。データは３つの実験を表す。 コア大環状ケトンおよびコア大環状ラクタムによるヒト腫瘍細胞遊走の阻害。創傷治癒アッセイは、コア大環状ケトン（２００μＭ）および大環状ラクタム（２００μＭ）が血清によって誘発されるマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）細胞の遊走に対する効果を全く有しないことを示した。 コア大環状ケトンおよびコア大環状ラクタムによるヒト腫瘍細胞遊走の阻害。ＭＥＦおよびヒト乳腺上皮ＭＣＦ−１０Ａ細胞の血清（１０％ＦＢＳ）誘発性遊走ならびに一次マウス白血球（好中球）のＮ−ホルミル−ペプチド誘発性（１００ｎＭ）遊走に対するコア大環状ケトンおよびコア大環状ラクタムのＩＣ５０である。データは３つの実験を表す。 マウスモデルにおけるコア大環状ケトンおよびコア大環状ラクタムによる乳房腫瘍転移の阻害。肺転移が６−チオグアニンクローン原性アッセイによって測定された。 マウスモデルにおけるコア大環状ケトンおよびコア大環状ラクタムによる乳房腫瘍転移の阻害。大環状ラクトンおよびマイグラスタチンセミコアの化学構造。 マウスモデルにおけるコア大環状ケトンおよびコア大環状ラクタムによる乳房腫瘍転移の阻害。マウスが死亡した日、腫瘍直径（ｍｍ）が電子キャリパー（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｃａｌｉｐｅｒ）で測定された。結果は平均±ＳＤ（ｎ＝５）。（＊，Ｐ＜０．０１）である。 大環状ケトン結合性タンパク質としてのファスチンの同定。ビオチンに複合された大環状ケトンコアの構造の略図。 大環状ケトン結合性タンパク質としてのファスチンの同定。親和性精製タンパク質のクマシー染色。４Ｔ１細胞の２００プレート（１０ｃｍ）からの全細胞溶解液がストレプトアビジンビーズで予め清浄化（ｐｒｅｃｌｅａｒ）された。予め清浄化された溶解物の半分がビオチンに複合された大環状ケトン（レーン１）、残りの半分がビオチン（レーン２）とともにインキュベートされた。ストレプトアビジンビーズの添加後、溶液はＰｏｌｙ−Ｐｒｅｐクロマトグラフィーカラムに移された。徹底洗浄後、結合されたタンパク質が溶出され、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析された。矢印はマウスｆａｓｃｉｎ １として同定されたバンドを示す。分子質量マーカーは左側に示される。 大環状ケトンに対する精製ファスチンの結合。精製ＧＳＴ−ファスチン（レーン２）およびＧＳＴ（レーン１）タンパク質のクマシー染色。 大環状ケトンに対する精製ファスチンの結合。ニュートラアビジンビーズがビオチンまたはビオチン−大環状ケトンと混合された。洗浄後、ＧＳＴまたはＧＳＴ−ファスチンが添加された。反応物は、室温で１時間インキュベートされた。３００ｍＭのＮａＣｌでの洗浄後、試料がＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析された。レーン５および６に、対照としてＧＳＴまたはＧＳＴ−ファスチンタンパク質が負荷された。上のパネルは抗−ＧＳＴ抗体でプローブされた。同じフィルタが抗ファスチン抗体で再プローブされた（下のパネル）。 大環状ケトンに対する精製ファスチンの結合。ファスチンに対する未標識大環状ケトンとビオチンに複合された大環状ケトンの競合。未標識大環状ケトンの量の増加（未標識大環状ケトン対ビオチンに複合された大環状ケトンのモル比が１：１および１０：１）により、ファスチンに対するビオチンに複合された大環状ケトンの結合が低下した。データは３〜５つの同様の実験を表す。 大環状ケトンはファスチンのアクチン束化活性を阻害する。低速共沈アッセイによるアクチン束化活性のアッセイ。重合Ｆ−アクチン（１ｍＭ）が、大環状ケトンの存在下または不在下で、０．１２５μＭまたは０．２５μＭの精製ファスチンとともにインキュベートされた。上清（Ｓ）またはペレット（Ｐ）が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、その後にクマシーブルー染色によって分析された。同様の結果を伴う５つの実験の代表例が示された。 大環状ケトンはファスチンのアクチン束化活性を阻害する。Ｆ−アクチン束化の蛍光顕微鏡法。Ｆ−アクチン（１ｍＭ）が、大環状ケトンの存在下または不在下で、ファスチン（０．１２５μＭ）とともにインキュベートされた。ローダミン−ファロイジンが添加され、アクチンフィラメントが標識された。試料が載せられ、蛍光顕微鏡法で画像化された。左パネル：ファスチンの不在下で、精製単量体Ｇアクチンが束を伴わずにＦ−アクチンに重合される。中間パネル：精製ファスチンの添加により、アクチンポリマーの太いフィラメントへの束化がもたらされる。右パネル：ファスチンと大環状ケトンとのプレインキュベーションにより、ファスチンがアクチンポリマーを束化する能力が低下し、その結果、太いフィラメントの数が減少した。５つの実験の代表例が示される。 大環状ケトンはファスチンのアクチン束化活性を阻害する。蛍光顕微鏡法に基づくＦ−アクチン束化アッセイの定量。結果は平均±ＳＤ（ｎ＝５，・，ｐ＜０．０５）である。 大環状ケトンはファスチンのアクチン束化活性を阻害する。大環状ケトンの存在下または不在下でのファスチン誘発性Ｆ−アクチン束の電子顕微鏡法。Ｆ−アクチン（１ｍＭ）は、大環状ケトンの存在下または不在下でファスチン（０．１２５μＭ）とともにインキュベートされた。電子顕微鏡写真がＦ−アクチン束の逆染色法によって得られた。代表的画像が示された。 大環状ケトンはファスチンのアクチン束化活性を阻害する。ファスチンとアクチンの相互作用アッセイ。高速遠心分離を用い、Ｆ−アクチンポリマーをペレット化した。これらの条件下で、ファスチン単独が沈殿されず、ファスチンはＦ−アクチンポリマーへの結合によってのみプルダウン可能であった。（同量のＦ−アクチンポリマーが添加されることから）同等量のＦ−アクチンポリマーが大環状ケトンの不在下および存在下でペレット中に存在する一方、有意により少ないファスチンが大環状ケトンの存在下でＦ−アクチンによってプルダウンされた。 腫瘍細胞遊走におけるファスチンの役割。ファスチンｓｉＲＮＡがファスチンタンパク質の発現を低下させたことを示すウエスタンブロット。 腫瘍細胞遊走におけるファスチンの役割。対照ｓｉＲＮＡおよび２つのファスチンｓｉＲＮＡで処理された４Ｔ１細胞を使用するボイデン（Ｂｏｙｄｅｎ）チャンバー遊走アッセイ。ファスチンｓｉＲＮＡ処理により、４Ｔ１細胞の血清誘発性遊走が低下した。結果は平均±ＳＤ（ｎ＝５、ｐ＜０．０５）である。 腫瘍細胞遊走におけるファスチンの役割。マウスファスチンｓｉＲＮＡ２で処理され、大環状ケトンの存在下または不在下でヒト野生型ＧＦＰ−ファスチンが形質移入された４Ｔ１細胞のボイデンチャンバー遊走アッセイ。結果は平均±ＳＤ（ｎ＝５、ｐ＜０．０５）である。 腫瘍細胞遊走におけるファスチンの役割。ウエスタンブロットは、対照ｓｉＲＮＡ、ファスチンｓｉＲＮＡ２で処理された４Ｔ１細胞、またはマウスファスチンｓｉＲＮＡ２およびヒト野生型ＧＦＰ−ファスチンの双方が形質移入された細胞から調製された全細胞抽出物におけるファスチンタンパク質の発現レベルを示す。 腫瘍細胞遊走におけるファスチンの役割。ウエスタンブロットは、対照ｓｉＲＮＡおよび２つの異なるファスチンｓｉＲＮＡで処理されたヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から調製された全細胞抽出物におけるファスチンタンパク質の発現を示す。 腫瘍細胞遊走におけるファスチンの役割。対照ｓｉＲＮＡおよび２つのファスチンｓｉＲＮＡで処理されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を伴うボイデンチャンバー遊走アッセイ。ファスチンｓｉＲＮＡ処理により、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の血清誘発性遊走が低下した。結果は平均±ＳＤ（ｎ＝５、ｐ＜０．０５）である。 腫瘍細胞遊走におけるファスチンの役割。ウエスタンブロットは、非侵襲性ＭＣＦ−１０Ａおよび転移性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から調製された全細胞抽出物におけるファスチンタンパク質の発現を示す。 腫瘍細胞遊走におけるファスチンの役割。対照ベクターまたはＧＦＰ−ファスチンが形質移入されたＭＣＦ−１０Ａ細胞のチャンバー細胞遊走アッセイ。下部パネルはＭＣＦ−１０Ａ細胞内でのファスチンの過剰発現を示す。結果は平均±ＳＤ（ｎ＝５、ｐ＜０．０５）である。 腫瘍細胞遊走におけるファスチンの役割。大環状ケトンの存在下または不在下でＧＦＰ−ヒトファスチン（ｈ−ファスチン）の様々な突然変異体で形質移入された、マウスファスチンｓｉＲＮＡ２で処理された４Ｔ１細胞のチャンバー細胞遊走アッセイ。下部パネルは、マウスファスチンｓｉＲＮＡ２で処理された４Ｔ１細胞内での様々なファスチン突然変異体の過剰発現を示す。結果は平均±ＳＤ（ｎ＝５、ｐ＜０．０５）である。 腫瘍転移におけるファスチンの役割。対照ｓｉＲＮＡおよび２つの異なるファスチンｓｉＲＮＡで処理された４Ｔ１細胞を伴うインビトロマトリゲル浸潤アッセイ。ファスチンｓｉＲＮＡ処理により、４Ｔ１細胞の血清誘発性浸潤が低下した。結果は平均±ＳＤ（ｎ＝５、ｐ＜０．０５）である。 腫瘍転移におけるファスチンの役割。対照ｓｉＲＮＡおよび２つのファスチンｓｉＲＮＡを発現する４Ｔ１細胞の原発性乳房腫瘍の成長。結果は平均±ＳＤである。 腫瘍転移におけるファスチンの役割。対照ｓｉＲＮＡおよび２つのファスチンｓｉＲＮＡを発現する４Ｔ１細胞の注射後４週間における原発性乳房腫瘍重量。 腫瘍転移におけるファスチンの役割。対照ｓｉＲＮＡおよび２つのファスチンｓｉＲＮＡを発現する４Ｔ１細胞の注射後４週間における各マウスの肺における転移性コロニーの総数。 腫瘍転移におけるファスチンの役割。対照ｓｉＲＮＡおよび２つのファスチンｓｉＲＮＡを発現するヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の注射後の表示日でのマウスの代表的な非侵襲的生物発光画像。 腫瘍転移におけるファスチンの役割。対照ｓｉＲＮＡおよび２つのファスチンｓｉＲＮＡを発現するヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の注射後の表示日でのマウスの非侵襲的生物発光画像の正規化した光子束。結果は平均±ＳＤである。 腫瘍転移におけるファスチンの役割。腫瘍組織の組織学的分析。左パネルは、図８Ｅからの肺の代表的なＨおよびＥ染色である。右パネルは、図８Ｅからの肺の代表的なＧＦＰイメージングである。 腫瘍転移におけるファスチンの役割。大環状ケトンの存在下または不在下でのヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の注射後の表示日でのマウスの非侵襲的生物発光画像の正規化した光子束。結果は平均±ＳＤである。 ヒト乳癌患者におけるファスチンの発現の増大。正常および乳房腫瘍試料におけるファスチンｍＲＮＡの相対的発現レベル。 ヒト乳癌患者におけるファスチンの発現の増大。正常な胸部組織試料、エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳房腫瘍およびＥＲ陰性乳房腫瘍におけるファスチンｍＲＮＡの相対的発現レベル。 ヒト乳癌患者におけるファスチンの発現の増大。正常な胸部組織試料、プロゲステロン受容体（ＰＲ）陽性乳房腫瘍およびＰＲ陰性乳房腫瘍におけるファスチンｍＲＮＡの相対的発現レベル。 ヒト乳癌患者におけるファスチンの発現の増大。ＥＲ陽性およびＥＲ陰性乳房腫瘍試料のファスチン免疫組織学的染色の代表的画像。 ヒト乳癌患者におけるファスチンの発現の増大。高いファスチンの発現（ｌｏｇ１０＞０．１）または低いファスチンの発現を有する患者の全生存率のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析。 ヒト乳癌患者におけるファスチンの発現の増大。高いファスチンの発現（ｌｏｇ１０＞０．１）または低いファスチンの発現を有する患者の無転移生存率のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析。 ヒト乳癌患者におけるファスチンの発現の増大。ＥＲ陽性およびＥＲ陰性乳癌試料のＲｏｓｅｔｔａマイクロアレイデータセットにおけるファスチンｍＲＮＡの相対的発現レベル。 ヒト乳癌患者におけるファスチンの発現の増大。ＰＲ陽性およびＰＲ陰性乳癌試料のＲｏｓｅｔｔａマイクロアレイデータセットにおけるファスチンｍＲＮＡの相対的発現レベル。 ファスチンおよびファスチンと大環状ケトンの複合体の全体構造。左パネルは、ＮおよびＣ末端側から見た、リボンの略図として示される、大環状ケトンの不在下でのファスチンの構造である。４つのβ−トレフォイルドメインは、赤、黄、緑および青に着色される。 ファスチンおよびファスチンと大環状ケトンの複合体の全体構造。右パネルは、左パネルがｙ軸に対して時計回りに９０°回転された構造である。 ファスチンおよびファスチンと大環状ケトンの複合体の全体構造。大環状ケトンがトレフォイル−１の表面に結合している、ファスチンと大環状ケトンの複合体の全体構造。 ファスチンに対する大環状ケトン結合部位。ファスチン上の大環状ケトン結合部位を示す、３σでのＦｏｂｓ−Ｆｃａｌｃの等高線図。 ファスチンに対する大環状ケトン結合部位。ファスチン残基と大環状ケトンの間の分子相互作用。 ファスチンに対する大環状ケトン結合部位。大環状ケトンの不在下（赤）および存在下（黒）でのファスチン分子のα炭素の重ね合わせ。 ファスチンに対する大環状ケトン結合部位。大環状ケトンの結合によって誘発される局所構造変化。大環状ケトンの不在下でのファスチンの構造は灰色で示される。原文では、大環状ケトンを有するファスチンの構造は緑、赤および青で示される。同様に、原文では、大環状ケトンの構造はシアンおよび赤で示される。 ファスチン上のアクチン結合部位。突然変異誘発試験は、ファスチンのＮおよびＣ末端の双方がアクチンの結合に寄与することを示した。 ファスチン上のアクチン結合部位。突然変異誘発試験は、ファスチンのＮおよびＣ末端の双方がアクチンの結合に寄与することを示した。 ファスチン上のアクチン結合部位。２９〜４２の残基は、配列がＭＡＲＣＫＳ上のアクチン結合部位に類似する。 ファスチン上のアクチン結合部位。Ｓｅｒ２９のタンパク質キナーゼＣリン酸化がファスチンのアクチン束化活性を阻害した。 ファスチン上のアクチン結合部位。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）における遺伝子スクリーニングにより、ファスチンのアクチン束化活性を低下（Ｇｌｙの突然変異）または排除（Ｓｅｒの突然変異）する２つの変異体が同定された。Ｓｅｒ２７４が同モデルのこの特定の表示に対する反対側にあることから、Ｓｅｒ２７４近傍の残基（Ｇｌｎ２７７−Ａｓｐ２８０）が同位置を示すことが示される。 大環状ケトン結合部位はアクチン結合部位の１つと重なる。大環状ケトンの結合に関与する残基Ｈｉｓ３９２およびＨｉｓ４７４は青で示された。アクチンの結合に関与する他の残基は、オレンジ（Ｎ末端ドメイン）、ライトブルー（Ｓｅｒ３９）、または赤（Ｇｌｙ３９３）で示された。 大環状ケトン結合部位はアクチン結合部位の１つと重なる。フィンブリンおよびアクチンフィラメントのクライオＥＭモデルに基づき、ファスチンおよび２つのアクチンフィラメントのモデルが提起される。 大環状ケトンの結合およびアクチン束化に関与する残基の突然変異誘発試験。精製ファスチンおよびその突然変異体タンパク質のクマシーブルー染色。 大環状ケトンの結合およびアクチン束化に関与する残基の突然変異誘発試験。野生型ファスチンおよびその突然変異体のアクチン束化アッセイ。 大環状ケトンの結合およびアクチン束化に関与する残基の突然変異誘発試験。大環状ケトンに対する感受性。野生型ファスチンＥ３９１Ａおよびファスチンの突然変異体Ｈ４７４Ａが、大環状ケトンの不在下または存在下でのそれらのアクチン束化活性についてアッセイされた。 図１６および１７の記憶媒体によってエンコードされる命令を実行するのに使用されるシステムの略図を示す。 磁気記憶媒体の横断面を示す。 光学的に読取り可能な（ｏｐｔｉｃａｌｌｙ−ｒｅａｄａｂｌｅ）データ記憶媒体の横断面を示す。
本発明は、ファスチンを阻害するための組成物および方法に関する。
定義
「有効量」は、一般に所望される効果を提供する量を意味する。例えば、有効用量は、有益であるかまたは所望される結果をもたらすのに十分な量である。用量は、１回以上の投与で投与されうる。何が有効用量であると考えられるかの正確な判定は、各被験体に固有の要素、例えばサイズ、年齢、治療される創傷（例えば欠陥）または疾患（例えば欠陥）、および創傷の発生または疾患の発症からの期間に基づく場合がある。当業者、特に医師であれば、有効用量を決定できるであろう。用量は、投与の形式、例えば、局所か全身か、計量式（ｆｒｅｅ）かカプセル化かに依存して変化しうる。効果は、転移の阻害または他の臨床エンドポイント、例えば転移癌の治療、減少または退縮でありうる。他の効果は、ファスチンｍＲＮＡの発現および／またはタンパク質レベルの低下または阻害を含みうる。
「ファスチンを発現する細胞（ｃｅｌｌ ｔｈａｔ ｅｘｐｒｅｓｓｅｓ ｆａｓｃｉｎ）」または「ファスチンを発現する細胞（ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｆａｓｃｉｎ）」は、ファスチンを発現する任意のヒトまたは動物細胞である。一部の実施形態では、細胞はファスチンを過剰発現する。かかる細胞は、例えば、癌細胞、ニューロン、免疫細胞、または抗原提示細胞でありうる。癌細胞は、本明細書中に記載の癌または腫瘍に関連した任意の癌または腫瘍細胞でありうる。例えば、癌細胞は、乳癌、卵巣癌、結腸癌、膵癌、食道癌、胃癌、肺癌、膀胱癌、上皮性悪性腫瘍、リンパ腫、肉腫、メラノーマ、または星状細胞腫の細胞でありうる。
本明細書で使用される用語「アクチン結合部位」は、アクチンがファスチンによって結合される２つの部位の中の１つを含むファスチンペプチドまたはファスチンペプチド模倣体を意味する。一方のファスチンアクチン結合部位は、ファスチンアミノ酸Ｔｈｒ３２６、Ｓｅｒ３２８、Ｓｅｒ３２９、Ｌｙｓ３３０、Ａｓｎ３３１、Ｓｅｒ３３３、Ａｒｇ２７６、Ｇｌｎ２７７、Ｍｅｔ２７９、Ａｓｐ２８６、Ｇｌｕ２８７、Ｇｌｎ２９１、Ｔｈｒ３２０、Ｔｈｒ３１８、Ｌｙｓ３１３、Ｔｈｒ３１１、Ｇｌｎ３６２、Ａｓｎ３６０、Ｌｙｓ３５９、Ａｓｐ１６８、Ｐｒｏ１５９、Ａｒｇ１５１、Ｌｙｓ１５０、Ａｒｇ１４９、Ａｒｇ１９７、Ａｒｇ２０１、Ｇｌｕ２０７、Ｇｌｕ２２７、Ｓｅｒ２３７、Ｐｒｏ２３６、Ｌｙｓ２４１、Ｌｙｓ２４７、およびＬｙｓ２５０を含む。他方のファスチンアクチン結合部位は、ファスチンアミノ酸Ｈｉｓ３９２、Ｇｌｕ３９１、Ａｌａ４８８、Ｌｙｓ４７１、Ｈｉｓ４７４およびＡｓｐ４７３を含む。
本明細書で使用される用語「マイグラスタチン類似体結合部位」は、マイグラスタチン類似体がファスチンによって結合される部位を含むファスチンペプチドまたはファスチンペプチド模倣体を意味する。マイグラスタチン結合部位は、ファスチンアミノ酸Ｈｉｓ３９２、Ｇｌｕ３９１、Ａｌａ４８８、Ｌｙｓ４７１、Ｈｉｓ４７４およびＡｓｐ４７３を含む。アクチンもまたこの部位に結合しうる。任意の特定の理論または機序に制約されるものではないが、マイグラスタチン類似体がマイグラスタチン結合部位に対するアクチンの結合を阻害すると考えられている。
本明細書で使用される用語「低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）」または「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡｉのメディエーター、すなわちヌクレオチド配列の同一性または類似性を共有する相手の特定の遺伝子の配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングを誘導可能なＲＮＡ分子を示す。一部の生物（例えば、シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）および様々な植物）では、これらのｓｉＲＮＡはより長いｄｓＲＮＡの核酸分解処理によって生成されうる。哺乳動物細胞では、それらはまた、短い（すなわち３０塩基対未満の）ヘアピンＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡから生成されうる。
本明細書で使用される用語「小さいヘアピンｓｉＲＮＡ」、「短いヘアピンｓｉＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」は、一本鎖の自身に対する折りたたみと、少なくとも１９塩基対を有する分子内二本鎖領域とのヘアピン様構造の形成を引き起こす自己相補性の領域を有するＲＮＡの一本鎖からなる低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を示す。それらが一本鎖であることから、ｓｈＲＮＡは単一の発現カセットから容易に発現されうる。
本明細書で使用される用語「ファスチン阻害剤」は、ファスチン核酸（例えば、配列番号２、４、６もしくは８のいずれかを有するファスチンｍＲＮＡ）、小分子（例えば、マイグラスタチン類似体）、ファスチン（例えば、ファスチンアクチン結合部位および／またはファスチンマイグラスタチン結合部位）に特異的に結合する抗ファスチン抗体、ファスチンアミノ酸Ｔｈｒ３２６、Ｓｅｒ３２８、Ｓｅｒ３２９、Ｌｙｓ３３０、Ａｓｎ３３１、Ｓｅｒ３３３、Ａｒｇ２７６、Ｇｌｎ２７７、Ｍｅｔ２７９、Ａｓｐ２８６、Ｇｌｕ２８７、Ｇｌｎ２９１、Ｔｈｒ３２０、Ｔｈｒ３１８、Ｌｙｓ３１３、Ｔｈｒ３１１、Ｇｌｎ３６２、Ａｓｎ３６０、Ｌｙｓ３５９、Ａｓｐ１６８、Ｐｒｏ１５９、Ａｒｇ１５１、Ｌｙｓ１５０、Ａｒｇ１４９、Ａｒｇ１９７、Ａｒｇ２０１、Ｇｌｕ２０７、Ｇｌｕ２２７、Ｓｅｒ２３７、Ｐｒｏ２３６、Ｌｙｓ２４１、Ｌｙｓ２４７、およびＬｙｓ２５０を含むファスチンペプチドまたはファスチンペプチド模倣体、ファスチンアミノ酸Ｈｉｓ３９２、Ｇｌｕ３９１、Ａｌａ４８８、Ｌｙｓ４７１、Ｈｉｓ４７４およびＡｓｐ４７３を含むファスチンペプチドまたはファスチンペプチド模倣体に、ハイブリダイズまたは結合することができるｓｉＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを意味する。
本明細書で使用される語句「ファスチンの発現または活性を阻害する」は、ファスチン遺伝子の発現を抑制するか、ファスチン遺伝子産物の翻訳に干渉するか、ファスチン遺伝子産物の機能に干渉するか（例えば、阻害剤に可逆的または不可逆的に結合するかまたはアクチンなどの細胞産物とのファスチン相互作用を遮断または破壊することによる）、ファスチン遺伝子産物を不活性化するか（例えば、不活性化作用物質との反応による）、またはファスチン遺伝子産物を除去する（例えば、ファスチン遺伝子突然変異または細胞破壊のためにファスチン遺伝子産物をタグ化することによる）ことを意味する。
本明細書で使用される用語「ノックダウン」は、遺伝子の発現が低下した状態を記述する。例えば、「ノックダウン」は、遺伝子の突然変異、遺伝子の欠失、または遺伝子の発現における低下によってもたらされうる。遺伝子の発現を低下させるための一方法はＲＮＡｉを含み、ここでは特定の遺伝子産物の発現または特定のＲＮＡ転写産物の細胞濃縮が、配列が前記遺伝子産物をコードする遺伝子に対して相同なｓｉＲＮＡによって開始される配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングによって低減または除去される。したがって、本明細書で使用されるＲＮＡｉは「ノックダウン」作用物質である。
「被験体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物は、限定はされないが、ヒト、家畜、競技用動物（ｓｐｏｒｔ ａｎｉｍａｌ）およびペットを含む。用語、動物またはペットの中に、限定はされないが、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウシおよびトリが含まれる。
本明細書で使用される「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療」は、けがもしくは疾患関連症状、またはけがもしくは疾患関連症状の徴候を、治療し、回復させ（ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ）、予防し、低減し、改善し、または阻害することを含む。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などは、米国特許法の中のそれらに由来する意味を有し、また「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味しうる。本明細書で使用される「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または同様のものは、限定されずに、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）を意味する。
ファスチン
ファスチンは、細胞遊走における血漿膜の主要な分化である、葉状仮足などの細胞突起内でのパラレルアクチン束の形成において重要な機能を有するアクチン束化タンパク質である（Ａｄａｍｓ ２００４）。ファスチンｍＲＮＡは通常、正常な上皮細胞によって発現されないが、その過剰発現が、乳房、卵巣、結腸、膵臓、食道、胃、肺、および膀胱を含む多くの異なるタイプの上皮性悪性腫瘍、ならびに他の腫瘍、例えばリンパ腫、肉腫、メラノーマ、および星状細胞腫において報告されている。ファスチンｍＲＮＡの高い発現は、悪性の臨床経過およびより短い生存率に相関する。ファスチンは、本明細書中に記載のマイグラスタチン類似体のタンパク質標的として同定されている。
ファスチンは、アクチンを高度に動的でかつ構造的に多様な細胞内足場（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｃａｆｆｏｌｄ）に組織化する。これらの足場は、運動性細胞内での糸状仮足突起を含む種々の機構的プロセスを組織化する。
種々の供給源由来のファスチンにおける配列が使用可能である。例えば、ファスチン配列については、アミノ酸および核酸配列の公的にアクセス可能なデータベースの探索が可能である。ヒトファスチンにおける配列の一例が、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ウェブサイト、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）によって維持されるデータベース内で見出すことが可能であり（登録番号ＡＡＬ０１５２６、ｇｉ：１５６２５２４１）、それは容易な参照のために下記に配列番号１として提供される。
１ ＭＴＡＮＧＴＡＥＡＶ ＱＩＱＦＧＬＩＮＣＧ ＮＫＹＬＴＡＥＡＦＧ ＦＫＶＮＡＳＡＳＳＬ
４１ ＫＫＫＱＩＷＴＬＥＱ ＰＰＤＥＡＧＳＡＡＶ ＣＬＲＳＨＬＧＲＹＬ ＡＡＤＫＤＧＮＶＴＣ
８１ ＥＲＥＶＰＧＰＤＣＲ ＦＬＩＶＡＨＤＤＧＲ ＷＳＬＱＳＥＡＨＲＲ ＹＦＧＧＴＥＤＲＬＳ
１２１ ＣＦＡＱＴＶＳＰＡＥ ＫＷＳＶＨＩＡＭＨＰ ＱＶＮＩＹＳＶＴＲＫ ＲＹＡＨＬＳＡＲＰＡ
１６１ ＤＥＩＡＶＤＲＤＶＰ ＷＧＶＤＳＬＩＴＬＡ ＦＱＤＱＲＹＳＶＱＴ ＡＤＨＲＦＬＲＨＤＧ
２０１ ＲＬＶＡＲＰＥＰＡＴ ＧＹＴＬＥＦＲＳＧＫ ＶＡＦＲＤＣＥＧＲＹ ＬＡＰＳＧＰＳＧＴＬ
２４１ ＫＡＧＫＡＴＫＶＧＫ ＤＥＬＦＡＬＥＱＳＣ ＡＱＶＶＬＱＡＡＮＥ ＲＮＶＳＴＲＱＧＭＤ
２８１ ＬＳＡＮＱＤＥＥＴＤ ＱＥＴＦＱＬＥＩＤＲ ＤＴＫＫＣＡＦＲＴＨ ＴＧＫＹＷＴＬＴＡＴ
３２１ ＧＧＶＱＳＴＡＳＳＫ ＮＡＳＣＹＦＤＩＥＷ ＲＤＲＲＩＴＬＲＡＳ ＮＧＫＦＶＴＳＫＫＮ
３６１ ＧＱＬＡＡＳＶＥＴＡ ＧＤＳＥＬＦＬＭＫＬ ＩＮＲＰＩＩＶＦＲＧ ＥＨＧＦＩＧＣＲＫＶ
４０１ ＴＧＴＬＤＡＮＲＳＳ ＹＤＶＦＱＬＥＦＮＤ ＧＡＹＮＩＫＤＳＴＧ ＫＹＷＴＶＧＳＤＳＡ
４４１ ＶＴＳＳＧＤＴＰＶＤ ＦＦＦＥＦＣＤＹＮＫ ＶＡＩＫＶＧＧＲＹＬ ＫＧＤＨＡＧＶＬＫＡ
４８１ ＳＡＥＴＶＤＰＡＳＬ ＷＥＹ
配列番号１のファスチンポリペプチドに対するゲノムヌクレオチド配列が、例えばＮＣＢＩ登録番号ＡＹ０４４２２９、ｇｉ：１５６２５２４０に見出される。配列番号１のポリペプチドに対するｃＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩデータベース内に登録番号ＢＣ００６３０４（ｇｉ：３３８７３５２５）として見出されうる。このヌクレオチド配列は、容易な参照のために下記に配列番号２として提供される。
１ ＧＣＴＧＣＧＧＡＧＧ ＧＴＧＣＧＴＧＣＧＧ ＧＣＣＧＣＧＧＣＡＧ ＣＣＧＡＡＣＡＡＡＧ
４１ ＧＡＧＣＡＧＧＧＧＣ ＧＣＣＧＣＣＧＣＡＧ ＧＧＡＣＣＣＧＣＣＡ ＣＣＣＡＣＣＴＣＣＣ
８１ ＧＧＧＧＣＣＧＣＧＣ ＡＧＣＧＧＣＣＴＣＴ ＣＧＴＣＴＡＣＴＧＣ ＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣ
１２１ ＧＣＣＡＡＣＧＧＣＡ ＣＡＧＣＣＧＡＧＧＣ ＧＧＴＧＣＡＧＡＴＣ ＣＡＧＴＴＣＧＧＣＣ
１６１ ＴＣＡＴＣＡＡＣＴＧ ＣＧＧＣＡＡＣＡＡＧ ＴＡＣＣＴＧＡＣＧＧ ＣＣＧＡＧＧＣＧＴＴ
２０１ ＣＧＧＧＴＴＣＡＡＧ ＧＴＧＡＡＣＧＣＧＴ ＣＣＧＣＣＡＧＣＡＧ ＣＣＴＧＡＡＧＡＡＧ
２４１ ＡＡＧＣＡＧＡＴＣＴ ＧＧＡＣＧＣＴＧＧＡ ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＴ ＧＡＣＧＡＧＧＣＧＧ
２８１ ＧＣＡＧＣＧＣＧＧＣ ＣＧＴＧＴＧＣＣＴＧ ＣＧＣＡＧＣＣＡＣＣ ＴＧＧＧＣＣＧＣＴＡ
３２１ ＣＣＴＧＧＣＧＧＣＧ ＧＡＣＡＡＧＧＡＣＧ ＧＣＡＡＣＧＴＧＡＣ ＣＴＧＣＧＡＧＣＧＣ
３６１ ＧＡＧＧＴＧＣＣＣＧ ＧＴＣＣＣＧＡＣＴＧ ＣＣＧＴＴＴＣＣＴＣ ＡＴＣＧＴＧＧＣＧＣ
４０１ ＡＣＧＡＣＧＡＣＧＧ ＴＣＧＣＴＧＧＴＣＧ ＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧ ＡＧＧＣＧＣＡＣＣＧ
４４１ ＧＣＧＣＴＡＣＴＴＣ ＧＧＣＧＧＣＡＣＣＧ ＡＧＧＡＣＣＧＣＣＴ ＧＴＣＣＴＧＣＴＴＣ
４８１ ＧＣＧＣＡＧＡＣＧＧ ＴＧＴＣＣＣＣＣＧＣ ＣＧＡＧＡＡＧＴＧＧ ＡＧＣＧＴＧＣＡＣＡ
５２１ ＴＣＧＣＣＡＴＧＣＡ ＣＣＣＴＣＡＧＧＴＣ ＡＡＣＡＴＣＴＡＣＡ ＧＣＧＴＣＡＣＣＣＧ
５６１ ＴＡＡＧＣＧＣＴＡＣ ＧＣＧＣＡＣＣＴＧＡ ＧＣＧＣＧＣＧＧＣＣ ＧＧＣＣＧＡＣＧＡＧ
６０１ ＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧ ＡＣＣＧＣＧＡＣＧＴ ＧＣＣＣＴＧＧＧＧＣ ＧＴＣＧＡＣＴＣＧＣ
６４１ ＴＣＡＴＣＡＣＣＣＴ ＣＧＣＣＴＴＣＣＡＧ ＧＡＣＣＡＧＣＧＣＴ ＡＣＡＧＣＧＴＧＣＡ
６８１ ＧＡＣＣＧＣＣＧＡＣ ＣＡＣＣＧＣＴＴＣＣ ＴＧＣＧＣＣＡＣＧＡ ＣＧＧＧＣＧＣＣＴＧ
７２１ ＧＴＧＧＣＧＣＧＣＣ ＣＣＧＡＧＣＣＧＧＣ ＣＡＣＴＧＧＣＴＡＣ ＡＣＧＣＴＧＧＡＧＴ
７６１ ＴＣＣＧＣＴＣＣＧＧ ＣＡＡＧＧＴＧＧＣＣ ＴＴＣＣＧＣＧＡＣＴ ＧＣＧＡＧＧＧＣＣＧ
８０１ ＴＴＡＣＣＴＧＧＣＧ ＣＣＧＴＣＧＧＧＧＣ ＣＣＡＧＣＧＧＣＡＣ ＧＣＴＣＡＡＧＧＣＧ
８４１ ＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡ ＣＣＡＡＧＧＴＧＧＧ ＣＡＡＧＧＡＣＧＡＧ ＣＴＣＴＴＴＧＣＴＣ
８８１ ＴＧＧＡＧＣＡＧＡＧ ＣＴＧＣＧＣＣＣＡＧ ＧＴＣＧＴＧＣＴＧＣ ＡＧＧＣＧＧＣＣＡＡ
９２１ ＣＧＡＧＡＧＧＡＡＣ ＧＴＧＴＣＣＡＣＧＣ ＧＣＣＡＧＧＧＴＡＴ ＧＧＡＣＣＴＧＴＣＴ
９６１ ＧＣＣＡＡＴＣＡＧＧ ＡＣＧＡＧＧＡＧＡＣ ＣＧＡＣＣＡＧＧＡＧ ＡＣＣＴＴＣＣＡＧＣ
１００１ ＴＧＧＡＧＡＴＣＧＡ ＣＣＧＣＧＡＣＡＣＣ ＡＡＡＡＡＧＴＧＴＧ ＣＣＴＴＣＣＧＴＡＣ
１０４１ ＣＣＡＣＡＣＧＧＧＣ ＡＡＧＴＡＣＴＧＧＡ ＣＧＣＴＧＡＣＧＧＣ ＣＡＣＣＧＧＧＧＧＣ
１０８１ ＧＴＧＣＡＧＴＣＣＡ ＣＣＧＣＣＴＣＣＡＧ ＣＡＡＧＡＡＴＧＣＣ ＡＧＣＴＧＣＴＡＣＴ
１１２１ ＴＴＧＡＣＡＴＣＧＡ ＧＴＧＧＣＧＴＧＡＣ ＣＧＧＣＧＣＡＴＣＡ ＣＡＣＴＧＡＧＧＧＣ
１１６１ ＧＴＣＣＡＡＴＧＧＣ ＡＡＧＴＴＴＧＴＧＡ ＣＣＴＣＣＡＡＧＡＡ ＧＡＡＴＧＧＧＣＡＧ
１２０１ ＣＴＧＧＣＣＧＣＣＴ ＣＧＧＴＧＧＡＧＡＣ ＡＧＣＡＧＧＧＧＡＣ ＴＣＡＧＡＧＣＴＣＴ
１２４１ ＴＣＣＴＣＡＴＧＡＡ ＧＣＴＣＡＴＣＡＡＣ ＣＧＣＣＣＣＡＴＣＡ ＴＣＧＴＧＴＴＣＣＧ
１２８１ ＣＧＧＧＧＡＧＣＡＴ ＧＧＣＴＴＣＡＴＣＧ ＧＣＴＧＣＣＧＣＡＡ ＧＧＴＣＡＣＧＧＧＣ
１３２１ ＡＣＣＣＴＧＧＡＣＧ ＣＣＡＡＣＣＧＣＴＣ ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ ＧＴＣＴＴＣＣＡＧＣ
１３６１ ＴＧＧＡＧＴＴＣＡＡ ＣＧＡＴＧＧＣＧＣＣ ＴＡＣＡＡＣＡＴＣＡ ＡＡＧＡＣＴＣＣＡＣ
１４０１ ＡＧＧＣＡＡＡＴＡＣ ＴＧＧＡＣＧＧＴＧＧ ＧＣＡＧＴＧＡＣＴＣ ＣＧＴＧＧＴＣＡＣＣ
１４４１ ＡＧＣＡＧＣＧＧＣＧ ＡＣＡＣＴＣＣＴＧＴ ＧＧＡＣＴＴＣＴＴＣ ＴＴＣＧＡＧＴＴＣＴ
１４８１ ＧＣＧＡＣＴＡＴＡＡ ＣＡＡＧＧＴＧＧＣＣ ＡＴＣＡＡＧＧＴＧＧ ＧＣＧＧＧＣＧＣＴＡ
１５２１ ＣＣＴＧＡＡＧＧＧＣ ＧＡＣＣＡＣＧＣＡＧ ＧＣＧＴＣＣＴＧＡＡ ＧＧＣＣＴＣＧＧＣＧ
１５６１ ＧＡＡＡＣＣＧＴＧＧ ＡＣＣＣＣＧＣＣＴＣ ＧＣＴＣＴＧＧＧＡＧ ＴＡＣＴＡＧＧＧＣＣ
１６０１ ＧＧＣＣＣＧＴＣＣＴ ＴＣＣＣＣＧＣＣＣＣ ＴＧＣＣＣＡＣＡＴＧ ＧＣＧＧＣＴＣＣＴＧ
１６４１ ＣＣＡＡＣＣＣＴＣＣ ＣＴＧＣＴＡＡＣＣＣ ＣＴＴＣＴＣＣＧＣＣ ＡＧＧＴＧＧＧＣＴＣ
１６８１ ＣＡＧＧＧＣＧＧＧＡ ＧＧＣＡＡＧＣＣＣＣ ＣＴＴＧＣＣＴＴＴＣ ＡＡＡＣＴＧＧＡＡＡ
１７２１ ＣＣＣＣＡＧＡＧＡＡ ＡＡＣＧＧＴＧＣＣＣ ＣＣＡＣＣＴＧＴＣＧ ＣＣＣＣＴＡＴＧＧＡ
１７６１ ＣＴＣＣＣＣＡＣＴＣ ＴＣＣＣＣＴＣＣＧＣ ＣＣＧＧＧＴＴＣＣＣ ＴＡＣＴＣＣＣＣＴＣ
１８０１ ＧＧＧＴＣＡＧＣＧＧ ＣＴＧＣＧＧＣＣＴＧ ＧＣＣＣＴＧＧＧＡＧ ＧＧＡＴＴＴＣＡＧＡ
１８４１ ＴＧＣＣＣＣＴＧＣＣ ＣＴＣＴＴＧＴＣＴＧ ＣＣＡＣＧＧＧＧＣＧ ＡＧＴＣＴＧＧＣＡＣ
１８８１ ＣＴＣＴＴＴＣＴＴＣ ＴＧＡＣＣＴＣＡＧＡ ＣＧＧＣＴＣＴＧＡＧ ＣＣＴＴＡＴＴＴＣＴ
１９２１ ＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧ ＣＴＡＡＧＧＧＡＣＧ ＧＴＴＧＧＧＧＧＣＴ ＧＧＧＡＧＣＣＣＴＧ
１９６１ ＧＧＣＧＴＧＴＡＧＴ ＧＴＡＡＣＴＧＧＡＡ ＴＣＴＴＴＴＧＣＣＴ ＣＴＣＣＣＡＧＣＣＡ
２００１ ＣＣＴＣＣＴＣＣＣＡ ＧＣＣＣＣＣＣＡＧＧ ＡＧＡＧＣＴＧＧＧＣ ＡＣＡＴＧＴＣＣＣＡ
２０４１ ＡＧＣＣＴＧＴＣＡＧ ＴＧＧＣＣＣＴＣＣＣ ＴＧＧＴＧＣＡＣＴＧ ＴＣＣＣＣＧＡＡＡＣ
２０８１ ＣＣＣＴＧＣＴＴＧＧ ＧＡＡＧＧＧＡＡＧＣ ＴＧＴＣＧＧＧＴＧＧ ＧＣＴＡＧＧＡＣＴＧ
２１２１ ＡＣＣＣＴＴＧＴＧＧ ＴＧＴＴＴＴＴＴＴＧ ＧＧＴＧＧＴＧＧＣＴ ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＣ
２１６１ ＣＣＴＣＴＣＣＣＡＣ ＧＴＧＧＣＡＧＡＧＧ ＣＴＣＡＧＣＣＴＧＧ ＣＴＣＣＣＴＴＣＣＣ
２２０１ ＴＧＧＡＧＣＧＧＣＡ ＧＧＧＣＧＴＧＡＣＧ ＧＣＣＡＣＡＧＧＧＴ ＣＴＧＣＣＣＧＣＴＧ
２２４１ ＣＡＣＧＴＴＣＴＧＣ ＣＡＡＧＧＴＧＧＴＧ ＧＴＧＧＣＧＧＧＣＧ ＧＧＴＡＧＧＧＧＴＧ
２２８１ ＴＧＧＧＧＧＣＣＧＴ ＣＴＴＣＣＴＣＣＴＧ ＴＣＴＣＴＴＴＣＣＴ ＴＴＣＡＣＣＣＴＡＧ
２３２１ ＣＣＴＧＡＣＴＧＧＡ ＡＧＣＡＧＡＡＡＡＴ ＧＡＣＣＡＡＡＴＣＡ ＧＴＡＴＴＴＴＴＴＴ
２３６１ ＴＡＡＴＧＡＡＡＴＡ ＴＴＡＴＴＧＣＴＧＧ ＡＧＧＣＧＴＣＣＣＡ ＧＧＣＡＡＧＣＣＴＧ
２４０１ ＧＣＴＧＴＡＧＴＡＧ ＣＧＡＧＴＧＡＴＣＴ ＧＧＣＧＧＧＧＧＧＣ ＧＴＣＴＣＡＧＣＡＣ
２４４１ ＣＣＴＣＣＣＣＡＧＧ ＧＧＧＴＧＣＡＴＣＴ ＣＡＧＣＣＣＣＣＴＣ ＴＴＴＣＣＧＴＣＣＴ
２４８１ ＴＣＣＣＧＴＣＣＡＧ ＣＣＣＣＡＧＣＣＣＴ ＧＧＧＣＣＴＧＧＧＣ ＴＧＣＣＧＡＣＡＣＣ
２５２１ ＴＧＧＧＣＣＡＧＡＧ ＣＣＣＣＴＧＣＴＧＴ ＧＡＴＴＧＧＴＧＣＴ ＣＣＣＴＧＧＧＣＣＴ
２５６１ ＣＣＣＧＧＧＴＧＧＡ ＴＧＡＡＧＣＣＡＧＧ ＣＧＴＣＧＣＣＣＣＣ ＴＣＣＧＧＧＡＧＣＣ
２６０１ ＣＴＧＧＧＧＴＧＡＧ ＣＣＧＣＣＧＧＧＧＣ ＣＣＣＣＣＣＴＧＣＴ ＧＣＣＡＧＣＣＴＣＣ
２６４１ ＣＣＣＧＴＣＣＣＣＡ ＡＣＡＴＧＣＡＴＣＴ ＣＡＣＴＣＴＧＧＧＴ ＧＴＣＴＴＧＧＴＣＴ
２６８１ ＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴ ＧＴＡＡＧＴＧＴＣＡ ＴＴＴＧＴＡＴＡＡＣ ＴＣＴＡＡＡＣＧＣＣ
２７２１ ＣＡＴＧＡＴＡＧＴＡ ＧＣＴＴＣＡＡＡＣＴ ＧＧＡＡＡＴＡＧＣＧ ＡＡＡＴＡＡＡＡＴＡ
２７６１ ＡＣＴＣＡＧＴＣＴＧ ＣＡＧＣＣＣＣＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
ヒトｆａｓｃｉｎ ２における配列の一例（登録番号ＮＰ＿００１０７０６５０、ｇｉ：１１６２９５２５１）が、下記に配列番号３として提供される。
１ ＭＰＴＮＧＬＨＱＶＬ ＫＩＱＦＧＬＶＮＤＴ ＤＲＹＬＴＡＥＳＦＧ ＦＫＶＮＡＳＡＰＳＬ
４１ ＫＲＫＱＴＷＶＬＥＰ ＤＰＧＱＧＴＡＶＬＬ ＲＳＳＨＬＧＲＹＬＳ ＡＥＥＤＧＲＶＡＣＥ
８１ ＡＥＱＰＧＲＤＣＲＦ ＬＶＬＰＱＰＤＧＲＷ ＶＬＲＳＥＰＨＧＲＦ ＦＧＧＴＥＤＱＬＳＣ
１２１ ＦＡＴＡＶＳＰＡＥＬ ＷＴＶＨＬＡＩＨＰＱ ＡＨＬＬＳＶＳＲＲＲ ＹＶＨＬＣＰＲＥＤＥ
１６１ ＭＡＡＤＧＤＫＰＷＧ ＶＤＡＬＬＴＬＩＦＲ ＳＲＲＹＣＬＫＳＣＤ ＳＲＹＬＲＳＤＧＲＬ
２０１ ＶＷＥＰＥＰＲＡＣＹ ＴＬＥＦＫＡＧＫＬＡ ＦＫＤＣＤＧＨＹＬＡ ＰＶＧＰＡＧＴＬＫＡ
２４１ ＧＲＮＴＲＰＧＫＤＥ ＬＦＤＬＥＥＳＨＰＱ ＶＶＬＶＡＡＮＨＲＹ ＶＳＶＲＱＧＶＮＶＳ
２８１ ＡＮＱＤＤＥＬＤＨＥ ＴＦＬＭＱＩＤＱＥＴ ＫＫＣＴＦＹＳＳＴＧ ＧＹＷＴＬＶＴＨＧＧ
３２１ ＩＨＡＴＡＴＱＶＳＡ ＮＴＭＦＥＭＥＷＲＧ ＲＲＶＡＬＫＡＳＮＧ ＲＹＶＣＭＫＫＮＧＱ
３６１ ＬＡＡＩＳＤＦＶＧＰ ＰＰＲＰＡＷＴＧＫＶ ＡＧＧＡＡＱＱＴＬＳ ＰＰＧＫＤＥＥＦＴＬ
４０１ ＫＬＩＮＲＰＩＬＶＬ ＲＧＬＤＧＦＶＣＨＨ ＲＧＳＮＱＬＤＴＮＲ ＳＶＹＤＶＦＨＬＳＦ
４４１ ＳＤＧＡＹＲＩＲＧＲ ＤＧＧＦＷＹＴＧＳＨ ＧＳＶＣＳＤＧＥＲＡ ＥＤＦＶＦＥＦＲＥＲ
４８１ ＧＲＬＡＩＲＡＲＳＧ ＫＹＬＲＧＧＡＳＧＬ ＬＲＡＤＡＤＡＰＡＧ ＴＡＬＷＥＹ
配列番号３のポリペプチドにおけるｃＤＮＡ配列が、ＮＣＢＩデータベース内に登録番号ＮＭ００１０７７１８２（ｇｉ：１１６２９５２５０）として見出されうる。このヌクレオチド配列は、容易な参照のために下記に配列番号４として提供される。
１ ＧＣＡＧＧＣＡＧＧＧ ＧＧＴＴＣＧＴＧＡＣ ＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧ ＴＣＴＧＧＧＧＧＣＴ
４１ ＧＴＧＧＧＣＣＡＧＣ ＣＧＡＧＣＣＧＡＣＣ ＣＧＧＧＣＴＴＣＴＧ ＧＧＧＧＡＣＣＧＣＧ
８１ ＧＧＧＧＣＣＧＴＧＡ ＧＣＡＣＴＣＡＧＡＧ ＧＧＴＧＣＡＴＣＣＣ ＡＧＧＣＣＣＣＴＣＣ
１２１ ＧＧＧＧＡＣＣＣＧＧ ＣＣＡＧＣＣＴＧＡＡ ＧＡＴＧＣＣＧＡＣＧ ＡＡＣＧＧＣＣＴＧＣ
１６１ ＡＣＣＡＧＧＴＧＣＴ ＧＡＡＧＡＴＣＣＡＧ ＴＴＴＧＧＣＣＴＣＧ ＴＣＡＡＣＧＡＣＡＣ
２０１ ＴＧＡＣＣＧＣＴＡＣ ＣＴＧＡＣＡＧＣＴＧ ＡＧＡＧＣＴＴＣＧＧ ＣＴＴＣＡＡＧＧＴＣ
２４１ ＡＡＴＧＣＣＴＣＧＧ ＣＡＣＣＣＡＧＣＣＴ ＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧ ＣＡＧＡＣＣＴＧＧＧ
２８１ ＴＧＣＴＧＧＡＡＣＣ ＣＧＡＣＣＣＡＧＧＡ ＣＡＡＧＧＣＡＣＧＧ ＣＴＧＴＧＣＴＧＣＴ
３２１ ＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣ ＣＡＣＣＴＧＧＧＣＣ ＧＣＴＡＣＣＴＧＴＣ ＧＧＣＡＧＡＡＧＡＧ
３６１ ＧＡＣＧＧＧＣＧＣＧ ＴＧＧＣＣＴＧＴＧＡ ＧＧＣＡＧＡＧＣＡＧ ＣＣＧＧＧＣＣＧＴＧ
４０１ ＡＣＴＧＣＣＧＣＴＴ ＣＣＴＧＧＴＣＣＴＧ ＣＣＧＣＡＧＣＣＡＧ ＡＴＧＧＧＣＧＣＴＧ
４４１ ＧＧＴＧＣＴＧＣＧＧ ＴＣＣＧＡＧＣＣＧＣ ＡＣＧＧＣＣＧＣＴＴ ＣＴＴＣＧＧＡＧＧＣ
４８１ ＡＣＣＧＡＧＧＡＣＣ ＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧ ＣＴＴＣＧＣＣＡＣＡ ＧＣＣＧＴＴＴＣＣＣ
５２１ ＣＧＧＣＣＧＡＧＣＴ ＧＴＧＧＡＣＣＧＴＧ ＣＡＣＣＴＧＧＣＣＡ ＴＣＣＡＣＣＣＧＣＡ
５６１ ＧＧＣＣＣＡＣＣＴＧ ＣＴＧＡＧＣＧＴＧＡ ＧＣＣＧＧＣＧＧＣＧ ＣＴＡＣＧＴＧＣＡＣ
６０１ ＣＴＧＴＧＣＣＣＧＣ ＧＧＧＡＧＧＡＣＧＡ ＧＡＴＧＧＣＣＧＣＡ ＧＡＣＧＧＡＧＡＣＡ
６４１ ＡＧＣＣＣＴＧＧＧＧ ＣＧＴＧＧＡＣＧＣＣ ＣＴＣＣＴＣＡＣＣＣ ＴＣＡＴＣＴＴＣＣＧ
６８１ ＧＡＧＣＣＧＡＣＧＧ ＴＡＣＴＧＣＣＴＣＡ ＡＧＴＣＣＴＧＴＧＡ ＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣ
７２１ ＣＴＧＣＧＣＡＧＣＧ ＡＣＧＧＣＣＧＴＣＴ ＧＧＴＣＴＧＧＧＡＧ ＣＣＴＧＡＧＣＣＣＣ
７６１ ＧＴＧＣＣＴＧＣＴＡ ＣＡＣＧＣＴＧＧＡＧ ＴＴＣＡＡＧＧＣＧＧ ＧＣＡＡＧＣＴＧＧＣ
８０１ ＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣ ＴＧＣＧＡＣＧＧＣＣ ＡＣＴＡＣＣＴＧＧＣ ＡＣＣＣＧＴＧＧＧＧ
８４１ ＣＣＣＧＣＡＧＧＣＡ ＣＣＣＴＣＡＡＧＧＣ ＣＧＧＣＣＧＡＡＡＣ ＡＣＧＣＧＡＣＣＴＧ
８８１ ＧＣＡＡＧＧＡＴＧＡ ＧＣＴＣＴＴＴＧＡＴ ＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡ ＧＴＣＡＣＣＣＡＣＡ
９２１ ＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧ ＧＴＧＧＣＴＧＣＣＡ ＡＣＣＡＣＣＧＣＴＡ ＣＧＴＣＴＣＴＧＴＧ
９６１ ＣＧＧＣＡＡＧＧＧＧ ＴＣＡＡＣＧＴＣＴＣ ＡＧＣＣＡＡＴＣＡＧ ＧＡＴＧＡＴＧＡＡＣ
１００１ ＴＡＧＡＣＣＡＣＧＡ ＧＡＣＣＴＴＣＣＴＧ ＡＴＧＣＡＡＡＴＴＧ ＡＣＣＡＧＧＡＧＡＣ
１０４１ ＡＡＡＧＡＡＧＴＧＣ ＡＣＣＴＴＣＴＡＴＴ ＣＣＡＧＣＡＣＴＧＧ ＧＧＧＣＴＡＣＴＧＧ
１０８１ ＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡ ＣＣＣＡＴＧＧＧＧＧ ＣＡＴＴＣＡＣＧＣＣ ＡＣＡＧＣＣＡＣＡＣ
１１２１ ＡＡＧＴＴＴＣＴＧＣ ＣＡＡＣＡＣＣＡＴＧ ＴＴＴＧＡＧＡＴＧＧ ＡＧＴＧＧＣＧＴＧＧ
１１６１ ＣＣＧＧＣＧＧＧＴＡ ＧＣＡＣＴＣＡＡＡＧ ＣＣＡＧＣＡＡＣＧＧ ＧＣＧＣＴＡＣＧＴＧ
１２０１ ＴＧＣＡＴＧＡＡＧＡ ＡＧＡＡＴＧＧＧＣＡ ＧＣＴＧＧＣＧＧＣＴ ＡＴＣＡＧＣＧＡＴＴ
１２４１ ＴＴＧＴＣＧＧＧＣＣ ＣＣＣＡＣＣＣＣＧＣ ＣＣＧＧＣＣＴＧＧＡ ＣＡＧＧＧＡＡＧＧＴ
１２８１ ＧＧＣＧＧＧＡＧＧＧ ＧＣＡＧＣＧＣＡＧＣ ＡＧＡＣＧＣＴＣＴＣ ＣＣＣＧＣＣＡＧＧＣ
１３２１ ＡＡＧＧＡＣＧＡＡＧ ＡＧＴＴＣＡＣＣＣＴ ＣＡＡＧＣＴＣＡＴＣ ＡＡＣＣＧＧＣＣＣＡ
１３６１ ＴＣＣＴＧＧＴＧＣＴ ＧＣＧＣＧＧＣＣＴＧ ＧＡＣＧＧＣＴＴＣＧ ＴＣＴＧＣＣＡＣＣＡ
１４０１ ＣＣＧＣＧＧＣＴＣＣ ＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧ ＡＣＡＣＣＡＡＣＣＧ ＣＴＣＣＧＴＣＴＡＣ
１４４１ ＧＡＣＧＴＣＴＴＣＣ ＡＣＣＴＧＡＧＣＴＴ ＣＡＧＣＧＡＣＧＧＣ ＧＣＣＴＡＣＣＧＧＡ
１４８１ ＴＣＣＧＡＧＧＣＣＧ ＣＧＡＣＧＧＡＧＧＧ ＴＴＣＴＧＧＴＡＣＡ ＣＧＧＧＣＡＧＣＣＡ
１５２１ ＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧ ＴＧＣＡＧＣＧＡＣＧ ＧＣＧＡＡＣＧＣＧＣ ＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣ
１５６１ ＧＴＣＴＴＣＧＡＧＴ ＴＣＣＧＴＧＡＧＣＧ ＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧ ＧＣＣＡＴＣＣＧＣＧ
１６０１ ＣＣＣＧＧＡＧＣＧＧ ＣＡＡＧＴＡＣＣＴＧ ＣＧＣＧＧＣＧＧＣＧ ＣＣＴＣＧＧＧＣＣＴ
１６４１ ＧＣＴＧＣＧＧＧＣＣ ＧＡＴＧＣＣＧＡＣＧ ＣＣＣＣＧＧＣＣＧＧ ＧＡＣＣＧＣＧＣＴＴ
１６８１ ＴＧＧＧＡＧＴＡＣＴ ＧＡＧＧＣＣＧＣＧＣ ＣＣＡＧＡＣＣＡＧＣ ＣＴＧＴＣＧＣＧＣＡ
１７２１ ＴＴＡＡＡＡＣＣＧＴ ＧＴＣＴＣＴＣＣＣＧ ＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
１７６１ ＡＡ
ヒトｆａｓｃｉｎ ３における配列の一例（登録番号ＮＰ＿０６５１０２、ｇｉ：９９６６７９１）が、下記に配列番号５として提供される。
１ ＭＤＥＴＥＷＩＨＲＨ ＰＫＡＥＤＬＲＶＧＬ ＩＳＷＡＧＴＹＬＴＦ ＥＡＣＫＮＴＶＴＡＴ
４１ ＡＫＳＬＧＲＲＱＴＷ ＥＩＬＶＳＮＥＨＥＴ ＱＡＶＶＲＬＫＳＶＱ ＧＬＹＬＬＣＥＣＤＧ
８１ ＴＶＣＹＧＲＰＲＴＳ ＨＨＧＣＦＬＬＲＦＨ ＲＮＳＫＷＴＬＱＣＬ ＩＳＧＲＹＬＥＳＮＧ
１２１ ＫＤＶＦＣＴＳＨＶＬ ＳＡＹＨＭＷＴＰＲＰ ＡＬＨＶＨＶＩＬＹＳ ＰＩＨＲＣＹＡＲＡＤ
１６１ ＰＴＭＧＲＩＷＶＤＡ ＡＶＰＣＬＥＥＣＧＦ ＬＬＨＦＲＤＧＣＹＨ ＬＥＴＳＴＨＨＦＬＳ
２０１ ＨＶＤＲＬＦＳＱＰＳ ＳＱＴＡＦＨＭＱＶＲ ＰＧＧＬＶＡＬＣＤＧ ＥＧＧＭＬＹＰＱＧＴ
２４１ ＨＬＬＬＧＭＧＣＮＰ ＭＲＧＥＥＷＦＩＬＱ ＨＣＰＴＷＶＳＬＲＳ ＫＴＧＲＦＩＳＶＩＹ
２８１ ＤＧＥＶＲＡＡＳＥＲ ＬＮＲＭＳＬＦＱＦＥ ＣＤＳＥＳＰＴＶＱＬ ＲＳＡＮＧＹＹＬＳＱ
３２１ ＲＲＨＲＡＶＭＡＤＧ ＨＰＬＥＳＤＴＦＦＲ ＭＨＷＮＣＧＲＩＩＬ ＱＳＣＲＧＲＦＬＧＩ
３６１ ＡＰＮＳＬＬＭＡＮＶ ＩＬＰＧＰＮＥＥＦＧ ＩＬＦＡＮＲＳＦＬＶ ＬＲＧＲＹＧＹＶＧＳ
４０１ ＳＳＧＨＤＬＩＱＣＮ ＱＤＱＰＤＲＩＨＬＬ ＰＣＲＰＧＩＹＨＦＱ ＡＱＧＧＳＦＷＳＩＴ
４４１ ＳＦＧＴＦＲＰＷＧＫ ＦＡＬＮＦＣＩＥＬＱ ＧＳＮＬＬＴＶＬＡＰ ＮＧＦＹＭＲＡＤＱＳ
４８１ ＧＴＬＬＡＤＳＥＤＩ ＴＲＥＣＩＷＥＦ
配列番号５のファスチンポリペプチドにおけるｃＤＮＡ配列が、ＮＣＢＩデータベース内に登録番号ＮＭ＿０２０３６９（ｇｉ：９９６６７９０）として見出されうる。このヌクレオチド配列は、容易な参照のために下記に配列番号６として提供される。
１ ＣＣＣＴＴＴＣＣＣＣ ＡＣＴＧＴＧＧＴＧＴ ＧＡＴＡＡＧＡＧＧＣ ＴＧＣＣＣＴＣＡＣＡ
４１ ＧＴＣＡＣＡＡＴＧＣ ＴＣＣＣＧＧＧＴＣＡ ＣＡＧＡＧＧＴＧＣＴ ＧＧＧＣＣＣＣＡＧＧ
８１ ＣＣＡＧＣＣＴＣＴＧ ＣＣＴＧＧＧＡＡＧＴ ＴＣＴＣＴＣＴＧＧＧ ＡＡＣＡＴＣＴＧＧＴ
１２１ ＧＧＧＴＡＣＴＡＣＡ ＧＧＣＣＣＴＡＴＴＣ ＣＡＧＧＣＣＣＴＡＴ ＧＧＣＣＴＧＴＧＧＡ
１６１ ＡＣＣＴＣＡＣＣＡＣ ＧＧＧＧＧＧＧＡＧＧ ＧＣＴＧＧＧＣＣＡＧ ＡＣＧＧＡＧＡＣＡＴ
２０１ ＣＡＣＣＴＧＴＧＧＴ ＧＴＣＡＧＣＣＣＣＡ ＴＧＧＡＴＧＡＧＡＣ ＡＧＡＧＴＧＧＡＴＡ
２４１ ＣＡＣＡＧＡＣＡＴＣ ＣＣＡＡＧＧＣＴＧＡ ＧＧＡＣＣＴＡＡＧＧ ＧＴＴＧＧＧＣＴＣＡ
２８１ ＴＣＡＧＣＴＧＧＧＣ ＡＧＧＡＡＣＣＴＡＣ ＣＴＣＡＣＣＴＴＴＧ ＡＧＧＣＡＴＧＣＡＡ
３２１ ＧＡＡＴＡＣＡＧＴＣ ＡＣＴＧＣＡＡＣＴＧ ＣＧＡＡＧＡＧＴＴＴ ＧＧＧＣＡＧＧＡＧＡ
３６１ ＣＡＧＡＣＣＴＧＧＧ ＡＧＡＴＣＴＴＧＧＴ ＧＡＧＣＡＡＴＧＡＧ ＣＡＴＧＡＧＡＣＡＣ
４０１ ＡＧＧＣＣＧＴＧＧＴ ＧＣＧＡＣＴＡＡＡＧ ＡＧＣＧＴＧＣＡＧＧ ＧＣＣＴＣＴＡＣＣＴ
４４１ ＧＣＴＧＴＧＴＧＡＧ ＴＧＴＧＡＴＧＧＣＡ ＣＣＧＴＧＴＧＴＴＡ ＴＧＧＣＣＧＣＣＣＡ
４８１ ＡＧＧＡＣＣＡＧＣＣ ＡＣＣＡＴＧＧＧＴＧ ＣＴＴＴＣＴＡＣＴＧ ＣＧＴＴＴＣＣＡＣＣ
５２１ ＧＧＡＡＣＡＧＣＡＡ ＧＴＧＧＡＣＣＣＴＣ ＣＡＧＴＧＣＣＴＡＡ ＴＣＴＣＴＧＧＴＣＧ
５６１ ＴＴＡＴＴＴＧＧＡＧ ＴＣＣＡＡＴＧＧＣＡ ＡＧＧＡＣＧＴＧＴＴ ＴＴＧＣＡＣＴＴＣＣ
６０１ ＣＡＣＧＴＣＣＴＣＴ ＣＡＧＣＴＴＡＣＣＡ ＣＡＴＧＴＧＧＡＣＣ ＣＣＣＣＧＡＣＣＡＧ
６４１ ＣＣＣＴＣＣＡＴＧＴ ＣＣＡＣＧＴＧＡＴＣ ＣＴＣＴＡＣＡＧＣＣ ＣＣＡＴＣＣＡＣＣＧ
６８１ ＣＴＧＣＴＡＴＧＣＣ ＣＧＧＧＣＴＧＡＣＣ ＣＣＡＣＴＡＴＧＧＧ ＣＣＧＣＡＴＣＴＧＧ
７２１ ＧＴＧＧＡＣＧＣＡＧ ＣＡＧＴＴＣＣＣＴＧ ＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧ ＴＧＴＧＧＣＴＴＣＣ
７６１ ＴＧＴＴＧＣＡＴＴＴ ＣＣＧＡＧＡＴＧＧＡ ＴＧＣＴＡＣＣＡＣＣ ＴＧＧＡＧＡＣＣＴＣ
８０１ ＴＡＣＡＣＡＣＣＡＣ ＴＴＣＴＴＧＴＣＣＣ ＡＴＧＴＡＧＡＣＣＧ ＧＣＴＧＴＴＣＴＣＣ
８４１ ＣＡＡＣＣＣＴＣＡＴ ＣＡＣＡＧＡＣＡＧＣ ＴＴＴＴＣＡＣＡＴＧ ＣＡＡＧＴＧＣＧＧＣ
８８１ ＣＴＧＧＡＧＧＧＣＴ ＴＧＴＧＧＣＡＣＴＧ ＴＧＴＧＡＴＧＧＡＧ ＡＡＧＧＡＧＧＣＡＴ
９２１ ＧＴＴＡＴＡＴＣＣＡ ＣＡＧＧＧＣＡＣＧＣ ＡＴＣＴＧＣＴＣＴＴ ＧＧＧＣＡＴＧＧＧＣ
９６１ ＴＧＣＡＡＣＣＣＣＡ ＴＧＡＧＧＧＧＴＧＡ ＧＧＡＧＴＧＧＴＴＣ ＡＴＣＣＴＡＣＡＧＣ
１００１ ＡＣＴＧＣＣＣＡＡＣ ＣＴＧＧＧＴＣＡＧＣ ＣＴＣＡＧＧＴＣＡＡ ＡＧＡＣＴＧＧＧＣＧ
１０４１ ＧＴＴＣＡＴＣＴＣＡ ＧＴＣＡＴＣＴＡＣＧ ＡＴＧＧＴＧＡＧＧＴ ＧＣＧＴＧＣＴＧＣＴ
１０８１ ＴＣＴＧＡＧＣＧＣＴ ＴＡＡＡＣＣＧＡＡＴ ＧＴＣＣＴＴＧＴＴＣ ＣＡＧＴＴＴＧＡＡＴ
１１２１ ＧＴＧＡＣＡＧＴＧＡ ＧＡＧＣＣＣＣＡＣＴ ＧＴＧＣＡＧＣＴＴＣ ＧＴＴＣＡＧＣＣＡＡ
１１６１ ＴＧＧＣＴＡＣＴＡＣ ＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡ ＧＧＣＧＣＣＡＣＡＧ ＧＧＣＡＧＴＡＡＴＧ
１２０１ ＧＣＴＧＡＴＧＧＧＣ ＡＣＣＣＣＣＴＧＧＡ ＧＴＣＴＧＡＣＡＣＧ ＴＴＣＴＴＣＣＧＡＡ
１２４１ ＴＧＣＡＣＴＧＧＡＡ ＣＴＧＴＧＧＣＡＧＧ ＡＴＣＡＴＣＣＴＧＣ ＡＧＴＣＣＴＧＣＡＧ
１２８１ ＧＧＧＧＣＧＣＴＴＣ ＣＴＧＧＧＣＡＴＴＧ ＣＡＣＣＣＡＡＣＡＧ ＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧ
１３２１ ＧＣＣＡＡＴＧＴＣＡ ＴＣＣＴＴＣＣＡＧＧ ＣＣＣＡＡＡＴＧＡＧ ＧＡＡＴＴＴＧＧＧＡ
１３６１ ＴＴＴＴＡＴＴＴＧＣ ＣＡＡＴＣＧＣＴＣＣ ＴＴＣＣＴＴＧＴＡＴ ＴＧＣＧＡＧＧＴＣＧ
１４０１ ＴＴＡＴＧＧＣＴＡＴ ＧＴＧＧＧＣＴＣＣＴ ＣＡＴＣＧＧＧＣＣＡ ＴＧＡＣＣＴＣＡＴＡ
１４４１ ＣＡＧＴＧＣＡＡＣＣ ＡＧＧＡＴＣＡＧＣＣ ＣＧＡＣＣＧＣＡＴＴ ＣＡＴＣＴＡＣＴＡＣ
１４８１ ＣＣＴＧＣＣＧＡＣＣ ＧＧＧＴＡＴＣＴＡＣ ＣＡＣＴＴＣＣＡＧＧ ＣＡＣＡＧＧＧＧＧＧ
１５２１ ＡＴＣＣＴＴＣＴＧＧ ＴＣＡＡＴＡＡＣＡＴ ＣＣＴＴＴＧＧＣＡＣ ＣＴＴＴＣＧＣＣＣＴ
１５６１ ＴＧＧＧＧＣＡＡＧＴ ＴＴＧＣＣＣＴＣＡＡ ＣＴＴＣＴＧＴＡＴＣ ＧＡＧＣＴＴＣＡＧＧ
１６０１ ＧＧＡＧＣＡＡＣＴＴ ＡＣＴＣＡＣＴＧＴＡ ＣＴＧＧＣＣＣＣＣＡ ＡＴＧＧＣＴＴＣＴＡ
１６４１ ＣＡＴＧＣＧＡＧＣＣ ＧＡＣＣＡＡＡＧＴＧ ＧＣＡＣＣＣＴＧＴＴ ＧＧＣＡＧＡＣＡＧＴ
１６８１ ＧＡＡＧＡＣＡＴＴＡ ＣＣＡＧＡＧＡＧＴＧ ＴＡＴＣＴＧＧＧＡＡ ＴＴＴＴＡＧＧＴＣＡ
１７２１ ＡＴＧＧＧＡＴＧＴＣ ＡＣＣＴＡＣＣＡＡＡ ＡＴＣＣＡＡＡＴＣＣ ＴＣＣＡＧＧＡＡＡＡ
１７６１ ＡＣＴＡＣＴＡＣＡＣ ＴＡＡＡＴＧＧＡＣＣ ＡＧＧＡＡＣＣＴＣＡ ＧＡＧＴＣＡＡＧＡＴ
１８０１ ＣＣＡＡＧＡＧＡＡＧ ＡＡＣＡＴＣＴＧＴＴ ＡＣＡＡＣＴＴＴＴＣ ＣＴＡＣＣＣＡＧＴＴ
１８４１ ＴＡＧＣＡＡＡＡＣＡ ＣＣＴＧＴＴＴＴＡＴ ＧＣＡＡＣＡＡＴＡＣ ＡＴＣＡＣＡＡＣＡＧ
１８８１ ＧＣＣ
マウスｆａｓｃｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇ １における配列の一例（登録番号ＮＰ０３２０１０、ｇｉ：１１３６８０３４８）が、下記に配列番号７として提供される。
１ ＭＴＡＮＧＴＡＥＡＶ ＱＩＱＦＧＬＩＳＣＧ ＮＫＹＬＴＡＥＡＦＧ ＦＫＶＮＡＳＡＳＳＬ
４１ ＫＫＫＱＩＷＴＬＥＱ ＰＰＤＥＡＧＳＡＡＶ ＣＬＲＳＨＬＧＲＹＬ ＡＡＤＫＤＧＮＶＴＣ
８１ ＥＲＥＶＰＤＧＤＣＲ ＦＬＶＶＡＨＤＤＧＲ ＷＳＬＱＳＥＡＨＲＲ ＹＦＧＧＴＥＤＲＬＳ
１２１ ＣＦＡＱＳＶＳＰＡＥ ＫＷＳＶＨＩＡＭＨＰ ＱＶＮＩＹＳＶＴＲＫ ＲＹＡＨＬＳＡＲＰＡ
１６１ ＤＥＩＡＶＤＲＤＶＰ ＷＧＶＤＳＬＩＴＬＡ ＦＱＤＱＲＹＳＶＱＴ ＳＤＨＲＦＬＲＨＤＧ
２０１ ＲＬＶＡＲＰＥＰＡＴ ＧＦＴＬＥＦＲＳＧＫ ＶＡＦＲＤＣＥＧＲＹ ＬＡＰＳＧＰＳＧＴＬ
２４１ ＫＡＧＫＡＴＫＶＧＫ ＤＥＬＦＡＬＥＱＳＣ ＡＱＶＶＬＱＡＡＮＥ ＲＮＶＳＴＲＱＧＭＤ
２８１ ＬＳＡＮＱＤＥＥＴＤ ＱＥＴＦＱＬＥＩＤＲ ＤＴＲＫＣＡＦＲＴＨ ＴＧＫＹＷＴＬＴＡＴ
３２１ ＧＧＶＱＳＴＡＳＴＫ ＮＡＳＣＹＦＤＩＥＷ ＣＤＲＲＩＴＬＲＡＳ ＮＧＫＦＶＴＡＫＫＮ
３６１ ＧＱＬＡＡＳＶＥＴＡ ＧＤＳＥＬＦＬＭＫＬ ＩＮＲＰＩＩＶＦＲＧ ＥＨＧＦＩＧＣＲＫＶ
４０１ ＴＧＴＬＤＡＮＲＳＳ ＹＤＶＦＱＬＥＦＮＤ ＧＡＹＮＩＫＤＳＴＧ ＫＹＷＴＶＧＳＤＳＳ
４４１ ＶＴＳＳＳＤＴＰＶＤ ＦＦＬＥＦＣＤＹＮＫ ＶＡＬＫＶＧＧＲＹＬ ＫＧＤＨＡＧＶＬＫＡ
４８１ ＣＡＥＴＩＤＰＡＳＬ ＷＥＹ
配列番号７のファスチンポリペプチドにおけるｃＤＮＡ配列が、ＮＣＢＩデータベース内に登録番号ＮＭ＿００７９８４（ｇｉ：１１３６８０３４７）として見出されうる。このヌクレオチド配列は、容易な参照のために下記に配列番号８として提供される。
１ ＴＧＴＧＧＡＧＡＡＣ ＴＧＣＡＧＣＧＧＧＣ ＴＡＡＧＣＣＧＴＧＴ ＴＧＡＡＣＡＡＡＧＧ
４１ ＡＧＧＴＣＧＧＧＣＡ ＣＡＧＣＴＡＴＣＣＡ ＡＧＣＴＣＣＣＧＧＧ ＧＣＣＡＣＣＧＧＧＣ
８１ ＣＧＣＣＣＴＣＣＧＣ ＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣ ＧＣＣＡＡＣＧＧＣＡ ＣＧＧＣＡＧＡＧＧＣ
１２１ ＴＧＴＧＣＡＧＡＴＴ ＣＡＧＴＴＣＧＧＧＣ ＴＣＡＴＣＡＧＣＴＧ ＣＧＧＣＡＡＣＡＡＧ
１６１ ＴＡＣＣＴＧＡＣＡＧ ＣＣＧＡＧＧＣＧＴＴ ＣＧＧＧＴＴＣＡＡＧ ＧＴＧＡＡＣＧＣＡＴ
２０１ ＣＣＧＣＴＡＧＴＡＧ ＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧ ＡＡＧＣＡＧＡＴＣＴ ＧＧＡＣＧＣＴＧＧＡ
２４１ ＧＣＡＡＣＣＴＣＣＣ ＧＡＴＧＡＧＧＣＧＧ ＧＣＡＧＣＧＣＧＧＣ ＣＧＴＧＴＧＴＣＴＧ
２８１ ＣＧＣＡＧＣＣＡＣＣ ＴＧＧＧＴＣＧＣＴＡ ＣＣＴＧＧＣＣＧＣＣ ＧＡＣＡＡＧＧＡＣＧ
３２１ ＧＣＡＡＣＧＴＧＡＣ ＣＴＧＣＧＡＧＣＧＣ ＧＡＧＧＴＧＣＣＣＧ ＡＣＧＧＣＧＡＣＴＧ
３６１ ＣＣＧＣＴＴＴＣＴＣ ＧＴＣＧＴＧＧＣＧＣ ＡＣＧＡＣＧＡＣＧＧ ＣＣＧＣＴＧＧＴＣＧ
４０１ ＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧ ＡＧＧＣＴＣＡＣＣＧ ＧＣＧＣＴＡＣＴＴＴ ＧＧＣＧＧＣＡＣＣＧ
４４１ ＡＧＧＡＣＣＧＣＣＴ ＧＴＣＣＴＧＣＴＴＣ ＧＣＧＣＡＧＡＧＣＧ ＴＧＴＣＧＣＣＧＧＣ
４８１ ＣＧＡＧＡＡＧＴＧＧ ＡＧＣＧＴＧＣＡＣＡ ＴＣＧＣＣＡＴＧＣＡ ＣＣＣＧＣＡＧＧＴＴ
５２１ ＡＡＣＡＴＣＴＡＣＡ ＧＣＧＴＴＡＣＣＣＧ ＣＡＡＧＣＧＣＴＡＣ ＧＣＧＣＡＴＣＴＧＡ
５６１ ＧＣＧＣＧＣＧＧＣＣ ＧＧＣＣＧＡＣＧＡＧ ＡＴＣＧＣＧＧＴＡＧ ＡＣＣＧＣＧＡＣＧＴ
６０１ ＧＣＣＴＴＧＧＧＧＣ ＧＴＣＧＡＣＴＣＧＣ ＴＣＡＴＣＡＣＣＴＴ ＧＧＣＣＴＴＣＣＡＧ
６４１ ＧＡＣＣＡＡＣＧＣＴ ＡＣＡＧＴＧＴＧＣＡ ＧＡＣＧＴＣＣＧＡＣ ＣＡＣＣＧＣＴＴＣＣ
６８１ ＴＧＣＧＣＣＡＣＧＡ ＣＧＧＧＣＧＣＣＴＴ ＧＴＧＧＣＡＣＧＧＣ ＣＧＧＡＧＣＣＣＧＣ
７２１ ＣＡＣＧＧＧＣＴＴＣ ＡＣＧＣＴＧＧＡＧＴ ＴＣＣＧＣＴＣＣＧＧ ＣＡＡＧＧＴＧＧＣＣ
７６１ ＴＴＴＣＧＣＧＡＣＴ ＧＣＧＡＡＧＧＴＣＧ ＣＴＡＣＣＴＧＧＣＴ ＣＣＧＴＣＣＧＧＧＣ
８０１ ＣＣＡＧＣＧＧＣＡＣ ＣＣＴＣＡＡＧＧＣＴ ＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡ ＣＣＡＡＧＧＴＧＧＧ
８４１ ＣＡＡＡＧＡＴＧＡＧ ＣＴＣＴＴＣＧＣＣＣ ＴＧＧＡＡＣＡＧＡＧ ＣＴＧＣＧＣＴＣＡＧ
８８１ ＧＴＧＧＴＧＣＴＧＣ ＡＧＧＣＧＧＣＣＡＡ ＣＧＡＧＡＧＧＡＡＣ ＧＴＧＴＣＣＡＣＧＣ
９２１ ＧＣＣＡＧＧＧＡＡＴ ＧＧＡＣＣＴＧＴＣＡ ＧＣＣＡＡＴＣＡＧＧ ＡＴＧＡＡＧＡＧＡＣ
９６１ ＣＧＡＴＣＡＧＧＡＧ ＡＣＣＴＴＣＣＡＧＣ ＴＧＧＡＧＡＴＣＧＡ ＣＣＧＣＧＡＣＡＣＡ
１００１ ＡＧＡＡＡＧＴＧＴＧ ＣＣＴＴＴＣＧＣＡＣ ＣＣＡＣＡＣＧＧＧＣ ＡＡＧＴＡＣＴＧＧＡ
１０４１ ＣＡＣＴＧＡＣＧＧＣ ＧＡＣＣＧＧＡＧＧＴ ＧＴＧＣＡＡＴＣＣＡ ＣＴＧＣＧＴＣＣＡＣ
１０８１ ＣＡＡＧＡＡＣＧＣＣ ＡＧＣＴＧＣＴＡＣＴ ＴＴＧＡＣＡＴＣＧＡ ＧＴＧＧＴＧＴＧＡＣ
１１２１ ＣＧＣＣＧＧＡＴＣＡ ＣＴＣＴＧＡＧＡＧＣ ＣＴＣＣＡＡＣＧＧＣ ＡＡＧＴＴＴＧＴＧＡ
１１６１ ＣＣＧＣＣＡＡＧＡＡ ＡＡＡＴＧＧＣＣＡＧ ＣＴＧＧＣＣＧＣＣＴ ＣＧＧＴＧＧＡＧＡＣ
１２０１ ＡＧＣＡＧＧＧＧＡＣ ＴＣＧＧＡＡＣＴＣＴ ＴＣＣＴＣＡＴＧＡＡ ＧＣＴＧＡＴＴＡＡＣ
１２４１ ＣＧＣＣＣＣＡＴＣＡ ＴＣＧＴＧＴＴＣＣＧ ＧＧＧＧＧＡＡＣＡＣ ＧＧＧＴＴＣＡＴＴＧ
１２８１ ＧＣＴＧＣＣＧＣＡＡ ＧＧＴＣＡＣＧＧＧＣ ＡＣＴＣＴＧＧＡＴＧ ＣＣＡＡＣＣＧＴＴＣ
１３２１ ＣＡＧＴＴＡＣＧＡＴ ＧＴＣＴＴＣＣＡＧＴ ＴＧＧＡＡＴＴＣＡＡ ＴＧＡＣＧＧＣＧＣＣ
１３６１ ＴＡＣＡＡＣＡＴＣＡ ＡＡＧＡＣＴＣＣＡＣ ＧＧＧＣＡＡＧＴＡＣ ＴＧＧＡＣＧＧＴＧＧ
１４０１ ＧＴＡＧＴＧＡＴＴＣ ＣＴＣＧＧＴＣＡＣＣ ＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧ ＡＣＡＣＣＣＣＴＧＴ
１４４１ ＧＧＡＴＴＴＣＴＴＣ ＣＴＴＧＡＧＴＴＣＴ ＧＴＧＡＣＴＡＣＡＡ ＴＡＡＧＧＴＧＧＣＴ
１４８１ ＣＴＣＡＡＧＧＴＧＧ ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡ ＣＣＴＧＡＡＧＧＧＧ ＧＡＣＣＡＣＧＣＴＧ
１５２１ ＧＧＧＴＣＣＴＧＡＡ ＧＧＣＣＴＧＣＧＣＧ ＧＡＧＡＣＴＡＴＣＧ ＡＣＣＣＣＧＣＣＴＣ
１５６１ ＡＣＴＣＴＧＧＧＡＧ ＴＡＣＴＡＧＧＧＣＣ ＡＣＣＴＧＣＣＣＴＣ ＴＧＣＡＧＧＣＣＧＣ
１６０１ ＴＣＴＣＧＴＣＡＧＴ ＣＣＣＴＣＣＴＧＴＴ ＡＴＣＣＴＴＡＣＴＣ ＡＴＣＧＧＧＴＧＧＣ
１６４１ ＣＣＴＧＣＡＧＣＡＧ ＧＴＧＧＣＡＡＡＣＣ ＣＣＴＴＧＣＣＴＴＴ ＣＡＡＡＣＴＧＧＡＡ
１６８１ ＡＣＣＣＡＡＧＡＧＡ ＡＡＡＣＧＧＴＧＣＣ ＣＴＴＧＣＴＧＴＣＡ ＣＣＣＴＣＴＧＴＧＧ
１７２１ ＡＣＣＣＣＴＴＴＴＣ ＣＣＴＡＡＣＴＣＡＣ ＴＧＣＴＣＣＣＣＡＴ ＧＧＧＴＣＧＧＴＧＧ
１７６１ ＣＴＧＣＡＧＡＣＴＧ ＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧ ＧＧＡＣＴＣＴＧＧＴ ＴＣＣＣＴＣＴＧＴＣ
１８０１ ＣＣＣＴＴＣＴＴＴＣ ＣＡＴＧＧＧＧＡＡＣ ＴＣＴＧＧＣＡＣＣＴ ＴＴＣＴＴＣＴＧＡＣ
１８４１ ＣＴＣＡＧＴＣＡＡＣ ＴＣＴＧＡＧＣＣＴＴ ＡＴＴＴＣＣＣＣＣＣ ＡＧＧＡＡＧＴＧＧＣ
１８８１ ＣＴＡＧＧＡＧＡＡＧ ＣＴＡＣＡＧＧＧＣＣ ＴＡＧＧＧＡＣＴＴＡ ＣＣＣＴＧＡＧＣＴＴ
１９２１ ＧＴＡＡＣＴＧＧＡＡ ＧＡＣＣＣＣＧＴＣＣ ＣＴＡＴＣＣＣＣＧＣ ＴＣＣＣＧＣＣＣＣＣ
１９６１ ＡＣＣＣＣＡＣＣＣＣ ＡＣＣＣＣＴＧＣＴＣ ＴＧＧＣＣＣＣＡＧＣ ＣＴＣＴＧＧＡＧＧＣ
２００１ ＣＡＧＣＣＴＴＴＴＧ ＧＣＧＧＧＡＣＴＧＡ ＡＧＣＣＧＧＧＣＡＴ ＧＧＣＣＡＡＣＣＴＴ
２０４１ ＧＣＣＣＡＣＡＡＧＴ ＧＴＴＴＴＴＣＴＧＧ ＡＴＣＴＴＧＧＣＴＧ ＧＡＡＧＧＣＡＧＴＣ
２０８１ ＴＧＴＣＣＣＡＴＣＣ ＴＧＣＡＧＴＧＴＴＴ ＧＧＧＣＣＴＧＧＣＴ ＣＴＴＴＧＡＣＴＣＡ
２１２１ ＡＡＧＣＴＡＧＣＴＡ ＧＧＴＧＧＣＡＣＴＣ ＣＧＴＧＴＣＧＣＴＣ ＣＴＧＣＡＣＡＴＴＣ
２１６１ ＴＧＧＡＡＧＧＧＧＣ ＧＧＧＣＣＴＣＴＣＡ ＣＣＣＡＣＣＴＣＡＴ ＴＣＣＴＴＴＴＣＣＣ
２２０１ ＣＣＴＧＧＣＣＴＧＡ ＣＴＧＧＡＡＧＣＡＧ ＡＡＡＡＡＴＧＡＣＣ ＡＡＡＴＣＡＧＴＡＴ
２２４１ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ ＴＴＣＴＴＴＡＡＧＧ ＡＡＡＴＧＴＴＡＣＴ ＧＴＴＧＡＡＡＧＧＣ
２２８１ ＣＣＴＡＧＧＣＡＡＧ ＣＣＴＧＣＣＣＴＧＴ ＴＧＧＴＴＧＴＡＧＴ ＣＧＴＧＡＧＴＧＧＴ
２３２１ ＣＴＴＧＧＧＧＧＧＡ ＧＡＴＧＣＴＴＧＧＣ ＴＣＣＴＧＴＣＣＣＴ ＧＣＣＴＣＣＣＣＡＧ
２３６１ ＣＧＧＧＴＴＣＣＣＴ ＣＣＣＴＣＣＣＴＣＣ ＴＧＣＣＴＧＡＣＣＡ ＣＣＣＣＡＧＣＴＣＴ
２４０１ ＧＧＣＴＣＴＧＴＧＡ ＴＴＧＧＴＧＣＴＣＣ ＡＣＧＴＣＴＴＣＣＣ ＡＧＡＣＡＣＣＴＣＧ
２４４１ ＧＧＧＣＴＣＣＴＧＧ ＧＣＧＧＧＡＧＡＡＡ ＧＣＣＧＧＡＴＧＴＧ ＣＣＣＣＴＣＣＣＴＧ
２４８１ ＧＧＡＧＣＣＣＴＧＧ ＡＧＴＡＡＡＣＣＴＣ ＡＧＧＧＧＧＣＣＣＴ ＴＴＣＣＣＡＡＴＣＡ
２５２１ ＣＣＣＣＣＴＴＣＣＡ ＣＣＧＡＣＣＣＣＴＣ ＡＡＣＡＣＣＡＴＧＣ ＡＴＣＴＣＡＣＴＣＴ
２５６１ ＧＧＧＴＧＴＣＴＣＧ ＣＴＣＣＴＴＴＡＴＴ ＴＴＴＴＴＧＴＡＡＣ ＴＧＴＣＡＴＴＴＣＴ
２６０１ ＡＴＡＡＣＴＣＴＧＡ ＡＧＡＣＣＣＡＴＧＡ ＴＡＧＴＡＡＧＣＴＴ ＴＧＡＡＣＴＧＧＡＡ
２６４１ ＡＡＴＡＡＡＧＴＡＡ ＡＡＴＣＡＡＧＴＣＴ ＧＣＧＧＣＣＣ
一部の実施形態では、ファスチンポリペプチドは、アクチン結合部位および／またはマイグラスタチン類似体における結合部位を含む切断ポリペプチドである。下記により詳細に例示されるように、ファスチンはマイグラスタチン類似体に結合し、かつかかるマイグラスタチン類似体におけるファスチン結合部位はファスチンアミノ酸残基Ｈｉｓ３９２、Ｇｌｕ３９１、Ａｌａ４８８、Ｌｙｓ４７１、Ｈｉｓ４７４およびＡｓｐ４７３を含む。さらに、ファスチンはまた、２つのアクチン結合部位を有する。これら２つの部位の１つは、マイグラスタチン類似体における結合部位と同じクレフト内に位置する。第２のアクチン結合部位は、アミノ酸残基Ｔｈｒ３２６、Ｓｅｒ３２８、Ｓｅｒ３２９、Ｌｙｓ３３０、Ａｓｎ３３１、Ｓｅｒ３３３、Ａｒｇ２７６、Ｇｌｎ２７７、Ｍｅｔ２７９、Ａｓｐ２８６、Ｇｌｕ２８７、Ｇｌｎ２９１、Ｔｈｒ３２０、Ｔｈｒ３１８、Ｌｙｓ３１３、Ｔｈｒ３１１、Ｇｌｎ３６２、Ａｓｎ３６０、Ｌｙｓ３５９、Ａｓｐ１６８、Ｐｒｏ１５９、Ａｒｇ１５１、Ｌｙｓ１５０、Ａｒｇ１４９、Ａｒｇ１９７、Ａｒｇ２０１、Ｇｌｕ２０７、Ｇｌｕ２２７、Ｓｅｒ２３７、Ｐｒｏ２３６、Ｌｙｓ２４１、Ｌｙｓ２４７、およびＬｙｓ２５０を含む。
本発明において使用されうる切断ファスチンポリペプチドの一例がファスチンアミノ酸２５９〜４９３を有する任意のファスチンペプチドであり、それは適切に折りたたむことで、アクチンおよび／またはマイグラスタチン結合部位が生成されうる。したがって、例えば配列番号１のアミノ酸２５９〜４９３を有するファスチンペプチドは、次の配列（配列番号９）を有する。
２５９ ＳＣ ＡＱＶＶＬＱＡＡＮＥ ＲＮＶＳＴＲＱＧＭＤ
２８１ ＬＳＡＮＱＤＥＥＴＤ ＱＥＴＦＱＬＥＩＤＲ ＤＴＫＫＣＡＦＲＴＨ ＴＧＫＹＷＴＬＴＡＴ
３２１ ＧＧＶＱＳＴＡＳＳＫ ＮＡＳＣＹＦＤＩＥＷ ＲＤＲＲＩＴＬＲＡＳ ＮＧＫＦＶＴＳＫＫＮ
３６１ ＧＱＬＡＡＳＶＥＴＡ ＧＤＳＥＬＦＬＭＫＬ ＩＮＲＰＩＩＶＦＲＧ ＥＨＧＦＩＧＣＲＫＶ
４０１ ＴＧＴＬＤＡＮＲＳＳ ＹＤＶＦＱＬＥＦＮＤ ＧＡＹＮＩＫＤＳＴＧ ＫＹＷＴＶＧＳＤＳＡ
４４１ ＶＴＳＳＧＤＴＰＶＤ ＦＦＦＥＦＣＤＹＮＫ ＶＡＩＫＶＧＧＲＹＬ ＫＧＤＨＡＧＶＬＫＡ
４８１ ＳＡＥＴＶＤＰＡＳＬ ＷＥＹ
配列番号３のアミノ酸２５９〜４９３を有するファスチンペプチドの別の例は、次の配列（配列番号１０）を有する。
２５９ ＰＱ ＶＶＬＶＡＡＮＨＲＹ ＶＳＶＲＱＧＶＮＶＳ
２８１ ＡＮＱＤＤＥＬＤＨＥ ＴＦＬＭＱＩＤＱＥＴ ＫＫＣＴＦＹＳＳＴＧ ＧＹＷＴＬＶＴＨＧＧ
３２１ ＩＨＡＴＡＴＱＶＳＡ ＮＴＭＦＥＭＥＷＲＧ ＲＲＶＡＬＫＡＳＮＧ ＲＹＶＣＭＫＫＮＧＱ
３６１ ＬＡＡＩＳＤＦＶＧＰ ＰＰＲＰＡＷＴＧＫＶ ＡＧＧＡＡＱＱＴＬＳ ＰＰＧＫＤＥＥＦＴＬ
４０１ ＫＬＩＮＲＰＩＬＶＬ ＲＧＬＤＧＦＶＣＨＨ ＲＧＳＮＱＬＤＴＮＲ ＳＶＹＤＶＦＨＬＳＦ
４４１ ＳＤＧＡＹＲＩＲＧＲ ＤＧＧＦＷＹＴＧＳＨ ＧＳＶＣＳＤＧＥＲＡ ＥＤＦＶＦＥＦＲＥＲ
４８１ ＧＲＬＡＩＲＡＲＳＧ ＫＹＬＲＧＧＡＳＧＬ ＬＲＡＤＡＤＡＰＡＧ ＴＡＬＷＥＹ
配列番号５のアミノ酸２５９〜４９３を有するファスチンペプチドの別の例は、次の配列（配列番号１１）を有する。
２５９ ＬＱ ＨＣＰＴＷＶＳＬＲＳ ＫＴＧＲＦＩＳＶＩＹ
２８１ ＤＧＥＶＲＡＡＳＥＲ ＬＮＲＭＳＬＦＱＦＥ ＣＤＳＥＳＰＴＶＱＬ ＲＳＡＮＧＹＹＬＳＱ
３２１ ＲＲＨＲＡＶＭＡＤＧ ＨＰＬＥＳＤＴＦＦＲ ＭＨＷＮＣＧＲＩＩＬ ＱＳＣＲＧＲＦＬＧＩ
３６１ ＡＰＮＳＬＬＭＡＮＶ ＩＬＰＧＰＮＥＥＦＧ ＩＬＦＡＮＲＳＦＬＶ ＬＲＧＲＹＧＹＶＧＳ
４０１ ＳＳＧＨＤＬＩＱＣＮ ＱＤＱＰＤＲＩＨＬＬ ＰＣＲＰＧＩＹＨＦＱ ＡＱＧＧＳＦＷＳＩＴ
４４１ ＳＦＧＴＦＲＰＷＧＫ ＦＡＬＮＦＣＩＥＬＱ ＧＳＮＬＬＴＶＬＡＰ ＮＧＦＹＭＲＡＤＱＳ
４８１ ＧＴＬＬＡＤＳＥＤＩ ＴＲＥＣＩＷＥＦ
配列番号７のアミノ酸２５９〜４９３を有するファスチンペプチドの別の例は、次の配列（配列番号１２）を有する。
２５９ ＳＣ ＡＱＶＶＬＱＡＡＮＥ ＲＮＶＳＴＲＱＧＭＤ
２８１ ＬＳＡＮＱＤＥＥＴＤ ＱＥＴＦＱＬＥＩＤＲ ＤＴＲＫＣＡＦＲＴＨ ＴＧＫＹＷＴＬＴＡＴ
３２１ ＧＧＶＱＳＴＡＳＴＫ ＮＡＳＣＹＦＤＩＥＷ ＣＤＲＲＩＴＬＲＡＳ ＮＧＫＦＶＴＡＫＫＮ
３６１ ＧＱＬＡＡＳＶＥＴＡ ＧＤＳＥＬＦＬＭＫＬ ＩＮＲＰＩＩＶＦＲＧ ＥＨＧＦＩＧＣＲＫＶ
４０１ ＴＧＴＬＤＡＮＲＳＳ ＹＤＶＦＱＬＥＦＮＤ ＧＡＹＮＩＫＤＳＴＧ ＫＹＷＴＶＧＳＤＳＳ
４４１ ＶＴＳＳＳＤＴＰＶＤ ＦＦＬＥＦＣＤＹＮＫ ＶＡＬＫＶＧＧＲＹＬ ＫＧＤＨＡＧＶＬＫＡ
４８１ ＣＡＥＴＩＤＰＡＳＬ ＷＥＹ
かかるファスチンペプチドは、治療剤および抗ファスチン抗体を産生するための抗原として有用である。本明細書中に例示および記載されるように、転移癌は、ファスチンの発現および／または活性の増大に関連する。したがって、ファスチンの発現およびファスチン活性と競合するかまたはそれを阻害する作用物質は、癌、特に転移癌の治療にとって有用な治療剤である。例えば、ファスチンアミノ酸２５９〜４９３を有するペプチドは、インビボでファスチンと競合し、かつ癌転移の促進において通常の役割を果たす内因性ファスチンを阻害しうる。さらに、ファスチンアミノ酸２５９〜４９３を有するペプチドの投与により、哺乳動物が内因性に生成されるファスチン、特にファスチンのアクチンおよび／またはマイグラスタチン結合部位に対して免疫されうる。免疫された動物において産生される抗体は、ファスチンがアクチンに結合することを阻止するのに役立つ。あるいは、かかる抗体は、ファスチンのマイグラスタチン結合部位に結合することにより、マイグラスタチン類似体の阻害効果を再現しうる。
阻害性核酸
ファスチンの発現および／または翻訳を阻害しうる核酸は、本明細書中に記載の本発明の方法において使用してもよい。かかる阻害性核酸は、ファスチン核酸、例えば配列番号２、４、６、もしくは８のいずれかに対応する配列を有するファスチンＲＮＡに結合しうる。阻害性核酸は、４以上のヌクレオチド長を有するリボースヌクレオチドまたはデオキシリボースヌクレオチドのポリマーである。阻害性核酸は、天然ヌクレオチド；合成、修飾、またはホスホロチオレートなどの擬似（ｐｓｅｕｄｏ）ヌクレオチド；ならびに３２Ｐ、ビオチン、蛍光色素またはジゴキシゲニンなどの検出可能な標識を有するヌクレオチドを含みうる。ファスチン核酸の発現および／または活性を低下させうる阻害性核酸は、ファスチン核酸に対して完全に相補的でありうる。あるいは、配列間での一部の変異性（ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）は許容されうる。
本発明の阻害性核酸は、ファスチン核酸（例えば、配列番号２、４、６、もしくは８のいずれか）に細胞内条件下またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズしうる。本発明の阻害性核酸は内因性ファスチン核酸に対して十分に相補的であり、一方または両方の条件下でファスチン核酸の発現が阻害される。細胞内条件は、細胞、例えば哺乳動物細胞の内部で典型的に見出される温度、ｐＨおよび塩濃度などの条件を指す。かかる哺乳動物細胞の一例が、癌細胞（例えば転移性細胞）、またはファスチンが発現されるかもしくは発現されうる任意の細胞である。
一般に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列における熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。しかし、ストリンジェントな条件は、他に本明細書中で適切とされたように、所望されるストリンジェンシーの度合に依存し、選択される配列の熱融解点より約１℃〜約２０℃低い範囲内の温度を包含する。例えばファスチンコード配列に対して正確に相補的な隣接ヌクレオチドの２、３、４、もしくは５もしくはそれより大きいストレッチ（それぞれは隣接コード配列に相補的でない隣接ヌクレオチドのストレッチによって分離される）を含む阻害性核酸は、ファスチン核酸の機能を阻害しうる。一般に、隣接ヌクレオチドの各ストレッチは、少なくとも４、５、６、７、もしくは８もしくはそれより大きいヌクレオチド長である。非相補的介在配列は、１、２、３、もしくは４ヌクレオチド長でありうる。当業者は、センス核酸に対してハイブリダイズされた阻害性核酸の計算される融解点を容易に使用し、特定の標的核酸の発現を阻害するために許容されることになるミスマッチの程度を見積もることができる。本発明の阻害性核酸として、例えばリボザイムまたはアンチセンス核酸分子が挙げられる。
アンチセンス核酸分子は一本鎖または二本鎖（例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ））である場合があり、また酵素依存性の様式でか、または立体遮断（ｓｔｅｒｉｃ ｂｌｏｃｋｉｎｇ）によって機能しうる。酵素依存性の様式で機能するアンチセンス分子は、標的ｍＲＮＡを分解するためのＲＮアーゼＨ活性に依存した形態を含む。これらは、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡおよびホスホロチオエート分子、ならびにセンス−アンチセンス鎖対合による標的ｍＲＮＡの認識、その後の標的ｍＲＮＡの分解またはＲＮＡ誘導サイレンシング複合体を伴う二本鎖ＲＮＡｉ／ｓｉＲＮＡ系を含む。立体遮断アンチセンスは、ＲＮアーゼ−Ｈから独立であり、標的ｍＲＮＡに結合し、他のプロセスを妨げることにより、遺伝子発現または他のｍＲＮＡ依存性細胞プロセスに干渉する。立体遮断アンチセンスは、（通常はＲＮアーゼ−Ｈ依存性アンチセンスとのキメラにおける）２’−Ｏアルキル、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、固定化核酸（ＬＮＡ）およびモルホリノアンチセンスを含む。
例えば、低分子干渉ＲＮＡを使用することで、ファスチン翻訳が、ファスチンポリペプチドのレベルが低下するように特異的に低下されうる。ｓｉＲＮＡは、転写後遺伝子サイレンシングを配列特異的な様式で媒介する。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｈｏｔｔｏｐｉｃｓ／ｒｎａｉ／ｒｎａｉ＿ｍａｙ２００２＿ｐｒｉｎｔ．ｈｔｍｌ（最後に検索を行ったのが２００６年５月１０日）を参照のこと。ｓｉＲＮＡは、一旦ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体に組み込まれると、、複合体を相同なｍＲＮＡ転写産物に誘導する（それは次いで複合体によって切断される）ことによって相同な内因性ｍＲＮＡ転写産物の切断を媒介する。ｓｉＲＮＡは、ファスチン転写産物の任意の領域に対して相同でありうる。相同性の領域は、３０以下のヌクレオチド長、好ましくは２５未満のヌクレオチド長、より好ましくは約２１〜２３ヌクレオチド長、最も好ましくは約１９ヌクレオチド長でありうる。ｓｉＲＮＡは、典型的には二本鎖であり、２つのヌクレオチド３’オーバーハング、例えば３’オーバーハングＵＵジヌクレオチドを有しうる。ｓｉＲＮＡを設計するための方法は当業者に既知である。例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−４９８頁（２００１年）；Ｈａｒｂｏｒｔｈら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．１３：８３−１０６頁（２００３年）を参照のこと。典型的には、ＡＡで始まる標的部位は、センスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖の双方に対して３’ＵＵオーバーハングを有し、約５０％のＧ／Ｃ含量を有する。ｓｉＲＮＡは、化学合成されうるか、インビトロ転写によって生成されうるか、あるいはｓｉＲＮＡ発現ベクターまたはＰＣＲ発現カセットから発現されうる。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｔｂ／ｔｂ＿５０６ｈｔｍｌ（最後に検索を行ったのが２００６年５月１０日）を参照のこと。化学合成されたｓｉＲＮＡは、ＰＣＲ用のＤＮＡプライマーの作製に使用される同じ固相支持体化学物質に依存する。発現またはウイルス性ベクターおよびそのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）プロモーターは、細胞内でアニールする別々のセンスおよびアンチセンス鎖としてのｓｉＲＮＡ転写産物、または単一の短いヘアピンＲＮＡ転写産物のいずれかの発現を駆動する（Ｐａｄｄｉｓｏｎ Ｐ．Ｊ．ら （２００２年） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１６、９４８−９５８頁；Ｓｕｉ Ｇ．ら （２００２年） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９、６０４７−６０５２頁；Ｐａｕｌ Ｃ．Ｐ．ら（２００２年） Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０、５０５−５０８頁；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ Ｍら （２００２年） Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０、４９７−５００頁）。ヒトおよびマウスＵ６ならびにヒトＨ１は、最も一般的に使用されるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。ポリメラーゼＩＩＩ酵素は、ＲＮＡ転写を、そのプロモーターをｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの合成に十分に適合させる明確な位置で開始させ、終結させる（Ｇｏｏｍｅｒ ＲＳら （１９９２年） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｅｐ ２５；２０（１８）：４９０３−１２頁）。
これらのＰｏｌ ＩＩＩプロモーター長が短いことにより（３００ｂｐ未満）、ＰＣＲ法を用いる発現カセットの生成が促進され、必要なプロモーターおよびｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ配列を有する二本鎖ＤＮＡの線状断片が増幅される（Ｃａｔａｎｏｔｔｏ Ｄ．ら （２００２年） ＲＮＡ８、１４５４−１４６０頁）。カセット自体またはカセットの精製されたインビトロ転写産物のいずれかが、ＲＮＡｉにおける核酸の供給源としての役割を果たす。
最後に、精製された哺乳動物のＤｉｃｅｒまたは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の酵素ＲＮアーゼＩＩＩでのｄｓＲＮＡインビトロの処理により、核酸がｓｉＲＮＡ二本鎖の集団に消化される。ｄｓＲＮＡの生成は、適切なベクターにクローン化される目的の遺伝子の遺伝子特異的な断片または完全長ｃＤＮＡのいずれかの両鎖のインビトロ転写を伴う。
ｓｉＲＮＡが発現ベクターまたはＰＣＲ発現カセットから発現される場合、ｓｉＲＮＡをコードする挿入物が、ｓｉＲＮＡヘアピンに折りたたむＲＮＡ転写産物として発現されうる。したがって、ＲＮＡ転写産物は、ヘアピンのループを形成するスペーサー配列および３’末端でのＵの文字列（ｓｔｒｉｎｇ）によって逆相補的アンチセンスｓｉＲＮＡ配列に連結されるセンスｓｉＲＮＡ配列を含みうる。ヘアピンのループは、任意の適切な長さ、例えば、３〜３０ヌクレオチド長、好ましくは３〜２３ヌクレオチド長であり、かつＡＵＧ、ＣＣＣ、ＵＵＣＧ、ＣＣＡＣＣ、ＣＴＣＧＡＧ、ＡＡＧＣＵＵ、ＣＣＡＣＡＣＣおよびＵＵＣＡＡＧＡＧＡを含む様々なヌクレオチド配列でありうる。ＳｉＲＮＡはまた、直接に、またはトランス遺伝子もしくはウイルスを介して導入される二本鎖ＲＮＡの切断により、インビボで生成されうる。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによる増幅は、一部の生物において生じうる。
表１は、本明細書中に記載の本発明において有用なヒトファスチンのｓｉＲＮＡ標的配列を例示する。
Figure 2011506274
アンチセンス阻害性核酸をさらに使用し、ファスチンの発現が、例えば転写および／または翻訳を阻害することによって、特異的に低下されうる。アンチセンス阻害性核酸は、ファスチンをコードするセンス核酸に相補的である。例えば、それは二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的であるか、またはｍＲＮＡ配列に相補的でありうる。それは、コード鎖全体、またはそのほんの一部に相補的でありうる。それはまた、ファスチンをコードする核酸の非コード領域の全部または一部に相補的でありうる。非コード領域は、コード領域に隣接する５’および３’領域、例えば５’および３’未翻訳配列を含む。アンチセンス阻害性核酸は、一般に少なくとも６つのヌクレオチド長であるが、約８、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０ヌクレオチド長でありうる。より長い阻害性核酸もまた使用されうる。
アンチセンス阻害性核酸は、当該技術分野で既知の方法を用い、例えばアンチセンス阻害性核酸をコードする発現ベクターまたは発現カセットからの発現によって調製されうる。あるいは、それは、天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたはその任意の組み合わせを使用する化学合成によって調製されうる。一部の実施形態では、阻害性核酸は修飾ヌクレオチドまたは非リン酸ジエステル結合から作られ、例えば、それらは阻害性核酸の生物学的安定性を高めるか、またはアンチセンス阻害性核酸とセンス核酸の間で形成される二本鎖の細胞内安定性を高めるように設計される。
天然ヌクレオチドは、リボースまたはデオキシリボースヌクレオチドアデノシン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルを含む。
修飾ヌクレオチドの例として、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン，２−メチルグアニン、３−メチルシトシン，５−メチルシトシン，Ｎ６−アデニン，７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル，β−Ｄ−マンノシルケオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸、ブトキソシン（ｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル，ケオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ），２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル，２−チオウラシル，４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンが挙げられる。
本発明の阻害剤は、ＲＮＡ干渉を介した遺伝子発現のサイレンシングに使用されうる強力なヘアピンターンを作るＲＮＡの配列である小ヘアピンＲＮＡまたは短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）でありうる。ｓｈＲＮＡヘアピン構造は、細胞機構によって切断されてｓｉＲＮＡになり、それは次いで標的ｍＲＮＡに結合し、それを切断する。ｓｈＲＮＡは、ｓｈＲＮＡコード領域がプロモーターに作動可能に連結され、ｓｈＲＮＡをコードするベクターを介して、細胞に導入されうる。選択されるプロモーターは、ｓｈＲＮＡの発現を可能にする。例えば、プロモーターは、ｓｈＲＮＡの連続的発現にとって有用なＵ６プロモーターでありうる。ベクターは、例えば娘細胞に受け継がれる可能性があり、それにより遺伝子サイレンシングの継承が可能になる。ＭｃＩｎｔｙｒｅ Ｇ、Ｆａｎｎｉｎｇ Ｇ、「Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｓｈＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ」、ＢＭＣ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．６：１（２００６年）；Ｐａｄｄｉｓｏｎら、「Ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡｓ（ｓｈＲＮＡｓ） ｉｎｄｕｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ」、ＧＥＮＥＳ ＤＥＶ．１６（８）：９４８−５８頁（２００２年）を参照のこと。
本発明の阻害剤はまた、リボザイムでありうる。リボザイムは触媒活性を有するＲＮＡ分子であり、相同性領域を有するｍＲＮＡなどの一本鎖核酸を切断することができる。例えば、Ｃｅｃｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１５３２−１５３９頁（１９８７年）；Ｃｅｃｈ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：５４３−５６８頁（１９９０年）；Ｃｅｃｈ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：６０５−６０９頁（１９９２年）；ＣｏｕｔｕｒｅおよびＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：５１０−５１５頁（１９９６年）を参照のこと。リボザイムを使用し、ファスチンｍＲＮＡ転写産物を触媒的に切断し、それによりｍＲＮＡの翻訳を阻害することが可能である。例えば、Ｈａｓｅｌｏｆｆら、米国特許第５，６４１，６７３号明細書を参照のこと。
トランスで高度に配列特異的な様式でＲＮＡ分子を切断しうるリボザイムを設計し、作成する方法が、当該技術分野において開発され、記載がなされている。例えば、Ｈａｓｅｌｏｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１頁（１９８８年）を参照のこと。リボザイムは、別個の「ハイブリダイゼーション」領域をリボザイム内に設計することによって、特異的なＲＮＡを標的としうる。ハイブリダイゼーション領域は、リボザイムが標的に対して特異的にハイブリダイズすることを可能にする、標的ＲＮＡに相補的な配列を有する。例えば、Ｇｅｒｌａｃｈら、欧州特許第３２１，２０１号明細書を参照のこと。標的配列は、特異的なヌクレオチド配列から選択される約５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、もしくは５０の隣接ヌクレオチドのセグメントでありうる。より長い相補的配列を使用することで、標的に対するハイブリダイゼーション配列の親和性が高まりうる。
リボザイムのハイブリダイズおよび切断領域が一体的に関連しうることから、相補性領域を介して標的ＲＮＡにハイブリダイズする時、リボザイムの触媒領域は標的を切断しうる。したがって、リボザイムのハイブリダイゼーション領域を修飾し、標的ファスチン核酸に相補的な配列を含めることによって、既存のリボザイムを修飾し、本発明のファスチン核酸が標的化されうる。あるいは、ファスチンをコードするｍＲＮＡを使用し、特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡがＲＮＡ分子のプールから選択されうる。例えば、ＢａｒｔｅｌおよびＳｚｏｓｔａｋ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１１−１４１８頁（１９９３年）を参照のこと。
したがって、本発明の阻害性核酸は、修飾ヌクレオチド、およびリボースとデオキシリボースヌクレオチドの組み合わせなどの天然ヌクレオチドを含む場合があり、また本発明のアンチセンス阻害性核酸は、上で考察される、ファスチンに相補的な任意の長さでありうる。
一部の実施形態では、発現カセットは、本明細書中に記載の様々な実施形態において使用される。発現カセットは、任意の適切な作成物であり、任意の適切な送達ベクター内に含められうる。かかる送達ベクターは、プラスミドＤＮＡ、ウイルス性ＤＮＡなどを含む。送達または発現ベクター内の発現カセットが標的細胞または標的生物に導入される場合の手段は、形質移入、逆形質移入（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ウイルス誘導形質移入（ｖｉｒｕｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、エレクトロポレーション、バイオリスティクスによる直接導入（例えば「遺伝子銃」；ＢｉｏＲａｄ，Ｉｎｃ．（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，Ｃａｌｉｆ．）の使用）などでありうる。使用されうる他の方法は、遺伝子治療の方法として当該技術分野で広く知られた方法を含む。一旦標的細胞または標的生物に送達されると、発現カセットは、ＤＮＡの自己複製断片（例えば発現ベクター）上で維持されうるか、または標的細胞または標的生物のゲノムに組み込まれうる。
典型的には、本発明の発現カセットおよびベクターを構築するため、ｓｉＲＮＡをコードする核酸、好ましくはＤＮＡが、既存の「空の」発現カセット内部の、固有の制限エンドヌクレアーゼ切断部位、または複数のクローニング部位に組み込まれ、本発明のｓｉＲＮＡ転写産物の生成を誘導可能な完全組換え発現カセットが形成される。かかる完全組換え発現カセットは、かかるｓｉＲＮＡ転写産物の発現用に設計される発現ベクター内部に存在するか、またはそれに挿入されることが多い。本発明の目的のための発現ベクターを作成するための方法は、本発明について通知された当業者にとって明らかであるべきである（一般に、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第２巻、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ａｓｓｏｃ． ＆ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、第１３章、１９８８年；Ｇｌｏｖｅｒ、「ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、第ＩＩ巻、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（Ｗａｓｈ．、Ｄ．Ｃ．）、第３章、１９８６年；Ｂｉｔｔｅｒら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」 １５３：５１６−５４４頁（１９８７年）；「Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ」、Ｓｔｒａｔｈｅｒｎら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻、１９８２年；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年を参照のこと）。
一般に、発現ベクター内部に挿入され、構築される発現カセットは、使用されるべきｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡに作動可能に連結されるプロモーターを有する。プロモーターは、天然プロモーター、すなわち細胞内での特定の遺伝子産物の発現に関与するプロモーターでありうるか、または任意の他の適切なプロモーターでありうる。あるいは、発現カセットは、キメラ、すなわちｓｉＲＮＡの発現に関与する天然プロモーターでない異種プロモーターを有するものでありうる。かかる異種プロモーターは、さらに標的細胞または生物と異なる種に由来しうる。
発現ベクターは、標的細胞内でのベクターの複製におけるＤＮＡ複製の起点をさらに含みうる。好ましくは、発現ベクターはまた、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内でのベクターの増幅における複製起点と、発現ベクターを有する標的細胞のみを選択し、維持するための選択マーカーを含む。さらに、一部の実施形態では、発現ベクターはまた、誘発性または脱抑制性（ｄｅｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ）プロモーターを有し、それはｓｉＲＮＡ転写産物のそれをコードするＤＮＡからの転写を制御するように機能する。転写エンハンサー配列および翻訳調節配列（例えばＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列）などの他の調節配列もまた、発現ベクター内に作動可能に含められうる。転写終結配列、およびポリアデニル化シグナル配列、例えばウシ生長ホルモン、ＳＶ４０、ｌａｃＺおよびＡｃＭＮＰＶ多面体タンパク質遺伝子に由来するものもまた存在しうる。
本発明の発現ベクターは、当該技術分野で公知の任意の技術により、例えば、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ウイルス感染、リポフェクション、バイオリスティクスなどにより、標的細胞に導入されうる。ｓｉＲＮＡの発現は、一時的または安定的、誘発性または脱抑制性でありうる。発現ベクターは、標的細胞内で、染色体外の状態、すなわち自己複製プラスミドまたはウイルスとして維持されうる。あるいは、発現ベクターまたはその一部は、安定な細胞系の部位特異的な組換えまたは選択などの従来の技術により、標的細胞の染色体に組み込まれうる。安定な細胞系内では、発現ベクターの少なくとも発現カセット部分は、標的細胞の染色体に組み込まれる。
ベクターコンストラクトは、限定はされないが、細菌、酵母細胞、植物細胞、線虫細胞、昆虫細胞、および哺乳動物ならびにヒト細胞を含む様々な標的細胞内での発現にとって適するように設計されうる。異なる標的細胞内での遺伝子産物の発現のために設計される発現ベクターを調製するための方法は、当該技術分野で周知である。
マイグラスタチン類似体
マイグラスタチン（１）は細胞遊走の阻害剤である。Ｎａｋａｅら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．２０００年、５３、１１３０頁；Ｎａｋａｅら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．２０００年、５３、１２２８頁；Ｔａｋｅｍｏｔｏら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．２００１年、５４、１１０４頁；Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．２００２年、５５、４４２頁；Ｗｏｏら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．２００２年、５５、１４１頁。マイグラスタチンの構造は次に提供される。
Figure 2011506274
本発明によると、遊走の類似体がファスチンに結合し、ファスチンの活性を阻害する。
マイグラスタチンはストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の培養液から最初に単離されたマクロライド天然産物であり、その構造は１４員環大環状ラクトンを特徴とする（図１Ａ）（Ｎａｋａｅら、２０００年、Ｗｏｏら、２００２年）。高いマイクロモル濃度では、同天然産物は、数種の腫瘍細胞の遊走をインビトロで阻害するが、これらの細胞内でのＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質の生合成に対する効果を全く有しない（Ｎａｋａｅら、２０００年）。
２種の合成マイグラスタチン類似体であるコア大環状ケトンおよびコア大環状ラクタム（図１Ａ）が、マウスモデルにおけるマウス乳房腫瘍転移の阻害について試験された（Ｓｈａｎら、２００５年）。これら２種の化合物はマウス乳房腫瘍転移の強力な阻害剤であり、それにより肺に広がる腫瘍の９１〜９９％が減少する。この効果における細胞基盤（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｂａｓｉｓ）が、ここで乳房腫瘍細胞の遊走を阻害する葉状仮足の形成の干渉であることが判明している。さらに、本発明の化合物が、ファスチンと相互作用し、それを阻害することによってこの効果を発揮することが判明している。
他に規定されない限り、次の定義が使用される、すなわち、ハロはフルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードである。アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニルなどは、直鎖基および分岐鎖基の双方を意味する。
キラル中心を有する本発明の化合物が光学的に活性があるラセミ形態で存在し、単離されうることは、当業者によって理解されるであろう。一部の化合物は多形を示しうる。本発明が、本明細書中に記載の有用な特性を有する、本発明の化合物の、任意のラセミ、光学的活性、多形、または立体異性形態、またはそれらの混合物を包含し、光学的活性形態を（例えば、再結晶化技術によるラセミ形態の分解、光学的活性出発原料からの合成、キラル合成、またはキラル固定相を使用するクロマトグラフ分離により）調製する方法や、本明細書中に記載の標準試験を使用するかまたは当該技術分野で周知の他の同様の試験を使用して、かかる形態の細胞遊走阻害活性を測定する方法が当該技術分野で周知であることは理解されるべきである。
ラジカル、置換基、および範囲についての以下に挙げられる特定の好ましい値はあくまで例示目的であり、それらは他の規定される値またはラジカルおよび置換基において規定される範囲内の他の値を除外しない。
具体的には、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ペンチル、３−ペンチル、またはヘキシルでありえ；（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、またはシクロヘキシルでありえ；（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル（Ｃ１−Ｃ６）アルキルは、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル、２−シクロプロピルエチル、２−シクロブチルエチル、２−シクロペンチルエチル、または２−シクロヘキシルエチルでありえ；（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシは、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ペントキシ、３−ペントキシ、またはヘキシルオキシでありうる。
一部の実施形態では、式Ｉの化合物は、次の構造、または薬学的に許容されうるその塩を有する。
Figure 2011506274
当該技術分野で使用可能な手順は、本発明の化合物を合成するために使用してもよい。例えば、本発明の化合物は、Ｎｊａｒｄａｒｓｏｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４年、１２６、１０３８−１０４０頁に記載のように作製されうる。
有機化合物の合成に関するさらなる詳細は、当該技術分野、例えば、Ｇｒｅｅｎｅ Ｔ．Ｗ．；Ｗｕｔｚ Ｐ．Ｇ．Ｍ． 「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ Ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」 第２版、１９９１年、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．において見出されうる。本明細書中に提供される実施例は、式Ｉの化合物における合成手順をさらに例示している。
化合物（例えば、本明細書中に記載のマイグラスタチン類似体および阻害性核酸）が安定な非毒性酸または塩基塩を形成するのに十分に塩基性または酸性である場合、塩としての化合物の投与は適切でありうる。本発明の特定の化合物は、治療のために遊離形態で、または必要に応じて、薬学的に許容されうるその誘導体として存在しうる。本発明によると、薬学的に許容されうる誘導体は、限定はされないが、薬学的に許容されうる塩、エステル、かかるエステルの塩、またはプロドラッグ、または本発明の化合物の他の付加体もしくは誘導体（必要とされる患者への投与時、他に本明細書中に記載の化合物、または代謝産物もしくはその残基を直接的または間接的に提供可能である）を含む。
本明細書で使用される用語「薬学的に許容されうる塩」は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、炎症、アレルギー反応などを伴わない、ヒトおよび下等動物の組織との接触状態での使用にとって適切であり、かつ合理的な便益／リスク比に応じた塩を示す。アミン、カルボン酸、および他の種類の化合物の薬学的に許容されうる塩は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅらは、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、６６：１−１９頁（１９７７年）（参照により本明細書中に援用される）において薬学的に許容されうる塩について詳述している。塩は、本発明の化合物の最終の単離および精製の間にインサイチュで、または遊離塩基または遊離酸の官能基を適切な試薬と反応させることによって、別々に調製されうる。例えば、遊離塩基の官能基は適切な酸と反応しうる。
さらに、本発明の化合物が酸性部分を有する場合、薬学的に許容されうるその適切な塩は、アルカリ金属塩、例えばナトリウムまたはカリウム塩；およびアルカリ土類金属塩、例えばカルシウムまたはマグネシウム塩などの金属塩を含みうる。薬学的に許容されうる非毒性酸付加塩の例として、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸および過塩素酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸もしくはマロン酸などの有機酸と形成されるか、またはイオン交換などの当該技術分野で使用される他の方法によって形成されるアミノ基の塩が挙げられる。他の薬学的に許容されうる塩は、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩（ｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｎｅｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、二グルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトナート（ｇｌｕｃｏｈｅｐｔｏｎａｔｅ）、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシーエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩（ｌａｕｒａｔｅ）、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などを含む。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩として、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが挙げられる。さらに、薬学的に許容されうる塩は、必要に応じて、非毒性アンモニウム、四級化アンモニウム、ならびにハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、低級アルキルスルホン酸塩およびアリールスルホン酸塩などの対イオンを用いて形成されるアミンカチオンを含む。
薬学的に許容されうる塩は、当該技術分野で周知の標準的方法を用い、例えばアミンなどの十分に塩基性の化合物を、生理学的に許容できるアニオンを提供する適切な酸と反応させることによって得られる。カルボン酸のアルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウムまたはリチウム）またはアルカリ土類金属（例えばカルシウム）塩もまた作製されうる。
さらに、本明細書で使用される用語「薬学的に許容されうるエステル」は、インビボで加水分解し、ヒト身体内で容易に分解し、親化合物またはその塩をあとに残すものを含むエステルを示す。適切なエステル基として、例えば、薬学的に許容されうる脂肪族カルボン酸、特にアルカン酸、アルケン酸、シクロアルカン酸およびアルカンジオン酸（ａｌｋａｎｅｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）に由来するものが挙げられ、ここでは各アルキルまたはアルケニル部分が有利にも６個以下の炭素原子を有する。特定のエステルの例として、ギ酸エステル、酢酸エステル、プロピオン酸エステル、酪酸エステル、アクリル酸エステルおよびエチルコハク酸エステルが挙げられる。
さらに、本明細書で使用される用語「薬学的に許容されうるプロドラッグ」は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、炎症、アレルギー反応などを伴う、ヒトおよび他の哺乳動物の組織との接触状態での使用にとって適切であり、合理的な便益／リスク比に対応し、かつそれらの意図される使用にとって有効な本発明の化合物のプロドラッグならびに本発明の化合物の両性イオン形態（可能な場合）を示す。用語「プロドラッグ」は、インビボで迅速に形質転換され、本明細書中に記載の式Ｉの親化合物を、例えば血液中での加水分解によって、生じる化合物を示す。Ｔ．ＨｉｇｕｃｈｉおよびＶ．Ｓｔｅｌｌａ、「Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓの第１４巻、ならびにＥｄｗａｒｄ Ｂ．Ｒｏｃｈｅ編、「Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ」、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、１９８７年（双方とも参照により本明細書中に援用される）において、徹底した考察が提供される。
抗ファスチン抗体
本発明は、ファスチンに特異的な抗体調製物、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１０および／もしくは１２を有するポリペプチドに結合可能な抗体を提供する。一部の実施形態では、抗体はアクチン結合部位またはマイグラスタチン類似体結合部位に結合しうる。例えば、一部の実施形態では、本発明の抗体は、マイグラスタチン類似体結合部位の主要部分を形成する、ファスチンアミノ酸残基Ｈｉｓ３９２、Ｇｌｕ３９１、Ａｌａ４８８、Ｌｙｓ４７１、Ｈｉｓ４７４およびＡｓｐ４７３のいずれかを含むエピトープ（ｅｐｉｔｏｐａｌ）部位に結合しうる。他の実施形態では、本発明の抗体は、ファスチンアクチン結合部位の１つの主要部分を形成する、ファスチンアミノ酸残基Ｔｈｒ３２６、Ｓｅｒ３２８、Ｓｅｒ３２９、Ｌｙｓ３３０、Ａｓｎ３３１、Ｓｅｒ３３３、Ａｒｇ２７６、Ｇｌｎ２７７、Ｍｅｔ２７９、Ａｓｐ２８６、Ｇｌｕ２８７、Ｇｌｎ２９１、Ｔｈｒ３２０、Ｔｈｒ３１８、Ｌｙｓ３１３、Ｔｈｒ３１１、Ｇｌｎ３６２、Ａｓｎ３６０、Ｌｙｓ３５９、Ａｓｐ１６８、Ｐｒｏ１５９、Ａｒｇ１５１、Ｌｙｓ１５０、Ａｒｇ１４９、Ａｒｇ１９７、Ａｒｇ２０１、Ｇｌｕ２０７、Ｇｌｕ２２７、Ｓｅｒ２３７、Ｐｒｏ２３６、Ｌｙｓ２４１、Ｌｙｓ２４７、およびＬｙｓ２５０のいずれかを含むエピトープ部位に結合しうる。
かかる抗体は、本明細書中で説明されるように、転移癌および腫瘍に関連したファスチンの活性を遮断するのに望ましい。したがって、本発明の抗体調製物は、ファスチン活性の阻害剤としての役割を果たし、それ故に治療剤として作用しうる。
ファスチン、ファスチン−アクチン結合部位および／またはファスチン−マイグラスタチン類似体結合部位を選択的に認識する抗体について調製し、スクリーニングするための方法が提供される。ファスチンアミノ酸残基Ｈｉｓ３９２、Ｇｌｕ３９１、Ａｌａ４８８、Ｌｙｓ４７１、Ｈｉｓ４７４およびＡｓｐ４７３（マイグラスタチン類似体結合部位）ならびに／あるいはファスチンアミノ酸残基Ｔｈｒ３２６、Ｓｅｒ３２８、Ｓｅｒ３２９、Ｌｙｓ３３０、Ａｓｎ３３１、Ｓｅｒ３３３、Ａｒｇ２７６、Ｇｌｎ２７７、Ｍｅｔ２７９、Ａｓｐ２８６、Ｇｌｕ２８７、Ｇｌｎ２９１、Ｔｈｒ３２０、Ｔｈｒ３１８、Ｌｙｓ３１３、Ｔｈｒ３１１、Ｇｌｎ３６２、Ａｓｎ３６０、Ｌｙｓ３５９、Ａｓｐ１６８、Ｐｒｏ１５９、Ａｒｇ１５１、Ｌｙｓ１５０、Ａｒｇ１４９、Ａｒｇ１９７、Ａｒｇ２０１、Ｇｌｕ２０７、Ｇｌｕ２２７、Ｓｅｒ２３７、Ｐｒｏ２３６、Ｌｙｓ２４１、Ｌｙｓ２４７、およびＬｙｓ２５０（アクチン結合部位の１つ）を含むペプチド配列が、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を産生するための抗原として使用される。本発明の抗体の産生に使用されるファスチンペプチドは、上で同定されるエピトープ部位を有するペプチドを含む。例えば、かかるファスチンペプチドは、配列番号１、３、５、７、９、１０および／もしくは１２のアミノ酸２５９〜４９３を含む配列を有する任意のペプチドを含む。
得られる抗体は、ファスチンまたは選択されるペプチド配列（例えば、抗体を産生するために使用される抗原ペプチド）への結合について選択される。次いで、抗体はファスチンの阻害についてスクリーニングされうる。阻害性抗体は、本明細書中に記載のように、例えば下文および実施例に記載のように、抗体を阻害についてスクリーニングすることによって選択される。
抗体分子は、免疫グロブリンと称される血漿タンパク質のファミリーに属し、その基本的構成要素である折りたたまれた免疫グロブリンまたはドメインは、免疫系および他の生物学的認識系の多数の分子において様々な形態で使用される。典型的な免疫グロブリンは、可変領域として公知の抗原結合領域および定常領域として公知の非可変領域を有する４つのポリペプチド鎖を有する。
天然抗体および免疫グロブリンは通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結される一方、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。重鎖および軽鎖の各々はまた、規則的な間隔が設けられた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）とその後にいくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の末端側に可変ドメイン（ＶＬ）およびその他方の末端側に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインと整列され、かつ軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列される。特定のアミノ酸残基は、軽鎖および重鎖の可変ドメインの間に界面を形成すると考えられる（Ｃｌｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６、６５１−６６頁、１９８５年）；ＮｏｖｏｔｎｙおよびＨａｂｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２、４５９２−４５９６頁（１９８５年））。
免疫グロブリンは、その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存し、異なるクラスに割り付けられうる。免疫グロブリンには、少なくとも５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２にさらに分かれうる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）およびミュー（μ）と称される。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ配列に基づき、カッパー（κ）およびラムダ（λ）と称される２つの明らかに異なるタイプのうち１つに割り付けられうる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元配置は周知である。
抗体の可変ドメインの文脈における用語「可変」は、可変ドメインの特定部分が抗体の中で配列が大きく異なるという事実を示す。可変ドメインは、結合が意図され、特定の各抗体のその特定の抗原に対する特異性を決定する。しかし、可変性は抗体の可変ドメインを通じて一様に分布されない。それは、軽鎖および重鎖可変ドメインの双方における、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される（超可変領域としても公知）３つのセグメント内に集中される。
可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク（ＦＲ）と称される。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインのそれぞれは、βシート構造に連結し、場合によってその一部を形成するループを形成する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって連結された、βシート配置を主にとる４つのＦＲ領域を含む。各鎖内のＣＤＲはＦＲ領域の近くに極めて接近してともに保持され、もう一方の鎖由来のＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、様々なエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞毒性における抗体の関与を示す。
したがって、本発明における使用が考えられる抗体は、全免疫グロブリン、Ｆｖ、Ｆａｂ、および類似断片などの抗体断片、可変ドメイン相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む一本鎖抗体などの形態（これらのすべては本明細書で使用される広義語「抗体」の下に該当する）を含む種々の形態のいずれかをとりうる。本発明ではポリクローナルまたはモノクローナル抗体の任意の特異性の使用を意図し、本発明は１つの特異的抗原を認識し、かつそれと免疫反応する抗体に限定されない。好ましい実施形態では、以下の治療およびスクリーニング方法の双方との関連で、本発明の抗原またはエピトープに対して免疫特異的である抗体またはその断片が使用される。
用語「抗体」はまた、完全長抗体の一部、一般には抗原結合または可変領域を示す。本発明の抗体としての役割を果たしうる抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片が挙げられる。抗体のパパイン消化により、Ｆａｂ断片と称される２つの同一の抗原結合断片（それぞれ単一の抗原結合部位を有する）と、残りの「Ｆｃ」断片（容易に結晶化するその能力故にそのように称される）とが生成される。ペプシン処理により、抗原に架橋可能な２つの抗原結合断片を有するＦ（ａｂ’）２断片と、残りの他の断片（ｐＦｃ’と称される）とが得られる。本発明に含められるさらなる断片が、ディアボディ、線形抗体、一本鎖抗体分子、および抗体断片から形成される多重特異性抗体である。一部の実施形態では、抗体はＦｖ、Ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２断片である。
したがって、本発明によって考えられる抗体は、ファスチンに特異的に結合する限り、完全長抗体である必要はない。さらに、本発明の抗体は、ファスチン結合ドメイン、例えばファスチンに結合する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するポリペプチドを含みうる。かかるＣＤＲは、約４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、９個のアミノ酸、約１２個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸、約１７個のアミノ酸、約１８個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸、約２５個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸以上といった程度に小さい可能性がある。一般に、本発明の抗体は、ファスチン、例えば配列番号１、３、５、７、９、１０および／もしくは１２を有するポリペプチドに特異的に結合する限り、任意の上限サイズを有する。
抗体断片は、その抗原に選択的に結合する能力を保持する。抗体断片の一部のタイプは次のように定義される。
（１）Ｆａｂは、抗体分子の一価抗原結合断片を有する断片である。Ｆａｂ断片は、全抗体を酵素パパインによって消化し、無傷軽鎖および１つの重鎖の一部を生じることによって生成されうる。
（２）Ｆａｂ’は、全抗体をペプシンで処理し、その後に還元し、無傷軽鎖および重鎖の一部を生じることによって得られる抗体分子の断片である。２つのＦａｂ’断片が１つの抗体分子に対して得られる。Ｆａｂ’断片は、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端での抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む数個の残基の付加により、Ｆａｂ断片と異なる。
（３）（Ｆａｂ’）２は、全抗体を酵素ペプシンで処理し、その後に還元しないことによって得られる抗体の断片である。Ｆ（ａｂ’）２は、２つのＦａｂ’断片の二量体（２つのジスルフィド結合によってともに保持される）である。
（４）Ｆｖは、完全抗原認識および結合部位を有する最小抗体断片である。この領域は、強力な非共有結合での１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインの二量体（ＶＨ−ＶＬ二量体）からなる。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用し、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を画定するのはこの配置内である。合わせて６つのＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を与える。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、親和性は結合部位全体より低いとしても、抗原を認識しかつそれに結合する能力を有する。
（５）一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）は、遺伝的に融合された一本鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結される、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を有する遺伝子操作された分子として定義される。かかる一本鎖抗体はまた、「一本鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体断片と称される。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原に結合するための所望される構造の形成するのを可能にするＶＨおよびＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓＦｖの概説としては、「Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、第１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編 Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｎ．Ｙ．）、２６９−３１５頁（１９９４年）を参照のこと。
用語「ディアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片を示し、同断片は同じポリペプチド鎖内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と重鎖可変ドメイン（ＶＨ）との連結（ＶＨ−ＶＬ）を含む。同じ鎖上で２つのドメイン間で対合できるには短すぎるリンカーを使用することで、ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対合し、かつ２つの抗原結合部位を生成することが求められる。ディアボディについては、例えば、欧州特許第４０４，０９７号明細書；国際公開許第９３／１１１６１号パンフレット、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８頁（１９９３年）で、より完全に説明されている。
ポリクローナル抗体を調製するための方法は、当業者が用いることができる。例えば、Ｇｒｅｅｎら、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ：Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｍａｎｓｏｎ編）、１−５頁（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）；Ｃｏｌｉｇａｎら、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｓｅｒａ ｉｎ Ｒａｂｂｉｔｓ，Ｒａｔｓ Ｍｉｃｅ ａｎｄ Ｈａｍｓｔｅｒｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、セクション２．４．１（１９９２年）（これらは参照により本明細書中に援用される）を参照のこと。
モノクローナル抗体を調製するための方法も同様に、当業者が用いることができる。例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５頁（１９７５年）；Ｃｏｌｉｇａｎら、セクション２．５．１−２．６．７；およびＨａｒｌｏｗら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、７２６頁（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂ．（１９８８年））（これらは参照により本明細書中に援用される）を参照のこと。モノクローナル抗体は、種々の十分に確立された技術により、ハイブリドーマ培養物から単離され、精製されうる。かかる単離技術は、プロテインＡセファロースを伴う親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーを含む。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、セクション２．７．１−２．７．１２およびセクション２．９．１−２．９．３；Ｂａｒｎｅｓら、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ（ＩｇＧ）：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第１０巻、７９−１０４頁（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）（１９９２年）を参照のこと。
モノクローナル抗体のインビトロおよびインビボ操作の方法もまた、当業者が用いることができる。例えば、本発明に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２５６、４９５頁（１９７５年）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製されうるか、または例えば米国特許第４，８１６，５６７号明細書に記載の組換え方法によって作製されうる。本発明での使用におけるモノクローナル抗体はまた、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８頁（１９９１年）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７頁（１９９１年）において記載される技術を使用し、ファージ抗体ライブラリから単離されうる。別の方法は、組換え手段によるモノクローナル抗体のヒト化により、ヒト特異的で認識可能な配列を有する抗体を産生することを含む。概説として、Ｈｏｌｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：２１９２−２２０１頁（１９９７年）およびＶａｓｗａｎｉら、Ａｎｎａｌｓ Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ ＆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、８１：１０５−１１５頁（１９９８年）を参照のこと。
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を示す（すなわち、個別の抗体を含む集団は、少量で存在しうる考えられる天然変異を除いて同一である）。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して特異的である。さらに、典型的には異なる決定基（エピトープ）に特異的な異なる抗体を含む従来のポリクローナル抗体調製物に対し、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に特異的である。モノクローナル抗体は、それらの特異性に加え、それが他の免疫グロブリンで汚染されていないハイブリドーマ培養によって合成される点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、抗体調製物が抗体の実質的に同種の集団であることを示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。
本明細書中のモノクローナル抗体は、詳細には、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である一方、鎖の残りが、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびにかかる抗体の断片を、それらが所望される生物学的活性を示す限り、含む（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．８１、６８５１−６８５５頁（１９８４年）。
抗体断片を作製する方法もまた、当該技術分野で公知である（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９８８年）（参照により本明細書中に援用される）を参照）。本発明の抗体断片は、抗体のタンパク質加水分解または断片をコードするＤＮＡの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現によって調製されうる。抗体断片は、全抗体のペプシンまたはパパイン消化という従来の方法によって得られる。例えば、抗体断片は、ペプシンによる抗体の酵素的切断によって生成され、Ｆ（ａｂ’）２という名称の５Ｓ断片を提供しうる。この断片は、チオール還元剤、および場合によってジスルフィド結合の切断から得られるスルフヒドリル基における保護基を使用してさらに切断され、３．５Ｓ Ｆａｂ’一価断片が生成されうる。あるいは、ペプシンを使用する酵素的切断により、２つの一価Ｆａｂ’断片およびＦｃ断片が直接生成される。これらの方法は、例えば、米国特許第４，０３６，９４５号明細書および米国特許第４，３３１，６４７号明細書とそれらの中に含まれる参考文献において記載されている。これらの特許は、それら全体が参照により本明細書中に援用される。
抗体を切断する他の方法、例えば一価軽鎖−重鎖断片を形成するための重鎖の分離、断片のさらなる切断、または他の酵素的、化学的、もしくは遺伝学的技術もまた、断片が無傷抗体によって認識される抗原に結合する限りにおいて使用されうる。例えば、Ｆｖ断片は、ＶＨおよびＶＬ鎖の結合を含む。この結合は非共有でありうるか、あるいは可変鎖は分子間ジスルフィド結合によって連結されうるか、またはグルタルアルデヒドなどの化学物質によって架橋されうる。好ましくは、Ｆｖ断片は、ペプチドリンカーによって連結されるＶＨおよびＶＬ鎖を含む。これらの一本鎖抗原結合性タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによって連結されるＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を作成することによって調製される。構造遺伝子は発現ベクターに挿入され、それは次に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを有する単一のポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖを生成するための方法は、例えば、Ｗｈｉｔｌｏｗら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ：ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、第２巻、９７頁（１９９１年）；Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６頁（１９８８年）；Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号明細書；およびＰａｃｋら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１２７１−７７頁（１９９３年）によって記載されている。
抗体断片の別の形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、抗原認識および結合に関与することが多い。ＣＤＲペプチドは、目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子をクローン化または作成することによって得られる。かかる遺伝子は、例えばポリメラーゼ連鎖反応を使用し、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することによって調製される。例えば、Ｌａｒｒｉｃｋら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ：ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、第２巻、１０６頁（１９９１年）を参照のこと。
本発明は、ヒト形態および非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化形態について検討する。かかるヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合部分配列など）である。例えば、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望される特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットもしくはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）から作成されうる。
場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体、取り込まれるＣＤＲもしくはフレームワーク配列のいずれにおいても見出されない残基を含みうる。これらの修飾は、抗体の性能をさらに高め、最適化するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、および典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含むことになり、ここでは、ＣＤＲ領域の全部もしくは実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域の全部もしくは実質的に全部がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、最適には免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域を含むことになる。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１、５２２−５２５頁（１９８６年）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２、３２３−３２９頁（１９８８年）；Ｐｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２、５９３−５９６頁（１９９２年）；Ｈｏｌｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８：２１９２−２２０１頁（１９９７年）およびＶａｓｗａｎｉら、Ａｎｎａｌｓ Ａｌｌｅｒｇｙ、Ａｓｔｈｍａ ＆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、８１：１０５−１１５頁（１９９８年）を参照のこと。
本発明はまた、抗体を突然変異させ、その親和性、選択性、結合力または他の所望の特性を最適化する方法を提供する。突然変異抗体は、抗体のアミノ酸配列変異体を示す。一般に、突然変異抗体においては、１つ以上のアミノ酸残基が、参照抗体において存在するものと異なる。かかる突然変異抗体は、必然的に参照アミノ酸配列と１００％未満の配列同一性または類似性を有する。一般に、突然変異抗体は、参照抗体の重鎖または軽鎖可変ドメインのうちのいずれかのアミノ酸配列と少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性または類似性を有する。好ましくは、突然変異抗体は、参照抗体の重鎖または軽鎖可変ドメインのうちのいずれかのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性または類似性を有する。抗体を突然変異させる一方法は、ファージディスプレイを使用する親和性成熟を含む。
したがって、本発明は、所望の特性を有する抗体および／または抗体断片または抗体ポリペプチドを選択するための方法に関する。かかる所望の特性は、ファスチンおよび／またはファスチンエピトープ（例えば本発明のファスチンアクチンまたはマイグラスタチン結合部位）に対する増大した結合親和性または選択性を含みうる。
本発明の抗体および抗体断片は、単離された抗体および抗体断片である。単離抗体は、それが産生される環境の成分から同定され、分離され、および／または回収されているものである。その産生環境の汚染物質成分は、場合によって抗体における診断または治療用途に干渉することになる物質であり、抗原タンパク質、酵素、ホルモン、および他のタンパク性または非タンパク性溶質を含みうる。用語「単離抗体」はまた、抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないことになる理由から、組み換え細胞内部の抗体を含む。しかし、一部の実施形態では、単離抗体は、例えば少なくとも１つの精製ステップを使用することにより、少なくとも部分的に精製されることになる。
所望される場合、本発明の抗体は、任意の利用可能な手順によって精製されうる。例えば、抗体は、抗体の産生に使用される抗原が結合される固体支持体に抗体調製物を結合させることにより、親和性精製されうる。汚染物質を洗い落とした後、抗体は既知の手順によって溶出されうる。当業者は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の精製および／または濃縮についての、免疫学分野において一般的な様々な技術を理解するであろう（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｕｎｉｔ ９、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１年（参照により援用される）を参照）。
一部の実施形態では、抗体は、少なくとも３つの異なる方法により、測定可能な程度に、すなわち、１）Ｌｏｗｒｙ法による測定として、抗体の９５重量％超、および最も好ましくは９９重量％超に至るまで；２）回転カップシークエンテーター（ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｃｕｐ ｓｅｑｕｅｎｔａｔｏｒ）の使用により、Ｎ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度まで；または３）クマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）または好ましくは銀染色を使用し、還元または非還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、同種になるまで、精製されることになる。
ファスチン構造
本発明はさらに、ファスチンの三次元構造に関する。表２は、ファスチン中の原子における三次元座標を提供する。実施例９により詳述されるように、ファスチンは２つのアクチン結合部位を有する。ファスチンがアクチンに結合する場合、それはアクチン束の形成を促進する。例えば、ファスチンの付加により、Ｆ−アクチン束の形成が誘発された（図６Ｂ）。
ファスチンの一次アクチン結合部位の１つは、マイグラスタチン類似体に対する結合部位である。第２のアクチン結合部位は、ファスチンアミノ酸残基Ｔｈｒ３２６、Ｓｅｒ３２８、Ｓｅｒ３２９、Ｌｙｓ３３０、Ａｓｎ３３１、Ｓｅｒ３３３、Ａｒｇ２７６、Ｇｌｎ２７７、Ｍｅｔ２７９、Ａｓｐ２８６、Ｇｌｕ２８７、Ｇｌｎ２９１、Ｔｈｒ３２０、Ｔｈｒ３１８、Ｌｙｓ３１３、Ｔｈｒ３１１、Ｇｌｎ３６２、Ａｓｎ３６０、Ｌｙｓ３５９、Ａｓｐ１６８、Ｐｒｏ１５９、Ａｒｇ１５１、Ｌｙｓ１５０、Ａｒｇ１４９、Ａｒｇ１９７、Ａｒｇ２０１、Ｇｌｕ２０７、Ｇｌｕ２２７、Ｓｅｒ２３７、Ｐｒｏ２３６、Ｌｙｓ２４１、Ｌｙｓ２４７、およびＬｙｓ２５０を含む。
マイグラスタチン類似体はアクチン結合部位の少なくとも１つに結合可能であり、かかる結合はアクチン束化を阻害する。例えば、マイグラスタチン類似体、大環状ケトンは、トレフォイル４とトレフォイル１の間のクレフトに面する側の、トレフォイル４の表面で結合する（図１０Ｃ）。大環状ケトンは、Ｈｉｓ３９２、Ｇｌｕ３９１、Ａｌａ４８８、Ｌｙｓ４７１、およびＨｉｓ４７４の側鎖ならびにＡｓｐ４７３のα炭素に干渉することによって定位置に保持される（図１１Ａ−Ｄ）。６つの残基はＵ形状曲線を形成し、親指と人差し指で環を保持するように大環状ケトンを保持する（図１１Ａおよび１１Ｂ）。２つの「指」の上部に２つのヒスチジン、Ｈｉｓ３９２およびＨｉｓ４７４があり、それらはファスチン−大環状ケトン相互作用に対する主要な寄与因子を有する。Ｈｉｓ３９２のＮＥ２窒素は大環状ケトン分子のケトン酸素から３．０１Å離れている一方、Ｈｉｓ４７４のＮＤ１窒素はヒドロキシル酸素から２．５７Å離れている。Ｈｉｓ３９２およびＨｉｓ４７４は、大環状ケトンとの水素結合を形成することにより、大環状ケトンの結合に寄与する（図１１Ｂ）。ファスチンと大環状ケトンの間の相互作用は、マクロライド環の炭素と残基Ｇｌｕ３９１、Ａｌａ４８８、Ｌｙｓ４７１およびＡｓｐ４７３との間のファンデルワールス力により、さらに安定化される（図１１Ｂ）。
ファスチンの添加が大環状ケトンの存在下でＦ−アクチン束の形成を誘発した（図６Ｂ）一方、Ｆ−アクチン束の形成が顕著に（＞８０％）阻害された（図６Ｂおよび６Ｃ）。
本明細書中に記載のように、ファスチンアミノ酸残基Ｈｉｓ３９２、Ｇｌｕ３９１、Ａｌａ４８８、Ｌｙｓ４７１、Ｈｉｓ４７４およびＡｓｐ４７３は、マイグラスタチン類似体結合部位の一部を形成する。
したがって、本明細書中に記載のように、ファスチンは２つの結合部位を有する。アクチンは両部位と相互作用しうる。しかし、マイグラスタチン類似体は、明らかに１つの部位のみと相互作用する。マイグラスタチン類似体結合部位は、約８×１０×１０オングストローム（すなわち、８Å×１０Å×１０Å）の寸法のＵ形状クレフトまたはポケットである。ファスチン上のアクチンに対する他方の結合部位もまたＵ形状であるが、それはファスチンの表面に沿って広がり、凹凸のあるポケットではない。
ファスチンを調節しうる作用物質を検出し、単離する方法
本発明は、ファスチンおよびファスチン活性に関連した疾患を阻害するための治療剤を生成または同定するのに有用なスクリーニング方法およびアッセイをさらに提供する。
当業者は、試験作用物質の、ファスチンの活性に会合し、結合し、および／または調節する能力についてスクリーニングするためのいくつかの方法の中の１つを用いることができる。例えば、当業者は、本明細書中に記載のファスチン構造を使用し、ファスチンアクチンおよびマイグラスタチン類似体の結合部位と相互作用しうる分子の種類、形状および構造を同定することができる。当業者はまた、試験作用物質がファスチンに結合し、および／または細胞遊走を阻害するか否かを観察することにより、試験作用物質をスクリーニングすることができる。これらの方法は、下記により詳細に説明される。
結合部位は、本発明において結合ポケットとも称され、薬剤発見などの分野においてかなりの有用性がある。かかる結合ポケットまたは部位は、ファスチンのアクチン束化活性の遺伝子座である。さらに、アクチンおよびマイグラスタチン類似体の結合部位の位置および組成物の同定は、ファスチン活性と相互作用し、それに結合し、および／またはそれを調節する小分子、薬剤および／または要素の発見を容易にする。ファスチン−アクチンおよびファスチン−マイグラスタチン類似体の結合部位の大きさ、構造および組成物を理解することはまた、これらの結合部位とより好ましい関連性を有する薬剤の設計を容易にし、したがって薬剤および治療剤に改善された生物学的効果を提供する。例えば、ファスチン結合部位のファスチン三次元構造と物理および化学特性は、同結合部位と相互作用するか、それらに結合するかまたはそれらを遮断する阻害剤の設計を容易にする。
適切な大きさ、原子構造および化学成分を示す試験作用物質を、実際の結合アッセイ、細胞遊走アッセイなどにおいてさらに試験し、それら試験作用物質がファスチンをインビボで阻害するための治療剤としての開発における有望な候補であるか否かが確認されうる。このスクリーニングプロセスは、例えば、表２中のファスチン三次元原子座標または機械読取り可能記憶媒体から生成される類似形状を画定する他の座標を使用するコンピュータスクリーン上でのアクチンまたはマイグラスタチン類似体の結合部位の１つの目視検査によって開始しうる。次いで、選択される断片または化学的部分は、その結合部位内部に、種々の方向に位置づけられるかまたはドッキングされうる。ドッキングは、ＱｕａｎｔａおよびＳｙｂｙｌなどのソフトウェアを使用してなされ、その後のエネルギー最小化および分子力学については、標準の分子力学力場（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｃｓ ｆｏｒｃｅ ｆｉｅｌｄ）、例えばＣＨＡＲＭＭおよびＡＭＢＥＲが用いられうる。
専門のコンピュータプログラムはまた、断片または化学的部分を選択するプロセスを援助しうる。これらは以下を含む。１．ＧＲＩＤ（Ｐ．Ｊ．Ｇｏｏｄｆｏｒｄ、「Ａ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃａｌｌｙ Ｆａｖｏｒａｂｌｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２８、８４９−８５７頁（１９８５年））。ＧＲＩＤはＯｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）から入手可能である。２．ＭＣＳＳ（Ａ．Ｍｉｒａｎｋｅｒら、「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ Ｍａｐｓ ｏｆ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ：Ａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｏｐｙ Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｓｅａｒｃｈ Ｍｅｔｈｏｄ．」 Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１１、２９−３４頁（１９９１年））。ＭＣＳＳはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能である。３．ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｄ．Ｓ．Ｇｏｏｄｓｅｌｌら、「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｄｏｃｋｉｎｇ ｏｆ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ａｎｎｅａｌｉｎｇ」 Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８、１９５−２０２頁（１９９０年））。ＡＵＴＯＤＯＣＫはＳｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能である。４．ＤＯＣＫ（Ｉ．Ｄ．Ｋｕｎｔｚら、「Ａ Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ−Ｌｉｇａｎｄ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６１、２６９−２８８頁（１９８２年））。ＤＯＣＫはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能である。
一旦適切な化学的実体または部分が選択されていると、それらは単一の試験作用物質（例えば化合物または複合体）に構築されうる。構築に先行し、ファスチンの構造座標に関係してコンピュータスクリーン上に表示される三次元画像上での断片同士の関係に関する目視検査が行われうる。この後、ＱｕａｎｔａまたはＳｙｂｙｌ［Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）］などのソフトウェアを使用し、マニュアルモデルビルディングがなされるであろう。
個別の化学的部分または断片の選択および結合において当業者を補助するのに有用なプログラムは以下を含む。１．ＣＡＶＥＡＴ（Ｐ．Ａ．Ｂａｒｔｌｅｔｔら、「ＣＡＶＥＡＴ：Ａ Ｐｒｏｇｒａｍ ｔｏ Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｂｌｅｍｓ」、Ｓｐｅｃｉａｌ Ｐｕｂ．、Ｒｏｙａｌ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、７８、１８２−１９６頁（１９８９年）；Ｇ．ＬａｕｒｉおよびＰ．Ａ．Ｂａｒｔｌｅｔｔ、「ＣＡＶＥＡＴ：ａ Ｐｒｏｇｒａｍ ｔｏ Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｔｈｅ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．、８、５１−６６頁（１９９４年））。ＣＡＶＥＡＴはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能である。２．ＩＳＩＳ（ＭＤＬ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，Ｃａｌｉｆ．））などの３Ｄデータベースシステム。この領域は、Ｙ．Ｃ．Ｍａｒｔｉｎ、「３Ｄ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３５、２１４５−２１５４頁（１９９２年）に概説されている。３．ＨＯＯＫ（Ｍ．Ｂ．Ｅｉｓｅｎら、「ＨＯＯＫ：Ａ Ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ Ｆｉｎｄｉｎｇ Ｎｏｖｅｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｓ ｔｈａｔ Ｓａｔｉｓｆｙ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｔｅｒｉｃ Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ａ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ」、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．、Ｆｕｎｃｔ．、Ｇｅｎｅｔ．、１９、１９９−２２１頁（１９９４年）。ＨＯＯＫはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能である。
ファスチンの調節剤または阻害剤を、１つの部分または化学的断片を上述のように一つずつ画定することによる段階的な方法で作成し始める代わりに、ファスチンに結合可能な試験作用物質を、空の結合部位、または場合により公知の阻害剤の一部を含むもののいずれかを使用し、全体、つまり「デノボ」として設計することができる。多数のデノボリガンドの設計方法があり、それは以下を含む。１．ＬＵＤＩ（Ｈ．−Ｊ．Ｂｏｈｍ、「Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｐｒｏｇｒａｍ ＬＵＤＩ：Ａ Ｎｅｗ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ａｉｄ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｅｓｉｇｎ、６、６１−７８頁（１９９２））。ＬＵＤＩはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能である。２．ＬＥＧＥＮＤ（Ｙ．Ｎｉｓｈｉｂａｔａら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、４７、８９８５頁（１９９１年））。ＬＥＧＥＮＤはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能である。３．ＬｅａｐＦｒｏｇ（Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）から入手可能）。４．ＳＰＲＯＵＴ（Ｖ．Ｇｉｌｌｅｔら、「ＳＰＲＯＵＴ：Ａ Ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）」、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ．Ｄｅｓｉｇｎ、７、１２７−１５３頁（１９９３年））。ＳＰＲＯＵＴはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｅｅｄｓ（ＵＫ）から入手可能である。
他の分子モデリング技術もまた、本発明に従って利用されうる［例えば、Ｎ．Ｃ Ｃｏｈｅｎら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３３、８８３−８９４頁（１９９０年）を参照；Ｍ．Ａ．ＮａｖｉａおよびＭ．Ａ．Ｍｕｒｃｋｏ、「Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ］、２、２０２−２１０頁（１９９２年）も参照；Ｌ．Ｍ．Ｂａｌｂｅｓら、「Ａ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｉｄｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ」、Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第５巻、Ｋ．Ｂ．ＬｉｐｋｏｗｉｔｚおよびＤ．Ｂ．Ｂｏｙｄ編、ＶＣＨ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、３３７−３８０頁（１９９４年）；Ｗ．Ｃ．Ｇｕｉｄａ、「Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｂａｓｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ」、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌｏｇｙ、４、７７７−７８１頁（１９９４年）も参照］。
一旦試験作用物質が上述の方法によって設計または選択されていると、試験作用物質がファスチン結合部位に結合する効率が、コンピュータ評価によって試験され、最適化されうる。例えば、有効なファスチン結合部位阻害剤は、好ましくはその結合状態と遊離状態との間でのエネルギーにおける差異が比較的小さい（すなわち結合の変形エネルギーが小さい）ことを示す必要がある。したがって、最も効率的なファスチン結合部位阻害剤は、好ましくは約１０ｋｃａｌ／モル以下、より好ましくは７ｋｃａｌ／モル以下の結合の変形エネルギーで設計される必要がある。ファスチン結合部位阻害剤は、全結合エネルギーにおいて類似した２つ以上の配座で結合部位と相互作用しうる。それらの場合、結合の変形エネルギーは、遊離実体のエネルギーと阻害剤がタンパク質に結合する場合に認められる配座の平均エネルギーとの間の差異であることになる。
ファスチン結合部位に結合するように設計または選択される試験作用物質は、その結合状態において、好ましくは標的結合部位および周囲の水分子との静電的反発相互作用が失われるように、さらにコンピュータによって最適化されうる。かかる非相補的静電的相互作用は、反発的電荷−電荷、双極子−双極子および電荷−双極子相互作用を含む。したがって、ファスチン結合部位内部での、帯電した、親水性および疎水性部分の化学組成および位置が評価され、試験作用物質のそれらと比較されうる。上述のように、ファスチンの一次アクチン結合部位は、ファスチンアミノ酸残基Ｔｈｒ３２６、Ｓｅｒ３２８、Ｓｅｒ３２９、Ｌｙｓ３３０、Ａｓｎ３３１、Ｓｅｒ３３３、Ａｒｇ２７６、Ｇｌｎ２７７、Ｍｅｔ２７９、Ａｓｐ２８６、Ｇｌｕ２８７、Ｇｌｎ２９１、Ｔｈｒ３２０、Ｔｈｒ３１８、Ｌｙｓ３１３、Ｔｈｒ３１１、Ｇｌｎ３６２、Ａｓｎ３６０、Ｌｙｓ３５９、Ａｓｐ１６８、Ｐｒｏ１５９、Ａｒｇ１５１、Ｌｙｓ１５０、Ａｒｇ１４９、Ａｒｇ１９７、Ａｒｇ２０１、Ｇｌｕ２０７、Ｇｌｕ２２７、Ｓｅｒ２３７、Ｐｒｏ２３６、Ｌｙｓ２４１、Ｌｙｓ２４７、およびＬｙｓ２５０を含む。さらに、ファスチンアミノ酸残基Ｈｉｓ３９２、Ｇｌｕ３９１、Ａｌａ４８８、Ｌｙｓ４７１、Ｈｉｓ４７４およびＡｓｐ４７３は、マイグラスタチン類似体結合部位の一部を形成する。
化合物の変形エネルギーおよび静電的相互作用を評価するための特定のコンピュータソフトウェアが当該技術分野で使用可能である。したがって、例えば、試験作用物質は、Ｇａｕｓｓｉａｎ ９４、改訂Ｃ（Ｍ．Ｊ．Ｆｒｉｓｃｈ、Ｇａｕｓｓｉａｎ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐａ．）、１９９５年）；ＡＭＢＥＲ、第４．１版（Ｐ．Ａ．Ｋｏｌｌｍａｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、１９９５年）；ＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、１９９５年）；Ｉｎｓｉｇｈｔ ＩＩ／Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）ＣＯＰＹＲＧＴ．１９９５年）；ＤｅｌＰｈｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、１９９５年）；およびＡＭＳＯＬ（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｅｘｃｈａｎｇｅ、Ｉｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）などのプログラムを使用して評価されうる。これらのプログラムは、例えば、「ＩＭＰＡＣＴ」グラフィックスを備えるＩｎｄｉｇｏ２などのＳｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓワークステーションを使用して実行されうる。他のハードウェアシステムおよびソフトウェアパッケージは、当業者にとって公知であろう。
別のアプローチが、ファスチン結合部位に全体的または部分的に結合しうる試験作用物質用の小分子データベースのコンピュータによるスクリーニングである。このスクリーニングにおいては、結合部位に対するかかる実体のフィット（ｆｉｔ）の質は、形状の相補性または見積もられる相互作用エネルギーのいずれかによって判断されうる［Ｅ．Ｃ．Ｍｅｎｇら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．、１３、５０５−５２４頁（１９９２年）］。
したがって、本発明の一態様は、機械読取り可能データでエンコードされるデータ記憶材料を含む機械読取り可能データ記憶媒体であり、機械読取り可能データは、前記データを使用するための命令でプログラムされた機械によって使用される場合、表２に記載されるファスチンアミノ酸残基Ｔｈｒ３２６、Ｓｅｒ３２８、Ｓｅｒ３２９、Ｌｙｓ３３０、Ａｓｎ３３１、Ｓｅｒ３３３、Ａｒｇ２７６、Ｇｌｎ２７７、Ｍｅｔ２７９、Ａｓｐ２８６、Ｇｌｕ２８７、Ｇｌｎ２９１、Ｔｈｒ３２０、Ｔｈｒ３１８、Ｌｙｓ３１３、Ｔｈｒ３１１、Ｇｌｎ３６２、Ａｓｎ３６０、Ｌｙｓ３５９、Ａｓｐ１６８、Ｐｒｏ１５９、Ａｒｇ１５１、Ｌｙｓ１５０、Ａｒｇ１４９、Ａｒｇ１９７、Ａｒｇ２０１、Ｇｌｕ２０７、Ｇｌｕ２２７、Ｓｅｒ２３７、Ｐｒｏ２３６、Ｌｙｓ２４１、Ｌｙｓ２４７、およびＬｙｓ２５０（アクチン結合部位）の構造座標によって規定される結合部位を含む分子もしくは分子複合体、または前記分子もしくは分子複合体の相同体のグラフィカル三次元表現を示し、ここで前記相同体は、前記アミノ酸の骨格原子から１．５オングストローム以下の二乗平均平方根偏差を有する結合部位を含む。
本発明の別の態様は、機械読取り可能データでエンコードされるデータ記憶材料を含む機械読取り可能データ記憶媒体であり、機械読取り可能データは、前記データを使用するための命令でプログラムされた機械によって使用される場合、表２に記載されるファスチンアミノ酸残基Ｈｉｓ３９２、Ｇｌｕ３９１、Ａｌａ４８８、Ｌｙｓ４７１、Ｈｉｓ４７４およびＡｓｐ４７３（マイグラスタチン類似体結合部位の一部）の構造座標によって規定される結合部位を含む分子もしくは分子複合体、または前記分子もしくは分子複合体の相同体のグラフィカル三次元表現を示し、ここで前記相同体は、前記アミノ酸の骨格原子から１．５オングストローム以下の二乗平均平方根偏差を有する結合部位を含む。
好ましくは、機械読取り可能データは、前記データを使用するための命令でプログラムされた機械によって使用される場合、表２に記載される、ファスチンアミノ酸残基Ｔｈｒ３２６、Ｓｅｒ３２８、Ｓｅｒ３２９、Ｌｙｓ３３０、Ａｓｎ３３１、Ｓｅｒ３３３、Ａｒｇ２７６、Ｇｌｎ２７７、Ｍｅｔ２７９、Ａｓｐ２８６、Ｇｌｕ２８７、Ｇｌｎ２９１、Ｔｈｒ３２０、Ｔｈｒ３１８、Ｌｙｓ３１３、Ｔｈｒ３１１、Ｇｌｎ３６２、Ａｓｎ３６０、Ｌｙｓ３５９、Ａｓｐ１６８、Ｐｒｏ１５９、Ａｒｇ１５１、Ｌｙｓ１５０、Ａｒｇ１４９、Ａｒｇ１９７、Ａｒｇ２０１、Ｇｌｕ２０７、Ｇｌｕ２２７、Ｓｅｒ２３７、Ｐｒｏ２３６、Ｌｙｓ２４１、Ｌｙｓ２４７、およびＬｙｓ２５０（アクチン結合部位）の構造座標、またはファスチンアミノ酸残基Ｈｉｓ３９２、Ｇｌｕ３９１、Ａｌａ４８８、Ｌｙｓ４７１、Ｈｉｓ４７４およびＡｓｐ４７３（マイグラスタチン類似体結合部位の一部）の構造座標によって規定される結合部位を含む分子もしくは分子複合体、または前記分子もしくは分子複合体の相同体のグラフィカル三次元表現を示し、ここで前記相同体は、前記アミノ酸の骨格原子から１．５オングストローム以下の二乗平均平方根偏差を有する結合ポケットを含む。
別の実施形態では、機械読取り可能データ記憶媒体は、第１の機械読取り可能データセットでエンコードされるデータ記憶材料を含み、第１の機械読取り可能データセットは、表２に示される構造座標のフーリエ変換を含み、前記データを使用するための命令でプログラムされた機械を使用する場合、分子もしくは分子複合体のＸ線回折パターンを含む第２の機械読取り可能データセットと組み合わされ、第２の機械読取り可能データセットに対応する構造座標の少なくとも一部が決定されうる。
例えば、表２に示される構造座標のフーリエ変換を使用し、他のファスチン、例えばｆａｓｃｉｎ ２、ｆａｓｃｉｎ ３、ｆａｓｃｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇ １、およびｆａｓｃｉｎ ２、ｆａｓｃｉｎ ３、ｆａｓｃｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇ １のアイソフォームの構造座標の少なくとも一部が決定されうる。
図１５は、これらの実施形態の１つの形態を示す。システム１０は、中央処理装置（「ＣＰＵ」）２０、ワーキングメモリ２２（例えばＲＡＭ（ランダムアクセスメモリ）または「コア」メモリでありうる）、大容量記憶メモリ２４（１つ以上のディスクドライブまたはＣＤ−ＲＯＭドライブなど）、１つ以上のブラウン管（「ＣＲＴ」）ディスプレイ端末２６、１つ以上のキーボード２８、１つ以上の入力ライン３０、および１つ以上の出力ライン４０（これらすべては従来の双方向システムバス５０によって内部接続される）を含むコンピュータ１１を含む。
入力ライン３０によってコンピュータ１１に連結される入力ハードウェア３６は、種々の方法で実行されうる。本発明の機械読取り可能データは、電話線または専用データライン３４によって接続される１つ以上のモデム３２の使用を介して入力される。その代わりまたはそれに加え、入力ハードウェア３６は、ＣＤ−ＲＯＭドライブまたはディスクドライブ２４を含みうる。ディスプレイ端末２６と併せ、キーボード２８もまた、入力デバイスとして使用されうる。
出力ライン４０によってコンピュータ１１に連結される出力ハードウェア４６は、従来のデバイスによって同様に実行されうる。例として、出力ハードウェア４６は、本明細書中に記載のＱＵＡＮＴＡなどのプログラムを使用し、本発明の結合ポケットのグラフ表示を表示するためのＣＲＴディスプレイ端末２６を含みうる。出力ハードウェアはまた、場合により、ハードコピー出力がもたらされうるようにプリンタ４２、または後の使用を意図してシステム出力を記憶するようにディスクドライブ２４を含みうる。
稼動中のＣＰＵ２０は、様々な入力および出力デバイス３６、４６の使用を調整し、大容量記憶装置２４からのデータアクセスおよびワーキングメモリ２２を行き来するアクセスを調整し、データ処理ステップのシーケンスを決定する。多数のプログラムを使用し、本発明の機械読取り可能データが処理されうる。かかるプログラムについては、本明細書中に記載される薬剤発見のコンピュータによる方法を参照して記載される。データ記憶媒体についての次の記述全体を通して、必要に応じて、ハードウェアシステム１０の部品に対する具体的な言及が含められる。
本発明の別の態様は、表２に記載の、ファスチンアミノ酸残基Ｔｈｒ３２６、Ｓｅｒ３２８、Ｓｅｒ３２９、Ｌｙｓ３３０、Ａｓｎ３３１、Ｓｅｒ３３３、Ａｒｇ２７６、Ｇｌｎ２７７、Ｍｅｔ２７９、Ａｓｐ２８６、Ｇｌｕ２８７、Ｇｌｎ２９１、Ｔｈｒ３２０、Ｔｈｒ３１８、Ｌｙｓ３１３、Ｔｈｒ３１１、Ｇｌｎ３６２、Ａｓｎ３６０、Ｌｙｓ３５９、Ａｓｐ１６８、Ｐｒｏ１５９、Ａｒｇ１５１、Ｌｙｓ１５０、Ａｒｇ１４９、Ａｒｇ１９７、Ａｒｇ２０１、Ｇｌｕ２０７、Ｇｌｕ２２７、Ｓｅｒ２３７、Ｐｒｏ２３６、Ｌｙｓ２４１、Ｌｙｓ２４７、およびＬｙｓ２５０（アクチン結合部位）またはファスチンアミノ酸残基Ｈｉｓ３９２、Ｇｌｕ３９１、Ａｌａ４８８、Ｌｙｓ４７１、Ｈｉｓ４７４およびＡｓｐ４７３（マイグラスタチン類似体結合部位の一部）によって規定される結合部位を含む分子もしくは分子複合体、または前記分子もしくは分子複合体の相同体の三次元表現を生成するためのコンピュータであり、ここで前記相同体は、前記アミノ酸の骨格原子から１．５オングストローム以下の二乗平均平方根偏差を有する結合部位を含み、ここで前記コンピュータは、（ａ）ファスチンまたはその一部の構造座標を含む機械読取り可能データでエンコードされたデータ記憶素材を含む機械読取り可能データ記憶媒体；（ｂ）前記機械読取り可能データを処理するための命令を記憶するためのワーキングメモリ；（ｃ）前記機械読取り可能データを前記三次元表現に処理するための、前記ワーキングメモリおよび前記機械読取り可能データ記憶媒体に連結された中央処理装置；および（ｄ）前記三次元表現を受信するために前記中央処理装置に連結された出力ハードウェアを含む。
一部の実施形態では、コンピュータは、表２に記載のファスチンアミノ酸残基Ｔｈｒ３２６、Ｓｅｒ３２８、Ｓｅｒ３２９、Ｌｙｓ３３０、Ａｓｎ３３１、Ｓｅｒ３３３、Ａｒｇ２７６、Ｇｌｎ２７７、Ｍｅｔ２７９、Ａｓｐ２８６、Ｇｌｕ２８７、Ｇｌｎ２９１、Ｔｈｒ３２０、Ｔｈｒ３１８、Ｌｙｓ３１３、Ｔｈｒ３１１、Ｇｌｎ３６２、Ａｓｎ３６０、Ｌｙｓ３５９、Ａｓｐ１６８、Ｐｒｏ１５９、Ａｒｇ１５１、Ｌｙｓ１５０、Ａｒｇ１４９、Ａｒｇ１９７、Ａｒｇ２０１、Ｇｌｕ２０７、Ｇｌｕ２２７、Ｓｅｒ２３７、Ｐｒｏ２３６、Ｌｙｓ２４１、Ｌｙｓ２４７、およびＬｙｓ２５０（アクチン結合部位）の構造座標またはファスチンアミノ酸残基Ｈｉｓ３９２、Ｇｌｕ３９１、Ａｌａ４８８、Ｌｙｓ４７１、Ｈｉｓ４７４およびＡｓｐ４７３（マイグラスタチン類似体結合部位の一部）の構造座標によって規定される結合ポケットを含むアクチン結合部位の分子もしくは分子複合体、または前記分子もしくは分子複合体の相同体の三次元表現を生成し、ここで前記相同体は、前記アミノ酸の骨格原子から１．５オングストローム以下の二乗平均平方根偏差を有する結合ポケットを含む。
一部の実施形態では、ファスチンポリペプチド断片の構造は、かかる三次元表現の生成に使用可能であり、ここではファスチンポリペプチド断片は、アクチン結合部位および／またはマイグラスタチン類似体結合部位、例えば配列番号９〜１２のいずれかを含む。
図１６は、図１５のシステム１０などのシステムによって実行されうる、機械読取り可能データでエンコードされうる磁気データ記憶媒体１００の横断面を示す。媒体１００は、極性または配向性が磁気的に変更可能な磁気ドメイン（外部から認められない）を有する、適切な基板１０１（従来式でありうる）および片面または両面に適切なコーティング１０２（従来式でありうる）を有する従来のフロッピー（登録商標）ディスクまたはハードディスクでありうる。媒体１００はまた、ディスクドライブまたは他のデータ記憶デバイス２４のスピンドルを受けるための開口部（図示されない）を有しうる。
媒体１００のコーティング１０２の磁気ドメインは、図１５のシステム１０などのシステムによる実行において、場合により従来の様式で、例えば本明細書中に記載の機械読取り可能データをエンコードするように分極または配向される。
図１７は、図１５のシステム１０などのシステムによって実行されうる機械読取り可能データまたは命令セットでもエンコードされうる、光学的に読取り可能なデータ記憶媒体１１０の横断面を示す。媒体１１０は、従来のコンパクトディスクリードオンリーメモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）、または光学的に読取り可能でありかつ磁気光学的に書換え可能な光磁気ディスクなどの書換え可能な媒体でありうる。媒体１００は、好ましくは、適切な基板１１１（従来式でありうる）、および通常では基板１１１の片面に適切なコーティング１１２（従来式でありうる）を有する。
ＣＤ−ＲＯＭの場合、周知のように、コーティング１１２は、反射をし、複数のピット１１３が刻まれることで、機械読取り可能データをエンコードする。ピットの配置は、コーティング１１２の表面にレーザー光を反射させることによって読み込まれる。保護コーティング１１４は、好ましくは実質的に透明であり、コーティング１１２の上に提供される。
光磁気ディスクの場合、周知のように、コーティング１１２はピット１１３を全く有しないが、レーザーによるのと同様に、特定の温度より高温で加熱される場合に極性または配向性が磁気的に変更可能な複数の磁気ドメインを有する（図示されない）。ドメインの配向性は、コーティング１１２から反射されるレーザー光の分極を測定することによって読み込まれうる。ドメインの配置は、上述のようにデータをエンコードする。
したがって、本発明によると、ファスチンとその一部およびその構造的に類似の相同体の三次元構造を表示可能なデータは機械読取り可能記憶媒体に格納され、それは構造のグラフィカル三次元表現を表示可能である。
したがって、例えば、ファスチンのＸ線座標データは、それら座標をファスチンの三次元構造に翻訳するためのソフトウェアがプログラムされたコンピュータと連携して使用される場合、種々の目的、例えば薬剤発見のために使用されうる。
ファスチンと相互作用する試験作用物質を同定するための方法は、物理的相互作用が検出される場合、本発明によってさらに包含される。試験作用物質はスクリーニングされ、有望な候補が生物学的アッセイおよび結合アッセイによって同定されうる。さらに、上述のコンピュータで支援される構造的設計方法を用いて同定された候補阻害剤は、かかる生物学的アッセイおよび結合アッセイを使用し、有用な生物学的活性について、さらに試験され、スクリーニングされうる。
ファスチンと試験作用物質の間での結合アッセイは、細胞ベースの結合アッセイ、溶相アッセイ、固相ベースのアッセイおよびイムノアッセイを含むいくつかの形式で実施されうる。一般に、試験作用物質は、ファスチンとともに特定の期間インキュベートされた後、腫瘍特異的なプロテアーゼと試験試料もしくは化合物との間の結合について測定される。ファスチンまたは試験作用物質に結合される標識またはレポーター分子が使用可能であり、それは顕微鏡検査、蛍光定量、シンチレーションカウンタ、酵素または任意の利用可能なイムノアッセイによって検出可能である。
一般に、ファスチンと相互作用する化合物もしくは分子を同定するためのアッセイは、化合物もしくは分子とファスチンとの結合を可能にする条件下で、ファスチンを、かかる化合物もしくは分子を含有しうる試験試料とともにインキュベートし、結合が生じているか否かを測定することを含む。ファスチンは、精製されても、または混合物中、例えば培養細胞内、組織試料内、体液中、培地中もしくはインビトロの水性溶液中に存在してもよい。定性的または定量的であるアッセイが使用されうる。定量アッセイは、ファスチンに対する試験作用物質またはファスチン阻害剤候補の結合パラメータ（親和性定数および反応速度）を決定するために使用されうる。また、アッセイを使用し、ファスチン断片、ファスチンドメイン（例えば、ファスチンアクチン結合ドメインまたはファスチンマイグラスタチン類似体結合ドメイン）に対する試験作用物質の結合が評価されうる。
試験作用物質は、実質的に精製されても、または粗混合物中に存在してもよい。試験作用物質は、核酸、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質または小分子量有機化合物でありうる。試験作用物質は、ファスチン活性を刺激または阻害するか否かを判定するため、ファスチン活性を増大または低下させるその能力についてさらに特徴付けられうる。
例えば、ファスチンが固体基板に結合され、結合されたファスチンが個別の試験作用物質または試験作用物質の混合物に暴露される場合、ファスチン親和性アッセイが実施されうる。ファスチンに結合する試験作用物質はファスチン調節作用物質候補である。固体基板は、ビーズ、マイクロタイターウェル、またはカラムマトリックスなどの任意の便利な固体表面であってもよい。試験作用物質はまた、ファスチンとともに個別にインキュベートされ、ファスチン−試験作用物質混合物は、穏やかな非変性条件下で電気泳動によって分離されうる。試験作用物質がファスチンに結合する場合、ファスチン−試験作用物質複合体の見掛けの分子量は、ファスチン単独の分子量より大きくなる。分子量のかかる変化は、（例えばポリアクリルアミドゲル中での）電気泳動によって分離された混合物を染色することによって容易に画像化されうる。試験作用物質はまた、ファスチンに対するアクチンの結合またはマイグラスタチン類似体の結合を競合的に阻害するか否かを確認するためにスクリーニングされうる。かかる競合的結合アッセイにおいては、例えば、試験作用物質との暴露およびインキュベーション後にどれだけの標識されたアクチンがファスチンに会合または結合された状態のままであるかを観察することによって、ファスチンに結合されるアクチンの量が定量されうる。したがって、例えば、結合は、競合ラジオイムノアッセイでのアクチン標識によって検出されうる。
これらおよび当業者にとって容易に使用可能な他の方法を利用し、ファスチンに結合可能な作用物質が同定されうる。
試験作用物質がファスチンに結合しうるというエビデンスが存在する場合、その試験作用物質は生物学的アッセイにおいてさらに試験され、それがファスチンの活性を阻害しうるか否かが判定されうる。あるいは、生物学的アッセイを使用し、有用なファスチン調節作用物質についてのスクリーニングがなされうる。本明細書中に記載のように、ファスチンはアクチン束化を促進する。したがって、試験作用物質をスクリーニングし、例えば本明細書中に記載のＦ−アクチンペレット化アッセイ（またはＹａｍａｓｈｉｒｏ−Ｍａｔｓｕｍｕｒａらによって記載されたもの、１９８５年）を使用し、それらがファスチンによるアクチン束化を阻害するか否かが確認されうる。かかるアッセイは、アクチン束がペレット化される場合の低速遠心分離を含む。例えば、図６Ａに示されるように、精製ファスチンのＦ−アクチンへの付加により、ペレット中のＦ−アクチン束の量が増加した。かかるアクチン束化を阻害する試験作用物質が、ファスチン阻害剤または調節作用物質の候補である。
ファスチンが種々の疾患の予後に関与しうる一方、癌の転移はファスチンが関与する、より重大な疾患の１つである。試験作用物質および／またはファスチン阻害剤候補が有用な抗転移活性を有するか否かをスクリーニングする一方法が、細胞透過性膜によって分離される上部および下部のウェルセットを伴うボイデンチャンバー細胞遊走アッセイである。細胞（典型的には癌細胞）が１つのチャンバー内で懸濁され、化学誘引物質が下部チャンバー内に存在しうる。試験作用物質は、上部チャンバー内または両方のチャンバー内に配置されうる。試験作用物質がかかる遊走を阻害しない場合、細胞が膜を通って下部チャンバーに遊走することになる（例えば、試験作用物質はファスチンのアクチン束化を阻害するため）。本願の実施例は、このタイプのアッセイをさらに例示し、説明する。
さらなるアッセイを実施し、疾患（例えば癌）を治療するための試験作用物質または薬剤候補のインビボ毒性およびインビボ有効性が評価されうる。適切な動物モデルおよび腫瘍細胞系が、これらの目的のために使用されうる。例えば、癌を発症する傾向を有するマウス、ラットまたは他のモデル動物が使用されうる。あるいは、転移することが知られている小さい腫瘍または腫瘍細胞もしくは癌細胞がモデル動物に移植されうる。腫瘍または癌細胞は、移植前に試験作用物質で処理されうる。あるいは、腫瘍、腫瘍細胞または細胞を受けた動物の一部が、次いで試験作用物質もしくはファスチン阻害剤候補で処理される。それら以外の動物は、対照動物とされ、および／または対照作用物質で処理される。腫瘍壊死、局所的腫瘍の潰瘍化のあらゆる総合的なエビデンス、ならびに各動物の運動性、刺激に対する応答、食餌、および重量を含む毒性のエビデンスを含む、腫瘍成長および身体的徴候が毎日監視されうる。モデル動物の健康、寿命および組織完全性に対して最小の負の効果を有する一方で腫瘍を有効に低減または除去する試験作用物質または阻害剤候補が、転移の化学療法剤および／または阻害剤としての開発において選択される。
アッセイを使用し、目的の癌細胞と相互作用しうる作用物質が同定されうる。この目的のため、多種多様なアッセイが使用されうる。例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの「Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｐｒｏｊｅｃｔ」内で実施されるアッセイを参照のこと。一般に、かかるアッセイは、目的の癌細胞を少なくとも１つの作用物質と接触させ、作用物質が癌細胞を殺滅させ、および／またはその細胞に対して他の有害な効果を有するか否かを観察することを含みうる。
複数のアッセイが、異なる試験作用物質またはファスチン阻害剤候補について、様々な濃度に対する異なる応答を得るために異なる濃度で、平行して実施されうる。典型的には、少なくとも１つの対照アッセイが試験に含まれる。かかる対照は、作用物質を全く含有しない生理溶液への目的の癌細胞の暴露を含む陰性対照でありうる。別の対照は、目的の癌細胞または目的の細胞に関連した第２の細胞に悪影響を及ぼすことが既に観察されている作用物質への目的の癌細胞の暴露を含みうる。別の対照は、目的の癌細胞に対して所望の効果を有する公知の治療用化合物、例えば特定の濃度または用量で公知の有効性を有する抗癌剤への、目的の細胞の暴露を含みうる。当業者は、目的の癌細胞に対する環状ペプチドの効果に関するスクリーニングおよび分析を容易にする対照化合物および条件を容易に選択できる。
任意の細胞種が、これらの方法によってアッセイされうる。例えば、任意の哺乳動物または他の動物の癌細胞種をスクリーニングし、本発明の作用物質がそれと選択的に相互作用しうるか否かが評価されうる。また、哺乳動物または他の動物の細胞のスクリーニングは、本発明の作用物質がそれと選択的に相互作用するか否かを確認し、および／あるいは、本発明の作用物質が、哺乳動物または他の動物細胞の生存度に対し、相互作用しないか、結合しないか、分解しないか、殺滅しないか、またはそれ以外では悪影響を及ぼさないか判定するために行いうる。
スクリーニングのための条件は、目的の細胞種を成長させるか、維持するか、またはそれ以外では培養するための、当業者によって使用される条件を含む。目的の癌細胞種は、作用物質の存在を別にすれば健常となる条件下でアッセイされるべきである。対照は、培養条件が細胞の生存度に影響したか否かを評価するために、細胞種が選択された培養条件下で維持され、かつ作用物質に暴露されないように実施されうる。当業者はまた、単純な生理溶液、例えば緩衝化生理食塩水中で洗浄された細胞に対してアッセイを実施し、作用物質または細胞と培地中の成分の間でのあらゆる相互作用を除去するか、またはそれについて試験することができる。しかし、アッセイにおける培養条件は、一般に、細胞に、適切な濃度の栄養素、生理的塩、緩衝液、および選択されたタイプの細胞の培養または維持に典型的に使用される他の成分を提供することを含む。他の種々の試薬が、スクリーニングアッセイにおいて含められうる。これらは、目的の細胞種の生理学的状態を再現するのに使用される塩、中性タンパク質、アルブミン、および血清（例えばウシ胎仔血清）のような試薬を含む。細胞の培養、成長および維持のための条件および媒体は、当業者にとって使用可能である。
選択される試薬および成分は、当業者によって選択される順序でアッセイに添加される。一般に、作用物質が最後に添加され、アッセイが開始される。アッセイは、任意の適切な温度、典型的には４℃〜４０℃の間で実施される。例えば、温度は、一般には、室温（約２０℃）〜約３７℃の範囲でありうる。インキュベーション期間は、活性の最適な範囲を確認するか、または試験作用物質が正常な非癌細胞に悪影響を及ぼさないことを保証するように選択される。しかし、インキュベーション時間は、迅速なハイスループットスクリーニングを促進するように最適化されうる。典型的には、インキュベーション時間は、約１分〜約５日間の間、例えば約３０分〜約３日間である。
インビトロで所望される活性を有する試験作用物質は、適切な動物モデルにおいて、インビボでの活性および／または毒性の欠如について試験されうる。かかる動物モデルは、霊長類ならびにマウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウシまたはウマを含む。例えば、マウスは、本発明の作用物質が毒性効果を有するか否かを試験し、および／または作用物質が癌細胞の転移を阻害しうるか否かを判定するのに便利な動物モデルである。
当業者は、インビボで本発明の作用物質の評価を容易に行うことができる。毒性試験においては、一連の異なる試験用量での試験作用物質が、異なる動物に別々に投与されうる。単回投与または一連の用量が動物に投与されうる。動物に対する作用物質の効果の評価を可能にするような試験期間が選択される。かかる試験期間は、約１日〜約数週間または数か月でありうる。
動物に対する作用物質の効果は、作用物質が動物の挙動（例えば、不活発状態、多動性）および生理的状態に悪影響を及ぼすか否かを試験期間にわたって観察することによって判定されうる。動物の生理的状態は、標準的方法によって評価されうる。例えば、試験期間の間、当業者は、例えば様々な酵素、タンパク質、代謝産物などを試験するために、採血し他の体液を採取することができる。当業者はまた、動物が、膨満、食欲不振、下痢、嘔吐、血尿、意識消失、および種々の他の生理的問題を有するか否かを観察することができる。試験期間後、動物は犠牲にされ、動物の組織または器官に対し、解剖学的、病理学的、組織学的および他の試験が実施されうる。
例えば、１種以上の試験作用物質が癌細胞転移を阻害しうるか否かを判定するため、マウスを選択した癌に感染させ、１種以上の試験作用物質の選択した試験用量をそれから少し後に投与する。あるいは、腫瘍細胞を、細胞のマウスへの移植前に試験作用物質で処理してもよい。作用物質がマウスを癌細胞の転移から保護するか否かを確認するために、マウスは、数日間から数週間にわたって観察される。試験期間の終了時、マウスは殺され、作用物質がマウスを転移から最適に保護したか否かを確認するため、および／または何らかの有害な副作用が生じているか否か判定するため、試験されうる。
対照を使用することで、作用物質が投与されない場合での癌の効果が確立される。他の対照も、例えば、本作用物質の安全性および有効性を、公知の抗癌化合物および転移の阻害剤のそれと比較して判定するために、行われうる。
使用の方法
ファスチンの活性を調節する作用物質は、種々の疾患および症状を治療するために使用されうる。例えば、本明細書中で例示されるように、ファスチンは、アクチン束化を促進し、癌細胞の細胞遊走および転移に主要な役割を果たす。したがって、本明細書中に記載の化合物、マイグラスタチン類似体、阻害性核酸、抗ファスチン抗体、試験作用物質およびファスチン調節候補物質を含む、ファスチンの調節剤および阻害剤を使用し、転移癌が治療され、阻害されうる。
しかし、ファスチンはまた、他の疾患および症状に関与する。例えば、軸索の形状およびトラジェクトリがファスチンによって調節される。Ｋｒａｆｔら、「Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｂｒａｉｎ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅ ｒｅｖｅａｌ ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｆａｓｃｉｎ ｉｎ ｎｅｕｒｉｔｅ ｓｈａｐｅ ａｎｄ ｔｒａｊｅｃｔｏｒｙ．」 Ｊ．ＮＥＵＲＯＳＣＩ．（２００６年）。ファスチンはまた、神経変性に関与する。Ｆｕｌｇａら、「Ａｂｎｏｒｍａｌ ｂｕｎｄｌｉｎｇ ａｎｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆ−ａｃｔｉｎ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔａｕ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ．」 ＮＡＴ ＣＥＬＬ ＢＩＯＬ．９（２）：１３９−４８頁（２００７年）。さらに、ファスチンはホジキン病に関与する。Ｐｉｎｋｕｓら、「Ｆａｓｃｉｎ，ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｎｅｗ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ｒｅｅｄ−Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｏｒ Ｂ ｃｅｌｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ?」 ＡＭ．Ｊ．ＰＡＴＨＯＬ．（１９９７年）。ファスチンはまた、例えば抗原提示細胞上で、抗原を処理し、提示する役割を果たす。Ｍｏｓｉａｌｏｓら、「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ａ ５５−ｋｄ ａｃｔｉｎ−ｂｕｎｄｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ．」 ＡＭ．Ｊ．ＰＡＴＨＯＬ．１４８（２）：５９３−６００頁（１９９６年）；Ｐｉｎｋｕｓら、「Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｉｎｇ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＨＩＶ−ｒｅｌａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ：ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｓｃｉｎ．」 Ｍｏｄ Ｐａｔｈｏｌ．１０（５）：４２１−２７頁（１９９７年）。さらに、ファスチンはまた、虚血性傷害に関与する。Ｍｅｌｌｅｒら、「Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ：ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｒａｐｉｄ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．」 Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２８（１）：５０−９頁（２００８年）。
本発明によると、ファスチン活性を調節する作用物質（例えば、本明細書中に記載の化合物、ファスチンポリペプチド断片、抗体および阻害性核酸）が、転移癌、神経細胞障害、ニューロン変性、炎症状態、ウイルス感染、細菌感染、リンパ過形成、ホジキン病、および虚血関連組織障害の治療および阻害のために使用されうる。
腫瘍転移は癌患者の死亡の主因である（Ｗｅｉｓｓ ２０００年、Ｆｉｄｌｅｒ ２００３年）。したがって、腫瘍転移の阻害または予防は、癌患者の生存率を有意に増加させ、副作用が低下した、より穏やかな放射線または化学療法を可能にし、固形腫瘍の進行を制御することになる。
腫瘍細胞遊走および浸潤は、腫瘍転移のプロセスにおける重要なステップである（Ｐａｒｔｉｎら １９８９年、Ａｚｎａｖｏｏｒｉａｎら １９９３年、Ｃｏｎｄｅｅｌｉｓら ２００５年）。進行する細胞遊走においては、アクチン細胞骨格は、ポリマーおよび束を形成し、細胞形状の動的変化に作用することによって再組織化されなければならない（Ｊａｆｆｅら ２００５年、Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ １９９４年、Ｏｔｔｏ １９９４年）。個別のアクチンフィラメントは柔軟であり、個別のフィラメントの伸長は細胞遊走にとって必要な膜突出にとって本質的に不十分である。アクチンフィラメントの束化は、アクチンフィラメントに対し、血漿膜からの圧縮力に逆らって突出するための剛性をもたらす（Ｍｏｇｉｌｎｅｒら ２００５年）。
重要なアクチン束化タンパク質の１つがファスチンである。ファスチンは、癌細胞の遊走および転移にとって重要な膜突起である糸状仮足内の主要なアクチンクロスリンカーである。ファスチンは、アクチンフィラメントを最大限架橋し、直線状のコンパクトで堅い束にするのに必要とされる。癌細胞内でのファスチンのｍＲＮＡおよびタンパク質の発現の増大は、急激な臨床経過、悪い予後および生存期間の短縮と相関している。
本発明によると、転移癌は、ファスチン阻害剤を投与することにより、治療、予防、および／または阻害がなされうる。
本明細書で使用される用語「癌」は、哺乳動物の固形腫瘍および血液学的悪性腫瘍を含む。用語「腫瘍細胞」および「癌細胞」は、本明細書中で同義的に使用される。
「哺乳動物の固形腫瘍」は、頭頸部、肺、中皮腫、縦隔、食道、胃、膵臓、肝胆道系、小腸、結腸、結腸直腸、直腸、肛門、腎臓、尿道、膀胱、前立腺、ペニス、睾丸、婦人科器官（ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｒｇａｎ）、卵巣、乳房、内分泌系、皮膚、中枢神経系の癌；軟組織および骨の肉腫；ならびに皮膚および眼内に由来するメラノーマを含む。
用語「血液学的悪性腫瘍」は、小児白血病およびリンパ腫、ホジキン病、リンパ球および皮膚に由来するリンパ腫、急性および慢性白血病、形質細胞腫ならびにＡＩＤＳに関連した癌を含む。
さらに、任意の進行段階での癌、例えば原発性、転移性、および再発性癌は治療されうる。一部の実施形態では、癌は、例えば転移が検出される前に治療することで、転移癌が発症することが阻害される。他の実施形態では、癌は、例えば転移が検出された時に治療することで、癌のさらなる転移および進行が阻害される。
本発明はまた、自己免疫不全症候群関連カポジ肉腫、副腎皮質の癌、頸部の癌、子宮内膜の癌、食道の癌、頭頸部の癌、肝臓の癌、膵臓の癌、前立腺の癌、胸腺の癌、カルチノイド腫瘍、慢性リンパ球白血病、エウィング肉腫、妊娠性絨毛腫瘍、肝芽腫、多発性骨髄腫、非小細胞肺癌、網膜芽細胞腫、または卵巣内腫瘍の治療に使用されうる。任意の進行段階での癌、例えば原発性、転移性、および再発性癌は治療または検出されうる。極めて多数のタイプの癌に関する情報が、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ（ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ）、または例えばＷｉｌｓｏｎら（１９９１年） 「Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、第１２版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．から見出されうる。
本明細書で使用される用語「正常な哺乳動物細胞」および「正常な動物細胞」は、正常な成長制御機構（例えば遺伝子制御）の下で成長し続け、かつ正常な細胞分化および正常な遊走パターンを示す細胞として定義される。癌細胞は、その成長パターン、遊走、およびその細胞表面の性質において正常細胞と異なる。例えば癌細胞は、その近隣とは無関係に連続的かつ無秩序に成長する傾向があり、遠位部位に遊走し、身体の他の領域において腫瘍を生成する（すなわち転移する）可能性がある。
本発明は、一部の実施形態では、動物、例えばヒトおよび獣医学用途における転移癌を治療または阻害する方法に関し、同方法は、被験動物（例えばヒト）、治療有効量の本発明の作用物質（例えば、マイグラスタチン類似体、阻害性核酸または抗ファスチン抗体）を投与するステップを含む。
疾患（例えば癌）の治療または治療することは、典型的に疾患に関連した少なくとも１つの徴候の緩和または低減を含むように意図される。治療はまた、２つ以上の徴候の緩和または低減を含む。例えば、疾患または症状の徴候および／または発生源を取り除くことによる治療により、疾患は治癒されうる。例えば、原発性腫瘍または癌細胞の除去または殺滅が癌を実質的に除去するように癌細胞の転移を実質的に阻害することによる治療により、癌は治癒されうる。治療はまた、癌および／または腫瘍細胞の転移を、癌細胞を直接的に殺滅するかまたはそのアポトーシスを促進することなく、停止または阻害しうる。
ファスチンは、細胞の成長、運動および相互作用を調節する上で重要な役割を果たす種々の細胞機能において機能する。しかし、ファスチンのアクチン束化機能は、腫瘍転移および浸潤性成長に直接関与する。
（例えば本明細書中に記載されるような様々な試験作用物質または治療剤の存在下での）ファスチンの抗転移活性は、本明細書中に記載され、当業者にとって使用可能な方法を用い、種々の癌に対して評価されうる。例えば、抗癌活性は、本発明の作用物質の、５０％の癌細胞転移を阻害する用量（ＧＩ５０）を同定することによって判定されうる。
本発明はまた、本発明の作用物質で癌を治療する（例えば転移を阻害する）ための治療有効用量を評価する方法であって、インビトロで作用物質のＧＩ５０を判定するステップを含む方法を提供する。かかる方法は、癌細胞の遊走を阻害するための１容量あたりに必要とされる作用物質の概算量の計算を可能にする。かかる量は、例えば標準の微量希釈法によって判定されうる。
一部の実施形態では、本発明の作用物質は、長期間にわたりまたは断続的に、複数回用量で投与されうる。
本明細書で使用される用語「動物」は、ファスチン活性または発現に関連した疾患、例えば転移癌にかかりやすいかまたはそれを有する動物、例えば温血動物を示す。哺乳動物は、ウシ、バッファロー、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ラット、ラビット、マウス、およびヒトを含む。また、他の家畜、家畜化された動物および捕獲動物も含まれる。用語「家畜（ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌ）」は、ニワトリ、シチメンチョウ、魚、および他の飼育される動物を含む。哺乳動物および鳥を含む他の動物は、本明細書中で記載され、権利請求される方法および組成物によって治療されうる。
調合および投与
本明細書中に記載の化合物、マイグラスタチン類似体、阻害性核酸、抗ファスチン抗体、試験作用物質およびファスチン調節剤候補を含む本発明の化合物は、医薬組成物として調合され、選択される投与経路に適する種々の形態で、すなわち、経口的または非経口的に、静脈内、筋肉内、局所または皮下経路により、哺乳動物宿主、例えばヒト患者に投与されうる。
阻害性核酸は、いくつもの方法で細胞に導入されうる。脂質媒介性形質移入においては、細胞は、エンドサイトーシスにより、核酸と脂質の間に非共有複合体を、またはポリマー試薬を取り入れる。エレクトロポレーションでは、短時間の電気パルスを使用することで細胞の血漿膜内に断裂部（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｓ）または孔が生じ、そこから核酸が入る。これらの両方法によると、ウイルス性ベクターを除くＲＮＡｉ核酸のいずれもがうまく送達される。ウイルス性ベクター送達は、多段階プロセスを介して生成される対応するウイルスへの細胞の感染によって行われる。ウイルス性ベクターには自己を複製する能力が欠如している。分化した細胞は、ウイルス複製およびパッケージングにとって必要な欠損遺伝子を発現する。これらの細胞は、ウイルス性ベクターを伴う従来の形質移入時、ウイルスを生成し、培地に放出する。ウイルス性ベクターを有するウイルスは回収され、精製される。所望される細胞系のウイルスによる感染は、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを導入し、遺伝子発現をノックダウンする。ウイルス性送達方法は、ウイルス性ベクターの使用を必要不可欠とし、ＲＮＡｉにおける核酸の他の供給源を提供できない。
ｓｉＲＮＡの送達は、裸ｓｉＲＮＡの直接送達；リポソームおよびリポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）への封入；抗体、ペプチド、アプタマー、および他の分子への複合；ならびに化学的および生物学的ポリマーとの複合体の形成によって行われうる。静脈内、腹腔内、鼻腔内、および腫瘍内へのｓｉＲＮＡ投与は、ＰＥＩ、低分子量ＰＥＩ、キトサン、アテロコラーゲン、トランスフェリン標的化ナノ粒子（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、液体−標的化安定化ナノ粒子（ｌｉｑｕｉｄ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）およびダイナミックポリ複合体（ｄｙｎａｍｉｃ ｐｏｌｙｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を含むポリマー担体およびナノ粒子を使用して行われうる。
ｓｉＲＮＡの送達は、ｓｉＲＮＡ分子の、限定はされないがタンパク質、ペプチド、およびアプタマーを含む標的化分子への複合によってさらに行われうる。ペプチドの場合、ポリ−Ａｒｇストレッチなどの塩基性領域が使用される（Ｋｕｍａｒ Ｐら、Ｎａｔｕｒｅ ２００７年７月 ５；４４８（７１４９）：３９−４３頁；Ｋｉｍ ＷＪら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００６年 ９月；１４（３）：３４３−３５０頁）。抗体においては、プロタミン融合タンパク質への複合が使用されうる（Ｓｏｎｇ Ｅら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００５年６月；２３（６）：７０９−７１７頁）。
マイグラスタチン類似体および阻害性核酸を含む本化合物は、全身性に、例えば、経口的に、不活性希釈剤または吸収可能な可食担体（ａｓｓｉｍｉｌａｂｌｅ ｅｄｉｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）などの薬学的に許容されうる媒体と併用して投与されうる。それらはハードまたはソフトシェルゼラチンカプセル内に封入されうるか、錠剤に圧縮されうるか、または患者の食事の食品に直接に組み込まれうる。経口治療剤投与においては、活性化合物は１つ以上の賦形剤と組み合わされ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液、シロップ剤、ウエハースなどの形態で使用されうる。かかる組成物および調製物は、少なくとも０．１％の活性化合物を含有するべきである。組成物および調製物の百分率は、当然のことながら変更でき、便益的には所与の単位剤形の重量の約２〜約６０％の間でありうる。かかる治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、有効用量レベルが得られることになる程度である。
錠剤、トローチ剤、ピル剤、カプセル剤などはまた、以下を含有しうる。すなわち、トラガカントガム、アカシア、トウモロコシデンプンまたはゼラチンなどの結合剤；二リン酸カルシウムなどの賦形剤；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；およびスクロース、フルクトース、ラクトースもしくはアスパルテームなどの甘味剤またはペパーミント、ウィンターグリーン油、もしくはサクランボ香料（ｃｈｅｒｒｙ ｆｌａｖｏｒｉｎｇ）などの香味剤を添加してもよい。単位剤形がカプセル剤である場合、それは、上述のタイプの物質に加え、液体担体、例えば植物油またはポリエチレングリコールを含有しうる。様々な他の物質が、コーティング剤として、またはそれ以外に固体単位剤形の物理的形態を修飾するために存在しうる。例えば、錠剤、ピル剤、またはカプセル剤は、ゼラチン、ワックス、セラックまたは糖などでコーティングされうる。シロップ剤またはエリキシル剤は、活性化合物、甘味剤としてスクロースまたはフルクトース、保存料としてメチルおよびプロピルパラベン、染料、およびサクランボもしくはオレンジ香料などの香味剤を含有しうる。当然のことながら、任意の単位剤形の調製において使用される任意の物質は、薬学的に許容可能であり、使用される量において実質的に非毒性であるべきである。さらに、活性化合物は徐放性製剤およびデバイスに組み込まれうる。
本明細書中に記載の活性化合物はまた、注入または注射により、静脈内または腹腔内に投与されうる。活性化合物またはその塩の溶液は、水中で調製され、場合により、非毒性界面活性剤と混合されうる。分散剤もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、およびこれらの混合物の中、ならびにオイル中で調製されうる。保存および使用の通常の条件下で、これらの製剤は、微生物の成長を阻止するための保存料を含有する。
注射または注入に適した医薬剤形は、場合によってリポソーム中に封入された、無菌の注射可能もしくは注入可能な溶液または分散剤の即時調製に適した、活性成分を含有する無菌水溶液または分散剤または無菌粉末を含みうる。すべての場合において、最終剤形は、製造および保存の条件下で、無菌、流体および安定であるべきである。液体担体または媒体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、非毒性グリセリルエステル、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または液体分散媒でありうる。適切な液性は、例えば、リポソームの形成、分散剤の場合での必要とされる粒度の維持または界面活性剤の使用によって維持されうる。微生物の作用の阻止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされうる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、緩衝液または塩化ナトリウムを含むことが好ましいものになる。注射可能な組成物の長期間の吸収（ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）は、吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物中での使用によってもたらされうる。
必要に応じ、上に列挙される他の成分のいくつかとともに活性化合物を必要とされる量で適切な溶媒に組み込み、その後に濾過滅菌することにより、無菌の注射可能な溶液が調製される。無菌の注射可能な溶液の調製における無菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥技術であり、それらは活性成分＋予め無菌濾過された溶液中に存在した任意の追加的な所望の成分の粉末を生じる。
局所投与においては、本化合物は、純粋な形態で、すなわちそれらが液体のときに、適用されうる。しかし、それらを皮膚に、皮膚科学的に許容されうる担体（固体または液体でありうる）と組み合わせて、組成物または調合物として投与することは、一般に望ましいものになる。
有用な固体担体は、タルク、粘土、微結晶性セルロース、シリカ、アルミナなどの微粉化固体を含む。有用な液体担体は、水、アルコールまたはグリコールまたは水−アルコール／グリコール混和物を含み、ここで本化合物は、場合によって非毒性界面活性剤を用い、有効なレベルで溶解または分散されうる。香料および追加的な抗菌剤などのアジュバントを添加することで、所与の用途における特性が最適化されうる。得られる液体組成物は、吸収性パッドから適用されうるか、包帯（ｂａｎｄａｇｅ）および他の包帯剤（ｄｒｅｓｓｉｎｇ）に含浸させて使用されうるか、またはポンプ型またはエアロゾル噴霧器を使用して患部上にスプレーされうる。
合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩およびエステル、脂肪アルコール、修飾セルロースまたは修飾ミネラル物質などの増粘剤もまた、液体担体とともに使用し、利用者の皮膚への直接適用を意図した、塗り広げることができるペースト剤（ｓｐｒｅａｄａｂｌｅ ｐａｓｔｅ）、ゲル剤、軟膏、石鹸などを形成することができる。
本発明の化合物の皮膚への送達に使用可能な有用な皮膚科学的組成物の例は当該技術分野で公知であり、例えば、Ｊａｃｑｕｅｔら（米国特許第４，６０８，３９２号明細書）、Ｇｅｒｉａ（米国特許第４，９９２，４７８号明細書）、Ｓｍｉｔｈら（米国特許第４，５５９，１５７号明細書）およびＷｏｒｔｚｍａｎ（米国特許第４，８２０，５０８号明細書）を参照のこと。
本発明の化合物の有用な用量は、それらのインビトロ活性と動物モデルにおけるインビボ活性を比較することによって決定されうる。ヒトに対し、マウスおよび他の動物における有効用量を外挿するための方法は当該技術分野で公知であり、例えば米国特許第４，９３８，９４９号明細書を参照のこと。
一般に、液体組成物、例えばローション中の本発明の化合物の濃度は、約０．０１〜２５重量％、好ましくは約０．１〜１０重量％となる。ゲルまたは粉末などの半固体または固体組成物中の濃度は、約０．０１〜１０重量％、好ましくは約０．１〜５重量％となる。
治療における使用にとって必要とされる化合物、または活性塩もしくはその誘導体の量は、選択される特定の塩だけでなく投与の経路、治療されている症状の性質、ならびに患者の年齢および症状によって変化することになり、最終的には指導医（ａｔｔｅｎｄａｎｔ ｐｈｙｓｉｃｉａｎ）または臨床医の裁量となる。しかし、一般に、適切な用量は、約１．０〜約２００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、例えば約２．０〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、例えば約３．０〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重（レシピエント）／日の範囲内、好ましくは約５〜２０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲内となる。あるいは、組成物は、２日間の停止を伴う５日間連続で週に５回、または３日間の停止を伴う４日間連続で週に４回、または一日おきに投与されうる。
ヒトに対し、マウスおよび他の動物における有効用量を外挿するための方法は当該技術分野で公知である（例えば米国特許第４，９３８，９４９号明細書を参照）。例えば、特定の実施形態では、本発明の化合物（例えば結腸癌および／または卵巣癌の治療において有用なもの）を、１日に１回以上、１日あたり被験体体重の、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約９０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約７０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約９０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約７０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約９０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約７０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約９０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約７０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの用量レベルで投与し、所望される治療効果が得られる。特定の実施形態では、化合物は、体重の約１ｍｇ／ｋｇ以上、５ｍｇ／ｋｇ以上；１０ｍｇ／ｋｇ以上、１５ｍｇ／ｋｇ以上、２０ｍｇ／ｋｇ以上、２５ｍｇ／ｋｇ以上、３０ｍｇ／ｋｇ以上、３５ｍｇ／ｋｇ以上、４０ｍｇ／ｋｇ以上、４５ｍｇ／ｋｇ以上、５０ｍｇ／ｋｇ以上、６０ｍｇ／ｋｇ以上、７０ｍｇ／ｋｇ以上の用量で投与されうる。０．０１ｍｇ／ｋｇより低いかまたは７０ｍｇ／ｋｇより高い用量（例えば７０〜２００ｍｇ／ｋｇ）が被験体に投与されうることも理解されるであろう。
特定の実施形態では、化合物は、化学療法（すなわち転移を阻害するため）で使用され、かつより高用量で投与されうる。例えば、化学療法で使用されるべき化合物を、１日に１回以上、１日あたり被験体体重の、約１００ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ、約１２０ｍｇ／ｋｇ〜約２８０ｍｇ／ｋｇ、約１４０ｍｇ／ｋｇ〜約２６０ｍｇ／ｋｇ、約１５０ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇ、約１６０ｍｇ／ｋｇ〜約２４０ｍｇ／ｋｇで投与し、所望される治療効果が得られる。
特定の他の実施形態では、化合物は、（例えば一般的タイプの腫瘍の範囲内で手術または放射線に対するアジュバントとしての）補助的治療で使用され、より低い用量で投与されうる。例えば、補助的治療において使用されうる化合物を、１日に１回以上、１日あたり被験体体重の、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇで投与し、所望される治療効果が得られる。
特定の他の実施形態では、化合物は、転移癌（例えば卵巣癌および／または結腸癌）の予防および／または治療のために使用され、中等度用量で投与されうる。例えば、補助的治療で使用されるべき化合物を、１日に１回以上、１日あたり被験体体重の、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約７０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約７０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約７０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇで投与し、所望される治療効果が得られる。
化合物は、例えば、単位剤形あたり、４５〜３０００ｍｇ、便宜的には９０〜２２５０ｍｇ、最も便宜的には４５０〜１５００ｍｇの活性成分を含有する単位剤形で便宜的に投与される。一部の実施形態では、化合物は約１〜約１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
理想的には、活性成分は、約０．５ｎＭ〜約１０μＭ、好ましくは約１ｎＭ〜１μＭ、最も好ましくは約１０ｎＭ〜約０．５μＭの活性化合物のピーク血漿濃度を得るように投与されるべきである。これは、例えば、場合によって生理食塩水中で、活性成分０．０５〜５％の溶液の静脈内注射、または約２０〜２０００ｍｇの活性成分を含有するボーラスでの経口投与によって得られる。所望の血液レベルは、約０．２〜１．０ｍｇ／ｋｇ／時間を提供する連続注入または約０．４〜２０ｍｇ／ｋｇの活性成分を含有する間欠的注入によって維持される。
所望される用量は、便宜上、単回投与で、または適切な間隔、例えば１日あたり２、３、４回以上の部分用量で投与される分割投与として示されうる。部分用量自体は、例えば、間隔が緩やかな何回もの分割投与、例えば吸入器からの複数回吸入または複数滴の眼への適用によるものにさらに分かれうる。
本発明の化合物は、転移癌の細胞遊走の阻害および治療のために投与される治療剤として有用である。かかる癌は、限定はされないが、動物の頭部、頚部、肺、中皮腫、縦隔、食道、胃、膵臓、肝胆道系、小腸、結腸、結腸直腸、直腸、肛門、腎臓、尿管、膀胱、前立腺、尿道、ペニス、睾丸、婦人科器官、卵巣、乳房、内分泌系、皮膚、または中枢神経系に関与する癌を含む。したがって、例えば、癌は、乳癌、白血病、肺癌、結腸癌、中枢神経系癌、メラノーマ、卵巣癌、腎癌、または前立腺癌でありうる。
さらに、本発明の化合物は、細胞遊走の阻害のさらなる検討における薬理学的ツールとして有用でありうる。
本発明の化合物はまた、癌細胞または腫瘍細胞の進行を治療または制御するのに有効な他の治療剤と並行投与してもよい。
さらに、本発明の化合物は、適切な動物モデルで試験してもよい。例えば、本発明の化合物は、公知の腫瘍を有する動物、または腫瘍細胞が限局された領域に注射されている動物において試験してもよい。長期間かけて形成する続発性腫瘍の程度または数は転移の尺度であり、かかる転移に対する化合物の阻害能が、原発性腫瘍を有するが試験化合物を全く受けない対照動物に対して、評価されうる。このタイプのインビボ試験から得られる実験結果が図８に示され、実施例においてさらに説明される。これらの結果は、本発明の化合物が腫瘍転移を実質的に低減または除去することを示す。
本発明の化合物ではまた、脳障害の治療における用途が見出されることになる（Ｋｒａｆｔら、「Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｂｒａｉｎ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅ ｒｅｖｅａｌ ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｆａｓｃｉｎ ｉｎ ｎｅｕｒｉｔｅ ｓｈａｐｅ ａｎｄ ｔｒａｊｅｃｔｏｒｙ．」 Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００６年））；ホジキン病（Ｐｉｎｋｕｓら、「Ｆａｓｃｉｎ，ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｎｅｗ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ｒｅｅｄ−Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｏｒ Ｂ ｃｅｌｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ?」 Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９９７年））；ウイルス感染（Ｍｏｓｉａｌｏｓら、「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｄｅｎｄｒｉｃ ｃｅｌｌｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ａ ５５−ｋｄ ａｃｔｉｎ−ｂｕｎｄｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ．」 Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９９６年））；神経変性（Ｆｕｌｇａら、「Ａｂｎｏｒｍａｌ ｂｕｎｄｌｉｎｇ ａｎｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆ−ａｃｔｉｎ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｔａｕ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ．」 Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００７年２月；９（２）：１３９−４８頁））；リンパ過形成（Ｓａｉｄら、「Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｉｎｇ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＨＩＶ−ｒｅｌａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ：ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｓｃｉｎ．」 Ｍｏｄ Ｐａｔｈｏｌ．１９９７年５月；１０（５）：４２１−７頁））；および虚血（Ｍｅｌｌｅｒら、「Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ：ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｒａｐｉｄ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．」 Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００８年１月 ２；２８（１）：５０−９頁））。
ここで本発明は次の非限定的な実施例によって例示されることになる。
実施例１
化学合成および特徴づけ
本実施例は、化合物の合成ならびに化学的および物理的特徴づけについて説明する。
合成：本発明の化合物は以下のように合成されうる。
Figure 2011506274
Figure 2011506274
使用される試薬および条件は次のとおりである。（ａ）Ｙａｍａｇｕｃｈｉアシル化（４８％）；（ｂ）Ｅｔ３Ｎ、ＤＭＡＰ、６−塩化ヘプタノイル（８９％）；（ｃ）グラブス触媒、トルエンおよび還流（４７および７３％）；（ｄ）ＨＦ−ピリジン、ＴＨＦ（７８および９０％）；（ｅ）ジフェニルホスホリルアジド（８７％）；（ｆ）ＰＰｈ３、Ｈ２Ｏ（９０％）；（ｇ）ＣＢｒ４、ＰＰｈ３（９５％）；（ｈ）ＥＤＣＩ、６−ヘプテン酸（７０％）；（ｉ）１−ベンゼンスルホニル−オクト−７−エン−オン、ＤＢＵ（７５％）；（ｊ）Ｎａ／Ｈｇ（７９％）；（ｋ）グラブス触媒、トルエン、還流（７０および７５％）；（ｌ）ＨＦ−ピリジン、ＴＨＦ（９０および９５％）。
分析機器：旋光度は、室温、ＪＡＳＣＯ ＤＩＰ−３７０デジタル偏光計で測定する。ｇ／１００ｍｌでの濃度（ｃ）および溶媒を括弧内に示す。赤外線スペクトルは、そのままで、またはＣＨＣｌ３中のフィルムとして（ＮａＣｌプレート）Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ １６００ＦＴ−ＩＲ分光光度計で得られる。吸収バンドはｃｍ−１で記される。１Ｈ−および１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、ＣＤＣｌ３中、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＭＸ−４００ＭＨｚまたはＢｒｕｋｅｒ Ａｄｖａｎｃｅ ＤＲＸ−５００ＭＨｚ分光計で記録する（１Ｈ−ＮＭＲに対して７．２６ｐｐｍ（δ）および１３Ｃ−ＮＭＲに対して７７．０ｐｐｍを参照）。カップリング定数（Ｊ）（Ｈ，Ｈ）はＨｚで示し、スペクトル分裂パターンは、一重項（ｓ）、二重項（ｄ）、三重項（ｔ）、四重項（ｑ）、多重項またはそれより多い重複シグナル（ｍ）、明白（ａｐｐ）、ブロードシグナル（ｂｒ）と指定される。低分解能質量スペクトル（イオンスプレー、エレクトロスプレーの変形）は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ１００分光計で取得する。試料は直接注入によって導入する。高分解能質量スペクトル（高速原子衝撃、ＦＡＢ）は、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ７０−ＳＥ−４Ｆ分光計で取得する。
マイグラスタチンコア７：［α］Ｄ＋１０６．０°（ｃ０．５０，ＣＨＣｌ３）；ＩＲ（ＣＨＣｌ３）３５６７，２９３３，２８８１，１７１６，１６０２，１４４８，１３９３，１２５５，１１０７，１０５２；１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ６．８１−６．７５（ｍ，１Ｈ）、５．７３（ｄ，Ｊ＝１５．９，１Ｈ）、５．６２−５．５５（ｍ，２Ｈ）、５．１４（ｄｄ，Ｊ＝１５．２，６．８，１Ｈ）、４．７２（ｄ，Ｊ＝１５．６，１Ｈ）、４．６３（ｄ，Ｊ＝１５．６，１Ｈ）、３．４２−３．３８（ｍ，２Ｈ）、３．２８（ｓ，３Ｈ）、３．０３−２．９７（ｍ，１Ｈ）、２．６９（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、２．４７−２．３８（ｍ，２Ｈ）、２．３２−２．１８（ｍ，２Ｈ）、１．６８（ｓ，３Ｈ）、０．８８（ｄ，Ｊ＝６．９，３Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６５．３６，１４９．５２，１３３．８５，１２９．７９，１２９．５１，１２７．５０，１２２．１５，８４．６２，７６．０９，６５．４０，５６．２５，３２．２０，３１．３４，２９．９９，２２．２７，１２．６６；ＭＳ（ＥＳＩ）３０３［Ｍ＋Ｎａ＋］；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ）Ｃ１６Ｈ２４Ｏ４［Ｍ＋Ｎａ＋］に対する計算値３０３．１５７１，実測値３０３．１５７２。
２，３−ジヒドロ−マイグラスタチンコア８：［α］Ｄ＋１１５．３°（ｃ１．００，ＣＨＣｌ３）；ＩＲ（ＣＨＣｌ３）３５６７，３０１６，２９３３，２８５８，１７２４，１４５０，１３８７，１３１７，１２５８，１１４５，１１１５，９７９；１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．７４−５．６７（ｍ，２Ｈ）、５．２３（ｄｄ，Ｊ＝１５．７，７．７，１Ｈ）、４．５４（ｄ，Ｊ＝１３．１，１Ｈ）、４．２９（ｄ，Ｊ＝１３．１，１Ｈ）、３．４６−３．３９（ｍ，２Ｈ）、３．３０（ｓ，３Ｈ）、２．８２−２．７７（ｍ，１Ｈ）、２．４４−２．３９（ｍ，１Ｈ）、２．２６−２．１５（ｍ，２Ｈ）、２．０３−１．９７（ｍ，１Ｈ）、１．７４（ｄ，Ｊ＝０．９，３Ｈ）、１．７４−１．７０（ｍ，１Ｈ）、１．６０−１．５２（ｍ，２Ｈ）、１．３６−１．３２（ｍ，１Ｈ）、０．９３（ｄ，Ｊ＝６．９，３Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７３．６９，１３５．１９，１３４．３９，１２９．０２，１２７．１４，８３．８２，７５．９１，６４．７６，５６．３４，３４．２３，３２．０６，２９．８８，２７．２０，２３．４０，２３．２７，１２．８１；ＭＳ（ＥＳＩ）３０５［Ｍ＋Ｎａ＋］；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ）Ｃ１６Ｈ２６Ｏ４［Ｍ＋Ｎａ＋］に対する計算値３０５．１７１９，実測値３０５．１７２９。
マイグラスタチンラクタム１３：［α］Ｄ＋１０１．３°（ｃ１．００，ＣＨＣｌ３）；ＩＲ（ＣＨＣｌ３）３５６６，３４４４，３０２１，２９３６，２８２８，１６５８，１５０４，１４７８，１３９８，１２２９，１０８８，９７９；１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．７９−５．７３（ｍ，１Ｈ）、５．６６（ｄ，Ｊ＝１０．２，１Ｈ）、５．２４（ｄｄ，Ｊ＝１５．８，７．５，１Ｈ）、５．１２（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、３．９１（ｄｄ，Ｊ＝１３．７，４．１，１Ｈ）、３．５０−３．４６（ｍ，２Ｈ）、３．３４−３．３０（ｍ，１Ｈ）、３．３１（ｓ，３Ｈ）、２．８９（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、２．５６−２．５２（ｍ，１Ｈ）、２．３２−２．２５（ｍ，２Ｈ）、２．１６−２．１１（ｍ，１Ｈ）、１．９６−１．８９（ｍ，１Ｈ）、１．７７（ｄ，Ｊ＝１．１，３Ｈ）、１．７３−１．５１（ｍ，３Ｈ）、１．３７−１．３２（ｍ，１Ｈ）、０．９４（ｄ，Ｊ＝６．９，３Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７３．３６，１３５．５２，１３３．７７，１２９．８９，１２８．７３，８３．２１，７６．３８，５６．４５，４１．４０，３５．９５，３２．２７，２９．８６，２７．００，２４．８２，２４．４２，１３．０３；ＭＳ（ＥＳＩ）３０４［Ｍ＋Ｎａ＋］；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ）Ｃ１６Ｈ２７ＮＯ３［Ｍ＋Ｎａ＋］に対する計算値３０４．１８８８，実測値３０４．１８８９。
マイグラスタチンケトン（１４）：［α］Ｄ＋７７．０°（ｃ０．５，ＣＨＣｌ３）；ＩＲ（ｎｅａｔ）３５６６，３０２２，３０１５，２９７５，２９３７，２８７９，１７００，１４４８，１３８４，１２３７，１１０９，１０８５，９７９ｃｍ−１；１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．７２（ｄｄｄ，Ｊ＝１５．０，８．５，６．０，１Ｈ）、５．３７（ｄｄ，Ｊ＝１０．０，０．９，１Ｈ）、５．３１（ｄｄ，Ｊ＝１５．６，７．８，１Ｈ）、３．４７（ｔ，Ｊ＝８．５，１Ｈ）、３．３６（ｄｄ，Ｊ＝９．２，１．２，１Ｈ）、３．３１（ｓ，３Ｈ）、２．７８（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、２，５１−２，４５（ｍ，２Ｈ）、２，３７−２．３２（ｍ，２Ｈ）、２，２６−２，１６（ｍ，５Ｈ）、１．６９（ｄ，Ｊ＝１．３，３Ｈ）、１．６９−１．５９（ｍ，２Ｈ）、１．５３−１．５０（ｍ，２Ｈ）、０．９５（ｄ，Ｊ＝６．８，３Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２１２．１０，１３５．２３，１３２．９１，１３０．２６，１２９．２２，８３．６９，７７．６２，５６．４５，４２．０８，４０．６７，３２．５７，３０．３３，２８．５７，２７．０１，２３．２２，２３．１４，１２．６１；ＭＳ（ＥＳＩ）３０３［Ｍ＋Ｎａ＋］；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ）Ｃ１７Ｈ２８Ｏ３Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ＋］に対する計算値３０３．１９３６，実測値３０３．１９３８。
（Ｒ）−イソプロピルマイグラスタチン（１７）：［α］Ｄ＋２１．３°（ｃ０．０９，ＣＨＣｌ３）；ＩＲ（ｎｅａｔ）３４９９，２９６７，２９２６，２８６６，１７２９，１４５３，１３８３，１２５７，１１１１，９８１ｃｍ−１；１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．６５（ｄｔ，Ｊ＝１５．５，７．５，１Ｈ）、５．５８（ｄｄ，Ｊ＝１０．７，１．３，１Ｈ）、５．３５（ｄｄ，Ｊ＝１５．５，６．０，１Ｈ）、４．８７（ｄ，Ｊ＝７．６，１Ｈ）、３．４９（ｄｄ，Ｊ＝９．１，６．０，１Ｈ）、３．３４（ｓ，３Ｈ）、３．２７（ｂｒ ｄ，Ｊ＝８．８，１Ｈ）、３．１３−３．０７（ｍ，１Ｈ）、２．８６，（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、２．３４−２．１５（ｍ，４Ｈ）、２．０６−１．９９（ｍ，１Ｈ）、１．７６（ｄ，Ｊ＝１．６，３Ｈ）、１．７５−１．５８（ｍ，３Ｈ）、１．４７−１．４１（ｍ，１Ｈ）、０．９８（ｄ，Ｊ＝７．０，３Ｈ）、０．９３（ｄ，Ｊ＝６．７，３Ｈ）、０．９２（ｄ，Ｊ＝６．７，３Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７２．５０，１３２．４５，１３２．０８，１３１．５８，１２８．２６，８２．４５，８０．７４，７７．４４，３３．００，３２．６６，３１．７６，３０．５６，２５．５７，２４．９１，２２．４４，１９．０２，１８．９６，１３．２０；ＭＳ（ＥＳＩ）３２４［Ｍ＋Ｎａ＋］；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ）Ｃ１９Ｈ３２Ｏ４Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ＋］に対する計算値３４７．２１９８，実測値３４７．２１９６。
（Ｓ）−イソプロピルマイグラスタチン（１８）：［α］Ｄ＋２５．１°（ｃ０．３２，ＣＨＣｌ３）；ＩＲ（ｎｅａｔ）３４７９，２９６７，２９２６，２８７６，１７２４，１４４８，１３７３，１２５７，１２３７，１０９１，９７６ｃｍ−１；１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．７０（ｄｄｄ，Ｊ＝１５．４，８．５，５．３，１Ｈ）、５．３３（ｄｄ，Ｊ＝１０．０，０．９，１Ｈ）、５．３０（ｄ，Ｊ＝７．０，１Ｈ）５．１９−５．１３（ｍ，１Ｈ）、３．４０−３．３０（ｍ，２Ｈ）、３．２８（ｓ，３Ｈ）、２．９９−２．９６（ｍ，１Ｈ）、２．７６（ｓ，１Ｈ）、２．３６−２．２４（ｍ，２Ｈ）、２．２０−２．０８（ｍ，２Ｈ）、１．９９（ｄｔ，Ｊ＝７．０，６．９，１Ｈ）１．６９（ｄ，Ｊ＝１．３，３Ｈ）、１．６２−１．５２（ｍ，４Ｈ）、０．９４（ｄ，Ｊ＝７．０，３Ｈ）、０．９１（ｄ，Ｊ＝６．６，３Ｈ）、０．８６（ｄ，Ｊ＝６．９，３Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１７２．９７，１３５．９４，１３３．８３，１３０．０９，１２７．７５，８６．４７，７８．７０，５５．９８，３３．９９，３２．８０，３０．３８，２９．８２，２７．３４，２２．５７，２１．３８，１９．０９，１８．０５，１５．２０；ＭＳ（ＥＳＩ）３２４［Ｍ＋Ｎａ＋］；ＨＲＭＳ（ＦＡＢ）Ｃ１９Ｈ３２Ｏ４Ｎａ［Ｍ＋Ｎａ＋］に対する計算値３４７．２１９８，実測値３４７．２１８７。
実施例２
マイグラスタチン類似体による転移腫瘍細胞遊走の阻害
細胞遊走を阻害するための本発明の化合物の有効性を、２つの方法、創傷治癒アッセイおよびチャンバー細胞遊走アッセイを用いて評価した。
方法
細胞
マウス４Ｔ１乳房腫瘍細胞およびヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳房腫瘍細胞をＡＴＣＣから入手し、それらは先行的に記載がなされている（Ｓｈａｎら ２００５年、Ｙａｎｇら ２００５年）。４Ｔ１細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で培養した。
創傷治癒アッセイ
創傷治癒アッセイは、コンフルエント細胞が、細胞層内での引っ掻き傷（ｓｃｒａｐｅ）または創傷を横切って遊走しうるか否かを観察することを含む。細胞遊走アッセイを先行的に記載のように実施した（Ｙａｎｇら ２００５年、Ｓｈａｎら ２００６年）。腫瘍細胞を、標準培地中、ゼラチンでコーティングした２４ウェルプレート内にプレーティングした。細胞がコンフルエンスまで成長後、無菌のピペットチップなどの無菌の器具を使用し、細胞のコンフルエント層内で創傷を作った。細胞をリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）または他の無菌溶液で洗浄し、次いで、１０％ＦＢＳを補充した培地を添加することによって遊走を誘発した。陽性対照における創傷が閉じた時、細胞を３．７％ホルムアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレット染色液で染色した。低濃度で創傷領域への細胞の遊走を阻害する化合物は、細胞遊走を阻害し、転移癌を治療するのに有用である。
チャンバー細胞遊走アッセイ
チャンバー細胞遊走アッセイは、細胞が公知のサイズの孔を有するフィルタを介して遊走しうるか否かを評価する。例えば、細胞遊走は、約８．０μｍの孔径を有するフィルタを有するボイデンチャンバーでアッセイされうる。つまり、無血清培地中の細胞を第１のチャンバーに添加し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を有する５００μｌの培地を第２のチャンバーに添加する。チャンバーを、２つの両チャンバー内の異なる濃度の化学化合物とともに３７℃で約６〜８時間インキュベートする。第１のチャンバー内の細胞を綿棒で除去し、もう一方のチャンバー内またはフィルタの反対側にある細胞を固定し、染色する。第２のチャンバーに面するフィルタのいくつかのランダム領域の写真を撮り、細胞の数をカウントし、遊走した（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｅｄ）細胞の平均数を計算する。
結果
インビトロでの腫瘍細胞の遊走に対するコア大環状ケトンおよびコア大環状ラクタム類似体の効果を試験した。図１に示されるように、創傷治癒アッセイおよびボイデンチャンバーアッセイの双方による測定によると、血清が転移性マウス乳房腫瘍４Ｔ１細胞の遊走を誘発したが、大環状ケトンまたは大環状ラクタム同族体の添加によって血清誘発性４Ｔ１細胞の遊走が阻害された（図１Ｂ〜１Ｄ）。大環状ケトンおよび大環状ラクタムのコア構造は、ＩＣ５０値がそれぞれ１００および２５５ｎＭの場合、かなり有効であった（図１Ｃおよび１Ｄ）。親化合物マイグラスタチンは２９μＭのＩＣ５０を有した（Ｎｊａｒｄａｒｓｏｎら ２００４年、Ｇａｕｌら ２００４年）。これらの化合物は、培養物中での４Ｔ１細胞の増殖に対してほとんど効果を有しなかった（同上）。
大環状ケトンおよび大環状ラクタム同族体はまた、いくつかの浸潤性および転移性ヒト腫瘍細胞系、例えばヒト乳房腫瘍ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞、ヒト前立腺腫瘍ＰＣ−３細胞、およびヒト結腸腫瘍Ｌｏｖｏ細胞の遊走を阻害した（図２Ａおよび２Ｂ）。それに対し、正常なヒト乳腺上皮ＭＣＦ−１０Ａ細胞、マウス胎児線維芽細胞、または一次マウス白血球の遊走は、これらの化合物に対してむしろ無反応であった（図２Ｃおよび２Ｄ）。これらの細胞試験によると、大環状ケトンおよび大環状ラクタムのコア構造が、正常細胞よりもマウスおよびヒト転移腫瘍細胞に対して高度に選択的であることが示された。これらの結果はまた、これら化合物の生化学標的のレベルまたは活性が転移腫瘍細胞内で高い可能性があり、それによりこれらの腫瘍細胞が化合物に対して感作されることを示唆する。
実施例３
マウスにおけるマイグラスタチン類似体による高度に転移性の乳癌細胞の肺転移の阻害
類似体を試験し、４Ｔ１マウス乳房腫瘍モデルにおいて、それらが腫瘍転移に作用しうるか否かを判定した。これらの化学化合物での処理を伴う場合または伴わない場合でのマウスにおける４Ｔ１腫瘍細胞の肺転移について試験した。マウス４Ｔ１腫瘍は、ヒト乳癌を、その解剖学的部位、免疫原性、成長特性、および転移特性において忠実に再現する（Ｐｕｌａｓｋｉら １９９８年）。４Ｔ１腫瘍は、乳腺から肺、骨、脳、および肝臓を含む種々の標的器官に自発的に転移する（Ａｓｌａｋｓｏｎら １９９２年）。ＢＡＬＢ／ｃマウスの乳腺における４Ｔ１細胞（１×１０５）の移植の１０日後、マウスの腹腔内に大環状ケトンおよび大環状ラクタムコア構造または対照の生理食塩水ＰＢＳを注射した。大環状ケトンまたは大環状ラクタムコア構造の用量は１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇであった。化合物を注射した。２０日後、マウスを殺し、肺への転移についてクローン原性アッセイによって試験した（Ｓｈｅｎら、２００５年）。対照の生理食塩水（媒体単独）を注射したマウスは、肺における転移性４Ｔ１細胞が多数あることを示したが、大環状ケトンまたは大環状ラクタムのいずれかで処理したマウスは、肺における転移性４Ｔ１細胞の数が９１％−９９％減少した（図３Ａ）。大環状ケトンまたは大環状ラクタムで処理したマウスは、生理食塩水で処理したマウスの場合に類似したサイズの原発性乳房腫瘍を形成し（図３Ｃ）、それは、これらの化学化合物が４Ｔ１細胞による原発性腫瘍形成に干渉しなかったことを意味する。マウスは体重減少、不活発、または被毛の乱れ（ｒｕｆｆｌｅｄ ｆｕｒ）のエビデンスが全くなく、正常であるように見られたことから、これらの化合物は明確な副作用を引き起こさなかった。これらの結果は、大環状ケトンおよび大環状ラクタムが乳腺から肺への４Ｔ１腫瘍細胞転移の強力な阻害剤であることを示す。
これらのコア構造の特定の効果のためのさらなる対照として、２つの他の化合物、すなわちマイグラスタチンセミコアおよび大環状ラクトンを試験した（図３Ｂ）。４Ｔ１細胞でインビトロでの細胞遊走に対するその阻害能について試験する時、マイグラスタチンセミコアは、ＩＣ５０が４０μＭの場合、大環状ケトンおよび大環状ラクタムより有意に低い活性を示した（Ｎｊａｒｄａｒｓｏｎら ２００４年、Ｇａｕｌら ２００４年）。大環状ラクトンは４Ｔ１細胞遊走の阻害時に極めて有効であったが（２４ｎＭのＩＣ５０）、先行する代謝安定性試験によると、それは、半減期が＜５分であり、マウス血漿中で非常に不安定であることが示された（Ｇａｕｌら ２００４年）。図３Ａに示されるように、マウスのマイグラスタチンセミコア（１０および２０ｍｇ／ｋｇ）による処理は、これらのマウスにおいて４Ｔ１腫瘍転移を有意に低下させなかった。２０ｍｇ／ｋｇの大環状ラクトンの４Ｔ１腫瘍転移に対する効果は統計的に有意であったが、それは大環状ケトンおよび大環状ラクタムの場合よりはるかに少なかった（図３Ａ）。大環状ラクトンの有効性の低下は、マウスにおけるその不安定性に起因する可能性が高かった。
実施例４
マイグラスタチン類似体による葉状仮足形成の阻害
４Ｔ１細胞内のアクチン細胞骨格および微小管に対する大環状ケトンおよび大環状ラクタムの効果について試験した。細胞遊走は逐次的かつ相互関連的な多段階プロセスである（Ｒｉｄｌｅｙら ２００３年）。それは、先端部で葉状仮足の形成、接着および脱離のサイクル、細胞体収縮（ｃｅｌｌ ｂｏｄｙ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ）、ならびに尾部退縮（ｔａｉｌ ｒｅｔｒａｃｔｉｏｎ）を伴う（Ｒｉｄｌｅｙら ２００３年）。コア大環状ケトンおよびコア大環状ラクタムは先端部での葉状仮足の形成を阻害した（Ｓｈａｎら ２００５年）。血清の添加が葉状仮足の形成を誘発したが、一方、大環状ケトンまたは大環状ラクタムコアのいずれかの添加は葉状仮足の形成を破壊した（Ｓｈａｎら ２００５年）。さらに、いずれの化合物も微小管の組織化に対して全く効果を有しなかった。これらのデータは、これらのマイグラスタチン類似体の腫瘍転移に対する作用の細胞基盤が、アクチン細胞骨格の再組織化の破壊を伴うことを示した。
実施例５
マイグラスタチン類似体はファスチンのアクチン束化活性を阻害する
方法
マイグラスタチン類似体のタンパク質標的としてのファスチンの同定
４Ｔ１マウス乳房腫瘍細胞から全細胞溶解液を作製した。細胞溶解液を固定化ニュートラアビジンビオチン結合性タンパク質（Ｐｉｅｒｃｅ，ＩＬ，ＵＳＡ）で予め清浄化し、ビオチンおよびアビジン結合性タンパク質を除去した後、細胞溶解液を（ニュートラアビジンビーズに複合された）ビオチン標識された大環状ケトンで満たしたカラムに装填した。遊離ビオチンおよびニュートラアビジンビーズで満たした対照カラムを並行的に操作した。カラムを、３００ｍＭのＮａＣｌを有する１０床容量（ｂｅｄ ｖｏｌｕｍｅｓ）の溶解緩衝液で洗浄後、結合されたタンパク質を、製造業者の使用説明書に従い、ｐＨ２．８での０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌで溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、１つのバンド（約５５ｋＤａ）が、ビオチン標識された大環状ケトンカラムから溶出される試料中に存在したが、ビオチンカラムから溶出される試料にはなかった。この約５５ｋＤａのタンパク質を有するバンドをゲルから切り取り、タンパク質を質量分析によってマウスｆａｓｃｉｎ １として同定した。
タンパク質の発現および精製
組換えＧＳＴ−ファスチン融合タンパク質をＢＬ２１大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）内で生成させた。１Ｌの培養物を１．０のＡ６００読み取り値まで成長させ、次いで０．３ｍＭのイソプロピル１−チオ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により、２５℃で１２時間インキュベートした。細胞を急速冷凍し、次いでトリス緩衝化生理食塩水中で音波処理によって溶解した。次いで、上清をグルタチオン−セファローズとともに４℃で２時間インキュベートした。徹底洗浄後、ＧＳＴ−ファスチンを溶出させ、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｐｌｕｓ−２０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮した。融合タンパク質からＧＳＴタグを除去するため、ビーズをトロンビンとともに４℃で一晩インキュベートした。上清を回収し、濃縮した。
ＧＳＴ−ファスチンおよびビオチン−大環状ケトンの相互作用
精製組換えファスチンタンパク質または対照タンパク質を、ビオチン−大環状ケトンとともに４℃で２時間インキュベートした。ビオチン−大環状ケトンに関連したタンパク質を、Ｕｌｔｒａｌｉｎｋ−固定化ニュートラアビジンアガロース（Ｐｉｅｒｃｅ）とともに沈殿させた。徹底洗浄後、結合されたタンパク質をＳＤＳ試料緩衝液で溶出させ、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって溶解した。
Ｆ−アクチン束化アッセイ アクチン束化活性を、低速遠心分離アッセイおよび蛍光顕微鏡法によって測定した。低速遠心分離アッセイにおいては、単量体ウサギＧアクチンの重合を、Ｆ−アクチン緩衝液（ｐＨ８の２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのＭｇＣｌ２および１００ｍＭのＫＣｌ）中、室温で誘発した。次いで、組換えファスチンタンパク質または対照緩衝液を、Ｆ−アクチンとともに室温で６０分間インキュベートし、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４１５Ｄ卓上遠心分離機、１０，０００ｇで３０分間遠心分離した。上清およびペレットの双方を等容量のＳＤＳ試料緩衝液中に溶解し、アクチンの量をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定した。蛍光顕微鏡法においては、単量体Ｇアクチンを上述のように重合した。Ｆ−アクチンをＦ−緩衝液中の組換えファスチンタンパク質と混合し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、５％ローダミン−ファロイジンを混合物に添加することによってアクチンを、標識した。試料をスライドとポリ−リジンでコーティングされたカバースリップの間に載せ、蛍光顕微鏡法によって画像化した。
Ｆ−アクチン結合アッセイ
アクチン重合を上述のように行った。次いで、組換えファスチンタンパク質または対照緩衝液を、Ｆ−アクチンとともに室温で６０分間インキュベートした。混合物を１００，０００ｇ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｉｒｆｕｇｅ）で３０分間遠心分離した。上清およびペレットの双方を等容量のＳＤＳ試料緩衝液中に溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
免疫蛍光顕微鏡法
ゼラチンでコーティングされたガラスカバースリップ上で培養した細胞を、ＰＢＳ中、３．７％ホルムアルデヒドで、室温で１０分間固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で５分間透過処理し、次いでＰＢＳで３回洗浄した。非特異的結合をブロッキングするため、細胞を１％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳの溶液とともに３０分間インキュベートし、次いで適切に希釈した一次抗体とともに１時間インキュベートした。一次抗体とのインキュベーション後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、蛍光複合二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）とともにインキュベートした。次いで、カバースリップをスライド上に固定し、Ｚｅｉｓｓ蛍光顕微鏡を使用して画像化した。
電子顕微鏡法
試料を新たにグロー放電された炭素コートした銅グリッド上に２分間吸収させ、２％酢酸ウラニルで染色した。グリッドを、８０ｋＶの加速電圧でＺｅｉｓｓ電子顕微鏡を使用して試験した。
結果
マイグラスタチン類似体の作用の分子的基盤を理解するため、マイグラスタチン類似体のタンパク質標的を同定した。ビオチン標識された大環状ケトンを使用したタンパク質標的の同定に向けた公平なアプローチで試験した（図４Ａを参照）。このビオチン標識されたマイグラスタチン類似体は、４Ｔ１乳房腫瘍細胞遊走の阻害において活性を示した（Ｇａｕｌら ２００４年）。ビオチン標識された大環状ケトンを使用し、親和性カラムを準備し、約５５ｋＤａのタンパク質標的を巧妙に精製し（図４Ｂ）、質量分析によってマウスｆａｓｃｉｎ １として同定した。
異なるが相補的なアプローチを使用し、ファスチンが標的であることを検証した。第１のアプローチは、マイグラスタチン類似体とファスチンの相互作用に対するインビトロ試験であった。ファスチンを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からＧＳＴ−融合タンパク質として精製した（図５Ａおよび５Ｂ）。ＧＳＴ対照でない精製したファスチンが、ビオチンに複合された大環状ケトンと特異的に相互作用した（図５Ａおよび５Ｂ）。さらに、過剰量の非ビオチン化大環状ケトンが、ファスチンとビオチンに複合された大環状ケトンの間の結合と効率的に競合した（図５Ｃ）。別のマイグラスタチン類似体の大環状ラクタムもまた、ビオチンに複合された大環状ケトンのファスチンへの結合と競合した（データは示さず）。まとめると、これらのデータは、ファスチンが大環状ケトンのタンパク質標的であることを示す。
３つの異なるアプローチを用い、ファスチンに対する大環状ケトンの効果について検討した。第１に、精製組換えファスチンタンパク質のアクチン束化活性をＦ−アクチンペレット形成アッセイによって検討した（Ｙａｍａｓｈｉｒｏ−Ｍａｔｓｕｍｕｒａら １９８５年）。この低速遠心分離アッセイにおいては、ペレットは、Ｆ−アクチンポリマーの束を有する。精製ファスチンは、ペレット中のＦ−アクチン束の量を増加させた（図６Ａ）。大環状ケトン単独がＦ−アクチン束の形成に対して全く効果を有しなかった一方、大環状ケトンはＦ−アクチンポリマーのファスチン誘発性束化を有意に低下させた（図６Ａ）。第２に、蛍光顕微鏡法を用い、大環状ケトンの不在下および存在下で、ファスチンに調節されるＦ−アクチンフィラメント束を画像化した（図６Ｂ）。Ｆ−アクチンフィラメントのローダミンに複合されたファロイジンによる染色から明らかなように、ファスチンの添加によってＦ−アクチン束の形成が誘発された（図６Ｂ）。それに対し、大環状ケトンの存在下で、Ｆ−アクチン束の形成が大きく（＞８０％）阻害された（図６Ｂおよび６Ｃ）。第３に、電子顕微鏡法を用い、アクチン束について試験した（図６Ｄ）。ＥＭ試験によると、大環状ケトンが束の厚みを減少させる（図６Ｄ）ことが示された。これらの細いＦ−アクチン束は、大環状ケトンの不在下では観察されなかった分岐を有することが多かった。ファスチンがＦ−アクチンポリマーを束にするには、ファスチンはＦ−アクチンポリマーとの結合を必要とする。したがって、大環状ケトンがファスチンとＦ−アクチンとの直接結合を阻害する可能性が高い。これを確認するため、高速遠心分離法を用い、Ｆ−アクチンポリマーをペレット化した（Ｙａｍａｓｈｉｒｏ−Ｍａｔｓｕｍｕｒａら １９８５年）。これらの条件下では、ファスチンは単独では沈殿せず、ファスチンはＦ−アクチンポリマーとの結合によってプルダウンされうるにすぎない（同上）。（同量のＦ−アクチンポリマーを添加したことから）ほぼ同量のＦ−アクチンポリマーが大環状ケトンの不在下および存在下でペレット中に存在する一方、有意により少ないファスチンが、大環状ケトンの存在下でＦ−アクチンによってプルダウンされた（図６Ｅ）。これらのデータは、大環状ケトンがファスチンのアクチン束化活性を阻害することを示す。
実施例６
乳房腫瘍細胞の遊走におけるファスチンの本質的役割
方法
ＲＮＡ干渉
ファスチンのＲＮＡｉを、ｐＳＵＰＥＲベクター（Ｏｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ）を使用し、４Ｔ１マウス乳房腫瘍およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳房腫瘍細胞において行った。マウスファスチンの２対の標的配列は、ＧＧＴＧＧＧＣＡＡＡＧＡＴＧＡＧＣＴＣ（配列番号６３）およびＧＴＧＧＡＧＣＧＴＧＣＡＣＡＴＣＧＣＣ（配列番号６４）であった。ヒトファスチンの２対の標的配列は、ＧＧＴＧＧＧＣＡＡＧＧＡＣＧＡＧＣＴＣ（配列番号６５）およびＧＣＣＴＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧＡＴ（配列番号６６）であった。形質移入の前日、細胞を０．５ｍｌの抗生物質を有しない成長培地中にプレーティングした。形質移入時、細胞は３０〜５０％コンフルエントであった。各形質移入試料においては、ｓｉＲＮＡを次のように調製した。
１）５０μｌの血清を有しないＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ低血清培地（または血清を有しない他の培地）中で適量のｓｉＲＮＡを希釈する。緩やかに混合する。
２）使用前にリポフェクタミン２０００を緩やかに混合し、次いで５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地（または血清を有しない他の培地）中で適量に希釈する。緩やかに混合し、室温で５分間インキュベートする。注：希釈リポフェクタミン２０００を希釈ｓｉＲＮＡと３０分以内に結合させる。より長いインキュベーション時間が活性を低下させうる。Ｄ−ＭＥＭがリポフェクタミン２０００用の希釈剤として使用される場合、５分以内に希釈ｓｉＲＮＡと混合する。
３）５分間のインキュベーション後、希釈ｓｉＲＮＡを希釈リポフェクタミン２０００と結合させる（全容量は１００μｌである）。緩やかに混合し、室温で２０分間インキュベートし、ｓｉＲＮＡ：リポフェクタミン２０００複合体の形成を可能にする。
１００μｌのｓｉＲＮＡ：リポフェクタミン２０００複合体を各ウェルに添加する。プレートを前後に振とうすることにより、緩やかに混合する。細胞を、ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で、遺伝子ノックダウンについてのアッセイに対してそれらの準備ができるまで２４〜７２時間インキュベートした。複合体を除去するかまたは培地を変更することは一般的に必要ではなかったが、４〜６時間後、形質移入活性を損なうことなく成長培地を交換した。
次の追加的な細胞系、すなわちヒト結腸腫瘍Ｌｏｖｏ−２２９細胞；ヒト前立腺腫瘍ＰＣ−３細胞；メラノーマＢ１６細胞；卵巣腫瘍細胞；および肺腫瘍細胞を、本明細書中に記載のように、マイグラスタチン類似体およびファスチンｓｉＲＮＡで同様に試験した。
ボイデンチャンバー細胞遊走アッセイ
飢餓培地中に懸濁した細胞（５×１０４）を、上部チャンバー（６．５ｍｍの直径、８μｍの孔径、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）のインサートに添加し、インサートを、１０％ＦＢＳを有する、または有しない飢餓培地を含有する２４ウェルディッシュ内に置いた（Ｙａｎｇら ２００５年、Ｓｈａｎら ２００６年）。阻害剤を使用する場合は、両方のチャンバーに添加した。遊走アッセイを４〜６時間実施し、細胞を３．７％ホルムアルデヒドで固定した。細胞をクリスタルバイオレット染色液で染色し、インサートの上部側の細胞を綿棒で取り出した。インサートの下部側の３つの無作為に選択されるフィールド（１０倍対物レンズ）を撮影し、遊走細胞をカウントした。遊走は、フィールド内での遊走細胞の平均数または陽性対照の遊走細胞の百分率のいずれかで表された。百分率を、式Ｐ＝１００×（Ｍ−Ｍｎｃ）／Ｍｐｃ（式中、Ｐは遊走細胞の百分率、Ｍは遊走細胞の数、Ｍｎｃは陰性対照の遊走細胞の数、またＭｐｃは陽性対照の遊走細胞の数である）を用いて計算した。
結果
浸潤性が高い腫瘍細胞系４Ｔ１マウス乳房腫瘍細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳房腫瘍細胞を使用し、腫瘍細胞内でファスチンタンパク質レベルを低下させる効果について試験した。マウスＦａｓｃｉｎ−１に対して、２つの異なるｓｉＲＮＡおよび１つの対照ｓｉＲＮＡを使用して４Ｔ１細胞を処理し、これらのｓｉＲＮＡを安定的に発現する細胞を選択した。ファスチンｓｉＲＮＡはファスチンタンパク質レベルをノックダウンしたが、一方、対照ｓｉＲＮＡはしなかった（図７Ａ）。ファスチンｓｉＲＮＡで処理された細胞は、完全な成長培地中で、対照ｓｉＲＮＡで処理された細胞および非形質移入４Ｔ１細胞に匹敵する速度で成長し（データは示さず）、これはファスチンがインビトロでの乳房腫瘍細胞増殖に必要とされないことを示唆する。これは、マウスモデルにおいて、マイグラスタチン類似体が腫瘍細胞増殖および原発性腫瘍成長に対して明らかな効果を全く有しなかったという先の観察に一致する（Ｓｈａｎら ２００５年）。ボイデンチャンバー細胞遊走アッセイによると、ファスチンｓｉＲＮＡ処理により４Ｔ１細胞の血清誘発性遊走が低下するが、対照ｓｉＲＮＡによる処理では低下しないことが示された（図７Ｂ）。ファスチンｓｉＲＮＡのこの阻害効果は、ヒトファスチンｃＤＮＡの形質移入によって救済されうるであろう（この特定の領域内では、アミノ酸変化を伴わず、２つのヌクレオチド変化が生じる）（図７Ｃおよび７Ｄ）。同様に、ファスチンｓｉＲＮＡ処理は、ファスチンタンパク質レベルを下方制御し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の遊走を低下させた（図７Ｅおよび７Ｆ）。ファスチンｓｉＲＮＡ処理は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の増殖に作用しなかった（データは示さず）。これらの機能喪失（ｌｏｓｓ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ）分析に加え、機能獲得（ｇａｉｎ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ）実験も行った。転移性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳房腫瘍細胞と比較し、ＭＣＦ−１０Ａ正常乳腺上皮細胞はより少量のファスチンタンパク質を発現した（図７Ｇ）。ＭＣＦ−１０Ａ細胞内でのファスチンの過剰発現は、これらの細胞の血清誘発性遊走を増大させた（図７Ｈ）。まとめると、これらのデータは、ファスチンが乳房腫瘍細胞の遊走において重要な役割を果たすことを示す。
本発明者らは、ファスチンと大環状ケトンの複合体のＸ線結晶構造を解明している（実施例９を参照）。複合体の構造に基づくと、ヒトファスチン内のＨｉｓ４７４は、大環状ケトンの結合にとって不可欠であるが、アクチンの結合ではそうではない。さらに、Ｈｉｓ４７４はショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ファスチン内で保存されず、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ファスチンは、大環状ケトンに対する感受性を全く伴わずに、ファスチンｓｉＲＮＡで処理された４Ｔ１細胞内での遊走異常を救済できると思われる（データは示さず）。図７Ｉに示されるように、ファスチンｓｉＲＮＡで処理されたマウス４Ｔ１細胞内でのヒトファスチンの発現が遊走を救済したが、この救済は大環状ケトンに対して感受性があった。それに対し、ヒトファスチンにおけるＬｙｓ（ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ファスチンは対応する位置にＬｙｓを有する）またはＡｌａのいずれかへのＨｉｓ４７４の変異が、ファスチンｓｉＲＮＡで処理された４Ｔ１細胞の遊走を救済した（図７Ｉ）。これらの救済は、大環状ケトンによって阻害されなかった。さらに、別のアクチン束化タンパク質であるビリンにより、ファスチン−ｓｉＲＮＡで処理された４Ｔ１細胞の救済実験を行った。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）遺伝子試験では、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の卵形成の間、ビリンはファスチン変異の表現型を部分的に救済した（Ｃａｎｔら １９９６年）。ビリンはインビトロで大環状ケトンに結合せず、ファスチン−ｓｉＲＮＡで処理された４Ｔ１細胞内でのビリンの過剰発現は、大環状ケトンに感受性を示さずに、遊走を部分的に救済した（データは示さず）。これらの結果によると、ファスチンは、大環状ケトンにとって、腫瘍細胞遊走の阻害におけるタンパク質標的であることがさらに確認される。
実施例７
マウスモデルにおいてファスチンの阻害が乳房腫瘍転移を遮断する
方法
マウスにおける乳房腫瘍転移
すべての動物の研究は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｅｉｌｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅに従って行った。４Ｔ１マウス乳房腫瘍の自発的転移アッセイを先行的に記載されるように行った（Ｓｈａｎら ２００５年）。ＮＯＤ−ＳＣＩＤ免疫不全マウスを肺転移実験において使用した。ＴＧＬレポーターを発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳房腫瘍細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄した。この人工的ＴＧＬレポーター遺伝子は、高感度ＧＦＰのＮ末端に融合された単純ヘルペスウイルス１チミジンキナーゼおよびＧＦＰのＣ末端に融合されたホタルルシフェラーゼを有する三重融合タンパク質をコードする（Ｐｏｎｏｍａｒｅｖら ２００４年）。次いで、０．２ｍｌ ＰＢＳ中の１×１０６個の細胞を側尾静脈に注射した。ルシフェラーゼベースの非侵襲的生物発光イメージングおよび分析をＩＶＩＳ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用して行った。
細胞浸潤アッセイ
飢餓培地中に懸濁した細胞（１×１０５）を、マトリゲルコーティングされたインサート（６．５ｍｍの直径、８μｍの孔径、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）の上部チャンバーに添加し、インサートを、血清を含有する、または含有しない培地を有する２４ウェルディッシュ内に置いた。阻害剤を使用する場合には、両方のチャンバーに添加した。浸潤アッセイを１６時間行い、細胞を３．７％ホルムアルデヒドで固定した。細胞をクリスタルバイオレット染色液で染色し、インサートの上部側の細胞を綿棒で取った。インサートの下部側の３つの無作為に選択されたフィールド（１０倍対物レンズ）を撮影し、インサートの下部表面上の細胞をカウントした。
結果
腫瘍転移におけるファスチンの役割を動物モデルにおいて試験した。（４Ｔ１腫瘍細胞を伴う）自発的転移モデルおよび（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞を伴う）実験転移モデルを使用した。第１に、ファスチンの抑制が腫瘍浸潤を阻害するか否かについて、３Ｄマトリックスを介して試験した。図８Ａに示されるように、４Ｔ１細胞内での２つのファスチンｓｉＲＮＡの発現が、４Ｔ１腫瘍細胞の浸潤を著しく低減した。同様に、ヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳房腫瘍細胞内でのｓｉＲＮＡによるファスチンの抑制が細胞浸潤を阻害した（データは示さず）。第２に、４Ｔ１腫瘍細胞を伴う自発的転移モデルを使用し、腫瘍転移におけるファスチンの役割について検討した（図８Ｂ〜８Ｄ）。４Ｔ１細胞をマウス乳腺に注射した。ファスチンｓｉＲＮＡで処理された細胞および対照ｓｉＲＮＡで処理された細胞の双方に由来する原発性腫瘍は、同様の速度で発生し（図８Ｂ）、４週間後、同様の重量を有し（図８Ｃ）、これからファスチンの抑制がインビボでの４Ｔ１細胞の増殖に作用しないことが確認された。４Ｔ１腫瘍細胞の移植から４週間後、マウスを殺し、肺への腫瘍転移について試験した（図８Ｄ）。対照ｓｉＲＮＡで処理された細胞を注射したマウスは、肺において多数の転移性４Ｔ１細胞を示したが、一方、ファスチンｓｉＲＮＡで処理された細胞は、肺へ転移することができなかった（図８Ｄ）。
第３に、免疫不全マウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト腫瘍細胞を伴う実験転移モデルを使用し、腫瘍転移におけるファスチンの役割およびマウスにおけるヒト腫瘍の転移に対する大環状ケトンの効果について検討した（図８Ｅ〜８Ｈ）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ１、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびホタルルシフェラーゼ（ＴＧＬ）をコードする三重融合タンパク質レポーターコンストラクトをレトロウイルスによって感染させた（Ｍｉｎｎら ２００５年）。ＧＦＰ陽性細胞を、蛍光活性化細胞ソーティングによって富化させた。これらの細胞を免疫不全マウスの尾静脈に注射した［ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス］。腫瘍細胞の肺への転移を非侵襲的生物発光イメージングによってモニタリングした（Ｍｉｎｎら ２００５）。
これら腫瘍細胞の大部分は、注射直後に肺の毛細管内に捕捉されることになった（マウス毛細管によって強いられるサイズ制限により、ヒト腫瘍細胞が肺を介して動脈系から静脈系へ（またはその逆に）通過できることはまれである）（Ｍｉｎｎら ２００５年）（図８Ｅ、０日目）。最初の数日以内に生物発光シグナルの実質的減衰が認められ、これは転移できない細胞が生存できないことを示した（図８Ｅおよび８Ｆ）。対照ｓｈＲＮＡで処理された（ｓｉＲＮＡを安定的に発現する）腫瘍細胞を有するマウスにおいて２週間後にシグナルが漸増し、細胞の転移および増殖が奏功したことを示した（図８Ｅおよび８Ｆ）。意外なことに、肺における（ｓｉＲＮＡを安定的に発現する）ファスチンｓｈＲＮＡで処理された細胞の存在は、対照ｓｈＲＮＡで処理された細胞の場合よりずっと少なかった（図８Ｅおよび８Ｆ）。したがって、ファスチンｓｉＲＮＡ処理は、乳房腫瘍転移を有意に阻害した。
腫瘍転移の阻害をさらに確認するため、異種移植マウス由来の肺組織の組織学的分析を行った（図８Ｇ）。異種移植マウス由来の肺組織を単離し、切片を作成した（ｓｅｃｔｉｏｎｅｄ）。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色は、ファスチンｓｉＲＮＡで処理されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞が注射されたマウス由来の肺の正常な構造を示した（図８Ｇ）。それに対し、対照ｓｈＲＮＡで処理された腫瘍細胞が注射されたマウス由来の肺組織は、転移性ヒト乳房腫瘍細胞によって重度に浸潤された（図８Ｇ）。注射されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞をＧＦＰで標識したことから、肺組織内での腫瘍細胞の同一性をＧＦＰ蛍光によって確認した（図８Ｇ）。これらの結果は、マウスモデルにおいて、ファスチンがヒト腫瘍転移にとって重要であることを示す。
さらに、ここでは動物モデルにおいて、大環状ケトンがヒト乳房腫瘍の転移を有効に遮断しうることが示された。ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに、三重融合タンパク質レポーターを有するＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞を注射した。大環状ケトン（１０ｍｇ／ｋｇ）または対照生理食塩水（ＰＢＳ）を、７週間、１日おきに（腹腔内を介して）投与した。ヒト乳房腫瘍細胞の肺への転移に対する大環状ケトンの効果を、光子束の測定により、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を使用してモニタリングした。図８Ｈに示されるように、大環状ケトンにより、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の転移が８０％超低減された。まとめると、データは、乳房腫瘍転移におけるファスチンの本質的役割、および転移性乳房腫瘍を治療するための治療剤としてファスチンの阻害剤（大環状ケトンおよびｓｉＲＮＡなど）を使用する実現性について示す。
実施例８
ヒト乳癌患者におけるファスチンの発現の増大
方法
マイクロアレイ遺伝子発現分析
ファスチンについての遺伝子発現データを各腫瘍試料から抽出し、各々について全試料にわたって平均化した（ｍｅａｎ−ｃｅｎｔｅｒｅｄ）。原発性乳癌由来の組織を、Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒでの日常的臨床管理の一部として実施される治療手順から得た。ヒト組織を使用するすべての研究手順は、ＭＳＫＣＣ臨床試験審査委員会（ＭＳＫＣＣ ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｂｏａｒｄ）によって認可された（Ｄｏａｎｅら ２００６年）。組織を液体窒素中でスナップ凍結し（ｓｎａｐ−ｆｒｏｚｅｎ）、−８０℃で保存した。各試料を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色されたクリオスタット切片を使用して組織学的に試験した。領域を凍結ブロックから手作業で切り離し、分析に使用される組織内で７０％を超える腫瘍細胞含有率を一貫して提供した。全ＲＮＡを、グアニジウムイソチオシアネートベースの緩衝液（Ｔｒｉｚｏｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））中での均質化により、凍結組織から抽出し、ＲＮＡｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））を使用して精製し、変性アガロースゲルを使用し、品質について試験した。相補的ＤＮＡを、Ｔ７−プロモーター−タグ化オリゴ−ｄＴプライマーを使用し、ＲＮＡから合成した。ＲＮＡ標的を、インビトロ転写によってｃＤＮＡから合成し、ビオチン化ヌクレオチドで標識した（Ｅｎｚｏ Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ））。遺伝子発現分析を、製造業者の使用説明書に従い、ＨＧ−Ｕ１３３ＡおよびＵ１３３Ｂオリゴヌクレオチドマイクロアレイを使用して実施した（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ））。差次的遺伝子発現を同定するため、２つの異なる尺度、すなわち各群の試料の正規化平均とスチューデントのｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）の間での倍率変化（比）を用いた。
結果
ヒト乳癌患者由来の腫瘍試料中のファスチンの発現レベルを試験した。１３７の乳癌試料および１６の正常な乳房試料から得られるマイクロアレイ遺伝子発現データセットを分析した。乳房腫瘍試料は、正常試料と比べてファスチンの発現が高いことを示した（図９Ａ）。さらに、エストロゲン受容体（ＥＲ）陰性群の患者（図９Ｂ）およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）陰性群の患者（図９Ｃ）において、ファスチン転写産物が有意に高レベルであることが認められた。抗ファスチン抗体での免疫組織染色により、ファスチンタンパク質がＥＲ陰性腫瘍（図９Ｄ）において上方制御される一方、ＥＲ陽性腫瘍細胞がファスチン染色に対して陰性である（血管内皮がファスチン陽性であることに注意）ことが確認された。これらのデータは、ファスチン転写産物およびタンパク質のレベルが侵襲性の強いＥＲ陰性乳房腫瘍内で有意に上昇することを示す。
乳癌患者２９５名のＲｏｓｅｔｔａマイクロアレイデータセットにおけるファスチンｍＲＮＡの発現レベルもまた分析した（ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒら、２００２年、ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒら、２００２年）。同様に、ファスチン転写産物のレベルは、ＥＲ陰性（図９Ｇ）およびＰＲ陰性（図９Ｈ）腫瘍において有意に高かった。Ｒｏｓｅｔｔａデータセットは、乳癌患者の詳細な臨床フォローアップ情報を有する。したがって、乳癌患者におけるファスチン発現の臨床と病理の関連性を評価した。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析によると、より高いファスチンの発現が、より低い全生存率（図９Ｅ）および、より低い無転移生存率（図９Ｆ）と関連性があることが示された。これらのデータは、ヒト乳癌患者において、より高いファスチン発現と転移および死亡との間に相関性があることを強調している。
実施例９
マイグラスタチン類似体によるファスチンの機能および腫瘍転移の阻害における構造的基盤
マイグラスタチン類似体の不在下および存在下でのファスチンのＸ線結晶構造を決定した。マイグラスタチン類似体は、アクチン結合のための表面として生化学的および遺伝的に規定されている溝内でファスチンに結合する。これらの構造的データは、マイグラスタチン類似体によるファスチンの阻害における分子的基盤を提供する。
方法
ヒトＦａｓｃｉｎ−１の発現および精製
組換えヒトＦａｓｃｉｎ−１を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内でＧＳＴ−融合タンパク質として発現させた。典型的には、抗生物質を有する１リットルの２ＹＴ培地に、ｐＧＥＸ４Ｔ−Ｆａｓｃｉｎ １プラスミドで形質転換された３ｍｌのＢＬ２１一晩培養物を接種し、それをＯＤ６００が約０．８に達するまで３７℃で成長させた。次いで、培養物を２２℃にし、誘導のために０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加した。一晩誘導後、５，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により、細菌を採取した。細菌ペレットを液体窒素で急速凍結し、０．２ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭ のＤＴＴ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および１ｍＭのＥＤＴＡを補充した３０ｍｌの１×ＰＢＳ中に懸濁した。超音波処理後、懸濁液を１５，０００ｒｐｍで６０分間遠心分離し、細胞残渣を除去した。次いで、上清を、４ｍｌのグルタチオンビーズ（Ｓｉｇｍａ）とともに４℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳで徹底洗浄後、ビーズを、１０ｍｌのトロンビン切断緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ）中に再懸濁した。ヒトＦａｓｃｉｎ−１を、４０〜１００単位のトロンビンと４℃で一晩インキュベートすることにより、ビーズから放出させた。遠心分離後、０．２ｍＭのＰＭＳＦを上清に添加し、残留トロンビン活性を不活性化した。ファスチンタンパク質をＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ゲル濾過カラムでさらに精製し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎで約８０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。１リットル培養物から得られる典型的な収量は約４０ｍｇである。
結晶化および構造決定
濃縮されたファスチンストックを、ファスチン緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、４０ｍＭのＫＢｒ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ）で１５ｍｇ／ｍｌまで希釈した。ファスチン−大環状ケトン複合体の成長においては、タンパク質を２ｍＭの大環状ケトンとともに室温で１時間インキュベートした。結晶滴（ｃｒｙｓｔａｌ ｄｒｏｐ）を、１００ｍＭヘペス、ｐＨ８．０、１６％のＰＥＧ４０００、１％イソプロパノールを含有するリザーバ溶液中、２０℃での懸垂滴拡散（ｈａｎｇｉｎｇ ｄｒｏｐ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）によって準備した。結晶を、低温溶液（ｃｒｙｏ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（１００ｍＭヘペス、ｐＨ８．０、１６％のＰＥＧ４００、１５％グリセロール）中で採取し、液体窒素で急速凍結した。Ｘ線回折データを、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにて、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｌｉｇｈｔ ＳｏｕｒｃｅビームラインＸ６ａで凍結結晶から収集した。ファスチンおよびファスチン−大環状ケトン複合体の原子モデルは最初に、Ｐｈａｓｅｒを使用する１ｄｆｃモデルでの分子置換によって得た。構造を、Ｃｏｏｔを使用して手作業で調節し、５％の反射を有するＲｆｒｅｅセットを有するＣＮＳおよびＲｅｆｍａｃ５で改良した。２つのファスチン分子を各非対称単位中に見出した。
アクチン束化アッセイ
アクチン束化アッセイを上の実施例４に記載のように実施した。
結果
ヒトＦａｓｃｉｎ−１の全体構造およびトポロジー
天然ヒトＦａｓｃｉｎ−１およびマイグラスタチン類似体、大環状ケトンコアとの複合体中のＦａｓｃｉｎ−１のＸ線結晶構造を決定した（図１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃ）。両結晶はＣ２空間群に属する。天然ファスチンの構造およびファスチン−大環状ケトン複合体の構造は、それぞれ２．１Åおよび２．７Åであることが決定された（図１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃ）。ファスチンの全体構造は、ダンベル形状のドメインを形成するβ−トレフォイル１および２、ならびに別の形状をとるβ−トレフォイル３および４を有する４つのβ−トレフォイル折りたたみを示す（図１０Ａ）。２つのダンベルは、β−トレフォイル２と３との間のループによって内部連結される。２つのダンベルドメインはトレフォイル２がトレフォイル３および４に直接接触するように配列される一方、トレフォイル４はトレフォイル１および２に直接接触する（図１０Ａ）。全体として、２つのダンベルは馬蹄形の外観をもたらす。
マイグラスタチン類似体結合ポケット
ファスチン−大環状ケトン複合体の全体ドメイン配列は、天然ファスチンのそれと酷似し、２つの馬蹄形のアームを形成する２つのダンベルを有する（図１０Ｃ）。３σ Ｆｏｂｓ−Ｆｃａｌｃ電子密度のピークがβ−トレフォイル４の表面上に認められた（図１１Ａ）。大環状ケトンのマクロライド環は、拡張密度（ｅｘｔｒａ ｄｅｎｓｉｔｙ）と十分に一致する。結合された大環状ケトン分子は、トレフォイル４とトレフォイル１の間のクレフトに面する側のトレフォイル４の表面に位置する（図１０Ｃ）。大環状ケトンは、Ｈｉｓ３９２、Ｇｌｕ３９１、Ａｌａ４８８、Ｌｙｓ４７１、およびＨｉｓ４７４の側鎖、ならびにＡｓｐ４７３のα炭素と相互作用することによって適所に保持される（図１１Ａ−１１Ｄ）。６つの残基はＵ形状曲線を形成し、親指および人差し指で環を保持するように大環状ケトンを保持する（図１１Ａおよび１１Ｂ）。２つの「指」の上に２つのヒスチジンＨｉｓ３９２およびＨｉｓ４７４が存在し、それはファスチン−大環状ケトン相互作用に対する大きな寄与因子（ｍａｊｏｒ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を有する。Ｈｉｓ３９２のＮＥ２窒素は大環状ケトン分子のケトン酸素から３．０１Å離れている一方、Ｈｉｓ４７４のＮＤ１窒素はヒドロキシル酸素から２．５７Å離れている。Ｈｉｓ３９２およびＨｉｓ４７４は、大環状ケトンと水素結合を形成することにより、大環状ケトンの結合に寄与する（図１１Ｂ）。ファスチンと大環状ケトンの間の相互作用は、マクロライド環炭素と残基Ｇｌｕ３９１、Ａｌａ４８８、Ｌｙｓ４７１およびＡｓｐ４７３の間のファンデルワールス力によってさらに安定化される（図１１Ｂ）。
ファスチン−大環状ケトン複合体の全体構造が天然ファスチンに類似し、すべてのα炭素原子における二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）が０．３Åであるが（図１１Ｃ）、大環状ケトンにとの「親指および人差し指（ｔｈｕｍｂ−ａｎｄ−ｉｎｄｅｘ−ｆｉｎｇｅｒ）」結合部位での数個の残基は「誘導適合（ｉｎｄｕｃｅｄ−ｆｉｔ）」機構の結果として移動する（図１１Ｄ）。Ｈｉｓ４７４のαＣαが大環状ケトンから離れるほうへ約２Å移動する間、そのイミダゾール基は、そのＣα−Ｃβ結合の周りを分子のほうへ１８０°回転する。その結果、Ｈｉｓ４７４のＮＤ１窒素は２．３Å接近し、大環状ケトンの水酸基と水素結合を形成する。その間、Ｈｉｓ３９２のイミダゾール基は、大環状ケトンのケトン基と水素結合を形成し、１Å押し出される。また、Ａｓｐ４７３のカルボキシル基は、阻害剤−ファスチン相互作用の結果として、そのＣβ−Ｃγ結合の周りを９０°回転する。
アクチン結合部位
ファスチンは、アクチンフィラメントを束化する単量体として機能し、ファスチンがこの束化活性のために２つのアクチン結合部位を有することが提起されている（Ｏｎｏら １９９７年）。本明細書中に示される結晶構造は、これに対する構造的説明を提供する（図１２Ａおよび１２Ｂ、オレンジおよびシアンで標識された残基）。ＮおよびＣ末端の双方は同じクレフト内に位置する（図１２Ａおよび１２Ｂ）。さらに、Ｎ末端での２９〜４２の残基のストレッチは、ＭＡＲＣＫＳ（ミリストイル化アラニンリッチＣキナーゼ基質）のアクチン結合部位に対する類似性を有し、さらにトレフォイル１〜４クレフトに面している（図１２Ｃ、原文中、オレンジで標識された残基）。さらに、ファスチンのアクチン束化活性は、Ｎ末端領域内部のタンパク質キナーゼＣリン酸化部位（Ｓｅｒ３９）によって負に調節される（図１２Ｄ、原文中、赤で標識された残基）。まとめると、これらのデータは、このクレフトが２つのアクチン結合部位のうちの１つを示すことを示唆する。
ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ファスチン相同体（ｓｉｎｇｅｄ）の遺伝子解析により、そのアクチン束化活性にとって重要な、ファスチンの２つの点突然変異が生じた（Ｃａｎｔら １９９６年）。一方の突然変異は、Ｇｌｙ３９３（ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）におけるＧｌｙ４０９）からＧｌｕであり、それはファスチンのアクチン束化活性を低下させた（図１２Ｄ、赤の標識残基）。このＧｌｙ３９３は、上述のアクチン結合部位内に位置する。他方、もう一方のｓｉｎｇｅｄ突然変異体がＳｅｒ２７４（ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）におけるＳｅｒ２８９）からＡｓｎであり、それはファスチンのアクチン束化活性をほぼ除去した（図１２Ｅ）。このＳｅｒ２７４は、ファスチンの反対側に位置する（図１２Ｅ）。この表面は、第２のアクチン結合部位を示しうる。
Ｆ−アクチンフィラメントと別のアクチン束化タンパク質であるフィンブリンとの相互作用の生化学および構造試験により、２つのアクチン結合部位が示された。フィンブリン上のこれら２つのアクチン結合部位は、ファスチンの２つの有望なアクチン結合部位と類似した表面内に位置する。フィンブリンは全体的なα−ヘリカル構造とすべてのβシートを有するファスチンからなるが、それらは類似した全体的構造配列を有する。
大環状ケトンは、ファスチン上のアクチン結合部位の１つに結合する。ファスチン−大環状ケトン複合体の構造は、大環状ケトンがファスチンのアクチン束化活性を阻害する機構がありうることを直接示唆した。大環状ケトン結合部位は、ファスチン上のアクチン結合部位の１つである（図１３Ａ）。したがって、あらゆる特定の理論に制約されるものではないが、大環状ケトン結合はファスチンへのアクチンフィラメントの結合を阻害する（図１３Ｂ）。
大環状ケトン結合に関与する５つの残基を突然変異させ、それらファスチン突然変異体のアクチン束化活性について試験した（図１４）。アクチン束化アッセイに基づくと、Ｈｉｓ３９２、Ｌｙｓ４７１およびＡｌａ４８８はアクチン束化にとって重要である一方、Ｇｌｕ３９１およびＨｉｓ４７４は重要でない（図１４Ａおよび１４Ｂ）。さらに、Ｇｌｕ３９１およびＨｉｓ４７４のアクチン束化活性の大環状ケトンに対する感受性について試験した（突然変異体Ｈｉｓ３９２、Ｌｙｓ４７１およびＡｌａ４８８については、それらにアクチン束化活性が欠損していることから試験しなかった）。図１４Ｃに示されるように、Ｈｉｓ４７４からＡｌａへの突然変異により、ファスチンに大環状ケトン処理に対する耐性が与えられた。したがって、Ｈｉｓ４７４は、大環状ケトン結合にとって不可欠である。まとめると、このデータは、大環状ケトン結合に関与する数個のファスチン残基がまた、アクチン結合に寄与することを示す。したがって、大環状ケトン結合部位はアクチン結合部位のうちの１つである。
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２７．Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ａｎｔｉｂｉｏｔ （Ｔｏｋｙｏ） ５５， ４４２ （Ａｐｒ， ２００２）．
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本明細書中で参照または記載されるすべての特許および出版物は、本発明が関係する当業者の技能のレベルを示し、かつ、かかる参照される特許および出版物の各々は、その全体が個別に参照により援用された場合と同程度まで参照により本明細書中に援用されるか、あるいはその全体が本明細書中で示される。本出願人は、任意のかかる引用される特許または出版物に由来するありとあらゆる事項および情報を、本明細書中に物理的に援用する権利を有する。
本明細書中に記載の特定の方法および組成物は、好ましい実施形態を代表し、例示的であり、本発明の範囲に対して限定するものとして意図されていない。他の目的、態様、および実施形態は、当業者が本明細書を考察する際に着想するであろうし、特許請求の範囲によって限定される、本発明の趣旨の範囲内に包含される。様々な代替および変更が、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、本明細書で開示される本発明に対してなされうることは、当業者にとって容易に理解されるであろう。本明細書中に例示的に説明される本発明は、任意の要素または限定なしに適切に実行されうるものであり、本明細書中で不可欠なものとして特定的に開示されることはない。本明細書中に例示的に説明される方法およびプロセスは、ステップの順序を変更しても適切に実行可能であり、その上、それらは本明細書または特許請求の範囲の中に示されるステップの順序に必ずしも限定されるものではない。本明細書および添付の特許請求の範囲の中で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明示されない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「宿主細胞（ａ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」に対する言及は、かかる宿主細胞の複数（例えば培養物または集団）などを含む。本特許は、いかなる環境下でも本明細書で具体的に開示される特定の実施例または実施形態または方法に限定されると解釈されることはない。本特許は、いかなる環境下でも、特許商標局（Ｐａｔｅｎｔ ａｎｄ Ｔｒａｄｅｍａｒｋ Ｏｆｆｉｃｅ）のいかなる審査官またはいかなる他の職員もしくは従業員によってなされるいかなる発言によっても、かかる発言が具体的でない場合、また本出願人による応答書簡において明示的に採用される条件（ｑｕａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｒ ｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ）を伴わない場合、限定されるように解釈されることはない。
使用されている用語および表現が、限定的でない説明の用語として使用され、また、かかる用語および表現の使用において、示され、説明される特徴またはその一部に相当するいずれも除外する意図は全くないが、様々な変更が権利請求される本発明の範囲内で可能であることは理解されている。したがって、本発明は好ましい実施形態および任意の特徴によって具体的に開示されているが、開示される本明細書中の概念の変更および変形が当業者によって提供可能であり、またかかる変更および変形が添付の特許請求の範囲によって限定される本発明の範囲内に含まれると考えられることは理解されるであろう。
本発明は、本明細書中で広義かつ一般的に説明されている。一般的開示の範囲内に該当するより狭い種および亜種のグループ分けの各々がまた、本発明の一部を形成する。これは、任意の主題を属から除去するという条件または消極的限定（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）下で、除去される材料が本明細書中で具体的に列挙されるか否かに無関係に、本発明の一般的説明を含む。
他の実施形態は次の特許請求の範囲の中に含まれる。さらに、本発明の特徴または態様がマーカッシュ（Ｍａｒｋｕｓｈ）グループの観点で説明される場合、当業者は、本発明はまた、マーカッシュグループの任意の個別のメンバーまたはメンバーのサブグループの観点でそれによって説明されることを理解するであろう。

Claims (53)

  1. ファスチンの発現および／または活性を阻害する方法であって、有効量のファスチン阻害剤を、ファスチンを発現する細胞に投与し、それにより前記細胞内での前記ファスチンの発現または活性を阻害するステップを含む、方法。
  2. 前記ファスチン阻害剤は、配列番号２、４、６もしくは８からなるファスチンＲＮＡもしくはＤＮＡに特異的に結合する阻害性核酸、小分子、ファスチンポリペプチド断片、またはファスチンに特異的に結合する抗体を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記阻害性核酸は、配列番号１３〜６２のいずれかからなるＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項２に記載の方法。
  4. 前記阻害性核酸は、前記阻害性核酸の発現を誘導する発現カセットを含む発現ベクターを投与することによって投与される、請求項３に記載の方法。
  5. 前記抗体は、ファスチンアクチン結合部位へのアクチンの結合を遮断するか、またはファスチンアクチン結合部位に特異的に結合する、請求項２に記載の方法。
  6. 前記ファスチンアクチン結合部位は、ファスチンアミノ酸Ｔｈｒ３２６、Ｓｅｒ３２８、Ｓｅｒ３２９、Ｌｙｓ３３０、Ａｓｎ３３１、Ｓｅｒ３３３、Ａｒｇ２７６、Ｇｌｎ２７７、Ｍｅｔ２７９、Ａｓｐ２８６、Ｇｌｕ２８７、Ｇｌｎ２９１、Ｔｈｒ３２０、Ｔｈｒ３１８、Ｌｙｓ３１３、Ｔｈｒ３１１、Ｇｌｎ３６２、Ａｓｎ３６０、Ｌｙｓ３５９、Ａｓｐ１６８、Ｐｒｏ１５９、Ａｒｇ１５１、Ｌｙｓ１５０、Ａｒｇ１４９、Ａｒｇ１９７、Ａｒｇ２０１、Ｇｌｕ２０７、Ｇｌｕ２２７、Ｓｅｒ２３７、Ｐｒｏ２３６、Ｌｙｓ２４１、Ｌｙｓ２４７、およびＬｙｓ２５０のいずれかを含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記ファスチンアクチン結合部位は、ファスチンアミノ酸Ｈｉｓ３９２、Ｇｌｕ３９１、Ａｌａ４８８、Ｌｙｓ４７１、Ｈｉｓ４７４およびＡｓｐ４７３のいずれかを含む、請求項６に記載の方法。
  8. 前記抗体は、ファスチンタンパク質に結合される場合、ファスチンアミノ酸Ｈｉｓ３９２およびＨｉｓ４７４の一方または両方へのアクチンの結合を遮断する、請求項５に記載の方法。
  9. 前記抗体は、ファスチンタンパク質に結合される場合、ファスチンアミノ酸Ｈｉｓ３９２およびＨｉｓ４７４の一方または両方に結合する、請求項５に記載の方法。
  10. 前記ファスチン阻害剤は、式Ｉ：
    Figure 2011506274
     （式中、
    ＸはＣＨ、Ｎ、ＮＨもしくはＯであり；
    Ｒ１はＯＨ、ＣＺ３であるか、またはＲ１およびＲ２がともに−Ｃ＝Ｏであり（式中、Ｚはハロである）；
    Ｒ２はＯＨ、ＣＺ３であるか、またはＲ１およびＲ２がともに−Ｃ＝Ｏであり（式中、Ｚはハロである）；
    Ｒ３はＨまたは低級アルキルであり；
    Ｒ４はＨまたは低級アルキルであり；
    Ｒ５はＯＨであり；
    Ｒ６はアルキルオキシであり；
    Ｙ１およびＹ２は別々に−ＣＨ２−であるか、またはＹ１およびＹ２がともに−Ｃ＝Ｃ−もしくは薬学的に許容されうるその塩を形成する）
    の化合物である、請求項１または２に記載の方法。
  11. 前記化合物は、次の化合物、すなわち
    Figure 2011506274
     のいずれか１つ、またはそれらの組み合わせである、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記ファスチンポリペプチド断片は、ファスチンアミノ酸Ｔｈｒ３２６、Ｓｅｒ３２８、Ｓｅｒ３２９、Ｌｙｓ３３０、Ａｓｎ３３１、Ｓｅｒ３３３、Ａｒｇ２７６、Ｇｌｎ２７７、Ｍｅｔ２７９、Ａｓｐ２８６、Ｇｌｕ２８７、Ｇｌｎ２９１、Ｔｈｒ３２０、Ｔｈｒ３１８、Ｌｙｓ３１３、Ｔｈｒ３１１、Ｇｌｎ３６２、Ａｓｎ３６０、Ｌｙｓ３５９、Ａｓｐ１６８、Ｐｒｏ１５９、Ａｒｇ１５１、Ｌｙｓ１５０、Ａｒｇ１４９、Ａｒｇ１９７、Ａｒｇ２０１、Ｇｌｕ２０７、Ｇｌｕ２２７、Ｓｅｒ２３７、Ｐｒｏ２３６、Ｌｙｓ２４１、Ｌｙｓ２４７、およびＬｙｓ２５０を含む、請求項２に記載の方法。
  13. 前記ファスチンポリペプチド断片は、ファスチンアミノ酸Ｈｉｓ３９２、Ｇｌｕ３９１、Ａｌａ４８８、Ｌｙｓ４７１、Ｈｉｓ４７４およびＡｓｐ４７３を含む、請求項２に記載の方法。
  14. 前記ファスチンポリペプチド断片はファスチンアミノ酸２５９〜４９３からなる、請求項１２または１３に記載の方法。
  15. 前記ファスチンポリペプチド断片は配列番号９、１０および／もしくは１２からなる、請求項２に記載のファスチン阻害剤。
  16. 前記細胞は動物細胞である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記動物はヒトである、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記ヒトは疾患または症状に罹患する、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記疾患または症状は、転移癌、神経疾患、神経変性、炎症状態、ウイルス感染、細菌感染、リンパ過形成、ホジキン病または虚血関連組織損傷である、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記癌は、上皮性悪性腫瘍、リンパ腫、肉腫、メラノーマ、星状細胞腫、中皮腫細胞、卵巣癌、結腸癌、膵癌、食道癌、胃癌、肺癌、尿癌、膀胱癌、乳癌、胃癌、白血病、肺癌、結腸癌、中枢神経系癌、メラノーマ、卵巣癌、腎癌または前立腺癌である、請求項１９に記載の方法。
  21. ファスチンの阻害剤を同定する方法であって、
    ａ）ファスチン配列を有する少なくとも１つのタンパク質またはペプチドを、少なくとも１つの試験作用物質と、前記成分を相互作用させるのに十分な時間接触させるステップと、
    ｂ）ファスチン配列を有する前記少なくとも１つのタンパク質またはペプチドと前記試験作用物質の間に結合が生じているか否かを判定するステップと、
    を含み、ここでファスチン配列を有する前記少なくとも１つのタンパク質またはペプチドと試験作用物質の間の結合が、前記試験作用物質が癌転移の阻害剤であることを示唆する、方法。
  22. 前記試験作用物質は、ファスチンアクチン結合部位へのアクチンの結合を遮断するかまたはファスチンアクチン結合部位に結合する、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記ファスチンアクチン結合部位は、ファスチンアミノ酸Ｔｈｒ３２６、Ｓｅｒ３２８、Ｓｅｒ３２９、Ｌｙｓ３３０、Ａｓｎ３３１、Ｓｅｒ３３３、Ａｒｇ２７６、Ｇｌｎ２７７、Ｍｅｔ２７９、Ａｓｐ２８６、Ｇｌｕ２８７、Ｇｌｎ２９１、Ｔｈｒ３２０、Ｔｈｒ３１８、Ｌｙｓ３１３、Ｔｈｒ３１１、Ｇｌｎ３６２、Ａｓｎ３６０、Ｌｙｓ３５９、Ａｓｐ１６８、Ｐｒｏ１５９、Ａｒｇ１５１、Ｌｙｓ１５０、Ａｒｇ１４９、Ａｒｇ１９７、Ａｒｇ２０１、Ｇｌｕ２０７、Ｇｌｕ２２７、Ｓｅｒ２３７、Ｐｒｏ２３６、Ｌｙｓ２４１、Ｌｙｓ２４７、およびＬｙｓ２５０を含む、請求項２１または２２に記載の方法。
  24. 前記ファスチンアクチン結合部位は、ファスチンアミノ酸Ｈｉｓ３９２、Ｇｌｕ３９１、Ａｌａ４８８、Ｌｙｓ４７１、Ｈｉｓ４７４およびＡｓｐ４７３を含む、請求項２１または２２に記載の方法。
  25. 前記試験作用物質は、ファスチンタンパク質に結合される場合、ファスチンアミノ酸Ｈｉｓ３９２およびＨｉｓ４７４の一方もしくは両方へのアクチンの結合を阻害する、請求項２１、２２または２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記試験作用物質は、ファスチンタンパク質に結合される場合、ファスチンアミノ酸Ｈｉｓ３９２およびＨｉｓ４７４の一方もしくは両方に結合する、請求項２１、２２または２４のいずれか一項に記載の方法。
  27. ファスチンに対する前記試験作用物質の結合定数を判定するステップをさらに含む、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記試験作用物質がファスチン媒介性アクチン束形成を阻害するか否かを判定するステップをさらに含む、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記アクチンはＦ−アクチンである、請求項２８に記載の方法。
  30. ファスチンの阻害剤を同定するための方法であって、
    ａ）表２に従い、ファスチンアミノ酸Ｔｈｒ３２６、Ｓｅｒ３２８、Ｓｅｒ３２９、Ｌｙｓ３３０、Ａｓｎ３３１、Ｓｅｒ３３３、Ａｒｇ２７６、Ｇｌｎ２７７、Ｍｅｔ２７９、Ａｓｐ２８６、Ｇｌｕ２８７、Ｇｌｎ２９１、Ｔｈｒ３２０、Ｔｈｒ３１８、Ｌｙｓ３１３、Ｔｈｒ３１１、Ｇｌｎ３６２、Ａｓｎ３６０、Ｌｙｓ３５９、Ａｓｐ１６８、Ｐｒｏ１５９、Ａｒｇ１５１、Ｌｙｓ１５０、Ａｒｇ１４９、Ａｒｇ１９７、Ａｒｇ２０１、Ｇｌｕ２０７、Ｇｌｕ２２７、Ｓｅｒ２３７、Ｐｒｏ２３６、Ｌｙｓ２４１、Ｌｙｓ２４７、およびＬｙｓ２５０におけるファスチン原子座標からファスチン結合部位の三次元構造画像を生成するステップであって、前記アミノ酸の骨格原子からの±ａ二乗平均平方根偏差は１．５オングストローム以下であるステップと、
    ｂ）有望な阻害剤を前記ファスチン結合部位内部に存在するように設計または選択し、それによりファスチンの阻害剤を同定するステップと、
    を含む、方法。
  31. ファスチンの阻害剤を同定するための方法であって、
    ａ）表２に従い、ファスチンアミノ酸Ｈｉｓ３９２、Ｇｌｕ３９１、Ａｌａ４８８、Ｌｙｓ４７１、Ｈｉｓ４７４およびＡｓｐ４７３におけるファスチン原子座標からファスチン結合部位の三次元構造画像を生成するステップであって、前記アミノ酸の骨格原子からの±ａ二乗平均平方根偏差は１．５オングストローム以下であるステップと、
    ｂ）有望な阻害剤を前記ファスチン結合部位内部に存在するように設計または選択し、それによりファスチンの阻害剤を同定するステップと、
    を含む、方法。
  32. 前記有望な阻害剤を合成または入手するステップと、前記有望な阻害剤をファスチンと接触させるステップと、前記有望な阻害剤がファスチンに結合するか否かを確認するステップと、をさらに含む、請求項３０または３１に記載の方法。
  33. 前記有望な阻害剤は、約８オングストローム×約１０オングストローム×約１０オングストローム以下である、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記方法は、データセットとして前記ファスチン原子座標を含むコンピュータシステムを使用して実施される、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. ファスチンの前記阻害剤は転移癌の阻害剤である、請求項２１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 表２のファスチン原子座標を含む機械読取り可能記憶媒体。
  37. 表２による、ファスチンアミノ酸Ｔｈｒ３２６、Ｓｅｒ３２８、Ｓｅｒ３２９、Ｌｙｓ３３０、Ａｓｎ３３１、Ｓｅｒ３３３、Ａｒｇ２７６、Ｇｌｎ２７７、Ｍｅｔ２７９、Ａｓｐ２８６、Ｇｌｕ２８７、Ｇｌｎ２９１、Ｔｈｒ３２０、Ｔｈｒ３１８、Ｌｙｓ３１３、Ｔｈｒ３１１、Ｇｌｎ３６２、Ａｓｎ３６０、Ｌｙｓ３５９、Ａｓｐ１６８、Ｐｒｏ１５９、Ａｒｇ１５１、Ｌｙｓ１５０、Ａｒｇ１４９、Ａｒｇ１９７、Ａｒｇ２０１、Ｇｌｕ２０７、Ｇｌｕ２２７、Ｓｅｒ２３７、Ｐｒｏ２３６、Ｌｙｓ２４１、Ｌｙｓ２４７、およびＬｙｓ２５０におけるファスチン原子座標を含み、ここで前記アミノ酸の骨格原子からの±ａ二乗平均平方根偏差は１．５オングストローム以下である、請求項３６に記載の機械読取り可能記憶媒体。
  38. 表２による、ファスチンアミノ酸Ｈｉｓ３９２、Ｇｌｕ３９１、Ａｌａ４８８、Ｌｙｓ４７１、Ｈｉｓ４７４およびＡｓｐ４７３におけるファスチン原子座標を含み、ここで前記アミノ酸の骨格原子からの±ａ二乗平均平方根偏差は１．５オングストローム以下である、請求項３６に記載の機械読取り可能記憶媒体。
  39. 配列番号２、４、６もしくは８からなるファスチンＲＮＡもしくはＤＮＡに特異的に結合する阻害性核酸、小分子、ファスチンポリペプチド断片、またはファスチンに特異的に結合する抗体を含むファスチン阻害剤。
  40. 前記阻害性核酸は、配列番号１３〜６２のいずれかからなるＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項３９に記載のファスチン阻害剤。
  41. 前記阻害性核酸は、ファスチン阻害性核酸の発現を誘導する発現カセットを含む発現ベクター内で発現される、請求項３９または４０に記載のファスチン阻害剤。
  42. 前記抗体は、ファスチンアクチン結合部位に特異的に結合するかまたはファスチンアクチン結合部位へのアクチンの結合を遮断し、ここで前記アクチン結合部位はファスチンアミノ酸Ｔｈｒ３２６、Ｓｅｒ３２８、Ｓｅｒ３２９、Ｌｙｓ３３０、Ａｓｎ３３１、Ｓｅｒ３３３、Ａｒｇ２７６、Ｇｌｎ２７７、Ｍｅｔ２７９、Ａｓｐ２８６、Ｇｌｕ２８７、Ｇｌｎ２９１、Ｔｈｒ３２０、Ｔｈｒ３１８、Ｌｙｓ３１３、Ｔｈｒ３１１、Ｇｌｎ３６２、Ａｓｎ３６０、Ｌｙｓ３５９、Ａｓｐ１６８、Ｐｒｏ１５９、Ａｒｇ１５１、Ｌｙｓ１５０、Ａｒｇ１４９、Ａｒｇ１９７、Ａｒｇ２０１、Ｇｌｕ２０７、Ｇｌｕ２２７、Ｓｅｒ２３７、Ｐｒｏ２３６、Ｌｙｓ２４１、Ｌｙｓ２４７、およびＬｙｓ２５０を含む、請求項３９に記載のファスチン阻害剤。
  43. 前記抗体は、ファスチンアクチン結合部位に特異的に結合するかまたはファスチンアクチン結合部位へのアクチンの結合を遮断し、ここで前記アクチン結合部位はファスチンアミノ酸Ｈｉｓ３９２、Ｇｌｕ３９１、Ａｌａ４８８、Ｌｙｓ４７１、Ｈｉｓ４７４およびＡｓｐ４７３を含む、請求項４２に記載のファスチン阻害剤。
  44. 前記抗体は、ファスチンアミノ酸２５９〜４９３を含む配列を有するポリペプチドを使用して生成された、請求項３９または４３に記載のファスチン阻害剤。
  45. 前記抗体は、配列番号９、１０および／もしくは１２を有するポリペプチドを使用して生成された、請求項３９または４３に記載のファスチン阻害剤。
  46. 前記ファスチンポリペプチド断片は、ファスチンアミノ酸Ｔｈｒ３２６、Ｓｅｒ３２８、Ｓｅｒ３２９、Ｌｙｓ３３０、Ａｓｎ３３１、Ｓｅｒ３３３、Ａｒｇ２７６、Ｇｌｎ２７７、Ｍｅｔ２７９、Ａｓｐ２８６、Ｇｌｕ２８７、Ｇｌｎ２９１、Ｔｈｒ３２０、Ｔｈｒ３１８、Ｌｙｓ３１３、Ｔｈｒ３１１、Ｇｌｎ３６２、Ａｓｎ３６０、Ｌｙｓ３５９、Ａｓｐ１６８、Ｐｒｏ１５９、Ａｒｇ１５１、Ｌｙｓ１５０、Ａｒｇ１４９、Ａｒｇ１９７、Ａｒｇ２０１、Ｇｌｕ２０７、Ｇｌｕ２２７、Ｓｅｒ２３７、Ｐｒｏ２３６、Ｌｙｓ２４１、Ｌｙｓ２４７、およびＬｙｓ２５０を含む、請求項３９に記載のファスチン阻害剤。
  47. 前記ファスチンポリペプチド断片は、ファスチンアミノ酸Ｈｉｓ３９２、Ｇｌｕ３９１、Ａｌａ４８８、Ｌｙｓ４７１、Ｈｉｓ４７４およびＡｓｐ４７３を含む、請求項３９に記載のファスチン阻害剤。
  48. 前記ファスチンポリペプチド断片はファスチンアミノ酸２５９〜４９３からなる、請求項３９または４７に記載のファスチン阻害剤。
  49. 前記ファスチンポリペプチド断片は配列番号９、１０および／もしくは１２からなる、請求項３９または４８に記載のファスチン阻害剤。
  50. 患者における転移癌を治療または阻害する方法であって、前記患者に、請求項３９〜４９のいずれか一項に記載のファスチン阻害剤を投与するステップを含む、方法。
  51. 薬剤の製造における、請求項３９〜４９のいずれか一項に記載のファスチン阻害剤の使用。
  52. 前記薬剤は、転移癌、神経疾患、神経変性、炎症状態、ウイルス感染、細菌感染、リンパ過形成、ホジキン病または虚血関連組織損傷の治療を目的とする、請求項５１に記載の使用。
  53. 前記薬剤は、哺乳動物における転移癌の治療または阻害を目的とする、請求項５１に記載の使用。
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