CN101443047A - 在哺乳动物细胞中Li表达的抑制作用 - Google Patents

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Abstract

本发明直接指向包括细胞中1i表达的抑制作用从而达到改变抗原呈递途径的目的的组合物和方法。更具体的，在这里公开的是与II类MHC分子抗原决定簇呈递相关的组合物和方法，其中所述抗原决定簇在正常情况下与II类MHC分子联合呈递。本发明涉及能够正常表达II类MHC分子的细胞或能够被诱导从而正常的表达II类MHC分子的细胞内的呈递作用。在这里尤其开了关于1i的RNA推论的实施方案。

Description

在哺乳动物细胞中Li表达的抑制作用
背景技术
[0001]通过T淋巴细胞识别那些抗原的肽片段，能够调节对特异性抗原的免疫反应。在抗原呈递细胞之内，被处理抗原的肽片段与主要组织相容性复合体(MHC)分子的抗原肽结合位点相连。然后，这种肽-MHC复合物被传递到细胞表面，从而能够被辅助细胞上的T细胞受体或细胞毒性T淋巴细胞识别(识别外源肽和本MHC分子的邻接面)。存在两类能够供给肽的MHC分子，I类MHC分子和II类MHC分子。
[0002]I类MHC分子将抗原呈递到CD8-细胞毒性阳性T-淋巴细胞中，之后，抗原被活化并能够直接杀死抗原呈递细胞。在内质网中，在其合成时刻左右，I类MHC分子只接受来自内源合成蛋白的肽，例如有传染性的病毒。
[0003]Il类MHC分子呈递抗原到CD4-阳性辅助T-淋巴细胞(T辅助细胞)中。一旦被活化，T辅助细胞能够通过直接接触和细胞因子释放促进细胞毒性T淋巴细胞的活化。与I类MHC分子不同，Il类MHC分子结合已经经非特异性或特异性胞吞作用内在化的外源性抗原。在合成时刻左右，通过与恒定的链蛋白(Ii)相结合阻止Il类MHC分子与内源性抗原相结合。从内质网将这种Il类MHC-Ii蛋白质复合物传递到前-Golgi层，在此通过水解作用释放Ii，结合外源抗原肽(Daibata et al.，Molecular Immunology 31：255-260(1994)；Xu et al.，MolecularImmunology 31：723-731(1994))
[0004]I类MHC分子和Il类MHC分子在细胞中有不同的分布。尽管不同的细胞型表达水平不同，但是几乎所有的有核细胞都能表达I类MHC分子。免疫系统的细胞在它们的表面上表达大量的I类MHC分子，而肝细胞的表达水平相对较低。无核细胞很少表达或不表达I类MHC分子。Il类MHC分子高水平的表达在B淋巴细胞和巨噬细胞上，而不是在其他组织细胞上，通过暴露于细胞因子中，许多其他细胞型可以被诱导表达Il类MHC分子。
[0005]在标准情况下，由于Ii蛋白总是与新生Il类MHC分子共合成，所以内源肽(带有可能导致自体免疫性疾病的自我决定因素)不结合非类MHC分子。因为身体免疫监视系统从未看见过包含自动决定肽和Il类MHC分子，因此这些决定基的耐受性没有得到发展。在生长的个体中如果Il类MHC分子不受到Ii的抑制，那么内源自主决定基会被Il类MHC分子呈递，起始对那些内源抗原的自身免疫反应。在某些自身免疫疾病中情况就是这样。通过在恶性细胞中启动这种作用，可以对肿瘤的内源性抗原以治疗为目的使用＂自身免疫反应＂，从而限制肿瘤细胞的发育或者除去肿瘤细胞。
[0006]在阴性-II类MHC分子、li-阴性肿瘤中已经显示了增大Il类MHC分子表达同时不伴随Ii蛋白增加的治疗效果(Ostrand-Rosenberg et al.，Journal of Immunol.144：4068-4071(1990)；Clements et al.，Journal of Immunol.149：2391-2396(1992)；Baskar et al.，Ce∥.Immunol.155：123-133(1994)；Baskar et al.，J.Exp.Med.181：619-629(1995)；and Armstrong et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：6886-6891(1997))。在这些研究中，转染II类MHC分子基因进入ll类MHC-阴性鼠肉瘤细胞中，产生ll类MHC-阳性的、但li-阴性的肿瘤细胞系。将这些细胞注入MHC相容的宿主体内，能够延缓母体肿瘤细胞的生长。由于Ii链妨碍内源肿瘤抗原的呈递，Ii蛋白基因与Il类MHC基因共转染进入肉瘤细胞系中，能够抑制Il类MHC基因的肿瘤-治疗效果。用鼠黑素瘤细胞已经产生了具有可比性的结果(Chen and Ananthaswamy，Journal of Immunology 151：244-255(1993)).
[0007]通常认为，这种治疗方法的成功是由于树状细胞的天然活性。树状细胞是专业的清除剂，能够处理进入肽中的外源抗原并将其从细胞表面上的MHC抗原呈递给T淋巴细胞。树状细胞具有通过I类MHC分子和Il类MHC分子呈递抗原的能力，使他们能够活化T辅助剂和T杀伤细胞。人们认为，为了引起强大的T杀伤细胞反应，需要有效的T辅助细胞反应，并且通过树状细胞产生结合的活化作用能够导致增加的抗肿瘤反应(Ridge et al.，Nature 193：474-477(1998)；Schoenberger et al.，Nature 193：480-483(1998))。依据发现的肿瘤细胞，巨噬细胞系的树状细胞能够吸收并处理肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原。然后，树状细胞迁徙到排干肿瘤位点的淋巴结处，并存在于新的T细胞发育结点皮层附近的结点处。在结点皮层，能够识别树状细胞肿瘤决定簇的静止的T杀伤细胞被活化并增殖，随后被释放进入循环中，作为有效的抗肿瘤药物，杀手T细胞。
[0008]尽管与T辅助细胞活化或＂许可＂树状细胞通过I类MHC分子呈递抗原相互作用，并由此活化T杀伤细胞，但是同时与T辅助细胞和T杀伤细胞相互作用是没有必要的；在T辅助细胞调节的活化作用之后，活化的树状细胞能够在相当长的一段时间内维持它们刺激T杀伤细胞的能力。分别被Il类MHC分子或I类MHC分子决定簇呈递的抗原肽不需要来自同一个抗原蛋白，从恶性细胞中分离的两个或两个以上抗原可以被树状细胞处理并呈递。所以，许可一个决定簇，或许不具有肿瘤特异性，带有该决定簇，就能够许可其他具有肿瘤特异性的决定基活化T杀伤细胞。这种′minorl′或者cryptic′决定簇已经被用于各种各样的治疗目的(Mougdil et al.，J.Immunol.159：2574-2579(1997))。
[0009]Il类MHC分子抗原呈递的实验变化被认为扩大了这种小决定簇的免疫反应。许多肽通常不能用于引入II类MHC分子，为II类MHC分子提供丰富的多变的肽源。这系列决定簇的开发引起反应性T辅助细胞数目的膨胀。这种膨胀的数目引起树状细胞许可，其中有一些直接以肿瘤特异性决定基和肿瘤相关决定基为目的。尽管正常细胞很可能共用肿瘤细胞决定簇，但是在正常细胞中只产生很小的细胞损伤。这是因为抗肿瘤反应的多效应子反应(杀手T细胞的量，外界活化细胞因子，巨噬细胞的吞噬及其产物，等等)并不直接针对正常细胞的原因。
[0010]通过抑制II类MHC分子与Ii蛋白的相互作用可以改变正常的Il类MHC抗原抗原呈递作用。这一过程可以通减少Ii蛋白总数，(例如通过通过减少表达)或通过用Ii免疫调节功能的干扰作用来完成。使用各种各样的反义技术可以实现Ii表达的抑制作用。已经有文献报道与用于Ii蛋白的mRNA的AUG位点相互作用的反义低聚核苷酸能够降低外源性抗原的Il类MHC呈递过程(Bertolino et al.，Internal Immunology 3：435-443(1991))。然而，对Ii蛋白表达和对内源性抗原通过II类MHC分子呈递的作用还没有被检验过。近年来，Humphreys等人的美国专利第5,726,020号(1998)已经识别了三个反义低聚核苷酸和依据引入抗原呈递细胞表达II类MHC分子的逆基因构建物能够有效的抑制Ii蛋白的表达。接种通过这一机理被Ii抑制的肿瘤细胞的小鼠比接种未经治疗的母体肿瘤细胞的小鼠相比，表现出更长的存活时间。这一观察结果表明，Ii蛋白的抑制作用增加了抗原决定簇抗原决定簇呈递的范围，引起一种对于肿瘤细胞更加有效的免疫反应。
[0011]在肉瘤细胞(Sail)肿瘤模型中，用这种Ii反义低聚核苷酸处理的肿瘤细胞是抵抗母体肿瘤入侵的有效的疫苗。作为临床上有效的体内治疗性反义试剂，可表现的Ii反义逆基因构建物(Ii-RGC)是可以创造的(美国专利申请第10/127,347号)。这是通过将不同的Ii基因片段反方向克隆入可表现的质粒或腺病毒中来构建的，能够评价多种肿瘤细胞给药方法(Hillman et al.，Gene Ther.10，1512-8(2003)；Hillman et al.，Human GeneTherapy14，763-775(2003))。在多个鼠肿瘤细胞系，包括A20淋巴瘤细胞，MC-38结肠恶性腺瘤细胞，Renca格腊维次氏瘤细胞，B16恶性黑素瘤细胞，和RM-9前列腺癌细胞中稳定或短暂的DNA转染来评价Ii-RGC基因。选择最具活性的一个Ii-RGC(-92，97)(在AUG中的起始密码子中A在位点1)进行体内研究。
[0012]在试验的细胞系之中，A20已经是II+/H+类MHC。当构建物通过脂质体或基因枪转染方法传递时，Ii-RGC(-92，97)显著地抑制Ii表达。另一种试验的肿瘤系是ll-/li-类MHC。这种细胞系在活体外用Ii-RGC(-92，97)和CIITA或IFN-K之一或两者进行共转染，建造ll-阳性/li-抑制类MHC表现型(Lu et al.，Cancer Immunol lmmunother 48，492-8(2003)；Hillmanet al.，Gene Ther.10，1512-8(2003)；Hillman et al.Human Gene Therapy 14，763-775(2003))。在体内，ll阳性/li-抑制类MHC表现型的感应现象还可以通过Ii-RGC和CIITA质粒与脂质体的瘤内注射产生(Lu et al.，CancerImmunol lmmunother 48，492-8(2003)；Hillman et al.，Human Gene Therapy 14，763-775(2003))，或者通过包含li-RGC(-92，97)、CIITA和IFN-K腺病毒载体的重组细胞产生(Hillman et al.，Gene Ther.10，1512-8(2003)).
[0013]使用二种肿瘤模型：Renca肾癌和RM-9前列腺癌，在确定的皮下肿瘤中通过瘤内注射检验这种治疗构建物的体内活性。在这两种肿瘤模型中，得到完全退化的肿瘤。在Renca模型中，瘤内注射CIITA和Ii-RGC质粒构建物和亚最佳剂量的IL-2质粒4天之后，在大约50％的小鼠中观察到肿瘤退化现象(Lu et al.，CancerImmunol lmmunother 48，492-8(2003))。在确定的Renca肿瘤中，重组细胞腺病毒，包括CIITA、IFN-κ、Ii-RGC构建物和IL-2基因的瘤内注射能够导致大约60-70％的小鼠出现完全的肿瘤退化作用且防止Renca肿瘤复发(Hillman et al.，Gene Ther.10，1512-8(2003))。在具有侵蚀性的贫乏地免疫原性RM-9前列腺肿瘤模型中，在50％的小鼠中。放射疗法能够增加次最佳剂量IL-2和MHC ll类-阳性/li-抑制表现型的产生完全肿瘤退化的效果。(Hillman et al.，Human Gene Therapy 14，763-775，2003).选择性地放射治疗确定的RM-9皮下注射肿瘤一天，然后使用质粒pCIITA、plFN-p、plL-2和pli-RGC进行连续4天的瘤内质粒基因治疗。只有当在基因治疗之前进行肿瘤放射疗法时，用这四种质粒进行的瘤内治疗都能导致超过50％小鼠产生完全的肿瘤退化作用。通过放射疗法和瘤内基因治疗不再受肿瘤影响的小鼠在第64天重新复发，这种小鼠能够防止RM-9复发，但不能防止同源的EL-4复发。这种发现表明，在RM-9模型中，放射疗法能够提高瘤内基因治疗对于原位肿瘤特异性免疫应答感应现象的治疗效果。
[0014]为了获得最佳的治疗效果，Il类MHC和Ii必须用CIITA诱导，且在Renca和RM-9肿瘤模型中Ii必须被Ii-RGC抑制(Lu et al.，CancerImmunol lmmunother 48，492-8(2003)；Hillman et al.，Human Gene Therapy 14，763-775，2003)。该结果与Martin等人的结果一致(J Immunol 162，6663-70(1999))Martin等人的结果显示，在鼠的肺癌模型中，通过CIITA的Il类MHC的感应现象并不产生有效的肿瘤细胞疫苗。这一研究结果证实了我们的发现，即通过转染CIITA的Il类MHC感应现象，可以产生Ii，并不能达到满意的治疗效果。必须通过抑制Ii蛋白获得MHC II+/H-类治疗表现型。为了检验Ii蛋白的最佳抑制效果，使用不同比率的治疗构建物CIITA和Ii-RGC。为了保证优秀的Ii抑制作用，要求至少1:4的比率(CIITAIi-RGC)。在RM-9前列腺肿瘤中使用IFN-κ从而产生不表达为母体细胞的I类MHC分子。Renca细胞是l类阳性MHC细胞且IFN-κ并不是产生I类MHC分子所必须的，但能够进一步正调节其表达。在两种肿瘤模型中，亚治疗剂量的IL-2质粒是促进免疫反应所必须的。
[0015]这里给出了对于小鼠确定肿瘤的治疗效果，还给出了在临床前研究确定最佳治疗方案的稳定进展，并创造了用于治疗人类癌症的试剂。在研究小鼠时使用的CIITA基因是人类的，而且其产物对鼠用于Il类MHC和Ii基因的启动基因有很好的作用(Ting et al.，Cell 109，521-33(1999)).产生了一些能够在人B淋巴母细胞和海拉细胞株中抑制Ii表达的人Ii-RGC。带有CIITA构建物的细胞的转导作用导致细胞表面II类MHC分子和胞内Ii的正调节作用，而具有CIITA和hli-RGC的细胞的转导作用抑制Ii，且不提高II类MHC分子的表达。在其他的人肿瘤细胞系，包括人B淋巴瘤细胞系Raji和人恶性黑素瘤细胞系中复制这些数据。
[0016]在本发明中，可以使用新设计的RNAi遗传构建物和新合成的低聚核苷酸进行这种方法。双链RNA可以用于哺乳动物细胞中RNA干涉(RNAi)的靶分子基因表达的选择性抑制作用。与反义不同，通过双链RNA并入核酸酶复合物，术语为RNA-诱导的沉默复合物(RISC)来调节RNAi，所述复合物随后裂解靶分子RNA。已经显示，长度小于25个核苷酸的双链RNA并不激化病毒传染的RNA响应特性RNA。RNA序列可以以靶分子基因RNA的任何区域为基准，通常在编码区。当使用合成的RNAi时，使用阳离子脂质体给药纳摩尔浓度的RNAi，在培养基中治疗细胞。活性RNAi可能也发展为表达的构建物。在所有的研究中，使用不与靶分子序列兼容的RNAi作为参照物。在使用Western、FACS和/或表型试验进行RNAi治疗治疗之后12到72小时测定基因表达的抑制作用。
[0017]Ii的RNAi抑制作用的稳固性能适用于由内源合成抗原呈递引起刺激作用。只须在一小部分细胞中抑制Ii一个很短的时间，就可以得到免疫刺激效果。这一点与其他与癌细胞生长有关的特异性靶分子完全相反，所述其他与癌细胞生长有关的特异性靶分子需要在几乎所有的细胞中连续的抑制作用。
[0018]RNA干扰技术(RNAi)是能够使双链RNA(dsRNA)特异性抑制带有互补序列的基因表达的过程(Moss，Curr.Biol.11：R772-5(2001)；Elbashir，Genes Dev.15：188-200(2001)).这一过程涉及若干基因产物，包括DICER，DICER是一种核糖核酸酶，能够向前裂解长链dsRNA成为21到25个核苷酸长度的双链片段。这些片段作为短干扰RNAs或小干扰RNAs(siRNA)在本领域内是已知的(Elbashir et al.，2001)。
[0019]对果蝇进行的研究已经证明，DICER能够使长dsRNA成为由二个21nt束组成的siRNAs，其中，这二个21nt束包括相互精确互补的19nt区域，产生19nt二倍区，该二倍区与2nt-3′凸起侧面连接(WO 01/75164；Bernstein et al.，Nature 409：363，2001).。然后，SiRNAs诱导形成蛋白质复合物，该蛋白质复合物能够识别并裂解靶分子mRNAs。DICER酶的同系物已经在从大肠杆菌到人类范围内的多种种族中识别(Sharp，2001；Zamore，Nat.Struct.Biol.8：746，2001)，这说明siRNAs具有能够使基因表达在许多不同的细胞型，包括哺乳动物和人类细胞中静止的能力。
[0020]随后人们发现，可以通过引入合成的21-核苷酸siRNA二倍体在哺乳动物细胞中引发RNAi(Elbashir et al.，2001)。在哺乳动物细胞培养基中，RNAi已经成功地在多种不同的细胞型中进行再造，所述不同的细胞型中都具有通过例如转染技术被引入细胞中的合成siRNAs(Elbashir et al.，2001)。虽然由于21核苷酸siRNAs太短而不能在哺乳动物细胞中诱导干扰素反应(Kumar and Carmichael，1998)，但是已经足够长来提供靶分子基因的序列特异性抑制作用，在作为研究工具和治疗剂方面，它们拥有巨大的潜力。
发明内容
[0021]本发明直接指向组合物和方法，包括细胞中Ii表达的抑制作用以便改变抗原呈递途径。本发明一方面涉及有效抑制Ii表达的siRNAs。在一个实施方案中，本发明的siRNA包括一种RNA二倍体。第一束RNA二倍体包括Ii的有义序列。第二束RNA二倍体包括Ii的有义序列的反向互补序列。在另一方面，siRNA包括在一种单一分子中的Ii有义序列，一种所述有义序列的反向互补序列和一种间插序列，所述间插序列能够使二倍体在有义序列和反向互补序列之间形成二倍体。在所有的实施方案中，Ii的有义序列优选长度为10到25个核苷酸，更优选长度为19到25个核苷酸，或最优选长度为21到23个核苷酸。在另一方面，本发明提供了一种DNA序列，所述DNA序列能够编码siRNAs，siRNAs能够有效的抑制Ii表达，抑制包括这种DNAs或siRNAs的细胞并抑制其使用方法。
[0022]在一个方面，本发明涉及用于抑制细胞中Ii表达的方法。这种方法包括向表达Ii的细胞中引入一种siRNA，其中siRNA是直接或者间接地引入细胞的。其后，siRNA形成一种RNA-诱导的沉默复合物，从而抑制Ii在细胞中表达。
[0023]抑制Ii表达的目的是为了改变抗原呈递途径。更具体地说，Ii表达的抑制作用可以用来促进具有抗原表位的II类MHC分子的装量，其中抗原表位通常不存在于上下文中。因此，在另一方面，本发明涉及Il类MHC分子-阴性细胞向Il类MHC分子-阳性细胞的转变。这种转变通过例如用重组细胞载体转染Il类MHC分子-阴性细胞来起作用，其中，所述重组细胞载体包括一种编码蛋白的可表现核酸序列，该核酸序列在Il类MHC分子-阴性细胞中的转染作用产生转染细胞表面上II类MHC分子的感应现象。
[0024]在另一方面，本发明涉及用于显示Il类MHC分子-阳性细胞重要表面上抗原表位的方法，其中，所述Il类MHC分子-阳性细胞中Ii蛋白表达受到抑制。这种方法包括：a)提供一种细胞，这种细胞或者是Il类MHC分子-阳性细胞，或者是被诱导表达II类MHC分子的细胞，和表达重要抗原表位的细胞；和b)向步骤a)的细胞中引入siRNA，其中siRNA被直接或间接地引入细胞中，并且，其中siRNA能够形成RNA-诱导的沉默复合物，从而抑制Ii在细胞中表达。在另一实施方案中，这种方法可能包括a)提供一种细胞，这种细胞或者是Il类MHC分子-阳性细胞或者是被诱导在其细胞表面上表达II类MHC分子的细胞，且进一步地，其中，该细胞表达Ii；和b)向步骤a)的细胞中引入一种重要抗原表位和一种Ii的抑制剂。Ii的抑制剂可能是siRNA。
[0025]在另一方面，本发明涉及用于刺激哺乳动物体内免疫反应的方法，免疫反应直接指向Ii蛋白表达被抑制的Il类MHC分子-阳性细胞的重要表面上的抗原表位。这种方法包括提供能够表达重要抗原表位的Il类MHC分子-阳性细胞或能够表达所关心的抗原表位和被诱导在其细胞表面表达II类MHC分子的Il类MHC分子-阴性的细胞；此后，向所述细胞中引入一种siRNA，其中这种siRNA直接或间接地被引入细胞，且siRNA能够形成一种RNA-诱导的沉默复合物，从而抑制Ii的表达；和用所述细胞或者Il类MHC分子与衍生自所述细胞的抗原表位的复合物来免疫哺乳动物。
[0026]在另一方面，本发明涉及用于靶向动物细胞型，用于免疫反应的方法，这种细胞型的特点在于识别抗原的表达。在这种方法中，提供了得自个体的外周血单核细胞的培养物，该培养物包括抗原呈递细胞。一种Ii表达的siRNA抑制剂被直接或者间接地引入培养物的抗原呈递细胞中，其中，在适于表达的情况下，siRNA抑制剂是一种可表现的核酸序列，能够编码识别抗原进入位于培养物中的细胞中。
[0027]在下面的部分详细描述了本发明的多个涉及的方面。
附图说明
[0028]图1是表示相对荧光强度的示意图。通过用腺苷酸/CIITA腺病毒载体传染鼠结肠恶性腺瘤细胞(MC38)，随后用Ii反义寡聚核苷酸处理，生产II+/H-类MHC表现型。A)母体MC38细胞(未治疗)；B)用腺苷酸/CIITA传染的MC38细胞；C)用腺苷酸/CIITA传染且用官能参照低聚核苷酸处理的MC38细胞；D)用腺苷酸/CIITA传染且用不匹配对照低聚核苷酸处理的MC38细胞；E)用腺苷酸/CIITA传染且用Ii反义低聚核苷酸处理的MC38细胞。
[0029]图2是表示在接种MHC II+/N-类细胞疫苗的小鼠体内MC-38结肠恶性腺瘤生长抑制作用的图表。插图说明：(圆形)用MC-38细胞免疫的小鼠；(三角形)用MC-38细胞免疫的小鼠，其中该MC-38用腺苷酸/CIITA和不匹配参照低聚核苷酸处理过；(菱形)用MC-38细胞免疫的小鼠，其中该MC-38用腺苷酸/CIITA和官能参照低聚核苷酸处理过；和(正方形)用MC-38细胞免疫的小鼠，其中该MC-38用腺苷酸/CIITA和Ii反义低聚核苷酸处理过。
[0030]图3是表示小鼠体内母体肿瘤抑制作用的示意图，所述小鼠是接种致死性辐射MC-38细胞的小鼠，其中，MC-38细胞用CIITA持续转染，能够利用Ii反义抑制Ii表达。用PBS(三角形)、官能低聚核苷酸(圆形)或Ii反义(正方形)处理MC-38细胞并将其转染CIITA，用CIITA接种小鼠(5只小鼠/组)。
[0031]图4是表示在接种MHC ll+/li-类细胞疫苗和用GM-CSF处理的小鼠体内，MC-38结肠恶性腺瘤生长抑制作用的示意图。插图说明：(三角形)用母体MC-38细胞免疫的小鼠；(圆形)用MC-38细胞和GM-CSF免疫的小鼠；(空心正方形)用经CIITA、官能对照低聚核苷酸和GM-CSF处理的MC-38细胞免疫的小鼠；(菱形)用经CIITA、Ii反义低聚核苷酸和GM-CSF处理的MC-38细胞免疫的小鼠。
[0032]图5是表示MC-38细胞中通过腺苷酸/IFN-.γ.引起的Il类MHC分子和Ii感应现象的示意图。用腺苷酸/IFN-.γ.(3MOI)感染MC-38指定的时间，然后用抗Il类MHC分子或Ii抗体染色且通过流式细胞计进行分析。
[0033]图6是表示相对荧光强度的示意图。通过用腺苷酸/CIITA和腺苷酸/li-RGC(li-92，97)协同感染细胞，在Renca细胞中产生MHC ll+/Ii-类表现型。用不同的腺苷酸/CIITA与腺苷酸/li-RGC的比率协同感染Renca细胞，培养72小时并用Il类MHC分子或Ii蛋白表达染色。A表示了母体Renca细胞；B表示了腺苷酸/CIITA受感染细胞；C表示了腺苷酸/CIITA与腺苷酸/li-RGC以1∶2的比率协同感染作用；D表示了腺苷酸/CIITA与腺苷酸/l-RGC以1∶4的比率协同感染作用。
[0034]图7是时间过程实验的表现，在此实验中，通过用腺苷酸/IFN-.γ./li-RGC(mli-92，97)传染细胞，在MC-38细胞中产生MHC ll+/li-类表现型。在腺苷酸/IFN-.γ./li-RGC(mli--92，97)处理120小时之后产生Ii-但II+类表现型(左图)，而单独用腺苷酸/IFN-.γ.传染则在MC-38细胞中不产生MHC II+/H-类表现型(右图)。
[0035]图8表现了瞬时转染Raji细胞(ll+/li+类MHC)，一种人类B-淋巴瘤细胞系中的li-抑制作用。将细胞平涂于12-孔平皿中以1.25 X 105细胞/小孔的密度过夜，并用人类Ii-反向基因构建物(hli-RGC)转染，从而抑制Ii表达。Effectene转染试剂(25.mu.l，QIAGEN)与浓缩的hli-RGC质粒DNA(1ug一起培养，产生和直接添加到细胞中的介质混合的effectene DNA复合物。在培养48小时之后，通过用抗人类Ii抗体、LN2(Pharmingen)和抗HLA-DR抗体免疫染色的II类MHC分子染色剂(Pharmingen)，对细胞进行Ii和Il类MHC分子表达分析。从图中可以看出，根据使用的Ii-RGC序列，与阳性对照细胞(左侧附图)相比，细胞的Ii表达被抑制了4％到9％。
[0036]图9表现了通过体内给药腺苷酸/li-RGC载体抑制肿瘤生长并生成II+/H-类MHC表现型。对BALB/c小鼠皮下注射5X105的Renca肾腺癌细胞。在注射肿瘤细胞之后大约10天，当肿瘤达到50-200mm3时，在4个连续给药日中的一天里对肿瘤注射不同的载体与DMRI E/c的结合物。然后，每两或三天测量肿瘤尺寸。当肿瘤尺寸达到1000mm3时，处死小鼠。左边的示图中的数据表示了在第一天注射2.mu.g IL-2、3.mu.g腺苷酸/BN/CIITA和18.mu.g腺苷酸/BN/li-RGC(-92，97)，随后第2-4天注射2.mu.g IL-2、18.mu.g腺苷酸/BN/li-RGC(-92，97)和3μg空质粒(腺苷酸/BN)(无CIITA)的四只小鼠。很明显，用CIITA和Ii-RGC包含载体和IL-2处理的小鼠的肿瘤生长表现出显著的减少，而只接收IL-2和对照载体治疗的小鼠体内肿瘤发育仍处于前进状态，并能够中止小鼠的生命。
具体实施方式
[0037]在一个方面，本发明涉及用于在个体免疫反应中调节或靶向病变-特异性的组合物和方法。调节，如这里使用的术语一样，是指涉及增大个体免疫系统对抗原的灵敏度或降低个体免疫系统对抗原的灵敏度(耐受性)。靶向，如这里使用的术语一样，是指涉及增大对抗原表位的灵敏度。
[0038]本申请所公开内容的所有方面都涉及的必需要素是细胞中Ii合成的抑制作用。术语＂抑制作用＂或＂抑制＂是指负调节，或起到减少Ii活性的作用或能够降低Ii RNAs水平使其低于不存在本发明抑制剂或抑制因子的情况下所观察到的水平。如在本发明背景技术部分介绍的一样，Ii是一种蛋白，能够被II类MHC分子共同调节。Ii结合II类MHC分子从而阻断通向内源合成抗原的II类MHC分子的途径(即，抗原合成在II类MHC分子-表达细胞之内)。将II类MHC分子/li复合物从内质网传递到前Golgi层，在这里，Ii被能够负荷外源性抗原(即，不是在抗原呈递细胞之内合成并被例如噬菌作用、调理作用、细胞表面抗体识别作用、互补受体识别、和Fc受体识别机理选择进入抗原呈递细胞之内的抗原)的阶段裂解过程释放。
[0039]由于复合Ii蛋白的存在，抗原被从内质网中结合的II类MHC分子上排出，这种抗原种类可以被认为是内源合成的抗原。这种抗原包括胞浆蛋白，胞浆蛋白被蛋白体消化并作为肽被抗原肽运输体(TAP)传递进入内质网。这种内源合成的抗原通常在内质网中与I类MHC分子结合。由于Ii蛋白阻断抗原肽肽-结合位点，这种抗原片段通常不与II类MHC分子的内质网结合。
[0040]通过抑制Ii蛋白的表达，具有巨大功能的肽被传输进入内质网用于与I类MHC分子结合，并随后呈递给CD8+T淋巴细胞，这种具有巨大功能的肽可以结合II类MHC分子用于随后呈递并活化CD4+T免疫调节细胞。这种CD4+T免疫调节细胞配合各种各样的免疫反应途径可以具有辅助剂或者抑制因子功能。T免疫调节细胞通过物理接触和细胞因子释放促进其他细胞的活化作用，其他细胞例如细胞毒性T淋巴细胞(T杀伤细胞)、B淋巴细胞、和树状细胞。
[0041]这里使用的术语＂重要的抗原表位＂涉及一种抗原表位，该抗原表位存在于衍生自蛋白的肽中，所述蛋白产生在发生抗原呈递作用的细胞内。这里使用的该术语包括已知的或未知的抗原表位。因此“重要的”调节剂并不是指抗原表位是预先确定的。抗原表位是＂重要的＂抗原表位仅仅由于此抗原表位被包含在一种蛋白中，所述蛋白在发生呈递作用的细胞的细胞质中被合成。
[0042]将肽从肽库中传递进入内质网用于结合内质网附近的I类MHC分子，通过这种肽与II类MHC分子的结合能够得到为干预治疗提供时机的重要生物学结论。通常，在Ii抑制作用村子的情况下结合II类MHC分子的抗原表位是＂隐蔽的＂表位，因为这种抗原表位不另外呈递到通过经典的抗原呈递途径与II类MHC分子结合的免疫系统中。通过分析试验抗原氨基酸序列的重叠的合成肽文库，可以实验上揭露这种隐蔽的抗原表位。已经发现，用试验抗原免疫的一族小鼠对得自文库的一组肽具有应答作用(＂显性抗原表位＂)。然而，当用文库的单一肽免疫另外的同源性小鼠时，发现一种先前未鉴定的子集(除了免疫肽中任何显性表位之外)也包含免疫抗原表位。这种先前未鉴别的抗原表位包括一组隐蔽的抗原表位。
[0043]尽管本发明的方法能够同时促进针对显性和隐性抗原表位的免疫性，但是在某些临床情况中，对于隐性抗原表位免疫反应的促进作用对治疗效果起到一种特殊的作用。例如，就促进对癌症相关抗原表位的治疗反应来说，T辅助细胞对隐性抗原表位的反应很可能为有效的树状细胞许可作准备，该树状细胞许可依次产生稳固的细胞毒性T淋巴细胞抗肿瘤反应，但是抑制T细胞从来不对这种隐性抗原表位发生反应。已经证实，对已经T细胞与癌症相关抗原显性抗原表位反应的抑制作用的发展，在肿瘤微转移的生长中起到重要作用。因此，本发明的一种有效的应用是促进T辅助细胞与隐性癌症相关决定簇的反应。
[0044]在另一方面，就自体免疫性疾病来说，对自体免疫性疾病涉及抗原的显性抗原表位的反应能够促进这种疾病的发病机理。开发可作为选择的，例如抑制对于新型隐性抗原表位的免疫反应途径在治疗上是有效的。这种方案同样可以应用在其他医学病况例如过敏症、移植排斥、和传染性疾病和心血管疾病的治疗过程中。在诊断、治疗监察和治疗患有这种疾病的病人时，要使用到一种化合物，在该化合物形成过程中最基础和最有效的第一步骤是识别在Ii蛋白被抑制条件下被抗原呈递细胞呈递呈递的Il类MHC抗原表位。这种抗原表位包括显性抗原表位和隐性抗原表位。由于就例如，癌症或传染病来说，免疫抑制反应不会向隐性抗原表位发展，且就自身免疫疾病或移植排斥来说，不会产生激化反应，因此隐性抗原表位可能更为有效。因此，医生可以根据给出的病理状况重新开始Th1或Th2，激活或抑制反应。产生、分离和表征这种抗原表位的方法是本发明的一个主题。
[0045]在另一方面，本发明提供了包含抗原表位的个体肽的呈递、分离和识别过程，其中所述抗原表位在没有Ii蛋白存在的情况下在内质网中与II类MHC分子结合。这种肽可以被合成且单独使用或与疫苗应用相结合使用，从而提高或抑制对由他们引起的疾病相关抗原的免疫反应。分离和表征这种抗原表位肽的方法已经被美国专利第5,827,526号、美国专利第5,874,531号和美国专利第5,880,103号所描述，这些专利通过引证在此并入本文。
[0046]许多抗原属于＂内源合成＂类抗原(通常从Il类MHC分子呈递过程中分离出)，这些抗原特异性地与某些病理学的病况有关。假定有，例如，肿瘤细胞或其他恶性细胞。这种细胞合成癌症特异性蛋白质和癌症相关蛋白质，所述癌症特异性蛋白质和癌症相关蛋白质包含治疗有效的Il类MHC抗原表位。然而，因为这些蛋白质是在抗原呈递细胞内被合成的，这种蛋白质的抗原表位被从与同样细胞II类MHC分子相关的呈递过程中赶出。通过能够合成抗原抗原蛋白的细胞对抗原表位呈递作用的抑制，也支持过滤性毒菌引起感染的细胞。病毒特异性抗原被从与病毒受感染细胞的II类MHC分子结合的呈递过程中赶出，而这种抗原可以存在于与同样细胞的I类MHC分子的结合过程。从而，其他外源病原体(例如，细菌或寄生虫)占领一种细胞并利用细胞器合成对病理病况具有特异性的蛋白质，结果是相同的。事物发展正常趋势的改变能够呈递结合II类MHC分子的病理特异性抗原，对新型Il类MHC抗原表位产生的反应有促进作用。
[0047]一系列治疗方式都包括在本发明的范围内。可以取得专利的组合物与这些治疗中的许多疗法有关。治疗方法包括体内和体外实施方案。被靶向用于Ii抑制作用的细胞可以是Il类MHC分子-阳性细胞(例如，天然存在的抗原呈递细胞例如树状细胞、巨噬细胞或B淋巴细胞)，或被诱导表达II类MHC分子的Il类MHC分子-阴性细胞(例如，肿瘤细胞)。这里使用的＂阴性Il类MHC分子＂的表达，不仅仅特定地包括能够在它们的细胞表面表达非II类MHC分子的细胞，而且包括另一种细胞，这种细胞与阳性参照细胞，例如天然存在的抗原呈递细胞(例如，树状细胞)表面上的II类MHC分子数目相比，包含相对低的II类MHC分子数目。在这里，术语＂相对低的＂是指与II类MHC分子-阳性对照细胞(例如，天然存在的抗原呈递细胞)可能包含的II类MHC分子数目相比，这里包括的细胞在其细胞表面上估计只包含大约25％、或者更少数目的II类MHC分子。使用例如本领域中为大家所熟知的萤光免疫检验技术，可以产生丰富的II类MHC分子。
[0048]在申请人以前已经提交并执行了的专利申请中，公开了用于调节免疫反应的Ii抑制作用。这些申请明确地公开了有抑制性的共聚物，该聚合物能够被引入细胞中并直接通过结合Ii mRNA和反向基因构建物抑制Ii合成，其中，该反向基因构建物作为核酸构建物被引入细胞中，所述核酸构建物能够随后转录进入RNA分子，并在特异性杂交之后抑制Ii表达。这些早期申请的专利申请包括美国申请第08/661,627号、第09/205,995号、第10/054,387号和第10/127,347号，这些申请所公开的内容通过引证在此并入本文。美国申请第08/661,627号和第09/205,995号分别作为美国专利第5,726,020号和第6,368,855发表。
[0049]如前面简短地提到的美国申请第09/205,995号，其公开的内容中包含大量关于化学合成共聚物的内容，该共聚物包含大约10到大约50个核苷酸碱基。这种共聚物包含与RNA分子靶向部分互补的核苷酸碱基序列，或者称为反义序列。这种共聚物的实施例包括反义低聚核苷酸和siRNAs.反义共聚物能够通过两种抑制RNA翻译为蛋白质。一种方法是阻断的RNA出口部分，该出口部分必须与核糖体、剪接体或对RNA成熟或翻译十分重要的其他因子相互作用才能完成RNA的翻译。第二种方法包括酶、H核糖核酸酶的增强，这些酶能够裂解与DNA杂交的RNA序列。因此，DNA或DNA样共聚物与RNA中相应部分的结合能够引起RNA在共聚物结合位点的裂解。
[0050]例如通过沃森-克里克碱基配对规则，共聚物与靶分子RNA杂交。共聚物的序列由靶分子RNA的互补序列确定。通常共聚物是用长度覆盖至少6个靶分子RNA互补核苷酸，的核苷酸序列化学合成的，其中最常用长度为12-25个核苷酸的核苷酸序列。统计上讲，大约15个核苷酸的序列在细胞的所有RNA中具有独特的性质，能够对任何特定的RNA具有高度的特异靶向性。结合的RNA也是很稳定的，对于包括20个碱基对的共聚物来讲，其Kd值大约在10～17M周围。
[0051]有时，在培养基中的细胞能够自然的吸收足够量的共聚物以达到有效作用。这种吸收量好象是一种主动过程，需要生物化学能量和某些特定细胞表面蛋白的参与。吸收还可以通过胞饮作用发生。通过在包含共聚物的高渗介质中培养细胞，随后在稍微低渗的介质中重悬浮细胞从而诱导胞内胞饮囊的破裂，从而可以提高这种途径。在其它情况下，可以通过电转化技术利用脂类、脂质体或聚烷氧基共聚物帮助吸收，或或通过链球菌溶血素O治疗渗透细胞膜。体内细胞通常比培养细胞更容易吸收共聚物。美国申请第09/205,995的实施例2提供了对于细胞通过电转化技术吸收共聚物的最优条件。
[0052]靶分子RNA的潜在位点是那些对功能性蛋白质复合物结合开放的位点，和其他对于共聚物结合开放的位点。使用核糖核酸酶H(RNase H)，即一种能够裂解与DNA杂交的RNA的酶，能够识别这种位点。通过在核糖核酸酶H参与的情况下向5′-放射性磷-标记的RNA中单独添加或添加在混合物中的DNA低聚核苷酸，经过RNA凝胶电泳和自动射线照相术之后，可以识别与低聚核苷酸及其他共聚物杂交的RNA上的位点。在本发明Ii RNA中发现的位点是AUG起始密码子区和前信使RNA第一接合位点区的位点，这些位点大部分是对核糖核酸酶H裂解位点开放的。
[0053]本发明中的术语＂低聚核苷酸＂是指多聚核苷酸，该多聚核苷酸包括核苷酸单位，所述核苷酸单位是由天然存在的碱基和异戊烯呋喃糖通过磷酸二酯键相连所形成的。术语＂共聚物＂包括低聚核苷酸以及由非天然存在的低聚核苷酸或低聚核苷酸修饰亚基形成的在结构上相关的分子。这种修饰发生在核苷酸的碱基部分，或者发生在核苷酸的糖部分，或者发生在核苷酸间连键基团。其他的连接体基团也经常被天然低聚核苷酸的糖和磷酸盐骨架取代，产生共聚物，具体内容将在后面进行讨论。
[0054]这种低聚核苷酸修饰作用和产生的特征对于本领域技术人员来讲是可以利用的。美国专利第4,469,863号(1984)、美国专利第5,216,141号(1993)、美国专利第5,264,564号(1993)、美国专利第5,514,786号(1996)、美国专利第5,587,300号(1996)、美国专利第5,587,469号(1996)、美国专利第5,602,240号(1997)、美国专利第5,610,289号(1997)、美国专利第5,614,617号(1997)、美国专利第5,623,065号(1997)、美国专利第5,623,070号(1997)、美国专利第5,700,922号(1997)、和美国专利第5,726,297号(1998)、这些专利所公开的内容通过引证在此并入本文。
[0055低聚核苷酸与互补RNA杂交的能力对化学修饰作用有很大的忍耐能力。因此，可以使用许多不同的功能性共聚物。尤其是，糖磷酸骨架，可以被大面积地改变且不损失形成沃森-克里克碱基配对的能力。根据定义，核苷酸包括糖、氮杂环和磷酸盐基序。某些合成的低聚核苷酸同系物缺少糖或磷酸基或者两者都缺少，但仍可通过沃森-克里克碱基配对原则以与反义低聚核苷酸同样的方式杂交，且可以用于相同的目的。这些包含核苷酸碱基的共聚物与低聚核苷酸在杂交RNA方面是功能等效的。下面概括了能够改变和改进用于反义应用性质的低聚核苷酸修饰作用。
[0056]已经公开了很多特异性修饰作用，包括非桥氧原子的置换、桥氧原子的置换、核苷酸内磷酸基团的置换、糖环周围的立体化学改变、呋喃核糖基环状结构修饰作用、核苷酸连接体修饰作用、和通过肽骨架置换糖磷酸骨架从而产生一种肽酰核酸(pna)。引用专利申请的实行产生下列权利要求的授权，该权利要求是美国专利第6,368,855号的典型的独立的权利要求。
[0057]1.一种ll类MHC-阳性抗原呈递细胞，该细胞不包含编码哺乳动物B7分子的外源构建物，且包含Ii蛋白质表达或免疫调节功能的特异性调节器，低聚核苷酸CTCGGT ACCT ACTGG被明确地排除在外，特异性调节器基本上由10到50个核苷酸碱基的共聚物组成，该共聚物的特点在于在生理条件下，能够特定地与编码哺乳动物Ii蛋白质的RNA分子的目标区杂交，其中特异性调节器的特点在于能够抑制Ii表达。
[0058]为了提供相应的背景信息，和为附加的权利要求提供支持，人们注意到先有技术公开的内容中包括至少二个上述权利要求中特异性限制。例如，低聚核苷酸3′CTCGGTACCTACTGG5′的特异性排除被并入到文献Bertolino et al.，Int.Immunol.3(5)：435-443(1991)所公开的内容中。对于编码哺乳动物B7分子的外源构建物的限制被引入Ostrand-Rosenberg(U.S.Pat.No.5,858,776)所公开的内容中。
[0059]这里所公开的一种重要的因素，也是之前从未报道过的内容，就是通过利用一种反向基因构建物抑制Ii在人类细胞中的表达。虽然以前已经报导过人类Ii序列(Strubin et al.，EMBO J.3：869-872(1984))，但是包含至少一部分这种序列的反向基因构建物的使用在之前从未报道过。此外，尽管已经报道过在例如鼠Ii序列和人类Ii序列之间存在重要的保守序列，但是非人类的反向基因构建物在用来抑制Ii在人类细胞中的翻译时，是无效的。
[0060]因此，在一个方面，本发明涉及一种可表现的反向基因构建物，包括能够编码RNA分子的DNA分子，该RNA分子与能够编码人类Ii蛋白质的mRNA分子互补，RNA分子具有与mRNA分子杂交的能力，从而抑制mRNA分子在人类细胞中的翻译。本发明的这个方面在随后的实施例部分进行了具体的说明。更准确地说，已经证实，包含cDNA插入物的构建物的表达在抑制Ii在人类淋巴瘤细胞系中的表达方面是有效的。在这些试验中有效的构建物包括与Ii mRNA5＂未翻译区互补的cDNA插入物，且包括起始密码子的翻译。有效的构建物能够编码长度最多为大约435个核苷酸的抑制性RNA。
[0061]除了使用能够编码与人li mRNA区域完全互补的RNA的反义基因构建物之外，本领域普通技术人员还可以识别野生型人类序列可以忍受的脱离程度。本发明的范围包括那些通过常规试验就可以凭经验确定的变异体(即，他们的特征是能够抑制人类细胞中li的表达)。一种特别有效的野生型变异体能够产生与人类li mRNA互补的长半衰期的反义RNA(相对于野生型RNA来讲)，这种变异体被证明能够有效地抑制人类细胞中的li表达。在场半衰期的种类里，设计反义RNA的阅读框，避免出现在相同的阅读框内起始密码子AUG随后立刻/马上接着中止密码子的情况。为了避免出现例如在阅读框1内AUG在中止密码子前不远位置的情况，可以设计一种新型的AUG，并引入阅读框1的AUG之前，在阅读框2或阅读框3中，确保在此修饰之后，阅读框内不存在中止密码子。
[0062]除了使用反义基因构建物之外，本领域技术人员可以认识到，其他的li表达抑制性共聚物可以被很方便的设计并构建。例如，双链小干扰RNA(siRNA)和编码这些分子的基因可以通过RNA干扰用来抑制li。
[0063]本发明的一个目的是提供一种组合物、载体和包含该组合物的细胞，以及使用他们的方法，其中，该组合物包括能够有效抑制li表达的siRNA。
[0064]这里使用的术语“RNA干扰(RNAi)”是指双链RNA(dsRNA)特异性的抑制基因向其互补序列表达的过程(Moss，Curr.Biol.11(19)：R772-5(2001)；，Elbashir，Genes Dev.15(2)：188-200(2001)).尽管不希望被任何理论所限制，但是RNAi被认为是通过包括多重RNA-蛋白相互反应的机制所产生的，该机制包括一下四个主要的步骤：集合带有RNA诱导的沉默复合物(RISC)的siRNA，RISC的活化，靶向识别和靶向裂解。这里使用的术语“短干扰RNAs(siRNA)”是指能够调节RNAi或基因沉默的任何核苷酸。术语siRNA包括多种天然产生的或合成的化合物，所述化合物具有RNAi功能。这种化合物包括但不限于，具有大约21到23个碱基对的双倍合成寡聚核苷酸，其末端有2-3个重叠的碱基对；一个寡聚核苷酸的发卡结构，具有由3-5个碱基对加入的21-23个碱基对的反义、互补和杂交序列；和能够导致前述结构或功能等价物表达的各种基因构建物。这种基因构建物通常可以体外制得并引入测试系统中，这种基因构建物还可以包括由宿主细胞或动物体基因编码的天然存在的siRNA前体产生的siRNA。
[0065]并不要求本发明的siRNA只包括RNA。本发明的siRNA可以包括一种或一种以上化学修饰和/或核酸类似物。这里所述的修饰和/或类似物可以分别是不会负面影响siRNA抑制li表达能力的任意的修饰和/或类似物。在siRNA中一个或一个以上化学修饰和/或核酸类似物的内含物优选能够预防或减缓核酸酶的消化，并依次产生更稳定的siRNA用于实际应用。能够稳定RNA的化学修饰和/或核酸类似物在本领域内是已知的。包括用硫原子代替非桥键磷酸基氧原子的硫代磷酸衍生物是这种类似物的一个例子，表示了对核酸酶消化增加的抵抗力。可以作为化学修饰靶点的siRNA的位点包括发夹结构的环区域、发夹结构(例如帽结构)的5’和3’末端、线性双链siRNA的3’悬挂区域，线性siRNA的有义链或反义链的5’和3’末端，和有义链或反义链的一种或一种以上的核苷。
[0066]这里使用的术语siRNA，与本领域内能够调节序列特异性RNAi的分子是等价的。这种等价物包括，例如，双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短干扰低聚核苷酸和后转录基因沉默RNA(ptgsRNA)。
[0067]尽管不希望局限于任何理论，人们通常认为在RNAi中双链RNA被处理成包括21-23个碱基对的片断，该片断能够结合互补mRNA并导致该互补mRNA降解(Bernstein，Nature 409(6818)：363-6(2001)，and InternationalPublication Number WO 0175164)。siRNA能够导致序列特异性后转录基因沉默。国际申请第WO 0175164中描述了为了治疗或预防目的将这种分子引入细胞中来抑制基因表达。在很多专利、专利申请和论文中记录了可以为了实现治疗或预防目的，将这种分子引入细胞中，抑制基因表达。这些文献通过引证在此并入本文，所述描述RNAi技术的文献包括但不仅限于：美国专利第6686463号，美国专利第6673611号，美国专利第6623962号，美国专利第6506559号，美国专利第No.6573099号，和美国专利第6531644号；国际申请第WO04061081号；第WO04052093号；第WO04048596号；第WO04048594号；第WO04048581号；第WO04048566号；第WO04046320号；第WO04044537号；第WO04043406号；第WO04033620号；第WO04030660号；第WO04028471号；第WO0175164号。描述有效利用这些化合物的方法和概念的文章包括但不仅限于Brummelkamp Science 296：550-553(2002)；Caplen Expert Opin.Biol.Ther.3：575-86(2003)；Brummelkamp，Sciencexpress21MarO3 1-6(2003)；Yu Proc Natl Acad Sci USA 99：6047-52(2002)；PaulNature Biotechnology 29：505-8(2002)；Paddison Proc Natl Acad Sci USA99：1443-8(2002)；Brummelkamp Nature 424：797-801(2003)；Brummelkamp，Science 296：-550-3(2003)；Sui Proc Natl Acad Sci USA 99：5515-20(2002)；Paddison，Genes and Development 16：948-58(2002).
[0068]在本发明的内容中，包括能够有效抑制li表达的siRNA的组合物可能包括一种RNA二倍体，该RNA二倍体包括一种li有义序列。在此实施方案中，RNA二倍体包括一种第一链和一种第二链，该第一链包括li的有义序列，第二链包括li有义序列的反义互补序列。在一个实施方案中，li有义序列由长度为10到25的核苷组成。更优选的，li的有义序列由长度为19到25的核苷组成。最优选的，li的有义序列由长度为21到23的核苷组成。li的有义序列优选包括一种li序列，此li序列包含翻译起始位点，更优选的包括人li mRNA的首个400nt之内的li序列部分。
[0069]在另一个实施方案中，包括能够有效抑制li表达的siRNA的组合物可能在单个分子中包括一种li有义序列、li序列的反向互补序列和一种间插序列，该间插序列能够在有义序列和反向互补序列之间双倍形成。li的有义序列可能的长度为10到25个核苷，或者，更优选的19到25个核苷，或者最优选的长度为21到23个核苷。本发明的siRNA可能包括一种RNA，该RNA的序列选自由SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17 and SEQ ID NO：18所组成的组。
[0070]本发明的siRNA可能包括一种li有义序列或li有义序列的反向互补序列，该li有义序列的反向互补序列小于完全相互互补或与li目标区域互补的序列，这些对于本领域技术人员来讲是非常显而易见的。换句话说，在有义或反向互补序列中，siRNA可能包括错配或突出部分。在一方面，有义序列或其反向互补序列可以是完全相邻的。这个或这些序列可能包括一种或一种以上的取代、缺失、和/或插入。本发明唯一的要求是siRNA有义序列对其反向互补序列和li的目标区域要具有足够的互补性，从而保证RNAi的活性。因此，本发明的一个目的是为能够保持足够的互补性的siRNA提供序列修饰，保证RNAi活性。本领域技术人员可以预见，本发明修饰的siRNA组合物将会基于计算出的修饰序列结合li互补序列和目标序列的结合自由能发挥作用。核酸结合自由能的计算方法及计算所得值在链杂交中发挥的作用在本领域内是已知的。
[0071]各式各样的给药系统可以用于体外和体内向靶细胞供给本发明的siRNA。本发明的siRNA可以直接地或间接地引入需要抑制Ii的细胞中。siRNA可以通过，例如，注射直接地被引入细胞。同样地，本发明的一种目标是提供一种组合物，该组合物包括可注射的，单位剂量形式的能够有效抑制Ii的siRNA。举例来说，本发明的siRNA可以静脉注射或皮下注射，为了达到治疗目的，与本发明的方法和组合物结合使用。这种治疗包括周期性给药或连续给药，直到达到能够在需要的组织中抑制Ii表达的治疗有效水平为止。
[0072]间接地，可表现的DNA序列或编码siRNA的序列可以被引入细胞中，之后从DNA序列或序列转录产生siRNA。因此，本发明的一种目标是提供一种组合物，该组合物包括一种DNA序列或一种能够编码有效抑制Ii表达的siRNA的序列。
[0073]本发明的DNA组合物包括一种第一DNA序列和一种第二DNA序列，所述第一DNA序列能够编码包括Ii有义序列的第一RNA序列，所述第二DNA序列能够编码包括Ii反向互补有义序列的第二RNA序列。第一和第二RNA序列在杂交的时候，能够形成一种siRNA二倍体，该siRNA二倍体能够形成一种RNA-诱导的沉默复合物，RNA-诱导的沉默复合物能够抑制Ii表达。第一和第二DNA序列可能是化学合成的或通过PCR使用适当的对Ii的引物合成的。做为选择，DNA序列可以使用克隆技术通过细胞重组获得，其中，克隆技术在本领域内是已知的。一旦获得，DNA序列可以被纯化，结合，然后被引入需要抑制Ii的细胞中。做为选择，可以将序列装入单一载体或分离的载体中，将这种载体或这些载体引入需要抑制Ii的细胞中。
[0074]给药系统可以用于向靶细胞中供给本发明的DNA组合物，所述靶细胞包括，例如，病毒和非病毒系统。适当的病毒系统的实施例包括，例如，腺病毒载体、腺病毒相关病毒、慢病毒载体、痘病病毒、逆转录病毒载体、牛痘、单纯疱疹病毒、艾滋病病毒、小鼠细小病毒、乙型肝炎病毒和流感病毒。还可以使用非病毒给药系统，例如使用未复合的DNA、DNA-脂质体复合物、DNA-蛋白质复合物和DNA-包衣镀金颗粒、细菌载体例如沙门氏菌，及其他技术例如包括VP22转运蛋白、Co-X-基因和复制子载体的技术。本发明上下文中的病毒载体或非病毒载体可以表达所关心的抗原。
[0075]用于表达动物细胞中所关心的核酸序列的一个选择是腺病毒系统。在随后的实施例部分，具体地公开了腺病毒系统的使用。腺病毒拥有一种双链DNA基因组其复制过程与寄主细胞分裂无关。相对于可选择的方法，腺病毒载体提供了大量有利条件用于将可以表达的构建物引入细胞。例如，腺病毒载体能够转换许多人类组织，且在分裂的和未分裂的细胞中获得高水平的基因表达。由于在靶细胞分离期间免疫系统的清除和稀释性损失，腺病毒载体的特点在于一种相对短时间的转基因表达。一些可以使用的给药途径包括静脉注射、胆管内给药、腹腔内给药、胞膜内给药、颅内和鞘内注射、和目标器官或组织的直接注射。因此，本领域技术人员可以认识到根据解剖学知识能够实现目标。
[0076]腺病毒基因组能够编码大约15个蛋白质，感染病毒包括一种纤维蛋白质，这种纤维蛋白质能够结合细胞表面受体。这种受体的相互作用产生内在化的病毒。病毒DNA进入受感染细胞的细胞核并且在没有细胞分裂的情况下开始转录。在E1A和E1B基因的控制下进行表达和复制(see Horwitz，M.S.，In Virology，2.sup.nd ed.，1990，pp.1723-1740)。除去E1基因能够导致病毒不能复制。
[0077]腺病毒血清型2和5已经广泛使用于载体建筑物。Bett等人(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.91：8802-8806(1994))使用缺失E1和E3腺病毒基因的腺病毒5型载体系统。293人类胚胎肾细胞系已经被用于表达E1蛋白质，且因此可以转互补于E1缺乏的病毒基因组。病毒可以从293细胞介质中分离出来并用限制性稀释噬菌斑试验(Graham and Prevek，In Methods inMolecular Biology：Gene Transfer and Expression Protocols，Humana Press1991，pp.109-128)净化。重组细胞病毒可以生长在293细胞系中，通过赖氨酸感染的细胞培养和分离，并通过氯化铯密度梯度离心提纯。与用于生产重组细胞腺病毒的293细胞相关的问题是，由于E1基因附加的侧面区，他们可能在生产病毒颗粒期间产生有复制能力的腺病毒(RCA)。尽管这种材料只是野生型腺病毒，并不是有复制能力的重组细胞，但是它对理想腺病毒材料的产生有重要的影响并使生产成本、用于临床使用的生产过程和成批产品验收的质量控制增大。已经产生可供选择的细胞系，例如PER.C6，PER.C6比293细胞具有更明确的E1基因集合(即不包含侧面病毒序列)，这些细胞系不允许产生RCA的重组细胞发生，且因此有可能抑制上述病毒生产。
[0078]腺病毒相关病毒(AAV)(Kotin，R.M.，Hum.Gene Ther.5：793-801(1994))是一种单链DNA，非自治的细小病毒能整合进入很多宿主的未分裂细胞的基因组中。还没有证据证明AAV与人类疾病有关，AAV不引起免疫反应。
[0079]AAV具有二个不同的生命周期阶段。野生型病毒可以感染寄主细胞，整合且保持潜伏状态。在有腺病毒参与的情况下，病毒被诱导为溶解相，该诱导过程取决于早期腺病毒基因的表达，并引起病毒复制活性。AAV基因组由二个开放阅读框组成(叫做rep和cap)，这两个开放阅读框侧面与转化的末端重复(ITR)序列连接。rep区编码能够调节AAV复制、病毒DNA转录、和在宿主基因组集合物中具有核酸内切酶功能的四个蛋白质。rep基因是唯一需要病毒复制的AAV序列。cap序列编码能够形成病毒衣壳的结构蛋白质。ITRs包含病毒复制的启动子，提供用壳体包裹的信号并参与病毒DNA集合。已经研发出重组细胞、复制缺陷病毒用于基因治疗缺少rep和cap的序列。复制缺陷型AAV可以通过将AAV复制所必需的单独的因素共同转染入自由的293细胞系中产生。美国专利第4,797,368号公开了相关内容，这些公开的内容通过引证在此并入本文。
[0080]逆转录病毒载体可以用于感染分裂细胞，逆转录病毒由一种RNA基因组所组成，这种RNA基因组被包覆在来源于寄主细胞膜和病毒蛋白的胞质鞘中。逆转录病毒基因表达包括一种反转录步骤，在此反转录步骤中阳性链RNA基因组被用作模板直接合成双链DNA，然后将双链DNA整合到宿主细胞DNA中。整合的原病毒能够使用寄主细胞器进行基因表达。
[0081]鼠白血病病毒是一种经常被使用的逆转录病毒(Miller et al.，Methods Enzymol.217：581-599(1993)).逆转录病毒载体一般通过gag、pol和env基因的缺失进行构建。这些序列的缺失提供了插入重要核酸序列的能力，并能够除去病毒的复制作用。编码抗菌素耐药性的基因通常作为筛选方法被包括在内。还可以包括启动子和增强子功能，例如，为随后体内给药的组织特异性表达作准备。长末端重复序列中包含的启动子和增强子也可以被使用。
[0082]携带重要外源核酸序列的病毒和这种病毒的修饰作用只能产生在包装病毒的细胞系中。包装细胞系可以通过将删除的病毒基因(gag、pol和env)稳定插入细胞来构建，从而它们存在于不同的染色体中预防重组作用。包装细胞系用来通过插入重组细胞前病毒DNA构造能够产生复制缺陷型反转录病毒的生产细胞系，所述反转录病毒包含所关心的核酸序列。包含长末端重复序列的质粒DNA侧面与包含用壳体包裹序列的gag基因的小部分相接，且使用用于DNA传递和吸收的标准技术(电转化技术、钙沉淀作用，等等)将所关心的基因转染进入包装细胞系中。这种方法的变体已经被用于降低有复制能力的病毒生产的可能性(Jolly，D.，Cancer Gene Therapy 1：51-64(1994)).通过包裹基因(env)确定病毒宿主细胞的范围，可以使用具有不同特异性的细胞取代env基因。还可以使用适当的配体与包裹蛋白质的结合进行靶向目标。
[0083]重组逆转录病毒载体的给药可以通过任何适用技术实现。这种技术包括，例如，病人细胞的非体内转导作用、直接将病毒注射入组织和通过逆转录病毒生产细胞给药。非体内方法需要分离并在组织培养基中保藏病人细胞。在这里，可以产生对靶细胞具有高比率的病毒颗粒并由此改进转导作用效率(参见，例如，美国专利第5,399,346号，其公开的内容在这里通过引证并入本文)。美国专利第4,650,764号所公开的内容与逆转录病毒表达系统的使用有关，所引用的专利公开的内容通过引证在此并入本文。
[0084]在有些情况下体内病毒的直接引入是必需的或优选的。反转录病毒已经用于治疗脑肿瘤，其中反转录病毒只感染分裂细胞(肿瘤细胞)的可能是尤其有利的。
[0085]已经提议直接对患有脑肿瘤的病人给药反转录病毒生产细胞系(参见，例如，Oldfield et al.，Hum.Gene Ther.4：39-69(1993))。这种生产细胞可能在脑肿瘤内生存一段时期，并分泌能够转换脑肿瘤围绕物的反转录病毒。
[0086]已经描述了用于表达的以痘病毒为基础的系统(Moss and Flexner，Annu.Rev.Immunol.5：305-324(1987)；Moss，B.，InVirology，1990，pp.2079-2111).例如，牛痘是一种大的、包裹的DNA病毒，这种DNA病毒能够在感染细胞的细胞质中进行复制。来自许多不同组织中的未分裂和分裂细胞的均被感染，并观察到不完整的基因组的基因表达。可以通过将转基因插入牛痘衍生的质粒中并将这种DNA转染入受牛痘感染细胞中产生重组病毒，其中，在受牛痘感染的细胞中进行同源重组导致病毒生产。一种非常不利的因素是这回引起宿主对150到200个病毒编码的蛋白质的免疫应答反应，产生有问题的重复给药。
[0087]单纯疱疹病毒是一种大的，双链DNA病毒，能够在感染细胞的细胞核中复制。这种病毒能够用于与外源核酸序列连接(参见Kennedy andSteiner，Q.J.Med.86：697-702(1993))。它的优点包括宽的宿主细胞范围，分裂的和未分裂的细胞的感染，且外源DNA的大序列可以通过同源重组作用被插入病毒基因组中。它的缺点是难以使病毒制剂不含有复制能力的病毒和有效的免疫反应。病毒胸苷激酶基因的缺失致使含有低水平的胸苷激酶的细胞中病毒复制能力的缺失。进行了活性细胞分裂的细胞(例如，肿瘤细胞)具有足够的胸苷激酶活性，从而能够进行复制。
[0088]许多其他病毒，包括HIV，小鼠的细小病毒，乙型肝炎病毒，和流感病毒已经作为基因转移的载体被公开(参见Jolly，D.，Cancer GeneTherapy 1：51-64(1994))。
[0089]还可以使用非病毒DNA传递策略。这种DNA传递策略涉及未复合的质粒DNA、DNA-脂类复合物、DNA-脂质体复合物、DNA-蛋白质复合物、DNA-包衣金颗粒和DNA-包衣的聚交酯乙交酯颗粒。纯化的核酸可以直接被注射入组织中，在例如肌肉组织中产生瞬时的基因表达，这一点在再生肌肉中尤其有效(Wolff et al.，Science 247：1465-1468(1990))。Davis等人(Hum.Gene Ther.4：733-740(1993))已经公布了DNA到成熟肌肉(通常优选骨骼肌)中的直接注射过程。
[0090]使用基因枪可以将位于金颗粒上的质粒DNA＂射＂入细胞(例如表皮或恶性黑素瘤)中。DNA共沉淀在金颗粒上，然后使用电火花或压缩煤气作为推进剂点燃(Fynan et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.SA.90：11478-11482(1993))。电转化技术还可以通过使用电转化技术探针将DNA传递进入固态肿瘤中，这一过程可以使用多种针矩阵和脉冲、旋转电场(Nishi et al.，CancerRes.56：1050-1055(1996)).已经要求保护向皮下肿瘤的高效基因转移，这一技术对重要细胞转染具有促进作用且与内部肿瘤注射步骤相比具有更好的分布特性。
[0091]优选使用脂类调节的转染作用用于体外和体内转染(Horton et al.，J.Immunology 162：6378(1999))。使用商业购得的脂类，例如DMRIE-C试剂，通过在注射之前混合DNA和脂类1到5分钟形成脂质体-DNA复合物。
[0092]通过用疏水性分子包裹亲水性分子使脂质体其作用，从而促进细胞进入。脂质体是由脂类制成的单层或多层脂质体。脂类组合物和制造工艺能够影响脂质体的结构。其他分子可以被引入脂膜中。脂质体可以是阴离子型或阳离子型。Nicolau等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.SA.80：1068-1072(1983))已经公开了他们在关于胰岛素从注射到鼠体内的阴离子型脂质体中表达方面所作的工作。除非有另外的靶分子存在，阴离子型脂质体主要靶向肝脏的网状内皮细胞。分子可以被引入脂质体表面从而改变它们的行为，例如细胞-选择性的传递(Wu and Wu，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987))。
[0093]Feigner等人(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.84：7413-7417(1987))已经公开了他们在关于阳离子型脂质体方面所作的工作，这一公开表明了核酸通过静电相互作用的结合并显示出细胞进入。阳离子型脂质体的静脉注射导致大部分器官中转基因表达
[0093]Feigner等人(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.84：7413-7417(1987))已经公开了他们在关于阳离子型脂质体方面所作的工作，这一公开表明了核酸通过静电相互作用的结合并显示出细胞进入。当注射入供给器官的传人血液中时，阳离子型脂质体的静脉注射导致大部分器官中转基因表达。阳离子型脂质体可以通过气雾剂对目标肺上皮细胞给药(Brigham et al.，Am.J.Med.Sci.298：278-281(1989)).阳离子型脂质体转基因传递过程的体内试验已经被公布了(参见，例如，Nabel et al.，Rev.Hum.Gene Ther.5：79-92(1994)；Hydeet al.，Nature 362：250-255(1993)和；Conary et al.，J.CHn.Invest.93：1834-1840(1994))。
[0094]正在研究能够作为DNA向吞噬细胞传递的系统的微粒，这种方法已经被Pangaea Pharmaceuticals报导过。一种DNA微囊化传递系统已经被应用并对能够吸收微球吞噬细胞，例如巨噬细胞的转导作用起到了更加有效的效果。向微球中装入有可能编码免疫原性肽的质粒DNA，该免疫原性肽在表达的时候能够导致肽通过MHC分子在细胞表面进行显示，所述细胞表面能够刺激针对包含相同抗原表位的肽和蛋白质序列的免疫反应。目前这种方法在抗肿瘤和抗病原体疫苗的发展方面起到了很多潜在的作用，但也可能用于其他的基因治疗用途。
[0095]能够均一的自动装配入病毒样颗粒(VLPs)的天然病毒外壳蛋白还可以用来包装DNA进行传递。人类多形瘤病毒的主要结构外壳蛋白(VP1)可以用重组蛋白质来表示并能够在自动装配入VLP期间包装质粒DNA。随后产生的颗粒可以被用于转换各种各样的细胞系。
[0096]在DNA载体中已经进行了一些改进，从而更可能适用于许多非病毒给药系统。这包括超螺旋微环(既不具有复制的细菌起源也不具有抗菌素耐药性基因，并且由于它们显示一种高水平的生物防范作用，因此可能是更安全的)，附加表达载体(在细胞核内非染色体外扩增质粒的地方复制附加体表达系统，并因此避免基因组集合情况发生)和T7系统(一种严格地细胞质表达载体，其中载体本身表达噬菌体T7RNA聚合酶，且使用第一启动子产生的聚合酶从第二T7启动子处驱除治疗基因)的使用。其他对DNA载体工艺更加普遍的改进包括顺式作用因素的使用，从而起到高水平表达的效果，还包括来源于α卫星重复DNA的序列的使用，从而提供每个细胞一次的循环复制过程和核靶向序列。
[0097]正如以上的讨论，本发明涉及在多种动物细胞类型中或Ii的体内或非体内的抑制作用。基于Il类MHC分子表达的状况，可以将与这里所讨论的有关的动物细胞类型划分成很宽的范围。这里将简要介绍这种宽的划分范围，并再次回顾特异性治疗方法的内容。
[0098]天然存在的抗原呈递细胞(有时被认为是专门抗原呈递细胞)参与获得性免疫反应。这些细胞是Il类MHC分子阳性细胞，包括树状细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞和某些其它的单核细胞。另外，一些细胞例如T淋巴细胞，在静止状态下不显示II类MHC分子，但可以依据适当的活化作用被诱导表达II类MHC分子。可以在体内或体外诱导这种细胞对抗原肽的II类MHC分子限制性呈递过程其作用，这种细胞可以被归入天然存在的抗原呈递细胞类。可以通过与自身血浆、作为多形核细胞的IFN-γGM-CSF进行混合细胞培养，诱导细胞表达II类MHC分子(Rasdak，Immunol.101(4)：521-30(2000))。可以同时诱导T细胞表达II类MHC分子并且，在与促细胞分裂剂和异种APCs一起培养的时候，假定抗原呈递细胞官能性(Patel，J.Immunol.163(10)：5201-10(1999)).
[0099]如下文中所进行的更为详细的描述，一种可以编码重要的抗原表位的能够表达的核酸序列有可能被引入这种细胞。在这些抗原表位的表达与Ii抑制作用相结合的时候，重要的抗原表位被显示在与II类MHC分子有关的抗原呈递细胞的表面上。
[00100]天然存在的抗原呈递细胞流遍整个身体和全部周围淋巴组织。周围淋巴组织位于身体的双流体系统，即血液和淋巴周围。这种双流体系统是相互接触的。淋巴由液体形成，所述液体从血液输送到组织内部和组织中的间隙中。由此细胞间隙，淋巴流入薄壁的淋巴管中，在这里被慢慢地移到大的中枢性聚集导管中。最终淋巴回到静脉，并在此重新进入血液。在血液中，淋巴细胞形成百分之20-30的有核细胞；在淋巴中它们形成百分比99的有核细胞。抗原呈递细胞在这些流体系统之内循环穿过淋巴结和脾的卵泡中心。在身体的淋巴结和脾的卵泡中心处高浓度的T淋巴细胞和B淋巴细胞水平，能够促进细胞的相互作用和无性繁殖的扩增。
[00101]其它的几乎没有II类MHC分子表达的重要细胞包括大多数的恶性细胞和过滤性毒菌感染的细胞。尤其要注意的是，已经有报道证明，在某些或所有细胞中，那些通常被认为是ll类MHC阴性的肿瘤能表达低水平的II类MHC分子。这包括，例如，乳癌、肺癌、或结肠癌。这种细胞可以表达病理特异性抗原，但考虑到II类MHC分子的缺失或相对低的含量，来自这种抗原的肽通过这种细胞的Il类MHC呈递作用还没有达到有效程度，在这种细胞中，有可能既诱导Il类MHC分子表达又抑制Ii表达，(共同调节Ii表达和Il类MHC表达)。这种结合物的干预作用导致与II类MHC分子相联系的细胞表面上显示这种与病理相关的包含抗原表位的肽。
[00102]另一类重要的细胞既不是恶性的、过滤性毒菌感染的细胞也不是天然存在的抗原呈递细胞。这种细胞的实施例包括成纤维细胞、角化细胞和肌肉细胞。该细胞是Il类MHC分子阴性细胞，且不可归类为天然存在的抗原呈递细胞。这种细胞与接种疫苗方法相结合在体内或非体内条件下都是有效的。考虑体内环境下，靶向肌细胞用于呈递与II类MHC分子相关的抗原。II类MHC分子中编码重要的抗原表位和诱导物的可以表达的核酸序列可以被注入到肌肉组织中。这种序列可以通过组织中的肌细胞吸收和表达。在注射区域之内的一定比率的肌细胞最终在细胞表面表达与II类MHC分子相联系的重要抗原表位。对通过这种呈递(例如，辅助性T细胞)产生的刺激作用有感受能够的细胞能够与呈递细胞接触，作为刺激作用-感受态细胞在淋巴中循环。如上所述，淋巴细胞形成循环淋巴中99％的有核细胞。被刺激的抗原呈递细胞可能与T淋巴细胞和B淋巴细胞在脾的淋巴结处协作，在脾的淋巴结处，细胞及其他因子的浓度能够促进相互作用并放大克隆选择。通过分泌B淋巴细胞和它们的成熟后代、血浆细胞产生的抗体离开淋巴中的结点并被传递到血液中。
[00103]前面的部分通过有局限性的讨论来介绍用于Ii抑制的重要细胞型。随后的讨论将会更加详细地研究这种介绍的细胞型和相关的方法。
[00104]已经证明Ii抑制治疗与肿瘤形成性疾病有关。这包括，例如，已经确定初期位置的癌症和未知初期位置的转移性癌症。前类癌症包括乳腺癌、头部和颈部的恶性肿瘤、卵巢癌、睾丸癌及其他滋养层疾病、皮肤癌、和恶性黑素瘤及其他有颜色的皮肤损害。
[00105]Ii抑制治疗还被证明可以用于能够过表达PAI-1并已经被诱导表达II类MHC分子的细胞。可以在冠状动脉粥样硬化噬菌斑、颈动脉、肾动脉、静脉和癌症细胞中发现这种细胞。PAI-1的过表达与肿瘤侵入、血管异生和转移、及心肌梗塞、动脉粥样硬化、再狭窄、和thrombembolic疾病有关(美国专利第6,224,865号；Gunther，J.Surg.Res.103(1)：68-78(2002)；Harbeck，J.Clin.Oncol.20(4)：1000-7(2002)；DeYoung，Circulation 104(16)：1972-1 and(2001)；Rerolle，Nephrologie 22(1)：5-13(2001))。在患有糖尿病的病人动脉壁中，纤溶酶原激活物1型抑制剂(PAI-1)有所增加，加速临床上观察到的患有糖尿病的病人体内动脉粥样硬化和噬菌斑的发展(Pandolfi，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.21(8)：1378-82(2001)).通过使用特异性抗体、肽拮抗剂、反义和诱骗低聚核苷酸能够抑制PAI-1的活性(Rerolle，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.21(8)：1378-82(2001)).
[00106]Ii抑制治疗还被证明与传染性疾病有关。这包括病毒性疾病(DNA和RNA病毒)、细菌性疾病(格兰氏阳性和革兰氏阴性)、分枝杆菌疾病、螺旋体疾病、立克次氏体病、支原体加衣原体疾病、真菌感染、原生动物和蠕虫感染和外寄生物感染。
[00107]关于天然存在的抗原呈递细胞，包括体内和非体内的应用。在目前所公开的内容中，术语＂靶向＂有时用于描述直接对于抗原蛋白质内抗原蛋白质或特定抗原表位的免疫反应。这种免疫反应部分特征在于T免疫调节细胞，例如T辅助细胞或抑制性T细胞的活化作用，其中T免疫调节细胞根据反应环境的变化可以是Th1、或Th2、或Th3细胞。例如，Th1反应是相对肿瘤抗原CTL反应发展的辅助反应，其中，该肿瘤抗原反应导致肿瘤细胞的死亡。然而Th1对过敏原的反应在功能上是一种抑制反应，免疫偏离对过敏原的反应，使其远离导致致病性IgE抗体生产的Th2反应。另外，目标方案不只包括免疫反应的初始部分，而且包括那些下游效应因子反应，其中，免疫反应是通过新型的或增加量的ll类MHC呈递抗原表位的呈递作用刺激发生的，下游效应因子反应通过T免疫调节细胞上的初期反应被诱导或被调节。因此，例如，目标包括起始于这里所教导的目标方法的CTL-抗癌反应或免疫球蛋白抗病毒反应。
[00108]目标包括免疫反应直接指向抗原的方案，无论抗原是指定的还是未知的，也不论抗原是否无经过过度实验就无法辨认。例如，目标可以被指向能够表达很多抗原的细胞，这里的每个抗原都可以促进免疫反应的产生。细胞内参与免疫反应的特定抗原在人与人之间可能是不同的，取决于个人的遗传组成。免疫反应对遗传因素的感受性在这里进行了很好的描述。因此，使用目标方法进行有效的治疗或诊断目的时，细胞具体的抗原成分不必也经常无法确定。
[00109]目标过程包括体内或体外发生的过程。在体内，例如，免疫调节型T细胞对通过ll类MHC阳性细胞呈递的抗原的活化作用可以发生在非肿瘤位置或透过肿瘤，其中，ll类MHC阳性细胞或者是肿瘤细胞或者是树状细胞。免疫反应效应因子部分的膨胀同样可以在体内或体外发生。就体外反应来说，可以产生能够重新引入人体或者另一选择个体的产物，从而影响治疗反应。这种产物的实施例包括树状细胞制剂、细胞毒性T细胞制剂、和克隆来自体外靶向培养的B细胞之后产生的抗体，例如B细胞杂交瘤生产之后产生的抗体。
[00110]为此，依据引入提供外周血单核细胞的个体所需的有治疗效果的产物，最初的培养物可以被分馏富集，得到所需细胞，例如，树枝状细胞或T淋巴细胞。另外，在这里教导的靶向过程起作用之后，培养物可以被分馏得到所需细胞，例如树枝状细胞或T淋巴细胞。或者在分离之后和本发明靶向过程之前，或者在靶向过程其作用之后，可以使用已有方法分馏来自个体的细胞。而且，已有过程可以将这种产物引入能够提供外周血单核细胞的个体中。为此，本发明关于靶向的方法不限于外周血单核细胞，还包括所有能够从个体获得的、包括口咽或其他区域粘膜细胞的细胞产物，支气管或胃灌洗所得的细胞，从任意器官例如肿瘤组织或正常组织，例如肝脏、胰腺、前列腺、骨骼肌、脂肪、皮肤通过活体切片检查或切除所得到的细胞。
[00111]在所有情况下，目标是向天然存在的抗原呈递细胞引入一种重要的抗原表位，该抗原表位对治疗的病理条件和Ii表达抑制剂具有特异性。肿瘤或病毒基因转染的树枝状细胞能够引起强烈的抗肿瘤或抗病毒免疫反应。在这种抗原基因转染的树枝状细胞中，Ii蛋白表达的抑制作用能够提高DNA接种疫苗的功效。在包括天然存在的抗原呈递细胞的体内和非体内实施方案的情况下，优选引入一种可表达的核酸序列和一种Ii抑制剂，其中，所述可表达的抗原序列能够编码重要抗原表位，所述Ii抑制剂可以是一种反向基因构建物或共聚物，例如反义或siRNA组合物。
[00112]术语“可表达的核酸序列”包括能够编码有翻译能力的RNA的有转录能力的DNA构建物，和在引入之前被转录的有翻译能力的mRNA。本领域技术人员熟知预告转录和翻译能力所需的分子信号。
[0013]在本发明所有实施方案中，有可能在单一分子构建物中提供这两种需要的元素(例如，使用具有足够能力接受能够编码抗原表位和Ii抑制剂的病毒载体传递系统)。由于例如，当需要II类MHC分子隐性细胞向II类MHC分子阳性细胞转变时，其他的序列也可以被包括在这种单一分子构建物中。在这种情况下，还可以包括一种可表达的核酸序列，该核酸序列编码能够影响转变过程的蛋白。这种蛋白包括，例如，CIITA和这里描述的干扰素γ。作为选择，可以使用单独表达的构建物来携带每种元素。在使用单独构建物的情况下，以独立的方式传递，单一抗原呈递细胞吸收每种构建物的可能性是统计学上的概率问题。而且，相对于有害免疫反应产生的病毒蛋白质的合成，在单一病毒颗粒中包裹一种以上的构建物，能够最大化Ii抑制作用治疗有效性感应的效果，并且当具体指明时，具有Ii类MHC感应和/或所需蛋白抗原合成感应的效果。这种抗病毒免疫反应能够，例如，限制治疗性干扰作用可能具有的频率。
[00114]因此，用于在能够抑制Ii蛋白质表达的Il类MHC分子阳性细胞表面上显示一种重要的抗原表位的方法可能包括：a)提供一种细胞，这种细胞或者是Il类MHC分子阳性的或者是能够被诱导在它的细胞表面上表达II类MHC分子的细胞，而且其中该细胞表达Ii；和向步骤a)的细胞中引入一种重要的抗原表位和一种Ii抑制剂。这种Ii的抑制剂可以是任意Ii抑制剂，且可以是本发明的反向基因构建物或共聚物，例如一种siRNA或反义组合物。重要的抗原表位可以在Ii抑制剂的引入之前、之后或同时被引入。在这种需要Il类MHC分子阴性细胞转变为Il类MHC分子阳性细胞的方法中，尽管不严格要求，但是可以当抑制Ii和/或重要的抗原表位时，可以引入编码影响转变蛋白质的可以表达的核酸序列。
[00115]也需要考虑通过非病毒性给药系统的引入。使用非病毒性给药系统，未复合的DNA、DNA-脂质体复合物、DNA-蛋白质复合物和DNA-包衣的金颗粒可以被送到细胞中。其中每一种方法分别提供了用于特定病理的控制筛选的优缺点。通过利用复合DNA(例如，DNA-脂质体复合物、DNA-蛋白质复合物、DNA-包衣的金颗粒、和聚交酯乙交酯颗粒中的微囊化作用)可能能保证送到单一细胞、两个编码核酸序列的抗原表位和编码Ii表达抑制剂的核酸序列中。即使通过不同的分子种类编码，但由于它们是＂被包裹的＂(例如，或者装入脂质体胶囊中，或者包衣在金颗粒上)，两个种类可能能被传给单一细胞。
[00116]DNA包衣的金颗粒通常使用所谓的＂基因枪＂工艺通过冲击法供给。使用这种技术，金颗粒可以被射入皮肤或肌肉组织中，并用于穿透细胞。被穿透的细胞已经显示了能够表达以这种方式被引进的核酸序列。树状细胞是天然存在的抗原呈递细胞，能够使用这种技术有效地被转染。例如，在被引入单一树枝状细胞的时候，这种表达构建物可以在与II类MHC分子有关的抗原呈递细胞表面上显示重要的抗原表位。抗原表位/Il类MHC分子复合物在抗原呈递细胞表面上的显示将会刺激其他的免疫细胞提供增加免疫反应。
[00117]做为选择，在提出的病理病况已经有确定的解剖位置(例如，原发瘤或某些肿瘤疾病的转移)的时候，可以表示出向确定的解剖学位置的直接注射。这种位置可能被富集在抗原呈递细胞例如树枝状细胞中。肿瘤是这种引入位置的实施例。用于实现向细胞中引入有关可以表达的核酸构建物的方法是恰当的。在向确定的肿瘤位置引入这种构建物的时候，优选包括一种编码刺激II类MHC分子表达蛋白质的附加的可以表达核酸序列。这种第三成分的加入对于细胞本身是有意的。如果抑制Ii表达的构建物和II类MHC分子生产的可以表达的诱导物被显示病变的细胞(例如，肿瘤细胞)吸收，该细胞便会在它的与II类MHC分子有关的细胞表面上显示病理特定的抗原表位。这种细胞可能同时刺激T辅助细胞和B淋巴细胞。因此，这三种可以表达因素的直接注射与针对定位病理的治疗的结合可被看作一种结合治疗，这种结合治疗靶向正常抗原呈递细胞和Il类MHC分子阴性细胞显示的病变。
[00118]除了利用可以表达的核酸序列来诱导Il类MHC分子生产之外，本领域技术人员可以识别这种和相关环境中核移植过程的适用性(Wolf，Arch.Med.Res.32(6)：609-13(2001)；Wakayama，Science 292(5517)：740-3(2001)).另外，一种抗原呈递细胞可以来源于那些已经被诱导除去区别从而表达肿瘤胚胎抗原的体细胞(Rohrer，J.Immunol.162(11)：6880-92(1999))。这种细胞可以用来诱导重要的抗原表位上的免疫攻击。在体内完全分化的细胞可以被诱导除去区别从而达到成熟形式影响器官再生(Abbate，Am.J.Physiol.277(3 Pt 2)：F454-63(1999))。为了刺激对异常细胞的免疫攻击，这些细胞还可以起到抗原呈递细胞的作用(Fu，Lancet 358(9287)：1067-8(2001))。
[00119]在本发明另一实施方案中，在体内靶向抗原呈递细胞，通过皮下注射一种细胞因子(例如，GM-CSF)刺激正常组织。这种皮下＂引发＂吸引树枝状细胞到此区域。引发注射之后注射能够编码重要的抗原表位的可以表达的核酸序列，及Ii合成的抑制剂(例如，siRNA)。新生细胞是病变-特异性肽的发生器，但通常不在与II类MHC分子有关的细胞表面上呈递这种特异性肽。在这种细胞中，有可能同时诱导II类MHC分子表达和抑制Ii表达。例如，II类MHC分子的表达可以通过引入II类MHC分子阴性细胞，一种编码刺激II类MHC分子生产的蛋白质的cDNA来诱导。这种蛋白质包括，例如CIITA或干扰素γ。这种结合干预引起病变特异性、包含抗原表位的肽显示在与II类MHC分子有关的细胞表面上。如上所述，可以表达的核酸序列的引入是实现这些目标的优选的方法。
[00120]正如以上的讨论，在病变表现一种确定的初期位置(例如一种肿瘤)的地方用直接注射。任选地，一种编码重要的抗原表位的可以表达的核酸序列可以被包括在注射材料中，靶向在该地区的重要的抗原表位。对于病变细胞，传递目标是Ii抑制因子和II类MHC分子诱导物。
[00121]随后，与肿瘤内注射结合的特异性方案以确定的治疗方案为基础，例如包括编码核酸序列的细胞因子或细胞因子的瘤内注射。这种方案在许多出版物中进行了描述，这些出版物包括例如：Schultz，J.，Cancer GeneTher.7(12)：1557-650(2000)；Mastrangelo，M.J.，Cancer Gene Ther.6(5)：409-22(1999)；Toda，M.，MoI.Ther.2(4)：324-9(2000)；Fujii，S.，Cancer GeneTher.7(9)：1220-30(2000)；Narvaiza，L1 J.Immunol.164(6)：3112-22(2000)；Wright，P.，Cancer Biother.Radiopharm.14(1)：49-57(1999)；Cancer Res.58(8)：1677-83(1998)；Staba，M.J.，Gene Ther.5(3)：292-300(1998)；美国专利第5,833,975号；美国专利第6,265,189 B1号；Griffith，T.S.，J.Natl.Cancer Inst.93(13)：998-1007(2001)；Siemens，D.R.，J.Natl.Cancer Inst.92(5)：403-12(2000)；Sacco，M.，Gene Ther.6(11)：1893-7(1999)；Cao，X.，J.Exp.CHn.Cancer Res.18(2)：191-2000(1999)；Wright，P.，Cancer Gene Ther.5(6)：371-379(1998)；Nasu，Y.，Gene Ther.6(3)：338-49(1999)；U.S.Patent No.6,034,072；Lotze，M.T.，Cancer J.ScL Am.6 Suppl 1：S61-66(2000)；Schmitz，V.，Hepatology 34(1)：72-81(2001)；Wang，Q.，Gene Ther.8(7)：542-50(2001)；Dow，S.W.，J.Clin.Invest.101(11)：2406-14(1998)；Kagawa，S.，Cancer Res.61(8)：3330-8(2001)；Addison，C.L.，Gene Ther.5(10)：1409-9(1998)；Lohr，F.，Cancer Res.61(8)：3281-4(2001)；Yamashita，Y.I.，Cancer Res.61(3)：1005-12(2001)；Kirk，C.J.，Cancer Res.61(5)：2062-70(2001)；Hum.Gene Ther.12(5)：489-502(2001)；Putzer，B.M.，J.Natl.Cancer Inst.93(6)：472-9(2001)；Mendiratta，S.K.，Hum.Gen.Ther.11(13)：1851-62(2000)；国际公开号WO99/47678；Natsume，A.，J.Neurooncology 47(2)：117-24(2000)；Peplinski，G.R.，Surgery 118(2)：185-90(1995)；deWilt，J.H.，Hum.Gene Ther.12(5)：489-502(2001)；Emtage，P.C.，Hum.Gene Ther.10(5)：697-709(1999)；Clin.Cancer Res.3(12 Pt 2)：2623-9(1997)；Chen，S.H.，MoI.Ther.2(1)：39-46(2000)；Putzer，B.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(20)：10889-94(1997)；Walther，W.，CancerGene Ther.7(6)：893-900(2000)；Fushimi，T.，J.CHn.Invest.105(10)：1383-93(2000)；Xiang，J.，Cancer Gene Ther.7(7)：1023-33(2000).
[00122]关于非体内应用，肿瘤细胞被从个体中分离出来，产生非体内培养物。这种培养物可以被个体的未经过选择的恶性细胞产生，所述恶性细胞可以是与正常细胞分离的，也可以是未与正常细胞分离的，或者可以获得作为细胞系或这种细胞系的克隆体的细胞。做为选择，这种细胞从确定的恶性细胞系处获得，所述恶性细胞系是无关病人或新鲜恶性组织(例如，结肠癌或卵巢癌)的外植体的恶性细胞系。
[00123]Ii抑制因子和II类MHC分子诱导物被引入培养细胞，产生需要的II类MHC分子相关的肿瘤特异性呈递或肿瘤相关抗原表位。II类MHC分子表达的诱导物在本领域为大家所熟知，包括，例如，Il类MHC分子处理因子(CIITA)1干扰素γ基因和干扰素γ细胞因子。经过这种方式处理的细胞不具有复制能力(例如，通过辐射或固定)，且能够用于惯用的免疫方案(例如，皮下注射、静脉注射、腹腔内注射或肌肉注射免疫)中。除了全细胞制剂外，其它的衍生物也可以被用于免疫制剂。
[00124]尽管大多数有关的肿瘤细胞是I类MHC分子且是i-阴性的，但同时某些肿瘤(例如，某些感染例如，乳房、肺和结肠的淋巴瘤、恶性黑素瘤和恶性腺瘤)是I类MHC分子-阳性和li-阳性的。在表达II类MHC分子的子集中只引入一种Ii抑制因子就足以达到需要的免疫刺激作用。应当认为，在这种细胞包含的Il类MHC分子诱导物可以通过增加T辅助细胞与II类MHC分子相关抗原相互作用的可能性来提高需要刺激作用。
[00125]另一种重要细胞既不是恶性病毒感染的细胞也不是天然存在的抗原呈递细胞。可以表达的核酸序列被传递到个体组织的组织间隙。这种组织包括，例如，肌肉、皮肤、脑、肺、肝、脾脏、骨髓、胸腺、心脏、淋巴、血液、骨、软骨、胰腺、肾、胆囊、胃、肠、睾丸、卵巢、子宫、直肠、神经系统、眼睛、腺体和结缔组织。组织的组织间隙包括细胞间质、流体、器官组织网状纤维间的粘多糖基质、导管或腔室壁的弹力纤维、纤维组织的胶原蛋白纤维、或放入肌细胞结缔组织或骨空隙中的相同基质。这些间隔同样可以通过血浆循环和淋巴系统的淋巴液进行使用。
[00126]已经有报道表示体内肌细胞尤其具有吸收和表达可以表达的核酸序列的能力(参见，例如，美国专利第6,214,804号，其公开的内容在这里通过引证并入本文)。这种传递优势是由于独特的肌肉组织构造，包括多核细胞、肌质网和横管系统。可以表达的核酸序列可以通过横管系统进入肌肉，所述横管系统包含细胞外液并延长深入肌细胞中。同时，这种可以表达的核酸序列可能进入损伤的肌细胞中，随后将损伤的肌细胞恢复。
[00127]在治疗应用方面，因为动物具有一种成适当比例地大肌肉块，该肌肉块可以通过皮肤直接注射方便地进入，因此，肌肉还被方便地用作传递可以表达的核酸序列的位点。因此，通过多次重复注射，相当大剂量的可以表达的核酸序列可以被储存在肌肉中。治疗可以延续较长的时间，这种治疗是安全的，且容易进行，不需要特殊的技术和设备。除了肌肉之外的组织，其特点在于不能很有效的吸收和/或表达可以表达的核酸序列，但也可以用作注射位点。
[00128]关于本发明，理想地情况是在靶细胞中抑制Ii合成，以及表达重要的抗原表位抗原表位特异性地与被治疗的病理情况有关)。如本领域内已知的，有效剂量的可以表达的核酸序列通常在0.05微克/kg体重到大约50mg/kg体重(通常大约0.005mg/kg到大约5mg/kg)范围内。应当认识到，有效剂量可能根据许多相应因子而变化。
[00129]用于产生能够生产上述病变相关的抗原并在与II类MHC分子有关的细胞表面上显示的细胞的另一方法是细胞融合方法。更准确地说，产生能够天然地生产II类MHC分子的细胞(例如，天然存在的抗原呈递细胞例如树枝状细胞)与显示重要病变的细胞(例如，肿瘤细胞)的融合体是常规实验内容。在这种融合细胞中，肿瘤特异抗原将会与II类MHC分子相结合被显示在融合细胞的表面上。在大多数场合下，产物是天然存在的抗原呈递细胞的一种融合体，其中，所述天然存在的抗原呈递细胞例如树枝状细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞、或某些多潜能细胞、和表达重要的抗原表位的细胞。这种表达重要的抗原表位的细胞包括，例如，恶性细胞、受病毒感染细胞或转换细胞、与自身免疫反应的感应现象有关的细胞、和调节自身免疫反应的细胞。后一类细胞包括通过抗独特型网络机理发挥影响的细胞(例如，表达变形性关节炎中致病性T细胞受体)。这种细胞型的细胞融合在体外产生。按照本文公开的内容进行Ii抑制和疫苗接种。
[00130]本领域技术人员可以认识到，本发明的方法可以与细胞因子治疗(即，引入编码核酸序列的细胞因子或细胞因子本身)相结合进入被治疗的细胞或它们的局部环境中。也可以使用其它的免疫共刺激分子(Akiyama，Y.，Gene Ther.7(24)：2113-21(2000)；Miller，P.W.，Hum.Gene Ther.11(1)：53-65(2000)；J.Neurosurg.94(2)：287-292(2001)；Jantscheff，P.，Cancer Immunol.Immunother.48(6)：321-30(1999)；Kikuchi，T.，Blood 96(1)：91-9(2000)；Melero，I.，Gene Ther.7(14)：1167-70(2000)；Lei，H.，Zhongua Zhong Liu ZaZhI 20(3)：MA-7(1998)).
[00131]正如前面提到的那样，本领域技术人员可以在不进行过度实验的情况下识别病变特异性抗原，在Il类MHC分子-相关的显示会向这种病变特异性抗原提供一种增强的免疫反应。此外，在所有情况下，为了影响与II类MHC分子有关的抗原显示，需要Ii抑制作用。下表是属于这类抗原的实施例的非限制性、非详尽列表：HIV gp 120(Barouch et al.，J.Immunol.15；168：562-8(2002))；HIV gag(Singh et al.，Vaccine 20：594-602(2001))；流行性感冒M1和M2(Okuda et al.，Vaccine 19：3681-91(2001))；B型肝炎表面抗原和核心抗原(Musacchio et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.282：442-6(2001))；人类端粒酶反转录酶(hTERT)(Heiseret al.，Cancer Res.61：3388-93(2001))；Gp75TRP-1(Bowne，Cytokines CeII MoI.Ther.5：217-25(1999))；TRP-2和gp100(Xiang，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：5492-7(2000))；PSA(Kim，Oncogene 20(33)：4497-506(2001))；CEA(von Mehren et al.，Clin.Cancer Res.7：1181-91(2001))；Erb2/Neu(Pilon et al.，Immunol.167：3201-6(2001)，和Tuting，Gene Ther.6：629-36(1999)).
[00132]本发明的另一方面提出，传染性病毒的基因重组在某种意义上能够促进对于这种构建物当作为预防或治疗疫苗被给药时的免疫反应。各种各样的病毒疫苗适合于基因修饰方法，尽管基因重组和用于构成并使用的方法根据重要的病毒不同而不同。为了这一目的，可以考虑使用设计并使用重组DNA病毒和RNA病毒的特异性方法，其中以牛痘作为重组DNA病毒的原型实施例，以流感病毒作为RNA病毒的原型实施例。
[00133]疫苗病毒具有两种形式，或者是DNA型或者是RNA型。一个形式包含Ii-RGC或用于表达siRNA的构建物，所述siRNA能够导致受感染细胞中Ii蛋白质表达被抑制，第二形式具有：a)一种Ii-RGC或一种用于表达siRNA的构建物，所述siRNA能够导致受感染细胞中Ii蛋白质表达被抑制，和b)一种导致II类MHC分子表达的基因构建物，例如，CIITA或干扰素-γ的基因。就DNA病毒，例如牛痘来说，基因在典型的哺乳动物启动子例如CMV、RSV、Ubc、EF-1α和U6的控制下。就RNA病毒，例如流行性感冒来说，插入构建物RNA的翻译通过流行性感冒病毒酶调节的RNA转录和翻译机制来表达。第一种病毒只具有抑制Ii蛋白质在受感染细胞中表达的能力，这种病毒靶向已经内源表达Ii蛋白质和II类MHC分子的细胞型。这种细胞型包括皮肤的郎格罕氏细胞、皮肤或呼吸道或内脏粘膜的表面中的其他树枝状细胞、或来自骨髓的被移动的细胞、或从骨髓或脾脏处获得的细胞，外周血巨噬细胞或其他体液例如腹部、胸膜、体腔心包处产生或诱导的渗出液或漏出液。其他的细胞型包括B细胞、或B族白血病和淋巴瘤细胞、和通过活化作用表达II类MHC分子和Ii蛋白质的细胞、例如某些T细胞子集和转换的恶性细胞或正常细胞。第二种病毒构建物(上述b型)可以在用于感染上述a)型病毒的所有细胞型中转染并调节Ii表达，此外还可以转染角化细胞、或肌细胞、或其他不正常表达II类MHC分子和Ii蛋白质但能被在病毒结合的基因序列影响下被例如CIITA或者干扰素γ诱导产生分子感应现象的细胞。
[00134]DNA病毒或RNA病毒这两种类型的实施例的构造可以用标准分子生物学技术实现。编码CIITA和li-特异性siRNA的cDNA可以使用标准分子克隆方法被引入编码牛痘、金丝雀痘或其他DNA病毒的质粒中(Panicali D.Proc Natl Acad Sci USA.1982；16：4927-31).完整的牛痘病毒DNA和CIITA和li-特异性siRNA表达框可以被克隆入与病毒序列侧面连接的载体中。克隆的CIITA和li特异性siRNA表达框之间发生同源重组且在适当的病况下选择新型病毒(PanicaliD.Proc Natl Acad Sci USA.1982：16：4927-31；Marti WR.Cell Immunol.1997：179：146-52；Bertley FMN.JImmunol.2004；172：3745-57).使用编码病毒cDNA的质粒同样可以构造重组RNA病毒。已经发展了一种以质粒为基础的反向遗传系统用于甲型流感病毒(Pleschka S.JVirol 1996；70：4188-92).这种系统使用包含平头人类聚合酶I启动子的质粒，能够表达病毒性RNA.CIITA和li-特异性siRNA表达框可以被克隆入编码流行性感冒HA或NA基因的质粒中。编码病毒基因组所有8个节段的质粒可以被共转染入组织培养细胞，从而恢复传染性的重组病毒，这些重组病毒可以用作接种疫苗。做为选择，编码CIITA和li特异性siRNA的重组质粒可以被转染入感染上的流行性感冒辅助病毒的细胞系中。使用一种选择方法，可以分离出包含遗传发生转染子病毒的病毒(Palese P.J Virol.1996；93：11354-8)。各种各样的构建物的设计和制备及其作为疫苗的应用可以根据下列美国专利所述的材料和方法实现：美国专利第5976552号、美国专利第5292506号、美国专利第4826687号美国专利第6740325号、美国专利第6651655号、美国专利第5948410号、美国专利第5824536号、美国专利第4029763号、美国专利第4009258号、美国专利第668463号、美国专利第667611号、美国专利第6623962号和美国专利第6506559号。可以使用体外和体内模型来检测表达CIITA和li-特异性siRNA的重组病毒增强Il类MHC的反应能力。
实施例
实施例1
包含CIITA cDNA的腺病毒载体的结构
[0135]实验的最初目标是为II类MHC分子有效的导入II类MHC分子阴性细胞(例如，MC-38和Renca)而建立一个腺病毒载体。使用Sal1从包含CIITA的pCEP-4载体上切除包括CMV启动子和聚A尾的CIITA基因的结构。这个片断连接到pBluescript质粒上生成pBlue/CIITA。然后用EcoRV和Xhol消化pBlue/CIITA释放包括CMV启动子、CIITA和聚A信号的DNA片断，将它连接到pQBI/BN(加拿大蒙特利尔昆腾公司)来生成pQBI/BN/CIITA。
[0136]根据厂家的说明书将这个载体共转染进用Cla1消化腺病毒DNA的293A腺病毒包装的细胞中(为减少背景病毒的左臂被删除)。共转染三个星期以后，产生的噬菌斑用位于-7到+12和+751到+769的CIITA互补DNA的两个DNA引物做PCR来筛选以保证CIITA基因的存在。一个克隆用于两种鼠的肿瘤细胞系：MC-38结肠腺癌和Renca肾细胞腺癌中II类MHC分子的试验诱导。II类MHC分子诱导的时间进程用腺苷酸/CIITA重组腺病毒载体在转染后在这些细胞系中测定。一种另外的等同的缺少CIITA插入的腺病毒载体被用作对照。它决定于那些II类MHC分子在转染后48-72小时有>95％的细胞被强烈地诱导。
实施例2
通过用腺苷酸/CIITA加上Ii反义寡核甘酸处理的MHCII类II+/Ii-表现型的生成。
[0137]这些实施例证明了通过用腺苷酸/CIITA的细胞感染表达MHCII+/Ii-类表现型的细胞的生成和通过定义Ii反义寡核甘酸的Ii表达的抑制。Ii反义寡核苷酸在前面已经证明是有效的(Qiu et al.，Cancer Immunol.Immunother.48：499-506(1999))。对照实验包括：a)没有处理；b)仅有腺苷酸/CIITA构造；c)腺苷酸/CIITA构造和正义对照寡核甘酸一起；和d)腺苷酸/CIITA构造和四-核甘酸错配对照反义寡核甘酸一起。简要地说，1.5x106MC-38细胞在用寡核甘酸电转化前接种于25cm2细颈瓶中24小时，并在包含1.5ml病毒繁殖液(1.26x106PFU/ml)的5ml总体积培养基总感染48小时。在感染的第一个24小时后，加入10ml新鲜的培养基再将细胞培养24小时。然后在用反义，正义或错配寡核甘酸电转化之前将这些细胞胰蛋白酶化并洗涤。电转化条件如下：将有包含50mM寡核甘酸的0.5ml RPMI 1640培养基的3-5x106细胞加入到电转化杯中。这些细胞在冰上培养10分钟并用BTX600电转化仪200V/1250mF电转化。然后将电转化杯在冰上再培养10分钟，之后将细胞洗涤一次，接种于25cm2细颈瓶中并培养24小时。这时，这些细胞被胰蛋白酶化并按照如前面所描述的对II类MHC分子分子Ii蛋白染色通过流式细胞术进行分析(Qiu et al.，CancerImmunol.Immunother.48：499-506(1999))。
[0138]在如图1所示的典型的实验中，Ii反义处理和腺苷酸/CIITA转染的细胞表现出良好的Ii选择性抑制，对II类MHC分子表达一点点或几乎没有影响。对照的寡核甘酸处理的细胞(也就是，使用错配或正义序列)表明没有Ii的抑制和有相对于腺苷酸/CIITA转染细胞可比较的II类MHC分子表达。
[0139]在动物研究的期望和产生更大量MHC II.sup.+/Ii.sup.-类细胞的需要中，上述研究在扩增体系中被重复。5x106 MC-38细胞在感染前接种于75cm2细颈瓶中18-24小时。这些细胞用5ml病毒繁殖液(1.26x106PFU/ml)感染90分钟并加入20ml新鲜的培养基。然后将这些细胞培养48小时并按照上面所述的方法电转化来输送寡核甘酸(50mM)。然后收集这些细胞并在新鲜的75cm2细颈瓶中再培养24小时，在这之后更换培养基并将这些细胞再培养3小时。然后对这些细胞分析II类MHC分子和Ii蛋白的表达以及鼠的免疫。如在前面的实验中观察到的，仅在用腺苷酸/CIITA感染的和用反义Ii处理的细胞中得到Ii蛋白表达的序列特异性抑制。
实施例3
通过MHC II+/Ii-类肿瘤疫苗的肿瘤保护
[0140]对这些研究，MC-38肿瘤疫苗肿瘤疫苗按照上面所描述的办法制备并用于接种6-7星期龄老、雌性的C57BL/6鼠(Jackson实验室)。特别地，MC-38细胞用如描述的腺苷酸/CIITA感染，分成四组并通过用以下几种方式电转化处理：a)无；b)50mM Ii反义寡核甘酸；c)50mM错配对照寡核甘酸；或d)50mM正义对照寡核甘酸，并接种于细颈瓶。24小时后，加入新鲜的培养基并再培养3小时。然后将细胞胰蛋白酶化，用50Gy(铯源)致死照射并按照1.2 x 106细胞/鼠接种于鼠中。五个星期以后，用5 x 105父系MC-38细胞挑战这些鼠并监测对肿瘤的出现。如图2所示，用Ii反义处理、相对于所有其它的对照群组提供较好的保护反对肿瘤生长腺苷酸/CIITA感染的MC-38细胞接种。这些数据与我们在前面使用用CIITA稳定地转染和Ii反义处理的MC-38细胞的研究是一致的(图3)。正如所见到的，使用稳定的CIITA转染的MC-38细胞或用Ii反义瞬时的腺苷酸/CIITA-感染的细胞的防护水平给出了一个可比较的防护水平。
实施例4
通过MHC II+/Ii-类肿瘤疫苗和GM-CSF的肿瘤保护
[0141]在另一系列的动物研究中，和GM-CSF一起的Ii-抑制MC-38疫苗关于父系MC-38细胞的随后的生长的角色被研究。对这些研究，在MC-38细胞免疫来吸引树枝状的细胞前一天给鼠在右后腿注射18g GM-CSF(R&D系统，明尼阿波利斯，美国明尼苏达州)s.c.。并且，用来使鼠免疫的MC-38细胞的数目仅3 x 105细胞/鼠，与用在前面的实验相比降低了4倍。如图4所示，GM-CSF提高了II+/Ii-类MC-38细胞引出的保护作用。仅接种3x105II+/Ii-类Ii-细胞的鼠同样地抑制父系细胞生长实际上在GM-CSF不存在时由1.2 x 106II+/Ii-类MC-38细胞诱导的。在前面的研究中，表明由IFN-诱导的MHC比由CIITA提供更强烈的抗肿瘤免疫应答的诱导(Qiu et al.，Cancer Immunol.Immunother.48：499-506(1999))。
[0142]这些研究表明在细胞因子和Ii抑制之间的协同效应是可行的。补充的研究计划结合GM-CSF和IFN-与Ii反义策略的利用并优化和扩增这个免疫方案。
实施例5
包含IFN-γ互补DNA的腺病毒载体的结构
[0143]IFN-γ在调节免疫应答的方向中起了重要的作用，并且它在包括一些恶性细胞的各种组织和细胞中诱导II类MHC分子和Ii。通过用IFN-结构转染来创造和通过反义寡核甘酸的Ii抑制的MHC II+/Ii-类肿瘤疫苗相对于另外的等同的肿瘤疫苗有增加的免疫遗传性，在这种等同的肿瘤疫苗中II类MHC分子表达是通过CIITA转染来诱导的(Qiu et al.，CancerImmunol.Immunother.48：499-506(1999))。可表达的鼠IFN-序列已经被克隆成腺病毒。II类MHC分子和Ii蛋白两者的表达是由腺苷酸/IFN-γ在非常低的浓度下被诱导的(参见图5)(即使是MOI值为1时，数据未显示)。为了产生腺苷酸/IFN-结构，鼠IFN-γ互补DNA(Chen et al.，J.Immunol.151：244-55(1993))通过用两个特殊的寡核苷酸互补的到包含IFN-γ互补DNA上起始和停止密码子的区域进行PCR来扩增。IFN-γ片断通过使用特别设计的核酸内切酶消化位点被克隆成pCDNA(3+)质粒并进行测序确认。CMV启动子、IFN-γ、和聚A信号采用适当的寡核苷酸被进一步PCR扩增然后使用适当的限制位点克隆成pQBI/Ad/BN。腺苷酸/IFN-γ重组病毒的产生通过实施例1中所描述的同样的方法进行。
实施例6
包含Ii-RGC的腺病毒载体的结构
[0144]几个Ii反向基因结构在RSV.5和pcDNA(3+)表达载体中被克隆。该结构的子集表明有能力使用传统的转染方法(例如，Iipofectin)在II类MHC分子阳性细胞(A20)中抑制Ii。当它已经表明Ii反义寡核甘酸也是有效的，他们要求有与显著相关的毒性的电转化或其他的方法。并且，至多30％-70％用寡核苷酸寡核苷酸的细胞证明有Ii表达的显著抑制。相反地，为基因输送地腺病毒载体的使用产生几乎100％的输送到所有细胞、要求的表型变化和实质上没有毒性。几个Ii-RGCs被克隆成腺病毒以得到更好的MHCII+/Ii-类表型的诱导。为了制出包含sIi-RGCs的重组腺病毒，由RSV(orCMV)启动子、Ii反向片断和多聚A信号组成的表达框架通过PCR扩增并克隆进pQBI/BN载体来生成pQBI/BN/Ii-RGC。腺苷酸/Ii-RGCs最后的结构通过实施例1中所描述的相同的程序来完成。在一个MHC II+/Ii-类表型的诱导实验中，RGC的增加到腺苷/CIITA时的4倍，当II类MHC分子的表达几乎没有效果时Ii在95％的细胞中被抑制(见图6)。
实施例7
包含IFN-γ和Ii-RGCs的腺病毒载体的结构
[0145]为简化感染，腺苷酸/IFN-γ/Ii-RGC的结构已经产生。启动子、Ii-RGC片断和多聚A信号通过采用适当的寡核甘酸进行PCR扩增并克隆进pQBI/Ad/BN/IFN-γ来制得pQBI/Ad/BN/IFN-γ/Ii-RGC，它其后用来产生腺苷酸/IFN-γ/Ii-RGCs。据观察，在通过采用腺苷酸/IFN-γ/Ii-RGCs感染MHCII+/Ii-类表型诱导实验中，通过用pQBI/Ad/BN/IFN-γ/Ii-RGC结构(腺苷酸/IFN-γ/Ii-RGC(-92，+97))感染96小时后，MC/38中产生MHC II+/Ii-类表型(参见图7)。
实施例8
包含多种Ii-RGCs的腺病毒载体的结构
[00146]为了Ii-RGCs得效果最佳，几个Ii-RGCs被克隆成腺病毒载体。PCR扩增及其他适当的分子生物学方法用于生成包含不同的Ii-RGCs结合的pQBI/Ad/BN结构。这样的结构的实例包括下面的集合所示。鼠Ii插入(-92，+97)、(+32，+136)、(+314，+458)的核甘酸序列分别如如SEQ ID NOS1、2和3序列表所示。
腺苷酸/(-92，+97)(+314，+458)
腺苷酸/(-92，+97)(+314，+458)X2
腺苷酸/(-92，+97)(+314，+458)X3
腺苷酸/(-92，+97)(+32，+136)
腺苷酸/(-92，+97)(+32，+136)(+314，+458)
[0147]一部分Ii-RGCs也与IFN-γ一起被克隆，包括下面所示的集合。
腺苷酸/CIITA/IFN-γ
腺苷酸/CIITA/IFN-γ/(-92，+97)
腺苷酸/IFN-γ/(-92，+97)
腺苷酸/IFN-γ/(-92，+97)(+314，+458)
腺苷酸/IFN-γ/(-92，+97)(+32，+136)(+314，+458)
[0148]在随后的努力中使包含Ii-RGCs的多拷贝的Ii-RGCs质粒效果最佳，每一个通过不同的启动子驱动。这些质粒包括下面所描述的。
pQBI/Ad/BN∥Ii-RGC(-92，97/-92，97)。启动子分别是RSV，EF-1a。
pQBI/Ad/BN∥Ii-RGC(-92，97/-92，97/-92，97)。启动子分别是RSV，EF-1a，UbC。pQBI/Ad/BN/Ii-RGC(-92，97/32，136/314,459)。启动子分别是RSV，EF-1a，UbC。
pQBIAd/BN/CIITA/Ii-RGC(-92，97/-92，97/-92，97)。启动子分别是CMV，RSV，EF-1a，UbC。
pQBI/Ad/BN/CIITA/Ii-RGC(-92，97/32，136/314,459)。启动子分别是CMV，RSV，EF-1a，UbC。
pQBI/Ad/BN/IFN-γ/Ii-RGC(-92，97/-92，97/-92，97)。启动子分别是CMV，RSV，EF-1a，UbC。
pQBI/Ad/BN/IFN-γ/Ii-RGC(-92，97/32，136/314,459)。启动子分别是CMV，RSV，EF-1a，UbC。
[0149]启动子的缩写：RSV(劳氏肉瘤病毒)，EF1a(多多肽延伸因子-a)，UbC(泛素C启动子)，CMV(细胞巨化病毒)
实施例9
包含人Ii-RGCs的质粒的结构
[0149]通过来源于人Ii基因序列的人Ii-RGCs(hIi-RGC)的人Ii表达的抑制在这里被公开。使用hIi-RGCs在人细胞中抑制Ii表达的实验结果如表1所示。人Ii互补DNA序列(Strubin et al.，EMBO J.3：869-72(1984))是Eric Long博士惠赠的。Ii基因片断的不同长度是使用适当的寡核甘酸通过PCR产生的。所有的Ii片断包含多个AUG起始和终止密码子。所有这些是设计来避免一个AUG通过一个终止密码子以任何阅读框架立即开始来增加反义RNA的半衰期。为做这个，一个AUG被制造以不同的阅读框架来跨越终止密码子。这些Ii PCR片断通过适当的限制位点被克隆成pcDNA3(+)表达载体。人淋巴瘤细胞系，Raji，使用这些hIi-RGCs来用于确定Ii抑制。根据厂家的说明使用1mg hIi-RGC质粒DNA用Polyfect转染试剂(Qiagen)瞬时转染Raji细胞。培养48小时后，为Ii和MHC II和Ii类的表达，通过用抗人Ii抗体、LN2(Pharmingen)和抗DR抗体(Pharmingen)染色细胞随后流式细胞计数来对细胞染色。
[0150]可以观察到li表达在部分细胞中被抑制(背景上4-9％的细胞(参见图8)。这些抑制抑制高地可再生的。另外，以这样的一种瞬时转染测定方式，典型的是培养物中仅仅10％的细胞，或更少，接受增加的DNA结构。因此，背景上4-9％的细胞反映了测定体系的实际转染效率。在这些细胞中没有关于II类MHC分子表达的看得见影响。
表1人淋巴瘤系，Raji中测试的hIi-RGCs。+和++表明一定百分比的细胞显示在没有MHC II分子影响时有深的li抑制(>95)
序列号#            Ii抑制
4                  +
5                  +/-
6                  ++
7                  -
8                  -
9                  -
10                 -
[00152]在尝试最优化hIi-RGCs的活动时，多拷贝hIi-RGCs(几个hIi-RGCs拷贝在一个质粒中)已被制得，在这些多hIi-RGCs中每一个表达框架通过不同的启动子启动。这些质粒如下列表所示。
pQBI/Ad/BN/hIi-RGC(-10，425/-10，425)。启动子分别为CMV，RSV。
pQBI/Ad/BN/hIi-RGC(-10，425/-10，425/-10，425)。启动子分别为CMV，RSV，EF-1a。
pQBI/Ad/BN/CIITA/hIi-RGC(-10，425/-10，425)vUbC，CMV，RSV。
pQBI/Ad/BN/CIITA/hIi-RGC(-10，425/-10，425/-10，425)。启动子分别为UbC，CMV，RSV，EF-1a。
pQBI/Ad/BN/IFN-/hIi-RGC(-10，425/-10，425/)。启动子分别为UbC，CMV，RSV。
pQBI/Ad/BN/IFN-/hIi-RGC(-10，425/-10，425/-10，425)。启动子分别为UbC，CMV，RSV，EF-1a。
实施例10
为MHC II+/Ii-类表型的诱导的Ii-RGC载体和IL-2一起的intratumor注射和治疗效果。
[0153]用105Renca细胞s.c.注射BALB/c鼠。在CIITA:Ii-RGC比率为1:6(w:w)，包含CIITA互补DNA基因、CIITA互补DNA基因和Ii-RGC(-92，97)、或CIITA基因加包含三倍Ii-RGC(-92，97/32，136/314,459)的质粒的质粒被注射进大小为0.05-0.2cm3 Renca瘤。在注射前25毫克的总DNA用DMRIE/C(1，2-dimeristyloxypropyl-3-二甲基-羟基乙基溴化胺/胆固醇)(GIBCO)在1:1(w/w)得比率下培养一到五分钟。注射DNA五天后，从切除得瘤得冷冻部分制得切片。制得的切片用抗鼠MHC II和Ii类抗体染色来确定肿瘤细胞的II+/Ii-类表型。为了排除在肿瘤中的II+细胞可能存在T细胞、B cells或巨噬细胞的可能性采用抗CD4、CD8、CD3、CD19(对B细胞)的抗体和MAC(巨噬细胞)进行染色。结果(数据未列出)表明用CIITA单独注射在肿瘤中有可比较的MHC II讲授Ii类染色，同时有证据说明用CIITA/Ii-RGC(-92，97)或CIITA质粒加包含三倍Ii-RGC的质粒注射的肿瘤中的i抑制。CD4、CD8、和CD3染色显示极个别阳性细胞，表明肿瘤中II+类细胞不是渗透性T细胞。B细胞和巨噬细胞染色也排除了II+类细胞不是B cells或巨噬细胞。同时，脾脏样品的切片也用所有上述的抗体染色作为阳性对照。
[0154]为了研究检测Ii抑制的治疗效果，用Renca格腊维次氏瘤s.c.注射BALB/c鼠并通过第一天瘤内注射不同的包含IL-2(2毫克)、CIITA(3毫克)和Ii-RGC(-92，97)(18毫克)的质粒制剂和第二到四天注射不含CIITA的相同的制剂来处理。对照的鼠连续四天接受一个空载体和2毫克IL-2。每隔2到3天测量肿瘤的大小。鼠随后生活31天到肿瘤大小达到1000mm3终止。结果表明用CIITA和包含载体的Ii-RGC及IL-2处理的鼠显示肿瘤生长显著的减少，而只接受IL-2和对照载体的鼠中肿瘤生长是累进的并要求鼠的生命结束(参见图9)。
实施例11.带有siRNA质粒的人类细胞中Ii的抑制作用
[00155]在抑制Ii蛋白质表达方面，siRNA构建物可以合理地被认为与Ii反向基因构建物同样有效。在这里显示了这种构建物的实施例，通过诱导与Ii cDNA基因共同转染抑制Ii蛋白质表达。在人类肾系293细胞中，检验十个siRNA构建物的Ii表达抑制作用。基于下列理由，可以表达的siRNA构建物优选合成的寡聚核苷酸：1)细胞与RNA低聚核苷酸的转染比与DNA表达构建物转染更加困难。2)合成的siRNA寡聚核苷酸的大规模合成比DNA质粒或其他载体的制备更加昂贵。3)使用组织特异性启动子，构建物的表达(由于Ii抑制的活性)可以被特异性器官或组织靶向。4)siRNA(无论合成的或从遗传载体表达的)的活性通常比反向基因构建物的活性高的多。为此，可以表达的siRNA构建物具有更大的潜在优势用于体内使用。
[00156]siRNA(Ii)构建物的设计：设计十个siRNA(Ii)构建物，表2列出了它们的构造中使用的寡聚核苷酸。用pSuppressor腺苷酸质粒(Imgenex.San Diego，CA)制备构建物，所述pSuppressor腺苷酸质粒是专门为了用于siRNAs的克隆而设计的。该质粒包含两个U6和SV40启动子，经过优化用于siRNA表达，提供了一种适当的克隆位点用于siRNA序列的插入，并允许传递到各式各样的细胞中。而且，这种质粒还可以用于构造包含siRNA-表达构建物的重组腺病毒。可以按照两种方法设计这种siRNA(Ii)构建物。第一，使用Imgenex计算机程序预测5构建物(表2中11-15)。这种程序能够识别具有可能与Ii RNA杂交的碱基组成(即，适当的G-C含量，等等)的RNA序列。如果产生的5siRNA的确与Ii mRNA杂交的话，该5siRNA(Ii)构建物(表2中11-15)被认为是有效的抑制剂。然而，因为任意给定的mRNA的三级结构是很难预计的，实验中没有发现这种计算机设计的siRNA(Ii)构建物能够接近Ii mRNA.因此，同时使用了第二方法来设计5其他的构建物(表2中16-20)。前面的关于使用Ii-RGC抑制Ii蛋白质表达的数据显示某些Ii反义寡聚核苷酸(Qiu Cancer Imm Immunother.48：499-506(1999)(Xu US 6,368,855)和Ii-反向基因构建物(RGC；Lu Cancer ImmunolImmunother.52：592-598(2003))(美国申请第10/127,347号)，与人类IimRNA第一400bp杂交，随后有效的Ii蛋白质表达抑制作用。从这些数据可知，人类Ii mRNA的这个区域能够很大程度上影响siRNA构建物。此外，这种方案与文献中的数据一致，文献数据表明，包含AUG翻译起始位点的mRNA区通常是一种对于反义构建物结合mRNA的灵敏区。因此，通过检查，设计另一5Ii siRNA构建物与人类IimRNAAUG起始位点周围第一400bp内的Ii mRNA部分杂交。因为在人类Ii mRNA的开始有两个AUG，这两个起始位点都是功能性翻译起始位点，设计siRNA同时靶向这两个位点。具体地说，在第一AUG周围设计两个重叠序列，在第二AUG周围设计三个重叠的siRNA序列。尽管这些5siRNA(Ii)序列未必具有最佳的退火参数，但它们可以用于与Ii RNA杂交。设计的所有序列都具有较短的环状序列，从而允许表达的siRNA序列形成发夹结构。发夹结构的形成产生一种功能性双链siRNA。在形成与mRNA相互作用并裂解目标mRNA的RNA-诱导的沉默复合物(RISC)的过程中，已经清楚地表明了对双链RNA的需要(NatureReviews Genetics 2：110-119，2001)。
表2 10个SiRNA构建物的结构
Figure A200580047371D00621
[00157]如上所述，对于分别编码有义链和互补连的shRNA(短发夹RNA)的两个寡聚核苷酸，通过使这两个寡聚核苷酸退火产生一种双链寡聚核苷酸。退火的寡聚核苷酸将会具有＂tcga＂(如上所示)和＂gatc＂悬垂从而帮助克隆进入Sal I和Xba I消化的pSuppressor载体中。划单线的表示的是有义序列。黑体的表示的是环状序列。划双线的表示的是反转序列。
[00158]实验步骤和结果。使用Sal1和Xba1酶切位点，按照标准分子生物学技术，通过将上述序列克隆进入pSuppressor腺苷酸质粒(Imgenex，SanDiego，CA)中产生10个siRNA(Ii)构建物。用带有每个这种Ii siRNA构建物(0.82毫克)的人类Ii cDNA基因质粒(0.18毫克)共同转染293人类肾系细胞(ATCC号码CRL-1573)。确定若干活性Ii siRNA构建物。简短地说，在6-孔平皿中过夜培养293个细胞(2x105/小孔)。使用功能性转染试剂(Qiagen，Valencia，Calif)按照使用说明书将DNA混合物转染进入293细胞中。在CO2培养箱中37℃下培养细胞36小时。用抗人类Ii抗体(LN-2，Pharmingen，San Diego，Calif)对细胞进行胞内染色，然后用流式细胞计(表3)分析。设置仪器的灵敏度(闸门)使其能够监测到99％的Ii-阴性293细胞。用空pSuppressor腺苷酸质粒与Ii cDNA进行共同转染作为阳性对照，即，无Ii抑制。对于这三个单独的实验，确定与空pSuppressor腺苷酸质粒转染的细胞或与十个siRNA质粒的每个转染的细胞中Ii+细胞的百分比(表3)。在所有情况下，与Ii+参照细胞的差值反映了各种各样的siRNA构建物进行Ii抑制的程度。质粒11-18的平均抑制作用(29％)是有效的。从这些数据中可以断定，质粒11-18(抑制平均值为29％)具有有效的活性，并质粒19、20、和空质粒没有Ii-抑制活性。
表3.siRNA构建物的Ii抑制作用
质粒     实验1         实验1         实验1          平均值
观测量差值％抑制观测量差值％抑制观测量差值％抑制抑制
空白     47.3          60.0          49.9
11       39.6  -7.716  53.8  -6.210  32.7  -27.355  27
12       31.1  -16.234 50.9  -9.115  39.3  -20.741  30
13       28.7  -18.639 59.0  -1.02   39.9  -20.140  27
14       18.6  -28.761 49.4  -10.618 38.2  -21.844  41
15       33.3  -14.030 52.3  -7.713  45.8  -14.228  24
16       30.2  -17.136 47.9  -12.120 35.8  -24.248  35
17       42.0  -5.311  44.4  -15.626 39.8  -20.240  26
18       33.7  -13.629 52.5  -7.513  51.6  -8.417   19
19       49.1  1.8-4   55.5  -4.58                  2
20       40.6  -6.714  63.2  3.25                   4
[00159]表3表示了质粒1I-20各自的结构。观测量＝观察到的Ii+细胞百分比。差值＝观察值与空质粒观察值百分比的差异。％抑制＝抑制百分比(差值/空质粒观察到的百分比)。抑制平均值＝三个实验％抑制的平均值。
[00160]用于测试siRNA在Raji细胞中影响的试验方法。使用基因枪传递方法将siRNA构建物转染入Raji细胞中。DNA沉淀在金颗粒上。在100μl0.05M的亚精胺中超生处理使金微载体(1μm颗粒中含0.5毫克)悬浮。添加指示量的在无内毒素的水中含量为1mg/ml的DNA，并进行超声处理，逐滴添加100μl 1M的CaCl2。维持这种金-DNA混合物10分钟，然后用250μl100％的乙醇洗涤3次。在末次洗涤之后，球粒被重新悬浮在200μl在100％的乙醇中含量为0.025mg/ml的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)中，转入15ml试管中，并用PVP/乙醇添加到1ml。0.5mg金每丸粒得到的微载体负载量(MLQ)和可变的DNA装料比(DLR)被传递给小鼠。1ml DNA/微载体悬浮液生产17个包衣的0.5-英寸的药包，使用前将此药包与干燥剂一起在4℃下储藏过夜。用基因枪传递方法对小鼠接种，接种疫苗前用电动剪毛刀除去每个小鼠腹部的毛皮。基因枪的枪膛直接指着腹部皮肤，使用400-500psi的氦压力供给单一微载体丸粒。使用一种氦活化的基因枪系统(PowderJect)t进行注射。
实施例12.siRNA二倍体对人类细胞中Ii的抑制作用
[00161]除了通过利用shRNA使Ii基因表达静止外，对包括siRNA二倍体化学合成的第二方法进行检验。与siRNA质粒载体相比，合成的siRNAs提供某些优点，第一，合成的siRNAs的传递不包括外源的质粒DNA的引入，所述外源的质粒DNA可能对真核细胞具有有害效应，包括插入物的突变形成。第二，合成的siRNAs产生瞬时的基因抑制，这能够带来更加有效的治疗目的，例如，在这里所描述的。
[00162]双链siRNA的设计和检验。当被引入细胞中时，反义RNA能够使特异性基因静止(Guo，Cell 81，611)。据证实，使用C.elegans，注射双链RNA比注射单独有义链或反义链能更有效的使基因静止(Fire，Nature391，806)。因此使用Qiagen(Valencia，CA)设计并合成其他的siRNA(Ii)(表4和表5)。合理的siRNA设计和精确的同源性分析是实现目标基因最优沉默和用于减少目标影响的关健。QIAGEN认可Novartis医药公司的HiPerformance设计算法，用于选择高功能性的RNAi目标序列。该算法以迄今为止siRNA官能性最大的独立性研究为基础，其中，分析了超过3000个合成的siRNA二倍体对于34个目标的基因沉默效率。这些数据用来发展一种复杂的模式识别算法。HiPerformance设计算法与专用的同源性分析工具和全面的非多余的基因数据库相结合，进行彻底的和精确的同源性分析。因此，专门设计的4-for-沉默siRNA二倍体提供了很好地特异性和有效的siRNA。4-for-沉默siRNA二倍体是高度纯化的HPP级siRNA。高的纯度增加了siRNA的特异性并减少了中止目标作用的可能性。
[00163]试验结果。下列实验显示，siRNA对于恒定链(Ii)具有特异性，其中，所述恒定链与II类MHC分子有关，在siRNA转染的人类细胞中，siRNA抑制Ii的表达。对于这些实验，转染之前24小时，在6孔平皿中每孔涂布2.5x104个希拉细胞。使用siRNAfect转染试剂(Qiagen公司)，按照使用说明书，用4个对于恒定链(Ii)具有特异性的siRNA转染希拉细胞。对LaminA/C具有特异性的siRNA和非沉默荧光素标记的siRNA被用作对照物，使Ii基因沉默。用100units/ml的干扰素γ(IFN-γ)和1 x 10-7M的甲状腺素处理细胞，在转染之后6小时诱导II类MHC分子表达。用对Ii、HLA-DR和同型对照物的抗体染色转染后48小时的细胞。如实施例11所述对细胞进行FACS分析(表6)。所有的四个siRNA(Ii)二倍体显示显著的Ii蛋白质表达抑制作用。
表4 四个siRNA的设计及其在Ii RNA序列中的位置
基线量   326a    431c    327g    243t
原点
1   cagggtccca gatgcacagg aggagaagca ggagctgtcg ggaagatcag aagccagtca
61  tggatgacca gcgcgacctt atctccaaca atgagcaact gcccatgctg ggccggcgcc
121 ctggggcccc ggagagcaag tgcagccgcg gagccctgta cacaggcttt tccatcctgg
181 tgactctgct cctcgctggc caggccacca ccgcctactt cctgtaccag cagcagggcc
241 ggctggacaa actgacagtc acctcccaga acctgcagct ggagaacctg cgcatgaagc
301 ttcccaagcc tcccaagcct gtgagcaaga tgcgcatggc caccccgctg ctgatgcagg
361 cgctgcccat gggagccctg ccccaggggc ccatgcagaa tgccaccaag tatggcaaca
421 tgacagagga ccatgtgatg cacctgctcc agaatgctga ccccctgaag gtgtacccgc
481 cactgaaggg gagcttcccg gagaacctga gacaccttaa gaacaccatg gagaccatag
541 actggaaggt ctttgagagc tggatgcacc attggctcct gtttgaaatg agcaggcact
601 ccttggagca aaagcccact gacgctccac cgaaagagtc actggaactg gaggacccgt
661 cttctgggct gggtgtgacc aagcaggatc tgggcccagt ccccatgtga gagcagcaga
721 ggcggtcttc aacatcctgc cagccccaca cagctacagc tttcttgctc ccttcagccc
781 ccagcccctc ccccatctcc caccctgtac ctcatcccat gagaccctgg tgcctggctc
841 tttcgtcacc cttggacaag acaaaccaag tcggaacagc agataacaat gcagcaaggc
g01 cctgctgccc aatctccatc tgtcaacagg ggcgtgaggt cccaggaagt ggccaaaagc
961 tagacagatc cccgttcctg acatcacagc agcctccaac acaaggctcc aagacctagg
1021 ctcatggacg agatgggaag gcacagggag aagggataac cctacaccca gaccccaggc
1081 tggacatgct gactgtcctc tcccctccag cctttggcct tggcttttct agcctattta
1141 cctgcaggct gagccactct cttccctttc cccagcatca ctccccaagg aagagccaat
1201 gttttccacc cataatcctt tctgccgacc cctagttccc tctgctcagc caagcttgtt
1261 atcagctttc agggccatgg ttcacattag aataaaaggt agtaattaga aaaaaaaaaa
1321 aaaaaaa
表5.具有末端悬挂的合成的siRNA序列
(I)siRNA(Ii)5’CCAUUGGCUCCUGUUUGAAUU3’(SEQ ID NO：21)
            3’UUCAAACAGGAGCCAAUGGUG5’(SEQ ID NO：22)
(II)siRNA(Ii)5’CACUGACGCUCCACCGAAAUU3’(SEQ ID NO：23)
             3’UUUCGGUGGAGCGUCAGUGGG5’(SEQ ID NO：24)
(III)siRNA(Ii)5’GAACUGGAGGACCCGUCUUUU3’(SEQ ID NO：25)
              3’AAGACGGGUCCUCCAGUUCCA5’(SEQ ID NO：26)
(IV)siRNA(Ii)5’GGGUGUGACCAAGCAGGAUUU3’(SEQ ID NO：27)
             3’AUCCUGCUUGGUCACACCCAG5’(SEQ ID NO：28)
表6.通过siRNA进行的Ii抑制
 
siRNA转染作用 ％Ii-阳性细胞 抑制作用平均值
未染色的HeLa细胞 0.0
HeLa(未处理)Ii抗体 5.6
HeLa Ii-表达+对照 89.1
HeLa Ii-表达+lamin siRNA 89.0
HeLa Ii-表达+siRNA(Ii)-I 39.3 49.8
HeLa Ii-表达+siRNA(Ii)-II 36.6 52.5
HeLa Ii-表达+siRNA(Ii)-III 52.6 36.5
HeLa Ii-表达+siRNA(Ii)-IV 40.2 48.9
实施例13.通过Ii抑制进行的HIVgD120DNA疫苗的免疫调节作用
[00164]将编码疫苗抗原的DNA引入树枝状细胞或者其他专门的抗原呈递细胞中，在这些细胞中的Ii蛋白质抑制的感应现象导致一种有效的T辅助细胞反应，增强T辅助细胞记忆力和细胞毒性T细胞(CTL)反应。这种反应使DNA疫苗具有有效的治疗效果，这种治疗效果在之前是该疫苗所缺少的。
[00165]如在本发明背景技术中详细描述的那样，对于这些作用的机理取决于存在抗原的细胞(APC)的内质网中Ii蛋白质表达的抑制。用蛋白体处理的细胞质肽被传递进入内质网用于在那里结合II类MHC分子；该细胞质肽还可以用于结合不被Ii蛋白阻断的II类主要组织相容性复合体(MHC)分子。通常，Ii蛋白质阻断II类MHC分子的抗原肽结合位点直到三聚物(II类MHC的α和β链+Ii蛋白质)被传递到后Golgi层，在这里，选择的外部抗原已经被传递用于与Ii蛋白质的蛋白水解作用一起蛋白水解消化抗原，并将抗原肽结合进入II类MHC分子中。
[00166]能够抑制Ii蛋白质表达的细胞中II类MHC分子上改变的内质网结合位点扩张了结合MHC类分子，持续其胞内向胞外运输呈递T辅助细胞路径的II类MHC分子抗原表位库。另外，因为大部分II类MHC分子结合并表达从转染的DNA疫苗基因中合成的决定簇，增加了许多抗原表位的呈递效力。基因的剂量，启动子的效力，在蛋白体过程中胞内质粒合成的蛋白质或蛋白质片段的稳定性影响，及其他因素都能促进疫苗肽在内质网中的浓度，所述疫苗肽能够在内质网中结合未被阻塞的II类MHC分子。
[00167]如本实施例所显示的，用带有Ii反向基因构建物(Ii-RGC)的共同免疫的小鼠极大地增强免疫小鼠与HIV gp120抗原DNA的反应，其中，所述Ii反向基因构建物诱导与Ii蛋白质的mRNA杂交的RNA的转录，从而导致Ii蛋白质表达的抑制作用。金珠免疫工艺的一种优势在于最后的最佳有效比，且用于DNA疫苗和Ii-RGC的质粒DNA的浓度可以在细胞内对每个细胞基给药，在所述细胞中，金珠吸收的DNA被刺激。
实验1
[00168]DNA包衣金珠的制备。在用DNA包衣金珠之前，应该对每个研究分别确定下列参数：每药包的金珠载重比(GLR)、每药包的DNA载重比(DLR)、DNA/金珠的比率(DGR)、每次免疫使用的药包数目(注射)、和需要的免疫数目。在实验1和实验2之后，DGR＝4、GLR＝0.5、DLR＝2。
表7.DNA和金珠的计算
 
DGRg/mg GLRmg/cartridge DLRg/cartridge 药包号 需要的DNA(g)       需要的金珠(mg)      
4 0.5 2 60 120 30
2 0.5 1 60 60 30
1 0.5 0.5 60 30 30
0.5 0.5 0.25 60 15 30
4 1 4 60 240 60
2 1 2 60 120 60
1 1 1 60 60 60
0.5 1 0.5 60 30 60
[00169]老鼠的免疫。用包括氯胺酮溶液(100mg/mL)200mL、甲苯噻嗪溶液(20mg/mL)250mL，和生理盐水300mL(总数750mL)的溶液麻醉雌性BALB/c小鼠(6-8周大)，每个小鼠连续进行六周的50毫升的腹膜内注射。然后用电动刮胡刀迅速刮小鼠并用基因枪射击。基因枪距离小鼠皮肤0.0到0.5厘米。用400psi氦汽油射击。对每只小鼠射4枪，不进行随后的加强。三周以后，使用长P18肽(RIQRGPGRAFVTIGK)和短P18肽(RGPGRAFVTI)分别体外进行IFN-γElispot试验。
[00170]ELISPOT实验。按照细胞限制技术商业可知的方案进行ELISPOT实验。简单地讲，向96孔免疫斑点孔板(M200)中加入100μL在0.01M磷酸钠、0.14M氯化钠溶液中浓度为6μg/ml的细胞因子特异性捕获抗体溶液，该溶液的pH值为7.2(磷酸缓冲盐溶液)，在4℃下培养过夜。吸入后，在RT中向每个小孔中加入200μL包含10％小牛血清白蛋白和1％盘尼西林-链霉素-谷氨酸盐的缓冲液。用1％的溶于PBS中的吐温-20洗涤四次，之后，用100μL抗原表位肽，在培养基中以5μg/孔或25μg/孔量重新激活100μL105到106个细胞/孔的得自免疫小鼠脾的单个细胞悬浮液，并在5％CO2中37℃下培养24-72小时。在用PBS洗涤两次，用洗涤缓冲液1洗涤4次之后，在RT中，向每个小孔中加入100μL在带有10％小牛血清白蛋白(稀释溶液)的PBS中浓度为2μg/ml的生物素酰化的抗人类IFN-γ两小时。用洗涤缓冲液1洗涤五次之后，在RT中向每个小孔中加入位于稀释缓冲液中的100μL链霉亲和素-辣根过氧化物酶结合物1小时。在用洗涤缓冲液1洗涤4次，用PBS洗涤两次之后，在黑暗中加入100μL的3-氨基-9-乙基咔唑/H2O2底物(Pharmingen551951)30-60分钟。通过用200μL去离子水洗涤3次来中止反应。用Immunospot 1.7e软件(Cellular Limited Technology)进行ELISPOT数据分析。
表8.HIV gp120 DNA疫苗反应的增强
Figure A200580047371D00701
*在构建物中，RSV/gp120，gp120基因具有领导序列
**在Ad/BN/gp120中，gp120不具有领导序列.
实验2
[00171]实验过程与实验1相同
表9.HIV gp120 DNA疫苗反应的增强
Figure A200580047371D00702
[00172]从以上数据可以看出，共同注射HIV gp120与Ii-RGC的DNA能够使CD4+T细胞IFN-γ反应得到显著的增强，此增强作用同时表现在细胞数量和细胞产量上(斑点尺寸)。这种增强的反应将会使CTL更加有效，使CD4+记忆细胞反应变强。
[0173]上述实验也证明了MHC II类反式激活因子(CIITA)的共注射引起相对于那些没有CIITA时可见得抑制的应答。由覆有DNA的珠推进角化细胞的事实引起的这些特性产生两个应答的模式，它依赖CIITA DNA是否也在该珠上。没有CIITA时疫苗DNA导致HIV gp120的表达、MHC I类决定物的表达，这可以引起MHC I类-限制的CTL应答。否则，为由那些细胞的II类MHC分子的呈现，HIV gp120抗原可能通过角化细胞释放然后通过巨噬细胞或树突状细胞清除。至少与通过这些细胞呈现的MHC I类单抗原决定簇的容量相比，从DNA合成的蛋白呈现的MHC II类单抗原决定簇推进角化细胞的T细胞的容量是非常低的。在这样的细胞中表达的li RGC没有有用的功能因为这些细胞不表达II类MHC分子或Ii蛋白。内生的合成抗原蛋白没有表达除非很少的在泡状运输到后-Golgi抗原配料成分后、除非在细胞外的释放后和通过专门的APC的吸收。
[0174]然而，当角化细胞同时用CIITA转染时，II类MHC分子在角化细胞上表达。如果Ii-RGC没有共转染进这样的细胞II类MHC分子的表达对通过那些细胞呈现的MHC II类单抗原决定簇不重要因为因为缺少MHC II类程序和提供的功能的其余部分，这些存在于专门的APCs后-Golgigolgi配料成分中。但是，当由于Ii RGC的结构、siRNA(Ii)s或反义Ii寡核苷酸Ii抑制也发生，然后MHC II类单抗原决定簇可以通过基因转染角化细胞而被显示。然而，在这种细胞中应答的生物学类型现在时一种抑制表型而不是一种活化表型。那些发生是因为对于在B7.1、B7.2、CD40、CD40、CD80、CD86、及其他对T细胞显示的APC辅助因子不存在的情况下通过II类MHC分子的T辅助细胞的单抗原决定簇的呈现。对通过没有辅助因子的II类MHC分子提供的抗原的单抗原决定簇T细胞活化的默认应答途径是Th2抑制表型。诱导的方法和这样的免疫抑制效果的使用通过从US 6,106,840，US6,218,132 and US 6,405796引用并入全文。当与疾病的发病机理相关的至少一个主要的抗原性的抗原是已知的和编码部分和所有的抗原的DNA是已知的，自身免疫疾病可以通过这种抑制抑制的方法来治疗。包括给药的治疗方案，例如下列三种DNA在金珠上按指定的浓度和比率：与发病机理相关的抗原的DNA、Ii-RGC质粒的DNA和CIITA的DNA。这样的免疫按以下列美国专利中指定的剂量、时间表和方法和用这样辅助药进行，这些专利是美国专利第6710035号，美国专利第6586409号，美国专利第6214804号，美国专利第6339068号，美国专利第5620896号，美国专利第6706694号，美国专利第6649409号，美国专利第6258799号，美国专利第6743444号，美国专利第6656706号，和美国专利第6783759号。
[0175]在一个方面这个治疗的方法可以被用于自身免疫疾病例如类风湿关节炎、多发性硬化、和I型糖尿病的治疗。例如，对人髓磷脂碱性蛋白、oligogliodendrocyte蛋白、及其他MS-相关的抗原的DNA疫苗可以与CIITA和Ii-RGC两者一起给药来抑制多发性硬化。同样地，对hcgp42、胶原、和类风湿性关节炎或骨关节炎相关的抗原的DNA疫苗可以与CIITA和Ii-RGC两者一起给药来抑制类风湿性关节炎。对胰岛素、谷氨酸脱羧酶、葡萄糖运输-2及其他I型糖尿病相关的抗原的DNA疫苗可以与CIITA和Ii-RGC两者一起给药来抑制I型糖尿病。在另一个方面，当移植组织的一种合适的抗原和编码的互补DNA是已知的，移植排斥可以通过这个方法治疗来抑制排异反应。包括给药的治疗方案，例如，带有确定浓度和比率的下列三种DNA的金珠：对移植排异反应相关的抗原的DNA、对CIITA的DNA、和对Ii-RGC的DNA。
实施例14 通过人Ii siRNA质粒的人树突状细胞中Ii的抑制
[0176]SiRNAs用于抑制新鲜人周血单核细胞衍生的树枝状细胞中的Ii蛋白的表达。人单核细胞的树突状细胞从人周血制备、商业制剂中得到(从所有细胞来的Leukopack，Inc.波士顿)。周血单核细胞(PBMC)(2.5 x 106)培养在包含X-VIVO 15培养基(产品号为04-418，Cambrex BioscienceWalkersville，Inc.，Walkersville，MD)的25mlDC培养基、10％人AB血清(产品号为100-512，Gemini Bio-Prodcuts，Woodland，CA)，1％青霉素链霉素-谷氨酰胺贮存液(产品号为10378-016，GIBCO，Grand Isle NY；储存液：青霉素10,000U/毫升；链霉素链霉素ug/毫升；L-谷氨酰胺，29.2毫克/毫升)中，37℃过夜，通含5％CO2空气以允许单核细胞粘附到塑料孔底部。未附着的T细胞和B细胞通过用0.1M磷酸钠缓冲液、0.14M NaCl溶液、pH7.4(磷酸盐缓冲盐水；PBS)温和的洗涤除去。然后将附着的单核细胞在包含0.2-2ng/毫升IL-4(R & D Systems，明尼阿波利斯、MN)和0.2-2ng/毫升GM-CSF(R & D Systems)的25毫升DC培养基中37℃培养7天，通含5％CO2空气以允许单核细胞分化成树枝状细胞。在第三天和第六天更换培养基。在带有0.2-2ng/毫升IL-4(R & D Systems)和0.2-2ng/毫升GM-CSF(R & DSystems)的DC培养基中通过胰酶消化和再悬浮来收集树突状细胞。在7天后的培养物中从大约Leukopack的2.5 x 106PBMC中得到大约2 x 106树突状细胞。那些单核细胞衍生的树突状细胞覆盖在6-孔平板上，有3ml带有IL-4和GM-CSF的DC培养基的每孔中3.3 x 105细胞。质粒的聚乙烯亚胺(PEI；产品号为408727，Sigma Aldrich，St.Louis，MO)配方加入到培养物中并在37℃培养，通5％CO2用空白和人Ii siRNA表达质粒DNA来转染树突状细胞(表10)。转染后48小时细胞用对Ii的抗体染色。细胞如实施例11中用FACS分析。两种人Ii siRNA表达在人树突状细胞中引起显著的Ii蛋白的抑制。
表10 用PEI-组成的人Ii siRNA质粒的人树突状细胞的转染和FACS分析
 
治疗 ％Ii阳性细胞 ％Ii抑制
空载体 62.7 -
P4 30.5 51.4
P7 32.5 48.1
P4+P7 26.7 57.4
序列表
非正式序列表
序列ID#1
Figure A200580047371D00741
序列ID#2
Figure A200580047371D00742
序列ID#3
Figure A200580047371D00743
人序列ID#4
Figure A200580047371D00744
人序列ID#5
Figure A200580047371D00745
人序列ID#6
Figure A200580047371D00752
人序列ID#7
Figure A200580047371D00753
人序列ID#8
Figure A200580047371D00754
人序列ID#9
Figure A200580047371D00762
人序列ID#10
Figure A200580047371D00771
SEQ ID NO：295’uucccagaugcacaggaggag
SEQ ID NO：305’augcacaggaggagaagcagg
SEQ ID NO：315’aagccagucauggaugaccag
SEQ ID NO：325’auggaugaccagcgcgaccuu
SEQ ID NO：335’caaugagcaacugcccaugcu
SEQ ID NO：345’ccugcagcuggagaaccugcg
SEQ ID NO：355’gccugugagcaagaugcgcau
SEQ ID NO：365’ugccaccaaguauggcaacau
SEQ ID NO：375’CCAUUGGCUCCUGUUUGAA
SEQ ID NO：385’CACUGACGCUCCACCGAAA
SEQ ID NO：395’GAACUGGAGGACCCGUCUU
SEQ ID NO：405’GGGUGUGACCAAGCAGGAU

Claims (159)

1.一种组合物，包括有效抑制Ii表达的siRNA。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，siRNA包括一种RNA二倍体，该RNA二倍体包括：a)一种包括Ii有义序列的第一链，该Ii的有义序列的长度是10到25个核苷酸；和b)一种包括a)中反向互补有义序列的第二链。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中，siRNA包括一种RNA二倍体，该RNA二倍体包括：a)一种包括Ii有义序列的第一链，该Ii的有义序列的长度是19到25个核苷酸；和b)一种包括a)中反向互补有义序列的第二链。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中，siRNA包括一种RNA二倍体，该RNA二倍体包括：a)一种包括Ii有义序列的第一链，该Ii的有义序列的长度是21到23个核苷酸；和b)一种包括a)中反向互补有义序列的第二链。
5.一种组合物，包括一种DNA序列，该DNA序列能够编码有效抑制Ii表达的siRNA。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中DNA序列位于一种质粒载体中。
7.根据权利要求5所述的组合物，其中DNA序列位于一种病毒载体中。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中病毒载体选自由腺病毒、腺病毒相关病毒、慢病毒、痘病病毒、流行性感冒、和反转录病毒所组成的组。
9.根据权利要求1或5所述的组合物，其中在单一分子中siRNA包括：a)一种Ii有义序列，长度为10到25个核苷酸；b)一种a)的反向互补序列；和c)一种能够在有义序列和反向互补序列之间形成二倍体的间插序列。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中在单一分子中siRNA包括：a)一种Ii的有义序列，长度为19到25个核苷酸；b)一种a)的反向互补序列；和c)一种能够在有义序列和反向互补序列之间形成二倍体的间插序列。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中在单一分子中siRNA包括：a)一种Ii的有义序列，长度为21到23个核苷酸；b)一种a)的反向互补序列；和c)一种能够在有义序列和反向互补序列之间形成二倍体的间插序列。
12.根据权利要求1或5所述的组合物，其中，siRNA包括选自由SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，和SEQ ID NO：18所组成的组的RNA序列。
13.一种组合物，包括：a)一种第一DNA序列，该第一DNA序列编码包括Ii有义序列的第一RNA序列；和b)一种第二DNA序列，该第二DNA序列编码包括步骤a)中Ii有义序列的反向互补序列；其中当第一和第二RNA序列杂交形成siRNA二倍体时能够形成一种RNA诱导的沉默复合物，该RNA诱导的沉默复合物能抑制Ii表达。
14.被包装在可注射的单位剂量形式中的权利要求1、5或13所述的组合物。
15.一种哺乳动物细胞，包含一种有效抑制Ii表达的siRNA。
16.根据权利要求15所述的哺乳动物细胞，其中，siRNA包括一种RNA二倍体，该RNA二倍体包括：a)一种包括Ii有义序列的第一链，其中有义序列的长度为10到25个核苷酸；b)一种包括a)中反向互补序列的第二链。
17.根据权利要求16所述的哺乳动物细胞，其中，siRNA包括一种RNA二倍体，该RNA二倍体包括：a)一种包括Ii有义序列的第一链，其中有义序列的长度为19到25个核苷酸；b)一种包括a)中反向互补序列的第二链。
18.根据权利要求17所述的哺乳动物细胞，其中，siRNA包括一种RNA二倍体，该RNA二倍体包括：a)一种包括Ii有义序列的第一链，其中有义序列的长度为21到23个核苷酸；b)一种包括a)中反向互补序列的第二链。
19.一种哺乳动物细胞，该哺乳动物细胞包含一种外源序列或能够表达siRNA的序列，所述siRNA能够有效抑制Ii表达。
20.根据权利要求19所述的哺乳动物细胞，其中外源序列或序列位于质粒载体中。
21.根据权利要求19所述的哺乳动物细胞，其中外源序列或序列位于病毒载体中。
22.根据权利要求21所述的哺乳动物细胞，其中病毒载体选自由腺病毒、腺病毒相关病毒、慢病毒载体、痘病病毒、流行性感冒、和反转录病毒所组成的组。
23.根据权利要求15或19所述的哺乳动物细胞，在进行任意操作之前，当存在于个体中时，所述哺乳动物细胞是阴性I1类MHC分子。
24.根据权利要求15或19所述的哺乳动物细胞，其中siRNA在单一分子中包括：a)一种Ii有义序列，长度为10到25个核苷酸；b)一种在a)中所述序列的反向互补序列；和c)一种能够在有义序列和反向互补序列之间形成二倍体的间插序列。
25.根据权利要求24所述的哺乳动物细胞，其中siRNA在单一分子中包括：a)一种Ii有义序列，长度为19到25个核苷酸；b)一种在a)中所述序列的反向互补序列；和c)一种能够在有义序列和反向互补序列之间形成二倍体的间插序列。
26.根据权利要求25所述的哺乳动物细胞，其中siRNA在单一分子中包括：a)一种Ii有义序列，长度为21到23个核苷酸；b)一种在a)中所述序列的反向互补序列；和c)一种能够在有义序列和反向互补序列之间形成二倍体的间插序列。
27.根据权利要求15或19中所述的哺乳动物细胞，其中有义序列包括包含转录起始位点的Ii序列。
28.根据权利要求15或19中所述的哺乳动物细胞，其中有义序列包括人类Ii mRNA的第一400nt之内的一部分Ii序列。
29.根据权利要求15或19中所述的哺乳动物细胞，其中siRNA包括选自由SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ IDNO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，和SEQ ID NO：18所组成的组的RNA。
30.根据权利要求15或19中所述的哺乳动物细胞，该哺乳动物细胞或者是癌细胞或者是包含传染剂的细胞，所述传染剂指导蛋白质的合成，所述蛋白质不过没有传染物存在的话不会存在于蛋白质中。
31.根据权利要求15或19中所述的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是一种I1类MHC分子阳性细胞。
32.根据权利要求15或19中所述的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是I1类MHC分子阴性细胞，且包含一种重组载体，该重组载体包括一种能够编码蛋白质的可以表达的核酸序列，在I1类MHC分子阴性细胞中，所述蛋白质的转染产生细胞表面上II类MHC分子的感应现象。
33.根据权利要求32所述的哺乳动物细胞，其中可以表达的核酸序列被病毒或非病毒表达载体携带。
34.根据权利要求33所述的哺乳动物细胞，其中病毒表达载体选自由腺病毒、腺病毒相关病毒、慢病毒、痘病病毒、流行性感冒和反转录病毒所组成的组中。
35.根据权利要求32所述的哺乳动物细胞，其中蛋白质选自由I1类MHC反式激活因子和干扰素γ所组成的组中。
36.根据权利要求15或19所述的哺乳动物细胞是一种恶性细胞。
37.根据权利要求15或19所述的哺乳动物细胞是一种受病毒感染的细胞。
38.根据权利要求15或19所述的哺乳动物细胞是一种天然存在的抗原呈递细胞。
39.根据权利要求15或19所述的哺乳动物细胞选自由树枝状细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞、和T淋巴细胞所组成的组。
40.根据权利要求15或19所述的哺乳动物细胞进一步包括一种重要的抗原。
41.根据权利要求40所述的哺乳动物细胞，其中在细胞内从编码重要抗原的可以表达的核酸序列中合成重要抗原。
42.一种用于在细胞中抑制Ii表达的方法，该方法包括向表达Ii的细胞中引入一种siRNA，其中siRNA被直接或间接地引入细胞，而且其中该siRNA能够形成RNA诱导的沉默复合物，从而抑制Ii在细胞中表达。
43.根据权利要求42所述的方法，其中siRNA被间接地引入细胞中，siRNA在细胞内从可以表达的核酸序列或编码siRNA的序列中被转录。
44.根据权利要求43所述的方法，其中可以表达的核酸序列或者序列包括：a)一种第一可以表达的DNA序列，这种第一可以表达的DNA序列能够编码包括Ii有义序列的第一RNA序列；和b)一种第二可以表达的DNA序列，该第二可以表达的DNA序列能够编码包括步骤a)中Ii有义序列的反向互补序列的第二RNA序列，其中第一RNA序列与第二RNA序列杂交形成一种siRNA二倍体。
45.根据权利要求44所述的方法，其中第一和第二可以表达的DNA中的至少一个是纯化的PCR产物。
46.根据权利要求44所述的方法，其中第一和第二可以表达的DNA中的至少一个位于一种载体中。
47.用于在I1类MHC分子阳性细胞表面上显示重要的抗原表位的方法，其中所述I1类MHC分子阳性细胞中Ii蛋白质的表达被抑制，所述方法包括：a)提供或者I1类MHC分子阳性细胞或者被诱导表达II类MHC分子的细胞，并提供表达重要的抗原表位的细胞，而且其中所述细胞表达Ii；和b)向步骤a)的细胞中引入一种siRNA，其中该siRNA被直接或间接地引入细胞中，而且其中siRNA能够形成一种RNA诱导的沉默复合物，从而抑制Ii在细胞中的表达。
48.根据权利要求47所述的方法，其中siRNA被间接地引入细胞，siRNA在细胞内从一种可以表达的核酸序列或编码siRNA的序列中被转录。
49.根据权利要求48所述的方法，其中可以表达的核酸序列或者序列包括：a)一种第一可以表达的DNA序列，该第一可以表达的DNA序列编码包括Ii有义序列的第一RNA序列；和b)一种第二可以表达的DNA序列，该第二可以表达的DNA序列编码包括步骤a)中Ii有义序列的反向互补序列的第二RNA序列，其中，第一RNA序列与第二RNA序列杂交形成siRNA二倍体。
50.根据权利要求49所述的方法，其中第一和第二可以表达的DNA中的至少一个是一种纯化的PCR产物。
51.根据权利要求49所述的方法，其中第一和第二可以表达的DNA中至少一个位于一种载体上。
52.根据权利要求47所述的方法，其中重要的抗原表位是癌细胞抗原的重要的抗原表位。
53.根据权利要求47所述的方法，其中重要的抗原表位是病毒抗原的重要的抗原表位。
54.根据权利要求47所述的方法，其中通过向步骤a)的细胞中引入一种重组载体来诱导I1类MHC分子的表达，其中，所述重组载体包括可以表达的核酸序列，该核酸序列编码一种蛋白质，这种蛋白质在I1类MHC分子阴性细胞中的表达产生细胞表面上II类MHC分子的感应现象。
55.根据权利要求54所述的方法，其中编码蛋白质的可以表达的核酸序列被携带在病毒或非病毒表达载体上。
56.根据权利要求54所述的方法，其中所述蛋白质选自由I1类MHC反式激活因子和干扰素γ所组成的组。
57.根据权利要求47所述的方法，其中步骤a)的细胞是癌细胞或包含传染剂的细胞，所述传染剂指导蛋白质的合成，如果没有传染剂存在的话，该蛋白质不会存在于细胞中。
58.根据权利要求47所述的方法，其中重要的抗原表位是癌细胞抗原的重要的抗原表位。
59.根据权利要求47所述的方法，其中重要的抗原表位是病毒抗原的重要的抗原表位。
60.根据权利要求51所述的方法，其中至少一个可以表达的DNA位于质粒载体中。
61.根据权利要求51所述的方法，其中至少一个可以表达的DNA位于病毒载体中。
62.根据权利要求61所述的方法，其中病毒载体选自由腺病毒、腺病毒相关病毒、丝状病毒、慢病毒、痘病病毒、流行性感冒、和反转录病毒所组成的组。
63.用于刺激哺乳动物免疫反应的方法，所述免疫反应指导Ii蛋白质表达被抑制的I1类MHC分子-阳性细胞表面上的重要的抗原表位，该方法包括：a)或者提供一种表达重要抗原表位的I1类MHC分子阳性细胞，或者提供一种表达重要抗原表位和被诱导在其细胞表面上表达II类MHC分子的细胞；b)向步骤a)的细胞中引入一种siRNA，其中该siRNA可以直接或间接地被引入细胞，且其中siRNA能够形成一种RNA-诱导的沉默复合物，从而抑制Ii的表达；和c)用步骤b)的细胞或I1类MHC非与衍生自步骤b)的细胞的重要抗原表位的复合物免疫哺乳动物。
64.根据权利要求63所述的方法，其中siRNA被间接地引入细胞中，该siRNA在细胞内从可以表达的核酸序列或编码siRNA的核酸序列中被转录。
65.根据权利要求64所述的方法，其中可以表达的核酸序列或者序列包括：a)一种第一可以表达的DNA序列，该第一可以表达的DNA序列编码包括Ii有义序列的第一RNA序列；和b)一种第二可以表达的DNA序列，该第二可以表达的DNA序列编码包括步骤a)中有义序列的反向互补序列的第二RNA序列，其中第一RNA序列与第二RNA序列杂交形成一种siRNA二倍体。
66.根据权利要求65所述的方法，其中第一和第二可以表达的DNA中至少一个是纯化的PCR产物。
67.根据权利要求65所述的方法，其中第一和第二可以表达的DNA中至少一个位于载体中。
68.根据权利要求63所述的方法，其中通过向步骤a)的细胞中引入一种重组载体来诱导I1类MHC分子表达，该重组载体包括一种编码蛋白质的可以表达的核酸序列，该蛋白质在I1类MHC分子阴性细胞中的表达产生细胞表面上II类MHC分子的感应现象。
69.根据权利要求68所述的方法，其中编码蛋白质的可以表达的核酸序列被病毒或非病毒表达载体携带。
70.根据权利要求69所述的方法，其中病毒表达载体选自由腺病毒、腺病毒相关病毒、慢病毒、痘病病毒、流行性感冒、和反转录病毒所组成的组。
71.根据权利要求68所述的方法，其中，所述蛋白质选自由Ii类MHC反式激活蛋白和干扰素γ所组成的组中。
72.根据权利要求63所述的方法，其中步骤a)的细胞或者是癌细胞或者是包含感染剂的细胞，所述感染剂能够指导蛋白质的合成，如果不是感染剂的存在，所述蛋白质不会存在于细胞中。
73.根据权利要求63所述的方法，其中，重要抗原表位是癌细胞抗原的重要抗原表位。
74.根据权利要求63所述的方法，其中，重要抗原表位是病毒抗原的重要抗原表位。
75.靶向个体细胞型用于免疫反应的方法，所述细胞型的特点在于能够表达识别的抗原，所述方法包括：
a)在培养基中提供包括抗原呈递细胞的个体的外周血单核细胞；
b)向步骤a)的培养基中的抗原呈递细胞中引入一种siRNA，其中，该siRNA或者被直接引入或者被间接引入细胞中，且其中siRNA能够形成RNA诱导的沉默复合物，从而抑制Ii的表达；和
c)向步骤a)的抗原呈递细胞中引入一种可表达的核酸序列，在培养基中适合表达的条件下，该可表达的核酸序列编码识别的抗原进入细胞中。
76.根据权利要求75所述的方法，其中，siRNA被间接引入细胞中，该siRNA在细胞内从可表达的核酸序列或编码siRNA的核酸序列中被转录。
77.根据权利要求76所述的方法，其中，可表达的核酸序列或序列包括：
a)第一可表达的DNA序列，该第一可表达的DNA序列编码包括Ii有义序列的第一RNA序列；和
b)第二可表达的DNA序列，该第二可表达的DNA序列编码包括步骤a)所述Ii有义序列的反向互补序列的第二可表达的RNA序列，其中，第一RNA序列和第二RNA序列杂交形成siRNA二倍体。
78.根据权利要求77所述的方法，其中，第一和第二可表达的DNA中至少一个是PCR产物。
79.根据权利要求77所述的方法，其中，第一和第二可表达的DNA中至少一个在载体中。
80.根据权利要求75所述的方法，其中，抗原呈递细胞选自由树枝状细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞所组成的组。
81.根据权利要求75所述的方法，其中，步骤c)的细胞可以被引入个体内实现治疗作用。
82.根据权利要求75所述的方法，其中，步骤a)的外周血单核细胞被分馏，从而富集抗原呈递细胞。
83.根据权利要求75所述的方法，其中在包含步骤c)的抗原呈递细胞的培养基中获得分馏的细胞亚群。
84.根据权利要求75所述的方法，其中，识别的抗原是一种癌细胞抗原。
85.根据权利要求75所述的方法，其中，识别的抗原是一种病毒抗原。
86.根据权利要求75所述的方法，进一步包括向个体中重新引入步骤c)的细胞。
87.根据权利要求42所述的方法，其中，抑制Ii的表达促进Ii类MHC分子在具有重要抗原表位的细胞的内质网上的装量。
88.根据权利要求42、47、63或75中任意一项所述的方法，其中，siRNA被引入到细胞中，引入方法选自由电转化技术、脂质调节的运输、脂质体、低渗诱导的胞饮作用和链球菌溶血素O-调节的细胞透化作用所组成的组。
89.根据权利要求43、48、64、或76中所述的方法，其中，可表达的核酸序列或编码siRNA的序列通过使用调节因子的方法被引入细胞中，所述细胞因子选自由阳离子树枝状聚合物、脂质、脂质体、金颗粒、聚交酯聚乙交酯颗粒、和聚烷氧基共聚物。
90.根据权利要求44、49、65、或77中任意一项所述的方法，其中，第一可表达的DNA序列和第二可表达的DNA序列被共转染进入哺乳动物细胞中。
91.根据权利要求42、47、63或75中任意一项所述的方法，其中在单一分子中siRNA包括：
a)长度为10到25个核苷酸的Ii有义序列；
b)a)中所述序列的反向互补序列；和
c)能在有义序列和互补序列之间形成二倍体的间插序列。
92.根据权利要求91所述的方法，在单一分子中的siRNA包括：
a)长度为19到25个核苷酸的Ii有义序列；
b)a)中所述序列的反向互补序列；和
c)能在有义序列和互补序列之间形成二倍体的间插序列。
93.根据权利要求92所述的方法，在单一分子中的siRNA包括：
a)长度为21到23个核苷酸的Ii有义序列；
b)a)中所述序列的反向互补序列；和
c)能在有义序列和互补序列之间形成二倍体的间插序列。
94.根据权利要求42、47、63或75中任意一项所述的方法，其中，siRNA包括一种RNA二倍体，该RNA二倍体包括：
a)一种包括Ii有义序列的第一链，该Ii有义序列的长度为10到25个核苷酸；
b)一种包括a)中有义序列的反向互补序列的第二链；
95.根据权利要求94所述的方法，其中，siRNA包括一种RNA二倍体，该RNA二倍体包括：
a)一种包括Ii有义序列的第一链，该Ii有义序列的长度为19到25个核苷酸；
b)一种包括a)中有义序列的反向互补序列的第二链；
96.根据权利要求95所述的方法，其中，siRNA包括一种RNA二倍体，该RNA二倍体包括：
a)一种包括Ii有义序列的第一链，该Ii有义序列的长度为21到23个核苷酸；
b)一种包括a)中有义序列的反向互补序列的第二链。
97.根据权利要求42、47、63或75中任意一项所述的方法，其中，siRNA包括包含翻译起始位点的Ii序列。
98.根据权利要求42、47、63或75中任意一项所述的方法，其中，siRNA包括人类Ii mRNA的第一400nt之内的部分Ii序列。
99.根据权利要求42、47、63或75中任意一项所述的方法，其中，siRNA包括至少一个单链3端引物悬端。
100.根据权利要求42、47、63或75中任意一项所述的方法，其中，siRNA包括至少一个单链5端引物悬端。
101.根据权利要求42、47、63或75中任意一项所述的方法，其中，siRNA是化学修饰的，从而预防核酸酶的降解。
102.根据权利要求42、47、63或75中任意一项所述的方法，其中，siRNA包括选自由SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，和SEQ ID NO：18所组成的组的RNA序列。
103.根据权利要求42、47、63或75中任意一项所述的方法，其中，Ii的抑制作用至少是15％。
104.根据权利要求42、47、63或75中任意一项所述的方法，其中，Ii的抑制作用至少是30％。
105.根据权利要求42、47、63或75中任意一项所述的方法，其中，Ii的抑制作用至少是40％。
106.根据权利要求43、48、64或76中任意一项所述的方法，其中，所述序列或编码siRNA的序列任选连接RNA聚合酶III启动子。
107.根据权利要求106所述的方法，其中，RNA聚合酶启动子是一种U6或SV40启动子。
108.根据权利要求1、5或13中任意一项所述的组合物，其中有义序列包括一种包含翻译起始位点的Ii序列。
109.根据权利要求1、5或13中任意一项所述的组合物，其中有义序列包括人Ii mRNA的第一400nt之内的Ii序列的一部分。
110.根据权利要求62或70中任意一项所述的方法，其中，所述痘病毒是牛痘。
111.根据权利要求8所述的组合物，其中所述痘病毒是牛痘。
112.根据权利要求22或34中任意一项所述的哺乳动物细胞，其中，所述痘病毒是牛痘。
113.在II类MHC分子阳性细胞表面上显示一种重要的抗原表位的方法，所述细胞中Ii蛋白的表达被抑制，该方法包括：
a)提供一种细胞，该细胞或者是II类MHC分子阳性细胞或者能够被诱导在其细胞表面上表达II类MHC分子，且进一步，其中，该细胞表达Ii；和
b)向步骤a)的细胞中引入一种重要的抗原表位和一种Ii抑制剂。
114.根据权利要求113所述的方法，其中，Ii抑制剂是10到50个核苷基的共聚物，该共聚物具有能够与一种RNA的目标区域特异性的杂交的特点，该RNA在生理条件下编码哺乳动物Ii蛋白，从而抑制Ii表达。
115.根据权利要求113所述的方法，其中，Ii抑制剂用一种方法被引入，所述方法选自由电转化、脂质诱导的传递、脂质体、和链球菌溶血素O-调节的细胞透化作用。
116.根据权利要求113所述的方法，其中，Ii抑制剂在细胞内由可表达的核酸序列产生。
117.根据权利要求116所述的方法，其中，所述可表达的核酸序列包括一种编码RNA分子的DNA分子，所述RNA分子与编码人Ii蛋白的mRNA互补，该RNA能够与mRNA分子杂交从而抑制mRNA分子的翻译。
118.根据权利要求117所述的方法，其中，所述RNA分子与一部分mRNA分子互补，所述mRNA包括翻译起始位点和大约425个核苷的编码序列。
119.根据权利要求116所述的方法，其中，可表达的核酸序列被病毒或非病毒表达载体携带。
120.根据权利要求119所述的方法，其中，病毒表达载体选自由腺病毒、腺病毒相关病毒、慢病毒、痘病病毒、流行性感冒、和反转录病毒所组成的组。
121.根据权利要求120所述的方法，其中痘病毒是牛痘。
122.根据权利要求119所述的方法，其中，病毒或非病毒表达载体还表达重要的抗原表位。
123.根据权利要求113所述的方法，其中，重要的抗原表位是病毒抗原的抗原表位。
124.根据权利要求113所述的方法，其中，Ii抑制剂是siRNA，该siRNA能够形成一种RNA诱导的沉默复合物，因此在细胞中抑制Ii的表达。
125.根据权利要求124所述的方法，其中，siRNA在细胞内从可表达的序列中产生，且进一步，其中，可表达的核酸序列包括：a)一种第一可表达DNA序列，该第一可表达的DNA序列编码包括Ii有义序列的第一RNA序列；和b)第二可表达的DNA序列，该第二可表达的DNA序列编码包括步骤a)中有义序列的反向互补序列的第二RNA序列，其中，第一RNA序列和第二RNA序列杂交可以生成siRNA二倍体。
126.根据权利要求125所述的方法，其中，第一和第二可表达的DNA中至少一个位于一种载体中。
127.根据权利要求116所述的方法，其中，可表达的核酸序列通过使用调节因子的方法被引入细胞中，其中，所述调节因子选自阳离子树枝状聚合物、脂质、脂质体、金颗粒、聚交酯聚乙交酯颗粒、和聚烷氧基共聚物。
128.根据权利要求125所述的方法，其中，第一可表达的DNA序列和第二可表达的DNA序列被共转染进入哺乳动物细胞中。
129.根据权利要求124所述的方法，其中在单一分子中siRNA包括：
a)长度为10到25个核苷酸的Ii有义序列；
b)a)中所述序列的反向互补序列；和
c)能在有义序列和互补序列之间形成二倍体的间插序列。
130.根据权利要求129所述的方法，在单一分子中的siRNA包括：
a)长度为19到25个核苷酸的Ii有义序列；
b)a)中所述序列的反向互补序列；和
c)能在有义序列和互补序列之间形成二倍体的间插序列。
131.根据权利要求130所述的方法，在单一分子中的siRNA包括：
a)长度为21到23个核苷酸的Ii有义序列；
b)a)中所述序列的反向互补序列；和
c)能在有义序列和互补序列之间形成二倍体的间插序列。
132.根据权利要求124所述的方法，其中，siRNA包括一种RNA二倍体，该RNA二倍体包括：
a)一种包括Ii有义序列的第一链，该Ii有义序列的长度为10到25个核苷酸；
b)一种包括a)中有义序列的反向互补序列的第二链。
133.根据权利要求132所述的方法，其中，siRNA包括一种RNA二倍体，该RNA二倍体包括：
a)一种包括Ii有义序列的第一链，该Ii有义序列的长度为19到25个核苷酸；
b)一种包括a)中有义序列的反向互补序列的第二链。
134.根据权利要求133所述的方法，其中，siRNA包括一种RNA二倍体，该RNA二倍体包括：
a)一种包括Ii有义序列的第一链，该Ii有义序列的长度为21到23个核苷酸；
b)一种包括a)中有义序列的反向互补序列的第二链。
135.根据权利要求124所述的方法，其中，siRNA包括包含翻译起始位点的Ii序列。
136.根据权利要求124所述的方法，其中，siRNA包括人类Ii mRNA的第一400nt之内的部分Ii序列。
137.根据权利要求42、47、63或75中任意一项所述的方法，其中，siRNA包括至少一个单链3端引物悬端。
138.根据权利要求42、47、63或75中任意一项所述的方法，其中，siRNA包括至少一个单链5端引物悬端。
139.根据权利要求124所述的方法，其中，siRNA是化学修饰的，从而预防核酸酶的降解。
140.根据权利要求124所述的方法，其中，siRNA包括选自由SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ IDNO：16，SEQ ID NO：17，和SEQ ID NO：18所组成的组的RNA序列。
141.根据权利要求113所述的方法，其中，Ii的抑制作用至少是15％。
142.根据权利要求113所述的方法，其中，Ii的抑制作用至少是30％。
143.根据权利要求113所述的方法，其中，Ii的抑制作用至少是40％。
144.根据权利要求124所述的方法，其中，所述序列或编码siRNA的序列任选连接RNA聚合酶III启动子。
145.根据权利要求144所述的方法，其中，RNA聚合酶启动子是一种U6或SV40启动子。
146.根据权利要求113所述的方法，其中，使用重组载体诱导II类MHC分子表达，其中，所述重组载体包括一种可表达的核酸序列，此核酸序列编码一种蛋白，这种蛋白在II类MHC分子隐性细胞中的表达，产生细胞表面上II类MHC分子的感应现象。
147.根据权利要求146所述的方法，其中蛋白质选自由I1类MHC反式激活因子和干扰素γ所组成的组中。
148.根据权利要求146所述的方法，其中，编码蛋白的可表达的核酸序列被病毒表达载体所携带。
149.根据权利要求148所述的方法，其中，病毒表达载体选自由腺病毒、腺病毒相关病毒、慢病毒、痘病病毒、流行性感冒、和反转录病毒所组成的组。
150.根据权利要求148所述的方法，其中，病毒表达载体表达重要的抗原表位。
151.根据权利要求149所述的方法，其中，痘病毒是牛痘。
152.根据权利要求1或5所述的组合物，其中，siRNA包括一种二倍体，该二倍体由第一链和第二链组成，第一链选自由SEQ ID NO′s：21，23，25，和27所组成的组，第二链选自由SEQ ID NO′s22，24，26，和28所组成的组。
153.根据权利要求15或19所述的哺乳动物细胞，其中，siRNA包括一种二倍体，该二倍体由第一链和第二链组成，第一链选自由SEQ ID NO′s：21，23，25，和27所组成的组，第二链选自由SEQ ID NO′s22，24，26，和28所组成的组。
154.根据权利要求42、47、63、75或124所述的方法，其中，siRNA包括一种二倍体，该二倍体由第一链和第二链组成，第一链选自由SEQ IDNO′s：21，23，25，和27所组成的组，第二链选自由SEQ ID NO′s　22，24，26，和28所组成的组。
155.根据权利要求1或5所述的组合物，其中，siRNA包括至少一个单链3端引物悬端。
156.根据权利要求1或5所述的组合物，其中，siRNA包括至少一个单链5端引物悬端。
157.根据权利要求1或5所述的组合物，其中，siRNA包括选自SEQ ID NO′s：29-40的Ii有义序列。
158.根据权利要求15或19所述的哺乳动物细胞，其中，siRNA包括选自SEQ ID NO′s：29-40的Ii有义序列。
159.根据权利要求42、47、63、75或124中任意一项所述的方法，其中siRNA包括选自SEQ ID NO′s：29-40的Ii有义序列。
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