CN1741821B - 用于癌症治疗的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于抑制过度增殖的细胞的生长或增殖、或诱导过度增殖细胞退化的组合物和方法。更具体地，本发明提供了用于刺激靶细胞(例如，过度增殖的细胞)中的糖原积累的组合物和方法、以使糖原增加到对靶细胞有毒性的水平。

Description

用于癌症治疗的组合物
相关申请 
本申请要求享有2002年10月29日提交的申请序列号60/422,365的优先权利益。 
发明领域
本发明涉及抑制过度增殖的细胞的生长或增殖，或诱导过度增殖的细胞的退化.更具体地，本发明涉及刺激靶细胞中的糖原积累，以使糖原增加到对靶细胞有毒性的水平。实现增加糖原积累的方法包括：例如，增加一个或多个能编码野生型或突变型的参与糖原合成或输入的蛋白的基因的表达或活性(例如，通过基因转移)，和降低一个或多个能编码野生型或突变型的参与糖原代谢、分解代谢、去除或降解的蛋白的基因的表达或活性(例如，通过反义核酸或小分子).
发明背景
癌症是全球范围内发病率和死亡率的主导原因。癌症患者的数量和经济成本都是巨大的。仅仅在美国，每年就有超过100万确诊的癌症患者，癌症的总年度花费超过了8700亿美圆，这构成了约4.7％的总年度保健支出。尽管近来的早期检测技术的进展已经导致了癌症死亡率的总体下降，仍然没有普遍有效的预防和治疗癌症的策略。由于多种原因，包括人口老龄化、环境污染等，预期以后几年的癌症病例的数目会增加。
现有的癌症治疗一般依赖于早期检测和侵入性的治疗(包括手术、化疗、放疗或激素疗法)的组合。但是，这些治疗的侵入力和普遍性的毒性对患者产生许多有害的副作用，因而严重损害了它们的临床有效性和患者的生活质量。
而且，一些癌细胞或肿瘤固有地对用于癌症治疗的细胞毒性的药物具有抗性；其它的最初能有反应，但是在治疗过程中会产生抗性，这是由于选择压力促成了预先存在的抗性细胞群体和/或药物诱导的变。实际上，药物抗性是癌症化疗失败的主要原因。在根除实体瘤 的癌细胞时，充分认识到放疗是相对无效的。这样的失败是不令人惊讶的，因为放疗需要源自氧的自由基来破坏细胞(Gray等，Brit.J.Radiol.26：683(1953))，由于缺乏合适的血液供应，肿瘤内的氧水平较低。而且，大多数化疗药物需要氧来发挥它们的功效(Giatromanolaki和Harris，Anticancer Res.21：4317(2001))。因此，需要能消除癌细胞且能在低氧或缺氧条件下发挥其细胞毒性作用的癌症疗法.
仍然不太清楚癌症的起因。但是，普遍接受的是，癌症形成或致癌作用是一个复杂过程，涉及多种遗传的和环境的因素.在不完全明白多种致癌作用因子之间的复杂相互作用的情况下，要鉴定出能特异性地且普遍地诱导癌细胞死亡或抑制肿瘤生长的治疗靶是一项艰巨的挑战。随着分子生物学和遗传学的出现，近来已经鉴定出了许多可能导致癌细胞异常生长的信号传递途径。例如，Ras在约30％的人类癌症中由于突变而激活，在不同类型的肿瘤中，经常发现生长因子受体(例如，表皮生长因子，胰岛素样生长因子，Her2/Neu受体)的过量表达.这些发现已经导致了设计用于阻断与癌症有关的信号转导途径中的特定组分的化合物的发现。但是，癌细胞中的信号转导涉及高度不同的且众多的途径和过程。因而，以使用化学药物来阻断特定的细胞途径作为治疗癌症的方法，具有克服抗性的可能.
因此，需要治疗癌症的改进方法，其应当能有效地诱导细胞死亡，同时使对正常细胞的副作用最小化。本发明满足了该需求，并提供了相关的优点。
发明概述
本发明提供了将细胞中的糖原提高到毒性水平的方法.示例性的方法包括：在细胞中表达能将细胞中的糖原的量提高到毒性水平的基因产物。在各个方面，基因产物包括能增加糖原的合成或胞内积累的蛋白，例如糖原生成酶，或能降低糖原的代谢、分解代谢、利用、降解或去除的蛋白，例如糖原分解酶.在各个其它方面，能降低本发明涉及抑制过度增殖的细胞的生长或增殖，或诱导过度增殖的细胞的退化。更具体地，本发明涉及刺激靶细胞中的糖原积累，以使糖原增加到对靶细胞有毒性的水平。实现增加糖原积累的方法包括：例如，增加一个或多个能编码野生型或突变型的参与糖原合成或输入的蛋白的基因的表达或活性(例如，通过基因转移)，和降低一个或多个能编码野生型或突变型的参与糖原代谢、分解代谢、去除或降解的蛋白的基因的表达或活性(例如，通过反义核酸或小分子)。
原的代谢、分解代谢、利用或降解的基因产物包括糖原分解酶的抑制性核酸(例如，反义多核苷酸、小干扰RNA分子或核酶)。
用于实现本发明的方法的靶细胞包括：例如，过度增殖的细胞，例如细胞增殖病的细胞；良性增生；和转移性的和非转移性的肿瘤和 癌细胞。适用于靶向定位的过度增殖的细胞可以是在受试者中，且可以在任何的器官或组织中.示例性的器官和组织包括：例如，脑、头和颈、乳房、食管、嘴、胃、肺、胃肠道、肝、胰、肾、肾上腺、膀胱、结肠、直肠、前列腺、子宫、子宫颈、卵巢、睾丸、皮肤、肌肉和造血系统。
根据本发明使用的基因产物包括蛋白和抑制性核酸(例如，反义多核苷酸、小干扰RNA分子或核酶)。基因产物可以任选地由多核苷酸编码，该多核苷酸可以包含在载体(例如，病毒或哺乳动物表达载体)中。基因产物和多核苷酸可以任选地包含在小泡(vessicle)中。多核苷酸的表达可以由在过度增殖细胞中有活性的调节元件、例如启动子(例如，己糖激酶II、COX-2、α-胎蛋白、癌胚抗原、DE3/MUC1、前列腺特异性抗原、C-erB2/neu、端粒酶逆转录酶或缺氧-反应启动子)驱动。
本发明的方法还包括：在靶细胞中表达任选地由多核苷酸编码的一种或多种其它基因产物。示例性的基因产物是能抑制细胞增殖的第二蛋白，例如细胞周期抑制剂或细胞周期蛋白抑制剂。
本发明还提供了将过度增殖细胞中的糖原提高到毒性水平的方法。示例性的方法包括：将细胞与能将过度增殖细胞中的糖原的量提高到毒性水平的试剂相接触。一方面，过度增殖细胞不是肝、肌肉或脑细胞。另一方面，试剂基本上不抑制糖原磷酸化酶同工型(例如，肝、肌肉或脑糖原磷酸化酶)的活性或表达.在各种其它方面，试剂能增强糖原的合成或胞内积累或降低糖原的代谢、分解代谢、利用、降解或去除。在其它方面，试剂能增强糖原生成酶的表达或活性，或降低糖原分解酶的表达或活性。示例性的试剂包括底物类似物。其它的示例性试剂包括能降低或抑制糖原的代谢、分解代谢、利用或降解的抑制性核酸(例如，反义多核苷酸、小干扰RNA分子或核酶)。
本发明的能将糖原提高到毒性水平的方法任选地包括一种或多种与糖原毒性有关的形态学变化，例如细胞膨胀、溶酶体数目的增加、溶酶体大小的增加、或溶酶体的结构变化.将糖原提高到毒性水平还包括这样的方法，其能造成细胞的裂解或细胞凋亡，或能抑制或减少细胞的增殖、生长或存活。
根据本发明使用的、且可以刺激或提高其表达或活性的示例性的 糖原生成酶包括：例如，糖原生成蛋白(Glycogenin)、糖原生成蛋白-2、糖原合酶、糖原生成蛋白相互作用蛋白(GNIP)、蛋白质磷酸酶1(PP-1)、葡萄糖转运蛋白(GLUT)、PP-1同工型或家族成员的靶向糖原的亚基，己糖激酶同工型或家族成员和谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶。PP-1家族成员的示例性的靶向糖原的亚基包括GL(PPP1R3B，PPP1R4)，PTG(PPP1R3C，PPP1R5)，PPP1R3D(PPP1R6)或Gm/RG1 (PPP1R3A，PPP1R3)。
根据本发明使用的、且可以抑制和降低其表达或活性的示例性的糖原分解酶包括：例如，糖原磷酸化酶、脱支酶、磷酸化酶激酶、葡萄糖-6-磷酸酶、PPP1R1A(蛋白质磷酸酶1，调节抑制剂亚基1A)，PPP1R2(蛋白质磷酸酶1，调节亚基2)，果糖磷酸激酶，糖原合酶激酶-3同工型，GCKR葡糖激酶调节蛋白和α-葡糖苷酶。
本发明还提供了治疗受试者中的细胞增殖病的方法.示例性的方法包括：在一个或多个患有该病的细胞中表达能增加胞内糖原的量、足以治疗细胞增殖病的基因产物.另一种示例性的方法包括：使一个或多个患有该病的细胞与能增加胞内糖原的量、足以治疗细胞增殖病的试剂相接触。一方面，细胞增殖病不是肝、肌肉或脑细胞病。另一方面，试剂基本上不抑制糖原磷酸化酶同工型(例如，肝、肌肉或脑糖原磷酸化酶)的活性或表达。
用于实现本发明的方法的细胞增殖病包括：例如，良性增生、转移性的和非转移性的肿瘤和癌症。肿瘤和癌细胞可以在受试者中，且可以在任何器官或组织中。示例性的器官和组织包括：例如，脑、头和颈、乳房、食管、嘴、胃、肺、胃肠道、肝、胰、肾、肾上腺、膀胱、结肠、直肠、前列腺、子宫、子宫颈、卵巢、睾丸、皮肤、肌肉和造血系统.肿瘤和癌症可以是任意阶段的实体或液体的，例如阶段I、II、III、IV或V的肿瘤，或在缓解中。示例性的肿瘤类型包括：例如，肉瘤、癌、黑素瘤、骨髓瘤、胚细胞瘤、神经胶质瘤、淋巴瘤和白血病.
本发明还提供了治疗患有肿瘤的受试者的方法.示例性的方法包括：在一个或多个肿瘤细胞中表达能增加胞内糖原的量、有效地治疗受试者的基因产物。另一种示例性的方法包括：使一个或多个肿瘤细胞与能增加胞内糖原的量、有效地治疗受试者的试剂相接触。一方面， 肿瘤不是肝、肌肉或脑肿瘤。另一方面，试剂基本上不抑制糖原磷酸化酶同工型(例如，肝、肌肉或脑糖原磷酸化酶)的活性或表达.
治疗方法包括预防性的方法以及与另一种治疗方法相组合的方法。因而，例如，当受试者患有细胞增殖病(例如肿瘤)时，受试者可以在诊断或出现肿瘤症状之前，在为受试者进行肿瘤治疗的同时，或者在受试者完成肿瘤治疗后，例如，当肿瘤缓解时进行治疗.因此，基因产物或试剂可以在施用另一种疗法(例如，抗肿瘤或免疫增强疗法)之前、基本上与其同时或之后施用。
根据本发明的方法的施用可以提高另一种疗法的有效性。例如，施用给正在进行或已经接受了抗肿瘤或免疫增强疗法的受试者，可以增加胞内糖原的量，由此提高抗肿瘤或免疫增强疗法的有效性。一方面，肿瘤疗法不是用于肝、肌肉或脑肿瘤。另一方面，试剂基本上不抑制糖原磷酸化酶同工型(例如，肝、肌肉或脑糖原磷酸化酶)的活性或表达。因而，治疗方法包括施用一种或多种其它的疗法。示例性的疗法包括：例如，施用抗肿瘤或免疫增强治疗或试剂.
本发明还提供了治疗受试者的方法，其能改善受试者的状况，例如，减少细胞增殖病的一种或多种不利症状。例如，对于肿瘤，示例性的治疗方法能减小肿瘤体积、抑制肿瘤体积的增加、抑制肿瘤的发展、刺激肿瘤细胞裂解或细胞凋亡、抑制肿瘤转移或延长受试者的寿命。
用于实现本发明的示例性的受试者包括哺乳动物，例如人，其包括患有或有患细胞增殖病风险的受试者.受试者还包括：例如，细胞增殖病疗法的候选者，或正在接受或已经接受了这样的疗法的受试者。例如，对于肿瘤，示例性的治疗包括抗肿瘤和免疫增强疗法。
示例性的抗肿瘤疗法包括：例如，化学疗法、免疫疗法、手术切除、放射疗法或过热疗法。示例性的抗肿瘤疗法还包括：例如，使用抗肿瘤试剂治疗，例如烷化剂、抗代谢物、植物提取物、植物生物碱、亚硝基脲、激素、核苷或核苷酸类似物，更具体地，环磷酰胺、咪唑硫嘌呤、环孢菌素A、氢化泼尼松、美法仑、苯丁酸氮芥、氮芥、马利兰、氨甲蝶呤、6-硫基嘌呤、硫鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、AZT、5-氮胞苷(5-AZC)和与5-氮胞苷有关的化合物、博来霉素、放射菌素D、光神霉素、丝裂霉素C、卡氮芥、罗氮芥、赛氮芥、链脲霉素、羟 基脲、顺氯氨铂、米托坦、甲基苄肼、氮烯唑胺、紫杉醇、长春碱、长春新碱、阿霉素或二溴甘露醇.
示例性的免疫增强治疗包括：例如，施用淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞、树突细胞、NK细胞或B-细胞。示例性的免疫增强治疗还包括：例如，使用免疫增强剂治疗，例如细胞生长因子、存活因子、分化因子、细胞因子或趋化因子，更具体地，IL-2，IL-1α，IL-1β，IL-3，IL-6，IL-7，粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子(GMCSF)，IFN-γ，IL-12，TNF-α，TNFβ，MIP-lα，MIP-1β，RANTES，SDF-1，MCP-1，MCP-2，MCP-3，MCP-4，嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)，嗜酸性粒细胞趋化因子-2，I-309/TCA3，ATAC，HCC-1，HCC-2，HCC-3，LARC/MIP-3α，PARC，TARC，CKβ，CKβ6，CKβ7，CKβ8，CKβ9，CKβ11，CKβ12，C10，IL-8，GROα，GROβ，ENA-78，GCP-2，PBP/CTAPIIIβ-TG/NAP-2，Mig，PBSF/SDF-1或淋巴细胞趋化因子(lymphotactin)。
本发明提供了无细胞的和基于细胞的鉴定具有抗细胞增殖活性的试剂的方法.示例性的方法包括：使能生成糖原的细胞与实验试剂接触；和在存在实验试剂的情况下或在与实验试剂接触后，测定糖原毒性.糖原毒性将实验试剂鉴定为具有抗细胞增殖活性的试剂。另一种示例性的方法包括：使能表达糖原生成酶或糖原分解酶的细胞与实验试剂接触；和在存在实验试剂的情况下或在与实验试剂接触后，测量糖原生成酶或糖原分解酶的活性或表达。糖原生成酶或糖原分解酶的升高的或降低的表达或活性分别将实验试剂鉴定为具有抗细胞增殖活性的试剂。其它的示例性的方法包括：使能表达某种基因的细胞与实验试剂接触，所述基因的表达由糖原生成酶或糖原分解酶的调节区控制；和在存在实验试剂的情况下或在与实验试剂接触后，测量该基因的表达。该基因的增强的或降低的表达将实验试剂鉴定为具有抗细胞增殖活性的试剂。
另一种示例性的方法包括：提供实验试剂，其能调节(提高或降低)糖原生成酶或糖原分解酶的表达或活性；使能表达糖原生成酶或糖原分解酶的细胞与实验试剂接触；和在存在实验试剂的情况下或在与实验试剂接触后，测定糖原毒性。
糖原毒性将实验试剂鉴定为具有抗细胞增殖活性的试剂。另一种 示例性的方法包括：使糖原生成酶或糖原分解酶与实验试剂接触；和在存在实验试剂的情况下或在与实验试剂接触后，测量糖原生成酶或糖原分解酶的活性。糖原生成酶或糖原分解酶的升高的或降低的活性分别将实验试剂鉴定为具有抗细胞增殖活性的试剂。
鉴定具有抗细胞增殖活性的试剂的方法可以用于检测糖原毒性，可以通过如下方法检测，例如，筛选与糖原毒性有关的形态学变化，筛选细胞生存力、筛选细胞增殖、生长或存活的抑制或减少。
鉴定试剂的方法可以采用测定基因表达或活性(例如，糖原生成酶或糖原分解酶或报道分子)的变化。示例性的糖原生成酶和糖原分解酶以及报道分子如本文所述.
鉴定试剂的方法可以在溶液中、固相中、体外地或体内地进行。
在本发明的方法中可以筛选的或用作靶的细胞是原核的或真核的。细胞可以是稳定地或瞬时地转化了核酸序列(例如，基因)的细胞，所述核酸序列的表达由调节区(例如，糖原生成酶或糖原分解酶的调节区)控制。细胞包括过度增殖的细胞、无限增殖化细胞、和肿瘤和癌细胞。
本发明提供了试剂盒。示例性的试剂盒包括一定量的能增强糖原生成酶的表达或活性的试剂，和在标签或包装插页上的关于给需要治疗的受试者施用试剂的说明书.另一种示例性的试剂盒包括一定量的能降低糖原分解酶的表达或活性的试剂，和在标签或包装插页上的关于给需要治疗的受试者施用试剂的说明书。另一种示例性的试剂盒包括一定量的能增强胞内糖原的积累的试剂，和在标签或包装插页上的关于给需要治疗的受试者施用试剂的说明书.试剂盒还任选地包含例如抗肿瘤剂或免疫增强剂、药物制剂和用于将试剂局部地、区域性地或全身地输送给受试者的制品。
附图说明
图1A和1B显示了感染AdGL后的降低的HeLa细胞生存力和提高的糖原沉积，其是时间和病毒载体剂量依赖性的。(A)用200 MOI(浅灰条)或1000MOI(深灰条)腺病毒感染了指定时间的HeLa细胞.每个条代表表示为百分比的来自AdGL-感染的细胞的活细胞与对照AdpSh感染的细胞的百分比。(B)感染了指定的200 MOI或1000 MOI腺病毒的HeLa细胞。在指定时间，测定载体转导后的胞内糖原水平。条代表感染了AdGL的细胞和感染了AdpSh(pSh)的细胞中的源自葡糖淀粉酶-还原的糖原的葡萄糖。更高的病毒载体剂量的确产生更高的糖原水平。
图2A至2D显示了用AdGL感染人结肠直肠癌(LoVo)和人乳房癌细胞系(MCF7)后，降低的细胞生存力和提高的糖原积累。(A)与AdpSh相比，感染了100 MOI AdGL后的LoVo细胞生存力。(B)与对照AdpSh相比，提高AdGL的MOI导致LoVo细胞中的源自葡糖淀粉酶-还原的糖原的葡萄糖的积累增加。与45 MOI对照AdpSh相比，当感染45 MOI AdGL时，MCF7细胞显示出(C)降低的生存力和(D)源自葡糖淀粉酶-还原的糖原的葡萄糖的积累增加。
图3A和3B表明，与单独使用AdGL相比，组合AdGL和细胞周期抑制剂roscovitine能增加糖原水平，并进一步降低细胞生存力。(A)与单独使用AdGL(深灰条)或组合使用roscovitine和对照AdpSh(中灰条)相比，组合AdGL和roscovitine(黑条)随时间过去显著地增加了感染的HeLa细胞中的源自葡糖淀粉酶-还原的糖原的葡萄糖。(B)roscovitine显著地降低了受AdGL-感染的细胞的细胞生存力。对于roscovitine-处理的(灰条)和未处理的细胞(白条)，将来自AdGL-感染的细胞的活细胞与对照AdpSh-感染的细胞相比较的比率表达为百分比。所有的处理都使用100 MOI病毒。
图4表明，遗传因子可以增强GL的表达，以进一步降低癌细胞生存力。使用的4种病毒是，不含有GL的AdpSh，含有GL但是没有增强元件的AdGL，含有GL和hsp70 5′UTR元件的AdhspGL和含有GL 和WPRE元件的AdGL WPRE。所有的病毒都以100 MOI使用。将来自感染了病毒的细胞的活细胞与对照AdpSh-感染的细胞的比率表达为百分比。
发明详述
本发明提供了调节胞内糖原水平的方法。通过调节糖原的胞内水平，可以使细胞交替地减少糖原或积累糖原。细胞中的糖原积累可以是毒性的，其可以导致细胞增殖、生长、存活或生存力的抑制或降低。当糖原以足以产生毒性的水平积累时，会导致细胞死亡。因而，可以 靶向不希望的细胞增殖、以及异常的和病态的过度增殖的细胞(例如，细胞增殖病例如肿瘤和癌细胞)，以减少靶细胞的增殖、生长、存活或生存力。
可以通过多种机理诱导或刺激糖原在细胞中积累。例如，可以诱导或提高能直接或间接参与糖原合成、生产或积累的酶(在本文中称作“糖原生成酶”)的表达或活性，由此增加糖原的胞内量。在另一个实例中，可以抑制或降低能直接或间接参与糖原的代谢、分解代谢、利用、降解或去除的酶(在本文中称作“糖原分解酶”)的表达或活性，由此增加糖原的胞内量。尽管参与糖原的合成、生产或积累、或糖原的代谢、分解代谢、利用、降解或去除的几种蛋白在技术上不是酶，因为它们不能催化底物产生反应，例如，GLUT是葡萄糖转运蛋白，靶向糖原的亚基家族是将PP-1与糖原相连的衔接分子，为了方便，这些蛋白也称作如本文所用的糖原生成酶和糖原分解酶，因为它们能参与调节糖原水平的各种途径。本发明因此包括提高糖原的胞内水平的方法，而不考虑具体的生理或生化机理。
可以通过多种方法来调节参与糖原合成、生产、积累、代谢、分解代谢、利用、降解、或去除的酶的表达或活性。例如，可以将一种或多种糖原生成酶、或能编码糖原生成酶的基因导入细胞中，以增加胞内糖原水平。在另一个实例中，可以将抑制性核酸(例如，反义物、核酶、小的干扰RNA或形成三链体的多核苷酸)或能编码抑制性核酸的核酸导入细胞中，以增加胞内糖原水平。可以将靶向糖原分解酶的、或能编码靶向糖原分解酶的反义物的抑制性核酸序列导入细胞中，以增加胞内糖原水平。向胞质内导入合适的核酸或蛋白，可以刺激或诱导胞内糖原积累，任选地达到毒性水平。
因而，根据本发明，提供了在细胞(例如，过度增殖的细胞)中调节(增加或降低)胞内糖原、任选地达到毒性水平的方法。在一个实施方案中，增加糖原的方法包括：在细胞中表达基因产物，其能增加细胞中的糖原的量、任选地达到毒性水平.在各个方面，基因产物是能增加糖原的合成或胞内积累的蛋白，或能降低糖原的代谢、分解代谢、利用、降解或去除的蛋白。在特定方面，基因产物包含糖原生成酶(例如，由多核苷酸编码)或靶向糖原分解酶的反义多核苷酸、小干扰RNA分子或核酶。
糖原生成酶的具体的非限制性的实例包括：糖原生成蛋白，糖原生成蛋白-2，糖原合酶，糖原生成蛋白相互作用蛋白(GNIP)，蛋白质磷酸酶-1(PP-1)，PP-1同工型或家族成员的靶向糖原的亚基，己糖激酶同工型或家族成员，或谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶。PP-1同工型和家族成员的靶向糖原的亚基包括GL(PPP1R3B，PPP1R4)，PTG(PPP1R3C，PPP1R5)，PPP1R3D(PPP1R6)或Gm/RG1(PPP1R3A，PPP1R3)。间接参与糖原积累的糖原生成酶的具体实例是葡萄糖转运蛋白(GLUT)，其能将葡萄糖转运到细胞中，用于糖原合成。示例性的糖原生成酶名称(使用Hugo命名法)、序列和对应的Genbank登记号包括：
糖原生成蛋白
GYG糖原生成蛋白NM_004130
GYG2糖原生成蛋白2NM_003918
糖原生成蛋白相互作用蛋白(GNIP)
AF396651，AF396655，AF396654
蛋白质磷酸酶-1
PPP1CA蛋白质磷酸酶1，催化亚基，α同工型NM_002708
糖原合酶
GYS1糖原合酶1(肌肉)NM_002103
GYS2糖原合酶2(肝)NM_021957
葡萄糖转运蛋白
SLC2A1溶质载体家族2(促进的葡萄糖转运蛋白)，成员1NM_006516 GLUT1
SLC2A2溶质载体家族2(促进的葡萄糖转运蛋白)，成员2NM_000340 GLUT2
SLC2A3溶质载体家族2(促进的葡萄糖转运蛋白)，成员3NM_006931 GLUT3
SLC2A4溶质载体家族2(促进的葡萄糖转运蛋白)，成员4NM_001042 GLUT4
SLC2A6溶质载体家族2(促进的葡萄糖转运蛋白)，成员6NM_017585 GLUT9，GLUT6
SLC2A7溶质载体家族2(促进的葡萄糖转运蛋白)，成员7 AL356306
SLC2A8溶质载体家族2(促进的葡萄糖转运蛋白)，成员8NM_014580 GLUTX1，GLUT8
SLC2A9溶质载体家族2(促进的葡萄糖转运蛋白)，成员9NM_020041 GLUT9，GLUTX
SLC2A10溶质载体家族2(促进的葡萄糖转运蛋白)，成员10NM_030777 GLUT10
SLC2A11溶质载体家族2(促进的葡萄糖转运蛋白)，成员11NM_030807 GLUT11，GLUT10
SLC2A12溶质载体家族2(促进的葡萄糖转运蛋白)，成员12NM_145176 GLUT12，GLUT8
SLC2A13溶质载体家族2(促进的葡萄糖转运蛋白)，成员13NM_052885 HMIT
SLC2A14溶质载体家族2(促进的葡萄糖转运蛋白)，成员14NM_153449 GLUT14
己糖激酶同工型和家族成员
GCK葡糖激酶(己糖激酶4，年轻人的成年型糖尿病2)NM_000162
HK1己糖激酶1NM_033500
HK2己糖激酶2NM_000189
HK3己糖激酶3(白细胞)NM_002115
谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶
GFPT1谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶1NM_002056
GFPT2谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶2NM_005110
PP-1同工型和家族成员的靶向糖原的亚基
PPP1R3B蛋白质磷酸酶1，调节(抑制剂)亚基3B NM_024607GL，FLJ14005，PPP1R4
PPP1R3C蛋白质磷酸酶1，调节(抑制剂)亚基3C NM_005398PPP1R5，PTG
PPP1R3D蛋白质磷酸酶1，调节亚基3D NM_006242 PPP1R6
PPP1R3A蛋白质磷酸酶1，调节(抑制剂)亚基3A(糖原和肌质网结合亚基，骨骼肌)NM_002711 PPP1R3，Gm/RG1
糖原分解酶的具体的非限制性的实例包括：糖原磷酸化酶、脱支 酶、磷酸化酶激酶、葡萄糖-6-磷酸酶、PPP1R1A(蛋白质磷酸酶1，调节抑制剂亚基1A)、PPP1R2(蛋白质磷酸酶1，调节亚基2)、果糖磷酸激酶、糖原合酶激酶-3同工型、GCKR葡糖激酶调节蛋白或α-葡糖苷酶。示例性的糖原分解酶名称(使用Hugo命名法)、序列和对应的Genbank登记号包括：
糖原磷酸化酶
PYGB磷酸化酶，糖原；脑NM_002862
PYGL磷酸化酶，糖原；肝(赫斯病，糖原积贮症VI型)NM_002863
PYGM磷酸化酶，糖原；肌肉(麦卡德尔综合征，糖原积贮症V型)NM_005609
磷酸化酶激酶
PHKA1磷酸化酶激酶，α1(肌肉)NM_002637
PHKA2磷酸化酶激酶，α2(肝)NM_000292
PHKB磷酸化酶激酶，βNM_000293
PHKG1磷酸化酶激酶，γ1(肌肉)NM_006213
PHKG2磷酸化酶激酶，γ2(睾丸)NM_000294
PHKGL磷酸化酶激酶，γ-样
CALM1钙调蛋白1(磷酸化酶激酶，δ)NM_006888
CALM2钙调蛋白2(磷酸化酶激酶，δ)NM_001743
CALM3钙调蛋白3(磷酸化酶激酶，δ)NM_005184
糖原合酶激酶-3
GSK3A糖原合酶激酶3αNM_019884
GSK3B糖原合酶激酶3βNM_002093
葡萄糖-6-磷酸酶
G6PC葡萄糖-6-磷酸酶，催化的(糖原积贮症I型，冯吉尔克病)NM_000151
蛋白质磷酸酶1，调节亚基
PPP1R1A(蛋白质磷酸酶1，调节(抑制剂)亚基1A)，
PPP1 R2(蛋白质磷酸酶1，调节亚基2)，
果糖磷酸激酶
PFKL果糖磷酸激酶，肝NM_002626
PFKM果糖磷酸激酶，肌肉NM_000289
PFKP果糖磷酸激酶，血小板NM_002627
葡糖苷酶
AGL淀粉-1，6-葡糖苷酶，4-α-葡聚糖基转移酶(糖原脱支酶，糖原积贮症III型)NM_000646
GAA葡糖苷酶，α；酸(蓬珀病，糖原积贮症II型)NM_000152
GANAB葡糖苷酶，α；中性AB
GANC葡糖苷酶，α；中性C AF545045
MGAM麦芽糖酶-葡糖淀粉酶(α-葡糖苷酶)NM_004668
GCKR葡糖激酶(己糖激酶4)调节蛋白NM_001486
通过试剂或处理，也可以调节能参与糖原合成、生产、积累、代谢、分解代谢、利用、降解或去除的酶的表达或活性。这样的试剂或处理可以直接地或间接地作用于参与糖原合成、生产、积累、代谢、分解代谢、利用、降解、或去除的蛋白。
例如，被酶较差地修饰的或未被修饰的糖原分解酶的底物类似物是这样的试剂类型的具体实例.底物类似物可以结合酶的活性位点，并抑制或阻止天然底物的结合，由此提高糖原水平。糖和碳水化合物类似物(例如，拟寡糖(pseudooligosaccharide))是用于抑制或降低糖原分解酶的表达或活性的一类试剂的具体实例。底物类似物还包括多肽和模仿天然底物的模拟物.例如，GSK-3能磷酸化糖原合酶，这反过来又使酶失活，由此降低糖原的水平。因而，糖原合酶的类似物是能抑制GSK-3的试剂的一个具体实例。
因而，根据本发明，还提供了使用能增加胞内糖原的量的试剂调节细胞中的糖原的方法。在一个实施方案中，方法包括：使细胞(例如，过度增殖的细胞)与能将糖原的量增加到毒性水平的试剂相接触，其中所述的细胞不是肝、肌肉或脑细胞。在另一个实施方案中，方法包括：使细胞与能将糖原的量增加到毒性水平的试剂接触，前提是该试剂基本上不抑制糖原磷酸化酶同工型(例如，肝、肌肉或脑糖原磷酸化酶同工型)的活性或表达.一方面，试剂能增强或刺激糖原生成酶的表达或活性。另一方面，试剂能降低或抑制糖原分解酶的表达或活性。在其它方面，过度增殖的细胞包括良性增生或转移性的或非转移性的癌细胞.癌细胞可以是在培养物中(体外)或体内的，例如，在受试者的脑、头或颈、乳房、食管、嘴、胃、肺、胃肠道、肝、胰、 肾、肾上腺、膀胱、结肠、直肠、前列腺、子宫、子宫颈、卵巢、睾丸、皮肤、肌肉或造血系统中。
如本文所使用的，当提及试剂或治疗剂是否“抑制、减少、增加或刺激”特定酶(例如糖原磷酸化酶同工型)的表达或活性时，术语“基本的”和“基本上”是指这样的规定，即试剂或治疗剂不影响细胞中的特定酶(例如，糖原磷酸化酶)的活性，而将胞内糖原增加到毒性水平。例如，基本上不抑制糖原磷酸化酶同工型的试剂在用于使胞内糖原积累到毒性水平的试剂浓度时不会抑制该酶.在肝、肌内和脑中存在3种已知的人糖原磷酸化酶同工型.因而，“基本上抑制”这些糖原磷酸化酶同工型是指，将肝、肌肉或脑中的酶活性降低或抑制到足以使胞内糖原增加到毒性水平(例如，降低的细胞增殖、生长、存活、生存力等)。
该规定不排除能间接刺激或抑制糖原生成酶或糖原分解酶(例如，糖原磷酸化酶同工型)的试剂和治疗剂，例如，抑制中间蛋白，其反过来抑制糖原磷酸化酶活性。该规定也不排除能直接靶向或结合糖原生成酶或糖原分解酶(例如糖原磷酸化酶)的试剂和治疗剂，和在用于使胞内糖原增加到低于毒性水平(例如，使用的试剂的量低于杀死细胞所需的量)的浓度.因此，当使用时，该规定是指试剂和治疗剂，所述试剂和治疗剂包括本文所述的试剂和治疗剂的具体的非限制性的实例，能靶向或结合糖原生成酶或糖原分解酶(例如糖原磷酸化酶)，且其作用是在使用的试剂或治疗剂浓度将胞内糖原增加到毒性水平。
试剂包括小分子。如本文所使用的，术语“小分子”是指大小低于约5千道尔顿的分子。一般地，这样的小分子是有机的，但是也可以是无机分子，例如元素或离子形式，例如锂、锌等。
能降低或抑制糖原分解酶的表达或活性的试剂的具体的非限制性的实例包括糖原磷酸化酶抑制剂，例如N-甲基-β-葡萄糖-C-羧酰胺(Watson等，Biochemistry，33：5745(1994))，α-D-葡萄糖(Oikonomakos等，Eur.J.Drug Metab.Pharmacokinet.19：185(1994))，吡喃葡萄糖亚基-螺-乙内酰脲16(Somsak等，Curr.Pharm.Des.15：1177(2003))，N-乙酰基-N′-β-D-吡喃葡萄糖基脲(Acurea)和N-苯甲酰基-N′-β-D-吡喃葡萄糖基脲(Bzurea)(Oikonomakos等，Eur.J.Biochem. 269：1684(2002))，N-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基胺(Board M.，Biochem.J.328：695(1997))，苯甲酰甲基咪唑鎓盐(VanSchaftingen和DeHoffmann E Eur.J.Biochem.218：745(1993))，CP-91149(吲哚-2-羧酰胺)(Latsis等，Biochem.J.368：309(2002))，Flavopiridol(Kaiser等，Arch.Biochem.Biophys.386：179(2001))，吲哚-2-羧酰胺(Hoover等，J.Med.Chem.41：2934(1998))，S-3-异丙基-4-(2-氯苯基)-1，4-二氢-1-乙基-2-甲基-吡啶-3，5，6-三羧酸酯(W1807)(Oikonomakos等，Protein Sci.10：1930(1999))，BAY R3401和BAY W1807(Bergans等，Diabetes，49：1419(2000)；Shiota等，Am.J.Physiol.273：E868(1997))，1，4-二脱氧-1，4-亚氨基-d-阿拉伯糖醇(arabinitol)(DAB)(Fosgerau等，Arch.Biochem.Biophys.380：274(2000))，5-氧-1H-吲哚-2-羧酸(1-(4-氟苄基)-2-(4-羟基哌啶-1-基)-2-氧代乙基)酰胺(CP320626)(Oikonomakos等，Structure，8：575(2000))，吡哆醛(5′)二磷酸(1)-α-D-葡萄糖(Withers G.J.Biol.Chem.260：841(1985))，3，4-二氯异香豆素(3，4-DC)(Rusbridge和Beynon FEBSLett.268：133(1990))，咖啡因(San Juan Serrano等，Int.J.Biochem.Cell.Biol.27：911(1995))，α-，β-，和γ-环糊精(Pinotsis等，Protein Sci.12：1914(2003))，吡喃葡萄糖亚基螺硫代乙内酰脲(Oikonomakos等，Bioorg.Med.Chem.10：261(2002))，氨基胍(Sugita等，Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.282：E386(2002))，proglycosyn(Yamanouchi等，Arch.Biochem.Biophys.294：609(1992))和2-脱氧-2-氟-α-D-吡喃葡萄糖基氟化物(Massillon等，J.Biol.Chem.270：19351(1995)).
能降低或抑制糖原分解酶的表达或活性的试剂的其它的非限制性的实例包括糖原合酶激酶-3同工型(α或β)抑制剂.糖原合酶激酶3(GSK-3)的失活导致底物的脱磷酸作用，所述底物包括糖原合酶和真核的蛋白合成起始因子-2B(eIF-2B)。这导致它们的功能活化，由此增加胞内糖原.
GSK-3的小分子抑制剂包括药物，例如hymenialdisine(例如，二溴-hymenialdisine)(Breton和Chabot-Fletcher，J.Pharmacol.Exp.Ther.282：459(1997)；Meijer，等，Chem.Biol.7：51(2000))；靛玉红(例如，5，5′-二溴-靛玉红)(Damiens等，Oncogene 20：3786 (2001)；Leclerc等，J.Biol.Chem.276：251(2001))；马来酰亚胺(例如，Ro 31-8220，SB-216763和SB-415286)(Coghlan等，Chem.Biol.7：793(2000)；Cross等，J.Neurochem.77：94(2001)；Hers等，FEBS Lett.460：433(1999)；Lochhead等，Diabetes 50：937(2001)；Smith等，Bioorg.Med.Chem.Lett.11：635(2001))；和蕈毒碱的激动剂(例如，AF102B和AF150)(Forlenza等，J.Neural.Transm.107：1201(2000)).其它的小分子GSK-3药物抑制剂与ATP竞争，例如Aloisines(例如，Aloisine A和Aloisine B)(Martinez，等，J.Med.Chem.45：1292(2002)；Martinez等，Med.Res.Rev.22：373(2002)；Mettey等，J.Med.Chem.46：222(2003)).GSK-3的小分子抑制剂还包括CHIR 98014、CHIR 98021和CHIR 99023(Ring等，Diabetes，52：588(2003)；Nikoulina等，Diabetes，51：2190(2002))。
GSK-3的小分子抑制剂还包括元素和离子，例如锂(Klein和Melton，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8455(1996)和Stambolic等，Curr.Biol.6：1664(1996))。尽管对GSK-3具有较好的特异性，仍然需要相对较高剂量的锂(Ki是mM)来抑制细胞培养物中的GSK-3活性(Stambolic等，Curr.Biol.6：1664(1996)).与其它的元素离子一样，锂通过与Mg2+竞争发挥作用(Ryves和Harwood Biochem.Biophys.Res.Commun.280：720(2001)；Carmichael等，J.Biol.Chem.277：33791(2002)和Stambolic等，Curr.Biol.6：1664(1996))。锌的二价形式(它模拟胰岛素作用)也在15mM的浓度抑制细胞培养物中的GSK-3(Ilouz等，Biochem.Biophys.Res.Commun.295：102(2002))。另一种金属离子铍在6mM的浓度能将GSK-3抑制到最大活性的一半(Ryves等，Biochem.Biophys.Res.Commun.290：967(2002))。
GSK-3结合蛋白是GSK-3抑制剂的其它实例。例如，胰岛素能通过依赖于磷酸肌醇3-激酶(PI 3-激酶)的机理灭活GSK-3。PI-激酶-诱导的PKB(也称作Akt)的活化导致2个GSK-3同工型(GSK-3b的S9；GSK-3a的S21)的PKB磷酸化作用(Cross等，Nature 378：785(1995))，这会抑制GSK-3活性。其它的刺激物通过S9/S21磷酸化作用导致GSK-3的失活，包括生长因子例如EGF和PDGF，其能刺激使GSK-3失活的激酶p90RSK(也称作MAPKAP-K1)。
能降低或抑制糖原分解酶的表达或活性的试剂的其它的非限制性 的实例包括α-葡糖苷酶抑制剂。大多数已知的天然的和合成的α-葡糖苷酶抑制剂是糖类似物，例如拟寡糖(Bischoff，H.，Eur.J.Clin.Investig.24：3(1994))、氮杂糖(azasugar)(Wong等，J.Org.Chem.60：1492(1995))和吲哚里西啶(indolizidine)生物碱(Elbein，A.D.，Ann.Rev.Biochem.，56：497(1987))。阿卡波糖(一种来自游动放线菌属(Actinoplane)物种的拟四糖)是α-葡糖苷酶的最有效的抑制剂之一(Legler G.Adv.Carb.Chem.Biochem.，48：319(1990))。它的结构类似于底物的过渡态.因此，底物类似物是根据本发明使用的α-葡糖苷酶抑制剂的具体种类。
能降低或抑制α-葡糖苷酶的表达或活性的试剂的其它的非限制性实例包括Bay m1099(Wisselaar等，Clin.Chim.Acta.，182：41(1989))，牛弥菜醇B环氧化物(Hermans等，J.Biol.Chem.266：13507(1991))，澳粟精胺(Rhinehart，等，Biochem.Pharmacol.41：223(1991))，Isofagomine(糖原磷酸化酶的肝和肌肉同工型的有效抑制剂)(Dong等，Biochem.35：2788(1996)；Lundgren等，Diabetes 45：S2521(1996)和Waagepetersen等，Neurochemistry International 36：435(2000))，Vilidamine，井冈霉烯胺(valienamine)和有效醇胺(Takeuchi等，J.Biochem.108：42(1990)；和美国专利号4,701,559)，Acarviosine-葡萄糖和异阿卡波糖(isoacarbose)(Kim等，Arch.Biochem.Biophys.371：277(1999))，Salacinol，其可以从斯里兰卡本地的植物中分离出(美国专利号6,455，573和Yoshikawa等，Bioorg.Med.Chem.10：1547(2002))，D(+)-海藻糖(Matsuur等，Biosci.Biotechnol.Biochem.66：1576(2002))，Callyspongynic acid(1)(Nakao等，J.Nat Prod.65：922(2002))，1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimcin)(DNM)(Papandreou等，Mol.Pharmacol.61：186(2002))，Touchi-提取物(Hiroyuki等，J.Nutr.Biochem.12：351(2001))，哌嗪二酮(1)(Kwon等，J.Antibiot.53：954(2000)；Sou等，Chem.Pharm.Bull.49：791(2002))，2，6-二脱氧-7-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)2，6-亚氨基-D-丙三氧基-L-古洛(gulo)-庚糖醇(7-O-β-D-吡喃葡萄糖基-α-同野尻霉素，1)(Ikeda等，Carbohydr.Res.323：73(2000))，乙醇胺和苯基6-脱氧-6-(吗啉-4-基)-β-D-吡喃葡糖苷(Balbaa等，Carbohydr.Res.317：100(1999))，N-甲基-1-脱氧野尻霉素(MOR-14)(Minatoguchi等， Circulation，97：1290(1998))，Acavisonine-西蒙精(simmondsin)(Baek等，Biosci.Biotechnol.Biochem.67：532(2003))，Nestrisine(Tsujii等，Biochem.Biophys.Res.Commun.220：459(1996))，Bayg 5421(Aletor等，Poult.Sci.82：796(2003))，桑枝(Ramulus mori，SZ)，(Ye等，药学学报，37：108(2002))，2，4，6-三硝基苯基2-脱氧-2，2-二氟-α-葡糖苷(Braun等，J.Biol.Chem.270：26778(1995))，L-组氨酸，其组胺和咪唑衍生物(Field等，Biochem.J.274：885(1991))，4-O-α-D-吡喃葡萄糖基脱二氧亚胺基葡糖醇(moranoline)，及其各种N-取代的衍生物(Yoshikuni等，Chem.Pharm.Bull，37：106(1989))，表澳粟精胺(Molyneux等，Arch.Biochem.Biophys.，251：450(1986))，野尻霉素(Chambers等，Biochem.Biophys.Res.Commun.107：1490(1982))和野尻霉素四唑(Mitchell等，Biochemistry，35：7341(1996)).
α-葡糖苷酶抑制剂的其它具体实例包括O-4，6-二脱氧-4-[[[1S-(1α，4α，5β，6α)]-4，5，6-三羟基-3(羟甲基)-2-环己烯-1-基]氨基]-α-D-吡喃葡萄糖基-(1-4)O-α-D-吡喃葡萄糖基-(1-4)-D-葡萄糖，也称作阿卡波糖；2(S)，3(R)，4(S)，5(S)-四羟基-N-[2-羟基-1-(羟甲基)-乙基]-5-(羟甲基)-1(S)-环六胺，也称作伏格列波糖(A0-128)(Goke等，Digestion，56：493(1995))；1，5-二脱氧-1，5-[(2-羟乙基)亚氨基]-D-山梨醇，也称作米格列醇；1，5-二脱氧-1，5-[2-(4-乙氧甲酰基苯氧基)乙基亚氨基]-D-山梨醇，也称作乙格列酯(emiglitate)(Lembcke等，Res.Exp.Med.191：389(1991))；2，6-二脱氧-2，6-亚氨基-7-(β-D-吡喃葡萄糖基)-D-丙三氧基-L-古洛庚糖醇，也称作MDL-25637；1，5-二脱氧-1，5-(6-脱氧-1-O-甲基-α-D-吡喃葡萄糖-6-基亚氨基)-D-山梨醇，也称作卡格列波糖(camiglibose)；1，5，9，11，14-五羟基-3-甲基-8，13-二氧代-5，6，8，13-四氢苯并[a]并四苯-2-羧酸，也称作普拉米西Q(pradimicin Q)；肥胖菌素(adiposine)和1，2-二脱氧-2-[2(S)，3(S)，4(R)-三羟基-5-(羟甲基)-5-环己烯-1(S)-基氨基]-L-吡喃型葡萄糖，也称作salbostatin。吲哚里西啶生物碱，例如australine、澳粟精胺和苦马豆素是α-葡糖苷酶抑制剂。α-葡糖苷酶抑制剂还包括经口的抗糖尿病药(Lebovitz，H.E.Drugs，44：21(1992))。N-丁基脱氧野尻霉素(N-丁基-DNJ)和DNJ的有关的N-烷基衍生物 是α-葡糖苷酶I和II的抑制剂(Saunier等，J.Biol.Chem.257：14155(1982)和Elbein，Ann.Rev.Biochem.56：497(1987))。1，5-二脱氧-1，5-亚氨基-D-山梨醇和衍生物(包括N-烷基、N-酰基、N-芳酰基、N-芳烷基、和O-酰基衍生物)是α-葡糖苷酶抑制剂。α-葡糖苷酶抑制剂包括L-阿拉伯糖和在植物中发现的形式，例如阿拉伯聚糖(arabinan)、阿拉伯糖基木聚糖和阿拉伯半乳聚糖。澳粟精胺是α-葡糖水解酶抑制剂的一个实例，该抑制剂是不能容易地逆转的，且具有相对较长的作用持续时间.它还抑制溶酶体α-葡糖苷酶，这导致溶酶体糖原的积累。另一种具体的α-葡糖水解酶抑制剂是1，5-二脱氧-1，5-(6-脱氧-1-O-甲基-6-α，D-吡喃葡萄糖基)亚氨基-D-山梨醇(MDL73945)(Robinson等，Diabetes 40：825(1991)).其它的α-葡糖水解酶抑制剂包括4，6-二脱氧-4-(4，5，6-三羟基-3-羟甲基环己-2-烯-1-基氨基)-α-D-吡喃型葡萄糖的吡喃葡萄糖基和寡葡糖苷基(oligoglucosidyl)衍生物。化合物O-{4，6-二脱氧-4-[1S-(1，4，6/5)-4，5，6-三羟基-3-羟甲基环己-2-烯-1-基氨基]α-D-吡喃葡萄糖基}-(l-4)-O-α-D-吡喃葡萄糖基-(l-4)-D-吡喃型葡萄糖是代表物(美国专利号4,062,950).
下面的表1说明了示例性的具有式I结构的α-葡糖苷酶抑制剂(见，美国专利号6,143,932和6,121,489)。式I的亚类如下：R1和R2 独立地为氢原子、氨基保护基、C1至C12酰基、C3至C10环烷基、C3 至C6杂环、C1至C12烷基、C1至C12取代的烷基、C7至C16烷基芳基，C7至C16取代的烷基芳基，C6至C15烷基杂环，或取代的C6至C15烷基杂环；R3、R5和R7独立地为氢原子、C1至C12烷基、C1至C12取代的烷基、苯基、取代的苯基、C7至C16烷基芳基、C7至C16取代的烷基芳基、C6至C15烷基杂环、或取代的C6至C15烷基杂环；R4、R6和R8独立地为C1至C18取代基；R9是氢原子；当R1和R2不是氢原子或氨基保护基时，R10任选地为C1至C18取代基；AA、BB和CC独立地为0至5；且B是0至3。与R3、R5和R7相结合的碳的立体化学独立地为R或S或二者的混合物；当B是2或3时，每个R4和R5可以是相同的或不同的；当B是0时，每个R6和R8是不同的；且R1或R2 可以与R3相连；R4可以与R5相连；R6可以与R7相连；分别地和独立地，以形成取代的或未取代的吡咯烷环。X和Y分别为氢原子，或一 起代表羰基.
表1中的IC50值代表达到50％酶被抑制的浓度，如前所述进行测定(Haslvorson和Ellias，Biochem.Biophys.Acta，30：28(1958))。最有活性的抑制剂是式I化合物，其中X和Y一起形成羰基，B是0，除另有说明外，AA、BB和CC为0，R9是氢原子，R8是苄基，R6是萘-2-基甲基，R3是S-(N-(萘-2-基甲基)吲哚-3-基甲基)，R1和R2 分别为氢，R10不存在，且R7
表1
  α-葡糖苷酶  R7   抑制  IC50(μM)
  R-(4-(N-苄氨基)-正丁基)   17
  S-(4-(N-苄氨基)-正丁基)   19
  S-(3-胍基)-正丙基)   38
  R-(3-胍基)-正丙基)   38
  S-吡咯烷(与R8相连)   141
  S-甲基   167
  氢原子   167
  R-(2-甲基)丙基   170
  S-(1-羟甲基)   176
  S-(苯基)   184
  S-(4-羟基苄基)   190
  R-甲基   199
  S-苄基   328
  S-(2-甲基)丙基   356
  S-(吲哚-3-基甲基)   356
  S-(异丙基)   356
  R-(2-甲基)丙-1-基   398
  S-4-羟基吡咯烷(prrolidine)(与R8相连)   437
  S-(1-羟乙基)   460
  S-[N′，N′-二苄基酰胺基]乙基])   529
  R-(4-羟基苄基)   540
  R-(异丙基)   552
  R-(N′-苄基吲哚-3-基甲基)   552
  S-(2-(甲基亚磺酰基)乙基)   564
  S-(1-甲基)丙-1-基   610
  S-(N′-苄基吲哚-3-基甲基)   632
  S-(正丙基)   632
  R-(吲哚-3-基甲基)   667
  S-(环己基甲基)   667
  R′-(1-羟乙基)   678
  R-吡咯烷(与R8相连)   702
  S-[N′，N′-二苄基酰胺基]乙基   713
  R-(正丁基)   724
  氢原子，AA＝1   770
  R-(正丙基)   828
能提高胞内糖原水平的试剂还包括：例如，赭曲毒素A(Dwivedi和Burns，Res.Vet.Sci.36：92(1984))，N-乙酰基半胱氨酸(Itinose等，Res.Commun.Chem.Pathol.Pharmacol.83：87(1994))，二氯醋酸盐(DCA)(Kato-Weinstein等，Toxicology，130：141(1998)；Lingohr等，Toxicol.Sci.68：508(2002))，斑蝥素(Wang等，Toxicology，147：77(2000))，Methylobromofenvinphos(IPO 63化合物)(Chishti和Rotkeiwicz，Arch.Environ.Contam.Toxicol.22：445(1992))，染料木黄酮(Okazaki等，(2002)Arch.Toxicol.76：553)，奎宁(al-Habori等，Biochem.J.282：789(1992))，Alveld毒素(Flaoyen等，Vet.Res.Commun.15：443(1991))，甲硫氨酸亚砜亚胺(sulfoximine)(Havor和Delorme Glia 4：64(1991))，衣霉素(Chardin等，Cell Tissue Res.，256：519(1989))，二甲双胍(Detaille等，Biochem.Pharmacol.58：1475(1999))，5-idotubercidin(Fluckiger-Isler和Walter Biochem.J.292：85(1993))，斑蝥素(Wang等，Toxicology，147：77(2000))，二氮嗪(Alemzadeh等，Eur.J.Endocrinol.146：871(2002))。
激素是能提高胞内糖原水平的试剂的另一个实例。具体的非限制性的实例包括表皮生长因子(Bosch等，Biochem.J.239：523(1986))，氢化可的松(BlackAm.J.Physiol.254：G65(1988))，去甲肾上腺素，血管活性肠肽(Allaman等，Glia，30：382(2000))，糖皮质激素(Laloux等，Eur.J.Biochem.136：175(1983))和胰岛素。
饮食添加剂是能提高胞内糖原水平的试剂的另一个实例.具体的非限制性的实例包括葡萄糖(Watson等，Biochemistry，33：5745(1994))，果糖(Gergely等，Biochem.J.，232：133(1985))，D-塔格糖(Kruger等，Regul.Toxicol.Pharmacol.29：S1-S10(1999))，与胰岛素组合的寡果糖(Flamm等，Crit.Rev.Food Sci.Nutr.41：353(2001))和Na+-协同转运的氨基酸例如谷氨酰胺、丙氨酸、天冬酰胺和脯氨酸(Hue L，Gaussin V.In：Amino Acid Metabolism and Therapyin Health and Nutritional Disease(Cynober，L.A.，ed)pp.179-188，CRC Press，Boca Raton，FL.(1995))。
植物和植物提取物是能提高胞内糖原水平的试剂的另一个实例。具体的非限制性的实例包括药鼠李(Rhamnus cathartica)(Lichtensteiger等，Toxicol.Pathol.5：449(1997))，苦瓜(Mormordica charantia)和黧豆属(Mucuna)(Rathi等，Phytother Res.16：236(2002))和Graninia Kola的粉碎的种子(Braide和Grill Gegenbaurs.Morphol.Jahrb.136：95(1990))。
除了本文公开的和本领域已知的示例性的抑制剂外，可以基于结构和功能知识来设计糖原分解酶抑制剂。例如，对于GSK-3，已经确定了晶体结构(Bax等，Structure(Camb)9：1143(2001)；Dajani等，Cell 105：721(2001)；ter Haar等，Nat.Struct.Biol.8：593(2001))。GSK-3的晶体结构的分析表明，该酶偏好最初的(primed)、磷酸化前的底物。GSK-3的T-环是分别在GSK-3b和GSK-3a的Y216和Y279处磷酸化的酪氨酸，但不是磷酸化的苏氨酸。Y216/Y279磷酸化作用可能在打开底物结合位点中起作用(Dajani等，Cell 105：721(2001))。因而，GSK-3的T-环酪氨酸磷酸化作用可能促进底物磷酸化作用，但不是激酶活性所严格需要的(Dajani等，Cell 105：721(2001))。GSK-3的晶体结构还表明，S9/S21丝氨酸磷酸化的抑制作用是产生最初的拟底物(pseudosubstrate)，其能分子内地结合带正电荷的口袋。该折叠排除了底物的磷酸化作用，因为催化槽被占据了。抑制机理是竞争性的，因此，足够高浓度的拟底物可以竞争过最初的底物，反之亦然。因而，模拟成能适合GSK-3激酶结构域的带正电荷的口袋的小分子抑制剂可以选择性地抑制最初底物(例如糖原合酶)的结合.
除了晶体结构外，研究表明GSK-3对于在“引发(priming)”残基(其位于GSK-3磷酸化作用位点的C-末端)处磷酸化前的靶蛋白具有偏好(Fiol等，J.Biol.Chem.262：14042(1987))。GSK-3底物的共有序列是Ser/Thr-X-X-XSer/Thr-P，其中第一个Ser或Thr是靶残基，X是任意的氨基酸(但经常是Pro)，且最后一个Ser-P/Thr-P是引发磷酸化作用的位点。引发磷酸化作用能将大多数GSK-3底物的底物磷酸化效率提高100-1000倍(Thomas等，FEBS Lett.458：247(1999))。例如，糖原合酶(原型的最初的底物)会通过酪蛋白激酶II(CK2)发生引发磷酸化作用，然后通过GSK-3发生顺序的多位点磷酸化作用(Fiol等，Arch.Biochem.Biophys.267：797(1988)；Fiol等，J.Biol.Chem.265：6061(1990))。一些GSK-3底物缺少引发位点。这些蛋白经常在或接近能模仿磷酸基-残基的引发位置显示出带负电荷的残基。
因为GSK-3具有许多底物，GSK-3需要许多调节水平来赋予底物特异性。因而，可以通过这些信号中的任一个来抑制GSK-3。例如，可以如下所述抑制GSK-3：通过丝氨酸磷酸化作用；抑制酪氨酸磷酸化作用或刺激酪氨酸脱磷酸作用；通过引发磷酸化作用，共价修饰底物来间接抑制；和通过GSK-3与结合或折叠蛋白的相互作用，抑制或促进GSK-3-介导的底物磷酸化.
还可以基于结构和功能知识来设计α-葡糖苷酶抑制剂。例如，α-葡糖苷酶的催化机理涉及碳正离子。2-脱氧-2-氟-α-D-葡糖基氟化物或5-氟-α-D-葡糖基氟化物等化合物的不可逆的酶抑制，是由于葡萄糖环的C-2或C-5处的氟化物的诱导效应，它会使得过渡态的葡糖基阳离子不稳定，且会促进稳定的葡糖基-酶中间体的形成(Krasikov等，Biochemistry，66：267(2001))。能模仿碳正离子(负电荷和/或半椅型构象)的特征的α-葡糖苷酶配体可以起抑制剂的作用。具有半椅型构象的δ葡糖酸内酯(δ-Gluconolacton)是牛肝α-葡糖苷酶的竞争性抑制剂(Firsov LM，Biokhimiya，43：2222(1978)).携带正电荷的α-葡糖苷酶抑制剂是更有效的抑制剂。例如，Tris能抑制α-葡糖苷酶活性(Krasikov等，Biochemistry，66：267(2001))。因而，能模仿碳正离子的配体特征的任何组合物都可以是能抑制α-葡糖苷酶的试剂，特别是带有正电荷的那些.
对于吲哚里西啶生物碱(澳粟精胺(castonospermine)，苦马豆素(swainosonine))和脱氧野尻霉素一般的6-员环结构，对于葡糖苷酶抑制不是必需的。相反地，环中存在的氮和羟基相对于氮的构型是抑制活性的主要先决条件(Tropea等，Biochemistry，28：2027(1989))。有效抑制的表现显然需要亚胺氮和催化酸之间的氢键。例如，N1-烷基-D-葡糖基胺向N1-丁基-(或十二烷基)-D-葡糖酸脒(gluconamidine)的转变伴有约10倍的抑制作用的提高；抑制剂的几何形状从四面体的C1-几何形状变成平面的sp2脒几何形状。认为这是因为，质子化了的脒不能从催化酸接受质子(Legler G，Finken M，Carbohydr.Res.，292：103(1996)).因此，最有活性的结构和随后的抑制剂应当在环中具有氮，其维持相对于羟基的构型。
在本发明的方法中，其中胞内糖原的量“增加”，这是指给定的一个或多个细胞中的糖原水平更高。当提及糖原时使用的术语“积累” 也是指胞内糖原水平的任何增加。当该术语在提及多个细胞时使用时，并非所有的细胞都能等同地响应和积累糖原。因而，一部分细胞可以表现出提高的糖原水平，而另一部分细胞则不表现出提高的糖原水平.
提高的胞内糖原水平可以是瞬时的或更长的持续时间，但是一般应当是足以产生毒性的量.糖原的毒性水平会导致减少的或降低的细胞增殖、生长、存活或生存力，或会产生一种或多种其它的糖原毒性特征。糖原毒性特征包括：例如，形态学变化例如糖原浓缩造成的细胞膨胀，增加的溶酶体的数目和大小，溶醇体的结构变化(其特征在于颗粒的出现)以及糖原的核积累，仅举几个例子。因此，通过测定细胞增殖或生长速度(例如，倍增时间、细胞周期长度等)、存活时间(例如，寿命)、生存力(裂解或细胞凋亡)或组织学的分析，可以确定糖原的毒性水平。
因而，本发明提供了能将糖原增加到对细胞具有毒性的量的方法.在各个方面，通过细胞增殖、生长或存活的抑制或减少，或通过测定与糖原毒性有关的形态变化，例如细胞膨胀、溶酶体数目的增加、溶酶体大小的增加或溶酶体的结构变化，可以检测毒性。
糖原的毒性水平还会导致降低的细胞生存力。因而，本发明提供了能将糖原增加到会造成细胞的裂解或细胞凋亡的量的方法。
具有毒性的糖原胞内水平随细胞类型而变化，因为某些细胞类型(例如肝和肌肉)倾向于储存更大量的糖原。结果，为了诱导糖原毒性，在正常情况具有更大量胞内糖原的细胞类型中，例如在肝和肌肉细胞中，糖原的绝对量会更大.例如，在人结直肠腺癌细胞系(HT-29，HRT-18，SW-480和Caco-2)的异步培养物中，细胞系彼此之间的糖原积累动力学类似，其特征在于在生长的指数期有较低的相对水平，随后在稳定期有3至4倍的增加。在HT-29和HRT-18细胞系的同步培养物中，在S、G2和M期都表现出较低的糖原量，随后在G1期开始增加，在G1期的中间达到峰值(初始值的2.5至3倍)。随后，在G1期的后一半时间出现对称的降低.但是，在稳定期和指数期出现的糖原对于每个细胞系具有特异性：在Caco-2、HRT-18、HT-29和SW-480细胞中，最大值分别是258.5±6.9(标准差)、88.9±2.6、87.5±3和17.5±1.8μg糖原/mg蛋白(Rousset等，Cancer Res.39(2Pt1)：531(1979))。 因此，糖原水平可以基于细胞类型而异，为了产生毒性，正常情况下糖原绝对水平较高的细胞一般也需要更高的糖原绝对水平.
对糖原毒性的敏感性也随细胞类型而异。因而，在某些细胞类型中，即使略微超过正常范围的糖原水平也足以诱导毒性，然而在其它的细胞类型中，为了诱导毒性，可能需要使糖原水平显著超过正常范围.在任一种情况下，使用本文公开的或本领域已知的各种实验和形态学标准中的任一个，都可以确定糖原毒性(见，例如，Phillips等， The Liver：An Atlas and Text of Ultrastructural Pathology.New York：Raven Press(1987)；Lembcke等，Res.Exp.Med.191：389(1991)和Baudhuin等，Lab.Invest.13：1139(1964))。
在本发明的各种实施方案中，可以使用以前已经将其表征为刺激或增加糖原生成酶的活性、抑制或降低糖原分解酶的活性、或能调节直接地或间接地影响胞内糖原水平的蛋白的活性的试剂和治疗剂，前提是该试剂或治疗剂是以能将糖原水平增加到毒性水平(包括足以杀死靶细胞的水平)的量使用。也就是说，当使用的试剂和治疗剂的量足以将糖原水平增加到毒性水平、或足以杀死细胞时，可以根据本发明使用本领域已知的具有糖原生成酶刺激活性、糖原分解酶抑制活性、或能调节影响胞内糖原水平的蛋白的活性的试剂和治疗剂。
在本发明的其它实施方案中，可以使用被认为或固有地刺激或增加糖原生成酶的活性、抑制或降低糖原分解酶的活性、或能调节依次导致胞内糖原水平升高的另一种蛋白的活性的试剂和治疗剂，前提是该试剂或治疗剂在本发明之前尚未用于治疗过度增殖的细胞或细胞增殖病(例如，良性增生或肿瘤或癌症).也就是说，根据本发明可以使用本领域已知的且识别出的、或本领域已知的且固有地能刺激或增加糖原生成酶的活性、抑制或降低糖原分解酶的活性、或能调节导致胞内糖原水平升高的蛋白的活性的任何试剂或治疗剂，前提是本领域已知的该试剂和治疗剂在本发明之前尚未用于治疗细胞增殖病。任选地，根据本发明使用的这样的已知的试剂和治疗剂能将糖原水平增加到毒性水平，包括足以杀死靶细胞的量。
本发明包括体内方法.例如，如本文所述，细胞(例如过度增殖的细胞)可以存在受试者中，例如哺乳动物(例如，人受试者)中。该受试者任选地患有细胞增殖病，或者处于患有细胞增殖病的风险 中。根据本发明，可以治疗患细胞增殖病的过度增殖的细胞，以增加胞内糖原，从而诱导毒性。
如本文所使用的，当提及细胞、组织或器官时，术语“细胞增殖病”、“过度增殖”、“过度增殖病”和其表述上的变体是指任何不希望的、过度的或异常的细胞、组织或器官增殖、生长、分化或存活。过度增殖的细胞是指这样的细胞，其增殖、生长或存活超过了对应的参考正常细胞，例如，细胞增殖病的细胞。增殖病和分化病包括疾病和生理状况，良性的增生状况和瘤形成，其特征在于受试者中的不希望的、过度的或异常的细胞数目、细胞生长或细胞存活.这样的疾病的具体实例包括转移性的和非转移性的肿瘤和癌症。
因而，本发明还提供了治疗受试者中的细胞增殖病(例如，良性增生或肿瘤或癌症)的方法。在一个实施方案中，治疗细胞增殖病(其不是肝、肌肉或脑细胞病)的方法包括：在一个或多个患有该病的细胞中表达能增加胞内糖原的量、足以治疗细胞增殖病的基因产物。在另一个实施方案中，治疗细胞增殖病(其不是肝、肌肉或脑细胞病)的方法包括：使一个或多个患有该病的细胞与能增加胞内糖原的量、足以治疗细胞增殖病的试剂相接触.在具体的方面，细胞增殖病包括转移性的或非转移性的癌症。在其它方面，癌细胞存在于头或颈、乳房、食管、嘴、胃、肺、胃肠道、胰、肾、肾上腺、膀胱、结肠、直肠、前列腺、子宫、子宫颈、卵巢、睾丸、皮肤或造血系统。
在另一个实施方案中，治疗细胞增殖病的方法包括：在一个或多个患有该病的细胞中，表达能增加胞内糖原的量、足以治疗细胞增殖病的基因产物。在另一个实施方案中，治疗细胞增殖病的方法包括：使一个或多个患有该病的细胞与能增加胞内糖原的量的试剂接触，前提是该试剂基本上不抑制糖原磷酸化酶同工型的活性或表达，其足以治疗细胞增殖病.在具体的方面，细胞增殖病包括转移性的或非转移性的癌症。在其它方面，癌细胞存在于脑、头或颈、乳房、食管、嘴、胃、肺、胃肠道、肝、胰、肾、肾上腺、膀胱、结肠、直肠、前列腺、子宫、子宫颈、卵巢、睾丸、皮肤或肌肉或造血系统.
还提供了治疗患有肿瘤、或处于患肿瘤的风险中的受试者的方法。在一个实施方案中，肿瘤不是肝、肌肉或脑肿瘤，且方法包括：在一个或多个肿瘤细胞中表达能增加胞内糖原的量、有效地治疗受试 者的基因产物.在另一个实施方案中，肿瘤不是肝、肌肉或脑肿瘤，且方法包括：使一个或多个肿瘤细胞与能增加胞内糖原的量、有效地治疗受试者的试剂相接触.在其它的实施方案中，方法包括：在一个或多个肿瘤细胞中表达能增加胞内糖原的量、有效地治疗受试者的基因产物。在另一个实施方案中，方法包括：使一个或多个肿瘤细胞与能增加胞内糖原的量的试剂接触，前提是该试剂基本上不抑制糖原磷酸化酶同工型的活性或表达，能有效地治疗该受试者。
还提供了治疗正在接受肿瘤疗法或已经接受了肿瘤疗法的受试者的方法。在一个实施方案中，肿瘤不是肝、肌肉或脑肿瘤，且方法包括：给受试者施用能增加细胞中的胞内糖原的量、足以治疗该受试者的试剂。在另一个实施方案中，方法包括：给受试者施用能增加胞内糖原的量的试剂，前提是该试剂基本上不抑制糖原磷酸化酶同工型的活性或表达、足以治疗该受试者。
如本文所使用的，术语“治疗”和其表述变体是指对个体患者施用本发明的规程、方案或方法，其中希望在患者中得到特定的生理效果或结果。由于不是每位治疗的患者都能对特定的治疗规程产生响应，治疗不要求在任何特定的患者或患者群体中都能达到希望的效果。换而言之，某个特定的患者或患者群体可能不对治疗产生响应.
术语“肿瘤”、“癌症”和“瘤形成”在本文中可互换地使用，是指任何细胞或组织来源的细胞或细胞群体，其生长、增殖或存活超过了正常的对应细胞的生长、增殖或存活。这样的疾病包括，例如，癌、肉瘤、黑素瘤、神经的(胚细胞瘤、神经胶质瘤)和网状内皮的、淋巴的或造血的肿瘤性转化病(例如，骨髓瘤、淋巴瘤或白血病).肿瘤包括转移性的和非转移性的类型，且包括任何阶段I、II、III、IV或V肿瘤，或缓解中的肿瘤.
肿瘤可以来自许多原发肿瘤类型，包括但不限于乳房、肺、甲状腺、头和颈、脑、肾上腺、甲状腺、淋巴、胃肠的(嘴、食管、胃、小肠、结肠、直肠)、生殖泌尿道(子宫、卵巢、子宫颈、膀胱、睾丸、阴茎、前列腺)、肾、胰、肝、骨、肌肉、皮肤，且可转移至第二位点.
“实体瘤”是指瘤形成或转移，其一般聚集在一起形成块。具体的实例包括：内脏肿瘤例如黑素瘤、乳房、胰、子宫和卵巢癌、睾丸癌，包括精原细胞瘤，胃或结肠癌，肝细胞瘤，肾上腺的、肾的和膀 胱的癌，肺、头和颈癌和脑肿瘤/癌症。
癌是指上皮的或内分泌组织的恶性肿瘤，包括呼吸系统癌、胃肠系统癌、生殖泌尿系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌和黑素瘤。该术语还包括癌肉瘤，例如，其包括癌的和肉瘤的组织组成的恶性肿瘤.腺癌包括腺组织的癌，或者其中肿瘤形成腺样的结构.黑素瘤是指黑素细胞和源自色素细胞源的其它细胞的恶性肿瘤，其可能产生于皮肤、眼睛(包括视网膜)或身体的其它区域。其它的癌可以形成于子宫/子宫颈、肺、头/颈、结肠、胰、睾丸、肾上腺、肾、食管、胃、肝和卵巢.
肉瘤是指间充质细胞源的恶性肿瘤。示例性的肉瘤包括例如，淋巴肉瘤、脂质肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤和纤维肉瘤。
神经瘤形成包括神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质细胞瘤。
“液体肿瘤”是指网状内皮的或造血系统的瘤形成，例如淋巴瘤、骨髓瘤或白血病，或在性质上是扩散的瘤形成。白血病的具体实例包括急性的和慢性的淋巴母细胞瘤、成髓细胞瘤和多发性骨髓瘤。一般地，这样的疾病源自较差地分化的急性白血病，例如，成红细胞白血病和急性成巨核细胞白血病。具体的骨髓病包括但不限于急性前髓白血病(APML)、急性髓性白血病(AML)和慢性髓性白血病(CML)；淋巴样恶性肿瘤包括但不限于急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，其包括B-谱学系ALL和T-谱学系ALL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、前淋巴细胞性白血病(PLL)、毛细胞性白血病(HLL)和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM)。具体的恶性淋巴瘤包括非-何杰金淋巴瘤和变体、外周T细胞淋巴瘤、成人T细胞性白血病/淋巴瘤(ATL)、皮肤T-细胞淋巴瘤(CTCL)、大颗粒淋巴细胞性白血病(LGF)、何杰金病和Reed-Sternberg氏病.
本发明的方法包括，在受试者的状况中提供可检测的或可测量的改善、即治疗益处的方法。治疗益处是状况中的任何客观的或主观的、瞬时的或暂时的或长期的改善，或者疾病的严重性或不利症状的减轻。因而，当递增地或部分地减轻了一种或多种有关的不利症状或并发症的严重性、持续时间或频率时，或者抑制或逆转了状况的一种或 多种生理的、生化的或细胞的表现或特征时，就实现了令人满意的临床目的.因此，治疗益处或改善(同义地使用“改进”)无需完全破坏所有的靶增殖细胞(例如，肿瘤)或消除与细胞增殖病有关的所有不利症状或并发症。例如，部分地破坏肿瘤细胞块，或甚至通过抑制肿瘤的发展或恶化而使肿瘤稳定化，可以降低死亡率和延长寿命，即使仅仅数天、数周或数月，尽管还存在一部分或大部分肿瘤。
治疗利益的具体的非限制性的实例包括：减小肿瘤体积(大小或细胞块)，抑制肿瘤体积的增加，减慢或抑制肿瘤发展或转移，刺激、诱导或增加肿瘤细胞裂解或细胞凋亡。如本文所公开的，本发明的方法的作用可以是增加肿瘤细胞块，由于糖原毒性诱导的细胞膨胀.因此，肿瘤的细胞膨胀消退后、或细胞裂解或细胞凋亡发生后，肿瘤细胞块会减小。对含有肿瘤的样品(例如，血液或组织样品)进行活组织检查，可以确认肿瘤细胞是否表现出糖原毒性的特征，或是否减小了肿瘤细胞的数目或抑制了肿瘤细胞的增殖、生长或存活.或者，对于实体瘤，侵入性的和非侵入性的成像方法可以确定肿瘤的大小或体积。
可以减少的或降低的与肿瘤、瘤形成和癌症有关的其它的不利症状和并发症包括：例如，恶心、厌食、嗜睡、疼痛和不适.因而，部分地或彻底地减少不利症状的严重性、持续时间或频率、改善受试者的主观感觉(例如提高的体力、食欲、心理良好)都是治疗利益的具体的非限制性的实例。
还认为能导致另一种治疗方案、规程或方法的应用的减少的治疗也是有效的.例如，对于肿瘤，如果其实践能导致治疗肿瘤所需的抗肿瘤或免疫增强疗法(例如化疗药物、放射疗法或免疫疗法)的更低频率或更低剂量，则认为本发明的方法具有治疗益处。
因而，根据本发明，提供了能增强抗肿瘤疗法的有效性的方法。在一个实施方案中，方法包括：给正在接受或已经接受了抗肿瘤或免疫增强疗法(不是针对肝、肌肉或脑肿瘤)的受试者施用能增加胞内糖原的量的试剂和抗肿瘤或免疫增强疗法。在另一个实施方案中，方法包括：给正在接受或已经接受了抗肿瘤或免疫增强疗法的受试者施用能增加胞内糖原的量的试剂，和抗肿瘤或免疫增强疗法，前提是该试剂基本上不抑制糖原磷酸化酶同工型的活性或表达。该试剂可以在 施用抗肿瘤或免疫增强疗法之前、基本上同时或之后施用。
能实现治疗利益或改善的治疗的剂量或“有效量”或“足够量”，可以客观地或主管地改进状况的一个、几个或所有的不利症状或并发症，达到可测量的或可检测的程度，尽管预防或抑制疾病、状况或不利症状的进展或恶化是令人满意的结果.因而，在细胞增殖病的情况下，该量足以为受试者提供治疗利益，或者改善疾病的症状.根据要治疗的疾病的状态或治疗的任何副作用的指示，可以成比例地增加或降低剂量。
当然，一般地与任何治疗方案一样，受试者会对治疗表现出不同的响应。因此，合适的量至少部分地取决于治疗的疾病(例如，良性增生或肿瘤和肿瘤类型或阶段)、期望的治疗效果以及个体受试者(例如，受试者中的生物利用率、性别、年龄等)和受试者基于遗传的和后生的变异性对药物的响应(例如，药物基因组学(pharmacogenomics))。
术语“受试者”和“患者”在本文中可互换地使用，是指动物、一般地为哺乳动物，例如非人的灵长类(大猩猩，黑猩猩，猩猩，猕猴，长臂猿)、家养动物(狗和猫)、农业和牧场动物(马、母牛、山羊、绵羊、猪)、实验室的和实验的动物(小鼠、大鼠、兔子、豚鼠)和人.受试者包括用于体内功效研究的疾病模型(例如，肿瘤或癌症的动物模型)的动物(例如，小鼠和非人的灵长类)。人受试者包括成年人和儿童，例如，新生儿和年长的儿童，年龄为1至5、5至10、10至18之间的和更大的，例如，年龄为60至65、65至70、70至100的。
受试者包括患有细胞增殖病或处于患有细胞增殖病的风险中的人。受试者还包括抗肿瘤或免疫增强疗法的候选者，正在接受抗肿瘤或免疫增强疗法的受试者，和已经接受了抗肿瘤或免疫增强疗法的受试者。
风险受试者包括具有细胞增殖病的家族史、遗传诱因的那些，或已经遭受了前面的细胞增殖病(例如，良性增生、肿瘤或癌症)的痛苦的那些。风险受试者还包括向致癌物或诱变剂的环境暴露，例如吸烟者，或者在工厂或工作场所中的那些。这样的受试者没有被确诊，或者没有表现出细胞增殖病的症状。因而，对与肿瘤有关的基因、基 因缺失或基因突变进行遗传筛选，可以鉴定出在发展细胞增殖病(例如癌症)的风险中的受试者。例如，在发展乳腺癌风险中的受试者缺乏Brcal。例如在发展结肠癌风险中的受试者具有缺失的或突变的肿瘤抑制基因，例如腺瘤性结肠息肉病(APC)。在对细胞增殖病具有特定的遗传诱因风险中的受试者是本领域已知的(见，例如，Genetic Basisof Human Cancer第2版.Bert Vogelstein(编辑)，Kenneth W.Kinzler(编辑)(2002)McGraw-Hill Professional；The Molecular Basis ofHuman Cancer.WB Coleman和GJ Tsongalis(2001)Humana Press和 The Molecular Basis of Cancer.Mendelsohn等，WB Saunders(1995)).
因此，可以预防地治疗风险受试者，以抑制或减小发展细胞增殖病的可能性，或者在已经治愈了细胞增殖病之后，抑制或减少复发相同的或不同的细胞增殖病的可能性。这样的治疗的结果可以是在治疗的风险受试者中部分地或彻底地防止细胞增殖病或其不利症状。
在本发明中有用的核酸包含能编码任何蛋白的序列，所述的蛋白能增加糖原的合成或胞内量，或直接地或间接地有助于糖原积累.因此，这样的序列包含能编码本文所述的任意的和所有的糖原生成酶的序列、和任意的和所有的糖原分解酶的抑制性核酸。
在本发明中有用的其它核酸序列包含能编码蛋白的序列，所述蛋白直接地或间接地调节参与胞内糖原积累的任意蛋白的表达或活性。具体的实例包括：能增加糖原生成酶的表达或活性的蛋白，和能降低糖原分解酶的表达或活性的蛋白。因此，这样的序列包含能调节糖原生成酶和糖原分解酶的转录或翻译的蛋白。这种蛋白的一个具体实例是Notch-1/Hes-1，其能抑制糖原分解酶α-葡糖苷酶(α-glucosisdase)基因的表达(Yan等，J Biol Chem.，277：29760(2002))。因此，根据本发明也可以使用能编码这样的蛋白、或靶向这样的蛋白进行抑制的核酸。
术语“核酸”、“多核苷酸”是指至少2个或多个核糖-或脱氧-核糖核酸碱基对(核苷酸)，它们通过磷酸酯键或等同键相连。核酸包括多核苷酸和多核苷.核酸包括单链的、双链的或三链的环状或线性的分子。核酸分子可以独立地或混合的属于任意的含有核苷酸的分子，例如但不限于RNA、DNA、cDNA、基因组核酸、非基因组核酸、天然的和非天然的核酸和合成的核酸。
核酸可以是任意的长度。在本发明中有用的核酸长度一般为约20个核苷酸至20Kb、10个核苷酸至10Kb、1至5Kb或更小、1000至约500个核苷酸或更小。核酸还可以更短，例如，长度为100至约500个核苷酸，或约12至25、25至50、50至100、100至250、或约250至500个核苷酸。更短的多核苷酸通常称作单链或双链DNA的“寡核苷酸”或“探针”。但是，这样的寡核苷酸的长度没有上限。
多核苷酸包括L-或D-形式和其混合物，还可以修饰它，以在施用给受试者时抗降解。具体的实例包括对存在于受试者的多种组织或体液中的内切核酸酶和外切核酸酶具有抗性的5′和3′键。
核酸包括反义物。如本文所使用的，术语“反义物”是指能结合特定的DNA或RNA序列的多核苷酸或肽核酸.反义物包括单链的、双链的、三链的或更多链的RNA和DNA多核苷酸和肽核酸(PNA)，其能结合RNA转录物或DNA。具体的实例包括能结合有义RNA的RNA和DNA反义物.例如，单链的核酸可以靶向参与细胞中的糖原的代谢、分解代谢、去除或降解的蛋白转录物(例如，mRNA)。反义分子一般与有义链100％互补，但是可以是“部分地”互补的，其中仅仅一些核苷酸结合有义分子(低于100％互补，例如，95％、90％、80％、70％，有时更少).
形成三链体的反义物可以结合双链DNA，从而抑制基因的转录。源自基因的转录起始位点的寡核苷酸，例如在离起始位点-10和+10的位点之间，是具体的实例。
用于抑制基因表达的短干扰RNA(称作siRNA或RNAi)是本领域已知的(见，例如，Kennerdell等，Cell 95：1017(1998)；Fire等，Nature，391：806(1998)；WO 02/44321；WO 01/68836；WO 00/44895，WO 99/32619，WO 01/75164，WO 01/92513，WO 01/29058，WO01/89304，WO 02/16620和WO 02/29858)。通过能编码形成“发夹”结构的RNA的核酸，或通过表达来自编码核酸的每个末端的RNA，制作能杂交的2个RNA分子，可以诱导RNAi沉默.
核酶是能催化RNA的特异性切割的酶促RNA分子，其可以用于抑制编码的蛋白的表达。核酶能与互补的靶RNA形成序列特异性的杂交体，靶RNA然后被切割。具体的实例包括设计的锤头基序核酶分子，其可以特异性地和有效地催化序列的内切核酸降解切割，所述的序列 能编码例如参与糖原的代谢、分解代谢、去除或降解的蛋白。
通过扫描靶分子的切割位点，包括例如GUA、GUU和GUC，可以最初地鉴定出潜在的RNA靶内的核酶切割位点。一旦鉴定出来，就评价与含有切割位点的靶区域相对应的约15至20个核糖核苷酸的RNA序列的二级结构特征，其可能赋予寡核苷酸不可操作性。施用核糖核酸酶保护测定，通过测试与互补的寡核苷酸杂交的可接近性，还可以评价备选的靶序列的适用性。
反义物、核酶、RNAi和形成三链体的核酸在本文中统一称作“抑制性核酸”或“抑制性多核苷酸”。这样的抑制性核酸可以抑制参与胞内糖原的代谢、分解代谢、去除或降解的蛋白、例如糖原分解酶的表达。这样的抑制性核酸可以抑制蛋白的表达或活性，所述蛋白依次抑制有助于糖原的合成或积累的蛋白的表达或活性.通过抑制这样的蛋白的表达或活性，可以缓解参与糖原的合成或积累的蛋白的抑制，并积累胞内糖原。
抑制性多核苷酸不需要表达控制元件来在体内发挥作用.这样的分子可以通过被动扩散被细胞吸收或进入细胞。还可以使用载体(例如病毒载体)将这样的分子导入细胞中。抑制性多核苷酸可以由核酸编码，以便转录它。而且，这样的能编码抑制性多核苷酸的核酸可以可操作地连接到表达控制元件上，以维持或增强编码的反义物在细胞中或体内的表达。
基于在数据库中可以得到的基因序列，可以设计抑制性核酸。例如，如本文所述，示例性的糖原分解酶的Genbank序列是本领域已知的，且可以用于设计抑制性核酸。
具体的抑制性核酸也是本领域已知的。糖原分解酶的反义物的具体实例包括磷酸化酶激酶α2表达调节(美国专利号6,458,591)；磷酸化酶激酶α1表达调节(美国专利号6,426,188)；磷酸化酶激酶β表达的抑制(美国专利号6,368,856)；糖原合酶激酶3β表达调节(美国专利号6,323,029)；糖原合酶激酶3α表达的抑制(美国专利号6,316,259)和肝糖原磷酸化酶表达的调节(美国专利号6,043,091).
siRNA抑制的具体实例包括GSK3α和GSK3β(Yu等，Mol Ther.7：228(2003)).通过转染发夹siRNA载体抑制GSK-3α或GSK-3β，可以提高GSK-3靶β-连环蛋白的表达，并抑制可导致更显著的β-连环 蛋白表达的2种激酶，表明了GSK-3α和GSK-3β的基于载体的siRNA抑制。
核酸还包括核苷酸和核苷取代、添加和缺失，以及衍生的形式和融合/嵌合序列(例如，能编码重组多肽)。例如，由于遗传密码的简并性，核酸包括关于能编码糖原生成酶的氨基酸序列的核酸简并的序列和子序列。其它的实例是与能编码糖原生成酶的氨基酸序列的序列互补的核酸。
核酸缺失(子序列和片段)可以具有约10至25、25至50或50至100个核苷酸。这样的核酸可以用于表达多肽子序列，用于遗传操纵(作为PCR扩增的引物和模板)，和作为探针，以检测细胞、培养基、生物样品(例如，组织、器官、血液或血清)或受试者中的能编码蛋白的序列的存在或量(例如，通过杂交).
术语“杂交”和其表述变体是指核酸序列之间的结合。杂交序列一般与能编码参考序列的氨基酸序列的核酸具有约50％同源性。杂交序列之间的杂交区可以延伸超过至少约10-15个核苷酸、15-20个核苷酸、20-30个核苷酸、30-50个核苷酸、50-100个核苷酸或约100至200个核苷酸或更多.
使用各种标准克隆和化学合成技术，可以生产出核酸.这样的技术包括但不限于核酸扩增，例如用引物(例如简并引物混合物)进行基因组DNA或cDNA靶的聚合酶链反应(PCR)，所述引物能与抗体编码序列退火.通过化学合成(例如，固相亚磷酰胺合成)或基因转录，也可以生产核酸。然后生产的序列可以体外地翻译，或者将其克隆进质粒中，并扩增，然后在细胞(例如，微生物，例如酵母或细菌，真核生物，例如动物或哺乳动物细胞或植物)中表达。
为了表达或操纵，可以将核酸整合进表达盒和载体中。当核酸可操作地连接到表达控制元件时，包含核酸的表达盒和载体可以表达.如本文所使用的，术语“可操作地连接”是指提及的元件之间的物理的或功能的关系，其允许它们以它们的想要的方式运行。因而，表达控制元件“可操作地连接”到核酸是指，控制元件调节核酸转录，和适当时的转录物的翻译.
要可操作地连接的元件不需要物理的连接.最小的元件可以连接到能编码糖原生成酶的核酸。能控制可操作地连接的编码蛋白(其“反 式”地结合最小的元件)的核酸的表达的第二元件可以影响糖原生成酶的表达。因为第二元件调节糖原生成酶的表达，所以第二元件是可操作地连接到能编码糖原生成酶的核酸的，尽管它不是物理地连接的。
术语“表达控制元件”是指能影响可操作地连接的核酸的表达的核酸。启动子和增强子是表达控制元件的具体的非限制性的实例。“启动子序列”是DNA调节区，其能启动下游(3′方向)序列的转录。启动子序列包含能促进转录起始的核苷酸。增强子也调节基因表达，但是可以在远离基因(它与其可操作地连接)的转录起始位点处发挥作用。增强子在基因的5′或3′端、和在基因内(例如，在内含子或编码序列中)发挥作用。其它的表达控制元件包括前导序列和融合配偶体序列，用于生成多基因的内部核糖体结合位点(IRES)元件，或多顺反子的，信使，内含子的剪接信号，维持基因的正确读框以允许mRNA的框内翻译的元件、提供合适的目标转录物的多腺苷酸化作用的多腺苷酸化信号，和终止密码子。
表达控制元件包括“组成型”元件，在不存在信号或刺激时，其中发生可操作地连接的核酸的转录。对信号或刺激作出响应、导致表达的表达控制元件(其增强或降低可操作地连接的核酸的表达)是“可调节的”.能对信号或刺激作出响应、增强可操作地连接的核酸的表达的可调节的元件称作“诱导型元件”。能对信号或刺激作出响应、降低可操作地连接的核酸的表达的可调节的元件称作“阻抑型元件”(即，该信号降低表达；当信号消除或没有时，增强表达)。
表达控制元件包括在特定的组织或细胞类型中有活性的元件，称作“组织特异性的表达控制元件”。组织特异性的表达控制元件一般是在特定的细胞或组织类型中有活性的，因为它们能被转录激活物蛋白或其它的转录调节剂所识别，与其它的细胞或组织类型相比，这些转录激活物在特定的细胞或组织类型是有活性的.
组织特异性的表达控制元件包括在过度增殖的细胞、例如细胞增殖病(包括肿瘤和癌症)中有活性的启动子和增强子。这样的启动子的具体的非限制性的实例是己糖激酶II，COX-2，α-胎蛋白，癌胚抗原，DE3/MUC1，前列腺特异性抗原，C-erB2/neu，端粒酶逆转录酶和缺氧反应启动子。
对于细菌表达，组成型的启动子包括T7，以及诱导型启动子例如噬菌体λ的pL，plac，ptrp，ptac(ptrp-lac杂交体启动子)。在昆虫细胞系统中，可以使用组成型的或诱导型的启动子(例如，ecdysone)。在酵母中，组成型的启动子包括，例如，ADH或LEU2和诱导型的启动子例如GAL(见，例如，Ausubel等，In：Current Protocols in MolecularBiology，卷2，Ch.13，ed.，Greene Publish.Assoc.& WileyInterscience，1988；Grant等，In：Methods in Enzymology，153：516-544(1987)，eds.Wu & Grossman，1987，Acad.Press，N.Y.；Glover， DNA Cloning，卷II，Ch.3，IRL Press，Wash.，D.C.，1986；Bitter，In：Methods in Enzymology，152：673-684(1987)，eds.Berger &Kimmel，Acad.Press，N.Y.；和Strathern等，The Molecular Biologyof the Yeast Saccharomyces eds.Cold Spring Harbor Press，卷I和II(1982))。
对于哺乳动物表达，可以使用病毒的或其它来源的组成型的启动子。例如，可以使用SV40，或病毒长末端重复序列(LTR)等，或源自哺乳动物细胞的基因组的(例如，金属硫蛋白IIA启动子；热休克启动子，类固醇/甲状腺激素/视黄酸反应元件)或源自哺乳动物病毒的(例如，腺病毒晚期启动子；诱导型小鼠乳癌病毒LTR)诱导型启动子。
因此，除了别的以外，本发明的方法包括：将核酸或蛋白导入靶细胞，例如，细胞增殖病的细胞.这样的细胞称作转化的细胞。当提及细胞或生物时使用的术语“转化的”是指，将外源分子、例如蛋白或核酸(例如，转基因)整合进细胞后，该细胞中的遗传变化.因而，“转化的细胞”是这样的细胞，其中或在其后代中已经手工地(例如通过重组DNA技术)导入了外源分子.核酸或蛋白可以在转化的细胞和其后代中稳定地或瞬时地表达。可以繁殖转化的细胞，并表达导入的蛋白，或转录核酸或表达编码的蛋白。后代细胞可以与亲本细胞不同，因为在复制过程中可能发生突变.
转化的细胞包括但不限于原核细胞和真核细胞，例如细菌、真菌、植物、昆虫和动物(例如，哺乳动物，包括人)细胞。在一个具体的方面，细胞是能生产糖原或对糖原毒性敏感的细胞。在另一个具体的方面，细胞是这样的细胞，其包含糖原生成酶、糖原分解酶或参与增 加或降低胞内糖原的其它蛋白的表达控制元件，其可操作地连接至报道分子.细胞可以存在于培养物、许多细胞中的一部分、或离体的组织或器官中，或在受试者中(体内)。
一般地，细胞转化采用“载体”，它是指质粒、病毒(例如病毒载体)、或本领域已知的其它的载体，其可以通过插入或整合核酸来操纵。为了遗传操纵，可以使用“克隆载体”，为了转录或翻译插入的多核苷酸，可以使用“表达载体”。这样的载体可以用于导入核酸，包括能编码糖原生成酶的核酸和能编码抑制性核酸(其可操作地连接至表达控制元件)的核酸，和在细胞中或在受试者体内表达编码的蛋白或抑制性核酸(例如，在溶液中或在固相中)。
载体一般含有用于在细胞中繁殖的复制起点.可以包含存在于载体中的控制元件(包括如本文所述的表达控制元件)，在合适时以促进转录和翻译。
载体可以包含选择标记.“选择标记”是这样的基因，它有利于选择含有该基因的细胞。“阳性选择”是指一个过程，其中含有选择标记的细胞在暴露于阳性选择后仍能存活。抗药性是阳性选择标记的一个实例；含有标记的细胞在含有选择药物的培养基中能存活，而缺少该标记的细胞则会死亡。选择标记包括抗药性基因例如neo，其能赋予对G418的抗性；hygr，其能赋予对潮霉素的抗性和puro，其能赋予对嘌呤霉素的抗性。其它的阳性选择标记基因包括有利于鉴定或筛选含有标记的细胞的基因。这些基因其中包括：荧光蛋白(GFP和GFP-样发色团，萤光素酶)的基因，lacZ基因，碱性磷酸酶基因和表面标记例如CD8。“阴性选择”是指一个过程，其中含有阴性选择标记的细胞在暴露于合适的阴性选择试剂后被杀死。例如，含有单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)基因(Wigler等，Cell 11：223(1977))的细胞对药物丙氧鸟苷(GANC)是敏感的。类似地，gpt基因赋予了细胞对6-硫代黄嘌呤(6-thioxanthine)的敏感性。
包含的病毒载体是基于逆转录病毒、腺伴随病毒(AAV)、腺病毒、呼肠孤病毒、慢病毒、轮状病毒基因组、猿猴病毒40(SV40)或牛乳头瘤病毒的病毒(Cone等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6349(1984)； Eukaryotic Viral Vectors，Cold Spring Harbor Laboratory，Gluzmaned.，1982；Sarver等，Mol.Cell.Biol.1：486(1981))。腺病毒能有效 地感染缓慢复制的和/或终末分化的细胞，且可以用于靶向缓慢复制的和/或终末分化的细胞。用于表达的其它病毒载体包括细小病毒、诺沃克病毒、冠状病毒、副粘病毒和弹状病毒、披膜病毒(例如，辛德比斯病毒和塞姆利基森林病毒(semliki forest virus))和水泡性口膜炎病毒(VSV).
哺乳动物表达载体包括用于体内和离体表达的那些，例如AAV(美国专利号5,604,090).以前已经证实，AAV载体能在人中表达，其水平足以实现治疗利益(Kay等，Nat.Genet.24：257(2000)；Nakai等，Blood 91：4600(1998))。腺病毒载体(美国专利号5,700,470；5,731,172和5,928,944)、单纯疱疹病毒载体(美国专利号5,501,979)、逆转录病毒(例如，慢病毒载体用于感染分裂的以及非分裂的细胞和泡沫病毒)载体(美国专利号5,624,820；5,693,508；5,665,577；6,013,516和5,674,703和WIPO公开WO 92/05266和WO 92/14829)和乳头瘤病毒载体(例如，人和牛乳头瘤病毒)都已经用于基因疗法(美国专利号5,719,054)中.载体还包括基于巨细胞病毒(CMV)的载体(美国专利号5,561,063).已经开发了能有效地将基因输送进肠道细胞中的载体(美国专利号5,821,235；5,786,340和6,110,456)。
通过将蛋白包含在能结合到靶细胞配体或受体的表面上，可以使用含有病毒或哺乳动物载体的病毒微粒或小泡来靶向特定的细胞类型(例如，不希望的增殖细胞)。或者，可以将细胞类型特异性的启动子和/或增强子包含在载体中，以在靶细胞中表达核酸。因而，可以使病毒载体本身、或病毒表面上的蛋白能靶向细胞，以实现体外、离体或体内转化.
通过本领域已知的方法，例如渗透压休克(例如，磷酸钙)、电穿孔、微注射、细胞融合等，也可以将组合物(例如，蛋白和核酸)导入靶细胞中。使用其它的技术，也可以实现核酸和多肽的体外、离体和体内导入。例如，聚合物，例如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素、硫酸鱼精蛋白或丙交酯/乙交酯共聚物、聚交酯/乙交酯共聚物、或乙烯乙酸乙烯酯共聚物。通过凝聚技术或通过界面聚合作用，例如通过分别使用羟甲基纤维素或明胶-微胶囊、或聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，可以将核酸包封在微胶囊中，或在胶体系统中。胶体分散系统包括大分子复 合物、纳米胶囊(nano-capsule)、微球体、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳状液、胶束、混合的胶束和脂质体.
用于将不同的组合物导入细胞的脂质体是本领域已知的，包括例如磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、脂转染试剂和DOTAP(见，例如，美国专利号4,844,904；5,000,959；4,863,740和4,975,282和GIBCO-BRL，Gaithersburg，Md)。用于基因疗法的基于哌嗪的两亲的(amphilic)阳离子脂质也是已知的(见，例如，美国专利号5,861,397).阳离子脂质系统也是已知的(见，例如，美国专利号5,459,127)。
聚合物、微胶囊和胶体分散系统(例如脂质体)在本文中统一称作“小泡”。因此，包括了体外、体内和离体地输送进细胞或组织中的病毒的和非病毒的载体方法.
术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本文中可互换地使用，指通过酰胺键或等同键共价连接的2个或多个氨基酸或残基。多肽的长度没有限制，氨基酸可以连接到非天然的和非酰胺的化学键上，包括例如，与戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯、双功能的马来酰亚胺或N，N′-二环己基碳化二亚胺(DCC)形成的那些。非酰胺键包括例如，酮亚甲基、氨基亚甲基、烯、醚、硫代醚等(见，例如，Spatola in Chemistry andBiochemistry of Amino Acids，Peptides and Proteins，卷7，pp 267-357(1983)，“Peptide and Backbone Modifications，”Marcel Decker，NY).
当用作组合物的修饰语时，术语“分离的”是指该组合物是通过手工制备的，或从其天然存在的体内环境指分离出来的.通常，这样分离的组合物基本上不含有一种或多种它们一般与其天然伴随的物质，例如，一种或多种蛋白、核酸、脂质、碳水混合物、细胞膜。术语“分离的”不排除替代的物理形式，例如多肽多聚体、翻译后的修饰(例如，磷酸化、糖基化)或衍生的形式。
当不含有大多数或全部一般与其天然伴随的物质时，“分离的”组合物也可以是“基本上纯的”。因而，分离的分子也是基本上纯的，不包含存在于众多其它序列中的多肽或多核苷酸，例如抗体库的抗体，或基因组或cDNA库中的核酸。“基本上纯的”分子可以与一个或多个其它分子组合.因而，术语“基本上纯的”不排除组合物的组合。
基本的纯度可以是至少约60％或更大的分子质量。纯度还可以是 约70％或80％或更大，且可以是更大，例如，90％或更大.可以通过任何合适的方法检测纯度，包括例如紫外光谱学、层析(例如，HPLC、气相)、凝胶电泳(例如，银染色或考马斯染色)和序列分析(核酸和肽).
根据本发明使用的核酸、蛋白、试剂和其它组合物包括如本文所述的修饰形式，前提是修饰形式保留未修饰过的或参考的核酸、蛋白、试剂或组合物的至少一部分功能或活性.例如，能编码参与糖原合成的修饰蛋白(例如，糖原生成酶)的核酸可以保留足够的活性，以刺激或增加胞内糖原(修饰过的蛋白可以单独使用，或者与另一种参与糖原合成的蛋白组合使用)，但是相对于参与糖原合成的参考的未修饰过的蛋白，具有升高的或降低的活性。
因而，本发明还使用蛋白、核酸、试剂和其它组合物，其含有示例性的蛋白、核酸、试剂和组合物的修饰.如本文所使用的，当提及组合物(例如蛋白、核酸、试剂或其它组合物)时，术语“修饰”和其表述变体是指源自参考组合物的修饰过的组合物。与参考的未修饰过的蛋白、核酸、试剂或组合物相比，这样的修饰过的蛋白、核酸、试剂和其它组合物可以具有更高的或更低的活性。
多肽修饰包括氨基酸取代、添加和缺失，其也称作“变体”。多肽修饰也包括用一个或多个D-氨基酸取代L-氨基酸(和其混合物)、结构和功能类似物，例如，含有合成的或非天然的氨基酸或氨基酸类似物的肽模拟物(peptidomimetics)，和衍生形式。
多肽修饰还包括融合(嵌合)多肽序列，其是含有一个或多个分子的氨基酸序列，所述分子通常不存在于参考天然(野生型)序列中，共价地附着到该序列上，例如，一个或多个氨基酸。修饰包括环结构，例如分子的氨基和羧基端之间的末端与末端的酰胺键，或分子内的或分子间的二硫键.可以体外或体内修饰多肽(包含抗体)，例如，翻译后地修饰，以包含例如糖残基、磷酸基、遍在蛋白质、脂肪酸或脂质。
“保守取代”是将一个氨基酸替换为生物学上、化学上或结构上类似的残基。生物学上类似是指，该取代与生物学活性(例如酶活性)相容。结构上类似是指，该氨基酸的侧链具有类似的长度，例如丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸，或具有类似的大小。化学上类似是指，该残基具有相同的电荷，或二者都是亲水的或疏水的。具体的实例包括一个 疏水残基的取代，例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另一个，或一个极性残基取代另一个，例如精氨酸取代赖氨酸，谷氨酸取代天冬氨酸，或谷氨酰胺取代天冬酰胺，丝氨酸取代苏氨酸等。
术语“相同”或“同一性”是指，提及的2个或多个实体是相同的。因而，当2个蛋白序列相同时，它们具有相同的氨基酸序列。“同一性区域”是指提及的相同的2个或多个实体的一部分。因而，当2个蛋白序列在一个或多个序列区相同时，它们在该区具有氨基酸同一性。术语“基本的同一性”是指，分子是结构上相同的，或具有参考分子的一个或多个功能(例如，生物学功能)中的至少部分功能。具有基本的同一性的多肽包括，与参考多肽具有50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或更高的同一性的氨基酸序列，前提是修饰的多肽具有至少部分的活性，例如有助于糖原合成或积累。
如本文所使用的，术语“子序列”或“片段”是指全长分子的一部分.蛋白子序列比全长对比序列少一个或多个氨基酸(例如一个或多个内部的或在氨基或羧基端的末端氨基酸缺失)。核酸子序列比全长对比核酸序列少至少一个核苷酸。因此，子序列可以是任意的长度，最高达全长分子.
修饰的形式还包括衍生序列，例如，氨基酸，其中游离的氨基形成盐酸胺、对甲苯磺酰基、苄氧羰基；游离的羧基形成盐、甲基和乙基酯；游离的羟基形成O-酰基或O-烷基衍生物，以及天然存在的氨基酸衍生物，例如，4-羟脯氨酸取代脯氨酸、5-羟赖氨酸取代赖氨酸、高丝氨酸取代丝氨酸、鸟氨酸取代赖氨酸等。使用本领域熟知的众多方法中的任一种，可以产生修饰(例如，基于PCR的定位缺失和插入诱变、化学修饰和诱变、交联等)。
使用本领域已知的方法，可以通过细胞表达或体外翻译使用能编码多肽的核酸的重组DNA技术或化学合成多肽链制备多肽序列。多肽序列也可以通过化学合成仪(见，例如，Applied Biosystems，FosterCity，CA)生产.
本发明可以与任意的其它治疗方案或治疗规程结合实施。本发明的组合物和方法也可以与能提供理想效果的任意的其它试剂或治疗剂相组合。示例性的试剂和治疗剂具有抗肿瘤活性或免疫增强活性。
因此，本发明提供了这样的方法，其中本发明的方法与任意的治疗方案或治疗规程组合使用，例如本文所述的或本领域已知的抗细胞增殖方案。在一个实施方案中，方法包括施用抗肿瘤或免疫增强治疗剂或试剂。抗肿瘤或免疫增强治疗剂或试剂可以在施用能增加胞内糖原的核酸或试剂或治疗剂之前、基本上与其同时或之后施用。
如本文所使用的，“抗肿瘤”、“抗癌”或“抗瘤形成”的试剂、治疗、疗法、活性或效果是指能抑制、降低、减缓、减少或预防增生、肿瘤、癌或瘤形成的生长、转移、增殖或存活的试剂、疗法、治疗方案、规程或方法。抗肿瘤的试剂、疗法或治疗可以如下进行：破坏、抑制或延迟细胞周期进程或细胞增殖；刺激或增强细胞凋亡、裂解或细胞死亡；抑制核酸或蛋白合成或代谢；抑制细胞分裂；或降低、减少或抑制细胞存活，或生产或利用细胞存活因子、生长因子或信号传递途径(胞外的或胞内的).
抗肿瘤疗法的实例包括化学疗法、免疫疗法、放射疗法(离子化或化学的)、局部的或区域的热(过热疗法)疗法和手术切除.
抗细胞增殖和抗肿瘤试剂的具体的非限制性种类包括烷化试剂、抗代谢物、植物提取物、植物生物碱、亚硝基脲、激素、核苷和核苷酸类似物.微生物毒素的具体的非限制性的实例包括细菌霍乱毒素、百日咳毒素、炭疽毒素、白喉毒素和植物毒素蓖麻蛋白。药物的具体实例包括环磷酰胺、咪唑硫嘌呤、环孢菌素A、氢化泼尼松、美法仑、苯丁酸氮芥、氮芥、马利兰、氨甲蝶呤、6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、AZT、5-氮胞苷(5-AZC)和与5-氮胞苷有关的化合物、博来霉素、放射菌素D、光神霉素、丝裂霉素C、卡氮芥、罗氮芥、赛氮芥、链脲霉素、羟基脲、顺氯氨铂、米托坦、甲基苄肼、氮烯唑胺、紫杉醇、长春碱、长春新碱、阿霉素和二溴甘露醇。
放射疗法包括给受试者内部地或外部地输送.例如，可以给受试者外部地施用α、β、γ和X-射线，无需受试者内在化或物理地接触放射性同位素。X-射线剂量范围的具体实例是，从日剂量50至200伦琴持续较长的时间(3至5/周)至单次剂量2000至6000伦琴。剂量变化较大，且取决于暴露时间、同位素的半衰期、发射的放射类型、细胞类型和治疗的位置以及疾病的发展阶段.放射性核素的具体的非限制性的实例包括例如47Sc，67Cu，72Se，88Y，90Sr，90Y，97Ru，99Tc，105Rh， 111In，125I，131I，149Tb，153Sm，186Re，188Re，194Os，203Pb，211At，212Bi， 213Bi，212Pb，223Ra，225Ac，227Ac和228Th。
如这里使用的，当提及试剂、疗法或治疗时使用的术语“免疫增强”是指，该试剂、疗法或治疗能增强、刺激、诱导或促进体液或细胞介导的免疫反应。这样的疗法可以增强一般的免疫反应，或者增强对特定靶的免疫反应，例如，细胞增殖病，例如肿瘤或癌症。
免疫增强剂的具体的非限制性的实例包括生长因子、存活因子、分化因子、细胞因子和趋化因子。其它的实例是单克隆抗体、多克隆抗体和其混合物.能通过肿瘤相关抗原(TAA)结合肿瘤细胞的抗体是免疫增强治疗的一个具体实例.术语“肿瘤相关抗原”或“TAA”是指由肿瘤细胞表达的抗原。
可以被靶向的TAA及相应抗体的具体实例包括例如，M195抗体，其能结合白血病细胞CD33抗原(美国专利号6,599,505)；单克隆抗体DS6，其能结合卵巢癌CA6肿瘤相关抗原(美国专利号6,596,503)；人IBD12单克隆抗体，其能结合上皮细胞表面H抗原(美国专利号4,814,275)和BR96抗体，其能结合结肠、乳房、卵巢和肺癌表达的Lex碳水化合物表位。可以使用的其它的抗肿瘤抗体包括例如，Herceptin(抗Her-2neu抗体)， 
Figure S038A7844619960328D000441
，Zevalin，Bevacizumab(Avastin)，Bexxar， 
Figure S038A7844619960328D000442
，Oncolym，17-1A(Edrecolomab)，3F8(抗成神经细胞瘤抗体)，MDX-CTLA4，IMC-C225(Cetuximab)和Mylotarg.
免疫增强剂和治疗剂的其它实例包括免疫细胞，例如淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞、树突细胞、NK细胞和B-细胞，它们表达针对细胞增殖病的抗体，或者可能产生针对细胞增殖病的免疫反应。能增强或刺激免疫原性的细胞因子包括IL-2、IL-1α、IL-1β、IL-3、IL-6、IL-7、粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子(GMCSF)、IFN-γ、IL-12、TNF-α和TNFβ，它们也是免疫增强剂的非限制性实例。包括MIP-1α、MIP-1β、RANTES、SDF-1、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、嗜酸性粒细胞趋化因子、嗜酸性粒细胞趋化因子-2、I-309/TCA3、ATAC、HCC-1、HCC-2、HCC-3、PARC、TARC、LARC/MIP-3α、CKβ、CKβ6、CKβ7、CKβ8、CKβ9、CKβ11、CKβ12、C10、IL-8、ENA-78、GROα、GROβ、GCP-2、PBP/CTAPIIIβ-TG/NAP-2、Mig、PBSF/SDF-1和淋巴细胞趋化因子在内的趋化因子是免疫增强剂的其它的非限制性的实 例。
本发明还提供了试剂盒，其包含试剂、核酸、蛋白和药物制剂，它们包装在合适的包装材料中，任选地与关于使用试剂盒组分的说明书(例如，关于实现本发明的方法的说明书)组合。在一个实施方案中，试剂盒包含一定量的能增强糖原生成酶的表达或活性的试剂，和在标签或包装插页上的关于给需要治疗的受试者施用试剂的说明书。在另一个实施方案中，试剂盒包含一定量的能降低糖原分解酶的表达或活性的试剂，和在标签或包装插页上的关于给需要治疗的受试者施用试剂的说明书。在另一个实施方案中，试剂盒包含一定量的能增强胞内糖原的积累的试剂，和在标签或包装插页上的关于给需要治疗的受试者施用试剂的说明书。在其它方面，试剂盒还包含抗肿瘤剂或免疫增强剂，例如，烷化剂、抗代谢物、植物生物碱、植物提取物、抗生素、亚硝基脲、激素、核苷类似物、核苷酸类似物或抗体.在其它方面，试剂盒包含例如用于将试剂局部地、区域性地或全身地输送给受试者的制品。
如本文所使用的，术语“包装材料”是指容纳试剂盒组分的物理结构。包装材料可以无菌地维持组分，且可以由通常用于该目的的材料(例如，纸、波纹纤维、玻璃、塑料、箔、安瓿等)制成。标签或包装插页可以包含实现本发明的方法的合适的书面说明书，例如，治疗细胞增殖病，用于鉴定具有抗细胞增殖活性的试剂的测定等。因而，在其它的实施方案中，试剂盒包含标签或包装插页，其包含用于在溶液中、体外、体内或离体地实现本发明的方法的说明书。
因此，说明书还可以包括关于实现本文所述的任何方法的说明。例如，本发明的药物组合物可以与关于给受试者施用以治疗细胞增殖病(例如肿瘤或癌症)的说明书一起包含在容器、包装或分配器中。说明书还可以包含令人满意的临床终点或可能发生的任何不利症状、储存信息、有效期、或管理机构(例如Food and Drug Administration)要求的用于人受试者的任何信息。
说明书可以是在“印刷物”上，例如在试剂盒内的纸或纸版上，在固定到试剂盒或包装材料上、或系在装有试剂盒组分的小瓶或试管上的标签上.说明书可以包含声音或视频磁带，且另外地包含在计算机可读介质上，例如磁盘(软盘或硬盘)、光学CD例如CD-或DVD- ROM/RAM、磁带、电存储介质例如RAM和ROM和它们的混合物，例如磁/光存储介质。
本发明的试剂盒还可以包含缓冲剂、防腐剂、或蛋白/核酸稳定剂。试剂盒还可以包含用于测定活性的对照组分，例如，对照样品或标准物。试剂盒的每个组分可以包装在单个的容器或混合物中，且所有的各个容器可以在一个或多个包装中。
蛋白、核酸、试剂和其它的组合物和本发明的方法还可以使用药物制剂.这样的药物制剂用于体内或离体地施用给受试者。
药物制剂包含“药学上可接受的”和“生理上可接受的”载体、稀释剂或赋形剂。如本文所使用的，术语“药学上可接受的”和“生理上可接受的”包括与药物施用相容的溶剂(水性的或非水性的)、溶液、乳状液、分散介质、涂层、等渗剂和吸收促进或延迟剂。这样的制剂可以包含在液体中；在乳状液、悬浮液、糖浆或酏剂或固体形式中；在片剂(涂覆的或未涂覆的)、胶囊(硬的或软的)、粉末、颗粒、晶体或微珠(microbead)中。补充的化合物(例如，防腐剂、抗细菌剂、抗病毒剂和抗真菌剂)也可以包含在组合物中。
可以使药物制剂与局部的、区域的或全身的施用途径相容。因而，药物制剂包含适用于通过特定途径施用的载体、稀释剂或赋形剂.本发明的组合物的施用途径的具体的非限制性的实例是肠胃外的，例如，静脉内的、皮内的、肌内的、皮下的、经口的、经皮的(局部的)、跨粘膜的、颅内的、眼内的、直肠的施用，和适用于施用方案或要治疗的状况的任何其它剂型。
用于肠胃外的、皮内的或皮下应用的溶液或悬浮液可以包含：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇、或其它的合成溶剂；抗细菌剂，例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，和用于调节张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱调节pH，例如盐酸或氢氧化钠。
用于注射的药物制剂包含无菌水性溶液(这是水溶性的)或分散体和用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸缓冲盐水(PBS)。载体可以使溶剂或分散介 质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其合适的混合物。可以维持流动性，例如，通过使用涂层例如卵磷脂，在分散体的情况下，通过维持需要的颗粒大小，和使用表面活性剂。抗细菌剂和抗真菌剂包括例如，对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸和硫柳汞。组合物中可以包含等渗剂，例如，糖类，多元醇例如甘露醇、山梨醇，氯化钠。通过包含能延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝或明胶，可以延长可注射组合物的吸收。
通过将需要量的活性组合物整合在合适的溶剂(含有一种或上述成分的组合)中，可以制备出无菌注射制剂。通常，通过将活性组合物整合进含有基础分散介质和任何其它成分的无菌载体中，制备出分散体。在用无菌粉末制备无菌注射溶液的情况下，制备方法包括，例如，真空干燥和冻干，这会产生活性成分和任意的其它理想成分(来自先前制备的它们的溶液)的粉末。
对于跨粘膜的或经皮的施用，制剂中使用了适用于要透过的屏障的渗透剂。这样的渗透剂是本领域已知的，对于跨粘膜施用，包括例如去污剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。通过使用鼻喷雾、吸入装置(例如，吸气器)或栓剂，可以实现跨粘膜施用。对于经皮给药，将活性混合物配制进软膏、油膏、凝胶、乳膏或贴剂中。
可以用载体制备药物制剂，所述载体能避免从体内快速消除，例如控释制剂或延时材料，例如单硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯.使用制品也可以输送制剂，例如植入物和微囊化的输送系统，以实现局部的、区域的或全身的持续输送或控释。
可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚乙醇酸(polyglycolic acid)、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。这样的制剂的制备方法是本领域的技术人员已知的.材料还可以从AlzaCorporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.公司商业购得。脂质体悬浮液(包含脂质体，其使用抗体或病毒外壳蛋白靶向细胞或组织)也可以用作药学上可接受的载体。它们可以根据已知的方法制备，例如如美国专利号4,522,811所述。
适用于给药的其它药物制剂是本领域已知的(见，例如，Gennaro(ed.)，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版，Lippincott，Williams & Wilkins(2000)；Ansel等，PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems，第7版，Lippincott Williams& Wilkins Publishers(1999)；Kibbe(ed.)，Handbook of PharmaceuticalExcipients American Pharmaceutical Association，第3版.(2000)；和 Remington′s Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms，Technonic Publishing Co.，Inc.，Lancaster，Pa.，(1993))。
根据本发明使用的包含核酸、蛋白、试剂、治疗剂和药物制剂的组合物可以包装在剂量单位形式中，以方便施用和剂量的统一。本文使用的“剂量单位形式”是指适合用作单位剂量治疗剂的物理上分离的单位；每个单位含有一定量的组合物和载体、赋形剂、稀释剂或介质结合，经过计算它们能产生理想的治疗效果.单位剂量形式取决于许多因素，包括但不一定限于采用的特定组合物、要达到的效果、要治疗的受试者的药物动力学和药物基因组学。
本发明提供了鉴定和筛选具有抗细胞增殖活性和可以用于治疗细胞增殖病(例如，癌症和肿瘤)的试剂和治疗剂的无细胞的(例如，在溶液中，在固相中)和基于细胞的(例如，体外或体内)方法。该方法可以在溶液中进行，使用原核或真核细胞在体外进行，和在体内进行，例如使用疾病动物模型。可以单独使用鉴定出的能增加糖原水平、例如达到毒性水平的试剂和治疗剂，或者与基因转移组合使用，以降低参与糖原的代谢、分解代谢、降解或去除的蛋白(例如，糖原生成酶)的表达或活性，或者增加或刺激参与糖原的合成或积累的蛋白(例如，糖原分解酶或葡萄糖转运蛋白)的表达或活性。
在一个实施方案中，鉴定具有抗细胞增殖活性的试剂的方法包括：使能生产糖原的细胞与实验试剂接触；和在存在实验试剂的情况下或在与实验试剂接触后，测定糖原毒性。糖原毒性将实验试剂鉴定为具有抗细胞增殖活性的试剂.在另一个实施方案中，鉴定具有抗细胞增殖活性的试剂的方法包括：使能生产糖原的细胞与实验试剂接触；和在存在实验试剂的情况下或在与实验试剂接触后，测定细胞生存力。减小的或降低的细胞生存力将实验试剂鉴定为具有抗细胞增殖活性的试剂。
使用未转化的能生产糖原的或能表现出糖原毒性的细胞，可以实现本发明的基于细胞的筛选测定。这样的细胞一般能表达一种或多种糖原生成酶或糖原分解酶，可以测定其表达或活性，以鉴定具有抗细 胞增殖活性的试剂。
因而，在另一个实施方案中，鉴定具有抗细胞增殖活性的试剂的方法包括：使能表达糖原生成酶或糖原分解酶的细胞与实验试剂接触；和在存在实验试剂的情况下或在与实验试剂接触后，测量糖原生成酶或糖原分解酶的活性或表达。糖原生成酶或糖原分解酶的升高的或降低的表达或活性分别将实验试剂鉴定为具有抗细胞增殖活性的试剂。在各个方面，测量了一种或多种糖原生成酶，例如糖原生成蛋白，糖原生成蛋白-2，糖原合酶，糖原生成蛋白相互作用蛋白(GNIP)，蛋白质磷酸酶1(PP-1)，葡萄糖转运蛋白(GLUT)，PP-1同工型或家族成员的靶向糖原的亚基(例如，GL(PPP1R3B，PPP1R4)，PTG(PPP1R3C，PPP1R5)，PPP1R3D(PPP1R6)或Gm/RG1(PPP1R3A，PPP1R3))，己糖激酶同工型或家族成员，谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶，或一个或多个糖原分解酶，例如糖原磷酸化酶，脱支酶，磷酸化酶激酶，葡萄糖-6-磷酸酶，PPP1R1A(蛋白质磷酸酶1，调节抑制剂亚基1A)，PPP1R2(蛋白质磷酸酶1，调节亚基2)，果糖磷酸激酶，糖原合酶激酶-3同工型，GCKR葡糖激酶调节蛋白或α-葡糖苷酶.
或者，在筛选方法中可以使用转化的细胞(例如，用核酸序列转化)。例如，细胞可以是稳定地或瞬时地转化了基因的，该基因的表达由糖原生成酶或糖原分解酶的调节区调节，该基因的表达变化可以指示该试剂是否具有抗细胞增殖活性.具体的实例是用报告基因转化的细胞，该报告基因是指能编码可以检测的蛋白的基因，例如半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、葡萄糖氧化酶、萤光素酶或绿色荧光蛋白.表达可以由选自下述的启动子调节：糖原生成蛋白，糖原生成蛋白-2，糖原合酶，糖原生成蛋白相互作用蛋白(GNIP)，蛋白质磷酸酶1(PP-1)，葡萄糖转运蛋白(GLUT)，PP-1家族的靶向糖原的亚基，己糖激酶家族成员，谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶，糖原磷酸化酶，脱支酶，磷酸化酶激酶，葡萄糖-6-磷酸酶，PPP1R1A(蛋白质磷酸酶1，调节抑制剂亚基1A)，PPP1R2(蛋白质磷酸酶1，调节亚基2)，果糖磷酸激酶，糖原合酶激酶-3同工型，GCKR葡糖激酶调节蛋白或α-葡糖苷酶.
因而，在另一个实施方案中，鉴定具有抗细胞增殖活性的试剂的方法包括：使能表达基因的细胞与实验试剂接触，所述基因的表达由 糖原生成酶或糖原分解酶的调节区调节；和在存在实验试剂的情况下或在与实验试剂接触后；测量该基因的表达，其中该基因的增强的或降低的表达将实验试剂鉴定为具有抗细胞增殖活性的试剂.
用于实现筛选方法的细胞类型的具体的非限制性的实例包括来自对细胞增殖病敏感的任何组织或器官的细胞。例如，细胞包括过度增殖的、无限增殖化的肿瘤和癌细胞系，和源自脑、头或颈、乳房、食管、嘴、胃、肺、胃肠道、肝、胰、肾、肾上腺、膀胱、结肠、直肠、前列腺、子宫、子宫颈、卵巢、睾丸、皮肤、肌肉或造血系统的原代分离物。
在其它的实施方案中，鉴定具有抗细胞增殖活性的试剂的方法包括：提供能增强糖原生成酶的表达或活性的实验试剂；使能表达糖原生成酶的细胞与实验试剂接触；和在存在实验试剂的情况下或在与实验试剂接触后，测定糖原毒性。糖原毒性将实验试剂鉴定为具有抗细胞增殖活性的试剂。
在其它的实施方案中，鉴定具有抗细胞增殖活性的试剂的方法包括：提供能结合糖原生成酶或糖原分解酶的实验试剂；使能表达糖原生成酶或糖原分解酶的细胞与实验试剂接触；和在存在实验试剂的情况下或在与实验试剂接触后，测定糖原毒性。糖原毒性将实验试剂鉴定为具有抗细胞增殖活性的试剂。
在辅助的实施方案中，鉴定具有抗细胞增殖活性的试剂的方法包括：提供能降低糖原分解酶的表达或活性的实验试剂；使能表达糖原分解酶的细胞与实验试剂接触；和在存在实验试剂的情况下或在与实验试剂接触后，测定糖原毒性.糖原毒性将实验试剂鉴定为具有抗细胞增殖活性的试剂.
在其它的实施方案中，鉴定具有抗细胞增殖活性的试剂的方法包括：使糖原生成酶或糖原分解酶与实验试剂接触；和在存在实验试剂的情况下或在与实验试剂接触后，测量糖原生成酶或糖原分解酶的活性。糖原生成酶或糖原分解酶的升高的或降低的活性分别将实验试剂鉴定为具有抗细胞增殖活性的试剂。在各个方面，接触是在无细胞的系统中(例如，在溶液中或在固相中)，或在基于细胞的系统中(例如，体外或体内)进行的。
当提及试剂或治疗剂时使用的术语“接触”是指，该试剂和其它 提及的实体之间的直接的或间接的相互作用。直接相互作用的一个具体实例是结合。间接相互作用的一个具体实例是试剂作用于中间分子，其又作用于提及的实体。因而，例如，使糖原生成酶或糖原分解酶与实验试剂接触包括：使试剂结合酶，或者使试剂作用于中间体，其又作用于该酶。
术语“测量”和“测定”和其表述变体在本文中可互换地使用，是指定性的或定量的确定，或定性的且定量的确定。当提及糖原水平、糖原或细胞毒性或酶(例如，糖原生成酶或糖原分解酶)的表达或活性等使用该术语时，预期测定糖原水平、毒性或酶的表达或活性等的所有方法，包括本文所述的和本领域已知的各种方法。例如，可以如下所述测定糖原毒性：筛选一种或多种与糖原毒性有关的形态学变化；筛选细胞生存力；筛选细胞增殖、生长或存活的抑制或减少。
实验试剂和治疗剂可以用于任意的原核或真核细胞，其中的糖原可以测量，或其生长、增殖或生存力可以检测。例如，无限增殖化的、过度增殖的或肿瘤或癌细胞可以在一定的条件下在培养基中生长一定的时间，该时间足以允许接触和测量或检测糖原积累、糖原毒性或减少的细胞生长、增殖、存活或生存力。
通过本领域已知的多种方法，可以检测糖原积累.示例性的方法如实施例1所述，其涉及葡糖淀粉酶介导的糖原向葡萄糖的水解，然后进行比色定量。将该值表达为μg还原的葡萄糖/百万细胞。已经开发了能测量葡萄糖向糖原的整合的高通量筛选测定(Berger J，Hayes NS.Anal Biochem.1998Aug 1；261(2)：159)，且可以用于测量糖原积累，以鉴定能增强或刺激胞内糖原积累的试剂和治疗剂。http://neo.pharm.hiroshimau.ac.jp/ccab/2nd/mini_review/mr32/yano.html
组织学分析也可以用于检测糖原.例如，使用McMannus氏过碘酸希夫(PAS)染色，可以在组织切片中观察到糖原。该染色是组织化学反应，因为过碘酸能氧化形成醛的碳碳键，所述的醛与能产生洋红色的品红-亚硫酸试液反应.或者，使用例如电子显微镜，能结合糖原的单克隆抗体和免疫金颗粒组合可以检测糖原(Baba，O.KokubyoGakkai Zasshi.60：264(1993))。
可以直接地或间接地确定糖原含量。例如，将放射标记的葡萄糖、例如[13C或14C]-葡萄糖整合进糖原，然后进行射线照相定量。确定糖 原的一个替代方法是，使用葡糖淀粉酶水解成葡萄糖单体，并通过比色测量还原的葡萄糖，例如，用葡萄糖Trinder比色试剂(Sigma，St.Louis，MO)(Kepler和Decker..In：Methods of Enzymatic Analysis，Eds.H.U.Bergenmeyer和K.Gawehn，Academic Press，New York，4：1127-1131(1974))。另一种糖原测定是用蒽酮试剂(Lab Express，Inc.Fairfield，New Jersey)比色检测酸还原的葡萄糖(Seifter等，Arch.Biochem.25：191(1950))。这些测定也可以用于高通量筛选能增加或刺激胞内糖原积累的试剂和治疗剂。
也可以体内检测糖原水平。例如，傅里叶变换红外光谱学已经用于确定人组织中的糖原水平(Yano K.，Evaluation Of Glycogen LevelsIn Human Carcinoma Tissues By Fourier Transform InfraredSpectroscopy.“Trends in Analytical Life Sciences”卷1(CCAB97)CyberCongress on Analytical BioSciences held on Internet Aug.21，1997)。NMR光谱学是连续地体内研究肌肉糖原代谢的非侵入性的方法(Roden和Shulman，Annu Rev Med.50：277(1999)).
在本领域已知的许多基于比色、发光、辐射测量或荧光测定的方法中，可以测量细胞毒性。用于确定细胞生存力的比色技术包括例如，锥虫蓝排斥(见，例如，实施例1和2).简而言之，用锥虫蓝对细胞染色，并使用血细胞计数器计数。活细胞排斥染料，而死亡的和垂死的细胞则摄入蓝色染料，并且在光学显微镜下能容易地区别开.中性红能被活细胞吸收，并浓缩在细胞的溶酶体中；通过定量中性红染色的细胞的数量，可以使用光学显微镜确定活细胞.四氮唑盐(例如MTT，XTT，WST-1)可以在比色测定方法中用于定量细胞生存力(Roche Diagnostics Corp.Indianapolis，IN).在线粒体(其仅仅在代谢完整的细胞中有活性)的呼吸链中，“琥珀酸盐-四氮唑还原酶”系统能将四氮唑盐切割成甲 .
确定细胞生存力的荧光技术包括例如，碘化丙啶、荧光DNA嵌入剂。碘化丙啶被活细胞排斥，但是能对死细胞的核染色。然后可以使用碘化丙啶标记的细胞的流式细胞仪来定量活的和死的细胞。AlamarBlue测定(Alamar Biosciences Inc Sacramento CA)采用氧化还原指示剂，它能改变代谢活性引起的颜色或荧光，并用于定量哺乳动物细胞的生存力或增殖.可以用分光光度法(荧光)测量Alamar Blue。乳 酸脱氢酶(LDH)的释放指示细胞的结构损伤和死亡，且可以通过分光光度酶测定来测量。溴脱氧尿苷(BrdU)能整合在新合成的DNA中，且可以用荧光染料标记的抗体检测。荧光染料Hoechst 33258能标记DNA，且可以用于定量细胞的增殖(例如，流式细胞仪)。定量整合的荧光染料羧基荧光素二醋酸琥珀酰亚氨基酯(CFSE或CFDA-SE)可以提供细胞分裂分析(例如，流式细胞仪)。该技术可以体外或体内地使用.7-氨基放射菌素D(7-AAD)是荧光嵌入剂，其与DNA结合后会发生光谱移位，且可以提供细胞分裂分析(例如，流式细胞仪)。
确定细胞增殖的辐射测量技术包括例如，[3H]-胸苷，其能整合进活细胞的新合成的DNA中，并经常用于确定细胞的增殖.通过闪烁计数可以定量死细胞的铬(51Cr)-释放，以定量细胞生存力。
检测细胞生存力的发光技术包括例如，CellTiter-Glo发光细胞生存力测定(Promega Madison WI)。该技术能定量存在的ATP的量，以确定活细胞的数目。
市场上可买到的用于检测细胞生存力和细胞增殖的试剂盒包括例如，细胞增殖Biotrak ELISA(Amersham Biosciences Piscataway，NJ)；Guava ViaCountTM Assay，其能基于荧光试剂的摄入差异提供快速的细胞计数和生存力确定(Guava Technologies，Hayward，CA)； 细胞增殖测定试剂盒(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)；和 
Figure S038A7844619960328D000532
测定试剂盒(PerkinElmer Life Sciences Inc.，Boston，MA)。 
Figure S038A7844619960328D000533
测定试剂盒(PerkinElmer Life Sciences Inc.，Boston，MA)可以使用时间分辨的荧光方法检测细胞增殖和毒性。BRET2(生物发光共振能量转移)是高级的、非破坏性的测定技术，用于监控活细胞中的蛋白-蛋白相互作用和胞内信号传递事件(PerkinElmer LifeSciences Inc.，Boston，MA)。BRET2是基于生物发光供体蛋白向荧光受体蛋白的共振能量转移的，使用Renilla萤光素酶(Rluc)作为供体，绿色荧光蛋白(GFP 2)的突变体作为受体分子。BRET2类似于荧光共振能量转移(FRET)，但是不需要激发光源和与其相关的问题(例如自身荧光造成的高背景).细胞死亡检测ELISA是用于体外定量确定细胞死亡后的与胞质组蛋白有关的DNA片段(单-和寡-核小体)的光度酶免疫测定(Roche Diagnostics Corp.，Indianapolis，IN)。LDH细胞毒性检测试剂盒能测量从损伤的细胞释放出的乳酸脱氢酶 (LDH)(Takara.Mirus.Bio，Madison，WI)。QuantosTM细胞增殖测定是基于荧光的测定，其测量来自裂解的细胞的DNA-染料复合物的荧光(Stratagene，La Jolla，CA)。CellTiter-Glo细胞生存力测定是用于测量细胞生存力的发光测定(Promega，Madison WI)。
实验试剂和治疗剂是可以购得的，或可以使用本领域已知的组合文库方法中的众多方法中的任一个来生产，包括：生物学文库；空间上可接近的平行的固相或溶液相文库；需要去卷曲的合成文库方法；“一个珠子一种化合物”文库方法；和使用亲合层析选择的合成文库方法。生物学文库方法限于肽文库，而其它的方法可以用于肽、非肽的寡聚物或化合物的小分子文库.
分子文库的合成方法是本领域已知的(见，例如，DeWitt等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6909(1993)；Erb等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：11422(1994)；Zuckermann等，J.Med.Chem.37：2678(1994)；Cho等，Science 261：1303(1993)；Carrell等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2059(1994)；Carell等，Angew.Chem.Int Ed.Engl.33：2061(1994)和Gallop等，J Med.Chem.37：1233(1994))。化合物文库可以存在于溶液(例如，Houghten，Biotechniques 13：412(1992))或珠子(Lam，Nature 354：82(1991))、芯片(Fodor Nature364：555(1993))、细菌(美国专利号5,223,409)、孢子(美国专利号5,233,409)、质粒(Cull等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1865(1992))或噬菌体(Scott和Smith，Science 249：386(1990)；Devli Science 249：404(1990)；Cwirla等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：6378(1990)；Felici，J.Mol.Biol.222：301(1991)和美国专利号5,233,409).
作为鉴定能增加细胞中的糖原的试剂或治疗剂的体外测定的一个实例，细胞可以在组织培养微量滴定板中生长。这些微量滴定板可以是适用于测量糖原积累或细胞毒性的任何形式。为了进行该测定，可以在适合细胞系生长的条件下，以合适的细胞密度，将细胞系(例如，癌细胞系)接种到板上。可以将实验试剂以各种浓度和各种剂型手工地或自动地应用于细胞，例如使用机器人装置。或者，可以对细胞进行实验处理，例如改变温度、pH、充氧作用(例如，缺氧)、盐或离子浓度等。细胞糖原积累或细胞毒性的确定取决于采用的具体测定，如本文所述的或本领域已知的.例如，发光计可以用于确定基于发光的 实验的结果，荧光计或流式细胞仪可以用于定量基于荧光的测定，闪烁计数器可以用于检测基于辐射测量的测定的结果，等.
除非另有定义，本文使用的所有技术和科技术语都具有与本发明技术领域内的普通技术人员的通常理解一样的含义。尽管与本文所述相似的或等同的方法和材料可以用于实践或验证本发明，本文还是公开了合适的方法和材料。
本文引用的所有出版物、专利、Genbank登记号和其它参考文献都整体引作参考。在有冲突的情况下，以本说明书为准，包括定义。
如本文所使用的，单数形式的“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数形式，除非上下文中清楚地另有说明。因而，例如，“一个基因或核酸”的表述包括多个基因或核酸，“一个细胞”的表述包括全部或部分细胞或许多细胞，等。
已经描述了本发明的许多实施方案。然而，应当明白，可以进行许多改变而不背离本发明的精神和范围.因此，下面的实施例意在解释而非限制权利要求书所述的发明范围。
实施例
实施例1
该实施例描述了各种示例性的材料和方法。
重组腺病毒载体：合成的寡核苷酸设计用于扩增人GL cDNA的可读框(SEQ ID NO：3-GenBank登记号XM_015545，位置10碱基对至1183碱基对)(SEQ ID NO ：1-有义引物GACCAATTGTCGCGCTTGCCA CAACC；SEQ ID NO：2-反义引物CTGCTCGAGCGCGCCAGCCA CCACT)。使用聚合酶链反应(PCR)，从人胎儿肝Marathon cDNA文库(Clontech，Inc.)扩增了1192个碱基对的片段。将该片段再克隆进pBluescript(Stratagene，Inc.)的EcoRV位点，生成pSSBS-GL。用三重覆盖率，对该质粒测序。将含有人GL cDNA的pSSBS-GL的HincII片段亚克隆进Adeno-X表达系统(Clontech，Inc.)的pShuttle的PmeI位点，生成pShuttle-hsGL。
通过PCR(SEQ ID NO：4-有义引物GGCAATTGAACGGCTAGCCTGAGGAGCTGC；SEQ ID NO：5-反义引物CCACTAGTGCGGTTCCCTGCTCTCTGTCG)，扩增了热休克蛋白70的5′非翻译区中的 翻译增强子元件(SEQ ID NO：6-来自Genbank登记号AC020768，与M11717对应，位置276碱基对至488碱基对)，并将213个碱基对的片段亚克隆进pNEB193载体(New England Biolabs，Inc.)的SmaI位点。用三重覆盖率，对得到的克隆进行测序。将257个碱基对的XbaI/SpeI片段平端克隆进pShuttle-GL中的GL cDNA的唯一的NheI位点5′，生成pShuttle-hspGL。
通过PCR(SEQ ID NO：7-有义引物TCGGGATCCAATCAACCTCTGGATTACA；SEQ ID NO：8-反义引物TGCTCTAGACAAGCAACACGGACC)，扩增了土拨鼠乙型肝炎病毒中的转录增强子元件(WPRE)(SEQ ID NO 9：Genbank登记号J02442，位置1093碱基对至1714碱基对)，并将641个碱基对的片段亚克隆进pGEM-T载体系统(Promega，Inc.)中.用三重覆盖率，对得到的克隆进行测序。将含有WPRE元件的NotI/XbaI限制片段克隆进GL cDNA的3′，生成pShuttle-GL WPRE。
使用Clontech的Adeno-X表达系统来生成用于该研究的腺病毒载体。根据生产商的说明，将空的pShuttle载体、pShuttle-GL、pShuttle-hspGL和pShuttle-GL WPRE转移进Adeno-X腺病毒基因组中，分别生成重组腺病毒载体AdpSh、AdGL、AdhspGL和AdGL WPRE。根据Clontech的Adeno-X表达系统的说明书，用腺病毒载体DNA转染HEK 293细胞，生产粗腺病毒原液。根据生产商的说明书，使用Adenopure腺病毒纯化试剂盒(Puresyn，Inc.)纯化出腺病毒颗粒。
细胞培养：从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)得到了HeLa(人子宫颈上皮腺癌)、MCF7(人乳房上皮腺癌)和LoVo(人结肠直肠上皮腺癌)细胞系。在添加了5％热灭活的胎牛血清(FBS)、2mM谷氨酰胺、青霉素(100 U/ml)-链霉素(100μg/mg)和2.2g/L NaHCO3的高-葡萄糖Dulbecco氏最小必需培养基(DMEM，Gibco#12800-017)中培养HeLa和MCF7细胞。在添加了5％热灭活的FBS、2mM谷氨酰胺、青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/mg)和2.2g/L NaHCO3的Kaighn氏改进的Ham氏F-12培养基(F-12K，ATCC)中培养LoVo细胞。
将培养的细胞系接种到6或12孔组织培养板上。当它们达到70-85％汇合时，用各种量的重组GL腺病毒或对照腺病毒感染细胞.将腺 病毒加到每个孔中的300μl培养基中，在37℃、5％CO2温育2小时。温育后，加入1.5ml培养基，在37℃、5％CO2温育.每天更换培养基。在感染后的各个时间点，使用锥虫蓝计数活细胞，并收集剩余的细胞，冷冻用于后续的糖原测量。
锥虫蓝生存力细胞计数：使用锥虫蓝(0.4％、Gibco)对死细胞和垂死的细胞进行染色。使用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Gibco #25200-056)，从组织培养板取下细胞，重新悬浮到1ml磷酸缓冲盐水(PBS)中。使用Neubauer血细胞计数器，进行手工细胞计数。
糖原测定：根据Keppler和Decker(Keppler和Decker，1984 in： Methods of Enzymatic Analysis第3版.(Bergmeyer，H.U.Bergmeyer，J.，和Grab，M.Eds.)，卷6，pp.11-18，VCH，New York.)，并进行一些改进，进行酶促的糖原向葡萄糖的水解。简而言之，对冷冻的细胞沉淀进行3轮的冻融，以破碎细胞膜。将细胞沉淀重新悬浮到200μl250mU葡糖淀粉酶(在0.2M醋酸钠缓冲液中，pH 4.8)中。
在摇动下，将裂解物在45℃温育2小时。通过在2500rpm离心10分钟，澄清裂解物。将上清液(5μl)和葡萄糖标准物转移到96孔板上，用10μl 0.25N氢氧化钠中和。然后用葡萄糖Trinder比色剂(Sigma，315-500)确定葡萄糖。使用分子装置VERSAmax微量培养板读数器，在505nm测量颜色反应的强度.
roscovitine研究：roscovitine(Calbiochem #557362)，[2-(R)-(1-乙基-2-羟乙基氨基)-6-苄基氨基-9-异丙基嘌呤]，是依赖于细胞周期蛋白的激酶Cdk2和Cdc2的有效的选择抑制剂.在二甲基亚砜(DMSO)中制备了roscovitine原液，并储存在-20℃备用。将药物稀释在培养基中，并以35μM的终浓度使用。在所有情况下，未处理的细胞的表现与单独用DMSO处理的细胞相同。在用腺病毒转导后24小时，将roscovitine加入细胞培养物中，并温育48至72小时。然后收集细胞，进行锥虫蓝生存力计数和糖原测量。
实施例2
该实施例描述的数据表明，将能编码增加胞内糖原的蛋白的基因转移到细胞中，可以将糖原增加到对该细胞有毒性的水平。
将能编码靶向糖原的亚基家族的成员(其能将PP-1靶向糖原颗 粒)的核酸克隆进了重组腺病毒载体中，以在靶人癌细胞系中表达。将能编码野生型人GL蛋白的cDNA克隆进如实施例1所述的腺病毒载体中。将能表达GL cDNA的重组腺病毒载体命名为AdGL。由于腺病毒自身在高剂量时可以是对细胞有毒性的，所以生产了与AdGL相同、但是缺少GL cDNA的对照载体，并命名为AdpSh。
使用从重组病毒载体生产的高滴度腺病毒颗粒来感染如实施例1所述的各种人癌细胞系。简而言之，将人子宫颈上皮腺癌细胞系(HeLa)培养至约70％汇合，然后用AdGL或对照AdpSh感染。24小时后，观察AdGL-感染的细胞与AdpSh-处理的细胞相比的形态学变化。另外，AdGL-感染的细胞的尺寸更大，且观察到了细胞更加变圆。
使用锥虫蓝排斥实验，估计了病毒感染后的细胞生存力.使用Neubauer血细胞计数器，对用锥虫蓝染色的细胞和活细胞进行计数。活细胞排斥染料，而死的和垂死的细胞则摄入蓝色染料，并且在光学显微镜下能容易地区别开.
感染后72小时，与对照AdpSh-处理的细胞相比，在AdGL-处理的细胞中观察到了明显的锥虫蓝摄入.因而，GL的超表达在HeLa细胞系中诱导了死亡。
用AdGL感染HeLa细胞后，观察到的细胞生存力的减小和糖原的增加是时间和病毒剂量依赖性的。HeLa细胞感染了200感染复数(MOI)或1000 MOI的AdGL或AdpSh腺病毒(图1)。将来自AdGL-感染的细胞的能排斥锥虫蓝的活细胞的数目与对照AdpSh-感染的细胞的比率表达为百分比(图1，图A)。结果表明，AdGL-感染的细胞的生存力随时间过去降低.
病毒剂量的增加也降低了AdGL-感染的细胞的生存力.在感染了AdGL的细胞中，在200至1000的增加的感染复数(MOI)，观察到了源自葡糖淀粉酶-还原的糖原的葡萄糖的剂量依赖性的增加(图1，图B)。相反地，在任一个感染复数，感染了对照AdpSh的细胞产生了最小的非特异性的源自葡糖淀粉酶-还原的糖原的葡萄糖积累(图1，图B)。
结果表明，糖原积累的增加与细胞生存力的降低有关。这些发现证实了GL的超表达所诱导的糖原积累会导致细胞死亡。
为了证实该策略对过度增殖的癌细胞的总体可用性，使用AdGL 腺病毒感染了2种其它的如实施例1所述的细胞系。GL在人乳房上皮腺癌(MCF7)和人结肠直肠上皮腺癌(LoVo)中的超表达导致了与HeLa细胞系类似的细胞生存力的降低和源自葡糖淀粉酶-还原的糖原的葡萄糖的增加(图2)。这些数据证实了能表达GL的腺病毒所诱导的糖原积累一般能杀死癌细胞.
实施例3
该实施例描述的数据显示在细胞中转移与能抑制细胞生长的药物组合的编码增加胞内糖原的蛋白的基因，将增加糖原积累和细胞死亡。
roscovitine是依赖于细胞周期蛋白的激酶Cdk2和Cdc2的有效的选择性抑制剂，且是细胞抑制性的。为了研究该药物与AdGL组合使用时，是否会增加糖原的积累和相应地降低细胞生存力，用AdGL或AdpSh腺病毒(500 MOI)感染了HeLa细胞，随后加入35μM roscovitine(图3).
AdGL和roscovitine的组合显著地增加了在感染的HeLa细胞中的糖原的量.相反地，在有或没有roscovitine的情况下，未感染的对照细胞没有表现出显著的糖原积累的增加(图3，图A).对于roscovitine-处理的和未处理的细胞，将来自AdGL-感染的细胞的排斥锥虫蓝的活细胞的数目与对照AdpSh-感染的细胞的比率表达为百分比(图3，图B)。
因此，数据证实了，能抑制、减少或阻止癌细胞生长的化合物可以与能表达糖原生成酶的载体(例如，腺病毒GL)组合使用，以将糖原增加到对癌细胞有毒性的水平。而且，相对于在靶细胞中单独表达糖原生成酶，增加了得到的糖原的量。
实施例4
该实施例描述的数据表明，可以对基因转移载体进行修饰，以增加基因的表达水平。
为了增加GL cDNA的表达水平，将2个核酸增强元件与AdGL载体对比了它们的降低细胞生存力的能力(图4).第一个元件能提高mRNA翻译的效率，最初是在人热休克蛋白-70(hsp70)基因的5′非翻 译区(5′UTR)鉴定出来的(Vivinus等，Eur J Biochem.268：1908(2001))。将该元件整合进AdGL载体，从而生成了如实施例1所述的AdhspGL。命名为WPRE的第二个元件是在土拨鼠肝炎病毒中鉴定出来的，是顺式作用的RNA转录后调节元件(Donello等，J Virol.72：5085(1998))。将WPRE整合进AdGL载体中，从而生成了如实施例1所述的AdGLWPRE。
如前所述，用每种病毒载体(500MOI)单独地感染了HeLa细胞。将来自病毒感染的细胞的排斥锥虫蓝的活细胞的数目与对照AdpSh-感染的细胞的比率表达为百分比。hsp705′UTR元件不能显著降低感染的HeLa细胞的生存力。与单独的AdGL相比，WPRE元件的整合导致细胞生存力降低了约1.5倍。因而，对基因转移载体的遗传修饰可以提高目标基因、例如GL的表达，由此增加糖原积累，并依次降低细胞生存力.
实施例5
该实施例描述了几个示例性的鉴定抑制试剂的α-葡糖苷酶活性测定.
简而言之，将10μl实验试剂溶液和990μl底物溶液(10mM麦芽糖)加到装有α-葡糖苷酶固定化的琼脂糖(10mg-湿凝胶)的末端加帽的小柱中。通过加入1.0ml含有10mM麦芽糖的模型肠液启动测定。在37℃温育30分钟后，通过葡萄糖CII-实验(Wako Pure ChemicalCo.，日本)定量释放出的葡萄糖。基于有或没有实验试剂的情况下的滤液中的葡萄糖量的差异，计算抑制活性。将在测定条件下能抑制50％的α-葡糖苷酶活性的实验试剂的量定义为IC50(Matsumoto等，Analytical Sciences，18：1315(2002)).
鉴定能抑制α-葡糖苷酶的试剂的其它示例性测定是针对α-葡糖苷酶(酵母，I型，Sigma Chemical Co.生产)以及从猪肠粘膜制备出的麦芽糖酶和蔗糖酶(根据Borgstrom和Dahlgvist在Acta Chem.Scand.，12：1997(1958)中所述的方法制备)的实验试剂。当麦芽糖和蔗糖用作底物时，将0.25ml-葡糖苷酶溶液(通过用0.02M磷酸盐缓冲液(pH 6.8)稀释制备)与0.5ml在相同缓冲液中的实验试剂的溶液相混合，且用0.25ml在相同缓冲液中的0.05M麦芽糖或0.05M蔗 糖作为底物。使混合物在37℃反应10分钟。然后加入葡萄糖B-实验试剂(3ml；它是用于葡萄糖测量的葡萄糖氧化酶试剂，Wako PureChemical Co.，日本)，使混合物在37℃温育20分钟。随后在505nm测量反应溶液的吸光度。
通过向0.25ml含有0.005mg/mlα-葡糖苷酶的0.02M磷酸盐缓冲液(pH 6.8)中加入0.5ml在相同缓冲液中的实验试剂溶液和0.25ml在相同缓冲液中的0.01M对硝基苯基-α-D-吡喃型葡糖苷酶溶液，使混合物在37℃反应15分钟，确定了当对硝基苯基-α-D-吡喃型葡糖苷酶用作底物时，实验试剂对α-葡糖苷酶(酵母，I型，Sigma Chemical Co.)和葡糖淀粉酶(根霉属(Rhizopus)霉菌，Sigma Chemical Co.)的抑制活性.加入碳酸钠溶液(3ml，0.1M)终止反应，在400nm测量吸光度。通过3至5个不同的实验试剂浓度确定抑制速度(％)，由此计算50％抑制浓度。
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Claims (17)

1.基因产物在制备将过度增殖细胞中的糖原增加到毒性水平的药物中的用途，所述基因产物能将所述细胞中的糖原的量增加到抑制或减少所述细胞的增殖、生长或存活的水平而且所述基因产物为蛋白质磷酸酶1同工型或家族成员的靶向糖原的亚基。
2.权利要求1的用途，其中所述的糖原的量造成所述细胞的裂解或细胞凋亡。
3.权利要求1的用途，其中所述的PP-1家族成员的靶向糖原的亚基包含蛋白质磷酸酶1的调节亚基3B、蛋白质磷酸酶1的调节亚基3C、蛋白质磷酸酶1的调节亚基3D或蛋白质磷酸酶1的调节亚基3A。
4.权利要求1的用途，其中所述的过度增殖细胞包含转移性的或非转移性的癌细胞。
5.权利要求4的用途，其中所述的癌细胞存在于头或颈、乳房、食管、肺、胃肠道、肝、胰、肾、肾上腺、膀胱、结肠、直肠、前列腺、子宫、卵巢、睾丸、皮肤、肌肉或造血系统中。
6.权利要求5的用途，其中所述的癌细胞存在于脑、嘴、胃或子宫颈。
7.权利要求4的用途，其中所述的过度增殖细胞存在于受试者中。
8.权利要求7的用途，其中所述的受试者是哺乳动物。
9.权利要求7的用途，其中所述的受试者是人。
10.权利要求1的用途，其中所述的基因产物是由多核苷酸编码的。
11.权利要求10的用途，其中所述的多核苷酸包含载体。
12.权利要求10的用途，其中所述的载体包含病毒或哺乳动物表达载体。
13.权利要求10的用途，其中所述的多核苷酸包含在小泡中。
14.权利要求1的用途，其中基因产物的表达是由在过度增殖的细胞中有活性的启动子赋予的。
15.权利要求14的用途，其中所述的启动子包含己糖激酶II，COX-2，α-胎蛋白，癌胚抗原，DE3/MUC1，前列腺特异性抗原，C-erB2/neu，端粒酶逆转录酶或缺氧反应启动子。
16.权利要求1的用途，还包括在细胞中表达抑制细胞增殖的第二种蛋白。
17.权利要求16的用途，其中所述的第二种蛋白包含细胞周期抑制剂。
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